Luận văn Nghiên cứu đặc trưng protein của virus gây hội chứng đỏ đuôi ở tôm sú (penaeus monodon) và tôm thẻ chân trắng (penaeus vannamei)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ****0O0**** ĐẶNG TRỊNH MINH ANH NGHIÊN CỨU ĐẶC TRƢNG PROTEIN CỦA VIRUS GÂY HỘI CHỨNG ĐỎ ĐUÔI Ở TÔM SÚ (Penaeus monodon) VÀ TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Penaeus vannamei) LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh -Tháng 9/2006- BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ****0O0**** NGHIÊN CỨU ĐẶC TRƢNG PROTEIN CỦA VIRUS GÂY HỘI CHỨNG ĐỎ ĐUÔI Ở TÔM SÚ (Penaeus monodon) VÀ TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Penaeus vannamei) LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện TS. VĂN THỊ HẠNH ĐẶNG TRỊNH MINH ANH TS. NGUYỄN NGỌC HẢI KHÓA: 2002 – 2006 CN. LÊ PHÚC CHIẾN Thành phố Hồ Chí Minh -Tháng 9/2006- MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC FACULTY OF BIOTECHNOLOGY  RESEARCHING SPECIFIC PROTEIN OF RED TAIL VIRUS IN BLACK TIGER SHRIMP (Penaeus monodon) AND PACIFIC WHITE SHRIMP (Penaeus vannamei) GRADUATION THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY Professor Student Ph.D. VAN THI HANH DANG TRINH MINH ANH Ph.D. NGUYEN NGOC HAI TERM: 2002 - 2006 BSc. LE PHUC CHIEN HCMC, 09/2006 iv LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập. Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học cùng các thầy cô đã trực tiếp giảng dạy trong suốt bốn năm qua. TS. Văn Thị Hạnh đã hết lòng hướng dẫn, truyền đạt kiến thức và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp. TS. Nguyễn Ngọc Hải đã truyền đạt kiến thức và tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực tập tốt nghiệp. CN. Đỗ Thị Tuyến thuộc phòng Các Chất Có Hoạt Tính Sinh Học - Viện Sinh Học Nhiệt Đới. Anh Lê Phúc Chiến, chị Phạm Thị Hạnh thuộc phòng Công Nghệ Tế Bào Động Vật - Viện Sinh Học Nhiệt Đới đã nhiệt tình giúp đỡ, và hướng dẫn trong quá trình thực tập. Những gì mà tôi học được trong thời gian thực hiện đề tài tại Viện Sinh Học Nhiệt Đới là những bài học thực tế mà tôi sẽ không thể nào quên. Các bạn bè thân yêu của lớp Công Nghệ Sinh Học khóa 28 và các bạn cùng phòng đã chia sẻ cùng tôi những vui buồn trong thời gian học cũng như hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ, động viên tôi trong thời gian thực tập. Tp Hồ Chí Minh, ngày 14 tháng 08 năm 2006. Đặng Trịnh Minh Anh v TÓM TẮT ĐẶNG TRỊNH MINH ANH, Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 08/2006. “NGHIÊN CỨU ĐẶC TRƢNG PROTEIN CỦA VIRUS GÂY HỘI CHỨNG ĐỎ ĐUÔI Ở TÔM SÚ (Penaeus monodon) VÀ TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Penaeus vannamei)” Hội đồng hướng dẫn:  TS. Văn Thị Hạnh  TS. Nguyễn Ngọc Hải  CN. Lê Phúc Chiến Khoá luận được thực hiện tại Phòng Công Nghệ Tế Bào Động Vật – Viện Sinh Học Nhiệt Đới là 1 phần của đề tài “Nghiên cứu hội trứng Taura ở tôm thẻ chân trắng và mối liên quan với tác nhân gây hội chứng đỏ đuôi ở tôm sú và tôm càng xanh”. Nguồn virus ban đầu đã được phòng thí nghiệm phân lập và nhân lên trong tế bào côn trùng Sf9. Nội dung của khoá luận là: Xác định đặc trưng protein của Red - Tail Virus (RTV) bằng kỹ thuật SDS-PAGE và Western Blot. Sau đó kiểm tra khả năng gây nhiễm thực nghiệm trên tôm sú và tôm thẻ chân trắng của RTV được nhân lên trong tế bào côn trùng Sf9. Bước tiếp theo là tiến hành thăm dò khả năng phân tách các thành phần protein của virus bằng phương pháp sắc ký lọc gel để phục vụ cho những nghiên cứu tiếp theo. Những kết quả thu được: 1. Sử dụng RTV thu từ tôm sú và tôm thẻ chân trắng được nhân lên trong tế bào côn trùng Sf9 gây nhiễm trở lại cho tôm sú và tôm thẻ thành công. 2. Xác định được các protein của RTV thu từ tôm sú và tôm thẻ được nuôi cấy trong tế bào côn trùng Sf9 bằng kỹ thuật điện di gel Sodium dodecyl sulfate – Polyacrylamide (SDS-PAGE) và điện di miễn dịch (Western Blot) vi MỤC LỤC PHẦN TRANG Trang tựa Lời cảm tạ ..................................................................................................................... iv Tóm tắt .......................................................................................................................... . v Mục lục ......................................................................................................................... .vi Danh mục các chữ viết tắt .......................................................................................... ...ix Danh mục các hình ....................................................................................................... .x Danh mục các bảng....................................................................................................... .xi PHẦN 1. MỞ ĐẦU ..................................................................................................... ..1 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................... ..3 2.1 Tình hình nuôi tôm trên thế giới ........................................................................... ..3 2.1.1 Hiện trạng chung ............................................................................................. ..3 2.1.2 Thiệt hại do TSV trên thế giới ........................................................................ ..4 2.2 Tình hình nuôi tôm tại Việt Nam ........................................................................... ..4 2.2.1 Hiện trạng chung ............................................................................................. ..4 2.2.2 Thiệt hại do TSV tại Việt Nam ....................................................................... ..5 2.3 Giới thiệu hội chứng Taura – TS (Taura syndrome) .............................................. ..6 2.3.1 Lịch sử và phân bố hội chứng Taura ............................................................ ..6 2.3.2 Phân loại và tên gọi ...................................................................................... ..7 2.3.2.1 Tên gọi .................................................................................................. ..7 2.3.2.2 Vị trí phân loại ...................................................................................... ..7 2.3.3 Đặc điểm cấu trúc và genom của TSV ........................................................ ..7 2.3.4 Biểu hiện bệnh hội chứng Taura ở tôm ......................................................... ..8 2.3.5 Vật chủ .......................................................................................................... ..9 2.3.6 Sự đa dạng di truyền và sự xuất hiện các chủng TSV mới ........................... 10 2.3.6.1 Sự đa dạng di truyền của TSV ............................................................... 10 2.3.6.2 Sự xuất hiện các chủng TSV mới .......................................................... 10 vii 2.3.7 Khả năng lây truyền của virus Taura ............................................................ 12 2.3.8 Một số đặc tính của virus Taura với các yếu tố lý hóa.................................. 12 2.4 Các phương pháp và kỹ thuật chuẩn đoán virus Taura .......................................... 13 2.4.1 Chuẩn đoán dựa vào triệu chứng lâm sàng ................................................... 13 2.4.2 Phương pháp mô học ..................................................................................... 14 2.4.3 Phương pháp cảm nhiễm sinh học ................................................................ 14 2.4.4 Phương pháp miễn dịch ................................................................................. 14 2.4.5 Phương pháp chuẩn đoán bằng mẫu dò gen (gene probe) ............................ 14 2.4.6 Phương pháp RT-PCR ............................................................................... 15 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ............................................................. 16 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ......................................................................... 16 3.2 Hoá chất, thiết bị, dụng cụ và vật liệu ................................................................... 16 3.2.1 Hóa chất ......................................................................................................... 16 3.2.1.1 Các hoá chất để thực hiện sắc ký lọc gel .................................................. 16 3.2.1.2 Các dung dịch gốc để thực hiện SDS-PAGE .......................................... 16 3.2.1.3 Các dung dịch gốc để nhuộm gel ............................................................ 16 3.2.1.4 Các dung dịch gốc để thực hiện Western Blotting .................................. 16 3.2.1.5 Các dung dịch để thực hiện Dot Blot ...................................................... 17 3.2.2 Thiết bị, dụng cụ .......................................................................................... 17 3.2.3 Vật liệu .......................................................................................................... 18 3.2.3.1 Kháng thể ................................................................................................ 18 3.2.3.1 Mẫu........................................................................................................... 18 3.3 Phương pháp ......................................................................................................... 18 3.3.1 Phương pháp SDS–PAGE ............................................................................. 18 3.3.1 Phương pháp SDS–PAGE ....................................................................................... 18 3.3.1.1 Nguyên tắc............................................................................................... 18 3.3.1.2 Phương pháp tiến hành ........................................................................... 20 3.3.2 Phương pháp Western Blot ........................................................................ 21 viii 3.3.2.1 Nguyên tắc............................................................................................... 21 3.3.2.2 Phương pháp tiến hành ............................................................................ 23 3.3.3 Gây nhiễm thực nghiệm cho tôm sú (Penaeus monodon) và tôm thẻ (Penaeus vannamei) bằng RTV được nhân lên trong tế bào Sf9 ................................................. 26 3.3.4 Phương pháp Dot Blot ................................................................................... 27 3.3.4.1 Nguyên tắc............................................................................................... 27 3.3.4.2 Phương pháp tiến hành .............................................................................. 27 3.3.5 Phương pháp sắc ký ................................................................................... 28 3.3.5.1 Nguyên tắc ............................................................................................. 28 3.3.5.2. Phương pháp tiến hành ............................................................................ 29 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................... 30 4.1 Kết quả SDS – PAGE ...................................................................................... 30 4.2 Kết quả Western Blot ...................................................................................... 32 4.3 Kết quả thí nghiệm gây nhiễm thực nghiệm ................................................... 34 4.4 Kết quả Dot Blot chỉ thị virus .......................................................................... 37 4.5 Kết quả sắc ký lọc gel ...................................................................................... 40 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................ 42 5.1 Kết luận ........................................................................................................... 42 5.2 Đề nghị ............................................................................................................ 42 PHẦN 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................... 43 PHỤ LỤC 1 ................................................................................................................. 47 PHỤ LỤC 2 ................................................................................................................. 48 PHỤ LỤC 3 ................................................................................................................. 50 PHỤ LỤC 4 ................................................................................................................. 52 ix DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT 1. APS Ammmonium persulphate 2. bp: Base pair 3. DNA: Deoxyribonucleic acid 4. DAB: 3,3’- Diaminobenzidinetetrahydrochloride 5. LOS: Lymphoid Organ Syndrome 6. IHHNV: Infectious Hypodermal and Haematopoietic Necrosis Virus 7. MBV: Monodon Baculovirus 8. Kb: Kilo base 9. KDa: Kilo Dalton 10. PAb: Polyclonal Antibody 11. PBS: Phosphate Buffered Saline 12. PCR: Polymerase Chain Reaction 13. PL: Post larvae 14. RNA: Ribonucleic acid 15. RT-PCR: Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction 16. RTV: Red - Tail Virus 17. ORF: Open Reading Frame 18. OIE: Office International Des Epizooties (Tổ chức dịch tễ thế giới) 19. SDS-PAGE: Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis 20. Sf9: Sepodoptera frugiperda 21. SPF: Specific Pathogen Free (Sạch bệnh) 22. TCT: Tôm thẻ chân trắng 23. TEMED: N, N, N’, N’ – tetramethylethylenediamine 24. TTBS: Tween tris buffer saline 25. TSV: Taura Syndrome Virus 26. YHV Yellow Head Virus 27. WSSV: White Spot Syndrome Virus x DANH MỤC CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1: Sự phân bố của TSV trên thế giới ................................................................ ..6 Hình 2.2: Sơ đồ cấu trúc bộ gen của TSV ................................................................... ..8 Hình 2.3: Tôm bị nhiễm TSV ....................................................................................... ..9 Hình 2.4: cây phát sinh loài của 40 phân lập TSV dựa vào trình tự aa của VP2 ......... 10 Hình 2.5: Cây phát sinh loài theo đoạn ORF2 (1011aa) của 6 chủng TSV ................. 11 Hình 3.1: Các bước thực hiện Western Blot................................................................. 21 Hình 3.2: Cách lắp ráp gel và màng nitrocellulose ...................................................... 22 Hình 3.3: Sơ đồ hệ thống chẩn đoán miễn dịch ......................................................... 28 Hình 4.1: Kết quả SDS – PAGE ................................................................................... 30 Hình 4.2: Kết quả Western Blot ................................................................................... 32 Hình 4.3: Tôm thẻ không gây nhiễm và tôm thẻ gây nhiễm ........................................ 34 Hình 4.4: Tôm thẻ chết do gây nhiễm thực nghiệm với RTV ...................................... 35 Hình 4.5: Ảnh chụp hiển vi tôm sú đối chứng nuôi trong phòng thí nghiệm (x40) ..... 36 Hình 4.6: Ảnh chụp hiển vi tôm sú nhiễm thực nghiệm với dịch tế bào nhiễm RTV . 36 Hình 4.7: Ảnh chụp hiển vi phần đuôi tôm sú nhiễm thực nghiệm với dịch tế bào nhiễm RTV ................................................................................................................... 36 Hình 4.8: Tôm sú giống gây nhiễm nhiễm thực nghiệm với RTV ............................. 37 Hình 4.9: Chỉ thị mức độ bệnh theo phương pháp Dot Blot ........................................ 37 Hình 4.10: Kết quả kiểm tra tôm thẻ trước khi gây nhiễm ........................................... 38 Hình 4.11: Kết quả kiểm tra tôm sú giống trước khi gây nhiễm .................................. 38 Hình 4.12: Kết quả kiểm tra tôm thẻ sau khi gây nhiễm .............................................. 38 Hình 4.13: Kết quả kiểm tra tôm sú giống sau khi gây nhiễm ..................................... 39 Hình 4.14: Kết quả dịch tế bào (DTB) Sf9 ................................................................... 40 Hình 4.15: Kết quả DTB nhiễm virus từ tôm sú Long An bị bệnh RTV (RT-PmLA).40 Hình 4.16: Kết quả DTB nhiễm RTV từ tôm thẻ chân trắng bị bệnh RTV (RTV-PvM) . ...................................................................................................................................... 41 xi DANH MỤC CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 2.1: Sản lượng tôm tôm thế giới năm 2002-2003 ............................................... ..3 Bảng 2.2: Sản lượng tôm nuôi ở Việt Nam qua các năm ............................................. ..5 Bảng 2.3: Các phương pháp chuẩn đoán TSV ............................................................ 13 Bảng 3.1: Các mẫu sử dụng .......................................................................................... 18 Bảng 4.1: So sánh trọng lượng các protein của RTV sau khi SDS-PAGE và trọng lượng của các protein đã được công bố ........................................................................ 31 Bảng 4.2: So sánh trọng lượng các protein của RTV sau khi Western Bloting và trọng lượng của các protein đã được công bố ........................................................................ 33 Bảng 4.3: Số tôm thẻ sống sót sau ba tuần gây nhiễm ................................................. 34 Bảng 4.4: Số tôm sú sống sót sau hai tuần gây nhiễm ................................................. 35 1 1 PHẦN 1. MỞ ĐẦU Nuôi tôm đang là thế mạnh của ngành thủy sản nước ta. Từ năm 1995 nghề nuôi tôm nước ta phát triển mạnh mẽ cả về diện tích, hình thức nuôi, năng suất, sản lượng và hiệu quả kinh tế. Cụ thể là năm 2004 diện tích tôm nuôi đạt hơn 460.000ha, tổng sản lượng đạt 350.000 tấn và là nguồn cung cấp nguyên liệu quan trọng cho chế biến xuất khẩu thủy sản. Nghề nuôi tôm đã thực sự trở thành một trong những nghề sản xuất hàng hóa lớn của Việt Nam. Tuy nhiên cùng với sự phát triển của nghề nuôi tôm, dịch bệnh do virus gây ra cũng liên tục lan rộng và gây thiệt hại nặng nề về kinh tế. Trong khi đó, những nghiên cứu về virus tôm còn rất hạn chế. Vì vậy, việc nghiên cứu tác nhân virus gây bệnh nhằm đề xuất giải pháp hạn chế tác nhân này là một yêu cầu cấp bách hiện nay. Bên cạnh đó, việc khai thác tiềm năng và phát triển thêm các chủng loại tôm nuôi khác để đa dạng hóa các sản phẩm tôm thương mại, tận dụng tối đa điều kiện tự nhiên và nhân lực ở các vùng ven biển cũng là vấn đề hiện đang rất được nhà nước quan tâm. Năm 2001 Việt Nam bắt đầu du nhập tôm thẻ chân trắng (P. vannamei) từ Đài Loan và Hawaii vào nuôi thử nghiệm ở một số vùng. Tôm thẻ chân trắng có những ưu thế so với tôm sú như chủ động về nguồn giống, thời gian nuôi ngắn hơn nhưng năng suất tương đương tôm sú, chịu được độ mặn cao và có thể nuôi được trong cả nước mặn, ngọt và lợ… Tuy nhiên việc nhập nuôi loài tôm này gắn liền với việc đưa virus hội chứng Taura (Taura Syndrome Virus – TSV) vào Việt Nam. Để tránh không xảy ra dịch bệnh như đã có đối với các nước từng du nhập tôm thẻ chân trắng (TCT) thì những thông tin đầy đủ về bệnh hội chứng Taura và khả năng lây lan TSV từ tôm này sang các loài tôm bản địa khác, đặc biệt đối với tôm sú, cũng là vấn đề rất được quan tâm. Năm 2000 Phòng Công Nghệ Tế Bào Động Vật – Viện Sinh Học Nhiệt Đới thu được mẫu tôm sú ở Long An nghi nhiễm TSV, với biểu hiện lâm sàng là đỏ đuôi quạt và đỏ 2 đốt thân cuối. Tôm còn sống nhưng vận động và tiêu thụ thức ăn kém. Các mẫu tương tự sau đó đã thu được ở Cần Giờ - Tp. Hồ Chí Minh. Năm 2003 phòng thí nghiệm cũng thu được mẫu tôm TCT với biểu hiện lâm sàng tương tự. Tất cả các mẫu tôm này đã được kiểm tra bằng phương pháp PCR và cho kết quả âm tính WSSV 2 2 (White Spot Syndrome Virus), IHHNV (Infectious Hypodermal and Haematopoietic Necrosis Virus), MBV (Monodon Baculovirus), YHV (Yellow Head Virus). Các kết quả nghiên cứu về đặc trưng sinh hóa, sinh học phân tử, cấu trúc hiển vi điện tử ở phòng thí nghiệm khẳng định tác nhân gây bệnh chính là virus. Vì vậy, đề tài: “Nghiên cứu đặc trưng protein của virus gây hội chứng đỏ đuôi ở tôm sú (Penaeus monodon) và tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)” là cần thiết và cấp bách nhằm xác định mối liên hệ giữa tác nhân gây bệnh đỏ đuôi đặc biệt này và virus hội chứng Taura ở tôm thẻ chân trắng để có biện pháp phòng ngừa kịp thời. Mục tiêu nghiên cứu Xác định đặc trưng protein của virus gây hội chứng đỏ đuôi ở tôm sú và tôm TCT. Yêu cầu thực hiện của đề tài Đề tài thực hiện gồm 3 nội dung như sau: Nội dung 1: Xác định các protein của virus gây hội chứng đỏ đuôi. Nội dung 2: Kiểm tra khả năng gây nhiễm thực nghiệm của virus gây hội chứng đỏ đuôi được nhân trong tế bào côn trùng Sf9 trên tôm sú và tôm thẻ chân trắng. Nội dung 3: Thăm dò khả năng phân tách các thành phần protein của virus bằng phương pháp sắc ký lọc gel. 3 3 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tình hình nuôi tôm trên thế giới 2.1.1 Hiện trạng chung Hiện nay, nghề nuôi tôm đang trên đà phát triển mạnh và trở thành một trong những ngành đem lại thu nhập lớn cho nền kinh tế quốc dân của một số nước trên thế giới. Vào những năm cuối thập kỷ 80, nghề nuôi tôm đã có những bước phát triển nhanh chóng, các trại nuôi tôm được xây dựng ở gần 40 nước, đưa sản lượng tôm nuôi từ tỷ lệ 2,1% năm 1981 lên 22% năm 1988 so với tổng sản lượng tôm (Latscha, 1989). So với năm 1984, sản lượng tôm nuôi năm 1990 tăng 368% với gần 600.000 tấn (FAO, 1992). Năm 2003, sản lượng tôm nuôi trên thế giới gia tăng nhanh chóng. Đứng đầu là Trung Quốc với 400.000 tấn, kế đến là Thái Lan 350.000 tấn so với năm 2002, Việt Nam xếp thứ 3 với 200.000 tấn. Trong đó các nước Đông Bán Cầu chiếm 70% tổng sản lượng tôm nuôi, còn lại là các nước Tây Bán Cầu. Bảng 2.1: Sản lượng tôm thế giới năm 2002 – 2003 Quốc gia Năm 2002 Năm 2003 Trung Quốc 280.000 400.000 Thái Lan 250.000 350.000 Việt Nam 150.000 200.000 Indonesia 102.000 168.000 Ấn Độ 125.000 160.000 Malaysia 20.000 32.000 Trung và Nam châu Mỹ 93.000 320.000 Các quốc gia khác 225.000 270.000 Tổng cộng 1.245.800 1.900.000 Nguồn: Thông tin hội thảo kỹ thuật nuôi tôm sú (2005) 4 4 2.1.2 Thiệt hại do TSV trên thế giới Virus hội chứng Taura (TSV) gây nên những tổn thất nghiêm trọng về doanh thu trên khắp cả vùng Châu Mỹ - Latinh vào những năm 1990. Người ta đã từng cho rằng TSV gây ra những tổn thất trực tiếp (do tỉ lệ tôm chết cao) vào khoảng 1 – 1,3 tỉ USD trong 3 năm đầu tiên tại Châu Mỹ - Latinh. Tuy vậy, những tổn thất gián tiếp do hàng hóa bị mất, chi phí cho tôm giống tăng và những hạn chế trong thương mại của khu vực tăng lên rất nhiều (Brock et al., 1997; Hernandez – Rodriguez et al., 2001). Sau khi TSV được phát hiện ở Ecuador năm 1992 đã làm cho sản lượng tôm nước nay sụt giảm 30% từ 100.000 tấn xuống còn 70.000 tấn. Ecuador mất khoảng 400 triệu USD/năm. Cũng kể từ khi phát hiện được TSV, dịch bệnh do virus này lan nhanh chóng khắp các nước ở vùng Châu Mỹ - Latinh và Bắc Mỹ (Ecuador, Brazil, Columbia, Peru, Panama...). Và dần dần virus hội chứng Taura cũng đã lây lan sang các nước Châu Á khi tôm TCT được du nhập và nuôi nhiều như ở Đài Loan, Trung Quốc, Thái Lan. Năm 1999/2000 TSV được phát hiện ở TCT tại Trung Quốc và Đài Loan (Tu et al., 1999; Yu và Song, 2000) với 19 trường hợp thông báo cho OEI từ Đài Loan vào năm 1999, dẫn đến 700.000 trường hợp và 200.000 tôm chết vào năm 2000 và dẫn đến 500.000 trường hợp và 50.000 tôm chết vào năm 2001. Gần đây, năm 2003 đã phát TSV hiện ở Thái Lan (Timothy Flegel, per.com), nhưng không được thông báo chính thức với OIE (Office International Des Epizooties). Vào tháng 4/2005 virus hội chứng Taura lại gây dịch lớn tại Châu Mỹ (Infofis, 6/4/2005), khiến sản lượng tôm của Venezuela sụt giảm khoảng 90%. 2.2 Tình hình nuôi tôm tại Việt Nam 2.2.1 Hiện trạng chung Việt Nam bước vào thị trường tôm thế giới chậm so với nhiều nước láng giềng Châu Á. Tuy nhiên, nhờ những điều kiện thời tiết thuận lợi, chính sách mở cửa của nền kinh tế, sự phát triển của thị trường tôm toàn cầu và tình trạng tôm nhiễm bệnh lây lan ở các nước khác đã tạo nên một bước tiến khá ngoạn mục cho Việt Nam vào thị trường thế giới. Việc nuôi tôm tiếp tục phát triển nhanh chóng trên khắp Việt Nam. Sản xuất tăng từ dưới 200 tấn (năm 1976) lên hơn 100.000 tấn (năm 2000) và 158.755 tấn (năm 5 5 2001). Năm 2001, 446.208 ha được dành cho nuôi tôm, tăng lên 97% so với năm 2000 với năng suất bình quân đạt 0,36 tấn /ha (Nguyễn Văn Thanh, 2003). Ngành thủy sản Việt Nam xuất khẩu 1,76 tỷ USD năm 2001, gấp đôi kim ngạch năm 1998, đứng hàng thứ ba về thu nhập xuất khẩu, và các trang trại hải sản chiếm diện tích tới hơn một triệu ha, tăng 74% so với năm 1998. Thu nhập ngoại tệ từ nuôi trồng thủy sản tăng lên hàng năm, và chỉ riêng tôm đã mang lại ước tính 500 triệu USD (Nguyễn Văn Thanh, 2003). Vào năm 2002, sản lượng tôm là 150.000 tấn. Năm 2003, sản lượng cho hơn 200.000 tấn. Năm 2004, sản lượng tôm ở Việt Nam đã đạt 350.000 tấn. Đến nay hàng thủy sản xuất khẩu của Việt Nam đã có mặt ở 80 nước và lãnh thổ, trong đó dẫn đầu là thị trường Nhật, kế đến là Mỹ (đây cũng là hai thị trường có sự gia tăng mạnh về giá trị xuất khẩu so với năm 2003), EU, Trung Quốc, Hồng Kông… (Chalor Limsuwan, Nguyễn Văn Hảo, 2005). Bảng 2.2: Sản lượng tôm nuôi ở Việt Nam qua các năm Năm Sản lượng (tấn) 1976 < 200 2000 > 100.000 2001 158.755 2002 186.600 2003 200.000 2004 350.000 Nguồn: Thông tin Khoa học Công nghệ - Kinh tế Thủy sản tháng 3/2005, 04/2005 2.2.2 Thiệt hại do TSV tại Việt Nam Năm 2003, bệnh hội chứng Taura đã bùng phát ở tôm TCT, gây ảnh hưởng nghiêm trọng tại nhiều vùng nuôi như Quảng Ninh, Phú Yên, Bạc Liêu, Cà Mau. Trước nguy cơ đó, Cục quản lý chất lượng, an toàn vệ sinh và thú y thủy sản đã dừng làm thủ tục nhập khẩu tôm TCT giống từ Trung Quốc và Đài Loan. Bên cạnh đó, Bộ Thủy Sản cũng có chỉ thị không được tiến hành sản xuất giống tôm TCT tại các trại giống tôm sú và giống tôm khác, chỉ được phép nuôi loại tôm này tại các khu vực ao, 6 6 đầm nuôi tách biệt (VietNamNet 03/10/04). Sau thời gian nuôi thử tôm TCT, dịch bệnh đã xảy ra ở một số nơi trên địa bàn cả nước. Quảng Nam có 20 ha tôm bị bệnh có khả năng là bệnh Taura, Bình Định có 20 ha (chưa rõ nguyên nhân bệnh). Ở Quảng Ngãi sau vụ 1 và 2 thành công, vụ thứ ba tôm chết hàng loạt trên 80% diện tích nuôi (khoảng 20 ha) với triệu chứng mềm vỏ, thân. Một số khu vực nuôi tôm chân trắng khác ở phía Nam như Sóc Trăng, Đồng Nai, Bà Rịa Vũng tàu cũng xảy ra dịch bệnh trên diện rộng (VietNamNet 03/10/04). Khả năng lây lan TSV sang các loài tôm khác ở Việt Nam, đặc biệt đối với tôm sú chưa được thống kê và nghiên cứu đầy đủ. Nhóm các nhà nghiên cứu Viện Công Nghệ Sinh học, Viện Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam đã khẳng định sự có mặt của TSV ở tôm TCT nuôi tại Quảng Ninh, Phú Yên, Bạc Liêu và từ sản phẩm tôm đông lạnh tại Hà Nội bằng kỹ thuật PCR. Các tác giả cũng khẳng định khả năng lây nhiễm thực nghiệm TSV từ tôm TCT sang tôm sú (Nguyễn Hoàng Uyên, 2005). 2.3 Giới thiệu hội chứng Taura – TS (Taura syndrome) 2.3.1 Lịch sử và phân bố hội chứng Taura Hình 2.1: Sự phân bố của TSV trên thế giới Virus hội chứng Taura lần đầu tiên được xác định từ các đầm nuôi xung quanh sông Taura ở Ecuado vào năm 1992 và lan rộng nhanh chóng ra toàn bộ MEXICO (1995) HAWAII (1994) BRAZIL (1994) PERU (1993) ECUADOR COLOMBIA (1993) TEXAS (1994) THAILAN (2003) CHINA (1999) TAIWAII (1999) 7 7 Châu Mỹ - Latinh và Bắc Mỹ trong vòng 3 năm. TSV lan ra đầu tiên qua Ecuado và sang Peru (1993), Colombia (bờ biển Thái Bình Dương và Đại Tây Dương), Hondurat, Guatemala, Ensanvado. Nicaragoa, Hawaii, Florida và Brazil (1994), Mexico, Texas, nam Carolina và Belize (1995/1996) (Brook, 1997; Lighter và Redman, 1998) và dần dần là cả châu Á, bao gồm Trung Quốc và Đài Loan (từ năm 1999) (Flegel và Fegan, 2002a), và gần đây nhất là Thái Lan (2003) (Timothy Flegel, per.com). 2.3.2 Phân loại và tên gọi 2.3.2.1 Tên gọi Tên phổ biến thường gọi là virus gây bệnh hội chứng Taura (TSV). [Ngoài ra có một số tên gọi khác chỉ tác nhân gây bệnh hội chứng Taura như: hội chứng Taura (Taura Syndrome – TS); bệnh Hội chứng Taura (Taura Syndrome Disease – TSD); bệnh đỏ đuôi (Red Tail Disease – RTD) (Lightner, 1996)]. 2.3.2.2 Vị trí phân loại Ban đầu TSV được phân loại là Picornavirus, họ Picornaviridae (Bonami, Lighner 1997) dựa trên cơ sở hình thái học và cấu trúc của tác nhân này. Tuy nhiên, kết quả nghiên cứu về trình tự genome virus cho thấy nó giống với các thành viên của một loại virus gây bệnh côn trùng (giống Cricket paralysis – like viruses) (Mari, 2002) và thuộc họ Dicistrovidae, giống Cripavirus (Mayo, 2002). Năm 2004 TSV đã được đưa ra khỏi giống Cripavirus và không được được xếp vào họ Dicistrovidae (Mayo, 2004). Hiện nay TSV được coi là loại virus chưa được phân loại (Phụ lục 1). 2.3.3 Đặc điểm cấu trúc và genom của TSV TSV là loại virus ssRNA có dạng hình khối 20 mặt, đường kính 30 – 32 nm, không có vỏ envelope, mật độ bouyant trong CsCl 1,338 g/ml (Lightner, 1996). Được sao chép trong nguyên sinh chất tế bào vật chủ. Genome của TSV (Hình 2.2) có kích thước khoảng 9 kb, xoắn đơn thẳng, có 10.205 nucleotid, tạo chuỗi poly–A –3’, chứa hai khung đọc mở (Open Reading Frame - ORF) lớn:  ORF 1 chứa chuỗi mã hóa protein phi cấu trúc của các enzyme như helicase (H), protease (P) và polymerase RNA phụ thuộc RNA (RNA–dependent RNA polymerase–RdRp).  ORF 2 chứa các chuỗi mã hóa cho các protein cấu trúc của TSV, bao gồm ba protein capsid chính VP1, VP2, VP3 tương ứng với các protein 55, 40 và 8 8 24 kDa. Ngoài ra còn có polypeptide phụ: 58 kDa. Đoạn gen VP2 mã hóa protein capsid 40 kDa là đoạn gen đặc hiệu có thể sử dụng để nhận dạng các chủng TSV (Bonami,1997; Mari, 1998; Mari, 2002). Vùng gen mã hóa protein phi cấu trúc Vùng gen mã hóa protein cấu trúc Hình 2.2: Sơ đồ cấu trúc bộ gen của TSV (Mari, 2002) 2.3.4. Biểu hiện bệnh hội chứng Taura ở tôm Hội chứng Taura được biết là bệnh của tôm TCT ở giai đoạn còn nhỏ, xảy ra trong khoảng 14 – 40 ngày sau khi thả. Tôm bị hội chứng Taura thường là loại tôm giống nhỏ, khoảng 0,05 – 5 g. Tôm lớn hơn cũng có thể bị ảnh hưởng, đặc biệt nếu chúng không được tiếp xúc với virus cho tới khi trở thành tôm non hay trưởng thành. Quá trình diễn biến của bệnh hội chứng Taura xuất hiện chủ yếu trong giai đoạn của một chu kỳ lột xác. Bệnh tiến triển theo hai giai đoạn (pha): pha tiền cấp tính (peracute) và pha hồi phục (hay mãn tính – chronic):  Pha tiền cấp tính (hay cấp tính) thường có biểu hiện: Thường thấy tôm chết hoặc hấp hối trong lưới hoặc nằm dưới đáy bể. Tôm thường yếu và mất phương hướng khi di chuyển. Biểu hiện sự lan tỏa vùng sắc tố đỏ làm cho toàn thân tôm có màu đỏ nhạt, quạt đuôi và chân bò có màu đỏ rõ rệt và thường chết trong khi lột xác. Biểu mô ở phần phụ mỏng (cạnh của chân bò hay quạt đuôi) thấy có dấu hiệu hoại tử biểu mô tập trung. Vỏ mềm, ruột trống rỗng và thường ở giai đoạn muộn của chu kỳ lột xác. Là điểm nhạy cảm trong quá trình phát sinh bệnh hội chứng Taura (Lightner, 1995).  Pha mãn tính (hay hồi phục) thường có biểu hiện: 9 9 Hình 2.3: Tôm bị nhiễm TSV Hình 1 – tôm nhiễm TSV thân biến màu hồng và đuôi quạt bị đỏ Hình 2 – đuôi bị tổn thương, vỏ kitin bị ăn mòn Hình 3 – ruột quăn không đầy thức ăn Hình 4 – trên thân xuất hiện những vệt sắc tố lạ Biểu hiện kiểu tổn thương của bệnh do vi khuẩn gây ra như có nhiều điểm bị đen hóa. Có thể có hoặc không có biểu hiện mềm vỏ hoặc lan tỏa sắc tố đỏ, vận động và tiêu thụ thức ăn bình thường. Tôm sống sót qua quá trình lột xác bước vào giai đoạn mãn tính hay hồi phục bệnh và có biểu hiện tổn thương vỏ bị đen (melanin hóa). Tôm bị nhiễm bệnh có thể trải qua bước tiền cấp tính khác của hội chứng Taura ở giai đoạn lột xác tiếp sau, hoặc chúng có thể lột xác bình thường và hồi phục mặc dù vẫn mang TSV (Lightner, 1996). TSV có thể gây chết từ 80 – 90%.Tuy nhiên tỷ lệ sống sót trong quần thể tôm bị bệnh có thể đạt tới 60% hay cao hơn. 2.3.5. Vật chủ Theo Lightner dải vật chủ đối với TSV chưa được biết đầy đủ nhưng đã tìm thấy sự hiện diện mầm bệnh Taura (TSV) ở các vật chủ sau (Lightner, 1996b): Nhiễm tự nhiên: Tôm thẻ chân trắng (P. vannamei), tôm xanh Nam Mỹ (P. stylirostris) 10 10 Nhiễm thực nghiệm: Tôm nương Trung Quốc (P. chinensis), tôm trắng Nam Mỹ (P. schmitti), tôm he Nhật Bản (P. japonicus), tôm trắng Bắc Mỹ (P. setiferus), tôm nâu Bắc Mỹ (P. aztecus) và tôm sú (P. monodon) Cho đến nay thì đã phát hiện thêm 2 loài tôm bị nhiễm TSV trong tự nhiên là Penaeus monodon và Metapenaeus ensis (Yun–Shiang Chang et al., 2004). 2.3.6 Sự đa dạng di truyền và sự xuất hiện các chủng TSV mới 2.3.6.1 Sự đa dạng di truyền của TSV Hình 2.4: Mối quan hệ phát sinh loài của 40 phân lập TSV dựa vào trình tự acid amin của VP2 Đến năm 2004 đã phát hiện có khoảng 40 phân lập TSV. Dựa vào sự thay đổi trình tự acid amin trên VP2 người ta chia chúng thành 3 nhóm khác nhau: Americas, Belize và SE Asia (Hình 2.4). 2.3.6.2. Sự xuất hiện các chủng TSV mới Vào vụ tôm 1999 – 2000, TSV gây ra tỷ lệ chết cao ở tôm giống Penaeus stylirostris ở Mexico. Kết quả kiểm tra bằng phương pháp PCR và lai Insitu dương 11 11 tính nhưng lại cho kết quả âm tính với hóa mô miễn dịch. Bởi vì giống tôm này trước đó được xem là kháng TSV. Nên chủng TSV này đã được nghiên cứu xem có phải có một chủng TSV mới đã xuất hiện ở Mexico không (Hasson, 2002). Các dữ liệu về hóa mô miễn dịch (immunohistochemistry) và sinh học phân tử giả thiết rằng có sự tồn tại ít nhất hai giống TSV. Một trong hai giống này có lẽ được tiến hóa do sự tiếp xúc với một vật chủ penaeid mới, P. stylirostris (Refugio, 2002). Theo Yun–Shiang Chang et al., thì sự thích ứng với môi trường mới và những đột biến nhanh chóng ở TSV đã tạo ra 1 số chủng TSV nhạy cảm với vật chủ mới như P. monodon và M. ensis ở Đài Loan. Sự thay đổi của các acid amin (Hình 2.5) tại vị trí 201, 408, 413, 560, 696, 713, 720, 729 và 785 giữ vai trò như dấu hiệu di truyền của TSV ở Đài loan, đặc biệt là biến đổi tại 201F và 560H (Robles–Sikisaka, 2002). Sự thay đổi vật chủ từ L. vannamei sang P. monodon và M. ensis là do sự biến đổi các acid amin xảy ra ở các vị trí 97 (ED), 598(VI), 710 (AV), 768 (ED) và 803 (LF) ở nhánh Tw2KPmTSV và Tw2KMeTSV của Đài Loan (Hình 2.5). P. monodon và M. ensis là 2 vật chủ mới của 2 phân lập TSV khác nhau cả về kiểu di truyền và kiểu hình. (Yun–Shiang Chang et al., 2004). Hình 2.5: Cây phát sinh loài theo đoạn ORF2 (1011aa) của 6 chủng TSV. Vị trí của 32 acid amin thay đổi so với chủng HI94TSV 12 12 2.3.7 Khả năng lây truyền của virus Taura Cơ chế lây lan của TSV vẫn chưa được xác định chắc chắn, mặc dù những giả thuyết ban đầu tập trung vào sự lây lan từ đầm nuôi này sang đầm nuôi kia thông qua tôm giống và tôm bố mẹ bị nhiễm bệnh (Lighter, 1995 và 1996; Garza et al., 1997). Những dữ liệu ít ỏi đã cho thấy TSV được du nhập vào Côlômbia và Brazil thông qua việc nhập tôm bố mẹ bị nhiễm bệnh từ Hawaii (Brock et al., 1997). Những con tôm bố mẹ đó đã không được kiểm tra TSV vì người ta vẫn chưa biết rằng hội chứng Taura là do virus gây nên. Những trường hợp như vậy đã một lần nữa minh chứng cho những vấn đề có liên quan tới việc di chuyển động vật qua biên giới, cho dù là những động vật được cho là sạch bệnh (Specific Pathogen Free – SPF). Nghiên cứu gần đây cho thấy việc truyền bệnh về mặt cơ học thông qua các vật chủ trung gian là chim và côn trùng cũng là một đường lây bệnh không kém phần và thậm chí còn nghiêm trọng hơn. Đôi khi, người ta còn tìm thấy TSV trong các xét nghiệm sinh học mô của Trichocorixa reticulata, một loài côn trùng phổ biến khắp thế giới sống ở của sông, và những phần có chứa virus của loài côn trùng này đã được chứng minh là gây ra sự lây nhiễm ở các con tôm chân trắng SPF trong các điều kiện thí nghiệm (Lighter, 1995). Các dạng lây lan và việc TCT chết ở Texas cũng cho thấy việc TCT ăn các côn trùng bị nhiễm bệnh có thể là một cơ chế lây lan bệnh TSV (Thompson et al., 1997). TSV có thể lây lan qua chim mòng biển (Larus atricilla) do những con chim này ăn tôm bị bệnh tại những đầm nuôi khác (Lighter, 1995 và 1996; Garza et al., 1997). Những kết quả thí nghiệm cho thấy những con tôm khỏe mạnh có thể bị nhiễm thông qua việc tiêm các yếu tố đươc tách từ tế bào tôm bị nhiễm bệnh hoặc trực tiếp ăn những con tôm bệnh (Brock et al., 1995; Hasson et al., 1995). Người ta thấy virus hội chứng Taura vẫn có thể lây lan sau một số chu kỳ làm đông lạnh. Điều này cho cho thấy khả năng truyền bệnh thông qua tôm đông lạnh đã nhiễm bệnh (Lighter, 1995; Brock et al., 1997). Tuy vậy, với những quy trình và biện pháp kiểm soát diệt khuẩn phù hợp, đường lây bệnh này hiện đang được coi là có tỷ lệ rủi ro thấp (Flegel và Fegan, 2000; Flegel, 2003). 2.3.8 Một số đặc tính của virus Taura với các yếu tố lý hóa - Bị mất hoạt tính trong tế bào ở 100oC trong vòng 10 phút - Các chất oxi hoá, SDS (sodium dodecyl sulfate), lipid hòa tan có thể làm mất hoạt tính của TSV (theo OIE) 13 13 2.4 Các phƣơng pháp và kỹ thuật chẩn đoán virus Taura. Tổ chức dịch tễ quốc tế (Office International Des Epizooties – OIE) đã liệt kê một số phương pháp để chuẩn đoán TSV. Bảng 2.3: Các phương pháp chuẩn đoán TSV Phương pháp Đối tượng Giả thiết Khẳng định Ấu trùng Tôm post Tôm non Trưởng thành Dấu hiệu lâm sàng - - - - ++ - Kính hiển vi - - - - ++ - Biểu hiệu bệnh lý - +++ +++ +++ +++ +++ Cảm nhiễm sinh học - - - - ++ ++ Kính hiển vi điện tử - - - - + + Chẩn đoán miễn dịch - - - - +++ +++ Chẩn đoán bằng mẫu dò - +++ +++ +++ +++ +++ RT – PCR - +++ +++ +++ +++ +++ Dấu (-) phương pháp không có sẵn hiện nay hoặc có nhưng chưa được thí nghiệm. Dấu (+) phương pháp có ứng dụng trong vài trường hợp, nhưng sự chính xác hoặc ứng dụng còn hạn chế. Dấu (++) phương pháp chuẩn với tính nhạy cảm và sự đặc biệt chẩn đoán tốt. Dấu (+++) phương pháp được khuyến cáo là đã sẵn sàng và chính xác. Trong 8 phương pháp liệt kê bởi OIE chỉ có 3 phương pháp được khuyến cáo đã sẵn sàng và có thể áp dụng được ngay (phương pháp mô bệnh học, lai DNA dot blot và (RT – PCR). Phương pháp mô bệnh học có thể nhận biết được bệnh nhưng không có giá trị chẩn đoán sớm, phương pháp chẩn đoán bằng chỉ thị gen (lai DNA, RT – PCR) có thể phát hiện rất sớm mầm bệnh TSV trước khi có biểu hiện bệnh lý. Hiện nay kỹ thuật PCR đã dùng để phát hiện nhiều loại virus (WSSV, IHHNV, YHV...), do đó sử dụng RT – PCR xác định TSV có nhiều thuận lợi khi triển khai rộng trong sản xuất. 2.4.1. Chẩn đoán dựa vào triệu chứng lâm sàng Ở thời kì phát bệnh tôm có màu đỏ nhợt nhạt, toàn bộ vỏ thân và ở đuôi có màu đỏ rõ rệt (bệnh đỏ thân, hồng thể) kèm theo những dấu hiệu tiêu biểu mỏng vỏ, xoang 14 14 tiêu hóa rỗng, tôm thường chết nhiều trong thời gian lột xác. Trong thời kì ủ bệnh xuất hiện những bất thường ở sắc tố của biểu bì, những đốm sắc tố này là những haemocyte do những thương tổn trong biểu bì biểu mô. Tôm có thể có hoặc không bị vỏ mềm và có vết đỏ, có thể ăn bình thường. Mặc dù chỉ xuất hiện một ít ngày dịch bệnh, nhưng dấu hiệu trong thời kì ủ bệnh có thể giúp cho việc nhận biết sự lây nhiễm TSV. 2.4.2. Phƣơng pháp mô học Chẩn đoán TSV trong thời kì phát bệnh tùy thuộc vào sự biểu hiện của mô khi nhuộm haematoxylin và Eosin, những điểm nhuộm màu ở vùng necrosis trong biểu mô bì biểu bì của bề mặt toàn thân, tất cả các phần phụ mang, xoang tiêu hoá. Trong thời kì ủ bệnh. Những tổn thương biểu bì thời kì phát bệnh tiêu biểu biến đi và được thay thế bởi những haemocytes ở tại cùng vị trí đó. Số lượng nhiều haemocytes có thể trở thành các sắc tố là những vệt đen, đó là đặc điểm của thời kì ủ bệnh. Những tổn thương như vậy có thể làm mòn biểu bì, và dễ bị Vibrio spp xâm nhập. Trong thời kì ủ bệnh của TS không có những dấu hiệu chính của nhiễm bệnh, và về tế bào học dấu hiệu duy nhất của nhiễm bệnh là sự có mặt LOS (Lymphoid Organ Syndrome). Đó là những sự tích tụ những tế bào hình cầu ở trung tâm các ống lymphoi bình thường. 2.4.3 Phƣơng pháp cảm nhiễm sinh học Sự nhiễm TSV có thể được xác định bằng cách cho ăn trực tiếp những mảnh thức ăn nhiễm virus. Hoặc tiêm truyền trực tiếp dịch chiết từ tôm đang mắc bệnh vào đối tượng thí nghiệm. Những dấu hiệu bệnh lý hoặc dấu hiệu điển hình về tế bào học sẽ xuất hiện sau 3 – 8 ngày (Lighter, 1996). 2.4.4 Phƣơng pháp miễn dịch Có thể sử dụng Monoclonal Antibodies (MAs) để xác định TSV ở những mẫu huyết và dịch tế bào đồng thể từ tôm. MAs còn có thể áp dụng để kiểm tra những mẫu mô đông lạnh, hoặc đã cố định. Hiện trên thị trường có sản phẩm của DiagXotics (Wilton, CT, USA). 2.4.5 Phƣơng pháp chẩn đoán bằng mẫu dò gen (gene probe) Nguyên lý của phương pháp là sử dụng một đoạn oligonucleotide (thiết kế trên trình tự gene đặc hiệu của TSV) gắn với một chất chỉ thị và gọi là mẫu dò (probe). Chất chỉ thị có thể là enzyme, đồng vị hoặc chất phát huỳnh quang… Sau đó lai probe với DNA – RNA của virus. Những probe này được tổng hợp trong phòng thí nghiệm 15 15 hoặc từ những nguồn thương mại. Phương pháp này có độ chính xác đặc hiệu, độ nhạy lớn hơn những phương pháp chẩn đoán truyền thống, tế bào học cổ điển. 2.4.6 Phƣơng pháp RT-PCR Phương pháp RT – PCR phát hiện virus Taura ở TCT được nhóm tác giả đại học Arizona thực hiện lần đầu tiên vào năm 1998 (Nunan L.M., et al., 1998). Tác giả sử dụng cặp mồi thiết kế tại vị trí 9195 và 9992 trên trình tự gen TSV khuếch đại đoạn gen đặc hiệu 231bp bằng phản ứng RT – PCR 16 16 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu A. Thời gian thực hiện đề tài: 3/2006 – 7/2006. B. Địa điểm thực hiện: Phòng Công Nghệ Tế Bào Động Vật – Viện Sinh Học Nhiệt Đới (1– Mạc Đĩnh Chi – Q.1 – Thành phố Hồ Chí Minh). 3.2 Hoá chất, thiết bị, dụng cụ và vật liệu 3.2.1 Hóa chất 3.2.1.1 Các hoá chất để thực hiện sắc ký lọc gel  Bio Gel – P100  Đệm photphat 3.2.1.2 Các dung dịch gốc để thực hiện SDS-PAGE  Monomere solution (30,8% T; 2%Cbis)  4X Running Gel Buffer (1,5 M Tris HCl; pH 8,8)  4X Stacking Gel Buffer (0,5 M Tris HCl; pH 6,8)  SDS 10%  Ammonium Persulfate 10%  2X Treatment Buffer (0,125 M Tris HCl; 4% SDS; 20% v/v Glycerol; 0,2 M DTT; 0,02% Bromophenol Blue; pH 6,8)  Tank Buffer (0,025 M Tris HCl; 0,1% SDS; 0,192 M Glycine; pH 8,3)  Thang protein chuẩn Low Range (19,8 – 108,5 kDa) (Bio–rad) 3.2.1.3 Các dung dịch gốc để nhuộm gel  Dung dịch nhuộm (0,025% Coomassie Brillant Blue R250; 40% methanol; 7% acetic acid)  Dung dịch giải nhuộm I (40% methanol; 7% acetic acid)  Dung dịch giải nhuộm II (5% methanol, 7% acetic acid) 3.2.1.4 Các dung dịch gốc để thực hiện Western Blotting  Towbin transfer buffer (25mM Tris, 192mM glycine, 20%MeOH, 0,1%SDS) 17 17 - Các dung dịch để phát hiện bằng miễn dịch  Phosphate buffer saline (PBS): 10mM sodium phosphate; 0,9% NaCl  Tween PBS (TPBS)  Tris buffer saline (TBS): 100mM Tris/HCl ; 0,9% NaCl  Blocking buffer: Tween tris buffer saline (TTBS); TTBS có 5% skim milk - Các dung dịch cho hệ thống sinh màu  Peroxidase assay buffer  DAB  CoCl2  Hydrogen peroxidase 30% 3.2.1.5 Các dung dịch để thực hiện Dot Blot - Đệm rửa (A1): 10 mM Na2 H PO4; pH 7,2; 150 mM NaCl - Đệm rửa (A2): 0,05% Tween 20 trong dung dịch A 1 - Dung dịch Bloking (B): 1% casein trong dung dịch A 2 - Dung dịch cơ chất và thuốc nhuộm (DAB): DAB 0,01 % /0,03% H 2O2 3.2.2 Thiết bị, dụng cụ  Bếp nhiệt khuấy từ IKAMAG  Bộ điện di nhỏ I Mudid  Bộ điện di SDS–PAGE và chuyển thẩm Power Pac Universal TM (Bio–rad)  Cân thường, cân phân tích  Máy sắc ký lọc gel (Bio–rad)  Máy lai HB–1000. Hybridize  Máy vortex VELP  Máy ly tâm thường Biofuge 13 (Heraus), máy ly tâm lạnh 4oC (Bio–rad)  Tủ lạnh –20oC, 4oC  Thiết bị hút chân không  Tủ ấm 37oC  Máy lắc  Cốc becher, ống đong, ống nghiệm, pipet, các loại micropipet, tube eppendoft, tip các loại, kẹp, kéo… 18 18 3.2.3 Vật liệu 3.2.3.1 Kháng thể - Kháng thể sơ cấp: Kháng thể đa dòng tổng hợp kháng với WSSV, IHHNV, MBV, YHV (được sản tại phòng thí nghiệm Công Nghệ Tế Bào Động Vật – Viện Sinh Học Nhiệt Đới) (K1). - Kháng thể sơ cấp: Kháng thể đa dòng đặc hiệu với RTV (được sản tại phòng thí nghiệm Công Nghệ Tế Bào Động Vât – Viện Sinh Học Nhiệt Đới) (K1). - Kháng thể thứ cấp: IgG kháng huyết thanh thỏ kháng IgY, được đánh dấu enzyme Peroxidase (K2) (A 9046 – SIGMA) 3.2.3.1 Mẫu Virus gây hội chứng đỏ đuôi thu từ tôm sú (RTV–Pm) được nhân lên trong tế bào côn trùng Sf9. Virus gây hội chứng đỏ đuôi thu từ tôm thẻ chân trắng (RTV-Pv) được nhân lên trong tế bào côn trùng Sf9 Dịch nuôi cấy tế bào côn trùng Sf9. Bảng 3.1: Các mẫu sử dụng Kí hiệu Nơi thu Nguồn RTV-PmLA Long An Tôm sú RTV-PmLA (SLT) Long An Tôm sú RTV-PmCG Cần Giờ Tôm sú RTV-Pv M Chợ HCM Tôm TCT DTB Sf9 3.3 Phƣơng pháp 3.3.1 Phƣơng pháp SDS–PAGE 3.3.1.1 Nguyên tắc SDS Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS–PAGE) là phương pháp điện di protein đứng để phân tách được các thành phần protein theo trong lượng phân tử. Nguyên tắc hoạt động của phương pháp này là: Gel polyacrylamide là lưới gel hình thành do các sợi polymer của acrylamide (polyacrylamide) liên kết lại với nhau bằng các cầu nối đồng hóa trị (khác với lưới gel agarose là sự liên kết các sợi polymer phân tử đường bằng các cầu nối không đồng hoá 19 19 trị). Gel polyacrylamide được pha từ hai thành phần chính là acrylamide và biacrylamide. Các sợi polyacrylamide được hình thành nhờ tác nhân hóa học hay tác nhân quang học. o Có hai tác nhân hóa học cần thiết đó là ammonium persulfate làm vai trò chất peroxide khởi động (initiator peroxide), và quaternary amine, N.N.N’.N’- tetramethylethylenediamine (TEMED) làm chất xúc tác. o Tác nhân quang học là ánh sáng UV bước sóng dài phối hợp với riboflavin làm tác nhân khởi động, và TEMED làm tác nhân xúc tác. Sự hình thành polyacrylamide để tạo lưới gel là một quá trình có sinh nhiệt. Do vậy, cần phải tối ưu hàm lượng tác nhân khởi động và tác nhân xúc tác để quá trình hoàn tất không nhanh quá, mà trong vòng 20 đến 60 phút là vừa. Nhờ Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) hoạt động như một chất tẩy mà làm biến tính được protein bằng cách bọc quanh phân tử protein, vì vậy đã tạo thành một lớp bọc điện tích âm chung quanh phân tử protein. Phân tử protein lúc này trở thành dạng que và mang điện tích âm nhiều hay ít tùy thuộc vào chiều dài (hay trọng lượng phân tử) của nó. Đây là động lực chính để các protein được phân giải theo trọng lượng phân tử của chúng khi điện di trong gel. Có hai hệ thống điện di: Hệ thống đệm liên tục và hệ thống đệm không liên tục. Hệ thống đệm không liên tục cho độ phân giải tốt hơn nhiều lần so với hệ thống đệm liên tục. Hiện nay, SDS–PAGE thường dùng hệ thống đệm không liên tục và phổ biến nhất là hệ thống Laemmli (Laemmli, 1970), biến thể từ hệ thống của Ornstein (1964) và Davis (1964). Trong hệ thống này, gel polyacrylamide được đổ thành hai lớp. Lớp ở trên có kích thước lưới gel lớn và không hạn chế, được gọi là lớp stacking gel. Lớp ở dưới là lớp gel để phân tách các thành phần protein chạy điện di, được gọi là running gel. Hai lớp gel này được pha với hai dung dịch đệm khác nhau về nồng độ muối đệm cũng như pH. Dung dịch điện di cũng được pha bằng một dung dịch đệm khác, gọi là tank buffer. Trong hệ thống đệm không liên tục này, khi bắt đầu điện di, các ion và thành phần protein di chuyển trước hết vào lớp stacking gel. Các thành phần protein tập trung thành một lớp mỏng giữa các ion dẫn đầu (leading ion) và các ion đi sau (trailing ion), và lớp mỏng protein này được di chuyển dần đến để tiếp cận lớp running gel. 20 20 Chính nhờ vậy mà các thành phần protein được phân giải rất tốt khi di chuyển trong running gel. 3.3.1.2 Phƣơng pháp tiến hành A. Đổ gel, chuẩn bị buồng điện di 1. Lắp ráp các khuôn đổ gel theo đúng sự hướng dẫn của nhà cung cấp. 2. Pha dung dịch running gel 12,5%. 3. Trong khi đợi running gel trùng hợp pha dung dịch stacking gel 4% acrylamide. Khi running gel trùng hợp hoàn toàn, cho tiếp vào khuôn stacking gel cho đến khi gần đầy khuôn. Cắm lược vào, để yên 30 – 60 phút. 4. Sau khi stacking gel đã trùng hợp hoàn toàn, rút lược nhẹ nhàng ra khỏi gel, tránh làm lệch gel giữa các răng lược. Rửa sạch các giếng gel bằng tank buffer. Ráp khuôn gel vào buồng điện di. Đổ đầy tank buffer vào hai máng trên và dưới của buồng điện di. Chuẩn bị điện di. B. Chuẩn bị mẫu để điện di 1. Mẫu nhận trực tiếp từ phòng Công Nghệ Tế Bào Động Vật – Viện Sinh Học Nhiệt Đới. 2. Trong một tube Eppendorf, trộn một thể tích (V) mẫu protein với một thể tích (V) 2X Treatment buffer. Đặt vào nồi đun cách thủy đang sôi để trong 2 phút. Mẫu sau khi chuẩn bị xong nên giữ trong đá bào cho đến khi thực hiện thí nghiệm. 3. Dùng pipette với đầu tip (cone) nhỏ, cho mẫu từ từ vào giếng gel. Luôn luôn để một giếng chứa thang protein chuẩn. C. Thực hiện điện di a) Đậy nắp máng điện di. Nối hai điện cực vào bộ cấp điện. b) Bật điện bộ nguồn. Chỉnh dòng điện 100 mA. c) Quan sát sự di chuyển của vạch màu trong gel điện di, nếu vạch màu chạm đáy gel, tắt bộ điện nguồn. Quá trình điện di đã hoàn tất. d) Đổ bỏ dung dịch điện di. Gở khuôn gel ra máng. Cẩn thận gở tách gel ra khỏi khuôn gel để tiến hành nhuộm hay blotting. 21 21 D. Nhuộm gel đã điện di 1. Cho gel vào khay nhuộm, đổ vào khay thuốc nhuộm Coomassie Blue cho ngập gel. Lắc đều và chậm trên máy lắc có xoay tròn (rotary shaker) trong 4 giờ hay qua đêm. 2. Thay thuốc nhuộm bằng dung dịch giải nhuộm I (Destaining solution I). Lắc tiếp trong 30 phút. 3. Thay dung dịch giải nhuộm I (Destaining solution I) bằng dung dịch giải nhuộm II (Destaining solution II). 4. Giữ gel trong dung dịch giải nhuộm II (Destaining solution II) cho đến khi chụp hình hay làm khô gel. Để tránh cho gel khỏi bị nứt, thêm vào dung dịch glycero l 1%. 3.3.2 Phƣơng pháp Western Blot 3.3.2.1 Nguyên tắc Western blotting và immunodetection là quá trình chuyển các band điện di từ gel SDS-PAGE sang màng nitrocelluse rồi sau đó dùng kháng thể đặc hiệu để phát hiện band protein đặc hiệu đã được chuyển lên màng. Hình 3.1: Các bước thực hiện Western Blot 22 22 Trong bước Western blotting, các band điện di từ gel được chuyển lên màng nitrocellulose bằng phương pháp sau:  Trong phương pháp sử dụng buồng (tank method): áp gel điện di lên trên màng nitrocellulose rồi cho chúng vào giữa hai tờ giấy thấm dày và vào giữa lớp nylon bọt mềm. Kẹp tất cả vào giữa hai khung lưới (cassette) rồi đặt vào buồng thấm có sẵn dung dịch đệm sao cho màng nitrocellulose thì ở gần lưới điện cực [+], còn gel điện di thì ở gần lưới điện cực [-]. Hình 3.2: Cách lắp ráp gel và màng nitrocellulose Khi áp điện thế vào giữa hai điện cực, các band protein trên gel điện di sẽ chịu tác động của lực điện trường để di chuyển về cực [+], nhờ vậy được chuyển rồi thấm lên màng nitrocellulose. Sau khi blotting, các band điện di đã được chuyển lên màng nitrocellulose và phát hiện theo nguyên tắc miễn dịch. Tiến trình này gồm các bước:  Trước hết, ủ màng với kháng thể đặc hiệu (kháng thể sơ cấp) cho protein muốn tìm, sau đó rửa sạch kháng thể thừa.  Phát hiện protein-kháng thể đặc hiệu bằng cộng hợp là kháng thể thứ cấp (secondary antibodies) gắn đặc hiệu với kháng thể sơ cấp. Cộng hợp này được gắn enzyme peroxidase (Horse radish peroxidase–HRPO) hay alkaline phosphatase (AP). Thông thường là alkaline phosphatase. Cơ chất sinh màu dùng cho cộng hợp alkaline phosphatase là hệ thống BCIP/NBT phát triển bởi Harlow và Lane (1998). Cơ chất cho cộng hợp peroxidase là hệ thống DAB/CoCl2. + _ Màng nitrocellulose Nylon bọt mềm Giấy thấm dày Gel điện di Tank method 23 23 3.3.2.2 Phƣơng pháp tiến hành A. Western Blotting chuyển band điện di từ gel lên màng nitrocellulose o Phƣơng pháp sử dụng buồng (tank method) 1. Tách bỏ phần stacking gel ra khỏi running gel. Ngâm running gel trong Towbin transfer buffer trong 5 – 15 phút để cân bằng ion. 2. Ứng với mỗi gel, cắt giấy thấm và màng nitrocellulose cho vừa với cassette. 3. Làm ướt màng nitrocellulose bằng cách thả dần vào trong khay nước cất trong 2 – 3 phút. 4. Đặt gel lên màng rồi cho vào giữa hai tờ giấy thấm dày đã cắt ở bước 2. Sau đó kẹp chúng vào giữa hai tấm bọc nylon mềm (sponge) và kẹp vào cassette. Tất cả các thao tác này đều phải thực hiện trong một khay chứa Towbin transfer buffer. 5. Dùng một pipette thủy tinh lăn lên trên để đuổi bỏ bọt khí (nếu có) giữa các lớp. 6. Cho dung dịch Towbin transfer buffer vào buồng để ngập hai hai lưới điện cực. Cho cassette đã chuẩn bị ở bước 4 và 5 vào buồng, chú ý đặt mặt có màng nitrocellulose gần lưới điện cực [+]. Các bước làm được trình bày như hình trên. 7. Đặt buồng lên trên máy khuấy từ. Nối hệ thống làm lạnh vào buồng. Bật máy quay từ để làm lạnh dung dịch đệm trong quá trình chuyển band. 8. Nối buồng với bộ cấp năng. Bật điện bộ cấp năng và điều chỉnh điện thế 50V. 9. Sau khi hoàn tất chuyển band, chuyển điện thế về zero, tắt nguồn điện. 10. Tháo cassette và lấy màng ra khỏi hệ thống. 11. Màng nitrocellulose này sẽ được đưa vào qui trình phát hiện bằng phản ứng miễn dịch. B. Phát hiện băng protein đặc hiệu bằng phản ứng miễn dịch 12. Ủ màng trong 100ml dung dịch TTBS hoặc TTBS có chứa 5% skim milk (blocking buffer) trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng hay qua đêm ở 4oC. 13. Đổ bỏ dịch này, rửa 3 lần trong 10 phút với TTBS. Tiếp tục ủ màng với TTBS có pha kháng thể đặc hiệu (primary antibody) ở độ pha loãng 1/5000. Thời gian ủ là 60 phút ở 37o C. 14. Rửa màng 3 lần trong 10 phút bằng TTBS 15. Ủ tiếp màng trong dung dịch TTBS có pha kháng thể cộng hợp ở nồng độ 1/50 000. Thời gian ủ là 60 phút ở 37o C. 24 24 16. Rửa màng 3 lần trong 10 phút bằng TTBS. Sau bước này, tiến hành quá trình sinh màu. 17. Cho màng vào dung dịch hiện màu (Pha dung dịch hiện màu bằng cách cho 1 mg DAB vào 4 ml PBS, trộn đều. Lọc qua giấy lọc. Sau đó cho 120 µl dung dịch CoCl2 1% vào dịch lọc trên. Tiếp tục cho 3µl H2O2 vào dịch mới pha. ). Ủ trong tối trong 5 – 30 phút cho đến khi màu xanh nâu của các band đặc hiệu hiện rõ. 18. Rửa màng nhiều lần với nước cất. Chụp hình ngay. Nếu muốn lưu lại thì để khô rồi gói trong giấy bạc. 25 25 Sơ đồ 3.1: Sơ đồ phương pháp SDS–PAGE và Western Blot Mẫu được phân đoạn bằng điện di trên gel polyacrylamide 12,5%. (gồm 2 gel) Nhuộm với thuốc nhuộm Coomassie Blue. Chuyển thẩm qua màng nitrocellulose. Rửa lần 1 bằng dung dịch giải nhuộm I (Destaining solution I.) Rửa lần 2 bằng dung dịch giải nhuộm II (Destaining solution II ) Chụp hình Blocking bằng TTBS hoặc TTBS có chứa 5% skim milk. Ủ kháng nguyên mục tiêu trên màng với kháng thể sơ cấp Rửa Ủ với kháng thể thứ cấp có gắn enzyme peroxidase. Rửa Hiện màu Chụp hình 26 26 3.3.3. Gây nhiễm thực nghiệm cho tôm sú (Penaeus monodon) và tôm thẻ (Penaeus vannamei) bằng RTV đƣợc nhân lên trong tế bào Sf9. A. Nuôi tôm trong phòng thí nghiệm  Môi trường nuôi tôm: * Nhiệt độ: 28 – 300C * pH: 7,8 – 8,5 * Độ mặn: 15 – 20‰ * Sục khí liên tục  Cho tôm ăn: * Cá hấp xay nhỏ và lòng đỏ trứng gà * Ngày 3 buổi: 8h, 13h và 18h * Lượng thức ăn bằng 10% trọng lượng cơ thể tôm/ngày  Vệ sinh bể: * Vào buổi sáng và chiểu tối * Hút loại bỏ chất cặn lơ lửng B. Thí nghiệm gây nhiễm thực nghiệm Tôm trước khi thí nghiệm được chẩn đoán bệnh bằng phương pháp Dot Blot cho chỉ thị bệnh âm tính (phần 4.4.1và 4.4.2). Ghi nhận số tôm sống hàng ngày sau khi gây nhiễm. Tôm chết trong nghiệm thức gây nhiễm được kiểm tra lại bằng phương pháp Dot Blot cho chỉ thị dương tính (phần 4.4.3 và 4.4.4).  Thí nghiệm 1: Gây nhiễm thực nghiệm đối với tôm thẻ. Tôm 35 – 40 ngày tuổi ở Hồ Cốc – Vũng Tàu. Chọn tôm khoẻ và đồng đều. Nuôi ổn định trong phòng thí nghiệm 7 ngày. Thí nghiệm được chia làm 3 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức có 8 con: * Nghiệm thức 1 (NT1): Đối chứng - không gây nhiễm. * Nghiệm thức 2 (NT2): Sử dụng dịch tế bào nhiễm RTV-Pmon từ tôm sú (RTVPmoLA): 50 l virus + cá hấp. Cho tôm ăn hết trong vòng 1 ngày. Sau 1 tuần gây nhiễm thêm 1 lần nữa. 27 27 * Nghiệm thức 3 (NT3): Sử dụng dịch tế bào nhiễm RTV-Pvan từ tôm TCT (RTV- PvanM): 50 l virus + cá hấp. Cho tôm ăn hết trong vòng 1 ngày. Sau 1 tuần gây nhiễm thêm 1 lần nữa.  Thí nghiệm 2: Gây nhiễm thực nghiệm đối với tôm sú giống. Tôm giống 12 ngày tuổi mua ở Cần Giuộc – Long An. Chọn tôm khoẻ và đồng đều. Nuôi ổn định trong phòng thí nghiệm 10 ngày. Thí nghiệm được chia làm 3 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức có 70 con: * Nghiệm thức 1 (NT1): Đối chứng – không gây nhiễm. * Nghiệm thức 2 (NT2): Sử dụng dịch tế bào nhiễm RTV-Pm từ tôm sú (RTVPmoLA): 50 l virus +100 mg lòng đỏ trứng, để khô ở -20oC. Cho tôm ăn hết trong vòng 1 ngày. * Nghiệm thức 3 (NT3): sử dụng dịch tế bào nhiễm RTV-Pv từ tôm TCT (RTV- PvanM): 50 l virus +100 mg lòng đỏ trứng để khô ở -20oC. Cho tôm ăn hết trong vòng 1 ngày. 3.3.4 Phƣơng pháp Dot Blot 3.3.4.1 Nguyên tắc Protein được đưa trực tiếp lên giấy lọc. Sau đó ủ với kháng thể sơ cấp, đến kháng thể thứ cấp và cho cơ chất tạo màu vào. Cuối cùng là so màu để đánh giá mức độ nhiễm bệnh. 3.3.4.2 Phƣơng pháp tiến hành: a) Sử dụng 20 µl dịch tế bào nhiễm virus hoặc dịch nghiền đồng thể (đã được ly tâm hoặc lọc qua giấy lọc) từ mẫu tôm nghi nhiễm bệnh đưa lên màng. Để yên khoảng 10 phút cho màng thấm khô. b) Chuyển màng vào dung dịch A2, lắc nhẹ trên máy lắc trong 15 phút. Thay dịch rửa và lặp lại thêm hai lần tiếp. c) Chuẩn bị dung dịch bloking ngay trước khi dùng. Ủ màng trong dung dịch bloking ít nhất 60 phút ở 37oC. Rửa màng 1 lần với dung dịch A2 và 2 lần với dung dịch A1 trên máy lắc. d) Chuẩn bị dung dịch K1 ngay trước khi dùng. Ủ màng trong dung dịch K1 trong 60 phút ở 37oC. Rửa màng như ở bước trên. 28 28 e) Chuẩn bị dung dịch K2 ngay trước khi dùng. Ủ màng trong dung dịch K2 trong 60 phút ở 37oC. Rửa màng như ở bước trên. f) Chuẩn bị dung dịch DAB ngay trước khi dùng. Ủ màng trong dung dịch DAB ở 37oC cho tới khi tín hiệu màu xanh xuất hiện trên màng. Ngừng phản ứng bằng cách rửa màng ba lần với dung dịch A1. Đánh giá kết quả ngay khi màng còn ở trong dung dịch rửa hoặc khi màng đã được lấy ra và làm khô ở nhiệt độ phòng. Cường độ màu trên màng phản ánh mức độ bệnh. Hình 3.3: Sơ đồ hệ thống chẩn đoán miễn dịch (Oberfelder, 1989) (nguồn: Oberfelder, 1989; trích dẫn bởi Văn Thị Hạnh, 2001) 3.3.5 Phƣơng pháp sắc ký 3.3.5.1 Nguyên tắc Sắc ký gel lọc (còn gọi là sắc ký rây phân tử, sắc ký gel, sắc ký thẩm thấu gel, sắc ký gel thâm nhập…) là một dạng sắc ký mới nhưng có khả năng lớn để phân tách, xác định kích thước và trọng lượng phân tử của các hợp chất cao phân tử. M a øn g N i t r o c e l l u l o s e P r o t e i n k h a ùn g n g u y e ân M a øn g N i t r o c e l l u l o s e P r o t e i n k h o a ù K h a ùn g t h e å ñ a ëc h i e äu M a øn g N i t r o c e l l u l o s e M a øn g N i t r o c e l l u l o s e K h a ùn g t h e å t h ö ù c a áp ñ a ùn h d a áu e n z y m e M a øn g N i t r o c e l l u l o s e S a ûn p h a åm C ô c h a át Kháng thể sơ cấp bắt cặp đặc hiệu với kháng nguyên trên màng, tạo phức kháng nguyên – kháng thể đặc hiệu Protein kháng nguyên được đưa lên màng Phần màng không gắn kháng nguyên được trám bằng protein Casein Kháng thể thứ cấp gắn enzyme kết hợp với phức kháng nguyên - kháng thể đặc hiệu Enzyme phân hủy cơ chất, tạo phức màu trên màng. Cường độ màu phản ánh nồng độ enzyme liên quan đến protein đưa vào 29 29 Phương pháp này chủ yếu dựa trên khả năng khác nhau của các phân tử chất tan thẩm thấu vào khung gel hoặc chui qua lỗ của các rây phân tử tuỳ theo kích thước và trọng lượng phân tử. Nghĩa là dựa trên sự phân bố của chất tan giữa dung môi tự do (pha động) và dung môi nằm trong các hốc của các vật xốp (pha tĩnh). Mức độ thâm nhập của các phân tử chất tan chủ yếu phụ thuộc vào kích thước lỗ và cấu trúc của chúng. Các đại phân tử có kích thước lớn hơn kích thước lỗ không thể thâm nhập vào các lỗ, các hốc, chúng chỉ có thể khuếch tán vào khe hở giữa các hạt rắn xốp và do đó bị rửa ra khỏi cột rất sớm. Các phân tử có kích thước nhỏ hơn kích thước các lỗ có khả năng thâm nhập vào lỗ. Khi dòng pha động đi qua, các phân tử đó lại ra khỏi các lỗ và di chuyển cùng pha động. 3.3.5.2. Phƣơng pháp tiến hành 1. Chuẩn bị gel Gel sử dụng có khả năng phân tách các protein trong khoảng 5000 – 100.000 kDa Dùng 1 cốc thủy tinh, cân 1lượng gel khô thích hợp (8,5 g gel khô) (dựa vào tỉ lệ 12 ml dung dịch đệm/1g gel khô). Sau đó cho thêm 200 ml dung dịch đệm vào rồi để yên trong 12 giờ để gel trương nở hoàn toàn. Hút bỏ dịch trên, thêm 2 lần thể tích dung dịch đệm để rửa gel, lập lại khoảng 4 lần. 2. Nhồi cột Ở đây ta dùng cột có đường kính 2 cm, cao 50 cm. Đổ gel vào cột sắc ký để yên khoảng 24 giờ để gel ổn định trong cột. Sau đó rửa cột bằng đệm trong 2 giờ. 3. Đưa mẫu vào cột Thực hiện sắc ký trên các dịch protein. Đưa mẫu vào cột cùng với dòng dung môi vì đưa mẫu như vậy không làm xáo trộn gel nhồi trong cột và tránh tạo bọt khí. Đưa mẫu vào thời điểm dung môi hạ xuống ngang bề mặt cột gel, để mẫu ngấm xuống thì đặt ống nghiệm bắt đầu hứng, mỗi ống nghiệm hứng 2 ml dịch lọc, tốc độ chảy 0,14 ml/phút. 4. Lượng mẫu đưa vào cột Lượng mẫu đưa vào cột phụ thuộc độ nhạy của bộ phận phát hiện mẫu, kích thước lỗ của gel, nồng độ mẫu có thể từ 2 – 100mg/ml. Thể tích mẫu đưa vào cột không quá 2% thể tích cột. 5. Thu mẫu 30 30 Để thu mẫu, dùng máy thu mẫu phân đoạn tự động gồm 80 ống nghiệm được sắp xếp theo vòng tròn. Dung dịch chảy ra khỏi cột được hứng vào ống nghiệm và khi đủ 2 ml máy sẽ di chuyển sang ống khác. Mẫu thu được trong các ống nghiệm sẽ được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo. 31 31 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả SDS – PAGE Hình 4.1: Kết quả SDS – PAGE Giếng 1: Thang protein chuẩn Low Range Giếng 2: dịch tế bào (DTB) Sf9 Giếng 3, 4: dịch siêu ly tâm tế bào nhiễm RTV từ tôm sú thu ở Long An (RTV- PmLA/SLT). Giếng 5, 6: DTB nhiễm RTV từ tôm sú thu ở Cần Giờ bị bệnh (RTV-PmCG). Giếng 7, 8: DTB nhiễm virus thu từ tôm sú Long An bị bệnh RTV (RT-PmLA). Giếng 9, 10: DTB nhiễm RTV từ tôm thẻ chân trắng (RTV-PvM). 108,5 kDa 98,7 54,6 29,5 33,5 19,8 1 2 5 6 7 a 4 9 10 8 3 51-52 kDa 40 28 17-19 108 > 108 kDa 31 33 55 24 32 32 Nhận xét Bảng 4.1: So sánh trọng lượng các protein của RTV sau khi SDS-PAGE và trọng lượng của các protein đã được công bố. Tên mẫu Các protein của TSV đã được công bố RTV-PmLA (SLT) RTV-PmLA RTV-PmCG RTV-PvM Bonami (1997) Lightner (1996) T rọ n g l ƣ ợ n g p ro te in ( k D a ) <17 <17 <17 <17 17 17 17 19 19 19 23 24 24 24 24 24 28 28 28 31 31 31 33 33 33 36,8 40 40 40 40 40 40 49 51-52 51-52 51-52 51-52 51,5 52,5 55 55 55 55 55 58 108 108 108 >108 >108 >108 Bảng 4.4 cho thấy các mẫu nhiễm virus có nhiều vạch khác so với tế bào đối chứng: 108 kD. Các mẫu nhiễm virus về cơ bản có các protein giống với các protein của TSV đã được công bố. Trong đó, protein 40 kDa có thể tương ứng với VP2 (40 kDa) là protein đặc trưng có thể sử dụng để nhận dạng các chủng TSV (Bonami,1997, Mari, 1998, Mari, 2002). Tuy vậy, để khẳng định sự có mặt của các vạch protein thuộc về virus, chúng tôi thực hiện điện di miễn dịch (Western Blot) dùng kháng thể đặc hiệu để chỉ thị các vạch protein đã được chuyển thẩm lên màng lai. 33 33 4.2. Kết quả Western Blot Hình 4.2: Kết quả Western Blot Giếng 1: Thang protein chuẩn Low Range. Giếng 2, 3: dịch siêu ly tâm tế bào nhiễm RTV từ tôm sú thu ở Long An (RTV- PmLA/SLT) Giếng 4, 5: dịch tế bào (DTB) Sf9 Giếng 6, 7: DTB nhiễm RTV từ tôm sú thu ở Cần Giờ bị bệnh (RTV-PmCG). Giếng 8: DTB nhiễm virus thu từ tôm sú Long An bị bệnh RTV (RT-PmLA) Giếng 9, 10: DTB nhiễm RTV từ tôm thẻ chân trắng (RTV-PvM). Nhận xét Kết quả cho thấy một số vạch protein từ gel điện di đã được thể hiện trên màng lai này. Đó là các protein gắn đặc hiệu với kháng thể. Kết quả xác định được một số vạch protein từ các mẫu nhiễm virus khác so với mẫu tế bào đối chứng (Bảng 4.2) 108,5 kDa 98,7 54,6 29,5 33,5 19,8 1 2 5 6 7 4 9 10 8 3 28 51-52 kDa 40 17-19 29 33 30-31 26 22 2 2 24 34 34 Bảng 4.2: So sánh trọng lượng các protein của RTV sau khi Western Bloting và trọng lượng của các protein đã được công bố. Tên mẫu Các vạch protein thu đƣợc (kDa) RTV- PmoLA/LT >108 52 51 40 RTV-PmoCG 52 51 40 có 4 vạch 29, 30-31, 33 kDa RTV-PmoLA 52 51 40 có 4 vạch 29, 30-31, 33 kDa RTV-PvanM 52 51 40 24 có 9 vạch trong khoảng 17- 29 kDa TSV đã công bố Lightner (1996), Bonami (1997) 58 55 52,5 51,5 49 40 36,8 24 23 Kết quả bảng trên cho thấy tất cả các mẫu dịch tế bào nhiễm virus gây bệnh đỏ đuôi đặc trưng ở cả tôm sú và tôm thẻ chân trắng về cơ bản có các protein giống nhau. Tuy nhiên RTV từ tôm thẻ có nhiều protein hơn từ tôm sú. Các mẫu tế bào nhiễm RTV có các protein trùng với TSV đã công bố là 52, 51 và 40 kD. Đây là các protein chính của RTV ở cả tôm sú và tôm TCT, trong đó có protein 40 kD tương ứng với VP2 (40 kDa) là protein đặc trưng có thể sử dụng để nhận dạng các chủng TSV (Bonami,1997, Mari, 1998) RTV-PmoLA/LT: Có 3 protein trọng lượng giống TSV như các tác giả đã công bố. Ngoài ra còn có thêm 2 protein có trọng lượng >108 kDa. RTV-PmoLA: Có 3 protein giống TSV như các tác giả đã công bố. Ngoài ra còn có thêm 4 protein có trọng lượng 29, 30 – 31 và 33 kDa RTV-PmoCG: Có 3 protein giống TSV như các tác giả đã công bố. Ngoài ra còn có thêm 4 protein có trọng lượng 29, 30 – 31 và 33 kDa RTV-PvanM: Có 4 protein giống TSV như các tác giả đã công bố. Ngoài ra còn có thêm 9 protein có trọng lượng 33, 31, 30, 29, 28, 26, 22, 19 và 17 kD. Sử dụng RTV ở tôm sú nhân qua tế bào làm kháng nguyên để thu kháng thể đặc hiệu dùng cho phương pháp Western Blot (Hình 4.2). Kết quả thu được các protein đặc trưng rất tách biệt ở mẫu RTV từ tôm TCT (RTV-PvM). Kết quả trên cho thấy kháng thể đặc hiệu RTV từ tôm sú đã nhận biết RTV từ tôm TCT. Như vậy có thể giả thiết rằng RTV ở tôm sú có quan hệ gần với RTV ở tôm thẻ chân trắng. 35 35 A B Để khẳng định lại các protein mà chúng tôi thu được từ kết quả điện di SDS- PAG và Western blot chính là protein của RTV, chúng tôi tiến hành gây nhiễm trở lại trên tôm thẻ thịt và tôm sú giống bằng dịch tế bào nhiễm RTV. 4.3 Kết quả thí nghiệm gây nhiễm thực nghiệm 4.3.1 Kết quả thí nghiệm gây nhiễm thực nghiệm đối với tôm thẻ Bảng 4.3: Số tôm thẻ sống sót sau ba tuần gây nhiễm Chỉ tiêu quan sát Phƣơng pháp Tổng số Số chết Số sống Tỷ lệ sống Nghiệm thức 1 / Đối chứng 8 2 6 75% Nghiệm thức 2 / RTVPmoLA 8 8 0 0% Nghiệm thức 3 / RTVPvanM 8 8 0 0% Kết quả cho thấy: - Qua bảng 4.1 có thể thấy tỉ lệ sống chết ở các nghiệm thức gây nhiễm và không gây nhiễm có sự khác biệt về mặt thống kê (P << 0,05) (Phụ lục 3) - Kết quả ở đợt thí nghiệm này cho thấy RTV có nguồn gốc từ tôm sú hay tôm TCT đều có khả năng gây nhiễm cho tôm thẻ. - Tôm ở hai bể gây nhiễm chết trong lúc lột xác, đỏ đuôi, hoại tử lan dàn từ mép đuôi quạt vào, chết liên tục trong 7 ngày (sau 2 tuần gây nhiễm) (Hình 4.4). Hình 4.3: Tôm thẻ không gây nhiễm và tôm thẻ gây nhiễm. Hình A: Tôm thẻ không gây nhiễm Hình B: Tôm thẻ gây nhiễm (sau 7 ngày gây nhiễm) 36 36 B A Hình 4.4: Tôm thẻ chết do gây nhiễm thực nghiệm với RTV. Hình A: Tôm thẻ chết trong lúc lột xác, có nhiều đốm hoại tử trên thân, đuôi đỏ Hình B: Tôm thẻ chết có biểu hiện đỏ đuôi. 4.3.2 Kết quả thí nghiệm gây nhiễm thực nghiệm đối với tôm sú Bảng 4.4: Số tôm sú sống sót sau hai tuần gây nhiễm Chỉ tiêu quan sát Phƣơng pháp Tổng số Số chết Số sống Tỷ lệ sống Nghiệm thức 1 / Đối chứng 70 24 46 66% Nghiệm thức 2 / RTVPmoLA 70 51 19 27% Nghiệm thức 3 / RTVPvanM 70 45 25 36% Kết quả cho thấy: Qua bảng 4.2 có thể thấy tỷ lệ sống chết ở các nghiệm thức gây nhiễm và không gây nhiễm có sự khác biệt về mặt thống kê (P << 0,05) (Phụ lục 3). Kết quả ở đợt thí nghiệm này cho thấy RTV có nguồn gốc từ tôm sú hay tôm TCT đều có khả năng gây nhiễm cho tôm sú giống. Quan sát ghi nhận được ở các thí nghiệm trên cho thấy khoảng 10 ngày sau khi gây nhiễm, phần lớn tôm chuyển màu đỏ ở đuôi quạt, vây râu và ăng ten (Hình 4.6). Sau đó xuất hiện các vết đen hoại tử và toàn thân chuyển màu hồng nhạt hoặc đỏ (Hình 4.6). Sau hai tuần gây nhiễm tôm có biểu hiện bỏ ăn, bơi lờ đờ và thường bị chết khi lột xác. Tỷ lệ chết 100% sau 24 ngày gây nhiễm. Các dấu hiệu quan sát thấy cũng tương tự như tôm bị bệnh tự nhiên: Phần đuôi đỏ hoại tử lan dần từ quạt đuôi lên các 37 37 đốt thân phía trên, vỏ thân mỏng, lỏng lẻo. Phần vây râu và ăng ten chuyển sang màu đỏ sau 10 ngày gây nhiễm (Hình 4.6). Sau 15 ngày gây nhiễm phần đuôi tôm chuyển màu đỏ đậm. Tế bào biểu mô sưng phồng. Đám hoại tử màu đen (Hình 4.7) bắt đầu xuất hiện ở quạt đuôi. Hình 4.5: Ảnh chụp hiển vi tôm sú đối chứng nuôi trong phòng thí nghiệm (x40) Hình 4.6: Ảnh chụp hiển vi tôm sú nhiễm thực nghiệm với dịch tế bào nhiễm RTV (10 ngày sau gây nhiễm) (x40) Hình 4.7: Ảnh chụp hiển vi phần đuôi tôm sú nhiễm thực nghiệm với dịch tế bào nhiễm RTV (15 ngày sau gây nhiễm) 38 38 Hình 4.8: Tôm sú giống gây nhiễm nhiễm thực nghiệm với RTV (15 ngày sau gây nhiễm) Phần quạt đuôi và ăng ten chuyển màu đỏ sớm nhất, sau đó phần đỏ lan dần toàn thân và bắt đầu xuất hiện đốm đen hoại tử ở phần quạt đuôi của tôm. Nhận xét: Tôm gây nhiễm nhân tạo với RTV có nguồn gốc từ tôm sú hay tôm thẻ đều chết với dấu hiệu lâm sàng phần đuôi đỏ hoại tử lan dần từ mép đuôi quạt vào. Tôm chết trong khi lột xác. Qua 2 lần thí nghiệm cho thấy RTV nhân lên trong tế bào có nguồn gốc từ tôm sú hay tôm TCT đều có khả năng gây nhiễm cho tôm sú giống và tôm thẻ thịt. 4.4. Kết quả Dot Blot chỉ thị virus Hình 4.9: Chỉ thị mức độ bệnh theo phương pháp Dot Blot 39 39 4.4.1. Kết quả kiểm tra tôm thẻ trƣớc khi thí nghiệm bằng phƣơng pháp Dot Blot với kháng thể tổng hợp. Hình 4.10: Kết quả kiểm tra tôm thẻ trước khi gây nhiễm. Nhận xét: Kết quả âm tính 4.4.2. Kết quả kiểm tra tôm sú giống trƣớc khi thí nghiệm bằng phƣơng pháp Dot Blot với kháng thể tổng hợp Hình 4.11: Kết quả kiểm tra tôm sú giống trước khi gây nhiễm. Nhận xét: Kết quả âm tính 4.4.3. Kết quả kiểm tra tôm thẻ sau khi thí nghiệm bằng phƣơng pháp Dot blot với kháng thể đặc hiệu RTV Mức độ bệnh: - Mức độ bệnh: ++++ Mức độ bệnh: ++ Hình 4.12: Kết quả kiểm tra tôm thẻ sau khi gây nhiễm. 40 40 Nhận xét: NT 1: kết quả âm tính NT 2: kết quả dương tính với mức độ nhiễm (++++) NT 3: kết quả dương tính với mức độ nhiễm (++) 4.4.4 Kết quả kiểm tra tôm sú giống sau khi thí nghiệm bằng phƣơng pháp Dot blot với kháng thể đặc hiệu RTV Mức độ bệnh: - Mức độ bệnh: ++++ Mức độ bệnh: +++ Hình 4.13: Kết quả kiểm tra tôm sú giống sau khi gây nhiễm. Nhận xét: NT 1: kết quả âm tính NT 2: kết quả dương tính với mức độ nhiễm (++++) NT 3: kết quả dương tính với mức độ nhiễm (+++) Như vậy từ kết quả gây nhiễm thực nghiệm trên tôm thẻ thịt và tôm sú, kết quả Dot Blot khẳng định rằng các protein mà chúng tôi đã xác định từ kết quả SDS-PAGE và Western Blot hoàn toàn là protein của RTV. Bước tiếp theo là chúng tôi thăm dò khả năng phân tách các thành phần protein của RTV bằng sắc ký lọc gel với hy vọng là thu được từng loại protein tinh sạch để phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo. 41 41 4.5 Kết quả sắc ký lọc gel Hình 4.14: Kết quả dịch tế bào (DTB) Sf9 Hình 4.15: Kết quả DTB nhiễm virus từ tôm sú Long An bị bệnh RTV (RT-PmLA) 42 42 Hình 4.16: Kết quả DTB nhiễm RTV từ tôm thẻ chân trắng bị bệnh RTV (RTV-PvM)  Nhận xét Sau khi chạy 3 mẫu: - Dịch tế bào côn trùng Sf9 không nhiễm RTV thu được 2 peak. - Virus gây hội chứng đỏ đuôi thu từ tôm sú (RTV-Pm) được nhân lên trong dịch tế bào côn trùng Sf9 thu được 2 peak lớn và 1 peak rất nhỏ ở ở phút thứ 540. - Virus gây hội chứng đỏ đuôi thu từ tôm thẻ chân trắng (RTV-Pv) được nhân lên trong dịch tế bào côn trùng Sf9 thu được 2 peak lớn và 1 peak rất nhỏ ở phút thứ 360. Chúng tôi nhận thấy 2 mẫu nhiễm RTV tuy có thêm 1 peak so với mẫu đối chứng nhưng chưa đủ tạo thành tín hiệu peak rõ ràng. Cả hai mẫu nhiễm RTV có 2 peak hoàn toàn giống nhau và giống với đối chứng, điều đó cho thấy 2 peak đó là của protein từ dịch tế bào côn trùng Sf9. Như vậy theo chúng tôi phương pháp sắc ký lọc gel khó có thể áp dụng vào việc tinh sạch các protein của RTV, vì kích thước lỗ của gel có thể cho ra đồng thời nhiều loại protein có trọng lượng phân tử gần nhau, mặt khác hàm lượng mỗi loại protein của RTV quá thấp nên nó khó có thể tạo thành tín hiệu peak. 43 43 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận 1. RTV được nhân lên trong tế bào côn trùng Sf9 có nguồn gốc từ tôm sú hay tôm TCT đều có khả năng gây nhiễm cho tôm sú giống và tôm thẻ thịt ngày tuổi. 2. RTV của tôm sú và tôm thẻ có các protein đặc trưng giống TSV ở tôm TCT là 52, 51 và 40 kD. 3. Có thể RTV từ tôm sú là một loại virus mới có liên quan gần với TSV hoặc là TSV đã biến thể để thích nghi với vật chủ mới là tôm sú. 5.2 Đề nghị 1. Hội chứng đỏ đuôi ở tôm sú và tôm thẻ chân trắng là bệnh do virus gây ra. Vì vậy cần khuyến cáo người sản xuất lưu ý hiện tượng bệnh này để tránh lây lan thành dịch bệnh. 2. RTV có thể là virus mới, có khả năng gây bệnh cho nhiều đối tượng tôm nuôi. Vì vậy cần tiếp tục nghiên cứu định danh loại virus này và khảo sát tình hình phát triển bệnh do virus này gây ra trên đối tượng tôm sú và tôm thẻ chân trắng. 44 44 PHẦN 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Phạm Thị Quang Anh, 2003. Khảo sát đặc trưng protein của một số virus gây bệnh phổ biến trên tôm sú (Penaeus Monodon). Khóa luận tốt nghiệp Cử Nhân Công Nghệ Sinh Học, Đại Học Khoa Học Tự Nhiên 2. Lâm Thị Kim Châu, Văn Đức Chín Ngô Đại Nghiệp, 2004. Giáo trình thực tập sinh hóa lớn. Đại Học Khoa Học Tự Nhiên. 3. Lê Phúc Chiến, 2005. Khảo sát đặc tính kháng virus đốm trắng WSSV (White spot syndrome virus) trên tôm sú (Penaenus monodon) của kháng thể lòng đỏ trứng gà-ASV. Khoá luận tốt nghiệp Cử Nhân Công Nghệ Sinh Học, Đại Học Khoa Học Tự Nhiên. 4. Văn Thị Hạnh, Nguyễn Văn Uyển, Nguyễn Thu Hằng, Nguyễn Trọng Bình, 2001. Phương pháp chẩn đoán bệnh virus hội chứng đốm trắng trên tôm dùng phản ứng miễn dịch trên màng nitrocellulose. Bài đã gửi đăng Tạp chí Sinh học, năm 2001. 5. Văn Thị Hạnh, Nguyễn Văn Uyển, Nguyễn Thị Thu Hằng, Nguyễn Thị Hồng Vân, 2003. Phương pháp enzyme miễn dịch dùng màng nitrocellulose chỉ thị virus gây bệnh ở tôm sú. Báo cáo khoa học Hội Nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, NXB Khoa học và Kỹ Thuật, Hà Nội , tr 603 – 606. 6. Nguyễn Thị Lang, 2002. Phương pháp cơ bản trong nghiên cứu công nghệ sinh học. Nhà xuất bản Nông Nghiệp TPHCM. 7. Chalos Limsuwan, Nguyễn Văn Hảo, 2005. Một số định hướng chiến lược cho nghề nuôi tôm sú trong tình hình hiện nay. Thông tin hội thảo kỹ thuật nuôi tôm sú NXB Nông Nghiệp Tp. HCM. 8. Nguyễn Ngọc Kiểng, 1996. Thống kê sinh học trong nghiên cứu khoa học. Nhà xuất bản giáo dục. 9. Nguyễn Văn Thanh, 2003. Một nghề còn lắm bất trắc: Ngành nuôi tôm Việt Nam - Tác động & cải thiện. Nhà xuất bản Chính Trị Quốc Gia Hà Nội. 10. Phạm Hùng Vân, 2004. Cẩm nang thực hành SDS-PAGE và Western Blotting- Immunodetection. Bộ y tế, Trường Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh. 45 45 11. Nguyễn Hoàng Uyên, 2005. Điều tra nghiên cứu bệnh Taura và một số bệnh thường gặp ở tôm chân trắng (Penaeus vannamei) nuôi tại Việt Nam và khả năng lây nhiễm. Báo cáo đề tài KHCN cấp Bộ TS. 12. Thông tin Khoa học Công nghệ - Kinh tế Thủy sản tháng 3/2005, 04/2005. 13. VietNamNet 03/10/04/ Q:\ khoa giao\NKY\DU PHONG\tom the chan trang.doc). TÀI LIỆU TIẾNG ANH 14. Anne Marie Moore, Jeffrey M. Lotz, Shiao Y. Wang, Acacia Alcivar-Warren và Arun K. Dhar, 2000. Detection of Taura syndrome virus using reverse transcription polymerase chain reaction. World Aquaculture society. 15. Bonami JR, Hassen KW, Mari J, Poulos BT, Lightner DV, 1997. Taura syndrome of marine penaeid shrimp: characterization of the viral agent. Journal of General Virologyl 78: 313-319. 16. Brock JA, Gose RB, Lightner DV & Hasson KW, 1997. Recent developments and an overview of Taura syndrome of farmed shrimp in the Americas, In: Diseases in Asian Aquaculture III, Flegel TW &MacRae IH, eds. Fish Health Section, Asian Fisheries Society, Manila, the Philippines, 275-283. 17. Aquatic animal health code, 2003. Taura syndrome. International health standards. 18. Carlos R. Pantoja, Solangel A. Navarro, Jaime Naranjo, Donal V. Lightner and Charles P. Gerba, 2004. Nonsusceptibility of Primate Cells to Taura Syndrome Virus. University of Arizona, Tucson, Arizona, USA. Suggested citation. 19. Center for Tropical and Subtropical Aquaculture-The Oceanic Institute, 1996. Shrimp Diseases. CTSA Publication No. 121 20. Diagnostic manual for aquatic animal disease, 2000. Taura syndrome-chapter 4.1.1. International health standards. 21. Heidi S. Erickson, Martha Zarain-Herzberg, Donald V. Lightner, 2002. Detection of Taura syndrome virus (TSV) strain differences using selected diagnostic methods: diagnostic implications in penaeid shrimp. Dis Aqua Organ 52: 1 – 10. 22. Isawa, H ., Asano, S., Sahara, K., Iizuka, T. & Bando, H., 1998). Analysis of genetic information of an insect picorna-like virus, infectious flacherie virus of 46 46 silkworm: evidence for evolutionary relationships among insect, mammalian and plant picorna (-like) viruses. Archives of Virology 143, 127-143. 23. Lightner DV, Redman RM, Poulos BT, Nunan LM, Mari JL, Hasson KW, 1997. Risk of spread of penaeid shrimp viruses in the Americas by the international movement of live and frozen shrimp. J Struct Biol 120(2): 134-145 24. Lightner DV, 1996a. Epizootiology, distribution and the impact on international trade of two penaeid shrimp viruses in the Americas. Rev Sci Tech 15(2):579-601. 25. Lightner DV, 1996b. “Taura syndrome of maine penaeid shrimp: Development and application of molecular detection methods of TSV from domestic shrimp aquaculture and evaluation of challenge studies in Gulf of Mexico Species. N OAA fisheries. 26. Lightner DV, Redman RM, Hasson KW, Pantoja CR, 1995. “Taura syndrome in Penaeus vannamei (Crustacea: Decapoda): gross signs, histopathology and ultra structure. Dis Aquat Organ 21: 53-59. 27. Mari J, Poulos BT, Lightner DV, Bonami JR, 2002. Shrimp Taura syndrome virus: genomic characterization and similarity with members of the genus Cricket paralysis-like viruses. Journal of General Virology 83(Pt 4):915-26. 28. Mari J, Bonami JR, Lightner DV, 1998. Taura syndrome of penaeid shrimp: cloning of viral genome fragments and development of specific gene probes. Dis Aquat Organ 33(1):11-7. 29. M. A. Mayo, 2005. Changes to virus taxonomy 2004. Arch Virol.150, 189-198 30. Nunan LM, Poulos BT, Lightner DV, 1998. Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) used for the detection of Taura syndrome virus (TSV) in experimentally infected shrimp. Dis Aquat Organ 34(2):87-91. 31. Kathy F.J. Tang, 2005. Phylogenetic analysis of Taura syndrome virus isolates collected between 1993 and 2004 and virulence comparison between two isolates representing different genetic variants. Virus research, 112, 69-76 32. Refugio Robles-Sikisaka, Kenneth W. Hasson, Denise K. Garcia, Katherine E. Brovont, Karyn D. Cleveland, Kurt R. Klimpel and Arun K. Dhar, 2002. Genetic variation and immunohistochemical differences among geographic isolates of Taura syndrome virus of penaeid shrimp. Journal of General Virology, 83, 3123- 3130. 47 47 33. Jocelyne Mari, Bonnie T. Poulos, Donald V. Lightner and Jean-Rober, 2002. Shrimp Taura syndrome virus: genomic characterization and similarity with members of the genus Cricket paralysis-like viruses. Journal of General Virology. 34. Yun-Shiang Chang, 2004. Genetic and phenotypic variations of isolates of shrimp Taura syndrome virus found in Penaeus monodon and Metapenaeus ensis in Taiwan. Journal of General Virology, 85, 2963-2968. SÁCH 35. Donald V. Lightner. A handbook of pathology and diagnostic procedures for diseases of Penaeid shrimp. Published by THE WORLD AQUACULTURE SOCIETY. (Edited, 1996) 36. Rodney F. Boyer. Modern Experimental Biochemistry. ( Second Edited, 1992) 48 48 PHỤ LỤC 1 49 49 PHỤ LỤC 2 Danh mục pha hoá chất  Running gel 12,5%  Monomere 5,45 ml  4X running gel 3,25 ml  SDS 10% 0,13 ml  Cho nước cất vào đến 4,16 ml  Amonium persulphate 10% 65 l  TEMED 4,3 l  Stacking gel  Monomere 0,88 ml  4X stacking gel 1,66 ml  SDS 10% 66 l  Cho nước cất vào đến 4,06 ml  Amonium persulphate 10% 33,4 l  TEMED 3,3 l  Loading buffer  4X stacking gel buffer 1 ml  Glycerol 0,8 ml  10% SDS 1,6 ml  2 – Mecapto etanol 0,4 ml  0,05% Bromophenol blue 0,2 ml 2 mg  Cho nước cất vào đến 4 ml  Destaining solution I  Methanol 80 ml  Acid acetic 14 ml  Cho nước cất vào đến 200 ml  Destaining solution II  Methanol 50 ml  Acid acetic 70 ml 50 50  Cho nước cất vào đến 1 lít  TTBS  Tris 12,11 g  Cho nước cất vào đến 900 ml  Chỉnh pH 7,5  NaCl 9 g  Cho nước cất vào đến 1 lít  Tween 20 1 ml  Khuấy đều  Đệm phosphate  NaH2PO4 0,0262 g  NaHPO4 0,115 g  NaCl 0,9 g  Cho nước cất vào đến 100 ml  Thuốc nhuộm gel  Coomassie brilliant blue R250 1,125 g  Metanol 200 ml  Trộn đều  Acid acetic 35 ml  Cho nước cất vào đến 500 ml 51 51 PHỤ LỤC 3 1. Tỷ lệ sống chết của thí nghiệm 1 a. Tỷ lệ sống chết giữa NT 1 và NT 2 Summary Statistics for Contingency Tables (Page 1) -------------------------------------------------------------------- Chi-square D.F. Significance -------------------------------------------------------------------- 9.60000 1 1.94577E-3 6.66667 1 9.82327E-3 with Yates correction WARNING: Expected values in 2 cells < 5 and 0 cells < 2. With rows With columns Statistic Symmetric dependent dependent -------------------------------------------------------------------- Lambda 0.71429 0.66667 0.75000 Uncertainty Coeff. 0.56159 0.57500 0.54879 Somer's D -0.77419 -0.75000 -0.80000 b. Tỷ lệ sống chết giữa NT 1 và NT 3 Summary Statistics for Contingency Tables (Page 1) -------------------------------------------------------------------- Chi-square D.F. Significance -------------------------------------------------------------------- 9.60000 1 1.94577E-3 6.66667 1 9.82327E-3 with Yates correction WARNING: Expected values in 2 cells < 5 and 0 cells < 2. With rows With columns Statistic Symmetric dependent dependent -------------------------------------------------------------------- Lambda 0.71429 0.66667 0.75000 Uncertainty Coeff. 0.56159 0.57500 0.54879 Somer's D -0.77419 -0.75000 -0.80000 52 52 2. Tỷ lệ sống chết của thí nghiệm 2. a. Tỷ lệ sống chết giữa NT 1 và NT 2 Summary Statistics for Contingency Tables (Page 1) -------------------------------------------------------------------- Chi-square D.F. Significance -------------------------------------------------------------------- 20.9354 1 4.75042E-6 19.4133 1 1.05271E-5 with Yates correction With rows With columns Statistic Symmetric dependent dependent -------------------------------------------------------------------- Lambda 0.36296 0.33846 0.38571 Uncertainty Coeff. 0.11100 0.11121 0.11080 Somer's D -0.38670 -0.38571 -0.38769 b. Tỷ lệ sống chết giữa NT 1 và NT 3 Summary Statistics for Contingency Tables (Page 1) -------------------------------------------------------------------- Chi-square D.F. Significance -------------------------------------------------------------------- 12.6026 1 3.85220E-4 11.4309 1 7.22326E-4 with Yates correction With rows With columns Statistic Symmetric dependent dependent -------------------------------------------------------------------- Lambda 0.29496 0.28986 0.30000 Uncertainty Coeff. 0.06595 0.06596 0.06595 Somer's D -0.30003 -0.30000 -0.30006 53 53 PHỤ LỤC 4 Các dụng cụ thiết bị thực hiện kỹ thuật SDS-PAGE và Western Blotting Đang thực hiện điện di SDS-PAGE