Luận văn Khảo sát hoạt tính và tinh sạch protease từ hai chủng nấm mốc aspergillus oryzae và aspergillus kawasaki trên môi trường bán rắn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH ĐẬU THỊ KIM DUNG KHẢO SÁT HOẠT TÍNH VÀ TINH SẠCH PROTEASE TỪ HAI CHỦNG NẤM MỐC ASPERGILLUS ORYZAE VÀ ASPERGILLUS KAWASAKI TRÊN MÔI TRƢỜNG BÁN RẮN Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH VÀ TINH SẠCH PROTEASE TỪ HAI CHỦNG NẤM MỐC ASPERGILLUS ORYZAE VÀ ASPERGILLUS KAWASAKI TRÊN MÔI TRƢỜNG BÁN RẮN Luận văn kỹ sƣ Giáo viên hƣớng dẫn : Sinh viên thực hiện : TS. NGUYỄN NGỌC HẢI ĐẬU THỊ KIM DUNG PGS-TS. NGUYỄN TIẾN THẮNG Khóa : 2002 - 2006 CN. ĐỖ THỊ TUYẾN Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY SURVEYING ACTIVITY OF PROTEASE AND PURIFYING PROTEASE EXTRACTING FROM TWO FUNGAL SPECIES ASPERGILLUS ORYZAE AND ASPERGILLUS KAWASAKI ON SEMI SOLID MEDIUM Graduation thesis Major : Biotechnology Professors : Student : PhD. NGUYEN NGOC HAI ĐAU THI KIM DUNG Vice Professor-PhD. NGUYEN TIEN THANG Term : 2002 - 2006 BA. ĐO THI TUYEN HCMC, 09/2006 iv LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến : * Ban Giám hiệu trƣờng đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công nghệ sinh học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học tập tại trƣờng. * Thầy Nguyễn Ngọc Hải đã hết lòng hƣớng dẫn, giải đáp mọi thắc mắc của em trong suốt quá trình thực hiện đề tài. * Thầy Nguyễn Tiến Thắng, cô Đỗ Thị Tuyến, là cán bộ trực thuộc phòng Các Chất Có Hoạt Tính Sinh Học thuộc Viện Sinh Học Nhiệt Đới TP.HCM đã nhiệt tình hƣớng dẫn và tạo mọi điều kiện để em có thể hoàn tất khóa luận này. * Anh Nguyễn Diên Sanh, anh Nguyễn Duy Long là những cán bộ nghiên cứu thuộc Viện Sinh Học Nhiệt Đới đã hỗ trợ cũng nhƣ cung cấp cho em nhiều kiến thức xung quanh đề tài. * Các bạn lớp CNSH K28 đã động viên, giúp đỡ tôi những lúc khó khăn cũng nhƣ chia xẻ những vui buồn trong suốt thời gian học tập. * Các bạn phòng Các Chất Có Hoạt Tính Sinh Học đã giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài. * Cuối cùng con xin cảm ơn bố mẹ đã, đang và mãi mãi là chỗ dựa vững chắc cả về tinh thần lẫn vật chất cho con niềm tin và động lực bƣớc vào đời. TÓM TẮT KHÓA LUẬN Đậu Thị Kim Dung, Đại học Nông Lâm Tp.HCM. Tháng 9/2006. “KHẢO SÁT HOẠT TÍNH VÀ TINH SẠCH PROTEASE TỪ HAI CHỦNG NẤM MỐC v ASPERGILLUS ORYZAE VÀ ASPERGILLUS KAWASAKI TRÊN MÔI TRƢỜNG BÁN RẮN”. Đề tài đƣợc thực hiện từ ngày 10/2/2006 đến ngày 1/6/2006 tại Viện Sinh Học Nhiệt Đới TP.HCM. Hội đồng hƣớng dẫn : PGS-TS. NGUYỄN TIẾN THẮNG TS. NGUYỄN NGOC HẢI CN. ĐỖ THỊ TUYẾN Chế phẩm enzyme thô dạng bột của hai chủng nấm mốc Aspergillus oryzae và Aspergillus kawasaki đƣợc chiết bằng nƣớc cất, thu đƣợc dịch chiết enzyme thô. Dịch chiết thô này đƣợc tủa với muối (NH4)2SO4 ở các nồng độ (% độ bão hòa) : 50, 55, 60, 65, 70, 75 và cồn 960 ở các tỷ lệ dịch chiết enzyme : cồn là 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6 Cặn tủa thu đƣợc hòa vào dung dịch đệm và xác định hoạt tính protease nhằm tìm ra nồng độ muối và tỷ lệ cồn tối ƣu cho việc tủa protease. Từ đó khảo sát điều kiện tối ƣu cho hoạt động của protease từ dịch tủa enzyme thu đƣợc từ nồng độ muối và tỷ lệ cồn tối ƣu. Cuối cùng, dịch tủa pha trong đệm đƣợc chạy qua sắc ký lọc gel và xác định trọng lƣợng phân tử protease bằng điện di. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau :  Ở cả hai chủng, nồng độ muối 65% độ bão hòa và tỷ lệ cồn 1 : 4 là tối ƣu để tủa protease.  Protease của cả hai chủng hoạt động mạnh nhất ở pH = 7 và nhiệt độ 470C.  Hoạt tính protease của Aspergillus oryzae cao hơn hoạt tính của Aspegillus kawasaki. MỤC LỤC NỘI DUNG TRANG Bìa ..................................................................................................................................... i Trang tựa .......................................................................................................................... ii vi Lời cảm tạ ...................................................................................................................... iii Tóm tắt khóa luận ........................................................................................................... iv Mục lục ............................................................................................................................ v Danh sách các chữ viết tắt ........................................................................................... viii Danh sách các bảng ........................................................................................................ ix Danh sách các hình và đồ thị .......................................................................................... xi PHẦN 1. MỞ ĐẦU ......................................................................................................... 1 1.1 Đặt vấn đề .................................................................................................................. 1 1.2 Mục đích nghiên cứu ................................................................................................. 2 1.3 Yêu cầu ...................................................................................................................... 2 2.1 Khái quát chung về enzyme ...................................................................................... 3 2.1.1 Lƣợc sử các công trình nghiên cứu enzyme ........................................................... 3 2.1.2 Định nghĩa về enzyme ............................................................................................ 5 2.1.3 Phân loại enzyme .................................................................................................... 6 2.1.4 Hoạt tính và các yếu tố ảnh hƣởng đến vận tốc phản ứng enzyme ........................ 7 2.1.4.1 Hoạt tính enzyme ................................................................................................. 7 2.1.4.2 Các yếu tố ảnh hƣởng đến vận tốc phản ứng enzyme ......................................... 7 2.1.5 Nguồn thu nhận và vai trò của enzyme trong đời sống .......................................... 9 2.1.5.1 Nguồn thu nhận ................................................................................................... 9 2.1.5.2 Vai trò ................................................................................................................ 11 2.2 Khái quát chung về enzyme protease ...................................................................... 11 2.2.1 Định nghĩa enzyme protease ................................................................................ 11 2.2.2 Lƣợc sử phát triển các enzyme protease .............................................................. 12 2.2.2.1 Protease từ động vật .......................................................................................... 12 2.2.2.2 Protease từ thực vật ........................................................................................... 12 2.2.2.3 Protease từ vi sinh vật ........................................................................................ 13 2.2.3 Nguồn thu nhận enzyme protease......................................................................... 13 2.2.3.1 Từ động vật ........................................................................................................ 13 2.2.3.2 Từ thực vật ......................................................................................................... 13 2.2.3.3 Từ vi sinh vật ..................................................................................................... 14 2.2.4 Ứng dụng của enzyme protease ............................................................................ 14 2.3 Protease thu nhận từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae ...................................... 15 2.3.1 Đặc điểm chủng nấm mốc Aspergillus oryzae ..................................................... 15 2.3.1.1 Phân loại ........................................................................................................... 15 2.3.1.2 Đặc điểm ............................................................................................................ 15 2.4 Thu nhận enzyme protease từ phƣơng pháp nuôi cấy bề mặt ................................ 16 2.5 Tinh sạch và xác định trọng lƣợng phân tử enzyme protease ................................. 18 2.5.1 Trích ly enzyme .................................................................................................... 19 2.5.2 Quá trình tủa ........................................................................................................ 20 2.5.3 Tinh sạch enzyme bằng phƣơng pháp sắc ký ....................................................... 22 2.5.4 Xác định trọng lƣợng phân tử enzyme protease bằng phƣơng pháp điện di SDS – PAGE ............................................................................................................................. 27 PHẦN 3 : VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ................................................................ 29 3.1 Thời gian và địa điểm .............................................................................................. 29 3.2 Vật liệu .................................................................................................................... 29 3.2.1 Chế phẩm enzyme thô .......................................................................................... 29 3.2.2 Hóa chất ................................................................................................................ 29 vii 3.2.3 Thiết bị .................................................................................................................. 29 3.3 Phƣơng pháp thí nghiệm .......................................................................................... 30 3.3.1 Bố trí thí nghiệm ................................................................................................... 30 3.3.1.1 Thí nghiệm 1 : Xác định hàm lƣợng và hoạt tính enzyme của dịch chiết enzyme thô .................................................................................................................................. 30 3.3.1.2 Thí nghiệm 2 : Xác định nồng độ muối (NH4)2SO4 và tỷ lệ cồn tối ƣu để tủa enzyme protease ............................................................................................................ 36 3.3.1.3 Thí nghiệm 3 : Xác định nhiệt độ và pH tối ƣu cho hoạt động của protease .... 37 3.3.1.4 Thí nghiệm 4 : Tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel...................................... 37 3.3.1.5 Thí nghiệm 5 : Xác định trọng lƣợng phân tử enzyme bằng phƣơng pháp điện di SDS – PAGE ............................................................................................................. 41 3.4 Phƣơng pháp xử lý số liệu ....................................................................................... 44 PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN.......................................................................... 45 4.1 Hàm lƣợng và hoạt tính của dịch chiết enzyme thô ................................................ 45 4.2 Nồng độ muối (NH4)2SO4 tối ƣu cho việc tủa protease .......................................... 45 4.2.1 Kết quả đối với chủng Asp.oryzae ........................................................................ 46 4.2.2 Kết quả đối với chủng Asp.kawasaki ................................................................... 48 4.3 Tỷ lệ cồn tối ƣu cho việc tủa protease ..................................................................... 49 4.3.1 Kết quả đối với chủng Asp.oryzae ........................................................................ 49 4.3.2 Kết quả đối với chủng Asp.kawasaki ................................................................... 51 4.4 So sánh việc tủa enzyme trong cồn 960 và tủa bằng muối (NH4)2SO4 .................... 53 4.5 Ảnh hƣởng của nhiệt độ và pH đến hoạt động của enzyme protease...................... 54 4.5.1 pH tối ƣu ............................................................................................................... 54 4.5.1.1 Kết quả đối với chủng Aspergillus oryzae ........................................................ 54 4.5.1.2 Kết quả đối với chủng Aspergillus kawasaki .................................................... 54 4.5.2 Nhiệt độ tối ƣu ...................................................................................................... 55 4.5.2.1 Kết quả đối với chủng Asp.oryzae ..................................................................... 55 4.5.2.2 Kết quả đối với chủng Asp.kawasaki ................................................................ 56 4.6 Kết quả tinh sạch qua lọc gel ................................................................................... 56 4.6.1 Kết quả đối với Asp.oryzae ................................................................................... 57 4.6.2 Kết quả đối với Asp.kawasaki .............................................................................. 59 4.7 So sánh hoạt tính riêng protease qua các lần tinh sạch của hai chủng nấm mốc Aspergillus oryzae và Aspergillus kawasaki ................................................................. 62 4.7.1 Tủa protease bằng muối ........................................................................................ 62 4.7.2 Tủa protease bằng cồn .......................................................................................... 62 4.8 Kết quả phân tách hệ enzyme protease bằng phƣơng pháp điện di trên gel SDS – PAGE ............................................................................................................................. 63 PHẦN 5 : KẾT LUẬNVÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................... 67 5.1 Kết luận.................................................................................................................... 67 5.1.1 Chủng nấm mốc Aspergillus oryzae ..................................................................... 67 5.1.2 Chủng nấm mốc Aspergillus kawasaki ................................................................ 67 5.1.3 So sánh hai chủng Aspergillus oryzae và Aspergillus kawasaki .......................... 68 5.2 Đề nghị .................................................................................................................... 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 69 PHỤ LỤC ...................................................................................................................... 70 viii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ CÁC THUẬT NGỮ Asp.oryzae : Aspergillus oryzae Asp.kawasaki : Aspergillus kawasaki CP : Chế phẩm (Chế phẩm enzyme dạng bột thô do phòng vi sinh ứng dụng Viện Sinh Học Nhiệt Đới cung cấp). ix CBB : Coomasie Brilliant Blue. ĐVHT : Đơn vị hoạt tính. HT : Hoạt tính HTR : Hoạt tính riêng. TCA : Trichloacetic acid A.U : Độ hấp thụ. mS/cm : Milisiemens/cm (đơn vị đo lƣờng độ dẫn điện). UI : Đơn vị hoạt tính enzyme. DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 2.1 Các kỹ thuật sắc ký dựa vào đặc tính của protein .......................................... 22 Bảng 3.1 Đƣờng chuẩn Albumin ................................................................................... 32 x Bảng 3.2 Đƣờng chuẩn Tyrosine ................................................................................... 34 Bảng 3.3 Khối lƣợng (NH4)2SO4 tƣơng ứng với mỗi nồng độ ...................................... 36 Bảng 3.4 Thể tích cồn tƣơng ứng với các tỷ lệ. ............................................................ 36 Bảng 4.1 Hoạt tính enzyme protease và hàm lƣợng protein của dịch chiết enzyme thô của hai chủng Asp.oryzae và Asp. kawasaki ................................................................. 45 Bảng 4.2 Tổng hàm lƣợng protein và tổng hoạt tính enzyme protease trong 15 ml dịch hòa tan tủa của Asp.oryzae khi tủa protease bằng muối ................................................ 46 Bảng 4.3 Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease có trong 1g chế phẩm enzyme thô của Asp.oryzae khi tủa protease bằng muối ............................................................ 46 Bảng 4.4 Tổng hàm lƣợng protein và tổng hoạt tính enzyme protease trong 15 ml dịch pha tủa của Asp.kawasaki khi tủa protease bằng muối .................................................. 48 Bảng 4.5 Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease có trong 1g chế phẩm enzyme thô của Asp.kawasaki khi tủa protease bằng muối ....................................................... 48 Bảng 4.6 Tổng hàm lƣợng protein và tổng hoạt tính enzyme protease trong 15 ml dịch hòa tan tủa của Asp.oryzae khi tủa protease bằng cồn .................................................. 50 Bảng 4.7 Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease có trong 1g chế phẩm enzyme thô của Asp.oryzae khi tủa protease bằng cồn .............................................................. 50 Bảng 4.8 Tổng hàm lƣợng protein và tổng hoạt tính enzyme protease trong 15 ml dịch pha tủa của Asp.kawasaki khi tủa protease bằng cồn .................................................... 51 Bảng 4.9 Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease có trong 1 g chế phẩm enzyme thô của Asp.kawasaki khi tủa protease bằng cồn .......................................................... 52 Bảng 4.10 So sánh việc tủa enzyme bằng tác nhân cồn và muối ở hai chủng Aspergillus oryzae và Aspergillus kawasaki. ................................................................ 53 Bảng 4.11 Sự thay đổi hoạt tính enzyme protease của Asp.oryzae theo pH ................ 54 Bảng 4.12 Sự thay đổi hoạt tính enzyme protease của Asp.kawasaki theo pH ............ 55 Bảng 4.13 Sự thay đổi hoạt tính enzyme protease của Asp.oryzae theo nhiệt độ ......... 55 Bảng 4.14 Sự thay đổi hoạt tính enzyme protease của Asp.kawasaki theo nhiệt độ .... 56 Bảng 4.15 Kết quả tinh sạch protease của Aspergillus oryzae qua sắc ký lọc gel ....... 59 Bảng 4.16 Kết quả tinh sạch protease của Aspergillus kawasaki qua sắc ký lọc gel .... 61 Bảng 4.17 So sánh hoạt tính riêng protease qua các quá trình tinh sạch khi tủa protease bằng muối ...................................................................................................................... 62 xi Bảng 4.18 So sánh hoạt tính riêng protease qua các quá trình tinh sạch khi tủa protease bằng cồn ......................................................................................................................... 62 Bảng 4.19 Giá trị Rf và trọng lƣợng phân tử của những protein trong thang. ............. 65 Bảng 4.20 Giá trị Rf và trọng lƣợng phân tử protease ở peak 3 của Asp.oryzae .......... 66 Bảng 4.21 Giá trị Rf và trọng lƣợng phân tử protease ở peak 2 của Asp.kawasaki ..... 66 DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ HÌNH TRANG Hình 2.1 Đƣờng biểu diễn ảnh hƣởng của nồng độ enzyme đến tốc độ xii phản ứng ......................................................................................................................... 8 Hình 2.2 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ cơ chất ......................................................................................................................... 8 Hình 2.3 Công thức cấu tạo enzyme protease ............................................................... 11 Hình 2.4 Nấm mốc Aspergillus oryzae qua kính hiển vi ............................................... 16 Hình 2.5 Khuẩn lạc của nấm mốc Aspergillus oryzae sau bảy ngày nuôi cấy trên môi trƣờng CBS – MEA2%. ................................................................................................. 16 Hình 2.6 Nguyên tắc phân tách trong quá trình tinh sạch bằng sắc ký ......................... 23 Hình 2.7 Quá trình lọc gel ............................................................................................. 26 Hình 3.1 Máy quang phổ UV-Vis ................................................................................. 31 Hình 3.2 Hệ thống sắc ký cột áp suất thấp, hãng Bio-Rad, Mỹ .................................... 38 Hình 4.1 Sắc ký đồ kết quả tinh sạch qua lọc gel Bio-gel P-100 khi tủa protease bằng muối đối với nấm Aspergillus oryzae ........................................................................... 58 Hình 4.2 Sắc ký đồ kết quả tinh sạch qua lọc gel Bio-gel P – 100 khi tủa protease bằng cồn đối với nấm Aspergillus oryzae .............................................................................. 58 Hình 4.3 Sắc ký đồ kết quả tinh sạch qua lọc gel Bio-gel P – 100 khi tủa protease bằng muối đối với nấm Aspergillus kawasaki........................................................................ 60 Hình 4.4 Sắc ký đồ kết quả tinh sạch qua lọc gel Biogel P-100 khi tủa protease bằng cồn đối với Aspergillus kawasaki .................................................................................. 60 ĐỒ THỊ Đồ thị 4.1 Đồ thị so sánh hàm lƣợng protein và hoạt tính enzyme protease trong dịch chiết enzyme thô giữa hai chủng nấm mốc Asp.oryzae và Asp.kawasaki ..................... 45 Đồ thị 4.2 Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease trong 1g chế phẩm enzyme thô của Asp.oryzae khi tủa protease bằng muối................................................................... 47 Đồ thị 4.3 Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease trong 1g chế phẩm enzyme thô của Asp.kawasaki khi tủa protease bằng muối ............................................................. 49 Đồ thị 4.4 Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease trong 1g chế phẩm enzyme thô của Asp.oryzae khi tủa protease bằng cồn ..................................................................... 51 Đồ thị 4.5 Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease trong 1g chế phẩm enzyme thô của Asp.kawasaki khi tủa protease bằng cồn ................................................................. 52 xiii Đồ thị 4.6 Ảnh hƣởng của pH đối với hoạt tính enzyme protease từ Asp.oryzae. ....... 54 Đồ thị 4.7 Ảnh hƣởng của pH đối với hoạt tính enzyme protease từ Asp.kawasaki ..... 55 Đồ thị 4.8 Ảnh hƣởng của nhiệt độ đối với hoạt tính protease từ Asp.oryzae ............. 55 Đồ thị 4.9 Ảnh hƣởng của nhiệt độ đối với hoạt tính protease từ Asp.kawasaki. ....... 56 Đồ thị 4.10 Đồ thị so sánh hoạt tính riêng protease qua các bƣớc tinh sạch khi tủa protein bằng muối. ......................................................................................................... 62 Đồ thị 4.11 Đồ thị so sánh hoạt tính riêng protease qua các bƣớc tinh sạch khi tủa protease bằng cồn. ......................................................................................................... 63 Đồ thị 4.12 Sự tƣơng quan giữa Lg của trọng lƣợng phân tử và giá trị Rf. .................. 65 1 PHẦN 1 : MỞ ĐẦU 1.2 Đặt vấn đề Để duy trì sự sống, cơ thể mỗi sinh vật phải thực hiện rất nhiều phản ứng hóa sinh. Nhƣ vậy điều gì đã giúp các phản ứng này đƣợc tiến hành mau lẹ phi thƣờng mà vẫn nhịp nhàng cân đối. Đó là nhờ khả năng xúc tác và điều hòa to lớn của enzyme. Có bản chất là một protein, enzyme không chỉ có thể thực hiện khả năng xúc tác sinh học bên trong cơ thể mà còn có thể thực hiện các xúc tác bên ngoài cơ thể khi tạo cho chúng một điều kiện thích hợp để hoạt động. Bởi lẽ đó, trong vòng vài chục năm gần đây việc sản xuất và ứng dụng các chế phẩm enzyme trên thế giới đã phát triển với tốc độ rất mạnh mẽ. Nhân tố quan trọng có tác dụng thúc đẩy cho sự phát triển của nền công nghiệp sản xuất enzyme đó là khả năng to lớn của vi sinh vật - những nhà máy chế tạo enzyme. Các vi sinh vật có tốc độ phát triển cực kỳ nhanh do đó có khả năng tạo ra một lƣợng enzyme vô cùng lớn trong một thời gian ngắn, đồng thời enzyme do chúng tạo ra có hoạt lực cao và chúng ta có thể tận dụng các phế thải của ngành khác để làm môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật để thu nhận enzyme. Protease là một trong những nhóm enzyme có nhiều ứng dụng quan trọng và phổ biến trong đời sống. Protease đƣợc sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau nhƣ công nghiệp, nông nghiệp, y học, trong nghiên cứu khoa học…Hoạt tính của enzyme nói chung và của protease nói riêng chịu ảnh hƣởng của nhiều yếu tố. Điều kiện tối thích để mỗi loại enzyme hoạt động là khác nhau. Do đó, để sử dụng enzyme hiệu quả nhất cần khảo sát điều kiện hoạt động tối ƣu cho hoạt động của enzyme đó. Nhằm mục đích khảo sát hoạt tính protease và tìm hiểu về kĩ thuật sắc ký lọc gel dùng trong việc tinh sạch enzyme, chúng tôi thực hiện đề tài :“Khảo sát hoạt tính và tinh sạch enzyme protease từ hai chủng nấm mốc Aspergillus oryzae và Aspergillus kawasaki trên môi trƣờng bán rắn”. Aspergillus oryzae từ lâu đã đƣợc dùng nhƣ là nguồn vi sinh vật đƣợc nuôi cấy để thu nhận enzyme protease. Tuy nhiên, đối với Aspergillus kawasaki thì ngƣời ta 2 chỉ biết đến nhƣ là nguồn vi sinh vật để thu nhận amylase. Do đó, qua đề tài, chúng ta có thể đánh giá đƣợc hiệu quả sử dụng protease của chủng Aspergillus kawasaki. 1.2 Mục đích nghiên cứu.  Xác định các điều kiện thu nhận và đặc tính của enzyme protease từ hai chủng nấm mốc Aspergillus oryzae và Aspgillus kawasaki.  So sánh hoạt tính enzyme protease giữa hai chủng nấm mốc Aspergillus oryzae và Aspergillus kawasaki. 1.3 Yêu cầu.  Thu nhận enzyme , xác định nồng độ muối (NH4)2SO4 bão hòa và tỷ lệ cồn tối ƣu trong việc tủa enzyme - bƣớc đầu trong quá trình tinh sạch enzyme.  Xác định pH và nhiệt độ tối ƣu cho hoạt động của enzyme protease.  Tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel.  Xác định trọng lƣợng phân tử của enzyme protease bằng kỹ thuật điện di SDS – PAGE. 3 PHẦN 2 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Khái quát chung về enzyme 2.1.1 Lƣợc sử các công trình nghiên cứu enzyme Từ trƣớc thế kỷ 17, khi loài ngƣời hoàn toàn chƣa hiểu biết gì về ezyme, ngƣời ta đã biết sử dụng rộng rãi các quá trình enzyme trong hoạt động thực tế nhƣ làm bánh mì, làm bia, rƣợu,…Việc ứng dụng enzyme trong giai đoạn này hoàn toàn có tính chất kinh nghiệm thuần túy và sử dụng enzyme thông qua hoạt động sống của tế bào vi sinh vật. Ngay từ thế kỷ 17, các nhà khoa học đã quen dùng từ “ferment” do nhà khoa học ngƣời Hà Lan Van Heltmon đề xƣớng. Theo nghĩa tiếng La Tinh thì “fermentatio” nghĩa là sự lên men, đó cũng là nguồn gốc của từ “ferment”. Theo ý kiến của ông, yếu tố tham gia tích cực vào quá trình lên men rƣợu là “ferment”. Yếu tố đó là gì thì còn là điều bí ẩn. Các nhà khoa học đã không vừa lòng với hiểu biết này và đã đi sâu vào thực nghiệm, quan sát, mô tả. Đến nửa cuối thế kỷ 18 bắt đầu có những thí nghiệm đầu tiên thô sơ và đơn giản chứng minh tác dụng của men tiêu hóa đƣợc nhà tự nhiên học ngƣời Pháp Réaunur tiến hành vào năm 1713 và đƣợc Spallanzani ngƣời Ý khẳng định lại một cách chặt chẽ hơn vào năm 1783 với tác dụng của dịch dạ dày phân hủy thịt. Năm 1814, viện sĩ viện hàn lâm khoa học Petecbua là Kirchov ngƣời Nga làm thí nghiệm chứng minh nƣớc chiết từ hạt lúa mạch nảy mầm có tác dụng chuyển hóa tinh bột thành đƣờng ở nhiệt độ 40 – 600C . Năm 1817 hai nhà khoa học Manaxenia (Nga) và Buchner (Đức) đã làm thí nghiệm thành công quá trình lên men bằng chất dịch vô bào từ nấm men. Nhà sinh lý học thực vật K.Tinniriazev đã viết “Không còn nghi ngờ gì nữa, lần đầu tiên ngƣời ta đã chứng minh đƣợc rằng hiện tƣợng lên men chung quy chỉ là một quá trình hóa học, nó có thể dễ dàng lập lại ngoài cơ thể sống nhờ những enzyme hòa tan chiết xuất từ những tế bào đã bị phá hủy cấu trúc”. Năm 1833, hai nhà khoa học ngƣời Pháp là A.Payen và J.Person thu nhận đƣợc chế phẩm enzyme amylase ở dạng kết tủa bằng cách thêm cồn vào dịch chiết từ hạt lúa nảy mầm. Kết tủa này có khả năng phân giải tinh bột thành đƣờng và đƣợc gọi 4 là diastase. Đây là thực nghiệm đặt nền móng cho các tiến bộ trong lĩnh vực enzyme vào nửa sau thế kỷ 19. Năm 1835, Berzelius lần đầu tiên đã đề ra khả năng giải thích tác dụng của enzyme trên cơ sở hóa học. Ông gọi hiện tƣợng làm tăng quá trình phản ứng là sự xúc tác và chất gây ra hiện tƣợng này là chất xúc tác. Năm 1856, Pasteur đã tiến hành nghiên cứu bản chất của quá trình lên men rƣợu. Theo ông, chính nấm men hay vi khuẩn lên men mà ta nhìn thấy dƣới kính hiển vi là nguyên nhân gây ra hiện tƣợng lên men rƣợu . Ông cho rằng chỉ có nấm men hay vi khuẩn còn sống mới có thể thực hiện quá trình lên men. Từ đó dẫn đến hai khái niệm mâu thuẫn nhau : men hữu hình (ferment hữu hình ) và men không nhìn đƣợc (ferment hòa tan). Năm 1862, nhà khoa học ngƣời Nga Danilevxki đã sử dụng một kỹ thuật đặc biệt để tách chiết trypsine ra khỏi hỗn hợp với amylase trong dịch tụy bằng kỹ thuật “phƣơng pháp hấp thụ chọn lọc enzyme” (tức là gắn enzyme lên bề mặt chất đỡ) và “phản hấp thụ” (nghĩa là giải phóng enzyme ra khỏi bề mặt chất đỡ) rồi kết tinh. Hiện nay chúng ta gọi đó là một dạng của “kỹ thuật sắc ký ”. Năm 1894, nhà khoa học ngƣời Pháp G.Bertrand phát hiện ra một loại enzyme mới là enzyme oxy hóa với việc phát hiện ra enzyme lacasae trong nhựa mủ cây sơn ta Rhus succedanea. Từ những thành tựu ban đầu đó, enzyme bắt đầu đƣợc chú ý nghiên cứu nhiều hơn vào cuối thế kỷ 19 đầu thế kỷ 20. Liên tiếp trong những năm 1930, 1931 hai nhà khoa học D.Northop và M.Kunitz đã tách đƣợc pepsine và trypsine dƣới dạng tinh thể. (Lê Ngọc Tú và ctv, 1982). Năm 1913, hai nhà khoa học L.Michalis và Menten đã nghiên cứu cơ chế xúc tác nhờ enzyme có sử dụng chất đồng vị, sử dụng phƣơng pháp quang học và phƣơng pháp hóa học nghiên cứu các nhóm hoạt động của enzyme đã đem lại cho chúng ta “phƣơng trình Michalis-Menten” nổi tiếng trong nghiên cứu động học của enzyme. (Nguyễn Hữu Chấn, 1984). Hiện nay enzyme đã trở thành một ngành khoa học mũi nhọn phát triển rất nhanh trên thế giới phân nhánh rất nhiều và liên quan chặt chẽ tới các ngành nhƣ hóa lý, hóa sinh, vi khuẩn, vi sinh học, sinh lý, y học,…Hàng năm trên thế giới xuất bản hàng chục nghìn công trình nghiên cứu về cơ chế tác dụng của enzyme, các phƣơng 5 pháp tách chiết và tinh chế, sự điều hòa về rối loạn hoạt động của cơ thể ở trạng thái sinh lý và bệnh lý. 2.1.2 Định nghĩa về enzyme Enzyme là nhóm protein chuyên biệt hóa cao có hoạt tính xúc tác sinh học, do tế bào sống tiết ra, có tác dụng tăng tốc độ và hiệu suất phản ứng hóa sinh, mà sau phản ứng vẫn còn giữ nguyên khả năng xúc tác. (Nguyễn Tiến Thắng, 2004) Các enzyme xúc tác cho hầu hết các phản ứng hóa học xảy ra trong cơ thể sống, đảm bảo cho các quá trình chuyển hóa các chất trong cơ thể sống tiến hành với tốc độ nhịp nhàng, có trật tự, theo những chiều hƣớng xác định. Pavlôv đã nói : “Hoạt động đầu tiên của enzyme là biểu hiện đầu tiên của hoạt động sống. Không có sự sống nào lại không có quá trình enzyme”. Điều này càng làm sáng tỏ định nghĩa của Anghen : “Sự sống, đó là phƣơng thức tồn tại của thể protein”. (Lê Ngọc Tú và ctv, 1982). Enzyme có trong mọi tế bào, mọi mô của mọi sinh vật nhƣng mỗi loại mô, mỗi loại tế bào thƣờng có những hệ thống enzyme đặc biệt. Các enzyme không chỉ tham gia xúc tác các phản ứng sinh học trong cơ thể sống mà còn xúc tác cho các phản ứng ngoài tế bào (in vitro). (Nguyễn Hữu Chấn, 1984). Enzyme có thể thực hiện hoạt động xúc tác trong điều kiện nhẹ nhàng, ở áp suất thấp và nhiệt độ bình thƣờng của cơ thể. Trong khi đó các chất xúc tác hóa học cần phải có nhiệt độ cần thiết cho phản ứng. Hơn nữa, các enzyme có khả năng chọn lựa cao đối với kiểu phản ứng mà nó xúc tác cũng nhƣ đối với chất mà nó tác dụng. (Lê Ngọc Tú và ctv, 1982). Các loại enzyme trong cơ thể đƣợc tổng hợp, hoạt động một cách rất hài hòa để sao cho các chất ban đầu đƣợc chuyển hóa đến sản phẩm cuối cùng thành một mắt xích hoàn chỉnh. Sự trục trặc nào đó ở một trong toàn bộ mắt xích này sẽ làm rối loạn cho cả hệ thống. Trong khi đó điều khiển tổng hợp và hoạt động của enzyme lại do gen. Mỗi một gen chịu trách nhiệm điều khiển tổng hợp một enzyme. (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004). Ƣu điểm cơ bản của enzyme khi tham gia các phản ứng sinh học có thể tóm tắt nhƣ sau :  Enzyme có thể tham gia hàng loạt các phản ứng trong chuỗi phản ứng sinh hóa để giải phóng hoàn toàn năng lƣợng hóa học có trong vật chất. 6  Enzyme có thể tham gia những phản ứng độc lập nhờ khả năng chuyển hóa rất cao.  Enzyme có thể tạo ra những phản ứng dây chuyền. Khi đó sản phẩm phản ứng đầu sẽ là nguyên liệu hay cơ chất cho những phản ứng tiếp theo.  Trong các phản ứng enzyme, sự tiêu hao năng lƣợng thƣờng rất ít.  Enzyme luôn luôn đƣợc tổng hợp trong tế bào của sinh vật. Số lƣợng enzyme đƣợc tổng hợp rất lớn và luôn luôn tƣơng ứng với số lƣợng các phản ứng xảy ra trong cơ thể. Các phản ứng xảy ra trong cơ thể luôn luôn có sự tham gia xúc tác bởi enzyme.  Có nhiều enzyme không bị mất đi sau phản ứng. Ngày nay các nhà khoa học đã tìm ra trên 1000 loại enzyme khác nhau có trong tế bào sinh vật, số lƣợng này là rất nhỏ so với số lƣợng có thật trong mỗi tế bào. Trong hơn 1000 loại enzyme đã biết, loài ngƣời mới thu nhận và kết tinh đƣợc khoảng 200 loại. (Nguyễn Đức Lƣợng, 2002). 2.1.3 Phân loại enzyme Khi số lƣợng enzyme đƣợc phát hiện còn ít, ngƣời ta đặt tên enzyme theo ý thích từng ngƣời tìm ra nó. Dần dần theo thời gian, số lƣợng enzyme tìm ra ngày càng nhiều nên cần có một hệ thống phân loại theo quy ƣớc quốc tế. Enzyme đƣợc phân loại theo tính chất của nó, đƣợc xếp vào từng nhóm nhỏ tƣơng ứng với các enzyme có bản chất tƣơng tự nhau, làm cho việc tìm hiểu và nghiên cứu trở nên dễ dàng hơn. Theo quy ƣớc quốc tế, tên gọi của enzyme thƣờng đƣợc đặt theo cơ chất đặc hiệu của chúng cùng với tên kiểu phản ứng mà chúng tham gia. Theo đó, tên enzyme thƣờng có hai phần. Phần đầu là tên cơ chất, phần sau chỉ khái quát bản thân các phản ứng. Tuy nhiên, có nhiều enzyme theo thói quen vẫn đƣợc gọi theo tên cũ, không theo hệ thống nhƣ trypsine, pepsine. Năm 1930, Hiệp Hội Hóa Sinh Quốc Tế (IOB) đã thống nhất phân loại enzyme ra làm 6 lớp và đƣợc đánh số thứ tự từ một đến sáu. Các số thứ tự này là cố định cho mỗi lớp. Mỗi lớp lại chia làm nhiều tổ, mỗi tổ có nhiều nhóm. Chính vì thế theo hệ thống phân loại, mỗi enzyme thƣờng có bốn số : số thứ tự một chỉ lớp, số thứ tự hai chỉ tổ, số thứ ba chỉ nhóm, số thứ tƣ chỉ enzyme. Tên của các lớp, tổ và nhóm nhƣ sau : 7 I. Oxydoreductase a. Dehydrogenase b. Oxydase c. Oxygenase d. Peroxydase II. Transferase a. Acyltransferase b. Glucosyltransferase c. Aminotransferase d. Phosphotransferase III. Hydrolase a. Peptide hydrolase b. Lipase IV. Liase a. Pyruvate decarboxylase b. Fumarate hydrolase V. Isomerase VI. Ligase 2.1.4 Hoạt tính và các yếu tố ảnh hƣởng đến vận tốc phản ứng enzyme 2.1.4.1 Hoạt tính enzyme Hoạt tính xúc tác của enzyme là do cấu trúc không gian ba chiều của các phân tử protein quyết định. Enzyme có hiệu suất xúc tác cực kỳ lớn, gấp hàng trăm, hàng nghìn hoặc hàng triệu lần các chất xúc tác vô cơ và hữu cơ khác. Tốc độ phản ứng do enzyme xúc tác phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau nhƣ nồng độ enzyme, bản chất và nồng độ của các chất phản ứng (cơ chất), nhiệt độ, pH môi trƣờng, nồng độ ion trong môi trƣờng, nồng độ các chất kìm hãm, các chất hoạt hóa enzyme. (Lê Ngọc Tú và ctv, 1982). 2.1.4.2 Các yếu tố ảnh huởng đến vận tốc phản ứng enzyme. a) Ảnh hƣởng của nồng độ enzyme Trong điều kiện thừa cơ chất, tốc độ phản ứng phụ thuộc bậc nhất vào nồng độ enzyme. Đƣờng biểu diễn có dạng nhƣ ở hình 2.1 8 Hình 2.1 : Đƣờng biểu diễn ảnh hƣởng của nồng độ enzyme đến tốc độ phản ứng b) Ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất Ở giai đoạn đầu của phản ứng, nếu nồng độ enzyme đƣợc giữ cố định và nồng độ cơ chất thay đổi, ngƣời ta nhận thấy vận tốc phản ứng tăng khi nồng độ cơ chất tăng. Khi nồng độ cơ chất tiếp tục gia tăng, đƣờng biểu diễn uốn cong và với nồng độ cơ chất cao thì vận tốc không còn gia tăng nữa và đƣờng biểu diễn tiệm cận với giá trị vmax. Km : Hằng số Michalis, là nồng độ cơ chất ứng với vận tốc bằng 1/2 vận tốc vmax. Hình 2.2 : Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ cơ chất c) Ảnh hƣởng của nhiệt độ Nhiệt độ có ảnh hƣởng rất lớn đến phản ứng enzyme và tốc độ phản ứng enzyme không phải lúc nào cũng tỷ lệ thuận với nhiệt độ phản ứng. Tốc độ phản ứng chỉ tăng đến một giới hạn nhiệt độ nhất định. Vƣợt quá giới hạn đó, tốc độ phản ứng sẽ giảm và dẫn đến mức triệt tiêu. Nếu đƣa nhiệt độ lên cao hơn mức nhiệt độ tối ƣu, hoạt tính enzyme sẽ bị giảm, khi đó enzyme không có khả năng phục hồi lại hoạt tính. V [E] V = k[E] Vmax [S] v 2 Km 0 9 Ngƣợc lại, ở nhiệt độ 00C, enzyme bị hạn chế hoạt động rất mạnh, nhƣng khi đƣa nhiệt độ lên từ từ hoạt tính enzyme sẽ tăng dần đến mức tối ƣu. Khi khảo sát vận tốc ban đầu của phản ứng theo nhiệt độ (in vitro), ngƣời ta thấy xuất hiện hai kỳ (pha) riêng biệt tƣơng ứng với hai hiện tƣợng khác nhau :  Ở nhiệt độ thấp (từ 0 – 400C), vận tốc phản ứng tăng khi nhiệt độ tăng. Sự gia tăng vận tốc này đơn thuần là do cung cấp năng lƣợng cho phản ứng.  Ở nhiệt độ cao sau đó (tùy thuộc vào từng enzyme, ở vào khoảng 450C), vận tốc phản ứng giảm do sự biến tính của protein. Đa số enzyme bị mất hoạt tính ở 80 – 1000C. Nhiệt độ tối ƣu của một enzyme phụ thuộc rất nhiều vào sự có mặt của cơ chất, pH, lực ion của môi trƣờng. d) Ảnh hƣởng của pH Sự thay đổi pH gây nên :  Sự biến đổi ion hóa của các nhóm chức năng trên chuỗi polypeptid của enzyme, do đó làm thay đổi điện tích cần thiết cho sự tạo thành phức hợp enzyme – cơ chất và sự duy trì cấu hình ba chiều nguyên thủy của chuỗi polypeptid của enzyme.  Sự thay đổi mức độ ion hóa của cơ chất, điều này cho phép hoặc ngăn cản sự tạo thành enzyme – cơ chất trong trƣờng hợp phản ứng đòi hỏi cơ chất phải ở dƣới dạng ion. Nhƣ vậy, hoạt tính của enzyme phụ thuộc rõ rệt vào pH môi trƣờng. Đó là vì pH môi trƣờng có ảnh hƣởng đến mức độ ion hóa của cơ chất, enzyme và trung tâm hoạt động của nó, phức chất enzyme – cơ chất và ảnh hƣởng đến độ bền của enzyme. Ngƣời ta có thể xác định một giới hạn pH tối ƣu cho hoạt động của một enzyme. Ngoài pH tối ƣu, vận tốc phản ứng giảm đi nhanh chóng. Điều này cho thấy tầm quan trọng của môi trƣờng phản ứng trong quá trình nghiên cứu các phản ứng enzyme in vitro. Mỗi một enzyme có một pH tối ƣu khác nhau, có thể rất acid (từ 1,5 -2), hoặc rất kiềm (9,5 – 10). pH tối ƣu của đa số các enzyme vào khoảng chung quanh giá trị trung tính (6 – 8). Tuy nhiên pH tối ƣu của một enzyme cũng không cố định mà phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau nhƣ bản chất và nồng độ cơ chất, tính chất dung dịch đệm, nhiệt độ. 10 2.1.5 Nguồn thu nhận và vai trò của enzyme trong đời sống 2.1.5.1 Nguồn thu nhận Enzyme đƣợc thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau : động vật (pepsin từ dạ dày, trypsin từ tụy tạng…), từ thực vật (amylase từ thóc nảy mầm, bromelin từ thơm…). Tuy nhiên không thể dùng hai nguồn này làm nguyên liệu để sản xuất với quy mô công nghiệp lớn các chế phẩm enzyme nhằm thỏa mãn các nhu cầu của nền kinh tế quốc dân. Nhƣ vậy trong các nguồn nguyên liệu sinh học thì nguồn nguyên liệu vi sinh vật (nấm men, nấm mốc, vi khuẩn…) là dồi dào và đầy hứa hẹn. Enzyme thu nhận từ vi sinh vật có nhiều ƣu điểm nổi bật và có tính chất độc đáo vƣợt xa các enzyme từ động vật và thực vật :  Vi sinh vật là nguồn nguyên liệu vô tận để sản xuất enzyme với một lƣợng lớn và có thể mở rộng để sản xuất tới phạm vi cần thiết, đồng thời việc thu chế phẩm cũng dễ dàng và có thể thỏa mãn trong một mức độ lớn nhu cầu của các ngành công nghiệp khác nhau.  Hệ enzyme vi sinh vật vô cùng phong phú. Do đó vi sinh vật có thể đồng hóa bất kỳ chất nào trong thiên nhiên. Trong khi đó có nhiều chất mà thực vật và động vật không thể đồng hóa đƣợc.  Enzyme của vi sinh vật có hoạt tính rất mạnh, vƣợt xa các sinh vật khác. Do vậy chỉ cần một lƣợng nhỏ enzyme có thể chuyển hóa một lƣợng lớn cơ chất.  Vi sinh vật sinh sản với tốc độ cực kỳ nhanh chóng, khối lƣợng lại nhỏ, kích thƣớc bé, nhƣng tỷ lệ enzyme trong tế bào tƣơng đối lớn nên quá trình sản xuất chế phẩm enzyme khá dễ dàng, thao tác thuận lợi, hiệu suất thu hồi cao.  Phần lớn thức ăn để nuôi cấy vi sinh vật dễ kiếm và rẻ tiền. Đa số vi sinh vật cho enzyme thƣờng có khả năng phát triển trên môi trƣờng đơn giản, rẻ tiền nhƣ các phụ phế liệu, phế phẩm của các nghành sản xuất.  Ƣu việt lớn của sự thu enzym từ vi sinh vật là có khả năng tăng cƣờng sinh tổng hợp các enzym nhờ chọn giống khi tạo đƣợc những biến chủng có hoạt lực cao. Vi sinh vật rất nhạy cảm với tác động môi trƣờng, có khả năng thích ứng với nguồn dinh dƣỡng. Vì vậy, khi thay đổi điều kiện sống của vi sinh vật hoặc tác động lên chúng bằng các tác nhân khác nhau có thể thay đổi dễ dàng hệ enzym cũng nhƣ hoạt tính của chúng và tăng tối đa sự sinh tổng hợp các enzym trong vi sinh vật nuôi 11 cấy. Điều đó cho phép ta có thể tạo đƣợc những enzym theo ý muốn, dễ dàng thu nhận đƣợc enzym có độ thuần khiết cao. 2.1.5.2 Vai trò Cùng với những thành tựu đạt đƣợc trong nghiên cứu lí thuyết về enzym, các nghiên cứu ứng dụng enzym trong thực tế ngày càng đƣợc mở rộng và đạt hiệu quả cao. Các chế phẩm enzym đƣợc sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau nhƣ trong hoá phân tích để định tính, định lƣợng các chất trong nông nghiệp, y học, công nghiệp thực phẩm, công nghiệp dƣợc liệu, công nghiệp nhẹ nhƣ công nghiệp dệt, công nghiệp da.  Trong y học có thể sử dụng enzym tinh chế để chữa bệnh, sản xuất các sinh tố và các chất kháng sinh.  Sử dụng chế phẩm enzym trong nông nghiệp để chế biến các sản phẩm nông nghiệp sản xuất thức ăn cho động vật đặc biệt là động vật còn non, xử lý hạt trƣớc khi gieo.  Trong công nghiệp thực phẩm, chế phẩm enzym đƣợc sử dụng khá rộng rãi trong nhiều ngành chế biến khác nhau : chế biến thịt, cá, sữa, công nghiệp sản xuất bánh mì và các thứ bánh kẹo khác. Sử dụng chế phẩm enzym thƣờng làm tăng nhanh quá trình chế biến, tăng hƣơng vị và giá trị dinh dƣỡng của sản phẩm. Ngoài ra, sử dụng enzym còn có thể tái tạo hƣơng vị của các loại rau quả tƣơi sau khi chế biến. Ngày nay, ngƣời ta cũng đã đạt đƣợc nhiều kết quả trong việc sử dụng một số enzyme trong bảo quản đồ hộp và một số nguyên liệu khác. 2.2 Khái quát chung về enzyme protease 2.2.1 Định nghĩa enzyme protease Protease là enzyme thuộc nhóm hydrolase, xúc tác cho quá trình thủy phân liên kết peptid (-CO – NH-) của phân tử protein và peptid thành các acid amin tự do, một ít peptid ngắn, pepton. Hình 2.3 : Công thức cấu tạo enzyme protease 12 2.2.2 Lƣợc sử phát triển các enzyme protease 2.2.2.1 Protease từ động vật Trong các protease, các enzyme của hệ tiêu hóa đƣợc nghiên cứu sớm hơn cả. Từ thế kỷ XVIII, nhà tự nhiên học ngƣời Pháp là Reaunur đã làm thí nghiệm rất đơn giản và đã phát hiện đƣợc rằng dịch dạ dày của chim ăn thịt có khả năng tiêu hóa thịt. Năm 1836, Schwam đã quan sát đƣợc hoạt động phân giải protein của dịch vị. Tuy nhiên, mãi đến hơn 30 năm sau ngƣời ta mới tách đƣợc enzyme này. Năm 1857, Corvisart tách đƣợc trypsine từ dịch tụy. Đây là protease đầu tiên thu nhận đƣợc ở dạng chế phẩm, trong chế phẩm vẫn còn lẫn nhiều protein khác. Năm 1862, Danilevxki dùng phƣơng pháp hấp phụ trên colondion đã tách đƣợc trypsine với amylase tụy tạng. Phƣơng pháp này có ý nghĩa rất lớn trong nghiên cứu tinh chế enzyme và protein. Năm 1872, Hommarsten đã tách đƣợc chế phẩm chymotrypsine (renin). Ngoài những enzyme của hệ tiêu hóa, các nhà khoa học cũng có những nghiên cứu đầu tiên về protease trong máu. Schidt đã nêu giả thiết rằng trong máu có enzyme fibrin (ngày nay gọi là trombin) tham gia trong quá trình đông máu. Ông đã tiến hành việc tách chiết enzyme này và kết tủa bằng cồn, chế phẩm nhận đƣợc có tác dụng làm cho dung dịch fibrinogen đông lại nhanh chóng. 2.2.2.2 Các protease từ thực vật So với các protease từ động vật, các protease từ thực vật đƣợc phát hiện muộn hơn. Năm 1874, Group – Besanez công bố đã nhận đƣợc protease từ hạt của một loại đậu. Họ cũng nhận thấy dịch chiết từ hạt đại mạch, bông, lanh đều có hoạt động phân giải protein. Ý kiến này dựa trên cơ sở thực nghiệm là sau khi cho dịch chiết từ các nguyên liệu trên tác dụng với fibrin, nuớc lọc của hỗn hợp cho phản ứng màu Biure. Bằng chứng này không thật sự vững chắc nên Group – Besanez không tiếp tục nghiên cứu. Vì vậy Wurtz đƣợc xem nhƣ là ngƣời đầu tiên tách chiết thành công protease từ thực vật (1879). Ông nêu lên rằng các phần khác nhau của cây đu đủ có 13 chứa protease, khi dùng cồn để kết tủa sẽ thu nhận đƣợc một chế phẩm enzyme không tinh khiết (100g/1 cây) gọi là papain. 2.2.2.3 Protease từ vi sinh vật Các protease của vi sinh vật mới đƣợc chú ý nghiên cứu nhiều từ năm 1950, mặc dầu từ năm 1918 – 1919 Waksman đã phát hiện đƣợc khả năng phân giải protein của xạ khuẩn. Trong hơn 10 năm nay, số công trình nghiên cứu protease vi vinh vật tăng lên đáng kể, nhiều hơn các công trình nghiên cứu protease của động vật và thực vật. Những kết quả đạt đƣợc trong lĩnh vực nghiên cứu protease vi sinh vật đã góp phần mở rộng quy mô sản xuất chế phẩm enzyme và ứng dụng enzyme trong thực tế. Trong thời gian gần đây ngƣời ta cũng đã có những phƣơng pháp thích hợp để nhận chế phẩm không tan của protesae. Kết quả này mở ra triển vọng to lớn trong nghiên cứu và các ứng dụng của các protease. 2.2.3 Nguồn thu nhận enzyme protease Các enzyme protesae nhƣ đã nói ở trên đƣợc thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau. 2.2.3.1 Từ động vật Protesae động vật thƣờng có ở tụy tạng, niêm mạc ruột non, niêm mạc dạ dày…  Pancreatin gồm : Trysin, chymotrypsin và một enzyme khác có ở tụy tạng, chúng đƣợc tiết ra ngoài tế bào cùng với dịch tụy.  Pepsin có ở niêm mạc dạ dày, đƣợc tiết ra ngoài tế bào cùng với dịch vị.  Renin chỉ có ở ngăn thứ tƣ ở dạ dày bê non dƣới 5 tháng tuổi, là enzyme đông tụ sữa điển hình trong công nghệ sản xuất fromage. 2.2.3.2 Từ thực vật Enzyme protease từ thực vật có ở các thanh phần khác nhau của cây nhƣ thân, lá và đặc biệt có nhiều ở quả . Ví dụ:  Papain có trong mủ cây đu đủ, quả đu đủ còn xanh  Bromelin có trong thân cây thơm xanh và quả thơm xanh.  Ficin có trong mủ cây sung, quả sung, quả vả. 14 2.2.3.3 Từ vi sinh vật Nhiều loài vi sinh vật có khả năng tổng hợp mạnh protease. Các enzyme này có thể ở trong tế bào (protease nội bào) hoặc đƣợc tiết vào trong môi trƣờng nuôi cấy (protease ngoại bào). Cho đến nay các protease ngoại bào đƣợc nghiên cứu kỹ hơn các protease nội bào. Một số protease ngoại bào đã sản xuất ở quy mô công nghiệp và đƣợc sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành kỹ nghệ khác nhau trong nông nghiệp và y dƣợc. Có nhiều công trình nghiên cứu cho thấy các protease của vi sinh vật có nguồn gốc khác nhau thì cũng có những tính chất khác nhau về nhiều mặt. Căn cứ vào cơ chế phản ứng, pH hoạt động tối ƣu,…Hartley (1960) đã phân loại các protease vi sinh vật thành 4 nhóm cơ bản nhƣ sau :  Protease serine  Protease kim loại (metallo protease)  Protease acid  Protease tiol 2.2.4 Ứng dụng của enzyme protease Các protease nói chung cũng nhƣ protease vi sinh vật nói riêng đƣợc sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau.  Trong sản xuất nƣớc chấm : Nƣớc mắm, tƣơng, chao,…  Trong công nghệ thực phẩm : Làm mềm thịt, tăng hƣơng vị thịt sau khi chế biến,…  Trong công nghệ thuộc da : Làm mềm lông, sạch lông, bóng da,…  Trong công nghệ tơ tằm : Làm bóng và tách rời các sợi tơ.  Trong hƣơng mỹ phẩm : Ngƣời ta trộn một lƣợng nhỏ protease vào kem xoa, kem cạo râu, dầu gội, dầu bôi tóc, kem mặt,… để làm da mềm mại, tẩy bỏ dễ dàng lớp tế bào già.  Xà bông, kem giặt có enzyme sẽ tẩy dễ dàng các vết bẩn. Đặc biệt ứng dụng giặt sạch vết máu, sữa trên vải.  Trong công nghiệp sữa, các protease nhƣ renine, pepsine đƣợc dùng trong sản xuất formate, sữa đông tụ.  Trong y học : 15 + Protease đƣợc dùng để sản xuất môi trƣờng dinh dƣỡng nuôi vi sinh vật, sản xuất huyết thanh miễn dịch. + Dùng để phân hủy các cục máu đông trong cơ thể, chữa bệnh nghẽn tĩnh mạch… + Sử dụng các chất hoạt hóa và kìm hãm protease để điều trị các bệnh đặc trƣng. + Sản xuất thuốc làm tăng khả năng tiêu hóa protein của những ngƣời bị tiêu hóa kém…  Trong nông nghiệp : Protease đƣợc dùng để sản xuất dịch thủy phân giàu đạm bổ sung vào thức ăn của lợn và gia cầm.  Trong kỹ nghệ phim ảnh : Protease từ vi khuẩn đƣợc dùng để tái sinh các nguyên liệu nhƣ phim điện ảnh, phim Rơnghen…Protease phân giải và hòa tan lớp nhũ tƣơng gelatin trên phim và giấy ảnh, do đó có thể làm sạch và sử dụng trở lại các loại phim và giấy ảnh quý. 2.3 Protease thu nhận từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae. 2.3.1 Đặc điểm chủng nấm mốc Aspergillus oryzae 2.3.1.1 Phân loại Giới : Fungi Ngành : Ascomycota Ngành phụ : Pezizomycota Lớp : Ascomycetes Bộ : Plectascales Họ : Aspergillaceae Giống : Aspergillus Loài : Aspergillus oryzae 2.3.1.2 Đặc điểm  Hình thái Chủng nấm mốc Aspergillus oryzae có màu vàng hoa cau, sợi nấm phát triển rất mạnh (chiều ngang 5 – 7 m), có vách ngăn chia sợi nấm thành nhiều tế bào (nấm đa bào), phát triển thành từng đám gọi là hệ sợi nấm hay khuẩn ty. 16 Hình 2.4 Nấm mốc Aspergillus oryzae qua kính hiển vi Hình 2.5 Khuẩn lạc của nấm mốc Aspergillus oryzae sau bảy ngày nuôi cấy trên môi trƣờng CBS – MEA2%.  Điều kiện phát triển : Độ ẩm môi trƣờng tối ƣu cho sự hình thành bào tử : 45%. Độ ẩm môi trƣờng tối ƣu cho sự hình thành enzyme : 55 - 58%. Độ ẩm không khí : 85 -95%. pH môi trƣờng : 5,5 - 6,5. Nhiệt độ nuôi cấy : 27 - 300C. 2.4 Thu nhận enzyme protease từ phƣơng pháp nuôi cấy bề mặt. Để thu nhận chế phẩm protease từ vi sinh vật cũng nhƣ các enzyme khác có thể dùng hai phƣơng pháp nuôi cấy : phƣơng pháp bề mặt và phƣơng pháp bề sâu. Phƣơng pháp bề mặt thƣờng dùng để nuôi cấy nấm mốc, phƣơng pháp bề sâu thƣờng dùng đối với vi khuẩn. Phƣơng pháp nuôi cấy bề mặt là phƣơng pháp nuôi cấy vi sinh vật đã đƣợc nghiên cứu và phát triển rất mạnh mẽ trong những năm đầu của thế kỷ XX. Lƣợng 17 enzyme đƣợc tạo thành từ nuôi cấy bề mặt thƣờng cao hơn rất nhiều so với phƣơng pháp nuôi cấy chìm. Nguyên liệu sử dụng trong nuôi cấy bề mặt thƣờng là những nguyên liệu có nguồn gốc thực vật nhƣ cám mì, cám gạo, gạo, ngô…Khi nuôi cấy vi sinh vật để thu nhận protease, ngƣời ta cho thêm bột đậu xanh hoặc bột đậu nành nhƣ những cơ chất cảm ứng cho sự tổng hợp của protease. Quá trình phát triển của nấm mốc trong môi trƣờng bán rắn khi nuôi bằng phƣơng pháp bề mặt trải qua các giai đoạn sau:  Giai đoạn 1: Giai đoạn này kéo dài 10-14 giờ kể từ thời gian bắt đầu nuôi cấy. Ở giai đoạn này có những thay đổi sau: + Nhiệt độ tăng rất chậm. + Sợi nấm bắt đầu hình thành và có màu trắng hoặc màu sữa. + Thành phần dinh dƣỡng bắt đầu có sự thay đổi. + Khối môi trƣờng còn rời rạc. + Enzym mới bắt đầu đƣợc hình thành. Trong giai đoạn này phải đặc biệt quan tâm đến chế độ nhiệt. Tuyệt đối không đƣợc đƣa nhiệt độ cao quá 300C vì thời kì đầu giống rất mẫn cảm với nhiệt.  Giai đoạn 2. Giai đoạn này kéo dài khoảng 14-18 giờ. Trong giai đoạn này có những thay đổi cơ bản sau: + Toàn bộ bào tử đã phát triển thành sợi nấm và sợi nấm bắt đầu phát triển rất mạnh. Các sợi nấm này tạo ra những mạng sợi chằng chịt khắp trong các hạt môi trƣờng, trong lòng môi trƣờng. + Môi trƣờng đƣợc kết lại khá chặt. + Độ ẩm môi trƣờng giảm dần. + Nhiệt độ môi trƣờng sẽ tăng nhanh có thể lên tới 40-45oC. + Các chất dinh dƣỡng bắt đầu giảm nhanh, do sự đồng hoá mạnh của nấm sợi. + Các loại enzym đƣợc hình thành và enzym nào có cơ chất cảm ứng trội hơn sẽ đƣợc tạo ra nhiều hơn. + Lƣợng oxy trong không khí giảm và CO2 sẽ tăng dần, do đó trong giai đoạn này cần phải đƣợc thông khí mạnh và nhiệt độ cố gắng duy trì trong khoảng 29- 30 oC là tốt nhất. 18  Giai đoạn 3. Giai đoạn này kéo dài khoảng 10-20 giờ. Ở giai đoạn này có một số thay đổi cơ bản nhƣ sau: + Quá trình trao đổi chất sẽ yếu dần, do đó mức độ giảm chất dinh dƣỡng sẽ chậm lại. + Nhiệt độ của khối môi trƣờng giảm, do đó làm giảm lƣợng không khí môi trƣờng xuống còn 20-25 thể tích không khí/thể tích phòng nuôi cấy/1 giờ. Nhiệt độ nuôi duy trì ở 300C. Trong giai đoạn này, bào tử đƣợc hình thành nhiều do đó lƣợng enzym sẽ giảm. Chính vì thế việc xác định thời điểm cần thiết để thu nhận enzym rất cần thiết. Kết thúc quá trình nuôi cấy ta thu nhận đƣợc chế phẩm enzyme. Chế phẩm này đƣợc gọi là chế phẩm enzyme thô (vì ngoài thành phần enzyme ra, chúng còn chứa sinh khối vi sinh vật, thành phần môi trƣờng và nƣớc có trong môi trƣờng). Ngƣời ta thƣờng sấy khô chế phẩm enzyme đến một độ ẩm thấp để đảm bảo cho chế phẩm enzyme thô không mất hoạt tính nhanh. 2.5 Tinh sạch và xác định trọng lƣợng phân tử enzyme protease Quá trình tinh sạch enzyme đƣợc tóm tắt nhƣ sau : Chế phẩm enzyme thô Trích ly Lọc Kết tủa enzyme Thu nhận kết tủa Tinh chế kết tủa bằng sắc ký lọc gel Kiểm tra độ tinh sạch, xác định trọng lƣợng phân tử 19 2.5.1 Trích ly enzyme Toàn bộ khối lƣợng chế phẩm enzyme thô đã sấy đƣợc đem đi nghiền nhỏ. Mục đích của quá trình nghiền là vừa phá vỡ thành tế bào vừa làm nhỏ các thành phần của chế phẩm thô. Khi thành tế bào bị phá vỡ, các enzyme ngoại bào và cả enzyme nội bào chƣa thoát ra khỏi tế bào sẽ dễ dàng thoát khỏi tế bào. Các loại enzyme thủy phân hòa tan trong nƣớc nên sau khi nghiền mịn, ngƣời ta dùng nƣớc, các dung dịch muối trung tính, các dung môi hữu cơ (cồn, acetone). Nhiều kết quả thí nghiệm cho thấy dùng nƣớc trong mục đích này cho kết quả tốt và dễ đƣợc dùng rộng rãi trong sản xuất. Theo phƣơng pháp khuếch tán bằng nƣớc có thể chiết đƣợc lƣợng enzyme trên 90 – 95% và trong nƣớc chiết không chứa các tạp chất không tan. Nƣớc thƣờng dùng khuyếch tán ở nhiệt độ 25 – 280C. (Lƣơng Đức Phẩm, 1998) Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình trích ly :  Tỷ lệ nƣớc trích Chế phẩm đã sấy khô cần nhiều nƣớc để trích ly enzyme hơn chế phẩm ẩm, tỷ lệ nƣớc trên chế phẩm khác nhau sẽ trích đƣợc lƣợng enzyme khác nhau. Lƣợng nƣớc dùng để trích ly gấp từ 2 – 3,5 lần so với lƣợng chế phẩm nấm mốc.  Thời gian trích Enzyme thủy phân dễ tan trong nƣớc, thời gian trích ly càng lâu càng có khả năng trích đƣợc nhiều enzyme hơn nhƣng làm tăng lƣợng tạp chất trong dịch chiết và giảm hoạt tính riêng của enzyme. Thời gian trích ly thích hợp khoảng 30 – 40 phút.  Nhiệt độ trích Nhiệt độ trích ly càng tăng thì vận tốc trích ly càng tăng nhƣng làm giảm hoạt tính enzyme nên kéo theo giảm hoạt tính riêng của dịch enzyme. Nhiệt độ trích ly tối thích là 20 – 300C. Để tăng cƣờng khả năng thu enzyme, chế phẩm đƣợc đánh tơi trƣớc khi trích để đạt đƣợc kích thƣớc hạt 1 – 5 mm. Ngoài ra trong công nghiệp, thƣờng dùng hệ thống trích ly liên tục gồm nhiều thùng chứa chế phẩm nấm mốc, trong mỗi thùng sẽ Sản phẩm enzyme tinh khiết 20 trích đƣợc nhiều lần. Cách làm này giúp tăng hiệu suất thu enzyme, tăng chất khô và hàm lƣợng enzyme trong dịch chiết thu đƣợc. 2.5.2 Quá trình tủa Dịch thu nhận đƣợc vẫn ở dạng chế phẩm enzyme thô, vì trong đó còn chứa nƣớc, các chất hòa tan khác từ khối môi trƣờng nuôi cấy. Dung dịch enzyme thô thƣờng chứa một lƣợng enzyme không nhiều, hoạt tính enzyme không cao. Chính vì thế việc tiếp theo là làm sao tách enzyme ra khỏi những vật chất này. Để làm đƣợc điều đó ngƣời ta phải tiến hành kết tủa enzyme nhờ những tác nhân gây kết tủa. Tủa là phƣơng pháp cô đặc enzyme hữu dụng và là bƣớc ban đầu trong tinh sạch enzyme. Bằng cách này ngƣời ta loại đƣợc một số protein tạp ở giai đoạn đầu của quá trình làm sạch enzyme.  Nguyên tắc : Enzyme là một phức hợp protein có khả năng tạo kết tủa với một số dung môi. Ở phân tử enzyme, các gốc ƣa nƣớc và kỵ nƣớc thƣờng nằm trên bề mặt. Chúng quyết định mức độ hòa tan của enzyme ở những loại dung môi khác nhau. Trong đó, các nhóm kỵ nƣớc có xu hƣớng nằm trong lòng phân tử protein, một phần không nhỏ nhóm này nằm trên bề mặt protein và có khả năng tiếp xúc với dung môi, các nhóm này sẽ cùng với nhóm tích điện và các nhóm lƣỡng cực khác có vai trò quyết định đến tính chất enzyme. Độ hòa tan của enzyme đƣợc coi là kết quả của tƣơng tác lƣỡng cực của chất hòa tan với nƣớc và tƣơng tác ion của chúng với muối có trong dung dịch tạo thành màng nƣớc bao quanh phân tử protein gọi là lớp vỏ hydrate. Nếu loại bỏ các tƣơng tác này, các phân tử protein sẽ kết tụ lại với nhau để tạo thành khối lớn, tách khỏi dung dịch, thƣờng gọi là tủa protein. Sau khi protein bị kết tủa, nếu loại bỏ các yếu tố gây kết tủa, protein lại có thể ở dạng tan (dung dịch keo) bền nhƣ trƣớc thì đƣợc gọi là kết tủa thuận nghịch, hoặc mất khả năng này gọi là kết tủa không thuận nghịch.  Những phản ứng kết tủa thuận nghịch protein a) Kết tủa bằng muối 21 Khi cho thêm muối (amonium sulfate) vào dung dịch protein, các phân tử muối sẽ phân ly thành các ion, chính các ion này bắt lấy các phân tử nƣớc khỏi protein, do vậy các phân tử protein có khuynh hƣớng liên kết với nhau và bắt đầu tập hợp lại. Khi cho một lƣợng muối đủ lớn vào thì protein sẽ bắt đầu tủa. Nếu quá trình này thực hiện trong điều kiện nhiệt độ lạnh thì protein sẽ tủa mà không bị biến tính. Sau đó thu protein bằng cách ly tâm và hòa tan vào dung dịch đệm có nồng độ muối thấp. Phƣơng pháp này thƣờng đƣợc sử dụng để tách chiết protein hòa tan. Nó cũng đƣợc sử dụng để thu phân đoạn các protein khác nhau trong hỗn hợp, vì các phân tử protein lớn có khuynh hƣớng kết tủa trƣớc, các phân tử nhỏ hơn vẫn còn nằm trong dung dịch. Vì thế chúng ta có thể tìm ra điều kiện mà có thể thu protein ta đang nghiên cứu nhiều nhất trong hỗn hợp nhiều protein nhờ phân tích các đoạn ở nồng độ muối khác nhau. Nhƣ vậy với quá trình này ta có thể thu đƣợc protein mong muốn một cách tinh sạch hơn. b) Kết tủa bằng dung môi hữu cơ Độ hòa tan của protein trong dung dịch phụ thuộc vào nhiều yếu tố, một trong số đó là hằng số điện môi của dung dịch. Nhìn chung những phân tử dung môi có hằng số điện môi lớn (nhƣ nƣớc, dimethylsulfoxid) có thể ổn định các tƣơng tác giữa chúng với các phân tử protein và tạo điều kiện thuận lợi cho sự hòa tan của protein trong dung dịch. Ngƣợc lại, các dung môi với hằng số điện môi nhỏ (acetone, ethanol) ngăn cản sự phân tán của các phân tử protein trong môi trƣờng. Do đó độ hòa tan của các phân tử protein giảm và xảy ra sự kết tủa do làm giảm hằng số điện môi hiện hữu của môi trƣờng. Điều này có đƣợc bằng cách thêm một dung môi hòa tan trong nƣớc (nhƣ acetone) vào dung dịch chứa protein. Sự kết tủa bằng acetone hoặc ethanol 960 có nhiều thuận lợi do tƣơng đối rẻ, có sẵn dạng tinh khiết với ít chất tạp nhiễm gây độc hay ức chế đối với enzyme. Do nhiệt độ bay hơi của dung môi thấp nên dễ tách bỏ dung môi khỏi chế phẩm enzyme bằng phƣơng pháp sấy nhẹ bằng quạt gió. Có thể xảy ra hiện tƣợng biến tính không thuận nghịch khi kết tủa bằng dung môi hữu cơ. Nguyên nhân là do, khi hằng số điện môi giảm, phân tử protein có thể tự tháo gỡ và trở thành dạng không hoạt động, trong khi đó các gốc kỵ nƣớc lại tiếp xúc 22 với dung môi. Hiện tƣợng này xảy ra khi tiến hành tủa ở nhiệt độ phòng. Khi tiến hành kết tủa enzyme bằng những dung môi hữu cơ cần hết sức lƣu ý đến nhiệt độ, ta bắt buộc phải làm lạnh cả dung môi hữu cơ và dung dịch enzyme. Mức độ nhạy cảm nhiệt độ của enzyme khi có mặt dung môi hữu cơ thƣờng mạnh hơn mức độ nhạy cảm của enzyme với nhiệt độ khi có mặt của muối vô cơ. Ngƣời ta thƣờng tiến hành kết tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ ở nhiệt độ từ 3 – 10 0C. Tỷ lệ và nồng độ các dung môi hữu cơ dùng để kết tủa enzyme đƣợc xác định bằng thực nghiệm cho từng loại enzyme và từng nồng độ enzyme có trong dung dịch enzyme. 2.5.3 Tinh sạch enzyme bằng phƣơng pháp sắc ký Sắc ký sinh học là phƣơng pháp nhẹ nhàng để tinh sạch các phân tử sinh học, đặc biệt là protein mà vẫn duy trì hoạt tính của chúng. Các kỹ thuật sắc ký tinh sạch protein dựa vào các đặc tính vật lý của chúng. Bảng 2.1 : Các kỹ thuật sắc ký dựa vào đặc tính vật lý của protein Đặc tính Kỹ thuật Điện tích Sắc ký trao đổi ion (Ion Exchange Chromatography) Sự phân cực o Sắc ký hấp phụ (Adsorption Chromatography) o Sắc ký giấy. o Sắc ký đảo pha (Reverse Phase Chromatography) o Sắc ký tƣơng tác kỵ nƣớc (Hydrophobic Interaction Chromatography – HIC) Kích thƣớc Sắc ký lọc gel (Gel Filtration Chromatography) Nhận biết sinh học (tính đặc hiệu của ligand) Sắc ký ái lực (Affinity Chromatography) 23 Hình 2.6 : Nguyên tắc phân tách trong quá trình tinh sạch bằng sắc ký Hơn 40 năm qua kể từ khi việc đƣa vào thị trƣờng sản phẩm thƣơng mại Sephadex TM, kỹ thuật sắc ký lọc gel đã đóng một vai trò quan trọng trong việc tinh sạch enzyme, polysaccharide, nucleic acid, protein và các đại phân tử sinh học khác.  Nguyên tắc : Lọc gel là phƣơng pháp đơn giản nhất trong tất cả các loại sắc ký. Kỹ thuật này dùng để tách những phân tử có kích thƣớc, trọng lƣợng khác nhau bằng cách cho chúng đi qua cột gel. Những phân tử có kích thƣớc đủ nhỏ để lọt vào bên trong lỗ gel sẽ bị trì hoãn và di chuyển chậm qua cột, trong khi những phân tử lớn hơn di chuyển bên ngoài các hạt gel nên sẽ di chuyển nhanh và đƣợc giải hấp (thôi) ra khỏi cột sớm hơn các phân tử nhỏ. Kỹ thuật này có thể áp dụng theo hai cách : a) Phân tách nhóm (Group separations) Các thành phần của một mẫu đƣợc phân tách thành hai nhóm chính theo phạm vi kích thƣớc. Sự phân tách nhóm đƣợc sử dụng để loại các phân tử lớn hay các phân tử tạp chất nhỏ (nhƣ đỏ phenol khỏi dịch nuôi cấy) hoặc để loại muối hoặc trao đổi đệm. b) Phân đoạn các phân tử sinh học với độ phân giải cao (High resolution fractionation of biomolecules) Các thành phần của cùng một mẫu đƣợc phân tách theo sự khác biệt về kích thƣớc phân tử của chúng. Phân tách với độ phân giải cao có thể đƣợc dùng để cô lập một hoặc nhiều thành phần, để phân tách các monomer ra khỏi khối hỗn hợp, để xác định trọng lƣợng phân tử hoặc để phân tích sự phân bố theo trọng lƣợng phân tử. 24  Ƣu và nhƣợc điểm của sắc ký lọc gel a) Ƣu điểm Sắc ký lọc gel là một kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện trên các phân tử sinh học mẫn cảm với sự thay đổi về pH, nồng độ của ion kim loại hoặc các chất đồng tác động (cofactor) và các điều kiện môi trƣờng khắc nghiệt. Sự phân tách có thể đƣợc thực hiện khi có sự hiện diện của các ion hoặc các cofactor thiết yếu, các chất tẩy (detergents), urea, guanidinehydrocloride, ở cƣờng độ ion cao hoặc thấp, ở 370C hay trong phòng lạnh tùy theo những yêu cầu của thí nghiệm. Kỹ thuật này cho phép thu lại lƣợng mẫu lớn, tách các phân tử có cùng pI và dễ dàng khử muối. b) Nhƣợc điểm - Chậm (tốc độ thấp = thời gian dài) - Yêu cầu các cột có kích thƣớc lớn tƣơng đối so với lƣợng mẫu. - Sự phân tách dựa trên sự khác nhau về kích thƣớc phân tử, thƣờng khó đạt đƣợc sản phẩm tinh khiết hoàn toàn. Vì lý do này, sắc ký lọc gel thƣờng đƣợc sử dụng với những kỹ thuật khác nhau nhƣ sắc ký trao đổi ion hay sắc ký hấp phụ.  Một số thông số vật lý của phƣơng pháp Giới hạn tách (Exclusion Limit-EL) : Là khối lƣợng phân tử (MW) nhỏ nhất không chui vào bên trong hạt gel, nhƣ vậy tất cả chúng sẽ bị thổi cùng một lƣợt ra khỏi cột. Thí dụ G-50 có giới hạn tách 30.000 Da, có nghĩa là các phân tử lớn hơn 30.000 Da đều không chui vào hạt gel. Phạm vi tách (Fraction Range-FR) : Thí dụ Sephadex G-50 có giới hạn tách từ 1.500-30.000 Da, có nghĩa là các phân tử nằm trong khoảng MW nói trên sẽ đƣợc phân tách dễ dàng bởi Sephadex G-50. Độ ngậm nƣớc (Water Regain-WR) : Là trọng lƣợng nƣớc mà 1g bột gel khô hút nƣớc. Thí dụ G-50 có WR là 5 0,3 g. Giá trị này chƣa tính đến lƣợng nƣớc bao quanh hạt. Do vậy không thể sử dụng nó để tính thể tích cột. Thể tích nền : Là thể tích cuối cùng mà 1g bột gel khô hấp thụ khi trƣơng nở trong nƣớc. G-50 có thể tích nền 9-11 ml/g gel khô. Hạt gel : hạt gel hình cầu có nhiều lỗ. Kích thƣớc hạt xác định bằng mesh hoặc đƣờng kính hạt theo m. Hạt có kích thƣớc lớn (50-100 mesh, 100-300 m) cho 25 tốc độ dòng chảy qua cột cao, nhƣng kết quả tách thấp. Ngƣợc lại những hạt mịn (400 mesh, 10-40 m) lại cho tốc độ dòng chảy qua cột nhỏ, tách cũng không tốt. Thƣờng ngƣời ta chọn hạt gel có kích thƣớc 100-200 mesh, 50-150 m. Thể tích trống : Là tổng thể tích không gian bao quanh hạt gel trong cột xác định nhờ chất màu blue dextran có MW 2.000.000 Da. Thể tích thổi : Là thể tích đệm cần thiết để rửa thổi chất cần tách ra khỏi cột.  Phân tách bằng sắc ký lọc gel Để phân tách, môi trƣờng lọc gel đƣợc nhồi trong cột để tạo nền nhồi. Môi trƣờng này là một chất nền có lỗ ở dạng hạt hình cầu, loại hạt này đƣợc chọn vì tính ổn định về vật lý và hóa học của chúng, và tính trơ (thiếu các đặc tính hấp phụ và phản ứng). Nền nhồi đƣợc cân bằng bằng dung dịch đệm, dung dịch này làm đầy các lỗ của chất nền và khoảng không giữa các hạt. Chất lỏng bên trong các lỗ đôi khi đƣợc xem nhƣ phase tĩnh và chất lỏng này ở trạng thái cân bằng với chất lỏng bên ngoài các hạt, đƣợc xem nhƣ phase động. Cần lƣu ý rằng, mẫu đƣợc giải hấp một cách đồng nhất (isocraticlly), nghĩa là không cần sử dụng các loại đệm khác nhau trong quá trình phân tách. Tuy nhiên, bƣớc rửa giải dùng loại đệm đang chạy thƣờng bao gồm ở thời điểm kết thúc của quá trình phân tách, làm cho việc loại bỏ bất kỳ loại phân tử nào còn lƣu trong cột đƣợc dễ dàng hơn và để chuẩn bị cột cho lần chạy kế tiếp.  Quá trình lọc gel 1. Các hạt hình cầu của môi trƣờng lọc gel đƣợc nhồi trong cột. 2. Mẫu đƣợc nạp vào cột. 3. Dung dịch đệm (phase động) và mẫu di chuyển qua cột. Các phân tử khuếch tán trong và ngoài các lỗ của chất nền (cũng đƣợc miêu tả nhƣ quá trình phân đoạn mẫu giữa phase động và phase tĩnh). Các phân tử nhỏ hơn di chuyển vào sâu trong chất nền hơn và do đó lƣu lại trong cột lâu hơn. 4. Khi dung dịch đệm di chuyển liên tục qua cột, các phân tử lớn hơn kích thƣớc lỗ gel không thể khuyếch tán vào trong các lỗ và di chuyển qua cột. Các phân tử nhỏ hơn khuyếch tán vào trong lỗ gel và bị trì hoãn trong quá trình di chuyển xuống dƣới đáy cột. 26 5. Các phân tử lớn rời cột trƣớc nhất sau đó là các phân tử nhỏ hơn theo trình tự kích thƣớc của chúng. Quá trình phân tách hoàn toàn xảy ra khi một lƣợng dung môi bằng tổng thể tích cột (tƣơng đƣơng với thể tích nền nhồi) di chuyển qua môi trƣờng lọc gel. Hình 2.7 : Quá trình lọc gel 27 2.5.4 Xác định trọng lƣợng phân tử enzyme protease bằng phƣơng pháp điện di SDS – PAGE Sau khi qua các bƣớc ly trích và tinh sạch, ngƣời ta thƣờng kiểm tra lại độ tinh sạch của protein nhờ kỹ thuật điện di. Nhờ kỹ thuật này ta còn có thể xác định trọng lƣợng phân tử và độ tinh sạch của chúng. Điện di trên gel là tách các phân tử sinh học (DNA, RNA, protein) bằng cách cho đi qua chất nền là gel trong một điện trƣờng. Kĩ thuật điện di SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis) là một kĩ thuật điện di trên gel polyacrylamide khi có sự hiện diện của SDS. Gel polyacrylamide là gel đƣợc tạo thành do sự polymer hóa các phân tử acrylamide và N,N’-methylene-bis-acrylamide. Quá trình polymer hóa đƣợc xúc tác bởi hệ thống ammoniumpersulfate (APS); N, N ,N’, N’ - tetramethylenediamine (TEMED). Sự di chuyển của các phân tử trên gel phụ thuộc vào điện trƣờng và kích thƣớc của lỗ gel.Khả năng phân tách cũng nhƣ giới hạn trọng lƣợng phân tử của các phân tử sinh học mà gel có thể phân tách tùy thuộc vào nồng độ acrylamide và bis-acrylamide : nếu nồng độ thấp sẽ tạo ra lỗ gel lớn, cho phép phân tách các phân tử sinh học có kích thƣớc lớn và ngƣợc lại. SDS là tác nhân làm biến tính và âm tính hóa các phân tử protein. Trong kỹ thuật này protein đƣợc xử lý với chất tẩy SDS và tác nhân khử cầu nối disulfite là mercaptoethanol.Với các tác nhân này protein từ cấu trúc bậc 2,3,4 đƣợc biến đổi thành chuỗi polypeptide (bậc 1) và tất cả các protein đều đƣợc tích điện âm. Nhờ đó, sự di chuyển trong gel của các phân tử protein chỉ phụ thuộc vào kích thƣớc, những phân tử có kích thƣớc lớn sẽ di chuyển chậm hơn những phân tử có kích thƣớc nhỏ khi đi qua một lỗ gel có kích thƣớc nhất định. Dƣới tác dụng của điện trƣờng các phân tử tích điện âm sẽ di chuyển về cực dƣơng và các phân tử tích điện dƣơng sẽ di chuyển về cực âm của điện trƣờng. Để xác định phân tử lƣợng của một protein, ngƣời ta thƣờng so sánh với một thang phân tử lƣợng chuẩn, là một hỗn hợp các protein có trọng lƣợng phân tử khác nhau đã biết. 28 Để đƣa các protein trong mẫu về cùng một vạch xuất phát đồng thời tạo ra sự phân tách tốt hơn, ngƣời ta thƣờng sử dụng phƣơng pháp điện di trên gel không liên tục (discontinuous gel). Trong phƣơng pháp này gel gồm 2 lớp:  Lớp gel gom (stacking gel) (lớp trên) : các protein trong mẫu đƣợc dồn lại và tạo một lớp băng mỏng.  Lớp gel phân tách (separating gel) (lớp dƣới) : tạo ra các băng protein có trọng lƣợng phân tử, kích thƣớc khác nhau từ một hỗn hợp protein xuất phát ban đầu. Hai lớp gel này đƣợc phân biệt nhau bởi dung dịch đệm, nồng độ acrylamide và vị trí. Kĩ thuật SDS-PAGE có thể xác định đƣợc những phân tử protein có trọng lƣợng phân tử từ 10.000-200.000 daltons. Những phân tử protein có trọng lƣợng lớn hơn 200.000 daltons thƣờng đƣợc xác định trên gel có nồng độ acrylamide hơn 2,5%. 29 PHẦN 3:VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 3.1 Thời gian và địa điểm Thời gian thực hiện đề tài từ tháng 10/2/2006 đến tháng 1/6/2006 tại Viện Sinh Học Nhiệt Đới TPHCM. 3.2 Vật Liệu 3.2.1 Chế phẩm enzyme thô Chế phẩm enzyme protease dạng bột thô của hai chủng Aspergillus oryzae và Aspergillus kawasaki do phòng Vi Sinh Ứng Dụng - Viện SHNĐ cung cấp. 3.2.2 Hóa chất Hóa chất để pha dung dịch đệm phosphate : Na2HPO4.12H2O, NaH2PO4 Hóa chất để tủa enzyme : Cồn 960, (NH4)2SO4 Hóa chất để xác định hàm lƣợng protein : Dung dịch albumin chuẩn 1mg/ml, thuốc thử Bradford (Coomasie Brilliant Blue, Ethanol tuyệt đối, Acid Phosphoric) Hóa chất để xác định hoạt tính enzyme : dung dịch Tyrosine 1mg/ml; HCl 0,1M; Na2CO3 0,4M; dung dịch Trichloacetic acid 0,4M (TCA); thuốc thử Folin; dung dịch đệm phosphate 0,1M; casein dạng bột. Hóa chất dùng trong phƣơng pháp sắc ký. Hóa chất dùng trong phƣơng pháp điện di. 3.2.3 Thiết bị  Máy đo quang phổ UV – Vis  Máy khuấy từ  Thiết bị lọc hút chân không  Máy ly tâm  Máy đo pH  Cân phân tích  Bể ổn nhiệt  Tủ sấy  Hệ thống sắc ký cột áp suất thấp, hãng Biorad gồm phễu đổ gel, flow adaptor, vòi hút chân không để khử khí cho dung dịch.  Ống nghiệm 30  Bình định mức  Ống đong  Giấy lọc  Phễu lọc  Đũa khuấy  Pipette thủy tinh, pipetman 50 – 300 l, 100 – 1000 l  Các dụng cụ để chạy điện di : Bộ điện di dứng, bộ nguồn chạy điện di, đầu típ, eppendorf, phao để eppendorf. 3.3. Phƣơng pháp thí nghiệm 3.3.1. Bố trí thí nghiệm 3.3.1.1. Thí nghiệm 1 : Xác định hàm lƣợng protein và hoạt tính protease của dịch chiết enzyme thô. Cân 100g chế phẩm enzyme thô của mỗi chủng, hòa tan trong 750 ml nƣớc cất. Khuấy đều hỗn hợp trong thời gian 1 tiếng bằng máy khuấy từ. Lọc hỗn hợp qua vải thô. Dịch lọc thu đƣợc tiếp tục lọc bằng thiết bị lọc hút chân không. Dịch sau lọc đƣợc đem đi ly tâm 4000 vòng/phút trong 15 phút. Loại bỏ cặn và thu lấy dịch . Định mức đến 650 ml. Bảo quản ở 100C. Dịch chiết enzyme thô đƣợc xác định hàm lƣợng protein theo phƣơng pháp Bradford và hoạt tính protease theo phƣơng pháp Amano. a) Xác định hàm lƣợng protein theo phƣơng pháp Bradford Bradford là một trong những phƣơng pháp để xác định hàm lƣợng protein. Phƣơng pháp này có một số ƣu điểm sau :  Dễ sử dụng (chỉ cần một loại thuốc thử).  Độ nhạy cao (có thể phát hiện protein ở 1 – 20 g)  Phức chất giữa thuốc nhuộm và protein tƣơng đối ổn định.  Phƣơng pháp này ít bị cản trở bởi các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu protein. 31  Nguyên tắc Phƣơng pháp này dựa trên sự thay đổi bƣớc sóng hấp thu cực đại và sự thay đổi màu xảy ra khi Coomasie Brilliant Blue liên kết với protein trong dung dịch acid. Trong dung dịch mang tính acid, khi không kết nối với protein thì thuốc nhuộm có bƣớc sóng hấp thu cực đại ở 465 nm. Khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm hấp thu cực đại ở bƣớc sóng 595 nm. Độ hấp thu ở bƣớc sóng 595 nm liên hệ trực tiếp với nồng độ protein. Dạng proton hóa của thuốc nhuộm Coomasie Brilliant Blue có màu da cam đỏ. Thuốc nhuộm liên kết chặt chẽ với các protein, tƣơng tác với cả nhóm kỵ nƣớc và các nhóm mang điện tích dƣơng trên phân tử protein. Trong môi trƣờng của các gốc mang điện tích dƣơng, sự proton hóa không xảy ra và màu xanh xuất hiện. Màu sẽ xuất hiện sau hai phút và ổn định trong gần một giờ.  Hóa chất và thiết bị  Hóa chất Dung dịch Albumin chuẩn. Thuốc thử Bradford.  Thiết bị Máy đo quang phổ UV - Vis Hình 3.1 : Máy quang phổ UV-Vis 32  Các bƣớc tiến hành  Xây dựng đƣờng chuẩn Albumin Pha dung dịch Albumin chuẩn 1mg/ml : Cân 100 mg Albumin dạng bột trên cân phân tích, định mức đến 100 ml bằng nƣớc cất. Pha thuốc thử Bradford : Coomasie Brilliant Blue (CBB) : 0,005 g Ethanol tuyệt đối : 23,5 g Acid phosphoric 85% : 42,5 g Phẩm màu CBB đƣợc làm tan trong ethanol, bổ sung acid phosphoric 85% và chỉnh tới 500 ml bằng nƣớc cất. Bảo quản trong chai tối. Chuẩn bị các ống nghiệm chứa dung dịch Albumin chuẩn ở các nồng độ xác định nhƣ bảng 3.1 Bảng 3.1 : Đƣờng chuẩn albumin Ống nghiệm Đối chứng 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Nồng độ ( g/ml) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Dung dịch albumin chuẩn ( l) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Nƣớc cất ( l) 1000 990 980 970 960 950 940 930 920 910 Thuốc thử Bradford (ml) 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 Tiến hành đo OD dung dịch trong các ống nghiệm ở bƣớc sóng 595 nm. Trị số mật độ quang của các ống từ 1 đến 9 sau khi trừ đi trị số của ống đối chứng sẽ xây dựng đƣợc đồ thị biểu diễn sự biến thiên của mật độ quang ( OD) theo nồng độ protein.  Xác định nồng độ protein của mẫu 33 Dịch chiết enzyme thô của hai chủng nấm mốc cũng đƣợc tiến hành tƣơng tự nhƣ trên. Mẫu đƣợc pha loãng sao cho trị số mật độ quang đo đƣợc trong khoảng của đƣờng chuẩn. Mật độ quang của mẫu cũng trừ đi trị số mật độ quang của ống đối chứng, rồi chiếu vào đƣờng chuẩn để suy ra lƣợng protein có trong dung dịch mẫu thí nghiệm ( g/ml). b) Xác định hoạt tính enzyme theo phƣơng pháp Amano  Nguyên tắc Dùng casein làm cơ chất, xác định hoạt tính phân giải protein của enzyme protease trên cơ sở định lƣợng sản phẩm tạo thành trong phản ứng bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin. Dựa vào đồ thị chuẩn để tính lƣợng tyrosine tƣơng ứng với lƣợng sản phẩm thủy phân dƣới tác dụng của enzyme. Hoạt động của enzyme đƣợc biểu diễn bằng đơn vị hoạt tính thủy phân protein của enzyme.  Hóa chất và thiết bị  Hóa chất HCl 0,1M Na2CO3 0,4M Dung dịch TCA 0,4M Tyrosine tinh khiết Thuốc thử Folin Đệm phosphate pH7 0,1M Dung dịch casein 1% : Cân 1g casein từ sữa (Hãng Merck), thêm vào 100 ml dung dịch đệm phosphate 0,1M; pH = 7.  Dụng cụ và thiết bị Ống nghiệm, pipette, bình định mức, giấy lọc. Bể ổn nhiệt Máy đo quang phổ UV – Vis Máy đo pH  Các bƣớc tiến hành  Xây dựng đƣờng chuẩn tyrosine 34 Bảng 3.2 Đƣờng chuẩn tyrosine. Ống số Đối chứng 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Nồng độ ( g/ml) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Dung dịch tyrosine chuẩn ( l) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Dung dịch HCl ( l) 1000 990 980 970 960 950 940 930 920 910 Na2CO3 (ml) 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 Thuốc thử Folin (ml) 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Pha dung dịch tyrosine ở các nồng độ khác nhau : 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 gtyrosine/mlHCl nhƣ bảng 3.2. Thêm 5 ml dung dịch Na2CO3 0,4M vào dung dịch tyrosine ở các nồng độ khác nhau ở trên và thêm 1 ml thuốc thử Folin vào dung dịch hỗn hợp. Sau khi trộn đều, để ổn định dung dịch ở 37 0,50C trong 20 phút. Đo độ hấp thụ của dung dịch này ở bƣớc sóng 660 nm. Ghi nhận kết quả As10, As20, As30, As40, As50, As60, As70, As80, As90. Đối với ống đối chứng dùng 1 ml acid HCl 0,1M thay cho tyrosine. Đo độ hấp thu của dung dịch này ở bƣớc sóng 660 nm và ghi nhận kết quả này là Aso. Trị số mật độ quang của các ống từ 1 đến 9 sau khi trừ đi trị số của ống đối chứng sẽ đƣợc giá trị OD1 đến OD9. Vẽ đồ thị dựa vào biến thiên của OD theo nồng độ protein. Đồ thị này gọi là đƣờng chuẩn tyrosine.  Xác định hoạt tính enzyme protease Hoạt tính enzyme đƣợc khảo sát ở nhiệt độ 370C và pH = 7. Cho 1 ml dung dịch cơ chất casein 1% vào ống nghiệm, ủ ở 37 0,50C trong 10 – 15 phút. Sau thời gian ủ, cho 1 ml dịch chiết enzyme thô vào và lắc đều. Đem ủ hỗn hợp này ở 37 0,50C trong một giờ. Cho vào 2 ml dung dịch TCA 0,4M để ngừng phản ứng enzyme. 35 Để ổn định dung dịch trong 25 phút, sau đó lọc dung dịch này qua giấy lọc để loại tủa. Cho 5 ml dung dịch Na2CO3 vào 1ml dịch lọc. Thêm 1 ml thuốc thử Folin. Trộn đều, để yên ở 37 0,50C trong 20 phút. Khi dung dịch xuất hiện màu xanh, đem đo độ hấp thu ở bƣớc sóng 660 nm (ghi nhận kết quả này là Am). Mẫu đối chứng : lấy 1 ml nƣớc cất thay cho 1 ml dung dịch enzyme và tiến hành các bƣớc tƣơng tự nhƣ mẫu thí nghiệm với cùng điều kiện. Ghi nhận kết quả độ hấp thụ là A0. Hàm lƣợng tyrosine đƣợc giải phóng do protease thủy phân đƣợc tính bằng cách lấy Am – A0 rồi lấy kết quả so với đƣờng chuẩn tyrosine để xác định hoạt độ protease theo tính toán sau : Một đơn vị hoạt tính (ĐVHT) enzyme protease đƣợc xác định là lƣợng enzyme để tạo ra lƣợng amino acid tƣơng đƣơng với 100 g tyrosine trong 1 ml dịch lọc dƣới điều kiện thí nghiệm. Hoạt tính enzyme protease (ĐVHT/ml) = (Am – A0).F.1/100.n Hoạt tính enzyme protease (ĐVHT/g) = F = [10/ As10 + 20/ As20 + 30/ As30 + 40/ As40 + 50/ As50 + 60/ As60 + 70/ As70 + 80/ As80 + 90/ As90]/9 Am : độ hấp thu của mẫu A0 : Độ hấp thu của ống đối chứng F : Hệ số tƣơng quan giữa hàm lƣợng tyrosine và độ hấp thu ở bƣớc sóng 660 nm trên đƣờng chuẩn. n : Hệ số pha loãng của enzyme 1/100 : Hệ số chuyển đổi V : Thể tích của dung dịch enzyme m : khối lƣợng chế phẩm enzyme thô.  Tính toán hoạt tính riêng (HTR) của enzyme protease Từ kết quả hàm lƣợng protein (mg/ml) và hoạt tính enzyme protease (UI/ml) tính hoạt tính riêng của enzyme. (Am – A0).F.1/100.n.V Số đơn vị hoạt tính m 36 HTR (UI/mg) = 3.3.1.2 Thí nghiệm 2 : Xác định nồng độ muối (NH4)2SO4 và tỷ lệ cồn tối ƣu để tủa enzyme protease. Chiết enzyme từ chế phẩm enzyme thô theo mô tả ở thí nghiệm 1, dịch chiết thu đƣợc đem đi tủa với các tác nhân tủa là muối (NH4)2SO4 và cồn 96 0 . a) Tủa protein bằng muối (NH4)2SO4 ở các nồng độ bão hòa khác nhau Bảng 3.3 : Khối lƣợng (NH4)2SO4 tƣơng ứng với mỗi nồng độ. Nồng độ (NH4)2SO4 (% độ bão hòa) 50 55 60 65 70 75 Dịch enzyme (ml) 50 50 50 50 50 50 (NH4)2SO4 (g) 15,7 17,55 19,5 21,5 23,6 25,3 Tiến hành tủa trong điều kiện nhiệt độ thấp để đảm bảo hoạt tính enzyme không bị ảnh hƣởng và quá trình tủa xảy ra tốt. Thể tích dịch enzyme và khối lƣợng muối (NH4)2SO4 tƣơng ứng với mỗi nồng độ đƣợc sử dụng nhƣ bảng 3.3 Dịch chiết enzyme thô đƣợc cho vào becher đặt trong chậu nhỏ chứa đá vụn xung quanh. Tất cả đƣợc đặt trên máy khuấy từ. Cho từ từ muối (NH4)2SO4 vào để muối có thời gian hòa tan trong dịch enzyme. Tiếp tục khuấy từ thêm 15 phút. Lấy dịch đi ly tâm 5000 vòng /phút trong 20 phút. Thu tủa, hòa lại trong 15 ml dung dịch đệm phosphate pH7. Cho dịch pha tủa vào lọ nhỏ, bảo quản 100C . b) Tủa enzyme bằng ethanol 960 ở các tỷ lệ khác nhau Bảng 3.4 : Thể tích cồn tƣơng ứng với các tỷ lệ Tỷ lệ dịch : ethanol 1:1 1:2 1:3 1:4 1:5 1:6 mg protein enzyme 37 Dịch enzyme (ml) 50 50 50 50 50 50 Ethanol (ml) 50 100 150 200 250 300 Để tránh làm biến tính protein, ethanol 960 phải đƣợc giữ lạnh trƣớc khi tiến hành tủa. Thể tích dịch enzyme và thể tích cồn tƣơng ứng với mỗi nồng độ đƣợc sử dụng nhƣ bảng 3.4 Lắc đều hỗn hợp, bảo quản lạnh trong một giờ. Ly tâm 5000 vòng/phút trong 20 phút. Bỏ dịch, thu tủa, hòa trong 15 ml dung dịch đệm phosphate pH7. Cho dịch hòa tan tủa vào lọ nhỏ, bảo quản 100C. c) Xác định nồng độ muối (NH4)2SO4 và tỷ lệ cồn tối ƣu để tủa enzyme protease. Dịch hòa tan tủa thu đƣợc từ việc tủa dịch chiết enzyme thô bằng (NH4)2SO4 và C2H5OH 96 0 ở các nồng độ và tỷ lệ khác nhau đƣợc xác định hàm lƣợng protein và hoạt tính protease (ở nhiệt độ 370C, pH = 7) nhƣ ở thí nghiệm 1. Nồng độ muối và tỷ lệ cồn tối ƣu cho việc tủa enzyme protease là giá trị mà ở đó hoạt tính protease thu đƣợc cao nhất. 3.3.1.3 Thí nghiệm 3 : Xác định nhiệt độ và pH tối ƣu cho hoạt động của protease. Dịch hòa tan tủa thu đƣợc khi tủa protease ở nồng độ muối và tỷ lệ cồn tối ƣu ở thí nghiệm 2 đƣợc xác định hoạt tính protease theo phƣơng pháp Amano ở các giá trị pH và nhiệt độ khác nhau. a) Xác định pH tối ƣu cho hoạt động của protease Khảo sát hoạt tính protease ở các giá trị pH : 4, 5, 6, 7, 8, 9 trong cùng điều kiện nhiệt độ (370C). Ở giá trị pH nào cho hoạt động của protease mạnh nhất (hoạt tính cao nhất) thì đó là pH tối ƣu cho hoạt động của enzyme. b) Xác định nhiệt độ tối ƣu Khảo sát hoạt tính enzyme ở các nhiệt độ (0C) : 37, 47, 57, 67, 77 trong cùng một điều kiện về pH (pH tối ƣu xác định đƣợc ở thí nghiệm trên). Ở nhiệt độ nào hoạt tính enzyme cao nhất thì đó là nhiệt độ tối ƣu cho hoạt động của enzyme. 38 3.3.1.4 Thí nghiệm 4 : Tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel a) Hóa chất và dụng cụ  Dụng cụ và thiết bị Hệ thống sắc ký cột áp suất thấp, hãng Bio-Rad, Mỹ. Phễu đổ gel Bình hút chân không. Flow Adapor 1,5 cm. Cột sắc ký Bio-Rad, kích thƣớc 30 x 1,5 cm; thể tích : 53 ml [thể tích = chiều cao cột x (đƣờng kính/2)2 x 3,14]. Bình đựng dung dịch đệm. Ống nghiệm: 50 cái. Vòi hút chân không để khử bọt khí cho các dung dịch Hình 3.2 Hệ thống sắc ký cột áp suất thấp, hãng Bio-Rad, Mỹ  Hóa chất  Gel Bio-Gel P-100, hãng Bio-Rad : là các hạt polyacrylamide tạo lỗ, đƣợc điều chế bằng quá trình đồng polymer hóa acrylamide và N, N’-methylene-bis- acrylamide. Các gel này rất ƣa nƣớc và không mang điện tích, giúp việc lọc các hợp chất nhạy cảm qua gel đạt hiệu quả. Đặc tính của Bio-Gel P-100 : dạng hạt mịn, kích thƣớc hạt 45 – 90 m, khả năng ngậm nƣớc : 12ml/1g gel khô, phạm vi phân tách : 5000-100000 daltons.  Đệm phosphate 0,1M; pH7 : khử bọt khí trƣớc khi dùng. b) Các bƣớc tiến hành 39  Chuẩn bị gel Cân 5 g gel Bio-gel P-100 khô. Cho bột gel từ từ vào dung dịch đệm phosphate 0,1M, pH = 7 đựng trong cốc. Dùng dung dịch đệm phosphate pH = 7 nhiều gấp hai lần so với thể tích lớp nền gel cần cho trong cột. Cụ thể dùng ít nhất 53 x 2 = 106 ml dung dịch đệm. Sau khi quá trình hydrate xảy ra hoàn toàn, gạn lớp nổi trên bề mặt. Chuyển dung dịch vào một bình hút chân không có gắn với vòi hút chân không Khử khí của dung dịch trong khoảng từ 5-10 phút, thỉnh thoảng lắc nhẹ bình, không dùng đũa khuấy vì nó có thể làm hƣ gel. Thêm dung dịch đệm để khử khí với thể tích gấp hai lần thể tích lớp nền và lắc nhẹ. Để gel ổn định cho đến khi 90 – 95% số hạt ổn định. Gạn hoặc loại lớp nổi trên bề mặt bằng cách hút để loại các hạt mịn. Gắn phễu đổ gel vào cột, đóng lỗ thoát của cột và cho dung dịch đệm làm đầy 20% thể tích cột. Rót đều dung dịch gel vào cột thành một dòng di chuyển nhẹ. Tránh làm bắn gel, đảm bảo việc nhồi cột đều và tránh bị bọt khí. Khi lớp nền đã hình thành trong cột từ 2 – 5 cm, mở khóa đầu ra của cột cho đến khi cột đƣợc nạp đầy gel. Khi cột đã đƣợc nạp đầy gel, mở khóa đầu ra của cột và gắn flow adaptor. Mở khóa đầu ra của cột, cho dung dịch đệm với thể tích gấp hai lần thể tích lớp nền chảy qua cột lúc điều khiển tốc độ chảy. Đóng đầu ra của cột, điều chỉnh flow adaptor xuống đến lớp nền gel. Nạp mẫu vào trên bề mặt lớp nền bằng cách bơm hoặc tiêm mẫu vào trên lớp nền gel qua flow adaptor.  Chuẩn bị mẫu Dịch hòa tan tủa sau khi tủa protein với nồng độ muối và tỷ lệ cồn tối ƣu ở thí nghiệm 2 đƣợc chạy qua sắc ký lọc gel. Mẫu chạy sắc ký phải sạch (không bị nhiễm bẩn và không có các hạt rắn), hòa tan hoàn toàn trong dung dịch đệm. Lọc mẫu qua milipore (màng lọc 0,45 micrometre) sẽ làm gia tăng độ bền và thời gian sử dụng của cột . Thu và xác định mẫu tách đƣợc. 40 Dịch ra khỏi cột đƣợc đo độ hấp thụ ở bƣớc sóng 280 nm bằng detector trong hệ sắc ký và đƣợc thể hiện độ hấp thu dƣới dạng sắc ký đồ bằng phần mềm LP Data View trên máy tính. Dịch đƣợc thu tự động bằng máy thu mẫu (collector), mỗi phân đoạn 2 ml.. Xác định hàm lƣợng protein và hoạt tính enzyme protease Dựa trên sắc ký đồ, tiến hành gom các phân đoạn thuộc cùng một peak. Các peak sẽ đuợc phân tích hàm lƣợng protein theo phƣơng pháp Bradford và hoạt tính protease theo phƣơng pháp Amano sau tinh sạch nhƣ thí nghiệm 2 c) Tính hiệu suất về hoạt tính enzyme protease và độ tinh sạch của enzyme sau tinh sạch bằng sắc ký lọc gel.  Hiệu suất về hoạt tính enzyme = Trong đó : HT enzyme 1 : Hoạt tính enzyme protease trƣớc tinh sạch (UI/ml dung dịch enzyme trƣớc tinh sạch. HT enzyme 2 : Hoạt tính enzyme protease sau tinh sạch (UI/ml dung dịch enzyme sau tinh sạch.)  HTR của enzyme protease sau tinh sạch =  Độ tinh sạch của enzyme = Trong đó : HTR enzyme 1 : Hoạt tính riêng enzyme trƣớc mỗi lần tinh sạch. HTR enzyme 2 : Hoạt tính riêng enzyme tƣơng ứng sau mỗi lần tinh sạch.  Độ tinh sạch của protease sau sắc ký = Trong đó : HTR enzyme 1 : Hoạt tính riêng của enzyme protease trƣớc tinh sạch HTR enzyme 2 : Hoạt tính riêng của enzyme protease sau tinh sạch. HT enzyme 2 HT enzym 1 HT enzyme 2 Hàm lƣợng protein sau tinh sạch HTR enzyme 2 HTR enzyme1 HTR enzyme 2 HTR enzyme 1 41 3.3.1.7 Thí nghiệm 5 : Xác định trọng lƣợng phân tử enzyme protease bằng phƣơng pháp điện di SDS - PAGE a) Thiết bị và dụng cụ Bộ điện di đứng Bộ nguồn chạy điện di Biorad. Pipetteman Đầu típ Eppendorf Dụng cụ làm gel (tấm kính, lƣợc, kẹp...) Hóa chất N,N,N’,N’-tetramethylennediamide(C6H16N2 – TEMED) Dung dịch Acrylamide/Bisacrylamide 40% (29:1)93,3%C) -Mercaptoethanol (HSCH2CH2OH) Thang protein chuẩn SDS-PAGE (Bio-rad), gồm các protein chuẩn có kích thƣớc xác định sau : Myosin : 200000 daltons. -galactosidase : 116250 daltons Phosphorylase b : 97400 daltons Bonvine serum albumin : 66200 daltons Ovalbumin : 45000 daltons Carbonic anhydrase : 31000 daltons Soybean trypsin inhibitor : 21500 daltons Lysozyme : 14400 daltons Aprotinin : 6500 dalons Sodium dodecyl sunfate (SDS) Ammoniumpersulfate [(NH4)2S2O8] Coomasie Brilliant Blue G-250 (Bio-rad) Cồn tuyệt đối (99,50) Methanol (CH3OH) 42 Tris (hydroxymethyl) aminomethane Acid acetic Bromophenol blue Glycerol (C3H8O3) Glycine (C2H5O2N) Acid Clohydric (HCl) Sodium dodecyl sunfate (SDS) 10% : cân 10g SDS, cho 100 ml nƣớc cất vào khuấy cho tới khi tan hết. Dung dịch đệm gel phân tách (separating gel buffer) Tris-Cl 1,5M; pH8,8- 0,4% SDS : cân 36,3g Tris pha trong 100 ml nƣớc cất, thêm dần HCl 6N và khuấy dung dịch trên cho tới khi pH kế chỉ 8,8. Hút 8 ml dung dịch SDS 10% cho vào. Thêm nƣớc cất cho đủ 200 ml, lắc đều giữ ở 40C Ammoniumpersulfate 10% (chỉ pha trƣớc khi dùng) : cân 0,1g cho vào một eppendorf 1000 l, thêm 1 ml nƣớc cất, lắc đều, để ở nhiệt độ phòng. Dung dịch đệm điện di Tris-glycine pH 8,3 : pha dung dịch mẹ 10X chứa 30 g Tris, 144g Glycine, 10g SDS hòa trong 1000 ml nƣớc cất. Dung dịch nạp mẫu 2X (2X treatment buffer) có thành phần nhƣ sau : 2,5 ml dung dịch đệm Tris-Cl 0,5M; pH 6,8; 4 ml 10%SDS; 2 ml Glycerol; 2 mg Bromophenol Blue; 0,2 ml mercaptoethanol; thêm nƣớc đủ 10 ml. Dung dịch nhuộm gel : chuẩn bị 250 ml dung dịch nhuộm gel chứa 0,625g Coomasie Blue G 250;112,5 ml ethanol tuyệt đối; 112,5 ml nƣớc cất và 25 ml acid acetic; lắc đều; giữ trong chai màu tối. Dung dịch giải nhuộm : 30 ml methanol, 10 ml acid acetic, 60 ml nƣớc cất. b) Phƣơng pháp  Đổ gel  Gel phân tách (separating gel) Cho các thành phần sau theo thứ tự, vào becher 50 ml sạch : 40% Acrylamide/Bis (29:1) : 2,5 ml Tris – HCl 1,5M pH8,8 – 4,4% SDS : 2,5 ml Nƣớc cất : 4,445 ml TEMED : 5 l 43 Ammoniumpersulfate 10% : 50 l Tổng thể tích : 10 ml Sau khi cho Ammoniumpersulfate 10% vào, lắc nhẹ ống Falcon vài lần (tránh tạo bọt khí), dùng pipetteman bơm dung dịch gel vào khuôn, đổ gel sao cho mức dung dịch gel cao hơn 7 cm (tránh tạo bọt khí trong khuôn gel). Sau đó nhẹ nhàng đặt một lớp nƣớc cất lên trên lớp gel để mặt gel đƣợc phẳng. Chờ gel đông (khoảng 20 – 30 phút).  Gel gom (Stacking gel): Cho các thành phần sau theo thứ tự vào becher 50 ml sạch khác : 40% Acrylamide/Bis (29:1) : 0,5 ml Tris – HCl 1,5M pH8,8 – 4,4% SDS : 1 ml Nƣớc cất : 2,476 ml TEMED : 4 l Ammoniumpersulfate 10% : 20 l Tổng thể tích : 4 ml Sau khi gel phân tách đã trùng ngƣng hoàn toàn, đổ hết nƣớc bên trên. Tiến hành đổ lớp gel gom bằng cách dùng pipetteman bơm dung dịch gel gom vào khuôn. Đồng thời đƣa lƣợc vào khuôn để tạo các giếng mẫu (tránh tạo bọt khí trong khuôn gel). Sau khi gel trùng ngƣng, tháo lƣợc, lắp đĩa gel vào bộ phận điện di cho dung dịch điện di vào buồng điện di.  Chuẩn bị mẫu và chạy điện di  Xử lý mẫu Tiến hành chạy điện di dịch chiết enzyme thô của Aspergillus oryzae và Aspergillus kawasaki đồng thời với peak đƣợc dự đoán là protease mà ta quan tâm của cả hai chủng khi tủa protein bằng cồn. Hút 30 l dung dịch nạp mẫu (2X treatment buffer) và 30 l dung dịch mẫu protein vào một eppendorf sạch, đậy nắp và búng nhẹ cho đều, đun sôi cách thủy 5 – 10 phút. Ly tâm 10000 vòng/phút trong 1-5 giây. Chú ý nồng độ protein trong mẫu vừa đủ sao cho hàm lƣợng protein trong một giếng không vƣợt quá 20 – 40 g và hàm lƣợng protein/band không vƣợt quá 0,1 g. 44 Đối với thang chuẩn protein (Biorad) hút 2 l vào eppendorf 1 ml chứa 8 l nƣớc cất và 10 l dung dịch nạp mẫu.  Tiến hành chạy điện di Dùng pipetteman 10 l nạp mẫu vào các giếng (20 l/giếng) Tiến hành chạy điện di ổn định dòng : 100V. Sau khi điện di, nhuộm gel với dung dịch nhuộm đã chuẩn bị trƣớc (2-4 giờ) trong một giờ. Sau đó tiến hành giải nhuộm bằng cách ngâm gel trong dung dịch giải nhuộm cho đến khi nền gel trở nên trong suốt không màu. Sau khi nhuộm xong, protein đƣợc phát hiện nhờ các vạch màu xanh lam trên nền gel trong suốt. Xác định trọng lƣợng phân tử của protein Đo khoảng cách di chuyển của các band protein từ gel phân tách tới các band protein và khoảng cách di chuyển từ gel phân tách tới vạch màu cuối cùng. Tính giá trị Rf : Rf = Vẽ biểu đồ lg của các giá trị trọng lƣợng phân tử của các protein chuẩn và các giá trị Rf của chúng. Trọng lƣợng phân tử của các vạch protein chƣa biết trọng lƣợng phân tử có thể xác định thông qua giá trị Rf của chúng. Trọng lƣợng phân tử của các protein chƣa biết trọng lƣợng phân tử có thể xác định thông qua giá trị Rf của chúng qua phƣơng pháp ngoại suy từ đồ thị. 3.4 Phƣơng pháp xử lý số liệu Số liệu đƣợc xử lý bằng phần mềm Excel. Khoảng cách di chuyển của protein Khoảng cách di chuyển của vạch màu bromophenol blue 45 PHẦN 4 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease của dịch chiết enzyme thô Chiết enzyme từ 100g chế phẩm enzyme thô bằng nƣớc cất. Dịch chiết thu đƣợc đem xác định hàm lƣợng protein và hoạt tính protease theo thí nghiệm 1 ở mục 3.3.1.1. Để dễ so sánh, chúng tôi quy đổi tổng hàm lƣợng protein và tổng hoạt tính protease trong 100g chế phẩm thành hàm lƣợng và hoạt tính trên một gam chế phẩm. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 4.1 Bảng 4.1 : Hoạt tính enzyme protease và hàm lƣợng protein của dịch chiết enzyme thô của hai chủng Asp.oryzae và Asp.kawasaki Hoạt tính protease (UI/g CP) Hàm lƣợng protein (mg/g CP) HTR(UI/mg) Asp.oryzae 29,01 31,20 0,93 Asp. kawasaki 12,85 20,40 0,63 Đồ thị 4.1 Đồ thị so sánh hàm lƣợng protein và hoạt tính enzyme protease trong dịch chiết enzyme thô giữa hai chủng nấm mốc Asp.oryzae và Asp.kawasaki  Nhận xét : Từ đồ thị 4.1 cho thấy hàm lƣợng protein và hoạt tính protease của Asp.oryzae cao hơn Asp.kawasaki. 4.2 Nồng độ muối tối ƣu cho việc tủa protease 0 5 10 15 20 25 30 35 Asp.oryzae Asp.kawasaki Hàm lƣợng (mg/g CP) Hoạt tính (UI/g CP) 46 Chiết enzyme từ chế phẩm enzyme thô theo mô tả ở thí nghiệm 1, dịch chiết đƣợc tủa với muối (NH4)2SO4 ở các nồng độ 50, 55, 60, 65, 70, 75% độ bão hòa. Sử dụng 50 ml dịch chiết enzyme thô cho mỗi nồng độ. Ly tâm để thu tủa. Sau đó cặn tủa thu đƣợc hòa tan vào 15 ml dung dịch đệm phosphate pH = 7. Xác định tổng hàm lƣợng protein và tổng hoạt tính enzyme protease (ở nhiệt độ 370C, pH = 7) trong 15 ml dịch hòa tan tủa này. Ở nồng độ nào cho hoạt tính enzyme cao nhất thì đó là nồng độ tối ƣu cho việc tủa enzyme protease. 4.2.1 Kết quả đối với chủng Asp.oryzae Bảng 4.2 Tổng hàm lƣợng protein và tổng hoạt tính enzyme protease trong 15 ml dịch hòa tan tủa của Asp.oryzae khi tủa protease bằng muối. Nồng độ muối (NH4)2SO4 (% độ bão hòa) Tổng hoạt tính (UI) Tổng hàm lƣợng (mg) HTR (UI/mg) 50 271,67 106,12 2,56 55 385,98 129,96 2,97 60 495,85 159,95 3,1 65 805,91 204,56 3,94 70 702,29 208,4 3,37 75 625,2 216,09 2,89 Để dễ so sánh, chúng tôi quy đổi hoạt tính enzyme protease và hàm lƣợng protein có trong 15 ml dịch hòa tan tủa ở các nồng độ thành hàm lƣợng và hoạt tính trong 1g chế phẩm enzyme thô. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 4.3. Bảng 4.3 : Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease có trong 1g chế phẩm enzyme thô của Asp.oryzae khi tủa protease bằng muối Nồng độ (NH4)2SO4 (% độ bão hòa) Hoạt tính (UI/g CP) Hàm lƣợng (mg/g CP) HTR (UI/mg) 50 35,33 13,8 2,56 55 50,19 16,9 2,97 60 64,48 20,8 3,1 65 104,80 26,6 3,94 47 70 91,33 27,1 3,37 75 81,3 28,0 2,89 Đồ thị 4.2 : Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease trong 1g chế phẩm enzyme thô của Asp.oryzae khi tủa protease bằng muối.  Nhận xét : Kết quả từ bảng 4.3 cho thấy :  Về hàm lƣợng : Sử dụng muối (NH4)2SO4 ở nồng độ 75% độ bão hòa thu đƣợc hàm lƣợng protein tủa là nhiều nhất. Nồng độ muối (NH4)2SO4 càng tăng thì hàm lƣợng protein tủa đƣợc càng nhiều. Điều này có đƣợc là do khi nồng độ muối càng cao, các phân tử muối phân ly thành các ion càng nhiều. Chính các ion này bắt lấy các phân tử nƣớc khỏi protein càng nhiều, do đó các protein có điều kiện tiếp xúc nhau và sa lắng.  Về hoạt tính : Sử dụng muối (NH4)2SO4 ở nồng độ 65% độ bão hòa cho hoạt tính enzyme protease cao nhất.  Hoạt tính riêng của enzyme ở nồng độ muối 65% độ bão hòa cao nhất. Nhƣ vậy, nồng độ muối tủa đƣợc nhiều protein nhất không phải là nồng độ tối ƣu để thu nhận enzyme protease. Bởi vì, ở các nồng độ muối khác nhau sẽ tủa đƣợc các protein khác nhau. Ở nồng độ muối 75% độ bão hòa, hàm lƣợng protein tủa đƣợc nhiều nhất nhƣng chứa nhiều protein tạp, không phải là enzyme protease. Ngƣợc lại, ở nồng độ muối 65% độ bão hòa, hàm lƣợng protein tủa đƣợc không cao nhất nhƣng hoạt tính protease mạnh nhất . Điều này chứng tỏ ở nồng độ muối 65% độ bão hòa tủa 0 5 10 15 20 25 30 50 55 60 65 70 75 Nồng độ muối amonium sunfat bão hòa (% độ bão hòa) Hà m lượ ng pr ote in (m g/g CP ) 0 20 40 60 80 100 120 Ho ạt tín h p rot ea se (U I/g CP ) Hàm lƣợng protein Hoạt tính protease 48 đƣợc nhiều protease nhất. Từ đây có thể kết luận, nồng độ muối (NH4)2SO4 65% độ bão hòa là tối ƣu để tủa enzyme protease vì vừa cho hoạt tính protease cao, vừa tiết kiệm lƣợng muối sử dụng. 4.2.2 Kết quả đối với chủng Asp.kawasaki Bảng 4.4 : Tổng hàm lƣợng protein và tổng hoạt tính enzyme protease trong 15 ml dịch hòa tan tủa của Asp.kawasaki khi tủa protease bằng muối Nồng độ (NH4)2SO4 (% độ bão hòa) Tổng hoạt tính (UI) Tổng hàm lƣợng (mg) HTR(UI/mg) 50 96,89 53,83 1,80 55 148,18 72,29 2,05 60 197,04 89,97 2,19 65 276,84 103,05 2,68 70 232,47 106,1 2,19 75 202,01 109,2 1,85 Để dễ so sánh, chúng tôi quy đổi hoạt tính enzyme protease và hàm lƣợng protein có trong 15 ml dịch hòa tan tủa ở các nồng độ thành hàm lƣợng và hoạt tính trong 1g chế phẩm enzyme thô. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 4.5 Bảng 4.5 : Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease có trong 1g chế phẩm enzyme thô của Asp.kawasaki khi tủa protease bằng muối Nồng độ muối (NH4)2SO4 (% độ bão hòa) Hoạt tính (UI/g CP) Hàm lƣợng (mg/g CP) HTR (UI/mg) 50 12,6 7 1,8 55 19,27 9,4 2,05 60 25,62 11,7 2,19 65 36 13,4 2,68 70 30,2 13,8 2,19 75 26,27 14,2 1,85 49 Đồ thị 4.3 Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease trong 1g chế phẩm enzyme thô của Asp.kawasaki khi tủa protease bằng muối.  Nhận xét : Tƣơng tự với chủng Asp.oryzae, đối với chủng Asp.kawasaki :  Ở nồng độ muối 75% độ bão hòa, hàm lƣợng protein tủa đƣợc là nhiều nhất.  Nồng độ muối 65% độ bão hòa chính là nồng độ tối ƣu để tủa enzyme protease. 4.3 Tỷ lệ cồn tối ƣu cho việc tủa protease Chiết enzyme từ chế phẩm enzyme thô theo mô tả ở thí nghiệm 1, dịch chiết đƣợc tủa với cồn lạnh ở các tỷ lệ dịch enzyme : cồn là 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6. Sử dụng 50 ml dịch trích enzyme thô cho mỗi tỷ lệ. Ly tâm để thu tủa sau đó hòa tan tủa trong 15 ml dung dịch đệm phosphate pH = 7. Xác định hàm lƣợng và hoạt tính của dịch hòa tan tủa. Ở tỷ lệ nào hoạt tính enzyme cao nhất thì đó là tỷ lệ cồn tối ƣu cho việc tủa enzyme. 4.3.1 Kết quả đối với chủng Asp.oryzae 0 5 10 15 50 55 60 65 70 75 Nồng độ muối amonium sunfat bão hòa (% độ bão hòa) Hà m lư ợn g pr ot ei n (m g/ g CP ) 0 10 20 30 40 Ho ạt tí nh p ro te as e (U I/g C P) Hàm lƣợng protein Hoạt tính protease 50 Bảng 4.6 : Tổng hàm lƣợng protein và tổng hoạt tính enzyme protease trong 15 ml dịch hòa tan tủa của Asp.oryzae khi tủa protease bằng cồn. Tỷ lệ dịch enzyme : cồn Tổng hoạt tính (UI) Tổng hàm lƣợng (mg) HTR (UI/mg) 1:1 247,46 130,11 1,9 1:2 337,98 155,03 2,18 1:3 454,48 185,48 2,45 1:4 701,63 216,55 3,24 1:5 563,68 197,79 2,85 1:6 524,30 193,48 2,71 Để dễ so sánh, chúng tôi quy đổi hoạt tính enzyme protease và hàm lƣợng protein có trong 15 ml dịch hòa tan tủa ở các nồng độ thành hàm lƣợng và hoạt tính trong 1g chế phẩm enzyme thô. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 4.7. Bảng 4.7 : Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease có trong 1g chế phẩm enzyme thô của Asp.oryzae khi tủa protease bằng cồn Tỷ lệ dịch trích : cồn Hoạt tính (UI/g CP) Hàm lƣợng (mg/g CP) Hoạt tính riêng (UI/mg) 1:1 32,18 16,92 1,9 1:2 43,95 20,16 2,18 1:3 59,1 24,12 2,45 1:4 91,24 28,16 3,24 1:5 73,3 25,72 2,85 1:6 68,18 25,16 2,71 51 Đồ thị 4.4 : Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease trong 1g chế phẩm enzyme thô của