Luận văn Ảnh hưởng của ph và nhiệt độ lên hoạt tính xúc tác của enzyme bromelain trong quả dứa

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM LÊ KIM THANH ẢNH HƯỞNG CỦA pH VÀ NHIỆT ĐỘ LÊN HOẠT TÍNH XÚC TÁC CỦA ENZYME BROMELAIN TRONG QUẢ DỨA LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KỸ SƯ Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Mã ngành: 08 Người hướng dẫn TRẦN THANH TRÚC NĂM 2007 Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang ii Luận văn đính kèm theo đây, với tựa đề tài :” Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính xúc tác của enzyme bromelain trong quả dứa” do Lê Kim Thanh thực hiện và báo cáo, đã được hội đồng chấm luận văn thông qua. Cán bộ hướng dẫn Cán bộ phản biện Trần Thanh Trúc Nguyễn Thị Thu Thủy Cần Thơ, ngày …tháng…năm 2007 Chủ tịch hội đồng Nguyễn Văn Mười Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang i LỜI CẢM TẠ
Em xin chân thành gửi lời cảm tạ và biết ơn sâu sắc đến: Cô Trần Thanh Trúc đã tận tình hướng dẫn và tạo điều kiện thuận lợi nhất cho em hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp; Và cô Nguyễn Thị Thu Thủy đã nhiệt tình truyền thụ những kiến thức quý báu, tạo cơ sở khoa học vững chắc cho em trong quá trình thực hiện đề tài; Em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô phòng thí nghiệm Công Nghệ Enzyme, Viện Nghiên Cứu Và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học đã nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đề tài. Em xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô bộ môn Công nghệ Thực Phẩm đã tận tình giảng dạy và truyền thụ những tri thức quý báu cho chúng em trong suốt thời gian học tập. Em xin cảm ơn thầy cố vấn Nhan Minh Trí và tập thể các bạn lớp Công Nghệ Thực Phẩm khóa 28 đã động viên và giúp đỡ em trong suốt khóa học vừa qua. Cần Thơ, ngày 15 tháng 6 năm 2007 Sinh viên thực hiện Lê Kim Thanh Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang i TÓM TẮT Trong công nghiệp chế biến thực phẩm từ quả dứa, sự biến đổi của các thành phần và giá trị dinh dưỡng của sản phẩm thường xảy ra trong quá trình tiền xử lý. Bên cạnh đó, sự tương tác giữa các thành phần bên trong nguyên liệu cũng có thể dẫn đến những biến đổi không mong muốn như trên. Một trong những nguyên nhân gây ra điều này đáng được quan tâm là hệ enzyme trong quả dứa mà tiêu biểu là hệ enzyme protease_bromelain quả. Đề tại này được đặt ra với mục đích là tìm ra quy luật hoạt động của hệ enzyme bromelain quả từ dịch chiết quả dứa ở các điều kiện xử lý pH = 4,6 – 9,5 và nhiệt độ từ 10 – 75 0C. Kết quả nghiên cứu cho thấy dịch chiết từ quả dứa được sử dụng cho nghiên cứu enzyme bromelain tốt nhất từ ngày bảo quản thứ tư trở đi; và bảo quản dịch chiết chứa enzyme tốt nhất là ở điều kiện lạnh đông. Đồng thời, có sự tương tác giữa pH và nhiệt độ xử lý lên hoạt tính của hệ enzyme bromelain quả trong dịch chiết. Hệ enzyme này thể hiện hoạt tính tối thích trong khoảng nhiệt độ từ 10 – 20 0C ở môi trường pH thấp, 30 – 40 0C ở môi trường pH kiềm (pH = 7,5 – 9,5) và 40 – 60 0C ở môi trường pH trung tính (pH = 6,8 -7,1). Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang ii MỤC LỤC TÓM TẮT ........................................................................................................... trang i MỤC LỤC ................................................................................................................... ii DANH SÁCH HÌNH.................................................................................................. iv DANH SÁCH BẢNG ................................................................................................. iv CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ....................................................................................... 1 1.1 TỔNG QUAN........................................................................................................ 1 1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU................................................................................... 1 CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU .................................................................... 2 2.1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY DỨA................................................................................. 2 2.2 GIỚI THIỆU VỀ ENZYME TRONG DỨA........................................................... 3 2.2.1 Sơ lược về hệ enzyme trong cây dứa ................................................................... 3 2.2.2 Sơ lược về enzyme bromelain ............................................................................. 4 2.2.3 Cấu tạo và hoạt tính chung của enzyme bromelain .............................................. 5 i. Cấu tạo............................................................................................................. 5 ii. Hoạt tính enzyme bromelain............................................................................. 6 2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme bromelain ................................ 7 i. Ảnh hưởng của nhân tố nhiệt độ ....................................................................... 7 ii. Ảnh hưởng của nhân tố pH............................................................................... 8 2.3 GIỚI THIỆU VỀ PHẢN ỨNG ENZYME ............................................................. 9 2.3.1 Động hóa học của phản ứng cơ bản..................................................................... 9 2.3.2 Động học phản ứng enzyme.............................................................................. 10 2.4 GIỚI THIỆU SƠ LƯỢC VỀ CASEIN................................................................. 11 2.5 SƠ LƯỢC CÁC NGHIÊN CỨU VỀ ENZYME BROMELAIN........................... 12 2.6 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ................................................................................ 13 CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 15 3.1 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU ......................................................................... 15 Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang iii 3.1.1 Nguyên liệu...................................................................................................... 15 3.1.2 Hóa chất thí nghiệm ........................................................................................ 15 3.1.3 Thiết bị thí nghiệm .......................................................................................... 15 3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................................ 16 3.2.1 Phương pháp chuẩn bị mẫu và hóa chất nghiên cứu .......................................... 16 3.2.2 Bố trí thí nghiệm............................................................................................... 17 CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ THẢO LUẬN................................................................... 20 4.1 Ảnh hưởng của thời gian bảo quản dịch chiết từ dứa chứa bromelain quả đến đặc tính enzyme ................................................................................................................ 20 4.2 Khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính xúc tác phản ứng thủy phân của enzyme bromelain quả trên cơ chất là casein ........................................................ 22 CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................. 26 5.1 Kết luận ............................................................................................................... 26 5.2 Đề nghị ................................................................................................................ 26 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 27 PHỤ LỤC .................................................................................................................... v Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang iv DANH SÁCH HÌNH Hình 1: Các giống dứa ăn quả phổ biến.................................................................................. 2 Hình 2: Quả dứa (Ananase Comosus).................................................................................... 3 Hình 3: Cách sắp xếp các amino acid trong phân tử bromelain ..................................... 6 Hình 4: Cấu trúc phân tử proteases cysteine ......................................................................... 6 Hình 5: Hình vẽ minh họa sự tác động của pHmôi trường lên hoạt tính enzyme........................... 8 Hình 6: Sơ đồ quy trình trích ly bromelain quả (thô) ............................................................ 16 Hình 7: Sơ đồ chuẩn bị dung dịch casein 1%........................................................................ 16 Hình 8: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hoạt tính của enzyme bromelain trong dịch quả theo thời gian bảo quản....................................................................................................................... 21 Hình 9: Mẫu dung dịch chiết chứa enzyme bromelain quả sau 12 ngày bảo quản ................. 22 Hình 10: Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng tương tác của pH và nhiệt độ xử lý lên hoạt tính của enzyme bromelain trong dịch quả dứa.................................................................................. 23 Hình 11: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hoạt tính của bromelain quả khi xử lý ở các nhiệt độ khác nhau............................................................................................................................. 24 Hình 12: Đồ thị biểu diễn hoạt tính của bromelain quả khi xử lý ở các nhiệt độ khác nhau ở pH thấp ................................................................................................................................ 25 Hình 13. Đường chuẩn tyrosine............................................................................................ vii DANH SÁCH BẢNG Bảng 1: Thành phần các acid amine trong casein ................................................................. 12 Bảng 2: Kết quả theo dõi hoạt tính của enzyme bromelain trong dung dịch dứa tươi theo thời gian bảo quản....................................................................................................................... 20 Bảng 3: Kết quả thí nghiệm khảo sát sự ảnh hưởng của pH và nhiệt độ môi trường xử lý lên hoạt tính của enzyme bromelain quả .................................................................................... xii Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 1 CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 TỔNG QUAN Khoảng 20 năm gần đây, với hơn 400 đề tài nghiên cứu, giới khoa học Châu Âu đã đưa ra một khuyến cáo rằng “với một quả dứa mỗi ngày, bạn sẽ không cần gặp bác sĩ” (Harvey and Ross, 1985). Câu nói trên đã được khoa học thực tiễn xác minh là phù hợp với dược tính đặc biệt của quả dứa. Qua nhiều nghiên cứu cho thấy quả dứa loài Ananas có khả năng dược lý cao là do trong thành phần của quả có hệ enzyme bromelain, hay còn gọi là enzyme dứa. Bromelain là tên gọi chung của một nhóm enzyme thực vật, được tìm thấy từ những cây dứa loài Ananas, họ Bromeliaceae. Enzyme này đã mang đến cho giống dứa Ananas sự nổi tiếng về khả năng dược lý trong việc chữa trị các bệnh về đường tiêu hóa và giảm đau, giảm sưng do viêm nhiễm. Về mặt thực phẩm, dứa là một loại cây ăn quả có nhiều giá trị dinh dưỡng và rất được ưa chuộng. Về mặt khoa học, dứa là một nguồn thực vật chứa loại enzyme đặc biệt có dược tính cao. Trong chế biến thực phẩm từ quả dứa, vấn đề đặt ra là cần quan tâm đến sự biến đổi về thành phần, giá trị dinh dưỡng và hệ enzyme trong quả dứa. Với vai trò không kém phần quan trọng, hệ enzyme trong quả dứa cũng cần được quan tâm đúng mức. Tuy nhiên, để biết được sự biến đổi về hoạt tính của hệ enzyme bromelain quả, cần phải biết quy luật chung về hoạt tính xúc tác của chúng. Giống như các enzyme khác, hoạt tính xúc tác của enzyme “bromelain quả” cũng chịu ảnh hưởng bởi nhiều nhân tố, trong đó nhân tố pH và nhiệt độ, là hai nhân tố được quan tâm nhiều nhất trong quá trình chế biến thực phẩm từ quả dứa. Từ vấn đề đặt ra trên, việc nghiên cứu khảo sát các ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính xúc tác của hệ enzyme bromelain trong quả dứa là cần thiết, nhằm tạo tiền đề và cơ sở cho việc nghiên cứu lâu dài về hệ enzyme này. 1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Khảo sát tác động của việc xử lý pH và nhiệt độ lên hoạt tính xúc tác của enzyme bromelain quả trên cùng một loại cơ chất. Trên cơ sở đó, tìm hiểu được quy luật biến thiên về hoạt tính của hệ enzyme này theo sự thay đổi của pH và nhiệt độ chế biến nhằm phục vụ cho công nghệ chế biến các sản phẩm từ dứa. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 2 Ruộng dứa Dứa Queen CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY DỨA Dứa là loại cây ăn quả nhiệt đới có nguồn gốc từ Nam Mỹ, được đưa tới các đảo khu vực Caribe nhờ những thổ dân Anhdieng Carib. Năm 1493, Christopher Columbus lần đầu tiên đã nhìn thấy các loại cây của chi này tại Guadeloupe. Ông đã đem chúng về Châu Âu và từ đây chúng được người Anh và Tây Ban Nha phát tán tới các đảo trên Thái Bình Dương (Morrison, 1963). Năm 1813, các cánh đồng trồng dứa thương phẩm được thành lập tại Hawaii, Philippines, Đông Nam Á, Florida và Cuba. Dứa đã trở thành một trong 3 loại cây ăn quả phổ biến nhất trên thế giới, sau chuối và các loại quả họ citrus (Anon, 1993). Dứa có tên khoa học là Ananas comosus. Thuộc loài Ananas, họ Bromeliaceae. Một số giống dứa trồng phổ biến nhất hiện nay là giống Queen và Cayenne, tên khoa học là Ananas comosus (Linnaeus) merril (Brasil). Ngoài ra, còn có một số giống dứa ăn quả phổ biến khác như Ananas sativus, Ananas bracteatur (Lindley) (Nam Mỹ).. (Collin et al., 1931). Hình 1: Các giống dứa ăn quả phổ biến Hiện nay, trên thế giới cây dứa được trồng ở hầu hết các nước nhiệt đới như Philippines, Thái Lan, Malaysia, Brazil, Mexico, Cuba, Nam Phi..và một số nước cận nhiệt đới như đảo Hawaii, Đài Loan.. Ở nước ta, dứa trồng từ Bắc đến Nam, diện tích trồng cả nước hiện khoảng 40.000 ha với sản lượng khoảng 500.000 tấn trong đó 90% là phía Nam. Các tỉnh trồng dứa nhiều ở miền Nam là Kiên Giang, Tiền Giang, Cà Mau, Cần Thơ, Long An… miền Bắc có Thanh Hóa, Ninh Bình, Tuyên Giang, Phú Thọ….miền Trung có Nghệ An, Quảng Dứa Cayenne Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 3 Nam, Bình Định,… Năng suất quả bình quân một năm ở các tỉnh phía Bắc khoảng 10 tấn, phía Nam 15 tấn/ha. Dứa là một loại quả nhiệt đới có giá trị dinh dưỡng và giá trị năng lượng cao. Dứa được sử dụng trong chế biến thực phẩm và rất được ưa chuộng. Thành phần hóa học của quả dứa bao gồm nước (81 – 87%), sacharose (4,59 – 12%), glucose, fructose, vitamine nhóm B, vitamine C và các khoáng chất Fe, Na, K, P, Mg.. Ngoài ra trong quả dứa còn có một hệ các acid hữu cơ đa dạng, tạo nên vị chua, thơm hấp dẫn cho quả như acid citric (28 – 66% tổng lượng acid trong quả) (Gortner, 1963), acid ascorbic (từ 200 – 710 mg/l) (Singleton, 1955), acid malic (18 – 30% tổng lượng acid trong quả (Chan et al.,1973), acid oxalic, acid formic..Hàm lượng acid trong quả thay đổi theo độ chín của dứa và chúng được phản ánh bởi thông số pH. Khi trái chín chuyển sang màu vàng, độ pH giảm xuống từ 3,9 – 3,7 (Teisson và Pineau, 1982). 2.2 GIỚI THIỆU VỀ ENZYME TRONG DỨA 2.2.1 Sơ lược về hệ enzyme trong cây dứa Trong dịch chiết từ thân cây dứa và quả dứa có một hệ enzyme khá đa dạng và phức tạp, chúng thay đổi trong suốt quá trình phát triển của cây và quả dứa. Giống như ở các loại thực vật khác, hệ enzyme trong cây dứa cũng bao gồm nhiều nhóm enzyme với các đặc tính khác nhau, trong đó, nhóm enzyme protease chiếm đa số. Protease trong dứa gồm có cysteine protease, đây là nhóm enzyme chính với đại diện là enzyme bromelain; ngoài ra còn có một lượng ít các enzyme peroxidase, amylase, cellulase, acid phosphatase. (Nguồn: truy cập ngày: 13/11/2006) - Enzyme peroxidase, tồn tại và có hoạt tính không đổi trong suốt quá trình phát triển của quả. Tuy nhiên, trong quả chín lượng enzyme này giảm dần, chỉ còn khoảng 1/3 so với ban đầu (Gortner và Singleton, 1965). - Cysteine protease là nhóm enzyme proteolytic chủ yếu nhất được tìm thấy trong dịch thân và quả dứa. Protease trong quả xuất hiện từ lúc bắt đầu ra hoa, tăng dần về số lượng trong suốt thời kỳ phát triển của quả. Ở giai đoạn quả chín, lượng enzyme này cũng có xu hướng giảm dần (Gortner và Singleton, 1965; Lodh et al., 1972). - Từ cây dứa loài Ananas, người ta đã tìm thấy được có tối thiểu 4 loại cysteine protease khác nhau (Rowan et al., 1988). Protease hiện diện chủ yếu trong dịch từ thân dứa là bromelain thân, ngoài ra còn có ananain (EC 3.4.22.31) và Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 4 comosain. Trong dịch quả dứa, cysteine protease chủ yếu là bromelain quả. - Từ một số nghiên cứu khác, các nhà khoa học còn tìm thấy trong dịch từ thân và quả của một loại dứa Bromelia pinguin (cùng họ Bromeliaceae) cũng chứa enzyme protease tên là pinguinain (EC.3.4.99.18). Loại này chỉ có một số đặc tính đặc biệt và hoạt tính hydrolase kém hơn so với bromelain (Toro-Goyco et al., 1968). - Từ quả xanh của giống Bromelia Hieronymi Mez, họ Bromeliaceae, các nhà khoa học đã tìm thấy được một loại peptidase mới tên là Hieronymain I. Loại enzyme này cũng đã được xác lập vào nhóm cysteine protease (Bruno M.A.; Pardo M.F.; Caffini N.O.; López L.M.I, 2003). Trong quá trình phát triển của cây và trái dứa, dịch chiết thân và trái còn chứa một số các enzyme dehydrogenase, synthase, pectin methyl esterase, pectin galactoronase nhưng với số lượng rất thấp. 2.2.2 Sơ lược về enzyme bromelain (bromeline) Enzyme bromelain lần đầu tiên được biết đến vào khoảng thế kỷ XIX. Năm 1892, nhà khoa học Chittenden là người đầu tiên đã tìm thấy sự hiện diện của một loại enzyme có khả năng thủy phân protein trong dịch của cây và trái dứa, Ananas Comosus (pineapple). Ông đã gọi nó là “bromeline”. Sau này, thuật ngữ “bromeline” hay “bromelain” đã được dùng để gọi chung các enzyme thủy phân protein (protease), được tìm thấy từ những cây giống cây dứa thuộc cùng họ Bromeliaceae. (Nguồn: truy cập ngày: 15/12/2006) Bromelain hiện diện ở tất cả các phần của cây dứa, loài Ananas. Chúng chiếm trên 50% protein trong thân dứa và quả dứa. Do đó enzyme bromelain còn được gọi là “enzyme dứa”. Tùy theo nguồn gốc, bromelain được phân làm 2 loại là bromelain thân (trích từ dịch thân dứa) và bromelain quả (trích từ dịch quả dứa) Trong công nghiệp, phần thân cây dứa được dùng làm nguyên liệu chính để sản xuất ra enzyme bromelain thương mại, vì đây là nguồn nguyên liệu dồi dào đặc biệt là sau mùa thu hoạch trái. Enzyme bromelain quả (EC 3.4.22.33) - Tên gọi khác: bromelain quả, juice bromelain, bromelase, bromelain quả FA2. Hình 2: Quả dứa (Ananase Comosus) Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 5 - Hoạt tính: là một endopeptidase, xúc tác phản ứng thủy phân protein tại vị trí bất kỳ trên mạch polypeptide. - Cơ chất: thủy phân cơ chất tự nhiên lẫn tổng hợp tương tự như bromelain thân.Tuy nhiên, bromelain quả hoạt động thủy phân tốt nhất trên cơ chất tổng hợp Bz-Phe-Val-Arg+NHMec, không phản ứng với cơ chất Z-Arg-Arg-NHMec như bromelain thân. (Nguồn: truy cập ngày: 13/11/2006) Bromelain quả là một protease acid, có phân tử lượng khoảng từ 23 đến 31 kDa tùy thuộc vào kỹ thuật phân tích của phòng thí nghiệm. Bromelain quả có điểm đẳng điện pI = 4,6 khác biệt cơ bản với bromelain thân với pI = 9,6 (Yamada et al., 1976; Ota et al., 1985). 2.2.3 Cấu tạo và hoạt tính của enzyme bromelain i. Cấu tạo - Mã số enzyme  Bromelain thân: E.C.3.4.22.32  Bromelain quả : E.C.3.4.22.33 (Nguồn: truy cập ngày: 21/12/2006) - Tên gọi khác: bromelin, bromeline, bromelain - Tên khoa học và y học : sulfuhydryl proteolytic enzyme, cysteine protease - Tên thương mại : Bromanase (Kramer – Novis), Bromelain 2400 Maximum Strength (Vitalize Corp) Bromelain là một thuật ngữ dùng chung để chỉ các enzyme được tìm thấy trong dịch chiết từ cây dứa, chủ yếu là các protease cysteine. Enzyme bromelain là một protease-thiol. Trong trung tâm hoạt động của bromelain có chứa cysteine. Đây là một amino acid có nhóm hóa học hoạt động mạnh là – SH (sulfuhydryl). Phân tử có dạng hình cầu do có cách sắp xếp phức tạp và trong mỗi phân tử có tất cả 5 cầu nối disulfite. Bromelain ở thân và quả dứa có thành phần acid amine thay đổi khác nhau. Bromelain thân có khoảng 321 – 144 acid amin, còn bromelain quả thì có khoảng 283 – 161 acid amin. Bromelain thân là một sợi polypeptide có amino acid ở đầu amin là valine và ở Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 6 đầu carbonyl là glycine. Bromelain quả có amino acid ở đầu amin là alanine. Khi phân tích cấu trúc bậc một của bromelain, Murachi và Busan nhận thấy cách sắp xếp amino acid trong phân tử bromelain như sau Ser – Val – Lys – Asn – Gln – Asn – Pro – Cys – Gly – Ala – Cys – Tryp – - Gly – Cys – Lys – Hình 3: Cách sắp xếp các amino acid trong phân tử bromelain (Nguyễn Đức Lượng, 2004) ii. Hoạt tính enzyme bromelain Enzyme bromelain có ba hoạt tính khác nhau: peptidase, amydase và esterase. Bromelain xúc tác phản ứng thủy phân trên nhiều cơ chất và có thể thủy phân cả cơ chất tự nhiên lẫn cơ chất tổng hợp như hemoglobin, casein, gelatin, BAA _ Benzoyl-L-Arginine amide, BAEE _Benzoyl-L- Arginine Ethyl Esther, BAEM _ Benzoyl-L-Arginine Methyl Esther…(Nguyễn Đức Lượng, 2004). Nhóm sulfuhydryl trong phân tử của enzyme đóng vai trò rất quan trọng trong các phản ứng của enzyme, là thành phần trực tiếp tham gia các phản ứng xúc tác. Chúng có khả năng gắn với cơ chất để tạo thành phức chất enzyme – cơ chất. Chúng tham gia vào nhiều biến đổi hóa học như sự ion hóa, acyl hóa, phosphoryl hóa, oxy hóa, alkyl hóa, tạo thành các mercaptide, serine mercaptal, liên kết hydrogen và những phức hợp chuyển điện tích. (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Giống như papain, bromelain đóng vai trò là một endopeptidase, có khả năng tham gia xúc tác, đẩy mạnh phản ứng thủy phân protein thành các oligopeptide và các amino acid. - Đối với cơ chất là casein, hoạt tính phân giải của bromelain trong thân dứa cao hơn bromelain trong quả xanh và quả chín. R R (- NH – CH – CO – NH – CH – CO - )n + H - OH Enzyme bromelain n = k + i R ( - NH – CH – COOH )i + R ( H2N – CH – CO - )k Hình 4: Cấu trúc phân tử proteases cysteine Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 7 - Đối với cơ chất tổng hợp như BAA, ở 50C và pH = 6,0 thì hoạt tính phân giải của bromelain trong quả xanh cao hơn bromelain trong thân và quả chín (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Hoạt tính của bromelain có thể được xác định theo các đơn vị: đơn vị Rorer, đơn vị BTU (đơn vị bromelain tyrosine), đơn vị CDU (đơn vị thủy phân casein), đơn vị GDU (đơn vị thủy phân gelatin), đơn vị MCU (đơn vị đông tụ sữa)… Thông thường người ta đánh giá hoạt tính của enzyme bromelain dựa trên đơn vị MCU hoặc GDU. 1 GDU tương đương với 1,5 MCU ( Nguồn: truy cập ngày: 12/12/2006) 2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme bromelain Giống như các cấu trúc xúc tác sinh học khác, hoạt tính của enzyme bromelain cũng chịu ảnh hưởng bởi các yếu tố:  Nhân tố môi trường gồm nhiệt độ, pH, ion kim loại..;  Nhân tố bên trong gồm nồng độ enzyme, nồng độ cơ chất, một số nhóm chức của enzyme và độ tinh khiết của enzyme. Các yếu tố nhiệt độ, pH thích hợp cho hoạt động xúc tác của enzyme bromelain còn phụ thuộc lẫn nhau và phụ thuộc vào các yếu tố khác như cơ chất, bản thân enzyme, thời gian phản ứng, sự có mặt của các chất hoạt hóa.. Bromelain là một enzyme có nguồn gốc thực vật vì thế tính chất của enzyme này sẽ gắn liền với một số tính chất của loại thực vật chứa chúng. Trong số các tác nhân ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme thì tác nhân vật lý là được quan tâm nhiều nhất bởi các ứng dụng của nó trong thực tiễn sản xuất, đặc biệt là sự ảnh hưởng bởi nhiệt độ và pH của môi trường xử lý enzyme hay trong quá trình chế biến loại thực vật chứa chúng. i. Ảnh hưởng của nhân tố nhiệt độ Nhiệt độ có những ảnh hưởng ở nhiều mức độ khác nhau lên hoạt tính của enzyme. Enzyme có bản chất là protein nên nó không bền dưới tác dụng của nhiệt độ, đa số các enzyme bị mất hoạt tính trên 700C (Lê Ngọc Tú, 2004). Enzyme bromelain có khả năng hoạt động trong khoảng nhiệt độ từ 45 – 600C. Nhiệt độ quá cao sẽ làm thay đổi cấu trúc của enzyme, phá vỡ các liên kết trong phân tử enzyme, làm thay đổi cấu trúc không gian của trung tâm hoạt động cysteine, làm vị trí không gian của nhóm – SH bị biến đổi nên enzyme không kết hợp được với cơ chất. Nhiệt độ quá thấp hoặc quá cao sẽ làm phân tử protein bị biến tính sẽ làm giảm hoạt tính của enzyme (Phạm Thu Cúc, 1999). Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 8 pH tối thích Độ hoạt động của enzyme pH pHtối thích Bên cạnh đó, nhiệt độ của phản ứng xúc tác còn chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố, đặc biệt là thời gian phản ứng, thời gian tác dụng càng dài thì nhiệt độ sẽ có những tác động làm ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme, nồng độ enzyme, nồng độ cơ chất, dạng tồn tại của enzyme.. Theo nhiều nghiên cứu cho thấy - Ở dịch chiết quả, (pH = 3,5), khi tăng nhiệt độ lên đến 600C thì bromelain vẫn còn hoạt tính. - Bromelain tinh khiết nhạy cảm với nhiệt độ hơn  Ở 5oC, pH = 4 – 10, enzyme bromelain giữ hoạt tính tối đa trên casein trong vòng 24 giờ;  Ở 55oC, pH = 6,1 ,enzyme bromelain bị mất 50% hoạt tính trong vòng 20 phút. - Quá trình đông khô, enzyme bromelain bị mất 27% hoạt tính (Nguyễn Đức Lượng, 2004) ii. Ảnh hưởng của nhân tố pH Giá trị pH là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzyme. Enzyme rất nhạy cảm với sự thay đổi pH của môi trường. Mỗi loại enzyme thường chỉ hoạt động mạnh nhất ở một vùng pH xác định gọi là pH tối thích. . Hình 5: Hình vẽ minh họa sự tác động của pH môi trường lên hoạt tính enzyme (Nguyễn Đức Lượng, 2004) Độ pH ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme do pH làm thay đổi trạng thái ion hóa của enzyme và của cơ chất, phức hợp enzyme-cơ chất. Nếu pH quá cao hoặc quá thấp sẽ làm ảnh hưởng đến điện tích và khả năng tích điện của enzyme và cơ chất, có thể làm giảm hoặc mất khả năng kết hợp với cơ chất của enzyme, do đó hoạt tính enzyme sẽ bị giảm hoặc thậm chí mất hẳn. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 9 Bromelain có biên độ pH hoạt động khá rộng, chúng có khả năng hoạt động tốt trong khoảng pH = 3 – 10. Tuy nhiên, khoảng pH tối thích của enzyme bromelain lại là pH = 5 – 8. (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Trong phân tử enzyme bromelain, trung tâm hoạt động là cysteine, chứa nhóm hóa học hoạt động mạnh là – SH . Khả năng xúc tác của nhóm cysteine là nhờ liên kết đồng hóa trị được tạo thành thioester giữa nhóm acyl của cơ chất và nhóm sulfuhydryl của gốc cysteine. Trong môi trường pH sinh lý (pH = 6 – 8), phần lớn các nhóm – SH ở trạng thái không ion hóa và sự tạo thành liên kết hydro với cơ chất là do sự tham gia proton của nhóm – SH . Chính nhóm proton – SH sẽ làm tăng mật độ điện tích xung quanh nguyên tử lưu huỳnh (Lê Ngọc Tú, 2004). Bên cạnh đó pH còn ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố khác, mức độ ảnh hưởng của pH môi trường lên enzyme tùy thuộc vào nhiệt độ, loại cơ chất, thời gian phản ứng, độ tinh khiết của enzyme, bản chất của dung dịch đệm và sự hiện diện của chất tăng hoạt. 2.3 GIỚI THIỆU VỀ PHẢN ỨNG ENZYME Enzyme là một chất xúc tác sinh học đặc hiệu, có vai trò xúc tác các phản ứng sinh hóa diễn ra trong cơ thể sống. Về cấu tạo, enzyme có bản chất là protein, trong phân tử enzyme có một hoặc vài bộ phận mang tính chất đặc hiệu, chỉ có bộ phận này mới tham gia xúc tác phản ứng. Bộ phận này được gọi là trung tâm hoạt động của enzyme. Trong trung tâm hoạt động, có những nhóm chức hóa học có chức năng trực tiếp trong quá trình xúc tác phản ứng. Tất cả các phần còn lại của enzyme đóng vai trò như một cái khung, giữ cho cấu trúc không gian thích hợp với khả năng xúc tác của enzyme. (Nguyễn Đức Lượng, 2004). 2.3.1 Động hóa học của phản ứng cơ bản Tất cả các phản ứng sinh hóa đều có thể diễn ra với sự có mặt hay không có mặt enzyme. Thông thường, các phản ứng hóa học chỉ có thể xảy ra khi phân tử các chất tham gia phản ứng phải tiếp xúc với nhau ở vị trí tham gia phản ứng và chúng phải ở trạng thái hoạt động. Muốn hoạt hóa các phân tử này cần cung cấp cho chúng một mức năng lượng nào đó đủ để đạt đến trạng thái hoạt hóa. Năng lượng đó gọi là năng lượng hoạt hóa. Khi có sự tham gia của enzyme, năng lượng cản trở được hạ thấp, nhờ vậy sự tạo thành phức hợp enzyme – cơ chất diễn ra dễ dàng hơn. Tức là đối với phản ứng có enzyme, chỉ cần một mức năng lượng nhỏ cung cấp cho hệ thống thì phản ứng đã xảy ra nhanh chóng. Vai trò xúc tác của enzyme trong phản ứng hóa học là khi có sự tham gia của các Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 10 enzyme, cơ chất được hoạt hóa mạnh, làm thay đổi tính chất và cấu trúc của cơ chất, từ đó sinh ra các sản phẩm mới của phản ứng (Lê Ngọc Tú, 2003). 2.3.2 Động học phản ứng enzyme Năm 1913, hai nhà khoa học Lenom Michealis và Maud Menten đã đưa ra mô hình động học để giải thích phản ứng được xúc tác bởi enzyme và lập phương trình phản ánh mối quan hệ giữa vận tốc phản ứng với nồng độ cơ chất và enzyme. Theo mô hình này, enzyme (E) kết hợp với cơ chất (S) tạo thành phức hợp enzyme – cơ chất (E – S). Phức hợp này sẽ được chuyển hóa tiếp tục để tạo thành sản phẩm (P) và giải phóng enzyme. Enzyme được giải phóng sẽ thực hiện phản ứng mới. Theo Michealis – Menten, cơ chế xúc tác tổng quát của phản ứng có enzyme được trình bày theo sơ đồ: Trong đó: K1, K-1, K2, K-2 là những hằng số vận tốc của các phản ứng tương ứng. K -1 có giá trị nhỏ nhất. Phản ứng chuyển hóa cơ chất thành sản phẩm là quan trọng nhất K2 tỉ lệ với nồng độ ES: v = K2.[ES] (v: vận tốc phản ứng) Khi nồng độ ES càng lớn, vận tốc phản ứng càng lớn (Nguyễn Đức Lượng, 2004) Theo thuyết Mischaelis và Menten, cơ chế phản ứng có xúc tác của enzyme xảy ra qua ba giai đoạn:  Giai đoạn một: enzyme (E) sẽ kết hợp với cơ chất (S) tại vị trí trung tâm hoạt động của enzyme bằng các liên kết hóa học, tạo thành phức hệ enzyme cơ chất (E-S). Ở giai đoạn này, các liên kết được hình thành thường là những liên kết yếu nên phức hệ E – S thường không bền. Phản ứng tạo phức hệ này thường xảy ra rất nhanh và cần có một ít năng lượng. Giữa E và S có năm loại liên kết tham gia, mỗi loại có đặc tính riêng và năng lượng liên kết khác nhau, gồm liên kết phối trí, liên kết hydro, liên kết ion, liên kết kỵ nước lực Vander-Waals và liên kết do dịch chuyển điện tử.  Giai đoạn hai: khi tạo thành phức hệ E – S, dưới tác dụng của enzyme, cơ chất sẽ bị thay đổi về cấu trúc không gian và mức độ bền vững của các liên kết bên trong phân tử, dẫn tới sự kéo căng và phá vỡ các liên kết đồng hóa trị tham gia ES E + P K2 E + S ES E + P K1 K -1 K2 K -2 Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 11 phản ứng. Sau đó xảy ra sự thay đổi mật độ điện tích của phức hợp E – S làm biến dạng các liên kết giữa chúng, kết quả là cơ chất được hoạt hóa, dẽ dàng tham gia phản ứng.  Giai đoạn ba: đây là giai đoạn cuối cùng, sản phẩm của quá trình phản ứng được tạo thành, enzyme tách ra và trở về trạng tháng ban đầu, chuẩn bị kết hợp với phân tử cơ chất khác. Quá trình phản ứng hoàn thành. (citied by P. R. Mathewson, 1998) 2.4 GIỚI THIỆU SƠ LƯỢC VỀ CASEIN Để xác định hoạt tính xúc tác của một loại enzyme, điều quan trọng nhất là lựa chọn cơ chất và phương pháp đo hoạt tính phù hợp. Khả năng xúc tác của enzyme phụ thuộc rất nhiều vào loại cơ chất. Đối tượng nghiên cứu ở đây là bromelain quả, cơ chất được chọn là casein sữa (hoặc có thể là dạng muối caseinate). Casein là protein chủ yếu có trong sữa, chiếm khoảng 80% protein của sữa. Casein là một trong những protein có tính acid vì trong phân tử của chúng có chứa nhiều gốc acid glutamic và acid aspartic. Các casein đều có điểm đẳng điện pI= 4,6. Casein không có cấu trúc bậc ba và bốn nên không bị biến tính theo định nghĩa mà bị biến đổi phần lớn do bị thủy phân bằng enzyme hoặc do xử lý nhiệt, khi đó các liên kết peptide bị cắt đứt và hình thành những nitro phi protein (các mạch peptide ngắn, acid amine tự do, muối amonium..). Các muối caseinate thì bền với nhiệt và tan trong nước tốt hơn. Casein trong sữa gồm bốn dạng chính: α (s1) và α (s2)-casein, β-casein, κ-casein. (Lê Văn Việt Mẫn, 2004)  α (s1)-casein: phân tử lượng khoảng 23000 Da, có 199 gốc acid amine. Do sự phân bố các phần tích điện và các phần ưa béo không đồng đều nên các phân tử loại này có tính chất lưỡng cực, 1 đầu ưa nước, 1 đầu kỵ nước.  α (s2)-casein: phân tử lượng khoảng 25000 Da, có 207 gốc acid amine, có tính ưa nước cao nhất trong các loại casein do phân tử của nó chứa nhiều nhóm phosphoryl và gốc cation nhất.  β-casein: phân tử lượng khoảng 24000 Da, có 209 gốc acid amine, có tính ưa béo cao nhất. Dưới 40C, β-casein hoàn toàn bị khử trùng hợp do có nhiều tương tác ưa béo bị phá hủy.  κ-casein: phân tử lượng khoảng 19000 Da, có 169 gốc acid amine. Loại này chỉ chứa một gốc phosphoryl và cũng có tính lưỡng cực. Đầu amino của phân tử protein thì ưa béo còn đầu carboxyl thì ưa nước. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 12 Casein trong sữa có nguồn gốc từ những chủng bò khác nhau thì có thể có cấu trúc bậc một khác nhau. Tuy nhiên cấu trúc bậc một của cùng một loại casein chỉ khác nhau bởi vài gốc acid amine trong phân tử protein của chúng (Lê Ngọc Tú, 2003). Bảng 1: Thành phần các acid amine trong casein Acid amine Tỉ lệ (%) Glutamic Acid Proline Leucine Lysine Valine Aspartic Acid Serine Tyrosine Isoleucine Phenylalanine Threonine Arginine Histidine Alanine Methionine Glycine Tryptophan Cystine 20,2 % 10,2 % 8,3 % 7,4 % 6,5 % 6,4 % 5,7 % 5,7 % 5,5 % 4,5 % 4,4 % 3,7 % 2,8 % 2,7 % 2,5 % 2,4 % 1,1 % 0,3 % Nguồn: truy cập ngày: 16/12/2006 2.5 SƠ LƯỢC CÁC NGHIÊN CỨU VỀ ENZYME BROMELAIN Shoshi et al. (1975) đã nghiên cứu về sự biến đổi về thành phần hóa học của bromelain thân I-1 và bromelain quả A dưới sự tác động của 2-hydroxy-5-5-nitrobenzyl Bromide, tetra nitromethane và H2O2. Kết quả nghiên cứu cho thấy, dưới tác động của các hợp chất trên, enzyme bromelain bị biến đổi mạnh về cấu trúc, thành phần các acid amine trong phân tử, trong khoảng pH và nhiệt độ nhất định. (Nguồn: truy cập ngày: 15/03/2007) Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 13 Yamada, Takahashi và Murachi (1976), đã tinh chế và định tính được một loại protease từ quả dứa, tên là bromelain quả FA2. Kết quả nghiên cứu cho thấy, sự biến đổi của enzyme này sẽ sinh ra chuỗi amino acid cuối cùng là Ala – Val – Pro – Gln – Ser – Ile – Asp – Trp – Arg – Asp – Tyr – Gly – Ala Thành phần amino acid của FA2 không khác biệt nhiều so với bromelain thân, tuy nhiên về cấu tạo FA2 có ít hơn về tổng lượng lysine và alanine so với glycine như bromelain thân nên có thể kết luận FA2 không phải là một glucoprotein. (Nguồn: opt=Abstract, truy cập ngày: 12/03/2007) Waliszewski và Corzo (2004) cũng đã nghiên cứu về ái lực xúc tác của enzyme bromelain quả dạng thô trên những cơ chất protein khác nhau. Nghiên cứu đã thực hiện với dịch quả dứa ở bốn mức độ chín khác nhau trên năm loai cơ chất gồm azocasein, azoalbumine, hemoglobin, natricaseinate và casein. Sản phẩm tạo thành được xác định bằng phương pháp quang phổ. Nghiên cứu đã đưa ra kết luận về khoảng pH và nhiệt độ tối thích đối với hoạt tính xúc tác của bromelain quả trên từng loại cơ chất trên. (Nguồn: truy cập ngày: 15/03/2007) Bên cạnh đó, Andrew et al. (1990) cũng đã tiến hành nghiên cứu về nhóm các enzyme cysteine proteinase của cây dứa và các nghiên cứu về ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính xúc tác của bromelain quả, comosain và pinguinain trên các loại cơ chất tổng hợp, sử dụng phương pháp quang phổ để xác định sản phẩm tạo thành. Một phần kết quả nghiên cứu cho thấy trong thân dứa có tối thiểu bốn loại cysteine protease trong khi trong quả dứa chỉ chứa 2 loại là bromelain thân và bromelain quả với bromelain quả là chủ yếu. Với cơ chất tổng hợp, hoạt tính của các cysteine proteinase này là thể hiện mạnh nhất. Ở trong nước, Phạm Thị Trân Châu và cộng sự cũng nghiên cứu một số tính chất của bromelain tách từ chồi dứa tây cho thấy trong chồi dứa, bromelain có hoạt tính cực đại ở pH = 6,5 nhiệt độ tối thích là 600C. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 14 2.6 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Nội dung nghiên cứu: khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính xúc tác phản ứng thủy phân của enzyme bromelain quả (thô) trên cơ chất là casein. Phần thí nghiệm bao gồm các nội dung:  Trích ly dung dịch enzyme bromelain quả (thô) từ nguồn nguyên liệu dứa tươi, giống dứa Queen (Ananas comosus), đạt độ chín 2 (chín 2-3 hàng mắt, thường sử dụng trong chế biến các sản phẩm dứa_thực phẩm)  Khảo sát sự thay đổi các đặc tính của enzyme bromelain trong dịch chiết (tính chất vật lý, hoạt tính thủy phân) theo thời gian bảo quản ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau.  Khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính xúc tác phản ứng thủy phân của enzyme bromelain quả (thô) trên cơ chất là casein và sau đó xác định hoạt tính của enzyme bằng cách xác định nồng độ sản phẩm sinh ra từ phản ứng thủy phân bằng phương pháp quang phổ. (áp dụng phương pháp Kunitz) Từ cơ sở là quá trình nghiên cứu trên, xây dựng biểu đồ biểu diễn mối tương quan giữa pH và nhiệt độ ảnh hưởng lên hoạt tính xúc tác phản ứng thủy phân của enzyme bromelain quả trên cơ chất là casein. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 15 CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 3.1.1 Địa điểm, thời gian nghiên cứu Địa điểm thực hiện: phòng thí nghiệm Bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm, khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại Học Cần Thơ. Thời gian thực hiện: Từ 12/3/2007 đến 28/5/2007. 3.1.2 Nguyên liệu  Dứa giống Queen, đạt độ chín 2 (chín 2-3 hàng mắt) 3.1.3 Hóa chất thí nghiệm  Casein – sodium caseinate, từ sữa bò (Sigma)  L - Cysteine hydrochlorid – monohydrate (Merck)  Trichloroacetic acid (TCA) (Trung Quốc)  Ethylene diamine tetraacetic acid disodium salt (EDTA) (Trung Quốc)  L - Tyrosine (C9H11NO3) (Merck)  Disodium hydro phosphate (Na2HPO4.12H2O), sodium dihydro phosphate (NaH2PO4.2H2O) (Trung Quốc)  Acid hydrochlorid 0,1N 3.1.4 Thiết bị thí nghiệm  Máy ly tâm lạnh (Hattich centrifugen D-78532 Tuttlingen, 1999, Germany)  Thiết bị ủ nhiệt (Water Bath)  Máy đo quang phổ (Hitachi U-1500 Spectrophotometer)  Cuvette thạch anh  Máy đo pH (Thermo electron corporation)  Cân phân tích độ chính xác 0,0001; 0,01  Micropipette, pipette, nhiệt kế  Máy ép trái cây (Philip)  Tủ lạnh, tủ đông và một số dụng cụ khác Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 16 3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.2.1 Phương pháp chuẩn bị mẫu và hóa chất nghiên cứu i. Phương pháp trích ly enzyme bromelain quả (thô) Dứa ở độ chín đã được lựa chọn, sau khi thu hái, tiến hành trích ly enzyme bromelain theo phương pháp trích ly tổng quát cho các enzyme theo sơ đồ ở hình 6. Hình 6: Sơ đồ quy trình trích ly enzyme bromelain quả (thô) Nguồn: Nguyễn Đức Lượng, 2004 ii. Phương pháp xác định hoạt tính của enzyme bromelain Sự thay đổi hoạt tính của enzyme bromelain trong quả khóm theo các điều kiện xử lý khác nhau được tiến hành theo phản ứng thủy phân của enzyme bromelain trong dịch quả trên cơ chất là casein (phương pháp Kunitz, xem phụ lục). iii. Phương pháp chuẩn bị dung dịch casein 1% Cơ chất casein sử dụng trong quá trình xác định hoạt tính của enzyme bromelain được chuẩn bị theo sơ đồ ở hình 7. Hình 7: Sơ đồ chuẩn bị dung dịch casein 1% Casein (1 g) 100 ml dd đệm phosphate 0,05 M, pH = 7,5 Đun cách thủy (85-900C, 1h) Bảo quản (40C) Dứa chín Gọt vỏ, bỏ mắt, cắt nhỏ Ép lấy dịch quả Lọc (giấy lọc) Ly tâm lạnh (7000 vòng/phút, 40C) Dịch chiết chứa enzyme bromelain quả Bảo quản Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 17 3.2.2 Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm 1: Khảo sát sự thay đổi các đặc tính của enzyme bromelain trong dịch chiết (tính chất vật lý, hoạt tính thủy phân) theo thời gian bảo quản ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau. Mục đích Xác định điều kiện bảo quản thích hợp mà enzyme vẫn duy trì và ổn định hoạt tính. Tiến hành thí nghiệm Dung dịch enzyme sau khi trích ly sẽ được đưa vào bảo quản với 2 nhân tố Nhân tố A: Nhiệt độ bảo quản A1: Nhiệt độ lạnh 40C A2: Nhiệt độ lạnh đông -30 0C Nhân tố B: Thời gian bảo quản, thay đổi ở 10 mức độ: B1: 1 ngày B2: 2 ngày B3: 3 ngày B4: 4 ngày B5: 5 ngày B6: 6 ngày B7: 8 ngày B8:10 ngày B9:12 ngày B10:14 ngày Mẫu chuẩn đối chứng là mẫu không bảo quản (mẫu vừa mới trích ly): B0 Ứng với mỗi nghiệm thức thời gian là một mẫu thử, lặp lại 2 lần. Số mẫu thí nghiệm: (10 nghiệm thức + 1 mẫu đối chứng)* 2 lần lặp lại * 2 (điều kiện bảo quản) = 44 mẫu Thu nhận kết quả Sau thời gian bảo quản, mẫu thí nghiệm được kiểm tra để xác định đặc tính vật lý (màu sắc, độ kết lắng) và hoạt tính enzyme theo phương pháp Kunitz với cơ chất là casein, điều kiện thí nghiệm: pH = 7,5; nhiệt độ = 370C. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính xúc tác phản ứng thủy phân của enzyme bromelain quả(trong dịch quả dứa) trên cơ chất là casein Mục đích Tìm hiểu quy luật biến đổi hoạt tính của enzyme bromelain trong dịch quả dứa ở những điều kiện tiền xử lý khác nhau. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 18 Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 2 nhân tố: Nhân tố C: pH môi trường Với khoảng pH khảo sát từ 4,6 ÷ 9,5; chia làm 11 mức độ C1: pH = 4,6 C2: pH = 5,6 C3: pH = 6,2 C4: pH = 6,5 C5: pH =6,8 C6: pH = 7,1 C7: pH = 7,5 C8: pH = 7,8 C9: pH = 8,4 C10: pH = 9,0 C11: pH = 9,5 Nhân tố D: Nhiệt độ môi trường Với khoảng nhiệt độ khảo sát thay đổi từ 100C ÷ 700C; chia làm 13 mức độ D1: 100C D2: 150C D3: 200C D4: 250C D5: 300C D6: 350C D7: 400C D8: 450C D9: 500C D10: 550C D11: 600C D12: 650C D13: 700C Ứng với mỗi nghiệm thức, thí nghiệm được lặp lại 2 lần. Tổng số mẫu thí nghiệm: n x m = 11 x 13 x 2 (lần lặp lại) = 286 mẫu Thí nghiệm được bố trí theo sơ đồ sau: D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10 D11 D12 D13 C1 C1 D1 C1 D2 C2 C2 D3 C3 C3 D4 C4 C4 D5 C5 C6 C7 C8 C9 C10 C11 Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 19 Tiến hành thí nghiệm Khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính xúc tác phản ứng thủy phân của enzyme bromelain quả trên cơ chất là casein. Các bước thực hiện dựa vào phương pháp Kunitz (phụ lục). Ứng với mỗi giá trị khảo sát có thực hiện thêm 1 mẫu đối chứng kèm theo (hình 8). Kết quả thí nghiệm - Hoạt tính của enzyme bromelain còn lại trong mẫu ở các chế độ xử lý khác nhau, được xác định theo mức độ thủy phân casein. - Xác định sự tương tác của điều kiện pH môi trường và nhiệt độ xử lý đến sự thay đổi hoạt tính của enzyme bromelain quả dứa. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 20 CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ THẢO LUẬN 4.1 ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN BẢO QUẢN DỊCH CHIẾT DỨA CHỨA ENZYME BROMELAIN QUẢ ĐẾN ĐẶC TÍNH ENZYME Trong quá trình nghiên cứu về enzyme bromelain ở dạng còn tồn tại trong dung dịch dứa tươi, bước đầu tiên là trích ly dung dịch dứa, loại bỏ các hợp chất màu và tạp chất. Để đồng nhất mẫu, cần tiến hành trích ly một lượng lớn enzyme, sau đó đưa vào bảo quản ở điều kiện tối ưu nhất mà không làm thay đổi lớn đến đặc tính enzyme trong dung dịch. Vì vậy, vấn đề đặt ra là cần tiến hành khảo sát khả năng bảo quản enzyme trong điều kiện nào là tốt nhất để hạn chế tối thiểu sự biến đổi của dung dịch enzyme. Thí nghiệm tiến hành khảo sát ở hai điều kiện bảo quản là tồn trữ lạnh ở nhiệt độ 4oC và bảo quản lạnh đông ở nhiệt độ -30oC. Dung dịch dứa tươi chứa enzyme bromelain quả được tiến hành trích ly, ly tâm và cho vào bao PA (5ml dd / mẫu), tiến hành bảo quản ở 2 chế độ nhiệt độ: bảo quản lạnh 4oC và lạnh đông ở -30oC, sau các khoảng thời gian dự kiến, mẫu được đem phân tích hoạt tính enzyme theo phương pháp Kunitz, đồng thời được đánh giá cảm quan về các đặc tính vật lý, có sự so sánh giữa các mẫu. Sự thay đổi hoạt tính của enzyme bromelain theo thời gian bảo quản được thể hiện ở bảng 2. Bảng 2: Kết quả theo dõi hoạt tính enzyme bromelain trong dd dứa tươi theo thời gian bảo quản Thời gian (ngày) Bảo quản lạnh (4 0C) Bảo quản lạnh đông (-30 0C) 0 10,355 b 10,270 c 1 10,375 b 9,320 a 2 10,775 c 9,580 b 3 11,385 d 11,795 c 4 11,415 d 11,925 d 5 12,050 e 11,925 d 6 12,040 e 11,910 d 8 12,045 e 11,895 d 10 12,015 e 11,890 d 12 10,775 c 11,985 d 14 7,825a 11,990 d Kết quả thể hiện là hoạt tính của enzyme theo đơn vị TU/ml dd, trên cơ chất là casein Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê ở độ tin cậy 95% Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 21 Từ kết quả ở bảng 2 và đồ thị ở hình 8 cho thấy các mẫu dung dịch chứa enzyme được bảo quản trong điều kiện lạnh và lạnh đông có hoạt tính enzyme không ổn định trong khoảng 3 ngày bảo quản đầu. Tuy nhiên, ở ngày bảo quản thứ 4 có sự thay đổi rõ rệt, hoạt tính enzyme bắt đầu ổn định hơn so với những ngày bảo quản tiếp sau, thể hiện qua giá trị hoạt tính TU/ml dung dịch tăng khác biệt đáng kể. Điều này có thể lý giải là do dung dịch ban đầu là một hệ tương đối phức tạp, trong thời gian đầu có thể có các phần tử trong hệ tương tác với nhau làm hoạt tính enzyme proteases trong hệ không được ổn định. Bên cạnh đó, do trong dung dịch ban đầu còn tồn tại một số phần tử “tiền enzyme” protease, sau một thời gian, gặp điều kiện thích hợp, các phần tử này sẽ biến đổi thành các protease, làm tăng nồng độ enzyme trong hệ nên hoạt tính thủy phân của enzyme tổng tăng lên. Ngoài ra, trong quá trình trích ly, các tác động của những thiết bị ép tách, ly tâm và sự chênh lệch nhiệt độ giữa các công đoạn có thể làm enzyme trong dung dịch bị ảnh hưởng. 6 7 8 9 10 11 12 13 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Thời gian (ngày) H o ạt tín h( TU /m l) BQ lạnh BQ lạnh đông Hình 8: Đồ thị biểu diễn kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến hoạt tính của enzyme bromelain trong dd dứa tươi So sánh giữa hai điều kiện bảo quản cho thấy, mẫu được bảo quản ở các điều kiện lạnh và lạnh đông nhìn chung hoạt tính enzyme thể hiện tốt vào ngày bảo quản thứ 4 trở đi. Tuy nhiên đến ngày bảo quản thứ 10, một số mẫu bảo quản ở điều kiện nhiệt độ lạnh có hiện tượng hư hỏng, enzyme bromelain trong dung dịch lúc này bắt đầu giảm hoạt tính. Hoạt tính enzyme ở ngày thứ 12 và 14 giảm thấp hẳn, khác biệt có ý nghĩa khi so sánh với giá trị thu được từ ngày thứ 4 đến ngày thứ 10. Do enzyme tồn tại trong dung dịch dứa là một hệ phức tạp, các biến đổi khác của các phần tử bên trong hệ đều gây ảnh hưởng đến đặc tính của enzyme. Xét về mặt khoa học thực phẩm, mẫu lúc này sẽ không còn khả năng sử dụng được nên ngừng quá trình khảo sát. Đối với mẫu bảo quản ở điều kiện lạnh đông, tính chất của enzyme trong dung dịch ổn định hơn, thể hiện qua giá trị hoạt tính thu được không thay đổi trong suốt thời gian tồn Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 22 trữ từ ngày thứ 4 đến sau 2 tuần bảo quản. Enzyme ở điều kiện bảo quản này có thể sử dụng tốt cho nghiên cứu trong thời gian dài. Điều này có thể giải thích dựa trên khả năng kìm hãm các hoạt động sinh hóa, vi sinh của hợp chất nhờ lạnh đông. Ở điều kiện lạnh đông -30oC, 86% nước trong dung dịch chứa enzyme bị đóng băng. Không có nước tự do, phần lớn các phản ứng sinh hóa có thể xảy ra trong dung dịch mẫu sẽ bị kìm hãm, một số có thể bị vô hoạt. Vì thế, sau rã đông, mẫu dung dịch có thể duy trì được trạng thái gần như ban đầu và không ảnh hưởng lớn đến đặc tính của các phần tử trong dung dịch. Các nghiên cứu về sự ổn định của enzyme cũng cho thấy, lạnh đông nhanh ở nhiệt độ nhỏ hơn -20oC (tốt nhất là -70oC hay lạnh đông bằng Nitơ lỏng) là chế độ tối ưu nhằm duy trì hoạt tính của enzyme (Copeland, 2000). Về đặc tính cảm quan, mẫu dung dịch dứa tươi chứa enzyme bromelain quả sau ly tâm ban đầu có trạng thái trong, màu vàng sáng đặc trưng của dung dịch dứa, không vẩn đục, không có mùi lạ. Sau những khoảng thời gian bảo quản mẫu ở hai điều kiện trên, nhận thấy các mẫu dung dịch có sự khác biệt ở nhiều mặt: - Mẫu được bảo quản ở điều kiện lạnh đông, sau các khoảng thời gian bảo quản từ 1 ngày, 2 ngày..đến 20 ngày, dung dịch sau rã đông vẫn giữ được trạng thái và màu sắc như ban đầu, không mùi lạ, không vẩn đục. - Mẫu được bảo quản ở điều kiện lạnh 4oC, sau 6 ngày bảo quản vẫn còn màu vàng sáng, không mùi lạ, không vẩn đục. Sau 10 ngày bảo quản, mẫu có màu vàng sậm, hơi vẩn đục, có mùi lạ. Sau 12 đến 14 ngày bảo quản, mẫu có mùi lạ mạnh, một số mẫu có hiện tượng sinh bọt khí, dung dịch bị đục, có hiện tượng lên men, bao bì bị căng phồng. Ở các mẫu này, sự khảo sát được dừng lại. Bảo quản lạnh Bảo quản lạnh đông Hình 9: Mẫu dung dịch dứa chứa enzyme bromelain sau 12 ngày bảo quản Từ các kết quả đã thu thập và phân tích, có thể cho phép kết luận: nên sử dụng dung dịch dứa chứa enzyme bromelain quả sau 3 ngày bảo quản, lúc đó enzyme trong dịch quả có tính chất ổn định và hoạt tính tốt. Sử dụng phương pháp lạnh đông để bảo quản Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 23 mẫu chứa enzyme có thể giúp duy trì chất lượng mẫu và hoạt tính enzyme trong thời gian dài tốt hơn so với phương pháp bảo quản lạnh. 4.2 KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA PH VÀ NHIỆT ĐỘ LÊN HOẠT TÍNH XÚC TÁC PHẢN ỨNG THỦY PHÂN CỦA ENZYME BROMELAIN QUẢ (TRONG DỊCH QUẢ DỨA) TRÊN CƠ CHẤT LÀ CASEIN Dung dịch dứa chứa enzyme bromelain quả được tiến hành xử lý ở các pH và nhiệt độ khác nhau, bố trí ngẫu nhiên 2 nhân tố. Sau đó, các mẫu được tiến hành phân tích hoạt tính enzyme trong dịch quả theo phương pháp Kunitz trên cơ chất là casein. Giá trị xác định được là nồng độ tyrosine sinh ra µmol/ml dd sản phẩm. Sau đó, dựa vào các giá trị này, xác định được hoạt tính enzyme bromelain quả theo đơn vị TU/ml dd dứa tươi. Thực hiện tiến trình thí nghiệm như đã trình bày ở phần bố trí thí nghiệm, các mẫu thí nghiệm được sử dụng là các mẫu có thời gian bảo quản từ ngày thứ tư đến ngày thứ 10. Kết quả thu nhận được thể hiện qua các bảng số liệu ở phần phụ lục và ở các đồ thị hình 10, 11, 12. Hình 10: Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng tương tác của pH và nhiệt độ xử lý lên hoạt tính của enzyme bromelain trong dịch quả dứa Từ đồ thị hình 10, nhận thấy có sự tương tác qua lại giữa pH và nhiệt độ lên hoạt tính xúc tác của enzyme bromelain quả. Ứng với mỗi khoảng nhiệt độ enzyme này sẽ có khoảng pH hoạt động và giá trị pH tối thích khác nhau và ngược lại. Về mặt tổng quát, hệ enzyme bromelain quả tồn tại trong dung dịch dứa tươi thể hiện hoạt tính cao nhất trong khoảng nhiệt độ từ 35 – 55oC với pH dung dịch đệm là 6,8 – 7,8. Kết quả này khá phù hợp với nghiên cứu của Waliszewski và Corzo (2004) về enzyme bromelain quả cũng trên cơ chất là casein. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 24 0 2 4 6 8 10 12 14 16 4 5 6 7 8 9 10pH ho ạ t t ín h (TU /m l) 15 oC 40 oC 0 2 4 6 8 10 12 14 16 4 5 6 7 8 9 10 pH ho ạ t t ín h (TU /m l) 70 oC 65 oC 40 oC 0 2 4 6 8 10 12 14 16 0 10 20 30 40 50 60 70 80 nhiệt độ (oC) ho ạt tín h (TU /m l) pH = 9,0 pH = 4,6 pH = 6,8 pH = 7,1 Hình 11: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hoạt tính của bromelain quả khi xử lý ở các nhiệt độ khác nhau Xét về nhiệt độ xử lý, từ đồ thị hình 11 thấy rằng, ở nhiệt độ thấp từ dưới 15oC, bromelain quả thể hiện hoạt tính thủy phân trên casein vẫn khá tốt. Ở 15oC, trên cơ chất casein, bromelain quả có hoạt tính khoảng 7,286 TU/ml tại pH = 6,8; giảm khoảng 50% hoạt tính so với ở 40oC, cùng pH. Điều này còn thể hiện: khi tiến hành thí nghiệm ở nhiệt độ 5oC, nhận thấy bromelain quả vẫn còn hoạt tính, tuy nhiên do một số điều kiện nghiên cứu không đáp ứng được nên sự khảo sát đã được dừng lại. Như đa số các enzyme khác, bromelain ở dạng tinh khiết rất nhạy cảm với nhiệt độ, phần lớn các enzyme này bị giảm hoạt tính từ 55oC và bị vô hoạt ở nhiệt độ trên 70oC, (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Tuy nhiên, từ đồ thị hình 11 cho thấy, ở dịch chiết quả (pH = 3,5 – 3,8), khi tăng nhiệt độ lên đến 70oC thì nhận thấy enzyme bromelain vẫn còn hoạt tính khá cao, khoảng 80% hoạt tính so với ở điều kiện 40oC, giá trị pH dao động từ 6,8 – 7,1. Điều này có thể là do trong dịch chiết còn chứa một số thành phần khác như protein, glucose,..có tác dụng giúp bromelain trở nên bền nhiệt hơn. Ở nhiệt độ từ 75oC đến 80oC, enzyme bị mất hoạt tính hoàn toàn. Điều này xảy ra có thể là do cấu trúc của enzyme đã bị phá hủy do nhiệt. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 25 Sự tương tác giữa pH và nhiệt độ môi trường xử lý enzyme được thể hiện: bromelain quả hoạt động tốt trong môi trường tính acid ở điều kiện nhiệt độ càng thấp (hình 12) và ngược lại khi nhiệt độ xử lý càng cao, enzyme bromelain quả có khuynh hướng hoạt động tốt ở môi trường có pH trung tính đến kiềm yếu. 0 1 2 3 4 5 0 10 20 30 40 50 60 70 nhiệt độ (oC) ho ạ t t ín h (TU /m l) pH 4,6 pH 5,6 Hình 12: Đồ thị biểu diễn hoạt tính bromelain quả dưới các điều kiện xử lý nhiệt độ khác nhau ở pH thấp Với môi trường xử lý có pH trung tính (pH = 6,8 – 7,1), bromelain quả có khuynh hướng hoạt động tốt ở nhiệt độ 40 – 60oC. Môi trường xử lý có pH từ kiềm yếu đến kiềm (pH = 7,5 – 9,5), bromelain quả hoạt động tối thích ở nhiệt độ 25 – 40oC; pH càng thấp (pH = 4,6 – 5,2), bromelain lại có khuynh hướng hoạt động tốt ở điều kiện nhiệt độ lạnh từ 10 – 25oC. Từ vấn đề này có thể đi đến hai khuyến cáo, vì đa phần các sản phẩm từ dứa đều có pH acid đến dưới trung tính nên trong quá trình xử lý kết hợp với điều kiện nhiệt độ thấp, cần quan tâm đến hệ enzyme protease trong dịch quả vì chúng vẫn hoạt động khá tốt. Mặt khác, đối với các sản phẩm dứa tươi, dùng trong thực phẩm, ở trạng thái lạnh (nhiệt độ xử lý thấp) thì hoạt tính protease hay dược tính tiêu hóa thể hiện càng tốt. Ở nhiệt độ cao, đặc tính này càng giảm. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 26 CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Ở mức độ của đề tài nghiên cứu này, các kết quả khảo sát hệ enzyme bromelain quả (trong dịch chiết) trên chỉ phù hợp với loại dứa giống Queen, độ chín 3, là loại và độ tuổi thường sử dụng nhất trong công nghiệp chế biến các sản phẩm từ dứa hiện nay. Từ các kết quả nghiên cứu trên nhận thấy: - So với bảo quản lạnh, bảo quản dịch chiết chứa enzyme ở điều kiện lạnh đông có thể giúp enzyme trong dung dịch ít bị biến đổi và hoạt tính của hệ enzmye bromelain quả thể hiện ổn định hơn (duy trì không đổi sau 2 tuần tồn trữ ở nhiệt độ -30oC). Mặt khác, sau khi trích ly, hoạt tính của hệ enzyme trong dịch chiết thể hiện sự ổn định từ ngày bảo quản thứ tư trở đi. Vì thế, để phục vụ cho nghiên cứu, các mẫu dịch chiết chứa enzyme được sử dụng từ sau thời gian này là tốt nhất. - Có sự tương tác qua lại giữa pH và nhiệt độ của môi trường xử lý lên hoạt tính của hệ enzyme bromelain quả trong dịch chiết từ quả dứa. Hệ enzyme bromelain quả tồn tại trong dung dịch dứa tươi thể hiện hoạt tính cao nhất trong khoảng nhiệt độ 35 – 55oC với pH dung dịch đệm là 6,8 – 7,8. Đối với những sản phẩm từ dứa, trong quá trình tiền xử lý, hệ enzyme protease trong quả, điển hình là bromelain quả vẫn có khả năng hoạt động tốt trong khoảng nhiệt độ khá rộng từ nhiệt độ lạnh đến 70oC. 5.2 ĐỀ NGHỊ - Khảo sát hệ enzyme pectinase trong dịch quả dứa ở độ chín 3. - Khảo sát hoạt tính của hệ bromelain quả dưới những điều kiện xử lý khác nhau về pH và nhiệt độ ở độ chín 4 và chín hoàn toàn. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 27 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Lê Ngọc Tú, (2004), Hóa sinh công nghiệp, Nhà xuất bản Khoa Học Kỹ Thuật Hà Nội. Lê Ngọc Tú, (2003), Hóa học thực phẩm, Nhà xuất bản Khoa Học Kỹ Thuật Nguyễn Đức Lượng, (2004), Công nghệ enzyme, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh. Phạm Thu Cúc, (1999). Giáo trình sinh hóa I, Tủ sách Đại Học Cần Thơ, 1999 Vũ Công Hậu, (1999), Trồng cây ăn quả ở Việt Nam, Nhà xuất bản Nông Nghiệp. Lê Văn Việt Mẫn, (2003), Công nghệ sản xuất các sản phẩm từ sữa và thức uống (tập 1), Nhà xuất bản Đại Học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh Tiếng Anh Arnord F. H., G.Goergiou, (2003). Directed enzyme evolution, Methods in molecular biology, volume 23, Humana Press Inc. Bartholomew D. P., R. E. Paull and K. G. Rohrbach (2003), The Pineapple: Botany, Cultivation and Ultilization.Interscience Publishers, New York. Bruno M.A.; Pardo M.F; Caffini N.O.; López L.M.I, Hieronymain I, a New Cysteine Peptidase Isolated from Unripe Fruits of Bromelia hieronymi Mez (Bromeliaceae), Journal of Protein Chemistry, Volume 22, Number 2, February 2003, pp. 127-134(8), Springer Buchholz K., V. Kasche, U.T. Bornscheuer, 2005. Biocatalysts and enzyme technology, Wiley-VCH Verlag GmbH and Co. KGaA, Weinheim. Copeland Robert A. (2000). Enzymes: A Practical Introduction to Structure, Mechanism, and Data Analysis. Wiley-VCH, Inc, 258 pp. Fernander G., Pomilio A. B. ,(2003), Optimized Growth Conditions and Determination of The Catalytic Type of The Peptidase Complex From A Novel Callus Culture of Pineapple (Ananas Comosus), Molecular Medicinal Chemistry, Vol 1, 39-49 p8 Gerald Reed, (1966), Enzymes in food processing; Academic Press, Inc Harvey. M and M.D. Ross (1985), Understanding the wonder of bromelain, Reprint from: BETTER NUTRITION The Consumers’ Guide To A Better, Healthier Life March 1985 Mathewson P. R. , (1998), Enzymes, in Eagan Press Handbook Series, the American Association of Cereal Chemists, Inc Ota S., H. Umi, E. Muta and Y. Okamoto (1975), Chemical Modification of Stem Bromelain I-1 and Fruit Bromelain A with 2-Hydroxy-5-nitrobenzyl Bromide, Tetranitromethane, and Hydrogen Peroxide, Journal of Biochem, Vol. 78, No. 3 627-635_© 1975 Japanese Biochemical Society Rowan A.D., D.J. Buttle and A.J. Barrett (1990), The cysteine proteinases of pineapple plant , Journal of Biochem. 266, 869 – 875 pp. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 28 Svendsen A., (2004), Enzyme functionality: design, engineering and screening novozymes A/S, Marcel Dekker, Inc. All rights reserved Voet D. and J.G. Voet , (2003), Biochemistry-3rd edition; volume 1, Springer-Verlag Berlin Heidelberg Waliszewski K.and C. Corzo (2004), Crude fruit-bromelain affinity to different protein substrates, 2004 IFT Annual Meeting, July 12-16 - Las Vegas, NV Whitaker J.R.; A. G. J. Voragen; D. W. S. Wong, (2003), Handbook of food enzymology, Marcel Dekker, Inc. All rights reserved Một số địa chỉ website www.brenda.uni-koeln.de/information/all_enzymes.php4?ecno=3.4.22.33 Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang v PHỤ LỤC 1: PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH Xác định hoạt tính của enzyme bằng phương pháp Kunitz (Nguồn: Kunitz, (1947), citied by Fernandez et al., 2003) Nguyên tắc Phương pháp đo hoạt tính dựa vào phản ứng thủy phân cơ chất protein (casein hoặc hemoglobin) bởi enzyme. Đối tượng thí nghiệm: enzyme bromelain quả và cơ chất là casein Phản ứng này sẽ được kết thúc tại 1 thời điểm nhất định bằng trichloroacetic acid (TCA). Sản phẩm tạo thành được xác định dựa vào độ hấp thụ ánh sáng của sản phẩm acid amine sinh ra (chủ yếu là tyrosine) đo ở bước sóng 280 nm. Đơn vị đo hoạt tính của bromelain (hay papain): được thể hiện qua đơn vị tyrosine (TU: tyrosine unit). 1TU: là lượng sản phẩm sinh ra tương đương với số µmol tyrosine do sự thủy phân casein của enzyme có trong 1ml dung dịch trong thời gian 1 phút ở điều kiện nhiệt độ và pH môi trường nhất định. Hoạt tính đặc hiệu của enzyme: là số đơn vị hoạt tính enzyme có trong 1 mg protein (TU/mg). Tiến hành thí nghiệm  Chuẩn bị hóa chất Dung dịch đệm Natriphosphate 0,05M, bổ sung 0,005M EDTA ở các khoảng pH khác nhau. Chất hoạt hóa cysteine 0.02M Dung dịch acid trichloroacetic (TCA) 15% (w/v): cân 15g TCA hòa tan với nước cất, sau đó thếm nước cất vào vừa đủ đến 100ml Casein 1%: hòa tan 1g casein với 100ml dung dịch đệm phosphate 0,05M, pH = 7,5 có bổ sung 0,005M EDTA. Dd này được hòa tan bằng cách đun cách thủy ở nhiệt độ 95oC khoảng 1 giờ cho đến khi hòa tan hoàn toàn. Bảo quản ở 4oC. Trước khi sử dụng, dung dịch phải được ủ ấm ở 37oC khoảng 30 phút.  Các bước thực hiện Làm 2 mẫu thí nghiệm song song, trong đó có một mẫu đối chứng. Các bước thực hiện theo sơ đồ Mẫu đối chứng tiến hành tương tự nhưng cho dd TCA vào trước, casein vào sau. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang vi Mẫu 1 (đối chứng) Mẫu 2 Tính toán kết quả Đơn vị hoạt tính enzyme trong 1 ml dung dịch enzyme được tính theo công thức sau k VT VxTu E hh *) * 1000**(= Trong đó Tu: hoạt tính enzyme (Tu/ml) X : nồng độ tyrosine (µmol/ml) * Vhh : thể tích tổng của dd phản ứng (4,8 ml) T : thời gian phản ứng (10 phút) VE: thể tích enzyme (120 µl) k: hệ số pha loãng (1) * Nồng độ tyrosine (x) trong công thức trên được xác định dựa vào đường chuẩn tyrosine lắc ủ 10 phút, toC 120 µl enzyme bromelain 240 µl dd cysteine 840 µl dd đệm phosphate pH = Cn Bổ sung 3600 µl dd TCA 15% Bổ sung 3600 µl dd casein 1% ổn định 10 phút Lọc Đo độ hấp thụ ở 280 nm ủ 20 phút, toC 120 µl enzyme bromelain 240 µl dd cysteine 840 µl dd đệm phosphate pH = Cn ủ 20 phút, toC Bổ sung 3600 µl dd casein 1% lắc ủ 10 phút, toC Bổ sung 3600 µl dd TCA 15% ổn định 10 phút Lọc Đo độ hấp thụ ở 280 nm Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang vii Xây dựng đường chuẩn Tyrosine Tyrosine được pha trong dung dịch HCl 0,2N Chuẩn bị dãy ống nghiệm chứa dd tyrosine chuẩn với nồng độ tăng dần từ 0,1; 0,125; 0,25; 0,3; 0,5; 0,7; 0,9; 1,0; 1,5; 2 µmol/ml. Thí nghiệm lặp lại 3 lần. [tyrosine] (µmol/ml) 0 0,1 0,125 0,2 0,3 0,5 0,7 0,9 1,0 1,5 2,0 OD (280nm) 0 0,132 0,191 0,316 0,401 0,646 0,8625 1,13 1,1245 1,873 2,518 Lắc đều các ống nghiệm trên máy Vortex. Sau đó tiến hành đo OD của các dung dịch ở bước sóng 280 nm. Từ kết quả đo OD, đường chuẩn tyrosine theo nồng độ tyrosine trong dung dịch và độ hấp thụ của các dung dịch đo được, được thiết lập như hình 13. y = 1.2406x R2 = 0.9978 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 Nồng độ tyrosine(mmol/l) M ật đ ộ qu an g A Hình 13. Đường chuẩn tyrosine Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang viii PHỤ LỤC 2 Thí nghiệm 1: Sự thay đổi hoạt tính của enzyme bromelain (TU/ml) theo điều kiện bảo quản khác nhau i. Bảo quản lạnh Analysis Summary Dependent variable: lanh Factor: thoi gian Number of observations: 22 Number of levels: 11 ANOVA Table for lanh by thoi gian Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 31.2293 10 3.12293 16757.19 0.0000 Within groups 0.00205 11 0.000186364 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 31.2313 21 Table of Means for lanh by thoi gian with 95.0 percent LSD intervals -------------------------------------------------------------------------------- Stnd. error thoi gian Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit -------------------------------------------------------------------------------- 0 2 10.355 0.00965307 10.34 10.37 1 2 10.375 0.00965307 10.36 10.39 2 2 10.775 0.00965307 10.76 10.79 3 2 11.385 0.00965307 11.37 11.4 4 2 11.415 0.00965307 11.4 11.43 5 2 12.05 0.00965307 12.035 12.065 6 2 12.04 0.00965307 12.025 12.055 8 2 12.035 0.00965307 12.02 12.05 10 2 12.025 0.00965307 12.01 12.04 12 2 10.775 0.00965307 10.76 10.79 14 2 7.825 0.00965307 7.80998 7.84002 -------------------------------------------------------------------------------- Total 22 11.005 Multiple Range Tests for lanh by thoi gian -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD thoi gian Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 14 2 7.825 X 0 2 10.355 X 1 2 10.375 X 2 2 10.775 X 12 2 10.775 X 3 2 11.385 X 4 2 11.415 X 10 2 12.025 X 8 2 12.035 X 6 2 12.04 X 5 2 12.05 X Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang ix -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 0 - 1 -0.02 0.0300468 0 - 2 *-0.42 0.0300468 0 - 3 *-1.03 0.0300468 0 - 4 *-1.06 0.0300468 0 - 5 *-1.695 0.0300468 0 - 6 *-1.685 0.0300468 0 - 8 *-1.68 0.0300468 0 - 10 *-1.67 0.0300468 0 - 12 *-0.42 0.0300468 0 - 14 *2.53 0.0300468 1 - 2 *-0.4 0.0300468 1 - 3 *-1.01 0.0300468 1 - 4 *-1.04 0.0300468 1 - 5 *-1.675 0.0300468 1 - 6 *-1.665 0.0300468 1 - 8 *-1.66 0.0300468 1 - 10 *-1.65 0.0300468 1 - 12 *-0.4 0.0300468 1 - 14 *2.55 0.0300468 2 - 3 *-0.61 0.0300468 2 - 4 *-0.64 0.0300468 2 - 5 *-1.275 0.0300468 2 - 6 *-1.265 0.0300468 2 - 8 *-1.26 0.0300468 2 - 10 *-1.25 0.0300468 2 - 12 0.0 0.0300468 2 - 14 *2.95 0.0300468 3 - 4 -0.03 0.0300468 3 - 5 *-0.665 0.0300468 3 - 6 *-0.655 0.0300468 3 - 8 *-0.65 0.0300468 3 - 10 *-0.64 0.0300468 3 - 12 *0.61 0.0300468 3 - 14 *3.56 0.0300468 4 - 5 *-0.635 0.0300468 4 - 6 *-0.625 0.0300468 4 - 8 *-0.62 0.0300468 4 - 10 *-0.61 0.0300468 4 - 12 *0.64 0.0300468 4 - 14 *3.59 0.0300468 5 - 6 0.01 0.0300468 5 - 8 0.015 0.0300468 5 - 10 0.025 0.0300468 5 - 12 *1.275 0.0300468 5 - 14 *4.225 0.0300468 6 - 8 0.005 0.0300468 6 - 10 0.015 0.0300468 6 - 12 *1.265 0.0300468 6 - 14 *4.215 0.0300468 8 - 10 0.01 0.0300468 8 - 12 *1.26 0.0300468 8 - 14 *4.21 0.0300468 10 - 12 *1.25 0.0300468 10 - 14 *4.2 0.0300468 12 - 14 *2.95 0.0300468 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang x ii. Bảo quản lạnh đông Analysis Summary Dependent variable: lanh dong Factor: thoi gian Number of observations: 22 Number of levels: 11 ANOVA Table for lanh dong by thoi gian Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 21.9879 10 2.19879 9127.07 0.0000 Within groups 0.00265 11 0.000240909 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 21.9906 21 able of Means for lanh dong by thoi gian with 95.0 percent LSD intervals -------------------------------------------------------------------------------- Stnd. error thoi gian Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit -------------------------------------------------------------------------------- 0 2 10.27 0.0109752 10.2529 10.2871 1 2 9.32 0.0109752 9.30292 9.33708 2 2 9.58 0.0109752 9.56292 9.59708 3 2 11.795 0.0109752 11.7779 11.8121 4 2 11.925 0.0109752 11.9079 11.9421 5 2 11.925 0.0109752 11.9079 11.9421 6 2 11.91 0.0109752 11.8929 11.9271 8 2 11.895 0.0109752 11.8779 11.9121 10 2 11.9 0.0109752 11.8829 11.9171 12 2 11.985 0.0109752 11.9679 12.0021 14 2 11.99 0.0109752 11.9729 12.0071 -------------------------------------------------------------------------------- Total 22 11.3177 Multiple Range Tests for lanh dong by thoi gian -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD thoi gian Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 1 2 9.32 X 2 2 9.58 X 0 2 10.27 X 3 2 11.795 X 8 2 11.895 X 10 2 11.900 X 6 2 11.910 X 5 2 11.925 X 4 2 11.925 X 12 2 11.985 X 14 2 11.990 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 0 - 1 *0.95 0.0341621 0 - 2 *0.69 0.0341621 0 - 3 *-1.525 0.0341621 0 - 4 *-1.655 0.0341621 Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang xi 0 - 5 *-1.655 0.0341621 0 - 6 *-1.64 0.0341621 0 - 8 *-1.625 0.0341621 0 - 10 *-1.63 0.0341621 0 - 12 *-1.715 0.0341621 0 - 14 *-1.72 0.0341621 1 - 2 *-0.26 0.0341621 1 - 3 *-2.475 0.0341621 1 - 4 *-2.605 0.0341621 1 - 5 *-2.605 0.0341621 1 - 6 *-2.59 0.0341621 1 - 8 *-2.575 0.0341621 1 - 10 *-2.58 0.0341621 1 - 12 *-2.665 0.0341621 1 - 14 *-2.67 0.0341621 2 - 3 *-2.215 0.0341621 2 - 4 *-2.345 0.0341621 2 - 5 *-2.345 0.0341621 2 - 6 *-2.33 0.0341621 2 - 8 *-2.315 0.0341621 2 - 10 *-2.32 0.0341621 2 - 12 *-2.405 0.0341621 2 - 14 *-2.41 0.0341621 3 - 4 *-0.13 0.0341621 3 - 5 *-0.13 0.0341621 3 - 6 *-0.115 0.0341621 3 - 8 *-0.1 0.0341621 3 - 10 *-0.105 0.0341621 3 - 12 *-0.19 0.0341621 3 - 14 *-0.195 0.0341621 4 - 5 0.0 0.0341621 4 - 6 0.015 0.0341621 4 - 8 0.03 0.0341621 4 - 10 0.025 0.0341621 4 - 12 *-0.06 0.0341621 4 - 14 *-0.065 0.0341621 5 - 6 0.015 0.0341621 5 - 8 0.03 0.0341621 5 - 10 0.025 0.0341621 5 - 12 *-0.06 0.0341621 5 - 14 *-0.065 0.0341621 6 - 8 0.015 0.0341621 6 - 10 0.01 0.0341621 6 - 12 *-0.075 0.0341621 6 - 14 *-0.08 0.0341621 8 - 10 -0.005 0.0341621 8 - 12 *-0.09 0.0341621 8 - 14 *-0.095 0.0341621 10 - 12 *-0.085 0.0341621 10 - 14 -0.04 0.0341621 12 - 14 -0.005 0.0341621 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang xii Thí nghiệm 2 Bảng 3: Kết quả thí nghiệm khảo sát sự ảnh hưởng của pH và nhiệt độ môi trường xử lý lên hoạt tính của enzyme bromelain quả oC pH 10 15 20 25 30 35 40 4,6 2,7529 3,621 3,122 2,714 0,7555 0,1476 0,2931 5,6 2,8137 3,76 3,8124 4,06 2,0799 0,1997 0,4386 6,2 2,818 4,737 5,2279 6,926 4,5853 4,4116 4,8458 6,5 0,0347 6,366 7,1037 7,872 7,8809 11,602 6,9734 6,8 0,0217 7,286 8,0372 9,149 10,525 12,01 14,016 7,1 0,013 6,934 7,7941 8,285 10,217 12,088 12,232 7,5 3,5432 6,774 7,4467 8,15 10,304 12,084 8,745 7,8 3,8428 6,557 7,0516 7,833 9,8131 12,566 7,9113 8,4 4,1814 6,522 7,8679 8,68 10,417 11,455 8,4975 9,0 4,7285 6,435 7,755 8,697 9,6655 11,411 9,3268 9,5 4,6157 6,283 7,0993 8,176 8,9013 10,252 7,3468 oC pH 45 50 55 60 65 70 4,6 0,4776 0,452 0,9466 0,773 0,1997 0,1824 5,6 0,508 0,578 0,7555 0,799 1,003 0,825 6,2 6,9734 5,228 3,7385 2,614 1,7629 0,9987 6,5 12,28 6,661 5,1975 3,647 2,6313 1,5545 6,8 13,1 12,67 12,349 12,31 11,819 11,281 7,1 14,377 14,55 14,933 13,88 11,324 9,7697 7,5 11,476 10,55 8,9143 11,06 9,7784 7,7289 7,8 10,586 7,577 7,8939 6,131 4,0642 3,8905 8,4 11,35 8,228 6,8041 5,02 1,4589 0,7642 9,0 8,6017 7,086 6,7303 3,769 0,7034 0,2345 9,5 8,8839 7,008 6,1571 3,196 0,6774 0,2953 (kết quả thể hiện là hoạt tính của enzyme theo đơn vị TU/ml dd, trên cơ chất là casein. Các giá trị trên là kết quả trung bình của 2 lần lặp lại.) Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang xiii Chương trình SAS cho đồ thị 3D và contour xác định ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến hoạt tính của enzyme bromelain (TU/ml) input NhD pH Act; cards; 10 4,6 2,7529 10 5,6 2,8137 10 6,2 2,818 10 6,5 0,0347 10 6,8 0,0217 10 7,1 0,013 10 7,5 3,5432 10 7,8 3,8428 10 8,4 4,1814 10 9 4,7285 10 9,5 4,6157 15 4,6 3,6213 15 5,6 3,7603 15 6,2 4,7372 15 6,5 6,3655 15 6,8 7,286 15 7,1 6,9343 15 7,5 6,7737 15 7,8 6,5566 15 8,4 6,5218 15 9 6,435 15 9,5 6,283 20 4,6 3,122 20 5,6 3,8124 20 6,2 5,2279 20 6,5 7,1037 20 6,8 8,0372 20 7,1 7,7941 20 7,5 7,4467 20 7,8 7,0516 20 8,4 7,8679 20 9 7,755 20 9,5 7,0993 25 4,6 2,7138 25 5,6 4,0599 25 6,2 6,9256 25 6,5 7,8722 25 6,8 9,1488 25 7,1 8,2847 25 7,5 8,1501 25 7,8 7,8331 25 8,4 8,6799 25 9 8,6972 Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang xiv 25 9,5 8,1762 30 4,6 0,7555 30 5,6 2,0799 30 6,2 4,5853 30 6,5 7,8809 30 6,8 10,525 30 7,1 10,217 30 7,5 10,304 30 7,8 9,8131 30 8,4 10,417 30 9 9,6655 30 9,5 8,9013 35 4,6 0,1476 35 5,6 0,1997 35 6,2 4,4116 35 6,5 11,602 35 6,8 12,01 35 7,1 12,088 35 7,5 12,084 35 7,8 12,566 35 8,4 11,455 35 9 11,411 35 9,5 10,252 40 4,6 0,2931 40 5,6 0,4386 40 6,2 4,8458 40 6,5 6,9734 40 6,8 14,016 40 7,1 12,232 40 7,5 8,745 40 7,8 7,9113 40 8,4 8,4975 40 9 9,3268 40 9,5 7,3468 45 4,6 0,4776 45 5,6 0,508 45 6,2 6,9734 45 6,5 12,28 45 6,8 13,1 45 7,1 14,377 45 7,5 11,476 45 7,8 10,586 45 8,4 11,35 45 9 8,6017 45 9,5 8,8839 50 4,6 0,4516 50 5,6 0,5775 50 6,2 5,2279 50 6,5 6,6608 Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang xv 50 6,8 12,666 50 7,1 14,555 50 7,5 10,551 50 7,8 7,577 50 8,4 8,2283 50 9 7,0863 50 9,5 7,0081 55 4,6 0,9466 55 5,6 0,7555 55 6,2 3,7385 55 6,5 5,1975 55 6,8 12,349 55 7,1 14,933 55 7,5 8,9143 55 7,8 7,8939 55 8,4 6,8041 55 9 6,7303 55 9,5 6,1571 60 4,6 0,7729 60 5,6 0,7989 60 6,2 2,6139 60 6,5 3,6474 60 6,8 12,31 60 7,1 13,882 60 7,5 11,055 60 7,8 6,131 60 8,4 5,0195 60 9 3,7689 60 9,5 3,1958 65 4,6 0,1997 65 5,6 1,003 65 6,2 1,7629 65 6,5 2,6313 65 6,8 11,819 65 7,1 11,324 65 7,5 9,7784 65 7,8 4,0642 65 8,4 1,4589 65 9 0,7034 65 9,5 0,6774 70 4,6 0,1824 70 5,6 0,825 70 6,2 0,9987 70 6,5 1,5545 70 6,8 11,281 70 7,1 9,7697 70 7,5 7,7289 70 7,8 3,8905 70 8,4 0,7642 Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang xvi 70 9 0,2345 70 9,5 0,2953 ; /*VI. Su thay doi hoat tinh cua bromealine*/ proc g3grid data=bromealine out=bromealine; grid NhD*pH=Act/ spline smooth=6 axis1=10 to 70 by 1 axis2=4.6 to 9.5 by 0.1; run; goptions reset=all nocell nocharacters ctext=black ftext=simulate htext=0.35 gunit=cm horigin=6 cm vorigin=2 cm hsize=10 cm vsize=9 cm colors=(black); axis1 order=10 to 70 by 10 label=(f=simulate h=0.35 cm a=0 j=c 'Nhiet do (C)') value=(f=simulate h=0.35 cm); axis2 order=4.6 to 9.5 by 1 label=(a=0 f=simulate a=90 h=0.35 cm j=c 'pH') value=(f=simulate h=0.35 cm); symbol1 height=0.3 cm font=simulate value= color=; symbol2 height=0.3 cm step= color=; symbol3 height=0.3 cm color=; symbol4 height=0.3 cm color=; symbol5 height=0.3 cm color=; symbol6 height=0.3 cm color=; symbol7 height=0.3 cm color=; symbol8 height=0.3 cm color=; Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang xvii symbol9 height=0.3 cm color=; symbol10 height=0.3 cm color=; symbol11 height=0.3 cm color=; symbol12 height=0.3 cm color=; symbol13 height=0.3 cm color=; symbol14 height=0.3 cm color=; symbol15 height=0.3 cm color=; symbol16 height=0.3 cm color=; symbol17 height=0.3 cm color=; symbol18 height=0.3 cm color=; symbol19 height=0.3 cm color= font= value=; legend1 LABEL = (F=simulate H=0.35 cm) VALUE = (F=simulate H=0.35 cm); proc gcontour data=bromealine; plot pH*NhD=Act/ autolabel=(check=none) levels= 0 to 18 by 1 clevels=black caxis=black haxis=axis1 vaxis=axis2 nolegend; run; goptions reset=all nocell nocharacters ctext=black ftext=simulate htext=0.35 gunit=cm horigin=5 cm vorigin=2 cm hsize=10 cm vsize=9 cm colors=(brown black brown); proc g3d data=bromealine; plot pH*NhD=Act/grid Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang xviii caxis=black tilt=80 rotate=45 yticknum=5 xticknum=6 zticknum=5; run;