Khóa luận Xác định tính sinh miễn dịch và hiệu quả của các loại vacxin từ vi khuẩn edwardsiella ictaluri phân lập trên cá tra tại các vùng địa lý vào các thời điểm khác nhau thuộc đồng bằng sông Cửu Long

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP XÁC ĐỊNH TÍNH SINH MIỄN DỊCH VÀ HIỆU QUẢ CỦA CÁC LOẠI VACXIN TỪ VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri PHÂN LẬP TRÊN CÁ TRA TẠI CÁC VÙNG ĐỊA LÝ VÀO CÁC THỜI ĐIỂM KHÁC NHAU THUỘC ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC NIÊN KHÓA: 2003 – 2007 SINH VIÊN THỰC HIỆN: LÊ HÙNG DŨNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  XÁC ĐỊNH TÍNH SINH MIỄN DỊCH VÀ HIỆU QUẢ CỦA CÁC LOẠI VACXIN TỪ VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri PHÂN LẬP TRÊN CÁ TRA TẠI CÁC VÙNG ĐỊA LÝ VÀO CÁC THỜI ĐIỂM KHÁC NHAU THUỘC ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG GIÁO VIÊN HƢỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN TS. NGUYỄN VĂN HẢO LÊ HÙNG DŨNG Th.S. NGUYỄN DIỄM THƢ Th.S. NGUYỄN THỊ HIỀN Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2007 iii LỜI CẢM TẠ Tôi xin chân thành cảm ơn: Ban Giám Hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả Quý Thầy Cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tại trƣờng. TS. Nguyễn Văn Hảo đã hết lòng hƣớng dẫn cho tôi trong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp tại Viện. Th.S. Nguyễn Diễm Thƣ, Th.S. Nguyễn Thị Hiền, Th.S. Nguyễn Mạnh Thắng, KS. Nguyễn Thị Mộng Hoàng, KS. Phạm Hồng Lan, KS. Lê Văn Tám, KS. Nguyễn Thị Hồng Vân, KS. Hà Thị Ngọc Nga đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ cho tôi trong suốt quá trình thực tập. Ban Giám Đốc Trung Tâm Quốc Gia Giống Thủy Sản Nƣớc Ngọt Nam Bộ, và các anh chị công nhân viên chức Trung tâm đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực tập. Các bạn sinh viên Đại học Nha Trang lớp Nuôi Trồng Thủy Sản một, hai khoá 2003 – 2008, các bạn sinh viên Đại học An Giang khoá 2004 - 2008, các bạn sinh viên lớp Nuôi Trồng Thuỷ Sản 30, Ngƣ Y 30 đã tận tình giúp đỡ và hỗ trợ công việc với tôi trong suốt quá trình thực tập. Bạn Phạm Văn Hùng, Nguyễn Thời Duy, Lê Thanh Tú, Nguyễn Thị Đang, Nguyễn Thị Hƣơng, Nguyễn Thảo Sƣơng, Đinh Thị Thuỳ Trang. Các bạn lớp Công Nghệ Sinh Học 29 đã cùng tôi trong quá trình học tập và trong suốt quá trình thực tập. Sinh viên thực hiện LÊ HÙNG DŨNG iv TÓM TẮT Cá tra là đối tƣợng nuôi có giá trị kinh tế cao trong các đối tƣợng cá nuôi nƣớc ngọt tại đồng bằng sông Cửu Long. Bệnh đốm trắng trên cá tra với các triệu chứng điển hình nhƣ việc xuất hiện các đốm trắng ở gan, thận, lách đang diễn ra khá phổ biến và gây thiệt hại đáng kể cho ngƣời nuôi. Nhằm hạn chế thiệt hại cũng nhƣ giảm thiểu việc sử dụng kháng sinh trên cá tra nuôi, chúng tôi tiến hành đề tài: “Xác định tính sinh miễn dịch và hiệu quả của các loại vacxin từ vi khuẩn Edwardsiella ictaluri phân lập trên cá tra tại các vùng địa lý vào các thời điểm khác nhau thuộc đồng bằng sông Cửu Long". Đề tài đƣợc thực hiện từ tháng 3 đến 8 năm 2007 tại Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II. Sau khi thu mẫu bệnh phẩm ngoài hiện trƣờng, định danh vi khuẩn bằng phƣơng pháp định danh truyền thống và phƣơng pháp PCR, thử nghiệm lại độc lực của vi khuẩn phân lập đƣợc (Edwarsiella ictaluri) và xác định liều gây chết 50% (LD50) của vi khuẩn này trên cá tại phòng thí nghiệm. Tiến hành sản xuất thử nghiệm vacxin kháng bệnh đốm trắng trên gan, thận lách cá tra bằng cách bất hoạt tế bào vi khuẩn bằng 0,4% formol kết hợp với hai chất bổ trợ là Montanide ISA 70M-PG và phèn chua nhằm đánh giá tính an toàn của các chất bổ trợ này và khả năng sinh miễn dịch của các loại vacxin trên. Những kết quả đạt đƣợc:  Vacxin với chất bổ trợ nhũ dầu Montanide ISA 70M-PG không hiệu quả, không có tính an toàn.  Vacxin với chất bổ trợ phèn chua bƣớc đầu thử nghiệm có độ an toàn, có khả năng tạo sức đề kháng và tạo đáp ứng miễn dịch cho cá tra mang mầm bệnh đốm trắng. Nồng độ vacxin thích hợp cho cá tra với chất bổ trợ phèn chua là 3x109 CFU/cá. v ABSTRACT In recent years, freshwater sutchi catfish, Pangasius hypophthalmus, becomes one of aqua-species with highly economic value in Mekong Delta. However, diseases had been occurred, particularly the white spot disease (WSD) with typical signs such as white spots of different sizes on liver, kidney and spleen. The outbreak in Tra-catfish caused unbenefied for fish farms. To reduce the risks for Tra-catfish farm as well as the antibiotics overused, we carry out this topic: “Determination of immune response on Tra-catfish and the efficacy of different vaccines against Edwardsiella ictalluri isolated from different areas and times in Mekong Delta”. This topic was performed from 3 to 8/2007 in Research Institute for Aquaculture II. After collecting fish samples in different areas on fish farms, biochemical tests and PCR analyses, challenge test to identify 50% lethal dose (LD50) of Edwardsiella ictalluri in wetlab. We carried out the experiments on vaccines with oil adjuvant - Montanide ISA 70M-PG and alum adjuvant to evaluate the immunizarion and safety of these vaccines. The results showed that:  Vaccine with oil adjuvant - Montanide ISA 70M-PG is not effective and safe.  While vaccine with alum adjuvant is safe, can induce the immune response of fish and increase its resistance to Ed. ictaluri. A suitable concentration of vaccine with alum adjuvant determined is 3 x10 9 CFU/ fish. vi MỤC LỤC ĐỀ MỤC TRANG TRANG TỰA LỜI CẢM TẠ .......................................................................................................... iii TÓM TẮT .........................................................................................................................iv ABSTRACT ....................................................................................................................... v MỤC LỤC .........................................................................................................................vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ..........................................................................ix DANH SÁCH CÁC BẢNG ............................................................................................. x DANH SÁCH CÁC HÌNH .............................................................................................xi Chƣơng 1: MỞ ĐẦU ........................................................................................................ 1 1.1 Đặt vấn đề ................................................................................................1 1.2 Mục đích và yêu cầu ................................................................................2 Chƣơng 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................. 3 2.1 Giới thiệu về cá tra Pangasius hypophthalmus Sauvage, 1878 ...............3 2.1.1 Hình thái ..............................................................................................3 2.1.2 Đặc điểm sinh trƣởng ..........................................................................4 2.1.3 Đặc điểm sinh sản ...............................................................................4 2.1.4 Tình hình sản xuất và tiêu thụ cá tra ..................................................5 2.2 Các bệnh thƣờng gặp trên cá tra ..............................................................5 2.2.1 Bệnh nhiễm khuẩn ...............................................................................5 2.2.1.1 Bệnh nhiễm khuẩn huyết do vi khuẩn Aeromonas .....................5 2.2.1.2 Bệnh nhiễm khuẩn do Pseudomonas .........................................6 2.2.1.3 Bệnh nhiễm khuẩn huyết do Edwardsiella .................................6 2.2.1.4 Bệnh đốm trắng nội tạng ............................................................7 2.2.2 Bệnh ký sinh trùng ..............................................................................9 2.2.2.1 Bệnh trùng bánh xe ....................................................................9 2.2.2.2 Bệnh trùng quả dƣa ...................................................................10 2.2.2.3 Bệnh trùng mỏ neo ...................................................................10 2.2.2.4 Bệnh do sán lá đơn chủ ký sinh ................................................10 2.2.2.5 Bệnh do giun sán nội ký sinh ...................................................11 2.2.2.6 Bệnh rận cá ...............................................................................11 2.2.3 Bệnh nấm thủy mi .............................................................................11 vii 2.3 Giới thiệu về vacxin phòng bệnh ...........................................................12 2.3.1 Hệ thống đáp ứng miễn dịch đặc hiệu ...............................................12 2.3.2 Các loại vacxin: .................................................................................12 2.3.2.1 Vacxin bất hoạt (chết)...............................................................12 2.3.2.2 Vacxin sống nhƣợc độc ............................................................13 2.3.2.3 Vacxin DNA .............................................................................13 2.3.3 Tình hình sử dụng vacxin ..................................................................13 2.3.3.1 Trên thế giới .............................................................................13 2.3.3.2 Tại Việt Nam ............................................................................14 2.3.4 Các phƣơng pháp sử dụng vacxin phòng bệnh cho cá .....................15 2.3.4.1 Tiêm ..........................................................................................15 2.3.4.2 Ngâm ........................................................................................15 2.3.4.3 Cho ăn .......................................................................................15 2.3.5 Giới thiệu sơ lƣợc về chất bổ trợ .......................................................16 2.3.5.1 Nguyên lý tác dụng của chất bổ trợ ..........................................16 2.3.5.2 Các loại chất bổ trợ thông dụng ................................................16 Chƣơng 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ............................................................. 18 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu..........................................................18 3.2 Vật liệu, Dụng cụ, Hóa chất ...................................................................18 3.2.1 Vật liệu .............................................................................................18 3.2.2 Thiết bị và dụng cụ ............................................................................19 3.2.3 Hoá chất ............................................................................................20 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu .......................................................................20 3.3.1 Chuẩn bị cá ........................................................................................20 3.3.2 Chuẩn bị vacxin .................................................................................20 3.3.3 Chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn sống ..................................................21 3.3.4 Phƣơng pháp gây nhiễm thực nghiệm ...............................................22 3.3.5 Phƣơng pháp theo dõi cá sau khi gây nhiễm .....................................22 3.3.6 Phƣơng pháp thu mẫu máu, mẫu vi khuẩn ........................................22 3.3.7 Phƣơng pháp vi ngƣng kết xác định hiệu giá kháng thể ...................24 3.3.8 Phƣơng pháp xử lý thống kê .............................................................25 3.4 Bố trí thí nghiệm ....................................................................................25 3.4.1 Thí nghiệm 1: Xác định hiệu quả vacxin với chất bổ trợ nhũ dầu ..............................................................................................................25 3.4.2 Thí nghiệm 2: Xác định lại độc lực ba chủng vi khuẩn .....................27 3.4.3 Thí nghiệm 3: Xác định hiệu quả vacxin với chất bổ trợ phèn chua ......................................................................................................27 viii Chƣơng 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................... 29 4.1 Kết quả thí nghiệm xác định hiệu quả của vacxin với chất bổ trợ nhũ dầu ........................................................................................29 4.2 Kết quả thí nghiệm xác định lại độc lực của ba chủng vi khuẩn ...........35 4.3 Kết quả thí nghiệm xác định hiệu quả vacxin với chất bổ trợ phèn chua .............................................................................................................36 4.3.1 Kết quả theo dõi bệnh tích lâm sàng của cá ......................................37 4.3.2 Kết quả phản ứng vi ngƣng kết xác định hiệu giá kháng thể ............40 Chƣơng 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................ 44 5.1 Kết luận ..................................................................................................44 5.2 Đề nghị ...................................................................................................44 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 46 1. Tài liệu tiếng Việt ....................................................................................46 2. Tài liệu tiếng nƣớc ngoài .........................................................................47 3. Tài liệu từ internet ....................................................................................47 PHỤ LỤC ix DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ĐBSCL : Đồng bằng sông Cửu Long TCB : Thức ăn chế biến TACN : Thức ăn công nghiệp Viện NC NTTS II : Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II NAVETCO : Công Ty Thuốc Thú Y Trung Ƣơng 3 TBVK, tbvk : Tế bào vi khuẩn CFU : Colony form unit LD50 : Lethal dose 50% ĐC : Đối chứng Nƣớc SL :Nƣớc muối sinh lí PBS : Phosphate buffered saline BSA : Bovine serum albumin x DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 3. 1. Ba chủng vi khuẩn Ed. ictaluri phân lập ở các thời điểm khác nhau ................................................................................................................. 19 Bảng 3. 2. Bố trí thí nghiệm xác định hiệu quả của vacxin dùng chất bổ trợ nhũ dầu Montanide ISA 70M-PG .................................................................. 26 Bảng 3. 3. Bố trí thí nghiệm xác định lại độc lực của ba chủng vi khuẩn ................ 27 Bảng 3. 4. Bố trí thí nghiệm xác định hiệu quả của vacxin với chất bổ trợ phèn chua ............................................................................................................ 28 Bảng 4. 1. Thí nghiệm 1: Tổng kết số lƣợng cá chết trong suốt thời gian thí nghiệm và tỉ lệ cá chết của từng nghiệm thức.............................................. 29 Bảng 4. 2. Kết quả theo dõi biểu hiện bệnh lý của cá thí nghiệm 1 .......................... 30 Bảng 4. 3. Kết quả thí nghiệm xác định lại độc lực ba chủng vi khuẩn ................... 35 Bảng 4. 4. Kết quả theo dõi biểu hiện bệnh lý của cá thí nghiệm 2 .......................... 35 Bảng 4. 5. Kết quả thí nghiệm 3 - Tổng kết số lƣợng cá chết trong suốt thời gian thí nghiệm và tỉ lệ chết của từng nghiệm thức .................................. 36 Bảng 4. 6. Kết quả theo dõi biểu hiện bệnh lý của cá thí nghiệm 3 .......................... 36 Bảng 4. 7. Kết quả giá trị hiệu giá kháng thể trung bình thí nghiệm 3 ..................... 40 xi DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2. 1. Hình thái cá tra .......................................................................................... 4 Hình 2. 2. Cá tra nhiễm bệnh đốm trắng ..................................................................... 7 Hình 2. 3. Vi khuẩn Edw. ictaruli dƣới kính hiển vi quang học ................................. 8 Hình 2. 4. Cá tra bệnh ................................................................................................ 8 Hình 3. 1. Thao tác tiêm cá ....................................................................................... 22 Hình 3. 2. Thao tác lấy máu cá ................................................................................. 23 Hình 3. 3. Thao tác lấy mẫu vi khuẩn trên thận ........................................................ 23 Hình 3. 4. Sơ đồ cụ thể hóa các bƣớc tiến hành phản ứng vi ngƣng kết .................. 25 Hình 3. 5. Hệ thống bố trí bể kính thí nghiệm .......................................................... 26 Hình 4. 1. Cá bị lở loét ngay vùng bụng ................................................................... 32 Hình 4. 2. Xoang bụng cá chứa đầy dịch trắng ......................................................... 32 Hình 4. 3. Cá có biểu hiện xuất huyết bên ngoài ...................................................... 38 Hình 4. 4. Cá có dấu hiệu xuất huyết xoang bụng .................................................... 38 Hình 4. 5. Cá có nhiều đốm trắng trên thận .............................................................. 38 Biểu đồ 4. 1. Tỉ lệ cá chết của thí nghiệm xác định hiệu quả vacxin với chất bổ trợ nhũ dầu .................................................................................. 34 Biểu đồ 4. 2. Thể hiện tỉ lệ cá chết các nghiệm thức của thí nghiệm 3 ................... 41 1 Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Những năm gần đây, nghề nuôi trồng thủy sản đã không ngừng phát triển và ngày càng có vị trí quan trọng trong nền kinh tế Việt Nam. Trong đó, các mặt hàng thủy sản xuất khẩu chủ yếu gồm tôm sú, cá tra, cá basa đã mang lại nguồn thu nhập rất lớn (Trần Thanh Xuân, 1996). Do những ƣu điểm của cá tra nhƣ dễ nuôi, mau lớn, sức chống chịu tốt, nhu cầu tiêu thụ trong và ngoài nƣớc lớn, đem lại thu nhập cao nên chúng bắt đầu đƣợc nuôi rộng rãi ở các vùng đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL). Hiện nay, với diện tích ao bè nuôi cá tra ngày càng tăng nhanh, cá đƣợc nuôi với mật độ dày, môi trƣờng nƣớc ô nhiễm cộng với điều kiện bất lợi của thời tiết đã tạo cho các bệnh nhiễm khuẩn phát triển và lây lan mạnh nhƣ bệnh đốm trắng nội tạng, bệnh xuất huyết trên cá tra… Việc dùng kháng sinh để điều trị bệnh nhƣ hiện nay tốn kém, không cho hiệu quả cao và lƣợng tồn dƣ kháng sinh ảnh hƣởng tới chất lƣợng của sản phẩm. Để hạn chế các thiệt hại do bệnh nhiễm khuẩn gây ra và nâng cao chất lƣợng sản phẩm trong nƣớc đặc biệt là xuất khẩu thì sử dụng vaxcin phòng bệnh trở thành biện pháp thay thế, đang đƣợc nghiên cứu và dần dần đƣa vào áp dụng trong thực tế. Với mong muốn góp phần vào việc ổn định nghề nuôi trồng thuỷ sản và do nhu cầu cấp thiết của thực tế chúng tôi tiến hành đề tài "Xác định tính sinh miễn dịch và hiệu quả của các loại vacxin từ vi khuẩn Edwardsiella ictaluri phân lập trên cá tra tại các vùng địa lý vào các thời điểm khác nhau thuộc ĐBSCL" 2 1.2 Mục đích và yêu cầu Xác định tính sinh miễn dịch của các loại vacxin và hiệu quả của chúng đối với vi khuẩn Ed. ictaluri đƣợc phân lập trên cá tra ở các vùng địa lí vào các thời điểm khác nhau:  Xác định hiệu quả của chất bổ trợ nhũ dầu Montanide ISA 70 M-PG và chất bổ trợ phèn chua về độ an toàn, khả năng tạo đáp ứng miễn dịch và khả năng bảo hộ trên cá tra đối với vi khuẩn Ed. ictaluri.  Sử dụng phƣơng pháp vi ngƣng kết xác định hiệu giá kháng thể đối với thí nghiệm dùng chất bổ trợ phèn chua. 3 Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu về cá tra Pangasius hypophthalmus Sauvage, 1878 Cá tra (Pangasius hypophthalmus) là một trong những loài cá có giá trị kinh tế quan trọng và đƣợc nuôi rộng rãi ở khu vực ĐBSCL. Cá tra có khả năng chịu đựng môi trƣờng nƣớc khắc nghiệt, thích nghi rộng với nhiều loại thức ăn. Tốc độ tăng trƣởng khá nhanh: 0,7 - 1,5 kg/năm. Mật độ nuôi trong ao có thể đạt tới 15 - 20 con/m 2 , năng suất trung bình từ 10 - 15 tấn/ha (Trần Thanh Xuân, 1996). Trƣớc đây giống cá tra đƣợc vớt ở sông Cửu Long (vùng giáp giới với Campuchia). Đến nay tại các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long, việc nuôi cá bè phân bố ở một nửa số tỉnh của vùng trong đó cá tra thƣờng đƣợc nuôi ở các bè cỡ lớn (Phạm Văn Khánh, 2000). 2.1.1 Hình thái Phân loại cá tra Pangasius hypophthalmus Sauvage, 1878 Ngành: có dây sống - Chordata Bateson, 1885 Ngành phụ: có xƣơng sống - Vertebrata Cuvier, 1812 Lớp: cá xƣơng - Osteichthyes Huxley, 1880 Lớp phụ: cá vây tia - Actinopterygii Bộ: cá da trơn - Siluriformes Họ: cá tra - Pangasiidae Giống: cá tra – Pangasius ( Cá tra là loài cá da trơn, có thân dài, bề ngang hẹp, đầu nhỏ vừa phải, miệng rộng. Loài này có hai đôi râu, trong đó có râu hàm trên ngắn hơn ½ chiều dài đầu, 4 râu hàm dƣới ngắn hơn ¼ chiều dài đầu. Vây lƣng và vây ngực của cá tra có gai cứng, có răng cƣa ở mặt sau. Điểm khởi đầu của vây lƣng gần đối xứng với vây bụng. Vây hậu môn tƣơng đối dài. Thân cá có màu xám hơi xanh trên lƣng, bụng có màu trắng hơi bạc (Phạm Văn Khánh, 2000). Hình 2. 1. Hình thái cá tra (Phạm Văn Khánh, 2000) 2.1.2 Đặc điểm sinh trƣởng Sau khi nở đƣợc 14 ngày cá có chiều dài từ 2 - 2,3 cm và nặng 0,25 g. Cá tra 5 tuần tuổi có chiều dài 5 - 6 cm, nặng 1,28 - 1,50 g/con. Sau một năm đạt 0,7 – 1,5 kg/con và sau 3 - 4 năm đạt 3 - 4 kg/con (Phạm Văn Khánh, 1997). 2.1.3 Đặc điểm sinh sản Trong tự nhiên, tuổi thành thục của cá tra từ 3 - 4 năm, thƣờng sinh sản vào tháng 5 - 7 hàng năm. Cá tra có tập tính bơi ngƣợc dòng đến các bãi đẻ, nơi có điều kiện sinh thái phù hợp cho sự phát triển của tuyến sinh dục. Các bãi đẻ thƣờng nằm ở vùng Kratie của Campuchia (www.fistenet.com.vn). Cá mẹ nặng 8 – 10 kg/con có sức sinh sản thực tế 3 - 6 vạn trứng/con, cá nặng 3,2 kg/con có sức sinh sản tƣơng đối 139 - 150 ngàn trứng/con (Phạm Văn Khánh, 1997). Trong sinh sản nhân tạo, cá đƣợc nuôi thành thục sớm và cho đẻ sớm hơn trong tự nhiên, cá tra có thể phát dục 1 – 3 lần trong một năm (Phạm Văn Khánh, 2000). 5 2.1.4 Tình hình sản xuất và tiêu thụ cá tra Gần đây, diện tích và sản lƣợng nuôi cá tra, basa ở vùng ĐBSCL càng mở rộng. Đối tƣợng nuôi này không chỉ là kế sinh nhai của hàng triệu ngƣời dân, mà còn là ngành kinh tế mũi nhọn; không chỉ là nguồn thực phẩm cho ngƣời tiêu dùng, mà còn là mặt hàng xuất khẩu chiến lƣợc với giá trị kim ngạch năm 2006 đạt đến gần 737 triệu USD, đứng thứ 2 sau xuất khẩu tôm (www.fistenet.com.vn). Sản lƣợng tăng đều đặn qua từng năm tƣơng ứng từ 86.700 tấn (1999) 110.000 tấn (2001) lên gần 210.000 (2003) rồi đến 375.500 tấn (2005) và năm 2006 vừa qua đã đạt mức 825.000 tấn. Nguồn này cung cấp cho tiêu thụ nội địa và chế biến xuất khẩu của 70 nhà máy có công suất chế biến khoảng 1,5 triệu tấn/năm. Tại thời điểm tháng 6/2007 diện tích nuôi cá tra, ba sa của 8 tỉnh ĐBSCL đã trên 4.800 ha vƣợt so với cuối năm 2006 đến 2.484 ha (www.vietlinh.com.vn). Về xuất khẩu, trong tháng 5/2007, các doanh nghiệp Việt Nam đã xuất 27.700 tấn, kim ngạch đạt 79 triệu USD, tăng khá mạnh so với cùng kỳ năm 2006. Và tổng kim ngạch xuất khẩu cá tra, basa của Việt Nam 5 tháng đầu năm đã đạt gần 375 triệu USD (www.vietlinh.com.vn). 2.2 Các bệnh thƣờng gặp trên cá tra 2.2.1 Bệnh nhiễm khuẩn 2.2.1.1 Bệnh nhiễm khuẩn huyết do vi khuẩn Aeromonas - Tác nhân gây bệnh: là các loài thuộc giống Aeromonas: A. hydrophila, A. caviae, A. sobria (Phạm Văn Khánh và Lý Thị Thanh Loan, 2005). - Dấu hiệu bệnh lý: Khi cá mắc bệnh, vùng bụng bị sẫm màu, xuất hiện từng mảng đỏ trên cơ thể, hoại tử đuôi và các vây, xuất hiện các vết thƣơng trên lƣng, các khối u trên bề mặt cơ thể, mắt lồi mờ đục và sƣng phù, xoang bụng chứa dịch nội tạng hoại tử (Từ Thanh Dung, 1994). - Phòng trị: Tránh tạo ra các tác nhân cơ hội nhƣ nhiễm ký sinh trùng, tránh làm xây xát cá, mật độ nuôi quá dày,... Dùng thuốc tím tắm cá, liều dùng là 4 ppm (4 g/m 3 nƣớc) đối với cá nuôi trong ao và 10 ppm đối với cá nuôi trong bè. Xử lý 6 lặp lại sau 3 ngày và tắm cá theo định kì (Bùi Quang Tề và ctv., 1999). Ngoài ra, cũng có thể dùng các loại kháng sinh (Oxytetracyline, Streptomycin, Sulfamid, Kanamycin) trộn vào thức ăn để trị bệnh cho cá (Phạm Văn Khánh và Lý Thị Thanh Loan, 2005). 2.2.1.2 Bệnh nhiễm khuẩn do Pseudomonas (bệnh đốm đỏ) - Tác nhân gây bệnh: P. fluorescens, P. anguiliseptica, P. chlororaphis (Bùi Quang Tề và ctv., 1999). - Dấu hiệu bệnh lý: Xuất huyết từng đốm nhỏ trên da, xung quanh miệng và nắp mang, phía mặt bụng, bề mặt cơ thể có thể chảy máu, tuột nhớt nhƣng không xuất huyết vây và hậu môn, Pseudomonas spp. xâm nhập vào cơ thể sẽ phá hủy các mô, các chức năng trong cơ thể, khi các cơ quan bị phá hủy có thể gây chết đến 70 - 80% (Từ Thanh Dung, 1994). - Phòng trị: Giảm mật độ nuôi, cung cấp nguồn nƣớc tốt, tắm 3 - 5 ppm KMnO4 trong một khoảng thời gian, có thể dùng các loại kháng sinh để điều trị nhƣ trong bệnh nhiễm khuẩn huyết do Aeromonas (Phạm Văn Khánh và Lý Thị Thanh Loan, 2005). 2.2.1.3 Bệnh nhiễm khuẩn huyết do Edwardsiella (Edwarsiellosis) - Tác nhân gây bệnh: Do Edwardsiella tarda (Bùi Quang Tề và ctv., 1999). - Dấu hiệu bệnh lý: Xuất hiện những vết thƣơng nhỏ trên da, đƣờng kính khoảng 3 – 5 mm. Cá mắc bệnh sẽ mất chức năng vận động do vây đuôi bị tƣa rách. Có thể xuất hiện những vết thƣơng bên dƣới biểu bì, cơ, các vết thƣơng này sẽ gây hoại tử vùng cơ chung quanh. Bệnh xuất hiện khi chất lƣợng nƣớc trong môi trƣờng nuôi xấu, nuôi với mật độ dày. Nhiệt độ thích hợp để bệnh phát triển khoảng 300 C (Từ Thanh Dung, 1994). - Phòng trị: Giữ sạch môi trƣờng nƣớc nuôi, giảm mật độ nuôi, có thể dùng các loại kháng sinh để điều trị nhƣ trong bệnh nhiễm khuẩn huyết do Aeromonas (Phạm Văn Khánh và Lý Thị Thanh Loan, 2005). 7 2.2.1.4 Bệnh đốm trắng nội tạng Bệnh này xuất hiện đầu tiên trên cá tra nuôi ở đồng bằng sông Cửu Long vào cuối năm 1998 (Ferguson và ctv., 2001) và từ đó đã gây thiệt hại nghiêm trọng đến nghề nuôi cá tra thâm canh. Khi cá nhiễm bệnh, tỉ lệ chết tăng cao từ 10 – 90% (Từ Thanh Dung và ctv., 2003). Hình 2. 2. Cá tra nhiễm bệnh đốm trắng - Tác nhân gây bệnh: Tác nhân đƣợc biết tới là Hafnia alvei, Plesiomonas shigelloides (Trần Thị Minh Tâm và ctv., 2003) hoặc Ed. ictaluri (Từ Thanh Dung và ctv., 2003). + H. alvei thuộc họ Enterobacteriacea, là trực khuẩn tròn 2 đầu, đƣờng kính 1 µm, dài 2 - 5 µm, gram âm (-), di động nhờ lông mao, yếm khí không bắt buộc, có 2 cơ chế hiếu khí và lên men. Nhiệt độ phát triển thích hợp nhất là từ 30 – 37oC (Trần Thị Minh Tâm và ctv., 2003). + P. shigelloides thuộc họ Enterobacteriacea, là trực khuẩn tròn 2 đầu, kích thƣớc 0,8 - 1,0 x 3,0 µm, gram âm (-), di động, kỵ khí không bắt buộc, có 2 cơ chế biến dƣỡng lên men hoặc hô hấp. Trên môi trƣờng thạch dinh dƣỡng hoặc thạch máu P. shigelloides có đƣờng kính 1,0 - 1,5 µm, màu xám, nhẵn bóng, hình ovan. Vi khuẩn này có thể mọc đƣợc từ 8 – 44oC, nhiệt độ thích hợp nhất là 37 – 38oC (trích từ Trần Thị Minh Tâm và ctv., 2003). 8 + Vi khuẩn Ed. ictaluri thuộc họ Enterobacteriacea phân lập từ cá tra là vi khuẩn gram âm (-), không di động, lên men, không oxy hoá. Cho phản ứng catalase dƣơng tính, âm tính trong phản ứng oxidase (Từ Thanh Dung và ctv., 2003). Theo Plumb (1993) vi khuẩn Ed. ictaluri phát triển tốt ở 28 – 30oC. Vi khuẩn này đƣợc phân lập lần đầu tiên trên cá nheo Mỹ (Hawke, 1979). Tuy nhiên, những biểu hiện bệnh lý trên cá nheo hoàn toàn khác so với trên cá tra nhiễm bệnh (Từ Thanh Dung và ctv., 2003). Hình 2. 3. Vi khuẩn Edw. ictaruli dƣới kính hiển vi quang học Hình 2. 4. Cá tra bệnh - Dấu hiệu bệnh lý: Bệnh hoại tử cơ quan nội tạng ở cá tra đƣợc mô tả với biểu hiện bệnh là các điểm hoại tử màu trắng đục chủ yếu ở thận, lách, gan của cá tra, đƣờng kính dao động từ 1 - 3 mm. Bệnh gây chết hàng loạt và tỉ lệ chết rất cao, xảy 9 ra từ giai đoạn cá hƣơng đến giai đoạn cá thịt và giảm dần sau giai đoạn 5 tháng tuổi. Dấu hiệu biểu hiện bên ngoài nhƣ: cá bơi lờ đờ quanh bờ, xuất huyết, lồi mắt, bỏ ăn,... Những đốm trắng thƣờng xuất hiện đầu tiên và nhiều ở thận. Khi cá bệnh nặng, những tổ chức này bị huỷ hoại hoàn toàn. Vì vậy, khi bệnh đã xảy ra việc dùng thuốc để điều trị chỉ có tác dụng đối với những con bị bệnh nhẹ, tuy nhiên việc điều trị cho hiệu quả thấp và thời gian bình phục lâu (Trần Thị Minh Tâm và ctv., 2003). - Phòng trị bệnh: Biện pháp phòng bệnh thông thƣờng nhất là bảo đảm tốt khâu môi trƣờng ao nuôi, nguồn nƣớc, giảm tác nhân gây bệnh…, dùng kháng sinh Oxytetracyline (55 – 77 mg/kg thể trọng cá, từ 7 – 10 ngày), Streptomycine (50 – 75 mg/kg thể trọng cá, từ 5- 7 ngày),…(www.fistenet.com.vn). Tuy nhiên, khi bệnh đã xuất hiện, thì biện pháp này tỏ ra không hiệu quả, tỉ lệ cá chết cao, do đó việc tiêm phòng vacxin cho cá trƣớc để ngăn ngừa mầm bệnh là biện pháp mới và đang đƣợc triển khai nghiên cứu để giảm bớt tỉ lệ chết này. (Từ Thanh Dung và ctv., 2003) 2.2.2 Bệnh ký sinh trùng 2.2.2.1 Bệnh trùng bánh xe - Tác nhân gây bệnh: Thƣờng gặp là 3 giống trùng: Trichodina, Tripartiella, Trichodinella (Lê Nhƣ Xuân và ctv., 1994). - Dấu hiệu bệnh lý: Khi mới mắc bệnh trên thân có nhiều nhớt màu hơi trắng đục, mang cá đầy nhớt. Cá thƣờng nhô hẳn đầu lên mặt nƣớc và lắc mạnh. Những con bệnh nặng mang đầy nhớt và bạc trắng, cá bơi không định hƣớng, cá lật bụng mấy vồng, chìm xuống đáy ao và chết (Bùi Quang Tề và ctv., 1999). - Phòng và trị bệnh: Giữ môi trƣờng luôn sạch, mật độ nuôi không quá dày. Dùng CuSO4 ngâm cá bệnh 0,5 – 0,7 g/m 3 hoặc tắm cho cá bệnh nồng độ 2 – 5 g/m 3 trong 30 phút. Dùng muối ăn 2 – 3% tắm cho cá 5 – 15 phút hoặc dùng formol liều lƣờng 20 ppm tắm cho cá từ 5 – 15 phút (Từ Thanh Dung, 1994). 10 2.2.2.2 Bệnh trùng quả dƣa - Tác nhân gây bệnh: Do một giống tiêm mao trùng Ichthyophthiosis (Lê Nhƣ Xuân và ctv., 1994). - Dấu hiệu bệnh lý: Trùng ký sinh trên da, mang và vây của cá, bám thành các hạt lấm tấm rất nhỏ, đƣờng kính từ 0,5 – 1 mm. Đồng thời, da và mang cá có nhiều nhớt màu sắc nhợt nhạt (Phạm Văn Khánh và ctv., 2005). Bệnh phát triển tốt ở nhiệt độ 22 – 25oC (Từ Thanh Dung, 1994). - Phòng và trị bệnh: Định kỳ vệ sinh ao nuôi, không thả cá với mật độ quá dày. Dùng Malachite green liều lƣợng 0,1 – 0,3 g/m3 phun xuống ao cá bệnh hay 1 – 2 g/m 3 tắm cá trong 30 phút (Từ Thanh Dung, 1994). 2.2.2.3 Bệnh trùng mỏ neo - Tác nhân gây bệnh: Trùng gây bệnh gồm các loài thuộc giống Lernaea, có dạng giống mỏ neo. Ký sinh trên cá là con cái trƣởng thành, thân dài 8 -16 mm. Nhiệt độ trùng phát triển là 26 – 28oC (Bùi Quang Tề và ctv., 1999). - Dấu hiệu bệnh lý: Cá nhiễm bệnh kém ăn gầy yếu, xung quanh chỗ trùng bám viêm và xuất huyết. Nơi trùng mỏ neo bám là điều kiện cho vi khuẩn xâm nhập và phát triển (Phạm Văn Khánh và Lý Thị Thanh Loan, 2005). - Phòng trị bệnh: Kiểm tra cá trƣớc khi thả vào ao nuôi. Xử lý thuốc tím 10 – 25 g/m 3 tắm trong 1h (Từ Thanh Dung, 1994). 2.2.2.4 Bệnh do sán lá đơn chủ ký sinh - Tác nhân gây bệnh: Do hai giống Dactylogyrus (sán lá 16 móc) và Gyrodactylus (sán lá 18 móc) (Bùi Quang Tề và ctv., 1999). - Dấu hiệu bệnh lý: Sán lá đơn chủ bám chặt vào mang và niêm mạc của mang để hút máu, gây viêm loét mang cá (Phạm Văn Khánh, 2000). - Phòng trị bệnh: Không nên thả cá với mật độ dày, thƣờng xuyên theo dõi chế độ ăn của cá để điều chỉnh cho thích hợp. Dùng nƣớc muối tắm cho cá nhỏ 0,5 – 1 kg/100 lít nƣớc và cá lớn 3 – 4 kg/100 lít nƣớc trong 15 – 30 phút. Dùng Dipterex 5% rắc xuống ao với nồng độ 0,5 - 1 g/m3 (Từ Thanh Dung, 1994). 11 2.2.2.5 Bệnh do giun sán nội ký sinh -Tác nhân gây bệnh: gồm các loại giun đầu móc (Acanthocephola), sán dây (Bothoricephalus), giun tròn (Philometra) (Phạm Văn Khánh và Lý Thị Thanh Loan, 2005). - Dấu hiệu bệnh lý: Giun chui vào và phá hoại tầng niêm mạc thành ruột, tạo điều kiện cho vi khuẩn khác xâm nhập gây bệnh. Đồng thời, giun hút chất dinh dƣỡng làm cho cá chậm lớn và tiêu tốn thức ăn (Bùi Quang Tề và ctv., 1999). - Phòng trị bệnh: Định kỳ vệ sinh ao nuôi. Dùng Dipterex 8 – 10 g/100 kg cá bệnh trộn vào thức ăn để tẩy giun (Phạm Văn Khánh, 2000). 2.2.2.6 Bệnh rận cá - Tác nhân gây bệnh: Trùng gây bệnh là một số loài thuộc giống Argulus và Alitropus (Bùi Quang Tề và ctv., 1999). - Dấu hiệu bệnh lý: Rận cá ký sinh trên thân, da, vây xoang bụng và mang cá hút máu làm da bị tổn thƣơng, sƣng đỏ tạo điều kiện cho tác nhân gây hại khác tấn công (Phạm Văn Khánh và Lý Thị Thanh Loan, 2005). - Phòng trị bệnh: Dùng thuốc tím với nồng độ 5 – 10 g/m3 trong thời gian 15 – 30 phút (Từ Thanh Dung, 1994). 2.2.3 Bệnh nấm thủy mi - Tác nhân gây bệnh: Do hai giống nấm là Saprolegnia và Achlya (Từ Thanh Dung, 1994). - Dấu hiệu bệnh lý: Khi cá mắc bệnh, trên da cá xuất hiện những vùng trắng xám, trên đó có các sợi nấm nhỏ, mềm, tua tủa (Từ Thanh Dung, 1994). Sau vài ngày sợi nấm phát triển đan chéo vào nhau thành búi trắng nhƣ bông có thể thấy bằng mắt thƣờng (Lê Nhƣ Xuân và ctv., 1994). - Phòng trị bệnh: Áp dụng các biện pháp phòng bệnh tổng hợp: ao ƣơng nuôi phải đƣợc tẩy dọn kỹ, làm tốt công tác kỹ thuật nuôi, cách li cá bệnh để tránh sự lây lan (Phạm Văn Khánh và Lý Thị Thanh Loan, 2005). Trị bệnh cho cá: tắm cá bệnh 12 trong nƣớc muối 0,5 – 1 kg/100 lít nƣớc cho cá hƣơng và 2 – 3 kg/100 lít nƣớc cho cá lớn trong 10 – 15 phút (Lê Nhƣ Xuân và ctv., 1994). 2.3 Giới thiệu về vacxin phòng bệnh 2.3.1 Hệ thống đáp ứng miễn dịch đặc hiệu Để hiểu rõ tác dụng của vacxin trƣớc hết chúng ta cần tìm hiểu về nguyên lí cơ bản của sự kích thích đối với hệ thống miễn dịch đặc hiệu. Khả năng đáp ứng miễn dịch hay miễn dịch đặc hiệu gồm hai dạng: + Miễn dịch dịch thể: Khi có kháng nguyên vào cơ thể hai loại tế bào lympho T và B cùng tham gia vào quá trình tiêu diệt kháng nguyên. Tế bào lympho B sẽ biệt hóa thành tế bào plasma và sinh ra kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên đã kích thích. Hoặc chúng biệt hóa thành các tế bào có khả năng trở thành tế bào plasma gọi là tế bào nhớ và khi có sự xâm nhập của kháng nguyên lần thứ hai, chúng sẽ tăng sinh nhanh và kết hợp với tế bào nhớ để tạo ra kháng thể nhanh hơn trong máu và đạt nồng độ cao hơn lần đầu tiên (Nguyễn Ngọc Nhiên, 1992). + Miễn dịch qua trung gian tế bào: Khi tác nhân gây bệnh xâm nhập vào cơ thể kích thích dòng lympho T biệt hóa thành các loại tế bào nhƣ tế bào giết, tế bào sinh chất lymphokin, tế bào ức chế với những chức năng khác nhau, chúng tăng sinh nhanh với số lƣợng lớn nhằm tấn công kháng nguyên (Lê Văn Hùng, 2002). 2.3.2 Các loại vacxin: Vacxin đƣợc chế tạo từ kháng nguyên của các tác nhân gây bệnh với mục đích phòng bệnh hay tạo miễn dịch cho cơ thể đáp ứng với bệnh trƣớc khi có sự xâm nhập của mầm bệnh. Hiện nay có ba loại vacxin đƣợc sử dụng rộng rãi: vacxin bất hoạt, vacxin sống nhƣợc độc, ngoài ra vacxin DNA mới đƣợc sử dụng mấy năm gần đây và có nhiều triển vọng. 2.3.2.1 Vacxin bất hoạt (chết) Vacxin đƣợc chế tạo từ vi sinh vật chết hoặc đã bị bất hoạt bằng các phƣơng pháp vật lý nhƣ chiếu xạ, nhiệt hay hóa chất để chúng không thể phát triển trong cơ thể và gây bệnh (Phạm Văn Ty, 2001). 13 2.3.2.2 Vacxin sống nhƣợc độc Các loại vacxin này đƣợc chế tạo từ các chủng vi sinh vật có độc lực thấp hoặc các chủng gây bệnh có độc lực cao bị làm yếu bằng phƣơng pháp chọn lọc tự nhiên hoặc gây ra đột biến đối với những gen kiểm soát độc lực để chúng không còn có khả năng gây bệnh. Tuy nhiên, các chủng vi sinh vật này vẫn còn sống và có thể gây ra một số phản ứng phụ, do vậy cần phải hết sức cẩn thận trong quá trình bảo quản và sử dụng vacxin sống (Lê Văn Hùng, 2002). 2.3.2.3 Vacxin DNA Vacxin DNA đƣợc sản xuất dựa vào kỹ thuật DNA tái tổ hợp, vacxin này chứa gen mã hóa cho kháng nguyên bề mặt của nhiều loại vi sinh vật gây bệnh. Trong thủy sản, vacxin DNA đƣợc tập trung nghiên cứu là vacxin phòng các bệnh virus (Gudding và ctv., 1999). 2.3.3 Tình hình sử dụng vacxin 2.3.3.1 Trên thế giới Vacxin cho cá đƣợc dùng thử vào những năm 30 của thế kỷ trƣớc để nâng cao sức đề kháng cho cá chống lại dịch bệnh chủ yếu là trên đối tƣợng cá hồi. Tuy nhiên, tới những năm 1970, do sự gia tăng các nông trại cá đặc biệt là các nông trại cá nƣớc mặn, thì vacxin đƣợc chú trọng phát triển hơn nhằm ngăn ngừa, kiểm soát bệnh và vacxin đã đƣợc thƣơng mại hóa từ thời gian này. Lý do dùng vacxin là do điều trị hóa trị liệu tốn nhiều chi phí, hiệu quả của thuốc kháng sinh chỉ trong thời gian ngắn, nhiều vi khuẩn kháng kháng sinh và đồng thời với những hiểu biết rõ ràng hơn về hệ thống miễn dịch của cá và về yếu tố độc lực chuyên biệt của mầm bệnh cá, những điều đó thúc đẩy sự nghiên cứu và sản xuất vacxin. Đầu tiên là những nghiên cứu về hệ thống đáp ứng miễn dịch của cá với các vi khuẩn Vibrio anguillarum, Pseudomonas punctata, Bacterium salmonicida. Hiện nay, vacxin thƣơng mại cho năm vi khuẩn: Y. ruckeri, V. anguillarum, V. orrdalii, A. salmonicida và V. salmonicida gây ra bệnh Vibriosis của cá vùng lạnh, vacxin này chống lại các mầm bệnh do vi khuẩn Y. ruckeri, V. anguillarum, V. orrdalii sản xuất 14 bởi Công ty Colorado, Wildlife Vaccines, Inc., đƣợc cho phép bởi USDA (United States Department of Agriculture) năm 1976. Mặc dù khi đó thành phần kháng nguyên kích thích sinh kháng thể của vacxin không đƣợc biết rõ, nhƣng vacxin này vẫn đƣợc dùng phổ biến. Vacxin có hiệu quả với nhiều đƣờng sử dụng khác nhau nhƣng đƣợc cấp phép cho phƣơng pháp ngâm do có thể gây miễn dịch cho một lƣợng lớn cá nhỏ, không phải thao tác nhiều dẫn đến giá lao động thấp và tránh đƣợc stress cho cá. Đến 1981, vacxin kháng A. salmonicida cũng đƣợc sản xuất bởi công ty trên, vacxin này ở ba hình thức: chỉ có một kháng nguyên A. salmonicida, kháng nguyên A. salmonicida với Y. ruckeri, hoặc với V. anguillarum và V. orrdalii. Mặc dù, vacxin này đƣợc đánh giá là có hiệu quả chống lại A. salmonicida , nhƣng chúng lại không đƣợc thƣơng mại hoá do tâm lý của ngƣời tiêu dùng vì vacxin này dùng phƣơng pháp tiêm. Nhƣng những năm sau đó vacxin này nhanh chóng đƣợc sử dụng do xuất hiện bệnh furunculosis gây thiệt hại lớn cho các nông trại cá hồi ở Scotland và Na Uy. Nền công nghiệp nuôi cá hồi ở đây tạo ra một thị trƣờng đầy tiềm năng để sản xuất vacxin, và thực tế có một số lƣợng lớn công ty sản xuất vacxin ra đời ngay cả ở Bắc Mỹ và Âu châu. Hiện tại, vacxin không đủ sức để kiểm soát hai mầm bệnh quan trọng đặc biệt ở cá hồi: bệnh trên thận do Renibaterium salmoninarum, bệnh nhiễm trùng máu rickettsial do Piscirickettsia salmoni. Thêm vào đó, vacxin cần phải chống lại ít nhất tám bệnh trên cá vây tia mà quan trọng là bệnh xuất huyết đƣờng ruột trên cá nheo do Ed. ictaluri, bệnh nhiễm khuẩn cầu ruột ở các loài cá nƣớc mặn do Enterococcus seriolicida và bệnh pasteurellosis do Pasteurella piscida (Evelyn, 1997). 2.3.3.2 Tại Việt Nam Ở nƣớc ta, vacxin cho cá vẫn chƣa đƣợc sử dụng, bƣớc đầu chỉ có những nghiên cứu rải rác nhƣng vẫn chƣa đƣợc ứng dụng trong thực tế nghề nuôi cá. Năm 2000, tập đoàn Intervet Nobio - Hà Lan có phối hợp với Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản III đánh giá khảo nghiệm bốn sản phẩm vacxin trên tôm sú nhƣng kết quả cho thấy vacxin này không hiệu quả nên vẫn chƣa đƣợc sử dụng (Lê Minh Hải và ctv., 2000). Ngoài ra còn có sự hợp tác nghiên cứu giữa công ty sản xuất 15 vacxin Pharma - Na Uy và tập đoàn Bayer trên cá tra và cá biển, nhƣng cho đến nay vẫn chƣa có thông tin cụ thể nào. 2.3.4 Các phƣơng pháp sử dụng vacxin phòng bệnh cho cá 2.3.4.1 Tiêm Cá thuộc nhóm động vật có xƣơng sống có hệ miễn dịch giống hệ phòng vệ của động vật hữu nhũ và chim. Cả miễn dịch đặc hiệu và không đặc hiệu điều quan trọng trong việc phòng thủ chống lại mầm bệnh xâm nhiễm. Các yếu tố bên ngoài có thể làm thay đổi kết quả miễn dịch của cá khi tiêm nhƣ liều lƣợng kháng nguyên, nhiệt độ, hoặc cá bị stress do cầm nắm. Nhƣợc điểm của phƣơng pháp tiêm là không tránh đƣợc yếu tố stress cho cá, làm gia tăng mức corticosteroid hiện diện trong máu của cá hồi trong suốt giờ đầu và sau khi tiêm vacxin. Tuy nhiên hiệu quả của phƣơng pháp này là kích thích đáp ứng miễn dịch hoặc tạo ra miễn dịch bảo hộ trong môi trƣờng tối ƣu, cá đáp ứng nhanh với sự thay đổi của môi trƣờng gây ra stress (Muiswinkel và Wiegertjes, 1997). 2.3.4.2 Ngâm Ngâm là phƣơng pháp thiết thực và hiệu quả nhất khi phòng bệnh cho cá với số lƣợng lớn, mặc dù cơ chế chính xác của hấp thụ kháng nguyên và bảo hộ vẫn chƣa đƣợc rõ. Phƣơng pháp này bao gồm các kỹ thuật nhƣ phun, ngâm trực tiếp, tắm. Các yếu tố ảnh hƣởng tới việc hấp thụ kháng nguyên khi ngâm vacxin gồm có: nồng độ vacxin, thời gian ngâm, cỡ cá, stress, độ pH, nồng độ muối trong dung dịch vacxin, nhiệt độ nƣớc, chất gây mê, chất bổ trợ đƣợc sử dụng và trạng thái kháng nguyên (hạt hoặc dạng hòa tan). Hầu hết các thử nghiệm về ngâm vacxin, kết quả cho thấy, kháng thể sinh ra không đƣợc phát hiện trong huyết thanh, ngay khi có sự xuất hiện thì cũng không có liên quan tới việc bảo hộ (Nakanishi và Ototake, 1997). 2.3.4.3 Cho ăn Phƣơng pháp cho ăn đơn giản là kháng nguyên trộn với thức ăn, thực hiện dễ dàng trên số lƣợng lớn cá ở tất cả các kích cỡ, tiết kiệm thời gian, công sức và tránh gây sốc cho cá. Tuy nhiên, cấp vacxin bằng cách cho ăn đòi hỏi số lƣợng lớn kháng 16 nguyên và không xác định đƣợc liều lƣợng chính xác cho mỗi cá. Nói chung, kết quả bảo hộ của phƣơng pháp này yếu và trong thời gian ngắn (Quentel và Vigneulle, 1997). 2.3.5 Giới thiệu sơ lƣợc về chất bổ trợ 2.3.5.1 Nguyên lý tác dụng của chất bổ trợ Cơ chế tác động của chất bổ trợ dùng trong vacxin đƣợc giải thích nhƣ sau: + Chất bổ trợ có tác dụng gây viêm, kích thích quá trình thực bào, giúp quá trình đáp ứng miễn dịch xảy ra mạnh hơn. + Các chất bổ trợ hấp thu kháng nguyên và thải kháng nguyên từ từ ra từ chỗ tiêm. + Chất bổ trợ còn có tác dụng lên tế bào lympho T hỗ trợ. 2.3.5.2 Các loại chất bổ trợ thông dụng Chất bổ trợ kết hợp với kháng nguyên làm tăng cƣờng hiệu quả của đáp ứng miễn dịch cho cá. Chất bổ trợ Freund hoàn toàn và không hoàn toàn, dầu khoáng và lipopolysaccharide đã đƣợc sử dụng để tăng cƣờng khả năng sản xuất kháng thể. Hiện nay, chất bổ trợ dầu khoáng đƣợc sử dụng có hiệu quả với vacxin đƣợc chế tạo từ kháng nguyên Aeromonas salmonicide và vacxin đa giá có sự kết hợp 3 kháng nguyên Vibrio spp., Yersinia sp., A. Salmonicide. Chất bổ trợ này có tác dụng giữ kháng nguyên lại dƣới dạng hạt và sau đó giải phóng kháng nguyên từ từ ngay vùng bụng (Anderson, 1997). Theo nghiên cứu của Tyler và Klesius (1994), chất bổ trợ nhũ dầu tiêm vào xoang bụng của cá nheo Ictalurus punctatus làm giảm khả năng đề kháng với vi khuẩn Ed. ictaluri và có thể gây ra một số phản ứng phụ. Sự kết hợp giữa kháng nguyên và chất bổ trợ phèn chua bằng phƣơng pháp truyền thống khác nhau đƣợc sử dụng cho A. salmonicide, Y. ruckeri với kết quả khác nhau. Theo Udey và Fryer (1984), hỗn hợp phèn chua đã đƣợc sử dụng làm chất bổ trợ với vacxin kháng Vibrioisis bằng phƣơng pháp ngâm giúp gia tăng tiếp thu kháng nguyên, nên đƣợc xem là có ý nghĩa trong việc gia tăng đáp ứng miễn 17 dịch cho cá. Tuy nhiên, các nghiên cứu về sử dụng chất này để làm chất bổ trợ trong các loại vacxin cho cá hiện vẫn còn ít (Trích dẫn Đỗ Thị Hòa và ctv., 2004). 18 Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu Từ tháng 3 đến tháng đầu tháng 6 năm 2007 tại Trung Tâm Quốc Gia Giống Thủy Sản Nƣớc Ngọt Nam Bộ, Viện NC NTTS II. Từ cuối tháng 6 đến đầu tháng 8 năm 2007 tại Phòng vi khuẩn, Phòng sinh học phân tử thuộc Trung Tâm Quốc Gia Quan Trắc Cảnh Báo Môi Trƣờng và Phòng Ngừa Dịch Bệnh Thuỷ Sản Khu Vực Nam Bộ, Viện NC NTTS II. 3.2 Vật liệu, Dụng cụ, Hóa chất 3.2.1 Vật liệu 1/ Mẫu cá giống Cá giống gồm 966 con khoảng hai tháng tuổi, sạch bệnh, có kích cỡ từ 40 – 60 g đƣợc sản xuất và nuôi trong môi trƣờng tốt nhất tại Trung Tâm Quốc Gia Giống Thuỷ Sản Nƣớc Ngọt Nam Bộ (trực thuộc Viện NC NTTS II). 2/ Vi khuẩn Ba chủng vi khuẩn Ed. ictaluri phân lập tại ba địa điểm khác nhau xảy ra vào thời điểm dịch bệnh, cá thu mẫu có những dấu hiệu bệnh tích điển hình nhƣ bơi lờ đờ, bỏ ăn, xuất huyết các vây và gốc vây; bên trong gan, thận, lách có nhiều đốm trắng nhỏ. Trong đó chủng vi khuẩn EI151 đã đƣợc phân lập, định danh (test sinh hoá, PCR) và xác định liều gây chết 50% (LD50) trên cá thí nghiệm là 22.500 tbvk/cá (tƣơng đƣơng 2,25 x104 tbvk/cá). 19 Bảng 3. 1. Ba chủng vi khuẩn Ed. ictaluri phân lập ở các thời điểm khác nhau Lô Kí hiệu Triệu chứng lâm sàng Địa điểm Ngày thu A Ei-23 Phân lập từ gan cá tra (57 – 60g). Cá bỏ ăn, mang bị trắng; bên trong máu có màu hồng nhạt, gan có đốm, thận không sƣng. Vĩnh Long 11/2/2006 B Ei-151 Phân lập từ thận cá tra (chiều dài thân khoảng 24 cm). Cá bỏ ăn, bơi lờ đờ, vây, thân xuất huyết, gan và thận có mủ trắng. Đồng Tháp 21/6/2006 C Ei-338 Phân lập từ lách cá tra. Cá bỏ ăn, xuất huyết các vây và gốc vây, thận có mủ. Đồng Tháp 11/8/2006 3/ Thức ăn: Thức ăn cho cá dạng viên nổi, là sản phẩm của công ty Uni-President (Đài Loan) và công ty Thức Ăn Thủy Sản Seafood (An Giang). 3.2.2 Thiết bị và dụng cụ Các thiết bị - dụng cụ cho gây nhiễm thực nghiệm: Bể xi măng, Máy sục khí; Các bể kính dung tích 200L, vợt, lƣới, xô,... Cân phân tích, Bơm tiêm, Kéo, Kẹp, Ðèn cồn. Các thiết bị - dụng cụ cho phân tích mẫu: Kính hiển vi; Tủ lạnh; Máy lắc (Stuart Scientific); Máy ly tâm (Hettich Zentrifugen); Đĩa petri; Que cấy; Bình tam giác; Ống nghiệm; Ðĩa microplate 96 giếng (dạng hình chữ "U"); Pipetman và pipette. 20 3.2.3 Hoá chất - Dung dịch formalin 36 %; Dung dịch formol 0,4 % (Merck) - Thuốc gây mê cá (Ethylenglycol monophenylether – C2H10O2)(Merck) - Các chất bổ trợ: Montanide ISA 70 M-PG (Seppic, Pháp); Phèn chua (Merck, Mỹ). - Môi trường nuôi cấy vi khuẩn: Môi trƣờng nƣớc thịt (NAVETCO); Môi trƣờng thạch máu (gồm môi trƣờng tổng hợp thƣơng mại và 7% máu cừu). - Hóa chất khác: Nƣớc cất vô trùng; Cồn 96o và 70o; Nƣớc muối sinh lý 0,85%. 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 3.3.1 Chuẩn bị cá Vệ sinh bể, bắt cá vào bể từ năm đến bảy ngày trƣớc khi làm thí nghiệm. Cá trƣớc khi đƣa vào bể phải đƣợc cân và đo để chọn đàn cá tƣơng đối đồng nhất khi làm thí nghiệm. Thí nghiệm đƣợc bố trí trong điều kiện nhiệt độ môi trƣờng nƣớc khoảng 28 - 30 oC, hệ thống lọc nƣớc hoạt động liên tục, cho cá ăn thức ăn viên nổi hai lần/ngày vào lúc 6h và 17h, mỗi tuần thay bông lọc một lần cho máy lọc nƣớc. 3.3.2 Chuẩn bị vacxin Nuôi cấy vi khuẩn: Vi khuẩn từ các ống đông khô ria lên các đĩa thạch máu 7%, nuôi cấy từ 36 - 48 giờ ở nhiệt độ 28 - 30oC. Chọn khuẩn lạc to, đẹp, đứng riêng lẻ cho vào bình cầu chứa 250 ml nƣớc thịt dinh dƣỡng, nuôi cấy trên máy lắc trong vòng 36 - 48 giờ ở nhiệt độ 28 - 30oC, đo độ đục và đếm để xác định số lƣợng vi khuẩn. Bất hoạt vi khuẩn: Vô hoạt huyền dịch này bằng dung dịch formol với tỉ lệ 0,4 % trong 48 giờ ở nhiệt độ 4oC. Để kiểm tra lại vi khuẩn có hoàn toàn bị bất hoạt hay không, ta cấy vi khuẩn mới bất hoạt lên môi trƣờng thạch máu, nếu vi khuẩn không mọc, ta kết luận vi khuẩn đã bị bất hoạt. 21 Thêm chất bổ trợ: Trộn dung dịch chất bổ trợ (theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất) với canh khuẩn vô hoạt sao cho 0,2 ml vacxin chứa 108, 109 và 3x109 tế bào vi khuẩn (TBVK).  Vaxcin không có chất bổ trợ  Vaxcin với chất bổ trợ Montanide ISA 70 M-PG (70% chất bổ trợ và 30% tế bào vi khuẩn) dạng nhũ dầu.  Vaxcin với chất bổ trợ phèn chua 0,4%: sử dụng phèn chua tinh khiết pha với nƣớc cất tạo ra dung dịch 20%. Tiếp tục tổ hợp huyền dịch vi khuẩn đã bất hoạt với dung dịch phèn chua 20% với tỉ lệ 50:1. Hấp tiệt trùng ở 116oC trong 30 phút. 3.3.3 Chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn sống Vi khuẩn từ ống đông khô ria lên các đĩa thạch máu, nuôi cấy từ 36 - 48 giờ ở nhiệt độ 28 - 30oC. Chọn khuẩn lạc to, đẹp, đứng riêng lẻ cho vào bình tam giác chứa 100 ml nƣớc thịt dinh dƣỡng, nuôi cấy ở 28 - 30oC trong vòng 36 - 48 giờ. Trƣớc khi sử dụng pha loãng bằng nƣớc muối sinh lý vô trùng ở độ pha loãng 10-2. Công cho cá với liều 0,2 ml/con (nếu nuôi vi khuẩn ở 28 - 30oC từ 36 - 48 giờ trong nƣớc thịt dinh dƣỡng thì nồng độ vi khuẩn đạt khoảng 5x108 CFU/ml). Ở độ pha loãng 10-2 thì 0,2 ml chứa khoảng 106 CFU. Xác định số lượng tế bào vi khuẩn sống: Pha loãng sáu lần theo hệ số 10 từ huyền dịch trên (100) để thành các dung dịch có độ pha loãng nhƣ sau: 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6 tƣơng ứng với các kí hiệu 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6. Từ mỗi độ pha loãng trên hút 20 µl nhỏ giọt lên đĩa thạch máu 7% (lặp lại hai lần), để khô rồi ủ ở 30°C trong 2 ngày. 22 3.3.4 Phƣơng pháp gây nhiễm thực nghiệm Cá đƣợc thuần trong bể kiếng từ bảy đến 10 ngày trƣớc khi tiến hành thí nghiệm. Gây nhiễm cho cá bằng cách tiêm vào xoang bụng. Tiêm cá với thể tích cố định là 0,2 ml/cá. Khi tiêm cá đƣợc gây mê bằng thuốc gây mê Ethylenglycol monophenylether nồng độ 0,17 ppm trong 2 – 3 phút. Dùng kim tiêm 1 ml tiêm trực tiếp vào xoang bụng cá sao cho kim tiêm và cá tạo thành một góc 30o (Hình 3.1). Hình 3. 1. Thao tác tiêm cá 3.3.5 Phƣơng pháp theo dõi cá sau khi gây nhiễm Sau khi gây nhiễm cá, theo dõi và ghi nhận các biểu hiện của cá trong bể, nếu cá chết trong vòng 24 giờ sau khi tiêm thì chứng tỏ cá bị sốc do tiêm. Theo dõi biểu hiện cá sau hai đến ba ngày gây nhiễm: cá bơi lờ đờ, bơi không định hƣớng, cá bỏ ăn, gầy yếu,... ngoài ra xem cá có xuất huyết các vây và gốc vây; xuất huyết hậu môn, hốc mắt, mắt đỏ, viêm loét chỗ tiêm,... Khi cá chết, giải phẫu cá có những biểu hiện xuất huyết nội tạng dẫn tới chảy máu xoang bụng, ruột chứa dịch vàng, xoang bụng chứa dịch trắng xem biểu hiện của các cơ quan bên trong nhƣ thận trƣớc và sau, gan, lách sƣng, nhũn, thâm đen, có mủ. 3.3.6 Phƣơng pháp thu mẫu máu, mẫu vi khuẩn 1/ Thu mẫu máu: Dùng kim tiêm 1 ml tiêm vào động mạch chủ lƣng, hƣớng kim nghiêng so với cá 30o, khi kim tiêm đụng xƣơng cá thì dừng lại, đƣa mũi kim lệch về phía 23 bụng, rút nhẹ pittông cho máu chảy lên (Hình 3.2). Lấy 0,6 ml máu/con cho vào eppendorf để lắng tách lớp, để qua đêm ở 4oC, rồi lấy phần huyết thanh cho vào eppendorf mới, bảo quản huyết thanh ở -20oC. Hình 3. 2. Thao tác lấy máu cá 2/ Thu mẫu vi khuẩn: Khi cá lờ đờ, sắp chết, mổ khám và chọn những cá có dấu hiệu bệnh tích điển hình. Tiến hành lấy mẫu vi khuẩn bằng cách dùng kéo vô trùng cắt phần thận hay gan, lách cho vào eppendorf vô trùng, giữ mẫu lạnh ở 4oC và chuyển về phòng thí nghiệm để tiến hành phân lập, định danh vi khuẩn (Hình 3.3). Hình 3. 3. Thao tác lấy mẫu vi khuẩn trên thận 24 3.3.7 Phƣơng pháp vi ngƣng kết xác định hiệu giá kháng thể Nguyên tắc: Phản ứng vi ngƣng kết là sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể đặc hiệu thể hiện dƣới dạng các hạt nhìn thấy đƣợc. Phản ứng này đƣợc thực hiện trên phiến nhựa 96 giếng. Pha loãng dung dịch kích thích ngay trên các dãy vi giếng của phiến nhựa bằng dung dịch đệm PBS có 0,6% BSA, cho đồng nhất thể tích huyền dịch kháng nguyên, trộn đều để yên ở nhiệt độ phòng hoặc qua đêm. Sau đó quan sát trực tiếp hoặc bằng kính lúp: nếu có mạng ngƣng kết bao phủ đáy là phản ứng dƣơng tính (+), ngƣợc lại nếu kháng nguyên tụ xuống đáy giếng thành một lớp màu trắng là phản ứng âm tính (-). Phƣơng pháp: + Chuẩn bị kháng thể: huyết thanh đƣợc xử lí bằng cách đun cách thủy 56 o C/32 phút để bất hoạt bổ thể. + Chuẩn bị kháng nguyên: vi khuẩn từ ống thạch nghiêng đã nuôi cấy 36 - 48h ở 28 - 30oC trộn với 5 ml nƣớc muối sinh lí trong ống nghiệm, đun ở 100oC/1h. Pha loãng 50 µl huyền dịch vi khuẩn sống bằng nƣớc muối sinh lí 0,85% NaCl có 0,5 % formaline, nồng độ vi khuẩn bây giờ khoảng 108 - 109 tbvk/ml. Các bƣớc tiến hành: - Hút 50 µl dung dịch PBS 0,6% BSA vào các giếng từ hai đến 12 (Hình 3.4). - Giếng thứ nhất, gồm 90 µl dung dịch PBS 0,6% BSA và 10 µl huyết thanh, độ pha loãng của huyết thanh là 1:10, trộn đều. - Sau đó, hút 50 µl dung dịch từ giếng thứ nhất chuyển lần lƣợt qua các giếng đến giếng 11 thì bỏ dung dịch này (không cho qua giếng 12 là giếng đối chứng). Nhƣ thế ta đã pha loãng bậc hai liên tiếp huyết thanh từ độ pha loãng đầu tiên. Giếng 12 chỉ có 50 µl PBS 0,6% BSA (không có huyết thanh). - Cho 50 µl huyền dịch vi khuẩn vào các giếng. Gõ nhẹ bốn cạnh của phiến nhựa để trộn đều hỗn hợp kháng nguyên - kháng thể. Ủ 2 giờ ở 37oC, sau đó ủ qua đêm ở 4oC 25 - Quan sát hiện tƣợng ngƣng kết. Giếng 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A H PBS (µl) 90 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 Huyết thanh(µl) 10 50 Vi khuẩn(µl) 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 Hình 3. 4. Sơ đồ cụ thể hóa các bƣớc tiến hành phản ứng vi ngƣng kết 3.3.8 Phƣơng pháp xử lý thống kê Số liệu đƣợc xử lý thống kê bằng trắc nghiệm F của phần mềm statgraphic 7.0. 3.4 Bố trí thí nghiệm 3.4.1 Thí nghiệm 1: Xác định hiệu quả vacxin với chất bổ trợ nhũ dầu Mục tiêu của thí nghiệm này là nhằm xác định khả năng sử dụng của chất bổ trợ nhũ dầu Montanide ISA 70M-PG của Seppic. - Bố trí sử dụng ba loại vacxin A, B, C tƣơng ứng với chủng vi khuẩn kí hiệu lần lƣợt là Ei-23, Ei-151, Ei-338 (Bảng 3.2). Mỗi loại vacxin gồm bốn nghiệm thức, ba nghiệm thức sử dụng vacxin ứng với ba nồng độ 108, 109, 3 x 109 tbvk/0,2 ml và một nghiệm thức đối chứng sử dụng nƣớc muối sinh lí. Mỗi nghiệm thức tƣơng ứng với hai bể, gồm 42 cá thí nghiệm. Tổng số là 24 bể, 504 cá, trọng lƣợng trung bình của cá là 43,39 g. - Thời gian thí nghiệm: Ngày thứ nhất tiêm ba loại vacxin lần lƣợt cho từng nghiệm thức sử dụng vacxin và tiêm nƣớc muối sinh lí cho các nghiệm thức đối 26 chứng; Ngày thứ 14 tiêm vacxin và nƣớc muối sinh lí nhắc lại. Ngày thứ 21 công vi khuẩn sống cho nghiệm thức sử dụng vacxin và nghiệm thức đối chứng (khi tiêm vacxin loại nào thì công vi khuẩn loại đó). Sau đó, tiếp tục theo dõi cá đến ngày thứ 42. Theo dõi và mô tả lại các dấu hiệu bệnh tích, thống kê số lƣợng cá sống và chết để tính tỉ lệ bảo hộ. Hình 3. 5. Hệ thống bố trí bể kính thí nghiệm Bảng 3. 2. Bố trí thí nghiệm xác định hiệu quả của vacxin dùng chất bổ trợ nhũ dầu Montanide ISA 70M-PG Nồng độ vacxin (tbvk/cá) Loại vacxin A B C 10 8 21 con x 2 21 con x 2 21 con x 2 10 9 21 con x 2 21 con x 2 21 con x 2 3x10 9 21 con x 2 21 con x 2 21 con x 2 Nƣớc SL 21 con x 2 21 con x 2 21 con x 2 Ghi chú: Các giống vi khuẩn: A: Ei-23; B: Ei-151; C: Ei-338 27 3.4.2 Thí nghiệm 2: Xác định lại độc lực ba chủng vi khuẩn Mục đích của thí nghiệm này nhằm kiểm tra lại độc lực của ba chủng vi khuẩn Ei-23, Ei-151, Ei-338 đã đƣợc sử dụng trong thí nghiệm 1. - Bố trí thí nghiệm: sử dụng ba chủng vi khuẩn nêu trên công cá với nồng độ công vi kuẩn (xem Bảng 3.3). Mỗi nghiệm thức gồm 18 cá, vậy tổng số cá sử dụng là 54 cá với trọng lƣợng trung bình là 64,90 g. - Thời gian thí nghiệm trong vòng bảy đến 10 ngày. Theo dõi cá trong suốt quá trình thí nghiệm, mô tả bệnh tích, tổng kết số cá chết. Bảng 3. 3. Bố trí thí nghiệm xác định lại độc lực của ba chủng vi khuẩn Loại vi khuẩn Nồng độ vi khuẩn (tbvk/cá) Số cá thí nghiệm A 2,5 x10 6 (110 LD50) 18 con B 2 x10 6 (90 LD50) 18 con C 5,6 x10 5 (25 LD50) 18 con Ghi chú: A: Ei-23, B: Ei-151, C: Ei-338 3.4.3 Thí nghiệm 3: Xác định hiệu quả vacxin với chất bổ trợ phèn chua Thí nghiệm đƣợc bố trí nhằm xác định hiệu quả của vacxin dùng chất bổ trợ phèn chua (Merck) đối với hai chủng vi khuẩn Ei-23 và Ei-151 tƣơng ứng với hai loại vacxin A và B. Riêng đối với chủng Ei-151, chúng tôi dùng thêm vacxin không có chất bổ trợ để so sánh với vacxin có sử dụng chất bổ trợ phèn chua. Mẫu huyết thanh của cá đƣợc thu để xác định hiệu giá kháng thể nhằm đánh giá hiệu quả của vacxin. - Thí nghiệm gồm hai nhóm vacxin thuộc hai chủng vi khuẩn Ed. ictaluri: vacxin B1 vacxin có chất bổ trợ, B2 vacxin không có chất bổ trợ, A1 vacxin không có chất bổ trợ (Bảng 3.4). Mỗi nghiệm thức vacxin đƣợc tiêm với ba nồng độ 108, 28 10 9 , 3 x 10 9 tbvk/0,2 ml và một nghiệm thức cá đối chứng đƣợc tiêm nƣớc muối sinh lí (trong thí nghiệm này hai loại vacxin B1, B2 chỉ sử dụng một nghiệm thức đối chứng). Mỗi nghiệm thức tƣơng ứng gồm 42 cá cho hai bể; thí nhgiệm sử dụng 22 bể, 462 cá, trọng lƣợng cá trung bình là 63,39 g. - Thời gian thí nghiệm (28 ngày): Ngày thứ nhất tiêm ba loại vacxin lần lƣợt cho từng nghiệm thức sử dụng vacxin, tiêm nƣớc muối sinh lí cho các nghiệm thức đối chứng. Ngày thứ 14 tiêm vacxin và nƣớc muối sinh lí nhắc lại. Ngày thứ 21 công vi khuẩn sống cho nghiệm thức sử dụng vacxin và nghiệm thức đối chứng của từng loại vacxin (khi tiêm vacxin loại nào thì công vi khuẩn loại đó) với liều 0,2 ml/con và nồng độ công vi khuẩn (xem Bảng 4.5). Ngày thứ 28 kết thúc thí nghiệm. - Theo dõi cá trong suốt quá trình thí nghiệm, mô tả dấu hiệu bệnh tích, thống kê số lƣợng cá sống và chết để tính tỉ lệ bảo hộ. - Thu mẫu huyết thanh các thí nghiệm vào ngày thứ nhất trƣớc khi tiêm vacxin, vào ngày 21 trƣớc khi công vi khuẩn sống và ngày 28 khi kết thúc thí nghiệm. - Thu mẫu vi khuẩn: sau khi công vi khuẩn sống cho cá, thu mẫu vi khuẩn đối với những cá chết có dấu hiệu bệnh đốm trắng điển hình nhƣ bên ngoài xuất huyết các vây và gốc vây nặng, bên trong thận, gan, lách có nhiều đốm trắng. Bảng 3. 4. Bố trí thí nghiệm xác định hiệu quả của vacxin với chất bổ trợ phèn chua Nồng độ vacxin (tbvk/cá) Loại vacxin B1 B2 A1 10 8 21 con x 2 21 con x 2 21 con x 2 10 9 21 con x 2 21 con x 2 21 con x 2 3x10 9 21 con x 2 21 con x 2 21 con x 2 Nƣớc SL 21 con x 2 21 con x 2 Ghi chú: B1, B2: Ei-151; A1: Ei-23 29 Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả thí nghiệm xác định hiệu quả của vacxin với chất bổ trợ nhũ dầu Bảng 4. 1. Thí nghiệm 1: Tổng kết số lƣợng cá chết trong suốt thời gian thí nghiệm và tỉ lệ cá chết của từng nghiệm thức Loại vacxin Nồng độ vacxin (tbvk/cá) Số cá thí nghiệm (x 2 bể) Số cá chết qua các ngày Số cá chết Số cá còn lại Tỉ lệ cá chết (%) 1-14 14-21 21-38 A 10 8 42 4 3 9 16 26 38,1 10 9 42 7 7 14 28 33,33 3x10 9 42 1 1 41 2,38 ĐC 42 0 42 0 B 10 8 42 1 2 3 39 7,14 10 9 42 1 1 2 40 4,76 3x10 9 42 0 42 0 ĐC 42 0 42 0 C 10 8 42 1 1 41 2,38 10 9 42 6 1 2 9 33 21,43 3x10 9 42 1 1 41 2,38 ĐC 42 0 42 0 Ghi chú: A (Ei-23), B (Ei-151), C (Ei-338), ĐC: đối chứng ; LD50 = 2,25 x10 4 tbvk/cá 30 Bảng 4. 2. Kết quả theo dõi biểu hiện bệnh lý của cá thí nghiệm 1 Thời gian Biểu hiện bệnh lý Ngày 1- 14 Ngày thứ 1: tiêm vacxin, cá biểu hiện bình thƣờng. Ngày thứ 2 – 5: cá hoạt động bình thƣờng. Ngày thứ 6: cá bắt đầu chết ở nghiệm thức 108 lô A với biểu hiện bên ngoài toàn thân mất màu từng mảng, da có rất nhiều nhớt; bên trong thận sƣng mất màu, gan và lách teo nhỏ, xoang bụng chứa đầy dịch trắng. Ngày thứ 7 – 10: cá chết rải rác ở các nghiệm thức 108 lô A, 10 9 lô C với những biểu hiện tƣơng tự nhƣ ngày thứ sáu. Ngày thứ 10, lúc 16h30 kiểm tra cá ở nghiệm thức 108 lô A và nghiệm thức 10 9 lô C chúng tôi quan sát thấy bề ngoài của các cá đƣợc kiểm tra toàn thân phủ nhiều vết chấm trắng nhỏ, lấy mẫu quan sát dƣới kính hiển vi thấy có nhiều trùng bánh xe. Chúng tôi tiến hành tắm formol cho toàn bộ cá thí nghiệm với nồng độ 20 ppm, thời gian khử 5 phút, sau đó tháo cạn nƣớc còn 5 cm đóng van và cấp nƣớc mới vào. Ngày thứ 12: lúc 8h30 tắm formol cho toàn bộ cá thí nghiệm lần 2, nồng độ 20 ppm trong 5 phút. Ngày thứ 11 - 13: cá hoạt động bình thƣờng. Ngày 14 - 21 Ngày thứ 14: lúc 10h tiêm nhắc lại vacxin, sau khi tiêm nhắc lại có ba cá chết do thao tác tiêm. Ngày thứ 15: cá hoạt động bình thƣờng. Ngày thứ 16: nghiệm thức 109 lô C có một cá chết biểu hiện bên ngoài phồng ngay vùng bụng và ứ động máu (Hình 4.1); bên trong thận sƣng, gan và lách thâm đen, xoang bụng chứa đầy dung dịch màu trắng (Hình 4.2). Ngày thứ 17: các nghiệm thức 108 lô A, 3 x109 lô C cá chết 31 có biểu hiện bên ngoài cá gầy ốm, tƣa vây, hoại tử điểm tiêm; bên trong gan teo sậm màu, thận sƣng và nhũn, tụy teo, mạch máu vón cục, xoang bụng chứa đầy dịch trắng. Ngày thứ 18 - 20: cá chết ở nghiệm thức 109 lô A có biểu hiện tƣơng tự nhƣ ngày thứ 17. Ngày 21 - 38 Ngày thứ 21: công vi khuẩn cho tất cả lô thí nghiệm. Trong quá trình cảm nhiễm, ở các nghiệm thức 108, 109 lô A có một số cá do quá nhỏ, gầy yếu, hoại tử vùng tiêm nên sẽ bị loại ra và không công vi khuẩn. Ngày thứ 22: nghiệm thức 108 lô A có hai cá chết biểu hiện giống nhau bên ngoài tƣa vây, thân gầy teo, viêm loét vùng tiêm; bên trong gan, thận và lách bị teo nhỏ, xoang bụng chứa đầy dịch trắng. Ngày thứ 23: nghiệm thức 108 lô A có một cá chết với biểu hiện nhƣ ngày thứ 22; nghiệm thức 109 lô A có một cá chết bên ngoài biểu hiện nhƣ trên bên trong đã xuất hiện đốm trắng nhẹ. Ngày thứ 24 – 38: cá chết ở các nghiệm thức tiêm vacxin có biểu hiện tƣơng tự nhƣ ngày thứ 22, cho đến thời điểm này cá ở các nghiệm thức đối chứng không chết. Ngày thứ 38: Chúng tôi kết thúc thí nghiệm. 32 Hình 4. 1. Cá bị lở loét ngay vùng bụng Hình 4. 2. Xoang bụng cá chứa đầy dịch trắng Ở thí nghiệm 1, trƣớc khi tiêm vacxin cá khỏe và biểu hiện bình thƣờng. Nhƣng sau khi tiêm vacxin trong khoảng thời gian từ ngày thứ 6 – 10 các nghiệm thức tiêm vacxin cá chết do ký sinh trùng ngoài biểu hiện bệnh tích của ký sinh, cá còn có những biểu hiện khác nhƣ bên ngoài lở loét vùng bụng; bên trong xoang bụng có chứa đầy dịch trắng, trong khi các nghiệm thức đối chứng thì cá hoạt động bình thƣờng. Trong thí nghiệm này điều kiện môi trƣờng, nguồn nƣớc là nhƣ nhau ở tất cả các nghiệm thức, cá đối chứng hoạt động bình thƣờng, chỉ ở các nghiệm thức tiêm vacxin có cá chết với những triệu chứng nhƣ trên. Điều này chứng tỏ chất bổ trợ nhũ dầu làm vacxin đã gây tác dụng phụ, tạo cơ hội cho ký sinh trùng phát triển. Sau đó chúng tôi xử lí formol cho tất cả các nghiệm thức sau một ngày thì cá không còn dấu hiệu của ký sinh trùng và cá hoạt động bình thƣờng từ ngày thứ 10 – 13. 33 Vào ngày thứ 14 chúng tôi tiêm nhắc lại vacxin, sau một ngày cá có những triệu chứng bất thƣờng, cá chết rải rác ở các nghiệm thức tiêm vacxin với những biểu hiện bên ngoài cá gầy yếu, bỏ ăn, lở loét ngay vùng bụng; bên trong thận, gan và lách teo, thận sƣng mất màu, gan thâm đen, xoang bụng chứa đầy dịch trắng và cá tiếp tục chết ở các ngày sau đó với những triệu chứng đã nêu, một điều cần chú ý là tất cả các cá chết khi giải phẫu bên trong xoang bụng đều chứa dịch trắng; trong khi đó cá ở các nghiệm thức đối chứng hoạt động bình thƣờng và không có con nào chết. Nhƣ vậy trong điều kiện thí nghiệm nhƣ nhau đối với các nghiệm thức có sự khác biệt lớn giữa nghiệm thức tiêm vacxin và đối chứng: nghiệm thức đối chứng cá hoạt động bình thƣờng, nghiệm thức tiêm vacxin cá chết sau khi tiêm vacxin với chất bổ trợ nhũ dầu, nhƣ thế có thể nói vacxin với chất bổ trợ nhũ dầu đã tác động không tốt tới hoạt động sống bình thƣờng của cá. Tuy nhiên, chúng tôi vẫn tiến hành công vi khuẩn sống cho cá đối chứng và cá tiêm vacxin để đánh giá thêm tác động của chất bổ trợ nhũ dầu lên tính mẫn cảm của cá đối với Ed. ictaluri. Khi công vi khuẩn sống cho tất cả các nghiệm thức vào ngày thứ 21, sau đó một ngày đã có cá chết ở các nghiệm thức tiêm vacxin với những biểu hiện tƣơng tự nhƣ lúc đầu và tiếp tục có cá chết vào những ngày tiếp theo với những bệnh tích tƣơng tự nhƣng thêm vào đó là những dấu hiệu của bệnh đốm trắng nhẹ; một điều cần lƣu ý là tới lúc này, cá ở các nghiệm thức đối chứng vẫn hoạt động bình thƣờng. Trong khi ở các nghiệm thức tiêm vacxin lại tiếp tục có cá chết, nhƣ thế ta có thể thấy rõ là vacxin với chất bổ trợ nhũ dầu Montanide ISA 70M-PG ngoài việc gây chết cá khi nuôi bình thƣờng trong điều kiện thí nghiệm còn gây chết cá nhiều hơn (Bảng 4.1 và Biểu đồ 4.1) khi có sự xuất hiện của Ed. ictaluri. Nhƣng sau khi công cƣờng độc vi khuẩn, cá đối chứng vẫn không chết nên chúng tôi nghi ngờ về độc lực của vi khuẩn hoặc nồng độ vi khuẩn chƣa đạt mức cho cá chết nên chúng tôi tiến hành thí nghiệm 2 để khẳng định lại vấn đề này. 34 Tỉ lệ cá chết thí nghiệm xác định hiệu quả vacxin với chất bổ trợ nhũ dầu 38,1 7,14 21,43 2,38 33,33 4,762,38 2,38 0 000 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 A B C Loại vacxin Tỉ lệ (% ) 10^8 10^9 3x10^9 ĐC Biểu đồ 4. 1. Tỉ lệ cá chết của thí nghiệm xác định hiệu quả vacxin với chất bổ trợ nhũ dầu Nhƣ vậy, bằng thực nghiệm ta có thể khẳng định chất bổ trợ nhũ dầu dùng trong thí nghiệm này không có độ an toàn, đem lại tác dụng không tốt cho cá mà theo hai tác giả Tyler và Klesius (1994), chất bổ trợ nhũ dầu tiêm vào xoang bụng của cá nheo Ictalurus punctatus làm giảm khả năng đề kháng với vi khuẩn Ed. ictaluri. Kết luận đƣợc rút ra từ thí nghiệm 1 là:  Chất bổ trợ nhũ dầu Montanide 70M-PG của Seppic không hoạt động, không an toàn.  Có thể độc lực của các chủng vi khuẩn có vấn đề: một là vi khuẩn đã hoàn toàn mất độc lực, hai là trong quá trình bảo quản làm vi khuẩn yếu độc lực. 35 4.2 Kết quả thí nghiệm xác định lại độc lực của ba chủng vi khuẩn Bảng 4. 3. Kết quả thí nghiệm xác định lại độc lực ba chủng vi khuẩn Loại vi khuẩn Nồng độ vi khuẩn (tbvk/cá) Số cá thí nghiệm Số cá chết Số cá còn lại Tỉ lệ cá chết (%) A 2,5 x10 6 (110 LD50) 18 con 10 8 55,6 B 2 x10 6 (90 LD50) 18 con 9 9 50 C 5,6 x10 5 (25 LD50) 18 con 4 14 22,2 Ghi chú: A (Ei-23), B (Ei-151), C (Ei-338); LD50 = 2,25 x10 4 tbvk/cá Bảng 4. 4. Kết quả theo dõi biểu hiện của cá thí nghiệm 2 Thời gian Biểu hiện bệnh lý Ngày 1 - 8 Ngày thứ 1: công vi khuẩn sống với liều lƣợng, nồng độ, cách thức đƣợc nêu trên, cá sau khi công biểu hiện bình thƣờng. Ngày thứ 2 – 3: cá hoạt động bình thƣờng. Ngày thứ 4: cá bắt đầu có triệu chứng của bệnh và cá chết rải rác ở các nghiệm thức, cá chết ở các nghiệm thức có biểu hiện giống nhau với các triệu chứng nhƣ bên ngoài xuất huyết các vây và gốc vây, mắt đỏ; bên trong gan, thận, lách đều có đốm trắng. Từ ngày thứ 4 trở đi: cá ở các nghiệm thức chết rất nhiều và có những dấu hiệu bệnh tích điển hình của bệnh đốm trắng. Ngày thứ 8: Chúng tôi kết thúc thí nghiệm. Thí nghiệm 2 cho kết quả chủng vi khuẩn Ei-23 và Ei-151 gây ra tỉ lệ cá chết trên 50% trừ chủng vi khuẩn Ei-338 do công với liều thấp (25LD50) nên tỉ lệ chết chỉ chiếm 22,2% (Bảng 4.3). Cá chết đều có những dấu hiệu bệnh tích điển hình của bệnh đốm trắng (Bảng 4.4). Tất cả điều này chứng tỏ các chủng vi khuẩn trên vẫn 36 còn độc độc lực và có khả năng gây chết cá. Nhƣ vậy, nghi vấn về vi khuẩn đã mất độc lực bị bác bỏ, nguyên nhân còn lại chúng tôi nghi ngờ là trong quá trình chuẩn bị vi khuẩn để công cƣờng độc, có thể nồng độ quá thấp nên cá đối chứng không chết hoặc quá trình bảo quản vi khuẩn sống trƣớc khi công đã làm vi khuẩn chết bớt trƣớc khi tiêm vào cá. Điều này đƣợc chúng tôi khắc phục ở thí nghiệm tiếp theo. 4.3 Kết quả thí nghiệm xác định hiệu quả vacxin với chất bổ trợ phèn chua Bảng 4. 5. Kết quả thí nghiệm 3 - Tổng kết số lƣợng cá chết trong suốt thời gian thí nghiệm và tỉ lệ cá chết của từng nghiệm thức Loại vacxin Nồng độ vacxin (tbvk/cá) Nồng độ vi khuẩn công (ngày 21) Số cá thí nghiệm (x 2 bể) Số cá chết qua các ngày Số cá còn Tỉ lệ cá chết (%) 1-14 14-21 21-28 B1 10 8 1,43 x 10 7 tbvk/cá (635 LD50) 42 0 0 41 1 95 10 9 42 0 0 39 3 93 3 x10 9 42 0 0 31 11 74 B2 10 8 42 0 0 42 0 100 10 9 42 0 0 42 0 100 3 x10 9 42 0 0 38 4 90 Đối chứng 42 0 0 42 0 100 A1 10 8 0,95 x 10 7 tbvk/cá (420 LD50) 42 0 0 40 2 95 10 9 42 0 0 30 12 71 3 x10 9 42 0 0 19 23 46 Đối chứng 42 0 0 42 0 100 Ghi chú: B1(có chất bổ trợ), B2 (không chất bổ trợ) (Ei-151); A1 (Ei-23): có chất bổ trợ; LD50 = 2,25 x10 4 tbvk/cá 4.3.1 Kết quả theo dõi bệnh tích lâm sàng của cá Bảng 4. 6. Kết quả theo dõi biểu hiện bệnh lý của cá thí nghiệm 3 37 Thời gian Biểu hiện bệnh lý Ngày 1 – 21 Trƣớc khi công vi khuẩn, cá khỏe biểu hiện bình thƣờng. Ngày 21 - 28 Ngày thứ 1: Công vi khuẩn, sau khi công cá biểu hiện bình thƣờng. Ngày thứ 2: sau khi công vi khuẩn, các nghiệm thức đối chứng cá có biểu hiện xuất huyết vây ngực và vây đuôi nhẹ. Ngày thứ 3: các nghiệm thức đối chứng A, B có cá chết đầu tiên với những biểu hiện bên ngoài mắt đỏ, hậu môn xuất huyết nhẹ, xuất huyết hàm, các vây xuất huyết nhẹ; bên trong gan, thận, lách sƣng nhũn, gan và thận xuất huyết nhẹ; ở nghiệm thức 108 lô B1 cá chết biểu hiện bên ngoài mắt đỏ, xuất huyết các vây và gốc vây; bên trong thận sƣng, gan xuất huyết; ở nghiệm thức 10 9 lô B1 cá chết biểu hiện tƣơng tự; các nghiệm thức tiêm vacxin còn lại cá chết rải rác có những biểu hiện tƣơng tự, bên trong chƣa có xuất hiện đốm trắng; lúc 17h - 22h nghiệm thức 108 lô B1 có một cá chết biểu hiện bên ngoài xuất huyết các vây, hậu môn nặng (Hình 4.3); bên trong thận, gan, lách sƣng, xuất huyết xoang bụng (Hình 4.4) và bắt đầu xuất hiện đốm trắng; các nghiệm thức còn lại của các lô vacxin và lô đối chứng cá chết rải rác và có những biểu hiện tƣơng tự. Ngày thứ 4: lúc này ở các nghiệm thức của từng lô thí nghiệm (cả lô đối chứng và lô vacxin) cá chết có những dấu hiệu của bệnh đốm trắng nhƣ bên ngoài các vây và gốc vây xuất huyết, xuất huyết hậu môn, hốc mắt, vồm miệng; bên trong thận, gan và lách sƣng nhũn, có đốm trắng nặng (Hình 4.5). Ngày thứ 5 – 8: cá chết ở các nghiệm thức và có những biểu hiện bệnh tích tƣơng tự, cá đạt tỉ lệ chết 100% ở các nghiệm thức lô đối chứng và ngay cả một số nghiệm thức ở lô vacxin; thí nghiệm kết thúc vào ngày thứ 8. 38 Hình 4. 3. Cá có biểu hiện xuất huyết bên ngoài Hình 4. 4. Cá có dấu hiệu xuất huyết xoang bụng Hình 4. 5. Cá có nhiều đốm trắng trên thận 39 Thí nghiệm 3 sử dụng vacxin với chất bổ trợ phèn chua đã đƣợc dùng phổ biến làm vacxin trong thú y. Sau khi tiêm vacxin lần nhất và tiêm nhắc lại, cá ở các nghiệm thức hoạt động bình thƣờng, nhƣ vậy so sánh với thí nghiệm 1, vacxin với chất bổ trợ phèn chua có độ an toàn hơn. Sau khi công vi khuẩn vào ngày thứ 21 của thí nghiệm, sau hai ngày cá ở một số nghiệm thức đều có những biểu hiện bệnh nhƣ cá bỏ ăn, lờ đờ, xuất huyết ở các vây và cá chết vào ngày hôm sau có những biểu hiện nhƣ bên ngoài với những triệu chứng vừa nêu còn xuất huyết hậu môn, hốc mắt, vòm miệng, mắt đỏ nhƣng bên trong chƣa có biểu hiện của bệnh đốm trắng. Những ngày tiếp theo, cá chết có những biểu hiện của bệnh đốm trắng rất rõ rệt (Bảng 4.6). Sau khi kết thúc thí nghiệm, ở các nghiệm thức đối chứng tỉ lệ cá chết đạt 100%. Tuy nhiên, một điều đáng nói là, các nghiệm thức tiêm vacxin tỉ lệ cá chết cũng khá cao (> 46%), có nghiệm thức chiếm 100%. Trong đó, các nghiệm thức tiêm vacxin của chủng vi khuẩn B có tỉ lệ cá chết cao nhất (Bảng 4.5). Theo kết quả quan sát thực nghiệm, cá chết với số lƣợng nhiều và chiếm tỉ lệ cao ở tất cả các nghiệm thức. Nhƣ vậy, nguyên nhân có thể do nồng độ công vi khuẩn cao, 420 LD50 (A) và 635 LD50 (B). Điều này sẽ đƣợc chúng tôi bàn luận tiếp khi trình bày về hiệu giá kháng thể trung bình và tỉ lệ cá chết. Qua phân tích trên, chúng tôi có thể rút ra một số kết luận:  Chất bổ trợ phèn chua dùng làm vacxin trong thí nghiệm này bƣớc đầu có độ an toàn, và có hiệu quả hơn chất bổ trợ nhũ dầu dùng ở thí nghiệm 1.  Tỉ lệ cá chết của các nghiệm thức vacxin và đối chứng cao có thể do nguyên nhân nồng độ vi khuẩn công quá cao. 40 4.3.2 Kết quả phản ứng vi ngƣng kết xác định hiệu giá kháng thể Bảng 4. 7. Kết quả giá trị hiệu giá kháng thể trung bình thí nghiệm 3 Loại vacxin Nồng độ vacxin (tbvk/cá) Trƣớc khi tiêm vacxin (ngày 1) Trƣớc khi công vi khuẩn (ngày 21) Sau khi công vi khuẩn (ngày 28) TTB n TTB n TTB n B1 (Có chất bổ trợ) 10 8 0 5 1200 4 x 10 9 1740 4 6240 2 3x10 9 2660 4 5414 3 B2(Không có chất bổ trợ) 10 8 1440 4 x 10 9 2380 4 x 3x10 9 3480 4 6240 4 ĐC 13 4 x A1(Có chất bổ trợ) 10 8 4080 4 6240 2 10 9 4680 4 6240 10 3x10 9 4540 4 6240 13 ĐC 403 4 x Ghi chú: B1(có chất bổ trợ), B2 (không chất bổ trợ) (Ei-151); A1 (Ei-23): có chất bổ trợ; TTB: giá trị hiệu giá kháng thể trung bình; n: số mẫu cá kiểm tra huyết thanh; x: không có mẫu (do sau khi công vi khuẩn cá đã chết hết); ĐC: mẫu đối chứng (cá thí nghiệm chỉ tiêm nƣớc muối sinh lí). Kết quả từ Bảng 4.7 cho thấy: trƣớc khi tiêm vacxin ngày thứ nhất, giá trị hiệu giá kháng thể trung bình (TTB) bằng 0. Ngày thứ 21 trƣớc khi công vi khuẩn, đối với 3 loại vacxin kết quả cho thấy nồng độ vacxin tiêm tăng dần (108, 109, 3 x10 9 ) thì TTB cũng tăng dần. So với hai nghiệm thức đối chứng A và B, các nghiệm thức vacxin có giá trị hiệu giá kháng thể trung bình cao hơn đáng kể, gấp khoảng 100 lần ở chủng vi khuẩn B (p < 0,05) và khoảng 10 lần ở chủng vi khuẩn A (p < 0,01). Trong đó vacxin B1 với nồng độ 3x109 có TTB cao gấp khoảng 2 lần vacxin với nồng độ 108 và 200 lần so với đối chứng (p < 0,05), vacxin A1 ở từng nồng độ đều có TTB cao và có sự khác biệt với đối chứng (p < 0,01) (Phụ lục 5.1 và 5.2). Nhƣ vậy, ta có thể kết luận rằng, các vacxin đƣợc sử dụng trong thí nghiệm này đều 41 cho đáp ứng miễn dịch sinh kháng thể. Các giá trị TTB của loại vacxin có chất bổ trợ của chủng Ei-23 (A1) cao gấp khoảng hai lần vacxin B1 (p < 0,01). Cụ thể ở từng nồng độ 3x109, 109, 108 vacxin A1 cao gấp vacxin B1 lần lƣợt là 1,7; 2,9; 3,4 (p < 0,01) (Phụ lục 5.3). Ta kết luận vacxin A1 có hiệu giá kháng thể trung bình cao hơn nhiều lần so với vacxin B1, nhƣ thế khả năng tạo đáp ứng miễn của vacxin A1 cao hơn vacxin B1. Đối với chủng vi khuẩn Ei-151, loại vacxin có chất bổ trợ (B1) có các giá trị TTB thấp hơn so với loại vacxin không có chất bổ trợ (B2), tuy nhiên giá trị này không có sự khác biệt về phƣơng diện thống kê và ngay cả khi so sánh ở từng nồng độ của hai loại vacxin này cũng không thấy sự khác biệt (p > 0,05) (Phụ lục 5.4). Cuối cùng, khi kết thúc thí nghiệm TTB của cá ở các nghiệm thức sử dụng vacxin còn sống là rất cao từ 5414 đến 6240. Tiếp tục so sánh hai loại vacxin B1 và B2, ta thấy ở nồng độ 109 vacxin B1 cá vẫn còn sống và có TTB = 6240, trong khi vacxin B2 cá chết hết. Còn ở nồng độ vacxin 3x109, TTB của cả hai loại vacxin đều cao và chúng không có sự khác biệt về phƣơng diện thống kê (p > 0,05) (Phụ lục 5.5). Nhƣ vậy vacxin có và không có chất bổ trợ phèn chua đều cho đáp ứng miễn dịch nhƣ nhau, tuy nhiên qua kết quả phân tích nêu trên ta có thể thấy vacxin với chất bổ trợ phèn chua có xu hƣớng tạo đáp ứng miễn dịch tốt hơn thể hiện qua tỉ lệ cá chết sau thí nghiệm, mà chúng tôi sẽ bình luận tiếp theo. Tỉ lệ cá chết của các nghiệm thức 95 100 9593 100 7174 90 46 100 100 100 0 20 40 60 80 100 120 B1 B2 A1 Loại vacxin Tỉ lệ (% ) 10^8 10^9 3x10^9 ĐC Biểu đồ 4. 2. Thể hiện tỉ lệ cá chết các nghiệm thức của thí nghiệm 3 42 Khi so sánh tỉ lệ cá chết ở các nghiệm thức tiêm vacxin B1 và A1 với đối chứng, ta thấy ở các nghiệm thức tiêm vacxin tuy cho tỉ lệ cá chết thấp so với đối chứng (100%) nhƣng đều ở mức cao (> 46%). Nghiệm thức ở nồng độ 3x109 của vacxin B1 cho tỉ lệ cá chết thấp so với đối chứng và với hai nghiệm thức còn lại (p < 0,01) (Phụ lục 4.2). Đối với vacxin A1, các nghiệm thức tiêm vacxin cá chết cũng với tỉ lệ cao, tuy nhiên nghiệm thức ở nồng độ vacxin 3x109 tỉ lệ cá chết thấp hơn so với đối chứng và với cả hai nghiệm thức ở nồng độ 108, 109 (p < 0,01) (Phụ lục 4.2). Nhƣ vậy, khi so sánh tỉ lệ cá chết giữa các nghiệm thức vacxin cho ta thấy vacxin với nồng độ 3x109 CFU/cá có tỉ lệ cá chết thấp hơn so với cá đối chứng và cá ở nồng độ vacxin 108 và 109. Điều này, chúng ta có thể xác định rằng nồng độ vacxin 3x10 9 CFU/cá là nồng độ vacxin thích hợp nhất để chọn tiêm cho cá tra. Tuy nhiên, một vacxin đƣợc xem là hiệu quả khi tỉ lệ chết của cá ở nghiệm thức vacxin dƣới 24% (hay tỉ lệ bảo hộ trên 76%) trong điều kiện cá đối chứng chết trong khoảng 60 - 80% (Nordmo, 1997). Nhƣng cá ở tất cả các nghiệm thức vaxcin và đối chứng trong thí nghiệm này đều không đạt đƣợc yêu cầu trên (tỉ lệ cá chết khá cao). Một điều cần chú ý là cá ở các nghiệm thức tiêm vacxin đều tạo ra đáp ứng miễn dịch thể hiện qua giá trị hiệu giá kháng thể trung bình cao so với cá ở các nghiệm thức đối chứng. Nhƣ vậy, nguyên nhân dẫn tới kết quả tỉ lệ cá chết cao là do nồng độ vi khuẩn công quá cao khiến cá không có khả năng chống chịu nổi, nhất là đối với chủng vi khuẩn B. So sánh hai loại vacxin B1 có chất bổ trợ phèn chua và B2 không có chất bổ trợ về khả năng gia tăng sức đề kháng của cá tra đối với Ed. ictaluri, ta thấy khi công vi khuẩn sống với cùng liều lƣợng thì tỉ lệ cá chết ở các nghiệm thức sử dụng chất bổ trợ phèn chua thấp hơn so với các nghiệm thức không dùng chất bổ trợ, và ở từng nồng độ đều có sự khác biệt, trong đó nồng độ 3x109 của vacxin B1 cho tỉ lệ cá chết thấp hơn của vacxin B2 (p < 0,05) (Phụ lục 4.3 ). Hơn nữa, do nồng độ vi khuẩn chủng Ei-151 công cho cá quá cao nên chúng tôi không thể đánh giá hay so sánh hiệu quả bảo hộ của hai loại vacxin (có và không có chất bổ trợ) ở các nồng độ vacxin tiêm so với nghiệm thức đối chứng. Tuy nhiên, ta cũng có thể kết luận bƣớc 43 đầu, vacxin sử dụng chất bổ trợ phèn chua có khả năng gia tăng sức đề kháng của cá tra tốt hơn vacxin không dùng chất bổ trợ, nhƣng điều này cần phải đƣợc nghiên cứu thêm ở những thí nghiệm kế tiếp. Tóm lại ở thí nghiệm này ta có thể khẳng định những điều sau:  Vacxin có hoặc không có chất bổ trợ phèn chua có tỉ lệ bảo hộ thấp mặc dù khả năng gây đáp ứng miễn dịch của chúng là tốt điều này liên quan tới nồng độ vi khuẩn công cƣờng độc là chƣa hợp lý (nồng độ vi khuẩn công cƣờng độc cho cá cao khiến tỉ lệ cá chết ở các nghiệm thức cao).  Vacxin với chất bổ trợ phèn chua và vacxin không có chất bổ trợ phèn chua về khả năng gia tăng sức đề kháng là có sự khác biệt theo so sánh thống kê, và vacxin có chất bổ trợ phèn chua có xu hƣớng đáp ứng miễn dịch tốt hơn. Nhƣ thế chúng ta cần có sự nghiên cứu thêm về vai trò của chất bổ trợ phèn chua đồng thời với các chất bổ trợ khác nhằm tăng hiệu lực của vacxin.  Nồng độ vacxin 3x109 CFU/cá là nồng độ vacxin thích hợp nhất để chọn tiêm cho cá tra. 44 Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận  Vacxin với chất bổ trợ nhũ dầu Montanide ISA 70M-PG không hiệu quả, không có tính an toàn.  Vacxin với chất bổ trợ phèn chua bƣớc đầu thử nghiệm có độ an toàn, có khả năng tạo đáp ứng miễn dịch trên cá tra đối với vi khuẩn Ed. ictaluri.  Vacxin với chất bổ trợ phèn chua mặc dù tạo ra đáp ứng miễn dịch tốt thể hiện qua hiệu giá kháng thể cao, tuy nhiên tỉ lệ bảo hộ thấp là do có liên quan mật thiết đến nồng độ vi khuẩn công cƣờng độc cao.  Nồng độ vacxin 3x109 CFU/cá là thích hợp nhất cho vacxin có chất bổ trợ phèn chua. 5.2 Đề nghị  Xác định thêm LD50 cho từng chủng vi khuẩn Ed. ictaluri phân lập từ cá tra ở các thời điểm khác nhau ứng với các loại cá thí nghiệm có kích cở khác nhau để có liều công cƣờng độc chính xác hơn.  Tiếp tục thử nghiệm vacxin với chất bổ trợ phèn chua dùng nồng độ vacxin là 3 x109 CFU/0,2ml và công cƣờng độc vi khuẩn với các nồng độ khác nhau (nồng độ công cƣờng độc thấp hơn) để chọn nồng độ vi khuẩn thích hợp.  Dùng kỹ thuật ELISA gián tiếp để xác đinh hiệu giá kháng thể nhằm đem lại kết quả xác định hiệu giá kháng thể chính xác hơn.  Thử nghiệm vacxin nghiên cứu ngoài thực địa (ao/bè nuôi) để xác định khả năng sử dụng của loại vacxin này. 45  Tiếp tục nghiên cứu sản xuất vacxin phòng bệnh đốm trắng trên cá tra nói chung và bệnh nhiễm khuẩn trên các đối tƣợng cá nuôi công cƣờng độc nghiệp khác. 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Tài liệu tiếng Việt 1. Từ Thanh Dung, 1994. Phòng và trị bệnh cá nước ngọt. Nhà xuất bản Nông Nghiệp Hà Nội. 32 trang. 2. Từ Thanh Dung, M Crumlish, H W Ferguson, N T N Ngọc, N Q Thịnh và D T M Thy, 2003. Xác định vi khuẩn gây bệnh đốm trắng trên gan cá tra (Pangasius hypophthalmus) nuôi thâm canh ở đồng bằng sông Cửu Long. Tuyển tập báo cáo khoa học về nuôi thủy sản, tr 411 – 415. 3. Lê Minh Hải và ctv., 2004. Thử nghiệm vaxcine Norvax VIB trong nuôi tôm sú. Tuyển tập các công trình nghiên cứu khoa học công nghệ 1984 – 2004. Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản III, trang 463 - 475. 4. Đỗ Thị Hoà và ctv., 2004. Bệnh học thuỷ sản. Nhà xuất bản Nông Nghiệp Tp HCM, tr 125 – 164. 5. Lê Văn Hùng, 2002. Miễn dịch học thú y. Nhà xuất bản Nông nghiệp, Tp. HCM. 192 trang. 6. Phạm Văn Khánh, 1997. Sinh sản nhân tạo cá tra. Báo cáo khoa học - Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II. 8 trang. 7. Phạm Văn Khánh, 2000. Kỹ thuật nuôi cá tra và basa trong bè. Nhà xuất bản Nông Nghiệp Tp Hồ Chí Minh. 40 trang. 8. Phạm Văn Khánh và Lý Thị Thanh Loan, 2005. Kỹ thuật nuôi một số loài cá kinh tế nước ngọt và phòng trị bệnh cá. Nhà xuất bản Nông Nghiệp Tp HCM. 102 trang. 9. Nguyễn Ngọc Lanh và ctv., 1997. Miễn dịch học. Nhà xuất bản Y học Hà Nội. 342 trang. 10. Nguyễn Ngọc Nhiên và ctv., 1992. Miễn dịch đại cương. Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, tr 56 – 66. 11. Trần Thị Minh Tâm và ctv., 2003. Nghiên cứu tác nhân hoại tử trên cơ quan nội tạng cá tra (Pangasianodon hypophthalmus). Tuyển tập nghề cá đồng bằng sông Cửu Long 2003, tr 315 - 321. 47 12. Bùi Quang Tề và ctv., 1994. Những bệnh thường gặp của tôm cá nuôi ở đồng bằng sông Cửu Long và biện pháp phòng trị. Nhà xuất bản Nông Nghiệp Tp HCM. 40 trang. 13. Phạm Văn Ty, 2001. Miễn dịch học. Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội. 110 trang. 14. Trần Thanh Xuân, 1996. Một số đặc điểm sinh học và sinh sản nhân tạo cá tra (Pangasius hypophthalmus). Các báo cáo khoa học đã được trình bày tại hội thảo quốc tế. Bộ Thủy Sản - Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II, tr 80 - 82. 15. Lê Nhƣ Xuân và ctv., 1994. Kỹ thuật nuôi cá nước ngọt. Sở Khoa học Công Nghệ và Môi Trƣờng An Giang. 230 trang. 2. Tài liệu tiếng nƣớc ngoài 16. Anderson D. P., 1997. Adjuvants and immunostimulants for enhancing vaccine potency in fish. Fish vaccinology 90: 257 – 265. 17. Evelyn T. P. T., 1997. A historical review of fish vaccinology. Fish vaccinology 90: 3 – 12. 18. Ferguson H. W., Turnbull J. F., Shinn A., Thompson K., Dung T. T. and Crumlish M., 2001. Bacillary necrosis in farmed Pangasius hypophthalmus (Sauvage) from the Mekong Delta, Vietnam. Journal of Fish Diseases 24: 509 – 513. 19. Gudding R., Lillehaug A., Evensen Q., 1999. Recent development in fish vaccinology. Veterinary Imumunology and Immunopathology 72: 203 – 212. 20. Hawke J. P., 1979. A beterium asociated with disease of pond cultured channel catfish. Journal of Fisheries Research Board of Cannada 36: 1508 – 1512. 21. Muiswinkel W. B., Wiegertjes G. F., 1997. Immune responses after injection vaccination of fish. Fish vaccinology 90: 55 – 57. 22. Nakanishi T., Ototake M., 1997. Antigen uptake and immune responses after immersion vaccination. Fish vaccinology 90: 59 – 68. 23. Nordmo R., 1997. Strengths and weaknesses of different challenge methods. Fish vaccinology 90: 303 – 309. 48 24. Quentel C., Vigneulle M., 1997. Antigen uptake and immune responses after oral vaccination. Fish vaccinology 90: 69 – 78. 25. Tyler J. W., Klesius P. H., 1994. Decreased resistance to Ed. ictaluri infection in Channel Catfish intraperitoneally administered an oil adjuvant. Journal of Aquatic Animal Health 6: 275 – 278. 3. Tài liệu từ internet 1. www.fistenet.com.vn 2. www.vietlinh.com.vn 3. www.taxonomy.nl/Taxonomicon/TaxonTree.aspx.id=153008 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Các số đo của cá thí nghiệm 1 STT p (g/con) L (mm) Lo (mm) H (mm) 1 51,52 20,3 18,1 3,5 2 39,3 18,4 16,1 3,2 3 50,18 20,7 18,2 3,6 4 57,97 21,5 18,5 3,6 5 41,42 18,5 16,7 3,1 6 41,92 19,2 16,5 2,8 7 39,56 18,2 16,1 3,1 8 32,74 17,5 14,5 2,6 9 50,17 20,2 17,5 3,1 10 32,45 17,7 15,2 2,6 11 48,8 20,1 17,1 3,6 12 35,69 17,8 15,6 2,8 13 46,96 19,5 17,2 3,2 14 44,84 19,5 16,8 3,2 15 44,44 19,2 16,5 3,2 16 60,16 20,7 18,5 3,5 17 40,17 19,1 16,2 2,8 18 34,14 17,8 15,2 2,8 19 41,78 17,5 15,1 3,1 20 37,67 18,7 16,5 3,1 21 43,73 18,5 16,3 3,3 22 52,81 19,1 17,1 3,4 23 47,79 20,1 17,1 3,4 24 39,62 18,2 16,1 3,1 25 39,84 18,2 16,1 3,1 26 38,77 18,5 16,1 2,7 27 36,44 19,1 15,1 2,8 28 49,33 19,1 16,5 3,4 29 41,2 18,2 16,1 3,4 30 40,15 17,2 16,1 2,8 TB 43,39 18,94 16,49 3,13 max 60,16 21,5 18,5 3,6 min 32,45 17,2 14,5 2,6 Ghi chú: P (g): Trọng lƣợng của cá tra thí nghiệm; L (mm): Chiều dài tổng; Lo (mm): Chiều dài chuẩn; H (mm): Chiều cao thân; TB (g): giá trị trung bình; max: giá trị lớn nhất; min: giá trị nhỏ nhất. Phụ lục 2: Các số đo của cá thí nghiệm 2: STT p (g/con) L (mm) Lo (mm) H (mm) 1 55,46 19 17,2 3,7 2 69,49 22,7 19,5 3,8 3 52,43 19,2 16,5 3,4 4 43,09 16,8 14,8 3,4 5 73,74 22 18,5 4 6 61,87 20 18 3,6 7 57,35 19,3 15,8 3,1 8 71,77 22,5 19 4 9 68,17 20,5 17,5 3,7 10 57,76 19 16,7 3,6 11 51,52 19,2 16,2 3,5 12 74,43 22 19,5 4 13 74,3 22,5 19 4 14 50,68 19 16 3,2 15 46,87 18,5 16 3,3 16 54,63 20,5 17,5 3,4 17 73,95 21,4 18 4,3 18 71,65 21,5 18,5 3,5 19 66,52 21 17,5 3,8 20 49,83 19,5 16,8 3,4 21 55,43 20,5 18 3,5 22 50,54 20 17 3,6 23 47,87 19,5 16,2 3,2 24 70,39 22,3 18,2 3,9 25 60,95 20,4 17,5 3,6 26 71,75 19 16,5 3,5 27 52,21 21,5 19 3,8 28 74,98 21,5 19 3,6 29 53,55 20,5 17,3 3,6 30 66,25 20,7 18,5 3,8 TB 60,98 20,4 17,52 3,63 max 74,98 22,7 19,5 4,3 min 43,09 16,8 14,8 3,1 Ghi chú: P (g): Trọng lƣợng của cá tra thí nghiệm; L (mm): Chiều dài tổng; Lo (mm): Chiều dài chuẩn; H (mm): Chiều cao thân; TB (g): giá trị trung bình; max: giá trị lớn nhất; min: giá trị nhỏ nhất. Phụ lục 3: Các số đo của cá thí nghiệm 3: STT p (g/con) L (mm) Lo (mm) H (mm) 1 80,42 23,5 19 4,2 2 75,12 20,2 17,2 3,8 3 77,8 19,9 16,9 3,5 4 98,52 19,5 16,8 3,7 5 53,9 18,8 15,8 3,6 6 76,45 21 17,9 3,9 7 57,35 19,3 15,8 3,1 8 71,77 22,5 19,2 4,2 9 56,54 18,5 15,6 3,5 10 50,25 18,4 15,6 3,5 11 53,89 19,6 16,9 3,7 12 66,12 20,3 17,2 4,1 13 80,4 22,6 19,5 4,5 14 72,24 21,2 18,1 4,2 15 74,21 21,9 18,6 3,9 16 50,07 19,9 16,5 3,8 17 52,97 19,2 16,4 3,6 18 53,13 19,8 16,8 3,8 19 58,83 19,5 16,6 3,4 20 50,41 19,8 16,6 3,8 21 54,91 19,8 16,1 3,7 22 51,61 18,5 18,9 3,4 23 76,17 22,6 18,8 4,2 24 70,39 22,3 18,2 3,9 25 71,53 20,9 16,3 3,2 26 42,71 18,6 16,3 3,2 27 52,21 19,4 16,4 3,8 28 80,4 22,6 19,5 4,5 29 50,41 19,8 16,6 3,8 30 50,07 19,9 16,5 3,8 TB 63,69 20,33 17,22 3,78 max 98,52 23,5 19,5 4,5 min 42,71 18,4 15,6 3,1 Ghi chú: P (g): Trọng lƣợng của cá tra thí nghiệm; L (mm): Chiều dài tổng; Lo (mm): Chiều dài chuẩn; H (mm): Chiều cao thân; TB (g): giá trị trung bình; max: giá trị lớn nhất; min: giá trị nhỏ nhất. Phụ lục 4: Bảng ANOVA về mối quan hệ giữa tỉ lệ cá chết của các loại vacxin với nhau và với đối chứng 4.1. So sánh vacxin B1 và đối chứng One-Way Analysis of Variance ------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level ------------------------------------------------------------------------- Between groups 778.00000 3 259.33333 172.889 .0001 Within groups 6.00000 4 1.50000 ------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 784.00000 7 Table of means for B1DC1.Tlcachet by B1DC1.nghthuc ------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean ------------------------------------------------------------------------- ------- ĐC 2 100.000000 .0000000 .8660254 98.299179 101.7008 b1-108 2 95.000000 1.0000000 .8660254 93.299179 96.7008 b1-109 2 93.000000 1.0000000 .8660254 91.299179 94.7008 b1-3x109 2 74.000000 1.0000000 .8660254 72.299179 75.7008 ------------------------------------------------------------------------- ------- Total 8 90.500000 .4330127 .4330127 89.649589 91.35041 Multiple range analysis for B1DC1.Tlcachet by B1DC1.nghthuc ------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups ------------------------------------------------------------------------- b1-3x109 2 74.000000 X b1-109 2 93.000000 X b1-108 2 95.000000 X ĐC 2 100.000000 X ------------------------------------------------------------------------- contrast difference limits ĐC - b1-108 5.00000 3.40164 * ĐC - b1-109 7.00000 3.40164 * ĐC - b1-3x109 26.0000 3.40164 * b1-108 - b1-109 2.00000 3.40164 b1-108 - b1-3x109 21.0000 3.40164 * b1-109 - b1-3x109 19.0000 3.40164 * ------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. 4.2. So sánh vacxin A1 và đối chứng One-Way Analysis of Variance ------------------------------------------------------------------------ Source of var Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level ------------------------------------------------------------------------- Between groups 3692.0000 3 1230.6667 820.444 .0000 Within groups 6.0000 4 1.5000 ------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 3698.0000 7 Table of means for A1DC1.Tlcachet by A1DC1.nghthuc ------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean ------------------------------------------------------------------------- ĐC 2 100.000000 .0000000 .8660254 98.299179 101.70082 a1-108 2 95.000000 1.0000000 .8660254 93.299179 96.70082 a1-109 2 71.000000 1.0000000 .8660254 69.299179 72.70082 a1-3x109 2 46.000000 1.0000000 .8660254 44.299179 47.70082 ------------------------------------------------------------------------- Total 8 78.000000 .4330127 .4330127 77.149589 Multiple range analysis for A1DC1.Tlcachet by A1DC1.nghthuc ------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups ------------------------------------------------------------------------- a1-3x109 2 46.000000 X a1-109 2 71.000000 X a1-108 2 95.000000 X ĐC 2 100.000000 X ------------------------------------------------------------------------- contrast difference limits ĐC - a1-108 5.00000 3.40164 * ĐC - a1-109 29.0000 3.40164 * ĐC - a1-3x109 54.0000 3.40164 * a1-108 - a1-109 24.0000 3.40164 * a1-108 - a1-3x109 49.0000 3.40164 * a1-109 - a1-3x109 25.0000 3.40164 * ------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. 4.3. So sánh vacxin B1 và B2 Analysis of Variance for B1B211.Tlcachet - Type III Sums of Squares ------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level ------------------------------------------------------------------------- MAIN EFFECTS A:B1B211.vacxin 261.33333 1 261.33333 28.000 .0007 B:B1B211.nongdo 602.00000 2 301.00000 32.250 .0001 RESIDUAL 74.666667 8 9.3333333 ------------------------------------------------------------------------- TOTAL (CORRECTED) 938.00000 11 Multiple range analysis for B1B211.Tlcachet by B1B211.vacxin ------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups ------------------------------------------------------------------------- b1 6 87.333333 X b2 6 96.666667 X ------------------------------------------------------------------------- contrast difference limits b1 - b2 -9.33333 4.06855 * ------------------------------------------------------------------------- Multiple range analysis for B1B211.Tlcachet by B1B211.nongdo ------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups ------------------------------------------------------------------------- 3x109 4 82.000000 X 109 4 96.500000 X 108 4 97.500000 X ------------------------------------------------------------------------- contrast difference limits 108 - 109 1.00000 4.98293 108 - 3x109 15.5000 4.98293 * 109 - 3x109 14.5000 4.98293 * ------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. ------------------------------------------------------------------------- One-Way Analysis of Variance ------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level ------------------------------------------------------------------------- Between groups 932.00000 5 186.40000 186.400 .0000 Within groups 6.00000 6 1.00000 ------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 938.00000 11 Table of means for B1B211.Tlcachet by B1B211.nghthuc ------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean ------------------------------------------------------------------------- B1-108 2 95.000000 1.0000000 .7071068 93.776173 96.22383 B1-109 2 93.000000 1.0000000 .7071068 91.776173 94.22383 B1-3x109 2 74.000000 1.0000000 .7071068 72.776173 75.22383 B2-108 2 100.000000 .0000000 .7071068 98.776173 101.22383 B2-109 2 100.000000 .0000000 .7071068 98.776173 101.22383 B2-3x109 2 90.000000 .0000000 .7071068 88.776173 91.22383 ------------------------------------------------------------------------- Total 12 92.000000 .2886751 .2886751 91.500375 92.49963 Multiple range analysis for B1B211.Tlcachet by B1B211.nghthuc ------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups ------------------------------------------------------------------------- B1-3x109 2 74.000000 X B2-3x109 2 90.000000 X B1-109 2 93.000000 X B1-108 2 95.000000 X B2-108 2 100.000000 X B2-109 2 100.000000 X contrast difference limits B1-108 - B1-109 2.00000 2.44765 B1-108 - B1-3x109 21.0000 2.44765 * B1-108 - B2-108 -5.00000 2.44765 * B1-108 - B2-109 -5.00000 2.44765 * B1-108 - B2-3x109 5.00000 2.44765 * B1-109 - B1-3x109 19.0000 2.44765 * B1-109 - B2-108 -7.00000 2.44765 * B1-109 - B2-109 -7.00000 2.44765 * B1-109 - B2-3x109 3.00000 2.44765 * B1-3x109 - B2-108 -26.0000 2.44765 * B1-3x109 - B2-109 -26.0000 2.44765 * B1-3x109 - B2-3x109 -16.0000 2.44765 * B2-108 - B2-109 0.00000 2.44765 B2-108 - B2-3x109 10.0000 2.44765 * B2-109 - B2-3x109 10.0000 2.44765 * ------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Phụ lục 5: Bảng ANOVA về mối quan hệ giá trị hiệu giá kháng thể trung bình của các loại vacxin với nhau và với đối chứng 5.1. So sánh vacxin B1 và đối chứng: Analysis of variance ------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level ------------------------------------------------------------------------- Between groups 7336634.4 3 2445544.8 12.501 .0168 Within groups 782512.5 4 195628.1 ------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 8119146.9 7 Table of means for B1DC.hieugia by B1DC.nghthuc ------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean ------------------------------------------------------------------------- ĐC 2 12.5000 7.50000 312.75240 -601.7268 626.7268 b1-108 2 1200.0000 400.00000 312.75240 585.7732 1814.2268 b1-109 2 1740.0000 140.00000 312.75240 1125.7732 2354.2268 b1-3x109 2 2660.0000 460.00000 312.75240 2045.7732 3274.2268 ------------------------------------------------------------------------- Total 8 1403.1250 156.37620 156.37620 1096.0116 1710.2384 Multiple range analysis for B1DC.hieugia by B1DC.nghthuc ------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups ------------------------------------------------------------------------- ĐC 2 12.5000 X b1-108 2 1200.0000 XX b1-109 2 1740.0000 XX b1-3x109 2 2660.0000 X ------------------------------------------------------------------------- contrast difference limits ĐC - b1-108 -1187.50 1228.45 ĐC - b1-109 -1727.50 1228.45 * ĐC - b1-3x109 -2647.50 1228.45 * b1-108 - b1-109 -540.000 1228.45 b1-108 - b1-3x109 -1460.00 1228.45 * b1-109 - b1-3x109 -920.000 1228.45 ------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. 5.2. So sánh vacxin A1 và đối chứng: Analysis of variance ------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level ------------------------------------------------------------------------- Between groups 24765559 3 8255186.5 91.315 .0004 Within groups 361613 4 90403.1 ------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 25127172 7 Table of means for A1DC.hieugia by A1DC.nghthuc ------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean ------------------------------------------------------------------------- ĐC 2 402.5000 242.50000 212.60659 -15.0465 820.0465 a1-108 2 4080.0000 320.00000 212.60659 3662.4535 4497.5465 a1-109 2 4680.0000 .00000 212.60659 4262.4535 5097.5465 a1-3x109 2 4540.0000 140.00000 212.60659 4122.4535 4957.5465 ------------------------------------------------------------------------- Total 8 3425.6250 106.30330 106.30330 3216.8518 3634.3982 Multiple range analysis for A1DC.hieugia by A1DC.nghthuc ------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups ------------------------------------------------------------------------- ĐC 2 402.5000 X a1-10