Khóa luận Ứng dụng khóa phân loại hình thái và vùng 16s rrna trên dna ty thể trong định danh cá bột thuộc họ pangasiidae

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ********000******** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG KHÓA PHÂN LOẠI HÌNH THÁI VÀ VÙNG 16S rRNA TRÊN DNA TY THỂ TRONG ĐỊNH DANH CÁ BỘT THUỘC HỌ Pangasiidae Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN KIỀU DỢI Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ********000******** ỨNG DỤNG KHÓA PHÂN LOẠI HÌNH THÁI VÀ VÙNG 16S rRNA TRÊN DNA TY THỂ TRONG ĐỊNH DANH CÁ BỘT THUỘC HỌ Pangasiidae Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. NGUYỄN VĂN HẢO NGUYỄN KIỀU DỢI ThS. NGUYỄN VIẾT DŨNG KS. NGUYỄN NGUYỄN DU Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2007 iii LỜI CẢM TẠ Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu Trƣờng Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy cô đã tạo điều kiện tốt và truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt thời gian học tại trƣờng. Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến thầy Nguyễn Văn Hảo đã tận tình chỉ bảo và tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Xin chân thành cảm ơn Chƣơng Trình Thuỷ Sản Ủy Hội Sông MêKông đã hỗ trợ kinh phí cho tôi thực hiện đề tài này. Tôi đặc biệt cảm ơn anh Nguyễn Nguyễn Du, anh Nguyễn Viết Dũng đã tận tâm, nhiệt tình hƣớng dẫn trong suốt thời gian tôi thực hiện đề tài. Xin chân thành cảm ơn anh Lâm Ngọc Châu, anh Nguyễn Văn Phụng phòng Nguồn Lợi Thủy Sản cùng chị Trì Thanh Thảo, anh Cao Thành Trung, anh Chu Quang Trọng phòng Thí Nghiệm Sinh Học Phân Tử đã quan tâm giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi hòan thành tốt đề tài. Sau cùng tôi xin cảm ơn gia đình cùng bạn bè thân yêu lớp Công Nghệ Sinh Học k29 đã chia sẽ cùng tôi những vui buồn trong thời gian học cũng nhƣ hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập. Sinh viên thực hiện NGUYỄN KIỀU DỢI iv ABSTRACT Morphological study plays important role in post-larvae fish taxonomy of the family Pangasiidae that contributes significantly to economy of the MeKong River Basin. However, this method bring limit true results. therefore we analysised the level of genetic diversity (A partial region of mitochondrial 16S rRNA gene, approximately 568 base pairs) of three catfish species to support morphological method. In this study, 976 specimens, originating from Mekong and Bassac River (from june 2006 to september 2006) were analysed morphologically. The result, the family Pangasiidae rate of 36,56% per in total specimens in 2006; three species (P. hypophthalmus, P. larnaudii, P. macronema) rate of 33,63% per in total Pangasiidae specimens and individual rate of 11,36% per in total number Pangasiidae. All Pangasiidae specimens of 2006 don’t analysised DNA because DNA was broke by formol. 26 individuals (size from 15 mm to 30 mm) from 64 specimens (6/2007) were add from three species: P. hypophthalmus, P. larnaudii, P. macronema. All specimens were sequenced and compared with standard sequence in genbank. This result, Sequences of 8/9 samples P. hypophthalmus similary with P. hypophthalmus (DQ334282, DQ334385, DQ334287). The exception of H1 sample, with one mutation at site nucleotide 26 to GenBank (DQ334282 – DQ334289); Sequences of 9 samples P. macronema similary from 99% to 100% sequences of P. macronema to GenBank (DQ334314); Sequences of 8 samples P. larnaudii similary 100% sequences of three haplotypes P. larnaudii (DQ334303, DQ334312, DQ334313). All in all, findings from this study demonstrated that morphological method correspond with three species P. hypophthalmus, P. larnaudii, P. macronema. v TÓM TẮT Khóa phân loại hình thái đóng một vai trò quan trọng trong việc định danh cá bột và cá con thuộc họ Pangasiidae vốn có ý nghĩa về kinh tế đối với vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long. Tuy nhiên, phƣơng pháp này cho độ chính xác nhất định. Vì vậy chúng tôi phân tích sự khác nhau ở mức độ di truyền cụ thể là vùng 16S rRNA (xấp xỉ 568 bp) trên DNA ty thể (mt DNA) ở 3 loài (đã có sẵn dữ liệu trên ngân hàng gene) để hỗ trợ phƣơng pháp định danh hình thái. Trong nghiên cứu này, chúng tôi thực hiện phân loại bằng hình thái 976 mẫu cá thu từ tháng 6/2006 đến tháng 9/2006 trên hai nhánh sông Tiền và sông Hậu. Kết quả họ Pangasiidae chiếm 36,56% so với tổng mẫu thu đƣợc năm 2006; 3 loài phân tích (P. hypophthalmus, P. larnaudii, P. macronema) chiếm 33,63% so với tổng mẫu Pangasiidae thu đƣợc nhƣng số lƣợng chỉ chiếm 11,36% so với tổng lƣợng cá thể họ Pangasidae. Các mẫu cá năm 2006 sau khi khi phân tích hình thái không phân tích đƣợc DNA (do DNA bị hủy trong formal), 26 cá thể từ 64 mẫu cá bột thu từ 22/6/2007 đến tháng 30/6/2007 đƣợc bổ sung của 3 loài nêu trên với kích thƣớc khác nhau (từ 15 mm – 30 mm), giải trình tự và đối chiếu với các trình tự chuẩn trên ngân hàng genbank để kiểm tra lại độ tin cậy của phƣơng pháp phân tích hình thái. Kết quả đạt đƣợc nhƣ sau:  Trình tự 8/9 mẫu loài P. hypophthalmus tƣơng đồng 100% với trình tự 3 kiểu gen P. hypophthalmus trên ngân hàng gene (DQ334282, DQ334285, DQ334287). Riêng mẫu H1 có một đột biến thay thế nucleotide ở vị trí thứ 26 so với tám kiểu gene tham khảo trên ngân hàng gene.  Trình tự 9 mẫu phân tích loài P. macronema giống từ 99% - 100% trình tự P. macronema trên ngân hàng gene (DQ334314).  Trình tự 8 mẫu loài P. larnaudii tƣơng đồng 100% với trình tự 3 kiểu gen P. larnaudii trên ngân hàng gene (DQ334303, DQ334312; DQ334313). Tóm lại, qua kết quả so sánh trình tự của 26 mẫu thuộc 3 loài phân tích với trình tự dữ liệu chuẩn trên ngân hàng gene đã khẳng định đƣợc khoá phân loại hình thái đối với các loài mà chúng tôi đƣa ra là phù hợp. vi MỤC LỤC ĐỀ MỤC TRANG Lời cảm tạ .................................................................................................................. III Abstract .................................................................................................................... IV Tóm tắt ....................................................................................................................... V Mục lục ..................................................................................................................... VI Danh sách các chữ viết tắt ........................................................................................ IX Danh sách các hình ..................................................................................................... X Danh sách các bảng và biểu đồ ................................................................................ XI Chƣơng 1. MỞ ĐẦU ................................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề ......................................................................................................... 1 1.2. Mục tiêu đề tài .................................................................................................. 2 1.3. Nội dung đề tài ................................................................................................. 2 Chƣơng 2. TỔNG QUAN ........................................................................................... 3 2.1. Tình hình nghiên cứu định danh các loài cá ..................................................... 3 2.1.1. Nghiên cứu thế giới ....................................................................................... 3 2.1.2. Nghiên cứu trong nƣớc .................................................................................. 4 2.2. Phƣơng pháp định danh hình thái định loại một số loài cá bột và cá con thuộc họ Pangasiidae ........................................................................................................ 5 2.3. Phƣơng pháp sinh học phân tử ứng dụng định loại một số loài cá .................. 8 2.3.1. Phƣơng pháp RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) ......... 8 2.3.2. Phƣơng pháp RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) ................ 8 2.3.3. Phƣơng pháp AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) .......... 8 2.3.4. Phân tích DNA ty thể (mtDNA) ................................................................ 9 vii 2.3.5. Phƣơng pháp PCR.................................................................................... 11 2.3.6. Phƣơng pháp giải trình tự bằng hệ thống sắc ký tự động ........................ 12 Chƣơng 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ......................................................... 13 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện ..................................................................... 13 3.2. Vật liệu ........................................................................................................... 13 3.2.1. Mẫu cá...................................................................................................... 13 3.2.2. Hóa chất ................................................................................................... 13 3.2.4. Thiết bị và dụng cụ .................................................................................. 14 3.3. Phƣơng pháp ................................................................................................... 15 3.3.1. Phƣơng pháp thu và định danh hình thái mẫu cá bột .............................. 15 3.3.2. Phƣơng pháp tách chiết mtDNA bằng phenol-chloroform...................... 16 3.3.3. Phƣơng pháp PCR khuếch đại vùng 16S trên mtDNA ............................ 16 3.3.4. Phƣơng pháp điện di acid nucleotide trên gel agarose ............................ 17 3.3.5. Phƣơng pháp giải trình tự ........................................................................ 18 3.3.6. Phƣơng pháp so sánh các trình tự ............................................................ 18 3.4. Bố trí thí nghiệm ............................................................................................. 18 3.4.1. Định danh phân loại bằng hình thái các loài cá bột thuộc họ Pangasiidae ........................................................................................................................... 18 3.4.1.1. Giai đoạn định tính ............................................................................ 18 3.4.1.2. Giai đoạn định lƣợng ........................................................................ 20 3.4.2. Ghi nhận các điểm đặc trƣng của cá bột trƣớc khi phân tích DNA ......... 21 3.4.3. Xác định và phân tích vùng 16S rRNA trên mtDNA .............................. 22 Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................ 23 4.1. Kết quả định danh phân loại bằng hình thái các loài cá bột thuộc họ Pangasiidae ........................................................................................................... 23 4.1.1. Kết quả hình thái phân loại ...................................................................... 23 4.1.2. Kết quả giai đoạn định tính ...................................................................... 25 viii 4.1.2.1. Phân tích mẫu xuất hiện họ Pangasiidae so với tổng mẫu thu đƣợc năm 2006 ........................................................................................................ 25 4.1.2.2. Phân tích mẫu xuất hiện loài nghiên cứu so với tổng mẫu Pangasiidae .................................................................................................... 27 4.1.3. Kết quả giai đoạn định lƣợng .................................................................. 29 4.1.3.1. Tỉ lệ số lƣợng cá thể của 3 loài cá phân tích và các loài khác .......... 29 4.1.2.4. Tỉ lệ số lƣợng cá thể của mỗi loài cá phân tích so với tổng lƣợng cá thể họ Pangasiidae ......................................................................................... 31 4.2. Ghi nhận các điểm đặc trƣng của cá bột trƣớc khi phân tích DNA ............... 33 4.3. Xác định và phân tích vùng 16S rRNA trên mtDNA ..................................... 34 4.3.1. Nhân dòng vùng gen mã hóa 16S rRNA ................................................. 34 4.3.2. Phân tích trình tự vùng 16S rRNA trên mtDNA của các mẫu cá ............ 38 4.3.2.1. Định danh 9 mẫu thuộc loài P. macronema ...................................... 38 4.3.2.2. Định danh 9 mẫu thuộc loài P. hypophthalmus ................................ 40 4.3.2.3. Định danh 8 mẫu thuộc loài P. larnaudii. ......................................... 42 Chƣơng 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................................... 44 5.1. Kết luận .......................................................................................................... 44 5.2. Tồn tại ............................................................................................................. 45 5.3. Đề xuất ............................................................................................................ 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 46 PHỤ LỤC .................................................................................................................. 50 ix DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT bp Cặp bazơ DNA Deoxyribonucleic acid mtDNA Mitochondrial DNA rRNA Ribosomal Ribonucleotide acid S Svedberg – đơn vị đo lƣờng vận tốc lắng PCR Polymerase chain reaction RFLP Restriction Fragment Length Lolymorphism RAPD Random Amplified Polymorphic DNA AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism Taq Thermus aquaticus UI Unit UV Ultra violet P. hypophthalmus Pangasianodon hypophthalmus P. larnaudii Pangasius larnaudii P. macronema Pangasius macronema ĐBSCL Đồng Bằng Sông Cửu Long Ctv Cộng tác viên x DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1. Pangasianodon hypophthalmus Sauvage (1878), 15 mm ........................... 6 Hình 2.2. Pangasius larnaudii Bocourt, 1866. 16 mm. .............................................. 6 Hình 2.3. Pangasius macronema Bleeker, 1851. 15 mm. .......................................... 7 Hình 2.4: H.2.5a. Cấu tạo tổng quát của ty thể. .......................................................... 9 Hình 2.5. Các picks màu quan sát trên máy Scan ..................................................... 12 Hình 4.1. Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage, 1878), 17 mm ........................ 33 Hình 4.2. Pangasius larnaudii Bocourt, 1866. 20 mm ............................................. 34 Hình 4.3. Pangasius macronema Bleeker, 1851. 15 mm ......................................... 34 Hình 4.4. Sản phẩm PCR khuếch đại vùng 16S rRNA trên mtDNA từ một số mẫu năm 2006 và năm 2005 ............................................................................................. 35 Hình 4.5: Sản phẩm PCR khuếch đại vùng 16S rRNA trên mtDNA từ vài mẫu cá đại diện ...................................................................................................................... 38 Hình 4.6: Các điểm khác nhau về trình tự vùng 16S rRNA trên mtDNA của 9 mẫu cá P. macronema ....................................................................................................... 39 Hình 4.7: Sự tƣơng đồng trình tự vùng 16S rRNA trên mtDNA của 9 mẫu cá P. hypophthalmus .......................................................................................................... 41 Hình 4.8: Sự tƣơng đồng trình tự vùng 16S rRNA trên mtDNA của 8 mẫu cá P. larnaudii ................................................................................................................... 43 xi DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ BIỂU ĐỒ BẢNG VÀ BIỂU ĐỒ TRANG Bảng 2.1. Số lƣợng các tia vi của P. macronema và P. siamensis (nguồn: Apichart Termvidchakorn,2003) ................................................................................................ 7 Bảng 4.1. Kích thƣớc các mẫu cá phân tích .............................................................. 37 Biểu đồ 4.1. Tỉ lệ họ Pangasiidae thu đƣợc trên tổng mẫu thu năm 2006 ............... 25 Biểu đồ 4.2. Sự phân bố của tổng lƣợng mẫu xuất hiện cá thể họ Pangasiidae ....... 25 Biểu đồ 4.3. Tỉ lệ % mẫu xuất hiện loài phân tích và tổng mẫu Pangasiidae thu đƣợc ........................................................................................................................... 27 Biểu đồ 4.4. Sự phân bố về lƣợng mẫu xuất hiện loài nghiên cứu so với lƣợng mẫu Pangasiidae .............................................................................................................. 27 Biểu đồ 4.5. Tỉ lệ % số lƣợng cá thể của 3 loài cá phân tích và các loài khác ......... 29 Biểu đồ 4.6. Sự phân bố về số lƣợng các loài nghiên cứu so với tổng lƣợng Pangasiidae ............................................................................................................... 29 Biểu đồ 4.7. Tỉ lệ % cá thể của từng loài phân tích trong tổng lƣợng cá thể họ Pangasiidae ............................................................................................................... 31 Biểu đồ 4.8. Sự phân bố về số lƣợng từng loài nghiên cứu so với tổng lƣợng Pangasiidae ............................................................................................................... 31 1 Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Đồng Bằng Sông Cửu Long nƣớc ta thuộc khu vực hạ lƣu sông Mekong, vốn có nguồn tài nguyên thủy sản phong phú. Các kết quả nghiên cứu về sự đa dạng và sự thay đổi thành phần các loài cá sẽ giúp ích cho việc quản lý và phát triển chiến lƣợc cho nghề nuôi trồng thủy sản tại khu vực này. Phƣơng pháp định danh trong phân loại học đóng vai trò quan trọng vào việc xác định sự đa dạng các loài cá trong tự nhiên. Theo truyền thống, phƣơng pháp định danh dựa trên các đặc điểm hình thái là phƣơng pháp đã đƣợc phát triển lâu đời và có độ tin cậy. Tuy nhiên, trong một số trƣờng hợp có thể khó phân biệt đƣợc sự khác nhau giữa những loài có quan hệ gần, do có sự giới hạn về một số đặc trƣng về hình thái học, đặc biệt khi mẫu vật là cá bột, hơn nữa công tác bảo quản mẫu cá cũng có thể làm thay đổi màu sắc tự nhiên của cá dẫn đến khó khăn khi phân loại một số lƣợng lớn mẫu trong thời gian dài. Gần đây, cùng với sự phát triển và hiểu biết về sinh học phân tử, nhiều chỉ thị sinh học phân tử đã đƣợc nghiên cứu và ứng dụng nhƣ là một công cụ hỗ trợ đắc lực cho công tác định danh các loài cá. Định danh các loài cá dựa vào vật liệu di truyền cho độ chính xác cao. Tuy nhiên, trong trƣờng hợp định danh trên cơ sở phân tích DNA bộ gen thƣờng gặp một số khó khăn do bộ gen có kích thƣớc lớn, một gen có thể có nhiều bản sao trên nhiều locus, mỗi locus có nhiều allen khác nhau ... Mặt khác, cá chịu ảnh hƣởng trực tiếp bởi môi trƣờng, nên có thể mang nhiều biến dị di truyền trên DNA bộ gen làm cho việc phân tích kết quả lại gặp càng nhiều khó khăn. Các chỉ thị phân tử dùng trong định danh và nghiên cứu di truyền thƣờng là những trình tự có tính bảo tồn cao trong cùng một loài và biến dị khác biệt giữa các loài, vì thế các gen mã hóa ribosomal RNA (rRNA) là một ứng viên tốt dùng định danh các loài sinh vật. Việt Nam hiện nay chƣa có nghiên cứu công bố về phân loại cá dựa vào bộ gen. Trong nghiên cứu này chúng tôi bƣớc đầu “Ứng dụng khóa 2 phân loại hình thái và vùng 16S rRNA trên DNA ty thể trong định danh cá bột thuộc họ Pangasiidae”. Nhằm hỗ trợ định danh một số loài cá có giá trị kinh tế quan trọng thuộc họ Pangasiidae trong khu vực Đồng Bằng Sông Cửu Long. 1.2. Mục tiêu đề tài Ứng dụng một số chỉ tiêu trong hệ thống phân loại hình thái vào phân loại cá bột thuộc họ Pangasidae để xác định số lƣợng và tỷ lệ các loài Pangasianodon hypophthalmus, P. larnaudii, P. macronema trong các mẫu thu đƣợc từ tháng 6/2006 đến tháng 9/2006 trên hai nhánh sông Tiền và sông Hậu ở Đồng Bằng Sông Cửu Long. Sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử để kiểm tra đánh giá độ tin cậy của khóa phân loại hình thái nêu trên. 1.3. Nội dung đề tài Định danh các mẫu cá thu đƣợc trên hai nhánh sông Tiền và sông Hậu thuộc Đồng Bằng Sông Cửu Long trong năm 2006 và 64 mẫu cá bột bổ sung thu từ 22/6/2007 đến 30/6/2007. Giải trình tự 26 cá thể (vùng 16S rRNA mã hóa bởi mtDNA) các loài: P. hypophthalmus, P. larnaudii, P. macronema thu vào tháng 6/2007. So sánh trình tự gen trên mtDNA mã hóa vùng 16S rRNA của một số mẫu phân tích với trình tự có sẵn trên ngân hàng genbank (dữ liệu di truyền) để kiểm tra và đánh giá phƣơng pháp định danh hình thái truyền thống sử dụng trên cá bột. 3 Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Tình hình nghiên cứu định danh các loài cá 2.1.1. Nghiên cứu thế giới Các loài cá thuộc họ Pangasiidae (cá da trơn) đƣợc nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm từ rất lâu do đặc tính cho thịt ngon, dồi dào trong tự nhiên và đặc biệt có giá trị kinh tế cao. Hàng loạt các công trình nghiên cứu phân loại cá Pangasiidae ra đời trên nguyên tắc chung là dựa vào các đặc điểm hình thái bên ngoài. Theo tác giả Roberts và Vidthayanon (1991), họ cá tra (Pangasiidae) vùng Đông Nam Á gồm hai giống: giống Helicophagus Bleeker, 1858, giống này có hai loài; giống Pangasius Valenciennes, 1840 có 19 loài. Sau đó, tác giả Walter J. Rainboth (1996), đã bổ sung thêm ba giống mới là Laides Jordan, 1919; Pangasianodon Chevey, 1930 và Pteropagasius Flowe, 1937. Tuy nhiên, việc định danh các loài cá thuộc họ Pangasiidae đều dựa vào một số các đặc trƣng chung: số tiết cơ, số lƣợng vi, số lƣợng và hình dạng răng, vị trí sắc tố xuất hiện và hình dạng cơ thể. Ngoài ra, tác giả Gehrke (1991), cũng công bố dữ liệu về ảnh hƣởng thức ăn tự nhiên lên sự phát triển của cá bột. Đặc biệt là xây dựng bộ hình mô tả điểm đặc trƣng gần 500 loài cá trên sông MeKong. Riêng Apichart Termvidchakorn từ năm 1983 đã tiến hành nghiên cứu về sự phân bố và phát triển của cá Caragid ở sông Kuroshio và các vùng lân cận Cho đến năm 2003 ông mới xuất bản bộ hình cá bột và cá con thuộc lƣu vực sông Mekong, với 62 loài khác nhau thuộc 21 họ và 14 bộ. Việc phân loại dựa vào hình thái để phân biệt các loài cá thuộc họ Pangasiidae đem lại nhiều dữ liệu có giá trị. Tuy nhiên, công tác định danh cá bột và cá con dựa vào các chỉ tiêu bên ngoài cho độ chính xác nhất định do cá có kích thƣớc quá nhỏ và chƣa trƣởng thành. Vì vậy, việc phát triển các chỉ thị di truyền phân tử (DNA marker) có ý nghĩa rất lớn trong việc hỗ trợ định danh các loài cá bột 4 và cá con. Các kỹ thuật hiện nay đang đƣợc ứng dụng rộng rãi trong thuỷ sản để tạo ra các DNA marker nhƣ: RFLP, RAPD, AFLP (xem mục 2.3.1; 2.3.2 và mục 2.3.3). Ngày nay, các nhà khoa học trên thế giới rất quan tâm việc định danh hình thái cá bột và cá con dựa vào vùng 12S rRNA và vùng 16S rRNA trên DNA ty thể (mtDNA) (xem mục 2.3.4). 2.1.2. Nghiên cứu trong nƣớc Ở Việt Nam, các nghiên cứu phân loại bằng hình thái cá nƣớc ngọt Đồng Bằng Sông Cửu Long tuy đã bắt đầu từ lâu nhƣng đến nay chƣa có một tài liệu nào hoàn chỉnh, đặc biệt là các loại cá bột và cá con thuộc họ Pangasiidae. Mai Đình Yên và cộng sự (1962) thống kê thành phần loài của một số loài cá bột và cá con vớt đƣợc trên sông Hồng ở Hà Nội, tuy nhiên lại ít đề cập đến việc mô tả chi tiết hình thái từng loài ở giai đoạn cá bột và con. Sau đó hàng loạt các tác giả cũng công bố số liệu về thành phần loài nhƣ: Mai Đình Yên và cộng sự (1979), Trƣơng Thủ Khoa và Trần Thị Thu Hƣơng (1993), Nguyễn Bạch Loan (1998). Các tác giải trên đều dựa vào số lƣợng các tia vi; hình dạng các tia vi, thân và miệng; hình dạng và số lƣợng răng để định danh một số loài cá thuộc họ Pangasiidae. Sau đó, tác giả Nguyễn Hữu Phụng và Nguyễn Bạch Loan (1999) cũng đƣa ra một số chỉ tiêu đặc trƣng và bộ hình về phân loại một số cá con thuộc họ Pangasiidae tƣơng đối hoàn chỉnh. Đến nay, Việt Nam vẫn chƣa có một công bố nào về ứng dụng các chỉ thị di truyền phân tử để định danh các loài cá bột và cá con thuộc họ Pangasiidae. Nhìn chung, phân loại cá nƣớc ngọt trên sông Cửu Long hiện nay vẫn còn gặp nhiều khó khăn do thiếu dữ liệu. Điều này ảnh hƣởng trực tiếp đến việc bảo tồn nguồn tài nguyên cá vốn có của vùng. 5 2.2. Phƣơng pháp định danh hình thái định loại một số loài cá bột và cá con thuộc họ Pangasiidae Ngày nay, việc định danh một số loài cá thuộc họ Pangasiidae dựa vào nhiều nguồn dữ liệu khác nhau. Tuy nhiên, nguyên tắc thực hiện của phƣơng pháp này là dựa vào các điểm đặc trƣng bên ngoài nhƣ: chiều dài thân, màu sắc (màu sắc trên đầu, trên thân, trên các tia vi), số tia vi (vi hậu môn, vi ngực, vi bụng, vi lƣng). Các chỉ tiêu trên quan sát dƣới kính hiển vi với độ phóng đại 40 lần. Ngoài ra, ngƣời ta còn phân biệt các chỉ tiêu trên theo cách khác. Theo Apichart TermvidChakorn (2003) các loài cá thuộc họ Pangasiidae đều trải qua bốn giai đoạn, mỗi giai đoạn có điểm đặc trƣng khác nhau: o Giai đoạn ấu trùng non: chiều dài thân khoảng 10 mm – 15 mm, còn túi noãn hoàn, vi lƣng chƣa nhìn thấy. o Giai đoạn ấu trùng trung gian: chiều dài thân khoảng 15 mm – 18 mm, tia vi lƣng mới xuất hiện nhƣng còn dính màng vi. o Giai đoạn ấu trùng già: chiều dài thân khoảng 19 mm – 34 mm, vi lƣng không còn dính màng vi. o Giai đoạn cá con: chiều dài thân khoảng 35 mm – 50 mm, đầy đủ tia vi hình thái, không còn các màng vi. Ở giai đoạn nầy các điểm đặc trƣng của mỗi loài thể hiện tƣơng đối đầy đủ. Ngoài ra, Apichart Termvidchakorn (2003) mô tả các chỉ tiêu để phân biệt một số loài cá bột thuộc họ Pangasidae nhƣ sau: Pangasianodon hypophthalmus Sauvage, 1878: Giai đoạn chiều dài cơ thể khoảng 15 mm, cơ thể giống hình cái rìu nhỏ, miệng trên và ruột ngắn. Cơ thể có sắc tố đen trên đầu và phần bụng của thân, sắc tố đen trên vi đuôi. Đến khi chiều dài thân khoảng 30 mm, các tia vi mọc tƣơng đối đầy đủ: vi lƣng có 1 tia cứng và 6 tia mềm, vi hậu môn có 1 tia cứng và 29 – 30 tia mềm, vi ngực có một tia cứng và 8 – 9 tia mềm, vi bụng có 8 tia mềm. 6 Hình 2.1. Pangasianodon hypophthalmus Sauvage, 1878; 15 mm Pangasius larnaudii Bocourt, 1866: Giai đoạn chiều dài thân khoảng 15 mm: có hắc tố trên đầu, thân và trên cuống đuôi, màng bụng đƣợc bao phủ bởi hắc tố, vi đuôi có hắc tố. Đến giai đoạn chiều dài cơ thể khoảng 30 mm: thân dài, miệng rộng, ruột ngắn, có hắc tố trên đầu, thân, vi lƣng và vi đuôi. Số lƣợng các tia vi: vi lƣng có 1 tia cứng và 7 tia mềm; vi hậu môn có 1 tia cứng và 28 – 32 tia mềm; vi ngực có 1 tia cứng và 9 tia mềm; vi bụng có 6 tia mềm. Hình 2.2. Pangasius larnaudii Bocourt, 1866; 16 mm. Pangasius macronema Bleeker, 1851: Giai đoạn chiều dài thân khoảng 15 mm, cơ thể có hắc tố trên đầu và thân, màng bụng có hàng hắc tố. Giai đoạn khoảng 30 mm: cơ thể có hình cái rìu, miệng trên có hình cầu, có hắc tố trên đầu và thân. Số lƣợng các tia vi: vi lƣng có 1 tia cứng và 7 tia mềm; vi hậu môn có 1 tia cứng và 30 – 33 tia mềm; vi ngực có 1 tia cứng và 9 tia mềm; vi bụng 1 tia cứng và 6 tia mềm. 7 Hình 2.3. Pangasius macronema Bleeker, 1851; 15 mm Theo Nguyễn Văn Hảo (2005) thì mô tả hình thái đặc trƣng của một số loài cá thuộc họ Pangasiidae nhƣ sau: P. hypophthalmus: Thân dài, dẹp về phía đuôi, đầu và mõm hơi dẹp bằng, khoảng cách hai mắt rộng, răng trên xƣơng lá mía 2 đốm tách rời nhau, mỗi đốm này nối liền với đốm răng xƣơng khẩu cái và song song với răng hàm trên. P. larnaudii: Thân dài, phần trƣớc tròn và dẹp dần về phía đuôi, gốc vây lƣng thẳng dốc, đầu dẹp bằng, mõm tù, hai hàm trên đều nhau, răng hàm nhỏ mịn, răng xƣơng lá mía xếp thành hai đốm rời nhau và nối với đốm răng xƣơng khẩu cái ở bên hoặc làm thành một vòng cung liên tục. P. marcronema: Thân dài, dẹp bên, đầu rộng dẹp bằng, mõm ngắn hàm trên nhô ra hơn hàm dƣới, răng hàm nhỏ mịn, râu dài kéo quá gốc vi ngực, mắt to lƣng thẩm. P. macronema trông rất giống P. siamensis nhƣng nhìn kỹ có một vài điểm khác nhau là: Đƣờng lƣng hơi lõm xuống, đầu hình chóp nhọn, hơi dẹp bên, râu dài đến gốc vi bụng (dài hơn P. macronema), số lƣợng các tia vi của hai loài nhƣ sau: P. siamensis P. macronema Vi lƣng I,7 I,6 Vi hậu môn 34 - 36 31 - 33 Vi ngực I, 10 - 11 I, 8 – 11 Vi bụng i, 6 i, 8 Bảng 2.1. Số lƣợng các tia vi của P. macronema và P. siamensis (nguồn: Apichart TermvidChakorn, 2003). 8 2.3. Phƣơng pháp sinh học phân tử ứng dụng định loại một số loài cá 2.3.1. Phƣơng pháp RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) Là phƣơng pháp đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn. Nguyên tắc phƣơng pháp là sau khi thực hiện phản ứng cắt bộ gen bằng một enzyme cắt giới hạn xác định, từ đó xác định đƣợc có hay không có sự thay đổi một đoạn trình tự DNA qua kết quả điện di để có thể phát hiện sự khác biệt về đa dạng di truyền của đối tƣợng đang nghiên cứu. Enzyme nhận biết các vị trí cắt tại 4, 5, 6 hay 8 bp trên dãy trình tự và cắt tại điểm nhận biết. Kết quả cho ra các đoạn DNA với kích thƣớc khác nhau đƣợc quan sát trên gel agarose, nhận biết các đọan cần phân tích bằng cách cho lai các đoạn trên với một probe đặc biệt, tiếp tục quan sát trên gel điện di, đoạn nào gắn với probe là đoạn cần tìm (Dodgson và ctv, 1997). Khó khăn lớn nhất trong phƣơng pháp RFLP là xác định mức độ đa hình thấp, khó thực hiện và tốn nhiều thời gian. Vì vậy, phƣơng pháp này ít đƣợc ứng dụng trong thủy sản. 2.3.2. Phƣơng pháp RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) Kỹ thuật này đƣợc phát triển đầu tiên bởi Welsh và MeClelland (1990); Williams và ctv (1990). Khuếch đại DNA với mồi ngẫu nhiên, chiều dài khoảng 8 – 10 bp. Kỹ thuật này đƣợc ứng dụng rộng rãi trong thủy sản, hàng loạt các kết quả nghiên cứu đã ứng dụng kỹ thuật này rất thành công ở một số loài thủy sinh vật: Partis và Wells (1996) sử dụng marker RAPD để phân loại thành công nhiều loài cá, phân tích cấu trúc của tảo biển do Van Oppen và ctv (1996), phân tích cấu trúc của tôm sú do Klibunga và ctv (2000). 2.3.3. Phƣơng pháp AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) Tƣơng tự nhƣ RFLP, nhƣng AFLP là sự kết hợp giữa hai phƣơng pháp RFLP và RAPD, nghiên cứu đa hình chiều dài các đoạn nhân. Mồi ở đây không thiết kế ngẫu nhiên mà thiết kế trên trình tự của adaptor và gắn thêm một nucleotide chọn lọc ở đầu 3’, sau đó gắn tiếp 3 nucleotide. Bấy giờ những trình tự nào có gắn với adaptor mới đƣợc khuếch đại bằng mồi đặc hiệu với adaptor, điều này có ý nghĩa 9 chọn lọc chặt chẽ hơn các trình tự DNA cần khuếch đại. Young và cộng sự (2001) đã sử dụng phƣơng pháp AFLP tạo ra 133 loại marker trong đó có 23 loại đƣợc dùng để chẩn đoán phân biệt các loại cá Hồi. Phƣơng pháp APLP cho độ chính xác cao tuy nhiên ít đƣợc ứng dụng rộng rãi trong thủy sản do vấn đề kinh tế. 2.3.4. Phân tích DNA ty thể (mtDNA) H. 2.4a H. 2.4b Hình 2.4: Hình.2.4a: cấu tạo tổng quát của ty thể (Alberts, 1994). Hình. 2.4b: cấu tạo mtDNA dạng vòng.( Sutovsky và cộng sự, 1999). Ở động vật, vật liệu di truyền có trong nhân và một số ít trong ty thể. Ti thể đƣợc xem nhƣ trung tâm cung cấp năng lƣợng của tế bào. Do ty thể nằm trong tế bào chất của giao tử cái (trứng) vì thế các gene trên DNA ty thể (mtDNA) tuân theo quy luật di truyền theo tế bào chất (Birky và cộng sự, 1989). MtDNA ít bị tác động của môi trƣờng nên ít bị biến dị di truyền (Spinger và Douzery, 1996). Dựa vào những đặc điểm nêu trên, mtDNA đƣợc ứng dụng rộng rãi trong các kỹ thuật sinh học phân tử. Đặc biệt là vùng mã hóa các phân tử ribosomal RNA (16S rRNA và 12S rRNA) rất đƣợc quan tâm ứng dụng phục vụ trong công tác nghiên cứu sự phát sinh loài và định danh loài do chúng có tính bảo tồn cao và kích thƣớc vừa phải thuận lợi cho việc phân lập, giải trình tự và phân tích trình tự vật liệu di truyền. 10  Các nghiên cứu về mtDNA ứng dụng trong thủy sản Do cấu trúc và điểm di truyền đặc biệt nêu trên nên mtDNA marker ngày càng đƣợc sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu sự đa dạng nguồn vật nuôi thủy sản gồm: cá Chình (Avise và cộng sự, 1986), cá Lam của (Graves và cộng sự, 1992), cá Đù đỏ (Gold và cộng sự 1993), cá Mập (Heist và Gold, 1999). Kết hợp với sinh tin học (bioinformatics), mtDNA đƣợc sử dụng thành công trong việc xây dựng cây phân loài. Đầu tiên là công trình nghiên cứu của Wheeler và Honeycutt (1988), sau đó là Smith (1989), Hillis (1993) đều sử dụng trình tự rRNA để quan sát các điểm đột biến và ứng dụng để xây dựng cây phát sinh loài. Đặc biệt là thành công của Douzery và Catzeflis (1995) đã giải trình tự vùng 12S rRNA mtDNA nhiều loài để nghiên cứu sự phân loại của động vật có xƣơng sống. Pouyaud và cộng sự (2000) thành công về ly trích DNA của cá da trơn Pangasiidae và sử dụng cặp mồi chuyên biệt (thiết kế bởi Chang và cộng tác viên, 1994) khuếch đại vùng 12S trên mtDNA, sau đó giải trình tự để quan sát sự khác biệt về khoảng cách di truyền giữa các loài thuộc họ Pangaiidae qua cây phân loài. Tƣơng tự, Gustiano và cộng sự (2003) phân tích 907 mẫu cá giống Pangasius thuộc họ ca da trơn Pangasiidae thu từ một số nƣớc Đông Nam Á nhƣ: Việt Nam, Malaysia, Indonesia chỉ ra sự khác biệt về trình tự vùng 12S rRNA trên mtDNA của các loài thuộc giống Pangasius ở mức độ từng base pairs. Vùng 12S rRNA trên mtDNA đƣợc sử dụng để thiết kế mồi. Sau đó giải trình tự đƣợc 737 nucleotide trên vùng 12S mtDNA của tất cả các loài thuộc giống Pangasius, và đã xác định các trình tự khác nhau của các mẫu cá phân tích. Kết quả đƣợc quan sát rõ qua cây phân loài là hầu hết các loài P. kunyit thu từ Việt Nam và Indonesia có khoảng cách di truyền rất gần nhau, d = 0,003; P. macronema (từ Indonesia) và P. polyuanodon (thu từ Việt Nam) là d = 0,004; P. djambal và P. bocourti có d = 0,005. Một nhóm cá P. kunyit thu từ sông Mekong Việt Nam và P. kunyit thu từ miền Bắc Borneo Malaysia giống nhau đến 77,2%, có khoảng cách di truyền là d = 0,01. Quan sát nhiều loài khác cũng có kết quả tƣơng tự: P. humeralis và P. nieuwenhuisii d = 0,006. Nhìn chung, tất cả các nghiên cứu trên đều giải quyết một vấn đề chung là sử dụng ƣu điểm của mtDNA để xác định mối quan hệ về di 11 truyền của các cá thể cùng loài ở nhiều vị trí địa lý khác nhau và cho ra kết quả rất thỏa mãn mà phƣơng pháp phân tích hình thái khó giải thích đƣợc. Pangasiide đƣợc xác định là họ có nhiều loài cá có ý nghĩa kinh tế của vùng sông MeKong, Tác giả Na-Nakorn và cộng sự (2006) đã thực hiện nghiên cứu hơn 600 cá thể, trong đó có 143 cá thể là Pagasianodon gigas (thu từ Cambodia và Thái Lan), 95 cá thể Pangasianodon hypophthalmus và 435 cá thể thuộc 7 loài, trong đó 5 loài Pangasius: P. bocourti, P. conchopphilus, P. larnaudii, P. macronema, P. sanitwongsei và hai giống với hai loài sau: Helicophagus waandersii, Pteropangasius pleurotaenia. Cặp mồi đƣợc thiết kế chuyên biệt để khuếch đại vùng 16S trên mtDNA (vùng này có chiều dài 568 bp), sau đó giải trình tự và xây dựng cây phát sinh loài để quan sát sự đa dạng về di truyền của 5 giống, 9 loài thuộc họ Pangasiidae. Kết quả có 56 haplotypes từ 9 loài Pagasiidae đã đƣợc xác định. Trong đó, loài có số lƣợng haplotype cao nhất là P. larnaudii với 11 kiểu và loài có số lƣợng haplotypes thấp nhất là P. macronema với 2 kiểu. Khi quan sát từ vùng 16S rRNA, sự khác nhau giữa các haplotypes về trình tự nucleotide là rất ít, chỉ từ một đến ba điểm đột biến. Ở tất cả các loài, sự khác biệt giữa các haplotypes ở mức độ từ thấp đến trung bình là 0,118 – 0,667 và sự khác biệt gữa các nucleotide thì ở mức rất thấp: 0,0002 – 0,0016. Ngoài ra, trong kết quả của nghiên cứu này ngƣời ta còn thấy gần nhƣ tất cả các loài đều xuất hiện đột biến. Điều này đƣợc biện luận rằng có khả năng do họ Pangasiidae phân bố quá rộng, mặt khác do xuất hiện từ rất lâu nên có thể bị tiến hóa theo thời gian. Các kết quả trên cho thấy, khi quan sát và so sánh trình tự mtDNA giải quyết đƣợc nhiều vấn đề trong việc định danh các loài cá, về quan hệ di truyền một cách nhanh chóng mà phƣơng pháp định danh hình thái khó giải quyết đƣợc. 2.3.5. Phƣơng pháp PCR Phƣơng pháp PCR do Karl Mullis và cộng sự phát minh năm 1985, thực chất đây là phƣơng pháp tạo dòng in vitro. Với sự tham gia của một enzyme chịu nhiệt DNA polymerase (ví dụ Taq polymerase) (Sake và ctv, 1985; Haase và ctv, 1990). 12 Khi DNA polymerase họat động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn khi có sự hiện diện của mồi chuyên biệt. Mồi là những đoạn oligonucleotide có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới. Khi ta cung cấp hai mồi chuyên biệt, một mồi xuôi (sens primer) và một mồi ngƣợc (antisens primer), bắt cặp bổ sung với hai đầu của trình tự DNA, các triphosphate deoxyribonucleotid sẽ đƣợc enzyme Taq gắn bổ sung vào đầu 3’OH của mồi. 2.3.6. Phƣơng pháp giải trình tự bằng hệ thống sắc ký tự động Đây là phƣơng pháp giải trình tự cải tiến từ phƣơng pháp Sager. DNA đƣợc nối dài với sự xúc tác của enzyme DNA polymerase, có sự tham gia của trình tự mồi ngắn bổ sung với mạch đơn cần giải trình tự, dNTP’s và các thành phần cần thiết khác, cùng một lƣợng nucleotide có 2’,3’-dideoxyribose đƣợc đánh dấu bằng chất phát huỳnh quang (bốn màu cho bốn loại bazơ khác nhau). Sau đó, sản phẩm PCR chứa hỗn hợp các đoạn DNA khi đi qua một điện di mao quản sẽ đƣợc phân tách và phát huỳnh quang khi đƣợc kích thích bởi tia laser. Trình tự DNA đƣợc ghi lại thông qua tín hiệu huỳnh quang thu đƣợc trên đồ thị sắc ký. Hình 2.5. Các picks màu quan sát trên máy Scan. Pick màu xanh là vị trí của bazơ Adenine (A), pick màu đỏ là vị trí của bazơ thymine (T), pick màu đen là vị trí của bazơ Guanine (G), cuối cùng là pick màu tím là vị trí của bazơ Cytosine (C). 13 Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện Thời gian nghiên cứu: từ 19/03/2007 – 20/07/2007. Địa điểm thực hiện: Phòng Nguồn Lợi và Khai Thác Thuỷ Sản Nội Địa và Trung Tâm Quốc Gia Quan Trắc Cảnh Báo Môi Trƣờng và Phòng Ngừa Dịch Bệnh Thủy Sản Khu Vực Nam Bộ thuộc Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II. 3.2. Vật liệu 3.2.1. Mẫu cá Các mẫu cá họ Pangasiidae có chiều dài từ 15 mm– 30 mm đƣợc thu vào mùa lũ năm 2006 (từ tháng 6-2006 đến tháng 9-2006) và tháng 6/2007, từ hai nhánh sông Tiền và sông Hậu, hiện đang đƣợc lƣu giữ tại Phòng Nguồn Lợi và Khai Thác Thủy Sản Nội Địa, Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản 2. 3.2.2. Hóa chất NaOH-SDS (sodium dodecyl sulfate): 40%, 100 ml dung dịch này gồm có: NaOH 0,5N, 2 g/100 ml: 5 ml; SDS 0,25%, 0,25 g/100ml: 5 ml; cuối cùng cho nƣớc vào đủ 100 ml. Phenol-chloroform-isoamyl alcohol (PCI, 25:24:1): hòa tan 25 ml phenol, 24 ml chloroform và 1 ml isoamyl ancohol. Ethanol 75 %, ethanol 100%. Sodium acetate 3M, pH 5.2: 10 ml dung dịch này gồm: 2,46 g muối CH3COONa (3M= 246); khoảng 4 ml nƣớc cất, sau đó chuẩn pH 5.2 với CH3COOH. Thêm nƣớc vừa đủ 10 ml. TBE 10X (tris borate EDTA) (pH = 8,3) 10 X: Hòa tan 108 g tris và 55 g boric acid trong khoảng 600 ml H2O. Sau đó thêm 9,8 g EDTA (ethylene diamine tetra acetic) 14 và chỉnh thể tích bằng H2O cho đủ 1 lít. TBE 1X sử dụng trong điện di: pha 100 ml TBE 10X cho nƣớc cất và đủ 1lít. Dung dịch nạp mẫu bromophenol 6X: 0,25% (w/v) bromophenol blue và 40% (v/v) glycerol. Ethidium bromide: hòa tan 50 mg ethidium bromide trong 5 ml nƣớc cất hai lần và bảo quản trong chai tránh sáng. 3.2.4. Thiết bị và dụng cụ Thiết bị và dụng cụ dùng trong phân tích hình thái o Kính hiển vi sôi nổi với độ phóng đại 40 lần. o Thƣớc kẽ ôli, đĩa petri và các thiết bị hỗ trợ cho việc định loại. o Các dụng cụ kéo, kẹp, kim. Thiết bị và dụng cụ dùng trong phân tích DNA * Thiết bị sử dụng - Máy Vortex (Zx3 Velp). - Máy block nhiệt khô. - Máy ly tâm. - Máy PCR (Thermocycle – Biorad). - Bộ điện di (Biorad Hybaid). - Bàn đọc UV (White/UV Transillminator). - Tủ mát, tủ lạnh -200C (Liebherr). - Tủ cấy vô trùng (Laminar – Box). - Cân phân tích. - Lò viba. 15 * Dụng cụ sử dụng - Pipettman loại 100 – 1000 µl; 10 – 100 µl; 0,5 – 10 µl. - Đầu tip tƣơng ứng với các loại pipet man. - Eppendorf loại 0,2 ml, 0,5 ml và 1,5 ml. - Các chai lọ đựng hoá chất, vật mẫu. - Đèn cồn, kéo, kẹp, chày nhựa. 3.3. Phƣơng pháp 3.3.1. Phƣơng pháp thu và định danh hình thái mẫu cá bột Sử dụng mẫu đã đƣợc thu từ tháng 6/2006 đến tháng 9/2006, trên hai nhánh sông Tiền và sông Hậu. Mẫu đƣợc thu mỗi ngày 4 lần: 5giờ sáng, 11 giờ, 17 giờ và 23 giờ trên mỗi nhánh sông (mỗi lần thu đƣợc tính là một mẫu). Mẫu đƣợc thu bằng lƣới Bongo net có kích thƣớc mắt lƣới 2a = 1 mm. Sau đó cố định mẫu bằng formol 5% và bảo quản trong ethalnol 20%, lƣu giữ tại Bộ Môn Ngƣ Loại Học, Phòng Nguồn Lợi và Khai Thác Thủy Sản Nội Địa. Từ các mẫu đƣợc lƣu giữ, chúng tôi lần lƣợt tách và lựa ra các cá thể họ Pangasiidae, để riêng từng mẫu và ghi nhận lại: Vị trí thu mẫu, thời gian thu mẫu, số lƣợng Pangasiidae từ mẫu ban đầu. Các số liệu sau khi ghi nhận, đƣơc xử lý với các hàm trong Access và Excel. Mẫu bổ sung thu từ 22/6/2007 – 30/6/2007, ngày hai lần trên mỗi nhánh sông với hai ngƣ cụ: lƣới Bongo net có kích thƣớc mắt lƣới 2a = 1 mm và đáy nhỏ. Sau đó mẫu đƣợc bảo quản trong ethalnol 95%. Từ các mẫu chứa họ Pangasiidae đem quan sát dƣới kính hiển vi sôi nổi với độ phóng đại 40 lần, kết hợp cùng với các tài liệu phân loại để xác định cụ thể từng loài riêng biệt: P. hypophthalmus, P. larnaudii, P. macronema. Ba lọ nhựa có dán nhãn riêng biệt đƣợc sử dụng để lƣu giữ tất cả các cá thể ứng với mỗi loài trên. Đồng thời ghi lại các thông tin liên quan nhƣ: Vị trí thu mẫu, thời gian thu mẫu, số lƣợng từng loài: P. hypophthalmus, P. larnaudii, P. macronema. 16 Trong quá trình định loại, chúng tôi cố gắng phân loại hết tất cả các loài có trong họ Pangasiidae. Sỡ dĩ chúng tôi chú trọng đến ba loài trên là vì trên ngân hàng genbank đang lƣu giữ ba loài trên. 3.3.2. Phƣơng pháp tách chiết mtDNA bằng phenol-chloroform Cắt một góc vi đuôi của mỗi cá thể cho vào eppendoff và nghiền nhuyễn với 400 µl dung dịch NaOH-SDS để phá vỡ tế bào. Sau đó biến tính protein bằng cách nung ở 1000C trong 7 phút và làm lạnh nhanh 5 phút. Đem ly tâm 5 phút với 13000 vòng/phút, hút 350 µl dịch nổi cho vào ống eppendoff mới. Tiếp tục thêm 350 µl dung dịch phenol: chlorofrom: Isoamyl và vortex mạnh, ly tâm trong 2 phút ở tốc độ 13000 vòng/phút. Thu nhận 300 µl dịch nổi phía trên vào ống tip mới (Bƣớc này đƣợc lặp lại lần hai nếu thấy lớp protein tủa trắng giữa dịch nổi và pha phenol- cloroform còn nhiều) Thêm vào vào khoảng 30 µl (1/10 thể tích dịch trong DNA) dung dịch 3M sodium acetate pH 5.2. Dùng ngón tay búng mạnh nhiều lần vào ống tip, sau đó cho 2.5V ethanol 100% lạnh vào, vortex và giữ trong tủ -200C trong 30 phút để DNA tủa. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút rồi đổ bỏ phần dịch nổi và giữ lại phần cặn có chứa nucleic acid. Thêm vào phần cặn tủa 1 ml ethanol 70% để rửa muối có trong cặn tủa, úp ngửa vài lần. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút. Dùng pipete hút bỏ ethanol, làm khô cặn trong block nhiệt khô ở nhiệt độ 560C cho đến khô hoàn toàn. Hoà tan cặn lóng DNA bằng 100 µl nƣớc cất trong block nhiệt khô khoảng 500C trong 10 phút, sau đó sử dụng ngay hay bảo quản trong tủ -200C. 3.3.3. Phƣơng pháp PCR khuếch đại vùng 16S trên mtDNA Vùng trình tự gen mã hóa 16S rRNA đƣợc khuếch đại từ mtDNA theo phƣơng pháp PCR (Na-Nakorn và cộng sự, 2006). Cụ thể nhƣ sau: mỗi phản ứng PCR (50 µl) gồm: 25 µl PCR Master mix (Promega, Mỹ), 0,5 µl mỗi mồi 16Sar 5’CGCCTGTTTAACAAAAACAT-3,) và 16Sbr 5’CCGGTCTGAACTC- AGATCATGT 3’ (mỗi mồi có nồng độ 50 pm/µl); mtDNA từ mẫu cá: 2 µl; nƣớc cất: vừa đủ 50 µl. 17 Chu kỳ nhiệt trong phản ứng PCR: Bƣớc thứ nhất (1 chu kỳ), DNA đƣợc biến tính ở 940C trong 3 phút. Bƣớc thứ hai (30 chu kỳ), biến tính DNA trong 30 giây, sau đó hạ nhiệt độ xuống 500C/30 giây để DNA và mồi bắt cặp. Nâng nhiệt độ lên 720C/30giây. Bƣớc thứ ba (1 chu kỳ), nối dài cuối cùng 720C/10 phút. Cuối cùng là hạ xuống 40C. 3.3.4. Phƣơng pháp điện di acid nucleotide trên gel agarose Nguyên tắc của phƣơng pháp điện di dựa vào các đặc tính của các acid nucleic. Đó là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên khi chịu tác động của một điện trƣờng, chúng sẽ di chuyển về cực dƣơng của điện trƣờng. Thông thƣờng ngƣời ta sử dụng gel agarose để phân tích các đoạn có kích thƣớc từ 0,5 – 20 kb. Gel đƣợc đổ trên một giá thể nằm ngang và điện di theo phƣơng ngang. Để đọc kết quả điện di ngƣời ta bổ sung một lƣợng ethidium bromide, chất này cho phép gắn xen vào giữa các base của các acid nucleic, dƣới tác dụng của tia tử ngoại sẽ phát huỳnh quang, qua đó xác định đƣợc vị trí của các đoạn DNA trên gel. Để ƣớc lƣợng kích thƣớc của các đoạn DNA cần phân tích thì ngƣời ta dùng thang DNA (tập hợp nhiều đoạn DNA đã biết kích thƣớc) để so sánh với các vạch của sản phẩm PCR. Nồng độ gel agarose dùng phân tích sản phẩm PCR vùng 16S rRNA của mtDNA là 1%. Cân 1 g gel agarose hòa với 100 ml dung dịch đệm điện di TBE 1X. Đun agarose trong lò viba khoảng 2 phút sau đó đem ra lắc đều đồng nhất mẫu, đun tiếp tục khoảng 2 phút nữa, đem ra ngoài lắc đều dƣới vòi nƣớc mạnh. Đến khi agarose còn khoảng 500C cho vào 5,3 µl ethidium bromide 1%, lắc nhẹ theo cổ tay cùng chiều và ngƣợc chiều kim đồng hồ đến khi đều thì đổ vào khuôn đã gắn lƣợc, chờ gel đông thì rút lƣợc ra. Dùng 10 µl mẫu sản phẩm PCR trộn đều với 2 µl dung dịch nạp mẫu loading dye 6X. Dùng pipete hút 10 µl đặt vào giếng gel, điện di 30 phút trong dung dịch đệm TBE 1X với dòng điện 100V. Đặt gel dƣới tia UV và quan sát kết quả. 18 3.3.5. Phƣơng pháp giải trình tự Trong nghiên cứu này, sản phẩm khuếch đại là vùng 16S rRNA trên mtDNA. Sản phẩm PCR đƣợc gửi đến công ty Công nghệ Sinh Học Nam Khoa (Tp. Hồ Chí Minh) để giải trình tự trực tiếp nhờ thể thống giải trình tự mao quản tự động (CEQ 8000, Beckman Coulter). Sản phẩm PCR đƣợc giải trình tự trên cả hai mạch để có độ chính xác cao bằng hai mồi đặc hiệu 16Sar và 16Sbr. 3.3.6. Phƣơng pháp so sánh các trình tự Trình tự vùng 16S trên mtDNA của cá Pangasiidae sau khi giải xong đƣợc phân tích bằng chƣơng trình BLAST ( Sau đó kiểm chứng lại kết quả định danh bằng hình thái, sử dụng phần mềm DNAMAN để xem sự khác biệt và sự bảo tồn về trình tự của các loài. 3.4. Bố trí thí nghiệm 3.4.1. Định danh phân loại bằng hình thái các loài cá bột thuộc họ Pangasiidae Trong nghiên cứu này chúng tôi đã sử dụng cách thu mẫu theo Dự Án Di Cƣ Cá Trên Sông MeKong năm 2006 ở hai nhánh sông Tiền (tại xã Vĩnh Xƣơng) và sông Hậu (tại xã Quốc Thái). Tổng mẫu cá thu đƣợc từ tháng 6/2006 – tháng 9/2006 là 976 mẫu và 64 mẫu bổ sung đƣợc thu từ 22/6/2007 – 30/6/2007. Quá trình định danh phân loại bằng hình thái trãi qua hai giai đoạn. 3.4.1.1. Giai đoạn định tính  Phân tích mẫu có họ Pangasiidae so với tổng mẫu thu đƣợc năm 2006 Số lƣợng các mẫu có xuất hiện các loài thuộc họ Pangasiidae đều đƣợc chọn ra và ghi nhận lại. Ở giai đoạn này, chỉ xác định có hoặc không có sự xuất hiện cá họ Pangasiidae trong mẫu cá thu đƣợc, mẫu có mặt bất cứ một cá thể nào thuộc họ Pangasiidae cũng đƣợc tính là một mẫu (mẫu cá có họ Pangasiidae). Ngƣợc lại, 19 mẫu không có bất cứ một cá thể nào thuộc họ Pangasiidae thì đƣợc tính là mẫu họ khác. Các công thức đƣợc tính nhƣ sau: Tỉ lệ họ Pangasiidae thu đƣợc trên tổng mẫu thu năm 2006:  % mẫu cá có họ Pangasiidae = (tổng số mẫu cá có họ Pangasiidae/tổng số lƣợng mẫu thu đƣợc)*100%.  % mẫu họ khác = (tổng số mẫu không có cá họ Pangasiidae/tổng số lƣợng mẫu thu đƣợc)*100%. Tần suất xuất hiện cá họ Pangasiidae ở các tháng khác nhau trong mùa và ở các thời điểm khác nhau trong ngày: Cộng và so sánh tất cả các mẫu có họ Pangasiidae xuất hiện trong từng tháng: Tháng 6, tháng 7, tháng 8 và tháng 9. Tƣơng tự, cộng và so sánh tất cả các mẫu có họ Pangasiidae xuất hiện trong từng thời điểm: buổi sáng (5:30 – 6:30 phút), buổi trƣa (11:30 - 12:30 phút), buổi chiều (17:15 – 18:15 phút) và nữa đêm (23:30 – 0:30 phút).  Phân tích mẫu xuất hiện loài nghiên cứu so với tổng mẫu Pangasiidae Từ các mẫu đã chọn, lấy ra các cá thể thuộc họ Pangasiidae cho vào lọ mới (mẫu Pangasiidae, trong mẫu này chỉ có cá thuộc họ Pangasiidae). Từ các mẫu này, tiếp tục xác định có hay không có sự có mặt của một trong ba loài nghiên cứu, mẫu có mặt bất cứ một cá thể nào thuộc 3 loài phân tích cũng đƣợc tính là một mẫu xuất hiện loài nghiên cứu. Ngƣợc lại, mẫu không có xuất hiện bất cứ một cá thể nào trong 3 loài phân tích thì đƣợc tính là mẫu không xuất hiện loài nghiên cứu. Các công thức đƣợc tính nhƣ sau: Tỉ lệ % mẫu xuất hiện loài nghiên cứu so với tổng mẫu Pangasiidae thu đƣợc:  % mẫu xuất hiện loài nghiên cứu = (tổng số mẫu xuất hiện loài nghiên cứu/tổng mẫu cá họ Pangasiidae)*100%.  % mẫu không xuất hiện loài nghiên cứu = (tổng số mẫu không xuất hiện loài nghiên cứu/tổng mẫu cá họ Pangasiidae)*100%. Tần số xuất hiện mẫu có loài nghiên cứu so với tổng mẫu Pangasiidae ở các tháng khác nhau trong mùa và ở các thời điểm khác nhau trong ngày: 20 Cộng tất cả các mẫu có xuất hiện loài nghiên cứu xuất hiện trong từng tháng: Tháng 6, tháng 7, tháng 8 và tháng 9 so sánh với tất cả các mẫu Pangasiidae trên các tháng tƣơng ứng. Tƣơng tự, cộng tất cả các mẫu có xuất hiện loài nghiên cứu xuất hiện trong từng thời điểm: buổi sáng (5:30 – 6:30 phút), buổi trƣa (11:30 - 12:30 phút), buổi chiều (17:15 – 18:15 phút) và nữa đêm (23:30 – 0:30 phút) so sánh với tất cả các mẫu Pangasiidae xuất hiện trong từng thời điểm tƣơng ứng. 3.4.1.2. Giai đoạn định lƣợng  Tỉ lệ số lƣợng cá thể của 3 loài cá phân tích và các loài khác Từ tất cả các mẫu chỉ chứa loài thuộc họ Pangasiidae (đã chọn ra ở giai đoạn định tính), tiếp tục chọn ra ba loài phân tích (P. hypophthalmus, P. larnaudii, P. macronema) tƣơng ứng với ba lọ riêng biệt (số lƣợng cá thể các loài phân tích), các cá thể còn lại trong mẫu Pangasiidae đƣợc gọi là cá thể các loài khác. Sau mỗi giai đoạn phân tích các số liệu về vị trí thu mẫu, ngày và giờ thu, số lƣợng, loài đƣợc ghi lại. Các phép tính nhƣ sau: Tỉ lệ % số lƣợng cá thể của 3 loài phân tích và các loài khác:  Tỉ lệ % các loài phân tích = (tổng số lƣợng cá thể các loài nghiên cứu/tổng số lƣợng cá thể họ Pangasiidae)*100%.  Tỉ lệ % các loài khác = (tổng số lƣợng cá thể họ Pangasiidae không phải loài nghiên cứu/tổng số lƣợng cá thể họ Pangasiidae)*100%. Tần số xuất hiện loài nghiên cứu ở các thời điểm khác nhau trong ngày và ở các tháng khác nhau trong mùa: Cộng tất cả các cá thể của các loài phân tích xuất hiện trong từng tháng: Tháng 6, tháng 7, tháng 8 và tháng 9 so sánh với tất cả các cá thể họ Pangasiidae trên các tháng tƣơng ứng. Tƣơng tự, cộng tất cả các cá thể của các loài cá phân tích xuất hiện trong từng thời điểm buổi sáng (5:30 – 6:30 phút), buổi trƣa (11:30 - 12:30 phút), buổi 21 chiều (17:15 – 18:15 phút) và nữa đêm (23:30 – 0:30 phút) so sánh với tất cả các cá thể họ Pangasiidae xuất hiện trong từng thời điểm tƣơng ứng.  Tỉ lệ số lƣợng cá thể của mỗi loài cá phân tích Tỉ lệ cá thể của từng loài phân tích trong tổng lƣợng cá thể Pangasiidae:  Tỉ lệ % loài P. macronema = (tổng số lƣợng cá thể loài P. macronema/tổng số lƣợng cá thể họ Pangasiidae)*100%.  Tỉ lệ % loài P. larnaudii = (tổng số lƣợng cá thể loài P. larnaudii/tổng số lƣợng cá thể họ Pangasiidae)*100%.  Tỉ lệ % loài P. hypophthalmus = (tổng số lƣợng cá thể loài P. hypophhalmus/tổng số lƣợng cá thể họ Pangasiidae)*100%. Tần số xuất hiện mỗi loài nghiên cứu ở các thời điểm khác nhau trong ngày và ở các tháng khác nhau trong mùa: Cộng tất cả các cá thể của từng loài phân tích riêng biệt xuất hiện trong từng tháng: Tháng 6, tháng 7, tháng 8 và tháng 9 so sánh với tất cả các cá thể họ Pangasiidae trên các tháng tƣơng ứng. Tƣơng tự, cộng tất cả các cá thể của từng loài phân tích riêng biệt xuất hiện trong từng thời điểm buổi sáng (5:30 – 6:30 phút), buổi trƣa (11:30 - 12:30 phút), buổi chiều (17:15 – 18:15 phút) và nữa đêm (23:30 – 0:30 phút) so sánh với tất cả các cá thể họ Pangasiidae xuất hiện trong từng thời điểm tƣơng ứng. 3.4.2. Ghi nhận các điểm đặc trƣng của cá bột trƣớc khi phân tích DNA Từ ba lọ chứa 3 loài cá nghiên cứu, chọn ngẫu nhiên mỗi lọ 10 cá thể với kích thƣớc từ 15 mm – 30 mm. Ghi nhận và vẽ lại các điểm đặc trƣng của mỗi loài nghiên cứu. Mục đích của giai đoạn này nhằm đối chiếu lại độ chính xác của phƣơng pháp định danh hình thái sau khi phân tích DNA. 22 3.4.3. Xác định và phân tích vùng 16S rRNA trên mtDNA Dựa vào kết quả định danh theo phƣơng pháp hình thái, sau khi chọn và ghi nhận lại các điểm đặc trƣng của 10 cá thể ở mỗi loài (mục 3.4.2) chúng tôi tiến hành phân lập và giải trình tự vùng 16S rRNA trên mtDNA. Dựa trên cơ sở dữ liệu của ngân hàng gene (genbank: đã có dữ liệu về trình tự và kiểu haplotype của 3 loài phân tích vùng 16S rRNA trên mtDNA gồm: Pangasianodon hypophthalmus (mã số truy cập: DQ334282 – DQ334289); P. larnaudii (mã số truy cập: DQ334303 – DQ334313) và P. macronema (mã số truy cập: DQ334314 – 334315). Các trình tự chuẩn này đƣợc sử dụng để làm trình tự đối chứng định danh ba loài phân tích. . 23 Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả định danh phân loại bằng hình thái các loài cá bột thuộc họ Pangasiidae 4.1.1. Kết quả hình thái phân loại Phân tích 976 mẫu thu đƣợc ở hai nhánh sông Tiền và sông Hậu năm 2006 trong đó có 357 mẫu có xuất hiện cá họ Pangasiidae, chúng tôi đã xác định đƣợc 3 loài của họ cá Pangasiidae (Pangasianodon hypophthalmus, Pangasius macronema và Pangasius larnaudii ), theo Nguyễn Hữu Phụng và Nguyễn Bạch Loan (1999) vị trí phân loại nhƣ sau: Ngành Động Vật có dây sống (Chordata) Phân ngành Động vật có xƣơng sống (Vertebrata) Tổng lớp cá (Pisses) Lớp Cá xƣơng (Osteichthyes) Phân lớp cá Vây tia (Actinopterygii) Bộ Cá nheo (Siluriformes) Họ Cá tra (Pangasiidae) Đặc điểm hình thái phân loại Bộ cá nheo (Siluriformes) Hai bên cơ thể đối xứng, cơ thể thay đổi từ hình ống đến hình trụ dẹp, vi bụng tách rời vi đuôi, vi lƣng và vi ngực có tia gai cứng, râu rất dài, cơ thể không có vẩy. Đặc điểm hình thái phân loại họ cá Tra (Pangasiidae) 24 Hai bên cơ thể đối xứng, cơ thể thay đổi từ hình ống đến hình trụ dẹp, vi bụng tách rời vi đuôi, vi lƣng và vi ngực có tia gai cứng, râu rất dài, cơ thể không có vẩy, có vi mỡ nhỏ ở sau vi lƣng, vi hậu môn có 28 – 46 tia mềm, vi đuôi phân thùy sâu, đầu hơi dẹp trên dƣới, miệng dƣới, mép có hai đôi râu. Đặc điểm hình thái phân loại Giống Helicophagus, Pangasianodon và Pangasius 1. Tia vi bụng từ 8 - 9 tia: Pangasianodon. Tia vi bụng nhỏ hơn 8 tia: 2. 2. Tia vi hậu môn từ 37 - 40 tia: Helicophagus. Tia vi hậu môn nhỏ hơn 37 tia : Pangasius. Theo Apichart TermvidChakorn (2003), Nguyễn Văn Hảo (2005) (mục 2.2) và tài liệu của Nguyễn Văn Trọng (1997), Mai Đình Yên và ctv (1979) chúng tôi đã tổng hợp nên các đặc điểm hình thái phân loại loài: Pangasianodon hypophthalmus, Pangasius macronema và Pangasius larnaudii đƣợc mô tả và ghi nhận ở mục 4.2. 25 Họ Pangasiidae; 357; 36,56% Họ khác; 619; 63,44% Họ Pangasiidae Họ khác 42 55 71 189 0 50 100 150 200 Sáng Trưa Chiều Nữa đêm Thời điểm thu Số lư ợn g m ẫu 32 155 72 98 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 Tháng 6 Tháng 7 Tháng 8 Tháng 9 Tháng thu mẫu Số lư ợn g m ẫu 4.1.2. Kết quả giai đoạn định tính 4.1.2.1. Phân tích mẫu xuất hiện họ Pangasiidae so với tổng mẫu thu đƣợc năm 2006 Biểu đồ 4.1. Tỷ lệ họ Pangasiidae thu đƣợc trên tổng mẫu thu năm 2006 A B Biểu đồ 4.2. Sự phân bố của tổng lƣợng mẫu xuất hiện cá thể họ Pangasiidae. A: biểu đồ biểu diễn tổng số lƣợng mẫu có xuất hiện cá thể họ Pangasiidae ở các thời điểm khác nhau trong ngày (sáng: 5:30 – 6:30 phút; trƣa: 11:30 – 12:30 phút; chiều: 17:15 – 18:15 phút và nữa đêm: 23:30 – 0:30 phút). B: biểu đồ biểu diễn tổng số lƣợng mẫu có xuất hiện cá thể họ Pangasiidae ở các tháng khác nhau trong mùa. 26 Kết quả giai đoạn định tính: có 357 mẫu xuất hiện loài cá thuộc họ Pangasiidae trên tổng 976 mẫu thu từ tháng 6/2006 – tháng 9/2006 (biểu đồ 4.1). Pangasiidae chỉ có 13 loài trên tổng số 255 loài cá nƣớc ngọt vùng ĐBSCL (Mai Đình Yên và ctv, 1985) nhƣng xuất hiện với tần số rất lớn 36,56% trên tổng số mẫu thu đƣợc. Ngoài ra, Pangasiidae có tần suất phân bố rất rộng và tập trung cao nhất vào tháng 7 (biểu đồ 4.2B). Từ đây bật lên hai vần đề: thứ nhất, tuy cá thuộc họ Pangasiidae có nhiều loài nhƣng lại đẻ khá tập trung và đẽ trƣớc tháng 7 nên đến tháng 7 tại vùng sông Cửu Long thu đƣợc nhiều nhất (155 trên tổng 357 mẫu có xuất hiện cá họ Pangasiidae). Thứ hai, có một số loài thuộc họ Pangasiidae đẻ rãi rác và kéo dài trong suốt mùa nghiên cứu nên các tháng còn lại đều thu đƣợc, nhƣng có số lƣợng thấp hơn hoặc đẻ cùng một lúc nhƣng vị trí các bãi đẻ khác nhau nên khi trôi xuống sông Cửu Long có sự phân bố không đồng đều về số lƣợng các mẫu cá có họ Pangasiidae trong các tháng. Tuy nhiên, ở biểu đồ 4.2A theo phân bố ngày đêm, trong số 357 mẫu cá có họ Pangasiidae xuất hiện nhiều nhất vào lúc giữa đêm chiếm 189 mẫu trên tổng 357 mẫu có xuất hiện họ Pangasiidae và tăng dần từ các thời điểm từ sáng, đến trƣa, đến chiều. Điều này chúng tôi cho rằng, tần số xuất hiện nhiều vào lúc giữa đêm liên quan đến vấn đề về lƣu tốc nƣớc, vì thủy triều ban đêm mạnh hơn ban ngày và các loài này có khả năng ban đêm đẻ nhiều hơn ban ngày nên thu ban đêm đƣợc nhiều hơn và ban ngày cũng thu đƣợc nhƣng với tần số thấp hơn. Nhìn chung, từ các kết quả trên có thể nói lên rằng, Pangasiidae có tần suất phân bố rất rộng đặc biệt là lúc giữa đêm. Nguồn tài nguyên về loại cá kinh tế này rất phong phú. Tuy nhiên, nguồn tài nguyên này không vô hạn. Để sử dụng lâu dài thì cần có mục đích và biện pháp khai thác thích hợp. 27 4.1.2.2. Phân tích mẫu xuất hiện loài nghiên cứu so với tổng mẫu Pangasiidae Biểu đồ 4.3. Tỷ lệ % mẫu xuất hiện loài phân tích và tổng mẫu Pangasiidae thu đƣợc A B Biểu đồ 4.4. Sự phân bố về lƣợng mẫu xuất hiện loài nghiên cứu so với lƣợng mẫu Pangasiidae. A: biểu đồ biểu diễn tần số xuất hiện mẫu có xuất hiện loài phân tích so với tổng mẫu Pangasiidae Mẫu không xuất hiện loài nghiên cứu; 225; 63,02% Mẫu xuất hiện loài nghiên cứu; 132; 36,98% Mẫu không xuất hiện loài nghiên cứu Mẫu xuất hiện loài nghiên cứu 22 15 45 5042 55 71 189 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 Sáng Trưa Chiều Tối Thời điểm thu mẫu S ố l ư ợ n g m ẫ u Mẫu xuất hiện loài phân tích Tổng Mẫu Pangasiidae 17 48 15 52 32 155 72 98 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 Tháng 6 Thang 7 Tháng 8 Tháng 9 Tháng thu mẫu S ố l ư ợ n g m ẫ u Mẫu xuất hiện loài phân tích Tổng mẫu Pangasiidae 28 ở các thời điểm khác nhau trong ngày. B: biểu đồ biểu diễn tần số xuất hiện mẫu có xuất hiện loài phân tích so với tổng mẫu Pangasiidae ở các tháng khác nhau trong mùa. Nhìn vào biểu đồ 4.3 ta thấy, các loài cá phân tích xuất hiện trong 132 mẫu trên tổng 357 mẫu có cá thuộc họ Pangasiidae (xấp xỉ 1/3), trong khi 3 loài nghiên cứu (P. hypophthalmus, P. larnauudi, P. macronema) chiếm tỷ lệ trên 1/4 trong 13 loài thuộc họ Pangasiidae. Điều này cho thấy tần số xuất hiện các loài này tƣơng đối nhiều. Ở biểu đồ 4.4B, các loài cá họ Pangasiidae nói chung và các loài phân tích nói riêng đều xuất hiện rất ít vào tháng 8 và tháng 6, nhiều vào tháng 7. Tuy nhiên, tần suất xuất hiện mẫu chứa các loài này không tập trung vào tháng 7 mà tập trung nhiều vào tháng 9. Đến đây chỉ có thể nói rằng tần suất phân bố các loài nghiên cứu dày ở tháng 9. Ở biểu đồ 4.4A, tuy không xuất hiện đột biến nhiều vào giữa đêm nhƣ các loài Pangasiidae nói chung nhƣng số lƣợng mẫu xuất hiện các loài nghiên cứu cũng tăng dần từ trƣa đến chiều, đến nửa đêm. Nhìn chung, kết quả nghiên cứu này rất có ý nghĩa đối với việc khai thác các loài Pangasiidae mong muốn, nhằm giảm thiểu tối đa thiệt hại về nguồn tài nguyên cá bột trên sông Cửu Long. 29 4.1.3. Kết quả giai đoạn định lƣợng 4.1.3.1. Tỉ lệ số lƣợng cá thể của 3 loài cá phân tích và các loài khác Biểu đồ 4.5. Tỉ lệ % số lƣợng cá thể của 3 loài cá phân tích và các loài khác A B A B Biểu đồ 4.6. Sự phân bố về số lƣợng các loài nghiên cứu so với tổng lƣợng Pangasiidae. Tổng cá thể loài khác; 2848; 88,64% Tổng cá thể các loài phân tích; 365; 11,36% Tổng cá thể loài khác Tổng cá thể các loài phân tích 293 528 564 1828 31 29 115 190 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 Sáng Trưa Chiều Nữa đêm Thời điểm thu mẫu S ố l ư ợ n g c á t h ể Pangasiidae Các loài phân tích 208 2358 140 507 62 166 20 117 0 500 1000 1500 2000 2500 Tháng 6 Tháng 7 Tháng 8 Tháng 9 Tháng thu ẫu S ố l ư ợ n g c á t h ể Pangasiidae Các loài phân tích 30 A: biểu đồ biểu diễn tổng số lƣợng các loài phân tích so với tổng lƣợng Pangasiidae ở các thời điểm khác nhau trong ngày. B: biểu đồ biểu diễn tổng số lƣợng các loài phân tích so với tổng lƣợng Pangasiidae ở các tháng khác nhau trong mùa. Kết quả quá trình phân tích hình thái ở giai đoạn định lƣợng: Tổng số lƣợng cá thể cá bột có trong 357 mẫu họ Pangasiidae (mục 4.1.2.2) là 3.213 cá thể, trong đó các loài phân tích chỉ có 365 cá thể, chiếm 11,36% tổng lƣợng Pangasiidae thu đƣợc (biểu đồ 4.5). Nhìn chung, qua các biểu đồ phân bố theo mùa của các loài cá họ Pangasiidae về tần suất xuất hiện và số lƣợng đều rất cao vào tháng 7 (biểu đồ 4.4B và 4.6B). Điều đó chứng minh rằng, các loài cá họ Pangasiidae tâp trung đẻ nhiều vào trƣớc tháng 7, và đây cũng là mùa sinh sản chính của các loài cá này. Vì vậy mà tại thời điểm tháng 7, vùng sông Cửu Long thu đƣợc nhiều loài cá họ Pangasiidae nhất. Tuy số lƣợng các loài nghiên cứu thấp hơn nhiều so với tổng lƣợng cá họ Pangasiidae thu đƣợc, nhƣng cả lƣợng mẫu và số lƣợng cá thể các loài cá nghiên cứu cũng tuân theo quy luật trên. Tƣơng tự, các loài họ Pangasiidae nói chung và các loài phân tích nói riêng, theo phân bố ngày đêm cả tần suất xuất hiện và tỷ lệ đều rất cao vào thời điểm buổi chiều và giữa đêm. 31 2848; 88,64% 36; 1,12% 12; 0,37% 317; 9,87% các loài không phân tích P. macronema P. larnaudii P. hypophthalmus 4.1.2.4. Tỉ lệ số lƣợng cá thể của mỗi loài cá phân tích so với tổng lƣợng cá thể họ Pangasiidae Biểu đồ 4.7. Tỉ lệ % cá thể của từng loài phân tích trong tổng lƣợng cá thể họ Pangasiidae A B Biểu đồ 4.8. Sự phân bố về số lƣợng từng loài nghiên cứu so với tổng lƣợng Pangasiidae. 293 528 564 1828 26 10112 178 13 125 611 10 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 Sáng Trưa Chiều Nữa đêm Thời điểm thu mẫu S ố l ư ợ n g c á t h ể các loài không phân tích P. macronema P. larnaudii P. hypophthalmus 2358 507 140208 17 146 10153 316 3 149 3 0 500 1000 1500 2000 2500 Tháng 6 Tháng 7 Tháng 8 Tháng 9 Tháng thu mẫu S ố l ư ợ n g c á t h ể Pangasiidae P. macronema P. larnaudii P. hypophthalmus 32 A: biểu đồ biểu diễn tổng số lƣợng từng loài phân tích so với tổng lƣợng Pangasiidae ở các thời điểm khác nhau trong ngày. B: biểu đồ biểu diễn tổng số lƣợng từng loài phân tích so với tổng lƣợng Pangasiidae ở các tháng khác nhau trong mùa. Khi phân tích về số lƣợng từng loài nghiên cứu (biểu đồ 4.7), trong 3213 cá thể thuộc họ Pangasiidae (mục 4.1.2.3) thì: P. hypophthalmus (cá tra sông) chiếm tỷ lệ rất ít 12 trên tổng số 3213 cá thể họ Pangasiidae (xấp xỉ 0,37%). Trong đó chỉ có 1 mẫu tháng 6 chiếm cao nhất là 9 cá thể, và ba mẫu còn lại mỗi mẫu 1 cá thể đều rơi vào tháng 9. Điều này có thể kết luận rằng, cá P. hypophthalmus đẻ sớm nhất, tức đẻ trƣớc tháng 6 vì vậy đến thời điểm tháng 6 thì vùng sông Cửu Long thu số lƣợng nhiều nhất; Loài P. macronema (cá sát) có 99 mẫu, rơi vào tháng 9 nhiều nhất (35 mẫu) nhƣng số lƣợng cá thể chỉ có 101. Tuy tháng 7 chỉ có 37 mẫu nhƣng tần suất xuất hiện lại rất nhiều: 146 cá thể. Tháng 6, tháng 8 đều xuất hiện nhƣng với số lƣợng rất ít. Nhƣ vậy, loài này đẻ rãi rác ở các tháng trong mùa nhƣng đẻ nhiều nhất là thời điểm trƣớc tháng 7; Riêng loài P. larnaudii (cá vồ đém) xuất hiện không đều, chỉ có 29 mẫu (với 36 cá thể) nhƣng lại phân bố đều trong 4 tháng nghiên cứu. Khả năng loài này đẻ rãi rác trong suốt mùa nghiên cứu nhƣng nhiều nhất là tháng 7 (có 11 mẫu với 16 cá thể) nên các tháng còn lại đều xuất hiện nhƣng rất ít. Lý do thứ hai cũng có thể do đẻ cùng lúc và di cƣ một lƣợt nhƣng bãi đẻ khác xa nhau, nên khi trôi xuống sông Cửu Long thì thu đƣợc rãi rác ở nhiều tháng trong mùa. Tƣơng tự, biểu đồ 4.8B tuy các loài phân tích có số lƣợng rất thấp so với tổng lƣợng cá họ Pangasiidae nhƣng đều xuất hiện nhiều vào lúc chiều và nữa đêm. Riêng loài P. hypophthalmus chỉ xuất hiện vào hai thời điềm là trƣa và chiều. Từ kết quả này cho thấy, các loài phân tích có tần suất xuất hiện và số lƣợng đều rất thấp so với tổng lƣợng Pangasiidae thu đƣợc. Hiện nay, hai loài cá đƣợc ngƣ dân vùng sông Cửu Long nuôi phổ biến là P. hypophhalmus và P. larnaudii. Từ kết quả này cho thấy rằng, ngƣ dân vùng đã giết khoảng 98% các loài thuộc họ Pangasiidae không mong muốn, chƣa kể đến các loài trong họ khác để chỉ đƣợc thu hai loài P. hypophthalmus và P. larnaudii. Đây là điều nguy hiểm đe dọa mối nguy 33 cơ tuyệt chủng của một số loài cá đang hiếm của vùng. Vì vậy cần có biện pháp bảo vệ và khai thác thích hợp nguồn tài nguyên vốn có trên sông Cửu Long. 4.2. Ghi nhận các điểm đặc trƣng của cá bột trƣớc khi phân tích DNA Từ 3 lọ chứa 3 loài phân tích, chọn ngẫu nhiên mỗi loài ra 10 cá thể để chuẩn bị cho quá trình phân tích DNA, các điểm đặc trƣng của các loài trên đƣợc ghi nhận và mô tả lại theo hình sau: o Pangasianodon hypophthalmus: Rất dễ phân biệt với các loài khác do có nhiều sắc tố nâu đen dọc theo thân mà các loài khác không có. Ngoài ra còn có sắc tố đen trên đầu và đuôi, cán đuôi thon và thân thon dài hơn các con khác. Hình 4.1. Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage, 1878), 17 mm. o Pangasius larnaudii: Tuy cũng có thân dài và dẹp dần về phía đuôi, cũng có hai đôi râu nhƣng điểm khác biệt để nhận dạng loài này so với các loài khác là: đầu to hơn các loài khác, miệng rộng kéo dài đến mắt, bụng cũng rất to và có nhiều hắc tố. Đuôi cũng có hắc tố giống nhƣ P. hypophthalmus, nhƣng vi ngực và vi lƣng có hắc tố rất rõ, đặc biệt sau nắp mang có chấm hắc tố. 34 Hình 4.2. Pangasius larnaudii Bocourt, 1866. 20 mm. o Pangasius macronema: loài này rất dễ nhầm lẩn với Pangasius siamensis (cùng giống), thân dài, hơi dẹp về phía đuôi, cũng có hắc tố trên đầu và thân, vi lƣng cũng có 1 tia cứng và 7 tia mềm, nhƣng khác biệt là P. siamensis mắt to hơn, râu dài hơn và đặc biệt sau gốc vi lƣng chẩm xuống mà ở P. macronema không có. Ngoài ra ở P. macronema, có hắc tố quanh gốc vi lƣng nhiều hơn và không có hắc tố trên gốc vi lƣng nhƣ P. siamensis. Hình 4.3. Pangasius macronema Bleeker, 1851. 15 mm 4.3. Xác định và phân tích vùng 16S rRNA trên mtDNA 4.3.1. Nhân dòng vùng gen mã hóa 16S rRNA Trƣớc khi nhân dòng vùng 16S rRNA trên mtDNA của tất cả các mẫu cá phân tích, chúng tôi thực hiện 2 lần thí nghiệm trên 3 loài đã định danh hình thái 35 đối với mẫu thu năm 2006 và 1 lần thí nghiệm cho mẫu năm 2005 bảo quản trong formol 5%: Lần 1: 2 mẫu P. macronema có kích thƣớc 15 mm, 2 mẫu P. macronema có kích thƣớc 24 mm và 1 mẫu cá tra bảo quản trong phòng Thí Nghiệm Sinh Học Phân Tử dùng làm đối chứng dƣơng. Kết quả chỉ có 1 mẫu 5T (giếng thứ 1) cho kết quả, 4 mẫu còn lại không có vạch DNA nào (hình A). Lần 2: Tiếp tục tách 2 mẫu cá tra kích thƣớc 19 mm, từ các mẫu đã định danh năm 2006 và 1 mẫu cá tra (ký hiệu 5T) phòng Thí Nghiệm Sinh Học Phân tử làm đối chứng dƣơng. Kết quả chỉ có mẫu 5T cho một vạch DNA (giếng thứ 1), hai mẫu còn lại âm tính (giếng 1 và giếng 2) (hình B). Lần 3: Cũng theo phƣơng pháp định danh nhƣ thế chúng tôi chọn 6 mẫu cá lớn đã xác định chính xác là cá họ Pangasiidae (kích thƣớc: 76 mm, 81 mm, 83 mm, 86 mm, 93 mm và 110 mm), nhằm mục đích kiểm chứng lại DNA có bị phân huỷ bởi formol không và 1 mẫu chứng dƣơng 5T đã sử dụng cho lần thí nghiệm 1 và 2. Kết quả tƣơng tự, cả 6 mẫu cá lớn thuộc họ Pangasiidae bảo quản trong formol năm 2005 đều cho kết quả âm tính, chỉ có mẫu 5T là cho 1 băng DNA duy nhất (hình C). Hình 4.4: Sản phẩm PCR khuếch đại vùng 16S rRNA trên mtDNA từ một số mẫu năm 2006 và năm 2005. Hình A: lần thí nghiệm thứ nhất với 2 mẫu cá P. macronema 15 mm (giếng 1, giếng 2) 36 và 2 mẫu cá 24 mm (giếng 3 và giếng 4). 5T: mẫu đối chứng dƣơng. Hình B: lần thí nghiệm thứ 2 với 2 mẫu cá P. hypophthalmus 19 mm (giếng 1, giếng 2). Mẫu 5T làm đối chứng dƣơng và M: thang Lambda DNA ECoRI Hind III. Hình C: lần thí nghiệm thứ 3 với 6 mẫu cá thuộc họ Pangasiidae có kích thƣớc lần lƣợc là: 76 mm, 81 mm, 83 mm, 86 mm, 93 mm và 110 mm (giếng thứ 1 đến giếng thứ 6). 5T là mẫu đối chứng dƣơng. Kết quả cả 3 lần thí nghiệm trên đều cho một kết quả duy nhất là mẫu 5T từ phòng Thí Nghiệm Sinh Học Phân Tử đều cho kết quả dƣơng và duy nhất chỉ có một vạch DNA. Nhƣ vậy, sản phẩm DNA rất tinh, phản ứng PCR chạy tốt. Trong hai lần thí nghiệm đầu, sau khi thực hiện phản ứng PCR các mẫu phân tích không cho vạch băng DNA nào có thể là do định danh sai hay DNA bị phá hủy bởi formol. Nhƣng với lần thí nghiệm thứ 3, thực hiện trên cả 6 mẫu cá lớn vẫn không cho một vạch băng DNA nào trong khi mẫu 5T vẫn hiện một vạch băng DNA rất rõ. Đến đây chúng tôi có thể kết luận rằng, formol đã phá hủy DNA. Nhƣ vậy, mẫu cá năm 2006 không thể tiến hành phân tích DNA đƣợc. Chúng tôi tiến hành định danh bổ sung 64 mẫu cá thu vào tháng 6/2007 trên hai nhánh sông Tiền và sông Hậu với phƣơng pháp định danh nhƣ đã định danh các mẫu cá năm 2006 và cách bố trí thí nghiệm tƣơng tự nhƣ đã trình bày ở mục 3.4. Từ kết quả này, chúng tôi chọn 26 cá thể ngẫu nhiên từ 3 loài và có kích thƣớc chiều dài thân từ 15 mm đến 30 mm để kiểm tra trình tự vùng 16S rRNA trên mtDNA (Bảng 4.1). 37 Tên loài Ký hiệu Chiều dài thân (mm) P. hypophthalmus H1 15 H2 16 H3 17 H4 17 H5 18 H6 20 H7 21 H8 21 H9 21 P. larnaudii L1 20 L2 22 L3 23 L4 25 L5 27 L6 27 L7 28 L8 30 P. macronema M1 15 M2 17 M3 20 M4 22 M5 22 M6 22 M7 22 M8 25 M9 30 Bảng 4.1. Kích thƣớc các mẫu cá phân tích DNA ty thể từ các mẫu cá đã chọn đƣợc tinh sạch bằng phƣơng pháp phenol- chloroform. MtDNA sau khi tinh sạch sẽ đƣợc hòa tan trong 100 µl nƣớc cất khử ion và sử dụng trực tiếp trong phản ứng PCR nhân dòng vùng gen mã hóa 16S rRNA trên mtDNA. Sản phẩm PCR đƣợc phân tích trên gel agarose 1% (Hình 4.5). 38 Kết quả cho thấy, mồi chuyên biệt 16Sar và 16Sbr đã khuếch đại đặc hiệu với trình tự đích trên mtDNA để cho ra một băng sản phẩm duy nhất có kích thƣớc khoảng 630 bp. Kết quả này tƣơng tự với kết quả nghiên cứu của Na-Nakorn và cộng sự (2006). Đến đây chúng tôi có thể xác định đƣợc các mẫu cá trên thuộc họ Pangasiidae. Chúng tôi tiếp tục tiến hành giải trình tự tất cả 26 mẫu cá phân tích, để xác định chính xác từng loài. Đồng thời kiểm tra lại độ tin cậy của phƣơng pháp phân tích hình thái. 4.3.2. Phân tích trình tự vùng 16S rRNA trên mtDNA của các mẫu cá 4.3.2.1. Định danh 9 mẫu thuộc loài P. macronema Chín mẫu cá ngẫu nhiên của loài P. macronema đƣợc đánh số ký hiệu từ M1 đến M9, mỗi cá thể có kích thƣớc khác nhau nhƣ đã trình bày ở bảng 4.1. Trình tự vùng 16S rRNA trên mtDNA của từng cá thể đƣợc phân tích bằng chƣơng trình BLAST cho thấy cả chín trình tự đều có độ tƣơng đồng cao nhất với kiểu gen P. macronema haplotype Pm01 (mã số trên ngân hàng gene DQ334314). Trên cơ sở kết quả này, chƣơng trình DNAMAN đƣợc sử dụng để thực hiện phép so sánh trình tự giữa 9 mẫu phân tích với hai trình tự kiểu gen P. macronema haplotype Pm01 (mã số trên ngân hàng gen DQ334314) và P. macronema haplotype Pm02 ( mã số M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 M Hình 4.5.: Sản phẩm PCR khuếch đại một vùng 16S rRNA trên mtDNA từ vài mẫu cá đại điện; M : thang LambdaDNA ECoRI Hind III; giếng 1, 2, 3: loài P. hypophthalmus ; giếng 4, 5, 6 loài P. larnaudii; giếng 7, 8, 9: loài P. macronema. 947 bp 564 bp 831 bp 630 bp 39 trên ngân hàng gen DQ334315). Kích thƣớc các cá thể phân tích xem chi tiết ở bảng 4.1. DQ334314 CGCCTCCTGCAAAAATCAACGTATAGGAGGTCTTGCCTGCCCAGTGACAA 50 DQ334315 -------------------------------------------------- 50 M1 -------------------------------------------------- 50 M2 -------------------------------------------------- 50 M3 -------------------------------------------------- 50 M4 -------------------------------------------------t 50 M5 -------------------------------------------------t 50 M6 -------------------------------------------------- 50 M7 -------------------------------------------------t 50 M8 -------------------------------------------------- 50 M9 -------------------------------------------------- 50 Hình 4.6a DQ334314 TTTGTTCAACGATTAAAGTCCT 572 DQ334315 ---------------------- 572 M1 ---- 554 M2 -----a---------t------ 572 M3 -----a---------t----- 571 M4 -----a---------t------ 572 M5 -----a---------t------ 572 M6 -----a---------t------ 572 M7 -----a---------t------ 572 M8 -----a---------t------ 572 M9 -----a---------t------ 572 Hình 4.6b Hình 4.6: Các điểm khác nhau về trình tự vùng 16S rRNA trên mtDNA loài P.macronema trên ngân hàng gen (DQ334314, DQ334315) với trình tự 8 mẫu P. macronema phân tích (từ M1 – M9). Hình 4.6a: Điểm đột biến tại vị trí nucleotide thứ 50 của mẫu M4, M5, M7 so với hai trình tự chuẩn. Hình 4.6b: Điểm đột biến tại vị trí nucleotide thứ 556 và 566 của 8 mẫu cá P. macronema (từ M2 đến M9) đang phân tích với hai trình tự chuẩn trên ngân hàng gene. Theo kết quả so sánh trình tự vùng 16S rRNA của mẫu cá M1 tƣơng đồng cao nhất so với kiểu gen P. macronema (Pm01) là 100% (xem phần phụ lục). Đặc biệt, kết quả phân tích cho thấy có 1 đột biến thay thế nucleotide ở 8/9 mẫu phân tích (mẫu M1 không có dữ liệu) có kết quả thống nhất khác biệt so với P. macronema (Pm01) và P. macronema (Pm02), đây là hai đột biến thay thế tại vị trí 556 (Thymine đƣợc thay bằng Adenine) và 566 (Adenine đƣợc thay bằng Thymine) (hình 4.6b). 40 Ngoài ra, còn ba vị trí mang đột biến thay thế nucleotide khác cũng đƣợc ghi nhận là Adenine thứ 50 đƣợc thay bằng Thymine ở mẫu M4, M5, M7 (hình 4.6a); Cytosine thứ 251 đƣợc thay bằng Thymine ở mẫu M2 (xem phụ lục), và cuối cùng là vị trí Cytosine thứ 326 của mẫu M8 đƣợc thay bằng Thymine (hình 4.6a). Từ kết quả trên chứng tỏ rằng, khóa phân loài dựa vào hình thái đối với loài P. macronema mà chúng tôi đƣa ra là phù hợp khi định danh lại bằng cách so sánh trình tự gen mã hóa 16S rRNA của mtDNA. Khi nhìn vào trình tự giữa các cá thể chúng tôi phân tích và trình tự P. macronema (DQ334314) có vài điểm không tƣơng đồng. Có thể là lý do sau: trong quá trình tiến hóa các cá thể có thể gặp những biến cố về môi trƣờng dẫn đến một số nucleotide bị biến đổi để quy định các tính trạng phù hơp hơn với môi trƣờng sống. Rất có thể đây là những kiểu gen mới mà các tác giả đi trƣớc chƣa ghi nhận đƣợc trong khi hai trình tự của P. macronema trên ngân hàng genbank chỉ khác nhau duy nhất một nucleotide tại vị trí 267 Thymine đƣợc thay bằng Cytosine (xem phần phụ lục). 4.3.2.2. Định danh 9 mẫu thuộc loài P. hypophthalmus Tƣơng tự nhƣ trƣờng hợp các mẫu cá thuộc loài P. macronema, chín mẫu cá bột của loài P. hypophthamus đƣợc định danh theo phƣơng hình thái học và đặt tên lần lƣợt từ H1 đến H9 (xem bảng 4.1). Kết quả so sánh trình tự vùng mtDNA mã hóa 16S rRNA của chín mẫu này với tám kiểu gene của loài P. hypophthalmus (DQ334282, DQ334283, DQ334284, DQ334285, DQ334286, DQ334287 DQ334288 DQ334289) tham khảo trên ngân hàng gene đều có độ tƣơng đồng cao (100%). DQ334282 ATACAAGACGAGAAGACCCTTTGGAGCTTAAGATACAAGATCAACTATGT 250 DQ334283 -------------------------------------------------- 250 DQ334284 -------------------------------------------------- 250 DQ334285 -----------------------------------t-------------- 250 DQ334286 -------------------------------------------------- 250 DQ334287 -------------------------------------------------- 250 DQ334288 -------------------------a------------------------ 250 DQ334289 -------------------------------------------------- 250 H1 -----------------------------------t-------------- 243 H2 -------------------------------------------------- 232 H3 -------------------------------------------------- 250 41 H4 -----------------------------------t-------------- 250 H5 -----------------------------------t-------------- 250 H6 -----------------------------------t-------------- 250 H7 -------------------------------------------------- 250 H8 -------------------------------------------------- 250 H9 -------------------------------------------------- 250 Hình 4.7a DQ334282 CCTAAAACCAAGAAAGACATTTCTAAGTCACAGAATATTTGACCACAAAG 400 DQ334283 ---------------a---------------------------------- 400 DQ334284 -------------------------------------------------- 400 DQ334285 -------------------------------------------------- 400 DQ334286 -------------------------------------------------- 400 DQ334287 --------------------------------------c----------- 400 DQ334288 -------------------------------------------------- 400 DQ334289 -------------------------------------------------- 400 H1 -------------------------------------------------- 393 H2 --------------------------------------c----------- 382 H3 -------------------------------------------------- 400 H4 -------------------------------------------------- 400 H5 -------------------------------------------------- 400 H6 -------------------------------------------------- 400 H7 --------------------------------------c----------- 400 H8 -------------------------------------------------- 400 H9 -------------------------------------------------- 400 Hình 4.7b Hình 4.7. : Sự tƣơng đồng trình tự vùng 16S rRNA trên mtDNA của 9 mẫu cá P. hypophthalmus phân tích (từ H1 đến H9) với tám trình tự chuẩn trên ngân hàng gene P. hypophthalmus haplotype: Ph01 đến Ph08 (DQ334282 – DQ334289). Hình 4.7a: tƣơng đồng trình tự mẫu H1, H4, H5, H6 với kểu gen P. hypophthalmus haplotype Ph04 (DQ334285). Hình 4.7b: tƣơng đồng trình tự mẫu H2, H7 với kểu gen P. hypophthalmus haplotype Ph06 (DQ334287). Theo kết quả so sánh từ hình 4.7, trong số chín cá thể đƣợc phân tích thì có hai cá thể: H2, H7 tƣơng đồng chính xác với kiểu gene P. hypophthalmus haplotype Ph6 (DQ334287) (Hình 4.7b), ba cá thể H3, H8, H9 tƣơng đồng hoàn toàn với với kiểu gen P. hypophthalmus haplotype Ph01 (DQ334282) (xem phần phụ lục). Bốn cá thể cuối cùng (H1, H4, H5, H6 ) đƣợc xác định tƣơng đồng với kiểu gene P. hypophthalmus haplotype Ph04 (DQ334285) (hình 4.7a). Trong đó, duy nhất chỉ có mẫu H1 là mang một đột biến thay thế nucleotide, với Guanidin thứ 26 đƣợc thay bằng Adenine, so với tám kiểu gene tham khảo trên ngân hàng gene. Nhƣ vậy, theo kết quả phân tích này kiểu gene ở mẫu cá H1 có thể là một kiểu gen mới. 42 Tóm lại, kết quả so sánh trình tự của chín mẫu cá phân tích so với dữ liệu chuẩn trên ngân hàng gene bằng chƣơng trình Blast và DNAMAN đã khẳng định chín mẫu cá này là loài P. hypophthamus. 4.3.2.3. Định danh 8 mẫu thuộc loài P. larnaudii. Tám mẫu cá bột thuộc loài P. larnaudii sau khi đã định danh, có kích thƣớc từ 20 mm - 30 mm (bảng 4.1). Kết quả sau khi giải trình tự vùng 16S rRNA trên mtDNA, các trình tự này đƣợc so sánh trên ngân hàng genbank tất cả đều có độ tƣơng đồng 100% với các trình tự mẫu cá thuộc loài P. larnaudii (ký hiệu các trình tự mẫu: Pl01 đến Pl13 tƣơng ứng với các trình tự gen có mã số truy cập DQ334303 - DQ334313) DQ334303 GTTAAACGGCCGCGGTATTTTGACCGTGCGAAGGTAGCGCAATCACTTGT 100 DQ334304 -------------------------------------------------- 100 DQ334305 -------------------------------------------------- 100 DQ334306 -------------------------------------------------- 100 DQ334307 --------------------------------------------c----- 100 DQ334308 -------------------------------------------------- 100 DQ334309 -------------------------------------------------- 100 DQ334310 ----------------------t--------------------------- 100 DQ334311 -------------------------------------------------- 100 DQ334312 ------------------c------------------------------- 100 DQ334313 -------------------------------------------------- 100 l1 -------------------------------------------------- 100 L2 -------------------------------------------------- 100 L3 -------------------------------------------------- 100 L4 -------------------------------------------------- 100 L5 ------------------c------------------------------- 100 L6 -------------------------------------------------- 100 L7 -------------------------------------------------- 100 L8 -------------------------------------------------- 100 Hình 4.8a DQ334303 CGATGTTGGATCAGGACATCCTAATGGTGCAGCCGCTATTAAGGGTTCGT 550 DQ334304 -------------------------------------------------- 550 DQ334305 -------------------------------------------------- 550 DQ334306 -------------------------------------------------- 550 DQ334307 -------------------------------------------------- 550 DQ334308 -------------------------------------------------- 550 DQ334309 -------------------------------------------------- 550 DQ334310 -------------------------------------------------- 550 DQ334311 -------------------------------------------------- 550 DQ334312 -------------------------------------------------- 550 DQ334313 ---------------g-------------------g-------------- 550 l1 -------------------------------------------------- 550 L2 -------------------------------------------------- 550 L3 -------------------------------------------------- 550 43 L4 ---------------g-------------------g-------------- 550 L5 -------------------------------------------------- 550 L6 ---------------g-------------------g-------------- 550 L7 ---------------g-------------------g-------------- 550 L8 -------------------------------------------------- 550 Hình 4.8b Hình 4.8. : Sự tƣơng đồng trình tự vùng 16S rRNA trên mtDNA của 8 mẫu cá P. larnaudii phân tích (từ L1 đến L8) với 11 trình tự chuẩn trên ngân hàng gene P. larnaudii haplotype: Pl01 đến Pl11 (DQ334303 – DQ334313). Hình 4.8a: tƣơng đồng trình tự mẫu L5 với kểu gen P. larnaudii haplotype Pl10 (DQ334312). Hình 4.8b: tƣơng đồng trình tự mẫu L4, L6, L7 với kểu gen P. larnaudii haplotype Pl11 (DQ334313). Quan sát trình tự trên ngân hàng genbank loài P. larnaudii có 11 kiểu gen. Tất cả 8 mẫu phân tích chỉ tƣơng đồng với 3 kiểu gen của P. larnaudii (DQ334303, DQ334312 và DQ334313) (xem phần phụ lục). Trong đó, có 4 mẫu: L1, L2, L3, L8 tƣơng đồng 100% với loài P. larnaudii haplotype Pl01 (DQ334303); mẫu L5 tƣơng đồng 100% với loài P. larnaudii haplotype Pl10 (DQ334312) (hình 4.8a) và 3 mẫu cuối cùng: L4, L6, L7 tƣơng đồng 100% với loài P. larnaudii haplotype Pl11 (DQ334313) (hình 4.8b). Nhƣ vậy, kết quả sau khi so sánh trình tự 8 mẫu cá P. larnaudii sau khi định danh bằng hình thái với trình tự chuẩn trên ngân hàng gene đã xác định đƣợc các mẫu phân tích đúng là loài P. larnaudii. Đồng thời ở đây chúng tôi cũng chƣa phát hiện một haplotype mới. 44 Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Qua phƣơng pháp phân tích hình thái kết quả số lƣợng các loài cần phân tích (P. hypophthalmus, P. larnaudii, P. macronema) chiếm tỷ lệ khá lớn 132 mẫu/357 mẫu có Pangasiidae. Kết quả phân tích từ ba loài thu đƣợc 132 mẫu có 365 cá thể thì P. macronema chiếm số lƣợng nhiều nhất 317 cá thể, P. larnaudii chỉ có 36 cá thể, P. hypophthalmus ít nhất 12 cá thể. Giải trình tự 26 sản phẩm PCR, đem so sánh từng trình tự sau khi giải với các trình tự trong ngân hàng Genbank ở chƣơng trình BLAST cho kết quả nhƣ sau: 9 mẫu P. macronema đều giống 99% với P. macronema có mã số truy cập DQ334314, chỉ khác với trình tự này từ 3 – 4 nucleotide; 8/9 mẫu P. hypophthalmus thì giống 100% với ba kiểu gen của P. hypophthalmus có mã số truy cập là DQ334282, DQ334285 và DQ334287, mẫu H1 còn lại chỉ có một điểm đột biến tại vị trí thứ nucleotide 26 với kiểu gen của P. hypophthalmus (DQ334285); 8 mẫu P. larnaudii cuối cùng tƣơng đồng 100% với 3/11 trình tự P. larnaudii có trên ngân hàng gene (DQ334303, DQ334312, DQ334313). Từ kết quả trên có thể khẳng định: sử dụng vùng 16S rRNA trên mtDNA để xác định cá bột loài P. hypophthalmus, P. larnaudii, P. macronema thuộc họ Pangasiidae cho kết quả phù hợp với phƣơng pháp định danh hình thái. Phƣơng pháp phân tích hình thái có thể áp dụng định danh ở mức độ loài từ kích thƣớc rất nhỏ là 15 mm ở 3 loài cá P. hypophthalmus, P. larnaudii, P. macronema thuộc họ Pangasiidae. 45 5.2. Tồn tại Tất cả mẫu cá thuộc họ Pangasiidae năm 2006 không phân tích đƣợc DNA. Số lƣợng các loài P. larnaudii và P. hypophthalmus quá ít, số lƣợng mẫu phân tích hạn chế nên độ tin cậy chƣa cao. 5.3. Đề xuất Trong nghiên cứu này, chúng tôi đƣa ra mục tiêu phân tích 3 loài: P. larnaudii, P. macronema và P. hypophthalmus. Tuy nhiên, số lƣợng các loài này quá ít. Vì vậy chúng tôi có một số đề xuất để các nghiên cứu sau này thực hiện tốt và đầy đủ hơn: Bên cạnh ngƣ cụ Bongo net bổ sung thêm ngƣ cụ đáy để thu đƣợc nhiều cá hơn. Tần số thu mẫu có thể tiến hành nhiều hơn, có thể 12 lần thu mỗi ngày nhƣng mỗi lần 60 đến 90 phút. Các mẫu cá thuộc họ Pangasiidae năm 2006 sau khi cố định bằng formol 5% đƣợc bảo quản trong cồn 20% đã không phân tích đƣợc DNA. Vì vậy, nên bảo quản mẫu bằng cồn 95% khi phân tích DNA. Số lƣợng cá thể các loài phân tích đƣợc bổ sung tháng 6/2007 ít nên chúng tôi chỉ thực hiện thí nghiệm trên 26 cá thể ở ba loài: P. macronema, P. larnaudii và P. hypophthalmus. Do vậy cho độ chính xác chƣa cao. Vì vậy nên nâng độ lặp lại trên 30 lần mỗi loài để tính thống kê sinh học sẽ cho độ chính xác cao và tin cậy hơn. 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài Liệu Tiếng Việt 1. Bộ Thủy Sản Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II, 2005. Tuyển Tập Nghề Cá Sông Cửu Long, 2005. NXB Nông Nghiệp 2. Mai đình Yên và cộng sự, 1962. Một số dẫn liệu về hình thái và phân loại học cá bột (ấu trùng) và cá con vớt được trên sông Hồng. NXB Khoa Học và Kỹ Thuật, Hà Nội. 3. Mai Đình Yên, Vũ Trung Tạng, Bùi Lai, Trần Mai Thiên, 1979. Ngư loại học. NXB Đại Học và Trung Học Chuyên Nghiệp, Hà Nội. 4. Mai Đình Yên, Nguyễn Văn Thiện, Lê Hoàng Yến, Nguyễn Văn Trọng, 1985. Định loại các loài cá nước ngọt Nam Bộ. NXB Khoa Học và Kỹ Thuật Hà Nội. 5. Nguyễn Bạch Loan, 1998. Đặc điểm phân loại và sinh học của một số loài cá họ cá tra Pangasiidae ở hạ lưu sông MeKong, Việt Nam. Luận án thạc sĩ ngàng nuôi trồng thủy sản. 6. Nguyễn Hửu Phụng và Nguyễn Bạch Loan, 1999. Thành phần lòai và phân bố của họ cá tra Pangasiidae ở lƣu vực sông MeKong, Việt Nam 7. Nguyễn Văn Hảo, 2005. Cá Nước Ngọt Việt Nam Tập II. NXB Nông Nghiệp Hà Nội. 8. Nguyễn Nhƣ Hiền – Trịnh Xuân Hậu, 2000. Tế Bào Học. NXB Khoa Học và Kỹ Thuật. 9. Nguyễn Văn Trọng, 1997. Trứng cá và cá con các thuỷ vực thuộc tỉnh Tiền Giang. Báo cáo Khoa Học. Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thuỷ Sản II. 10. Lê Đức Trình, 2001. Sinh Học Phân Tử Của tế Bào. NXB Khoa Học và Kỹ Thuật. 11. Hồ Hùynh Thùy Dƣơng, 2003. Sinh Học Phân Tử. Tái bản lần 3, NXB Giáo Dục, Thành Phố Hồ Chí Minh. 47 12. Trƣơng Thủ Khoa và Trần Thị Thu Hƣơng, 1993. Định loại các loài cá. NXB khoa học và Kỹ Thuật, Hà Nội. Tài Liệu Nƣớc Ngòai 13. Apichart TermvidChakorn, 2003. Freshweter Fish Larvae. Inland Fisheries Resources Research and development Instute, Inland Fisheries Research and Development Bureau Deparment of Fisheries, Thailand , pp 135. 14. Avise, J.C., Helfman, G.S., Saunders, N.C., Hales, L.S., 1996. Mitochondrial DNA differentiation in North Atlanticeel: population genetic consequences of an unusual life history pattern. 83: 4355 – 4354. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 15. Alberts, Bruce; et.al. (1994). Molecular Biology of the Cell, Third Edition, New York: Garland Publishing Inc. 16. Birky, C.W.,Fuerst, P., Maruyama, T., 1989. Organelle gene diversity under migration, mutation and drift. Genetics 121: p613 – 617. 17. Chang, Y.S., Huang, F.L. and Lo, T.B., 1994. The complete nucleotide sequence and gene organization of carp (Cyprinus carpio) mitochondrial genome. Journal of Molecular Evolution 38: p138 – 155. 18. Dodgson,. J.B., Cheng, H.H., Okimoto, R., 1997. DNA markers technology: a revolution in animal genetics. Poult. Sci 17: p1108 – 1114. 19. Douzery E., F. M. Catzeflis, 1995. Molecular evolution of the mitochondrial 12S rRNA in Ungulata (Mammalia) J. Mol. Evol 41: p622-636 20. Gehrke, P.C., 1991. Diel abundance, migration and feeding of fish larvea (Eleotridae) in a floodplain billabong. The fisheries society of the British isles. 21. Gold, J.R., Richardson, L.R., Furman, C., King, T.L., 1993. Mitochondrial DNA differentiation and population structure in red drum (Sciaenops ocellatus) from the Gulf of Mexico and Atlantic Ocean. Mar. biol 116: p175 – 185. 48 22. Graves, J.E., McDowell, J.R., Jones, M.L., 1992. A genetic analysis of weakfish Cynoscion regalis stock structure along the mid – Alantic coast. Fish. Bull 90: p469 – 475. 23. Heist, E.J., Gold, J.R., 1999. Microsetellite DNA variation in sandbar sharks (Carcharhinus plumbeus) from the Gulf of Mexico and mid-Atlantic bight. Copeia 1: p182 – 186. 24. Hurng-Yi Wang and Sin-Chi Lee, 2002. Secondary Structure of Mitochondrial 12S rRNA Among Fish and Its Phylogenetic Applications. Molecular Biology and Evolution 19: p138-148. 25. Klinbunga, S., Ampayup, P., Tassanakajon, A., Jarayabhand, P., Yoosukh, W., 2000. Development of species-specific markers of the tropical oyster (Crassostrea belcheri) in Thailand. Mar. Biotechnol 2: p476 – 484. 26. Palumbi, S.R., Martin, A.P., Romano, S., McMillan, W.O., Stice, L. and Grabowski, G., 1991. The simple fool’s guide to PCR. Honolulu: Deparment of Zoology, University of Hawaii. 27. Partis, L., Wells, R.J., 1996. Indentification of fish species using random amplfied polymorphic DNA (RAPD). Mol. Cell. Probes 10: p435 – 441. 28. Pouyaud, L., Teugels, G.G., Gustinano, R. and Legendre, M., 2000. Contribution to the pholygeny og pangasiid catfishes (Siluriformes, Pangasiidae). Cybium 23: p247 – 258. 29. Roberts, T.R. and Vidthayanon, C., 1991. Systematic revision of the Asian catfish family Pangasiidae with biological observations and description of three new species. Proceedings of the Academy of Natural Sciences of Philadelphia 143: p406 – 252. 30. Smith, J.L.B., 1953. The Sea Fishes of Southern Africa. Central News Agency, LTD, South Africa. 31. Springer M. S., E. Douzery, 1996. Secondary structure and patterns of evolution among mammalian mitochondrial 12S rRNA molecules J. Mol. Evol 43: p357-373. 49 32. Sutovsky, P., et. al. Ubiquitin tag for sperm mitochondria. Nov. 25, 1999 > 33. Waiter J. Rainboth, 1996. Fishes of The Cambodian MeKong. Food And Argriculture Organization (FAO) of The United Nations. pp 265 34. Wheeler W. C., R. L. Honeycutt, 1988. Paired sequence difference in ribosomal RNAs: evolution and phylogenetic implications. Mol. Biol. Evol 5: p90-96 35. Young, W.P., Ostberg, C.O., Keim, P., Thorgaard, G.H., 2001. Genetic characterization of hybridixation and introgression between anadromous rainbow trout (Oncorhynchus mykiss irideus) and coastal cutthroat trout (O. clarki clarki). Mol. Ecol 10: p921 – 930. 36. R. Gustiano; G. G. Teugels and L. Pouyaud, 2003. Revision of The Pangasiidae kunyit catfish complex, with description of two new species from South- East Asia (Siluriformes; Pangasiidae). Journal of Natural Histary 37: 357 – 376. 37. Laurent Pouyaud; Rudhy Gustiano and Guy G. Teugels, 2002. Systematic revision of Pangasius Polyuranodon (Siluriformes, Pangasiidae) with description of two new species. Cybium 26: 243 – 252. 38. Z.J. Liu; J.F. Cordes, 2004. DNA marker technologies and their applications in aquaculture genetics. Aquaculture 238: 1 – 37. 39. U. Na-Nakorn, S. Sukmanomon, M. Nakajima, N. Taniguchi, W. Kamonrat, S. Poompuang and T. T. T. Nguyen, 2006. MtDNA diversity of the critically endangered MeKong giant catfish (Pangasianodon gigas Chevey,1993) and closely related species: implications for conservation. Animal Conservation 9: 483 – 494. The Zoological Society of London. 40. Sake R. K., Scharf S., Faloona F., Mullis K. B., Horn Mullis K.B., Horn G., Erlich H.A., Amheim N., 1985. Enzymatic amplification of globin genomic sequences and restriction site.analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 230,1350 – 1355 41. Haase A., Retzel E. F., Stakus K. A., 1990. Amplification arid detection of lentiviral DNA inside cells. Proc Natl Acad SC! USA 87: p4971 – 4975. 50 PHỤ LỤC FILE: Multiple_Sequence_Alignment PROJECT: NUMBER: 11 MAXLENGTH: 572 NAMES: DQ334314 DQ334315 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 MAXNAMELEN: 9 ORIGIN DQ334314 CGCCTCCTGCAAAAATCAACGTATAGGAGGTCTTGCCTGCCCAGTGACAA 50 DQ334315 -------------------------------------------------- 50 M1 ....---------------------------------------------- 46 M2 ....---------------------------------------------- 46 M3 ....---------------------------------------------- 46 M4 ....---------------------------------------------t 46 M5 ....---------------------------------------------t 46 M6 ....---------------------------------------------- 46 M7 ....---------------------------------------------t 46 M8 ....---------------------------------------------- 46 M9 ....---------------------------------------------- 46 DQ334314 GTTAAACGGCCGCGGTATTTTGACCGTGCGAAGGTAGCGCAATCACTTGT 100 DQ334315 -------------------------------------------------- 100 M1 -------------------------------------------------- 96 M2 -------------------------------------------------- 96 M3 -------------------------------------------------- 96 M4 -------------------------------------------------- 96 M5 -------------------------------------------------- 96 M6 -------------------------------------------------- 96 M7 -------------------------------------------------- 96 M8 -------------------------------------------------- 96 M9 -------------------------------------------------- 96 DQ334314 CTTTTAAATGAAGACCTGTATGAATGGTGGAACGAGGGCTTAACTGTCTC 150 DQ334315 -------------------------------------------------- 150 M1 -------------------------------------------------- 146 M2 -------------------------------------------------- 146 M3 -------------------------------------------------- 146 M4 -------------------------------------------------- 146 M5 -------------------------------------------------- 146 M6 -------------------------------------------------- 146 M7 -------------------------------------------------- 146 M8 -------------------------------------------------- 146 M9 -------------------------------------------------- 146 DQ334314 CCTTTTCAAGTCAATGAAATTGATCTGCCCGTGCAGAAGCGGACATAAAA 200 DQ334315 -------------------------------------------------- 200 M1 -------------------------------------------------- 196 M2 -------------------------------------------------- 196 M3 -------------------------------------------------- 196 M4 -------------------------------------------------- 196 M5 -------------------------------------------------- 196 M6 -------------------------------------------------- 196 M7 -------------------------------------------------- 196 51 M8 -------------------------------------------------- 196 M9 -------------------------------------------------- 196 DQ334314 ATACAAGACGAGAAGACCCTTTGGAGCTTAAGATACAAGATCAACTATGT 250 DQ334315 -------------------------------------------------- 250 M1 -------------------------------------------------- 246 M2 -------------------------------------------------- 246 M3 -------------------------------------------------- 246 M4 -------------------------------------------------- 246 M5 -------------------------------------------------- 246 M6 -------------------------------------------------- 246 M7 -------------------------------------------------- 246 M8 -------------------------------------------------- 246 M9 -------------------------------------------------- 246 DQ334314 CAAGAATCCCCAAACTAGATTAAACTAAATAGCTAACTGATCCCTATCTT 300 DQ334315 --------------------c----------------------------- 300 M1 -------------------------------------------------- 296 M2 t------------------------------------------------- 296 M3 -------------------------------------------------- 296 M4 -------------------------------------------------- 296 M5 -------------------------------------------------- 296 M6 -------------------------------------------------- 296 M7 -------------------------------------------------- 296 M8 -------------------------------------------------- 296 M9 -------------------------------------------------- 296 DQ334314 CGGTTGGGGCGACCGCGGGAGAAAACAAAGCTCCCACGCAGACTGGGGTT 350 DQ334315 -------------------------------------------------- 350 M1 -------------------------------------------------- 346 M2 -------------------------------------------------- 346 M3 -------------------------------------------------- 346 M4 -------------------------------------------------- 346 M5 -------------------------------------------------- 346 M6 -------------------------------------------------- 346 M7 -------------------------------------------------- 346 M8 -------------------------t------------------------ 346 M9 -------------------------------------------------- 346 DQ334314 ACATCCCTAAAACCAAGAAAGACATCTCTAAGTCACAGAACATCTGACCA 400 DQ334315 -------------------------------------------------- 400 M1 -------------------------------------------------- 396 M2 -------------------------------------------------- 396 M3 -------------------------------------------------- 396 M4 -------------------------------------------------- 396 M5 -------------------------------------------------- 396 M6 -------------------------------------------------- 396 M7 -------------------------------------------------- 396 M8 -------------------------------------------------- 396 M9 -------------------------------------------------- 396 DQ334314 CAAAGATCCGGCCTAACCCGCCGACCAACGGACCAAGTTACCCTAGGGAT 450 DQ334315 -------------------------------------------------- 450 M1 -------------------------------------------------- 446 M2 -------------------------------------------------- 446 M3 -------------------------------------------------- 446 M4 -------------------------------------------------- 446 52 M5 -------------------------------------------------- 446 M6 -------------------------------------------------- 446 M7 ----------------------------------------