Khóa luận Tìm hiểu tuyến trùng ký sinh sâu hại và quy trình công nghệ sản xuất tuyến trùng ký sinh sâu hại

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC KỸ THUẬT CƠNG NGHỆ TP. HCM KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP TÌM HIỂU TUYẾN TRÙNG KÝ SINH SÂU HẠI VÀ QUY TRÌNH CƠNG NGHỆ SẢN XUẤT TUYẾN TRÙNG KÝ SINH SÂU HẠI Ngành: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện : LƯU VĂN THUYẾT MSSV: 207111057 Lớp: 08CSH1 TP. Hồ Chí Minh, 2011 i LỜI CAM ðOAN Em tên là: Lưu Văn Thuyết là sinh viên của trường đại học kỹ thuật cơng nghệ TP. HCM. Em xin cam đoan bài khố luận của Em với đề tài “tìm hiểu tuyến trùng ký sinh sâu hại và quy trình cơng nghệ sản xuất tuyến trùng ký sinh sâu hại”. Hồn tồn được thực hiện dựa trên năng lực của Em. Tuyệt đối khơng sao chép tài liệu của người khác, nội dung và số liệu trong bài của Em là trung thực với những mục cĩ nguồn gốc từ tài liệu tham khảo được trích dẫn rõ ràng cả tên tác giả và đề tài nghiên cứu. Nếu bài khố luận của Em cĩ gì gian dối em xin chịu trách nhiệm hồn tồn. Người thực hiện Lưu Văn Thuyết ii MỤC LỤC Danh mục các bảng viết tắt ............................................................................... v Danh mục các bảng .......................................................................................... vi Danh mục hình ảnh ......................................................................................... vii Lời nĩi đầu ........................................................................................................ 1 CHƯƠNG 1: CƠ SỞ LÝ LUẬN CỦA BIỆN PHÁP SINH HỌC 1.1. Vị trí của biện pháp sinh học trong hệ thống tổng hợp bảo vệ cây trồng .. 2 1.1.1. Biện pháp hố học giữ vị trí quan trọng trong BVTV từ những năm đầu thế của thế kỷ XX ...................................................................... 2 1.1.2. Hạn chế của thuốc hố học và vai trị của biện pháp sinh học trong BVTV vào thập kỷ 80 – 90 thế kỷ XX ..................................................... 3 1.2. ðấu tranh sinh học trong tự nhiên là cơ sở, nền tảng của cơng nghệ sinh học trong BVTV ................................................................................................ 4 1.1.2. Khái niệm về đấu tranh sinh học .................................................... 4 1.2.2. Cơ sở khoa học của đấu tranh sinh học trong bảo vệ thực vật ....... 4 1.2.3. Các nhĩm vi sinh vật cĩ ích trong ðTSH ...................................... 5 CHƯƠNG 2: NHỮNG THÀNH TỰU CƠ BẢN CỦA BIỆN PHÁP ðẤU TRANH SINH HỌC 2.1. Các hướng chính của đấu tranh sinh học ................................................... 6 2.1.1. Nâng cao khả năng hoạt động của các sinh vật cĩ ích ngồi tự nhiên bao gồm .......................................................................................... 6 2.2.2. Nghiên cứu tạo ra các chế phẩm sinh học và các vũ khí sinh học khác để ứng dụng trong phịng trừ các vi sinh vật gây hại bao gồm ........ 6 2.3. Nhĩm chế phẩm ứng dụng cho phịng trừ sâu bệnh tại Việt Nam ............. 7 CHƯƠNG 3: SINH HỌC CỦA TUYẾN TRÙNG 3.1. Giới thiệu về tuyến trùng kí sinh cơn trùng ............................................. 11 iii 3.1.1.khái niệm ....................................................................................... 11 3.1.2. Phân loại ....................................................................................... 11 3.1.3. Phổ ký chủ .................................................................................... 12 3.2. Cơ chế xâm nhập, ký sinh và gây bệnh của tuyến trùng EPN ................. 13 3.2.1. ðặc tính sinh học của tuyến trùng EPN ....................................... 13 3.2.2. Sự xâm nhập vào cơn trùng vật chủ của tuyên trùng ................... 18 3.2.3. Thời gian sinh trưởng và phát triển của tuyến trùng .................... 19 3.3. Quan hệ tương tác giữa tuyến trùng và vi khuẩn cộng sinh .................... 20 3.3.1.Vai trị của tuyến trùng trong tổ hợp ............................................. 20 3.3.2.Vai trị của vi khuẩn cộng sinh trong tổ hợp ................................ 22 3.3.3. Vai trị của tổ hợp chống lại hệ thống bảo vệ của cơn trùng ........ 22 3.3.4. Cơ chế chống lại các vi sinh vật gây bệnh khác ........................... 25 3.4. Sự di chuyển của tuyến trùng EPN .......................................................... 26 3.5. Khả năng sinh sản của một số chủng EPN trong cơn trùng vật chủ ........ 26 3.5.1. Khả năng sinh sản của một chủng EPN trong BSL...................... 27 3.5.2. Tương quan giữa số lượng nhiễm và sản lượng IJs ..................... 28 3.5.3. Khả năng sinh sản của một số chủng EPN trong sâu hại ............. 29 CHƯƠNG 4: CƠNG NGHỆ NHÂN NUƠI TUYẾN TRÙNG 4.1. Lựa chọn cơng nghệ thích hợp ................................................................ 31 4.2. Cơng nghệ nhân nuơi in vivo ................................................................... 33 4.2.1. Xâm nhiễm tuyến trùng vào ấu trùng BSL .................................. 34 4.2.2. Thu hoạch tuyến trùng IJs ............................................................ 35 4.2.3. Chuẩn bị cho bảo quản ................................................................. 37 4.3. Cơng nghệ nhân nuơi in vitro ................................................................... 37 4.3.1. Phân lập VKCS ............................................................................. 38 4.3.2. Chuẩn bị mơi trường nhân nuơi tổ hợp tuyến trùng ..................... 39 4.3.3. Chuẩn bị dụng cụ nhân nuơi ......................................................... 40 iv 4.3.4. Gây nhiễm vi khuẩn ...................................................................... 40 4.3.5. Gây nhiễm tuyến trùng và nhân giống tổ hợp(monoxenic) ......... 41 4.3.6. Thu hoạch IJs ................................................................................ 42 4.3.7. Xử lý sự cố .................................................................................... 42 4.3.8. Bảo quản IJs .................................................................................. 44 CHƯƠNG 5: HIỆU LỰC PHỊNG TRỪ SÂU HẠI CỦA MỘT SỐ CHỦNG EPN 5.1. Cơ sở đánh giá hiệu lực gây chết của các chủng EPN ............................. 46 5.2. Hiệu lực gây chết của một số chủng EPN trong điều kiện phịng thí nghiệm ............................................................................................................. 47 5.2.1. Hiệu lực gây chết sâu hại của chủng S_TK10.............................. 47 5.2.2. Hiệu lực phịng trừ sâu của S-TX1 ............................................... 50 5.2.3. Hiệu lực gây chết của chủng H-MP11 ......................................... 51 5.2.4. Hiệu lực gây chết của chủng H-NT3 ............................................ 53 CHƯƠNG 6: KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 6.1. Kết luận .................................................................................................... 57 6.2. ðề nghị ..................................................................................................... 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 58 v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT BVTV: Bảo vệ thực vật ðTSH: ðấu tranh sinh học VKCS: Vi khuẩn cộng sinh EPN: Entomopathogenic Nematodes BSL: Galleria Mellonella IJs: Infective juveniles H: Heterorhabdititis S: Steinernema vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1: Thời gian sinh trưởng và phát triển của 4 chủng EPN Bảng 3.2: Danh sách các lồi vi khuẩn cộng sinh với EPN Bảng 5.1: Hiệu lực gây chết sâu khoang của chủng S-TK10 Bảng 5.2: Hiệu lực gây chết sâu xanh bướm trắng của chủng S-TK10 Bảng 5.3: Hiệu lực gây chết bọ hung đen của chủng S-TK10 Bảng 5.4: Hiệu lực gây chết sâu xanh của chủng S-TX1 Bảng 5.5: Hiệu lực gây chết sâu xanh của H-MP11 Bảng 5.6: Hiệu lực diệt sâu xanh da láng của H-MP11 Bảng 5.7: Hiệu lực gây chết sâu keo da láng ở chủng H-NT3 Bảng 5.8: Hiệu lực gây nhiễm sâu xám của chủng H-NT3 Bảng 5.9: Hiệu lực gây chết bọ hung đen của chủng H-TN3 vii DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 3.1: Tuyến trùng EPN Hình 3.2: Chu trình xâm nhập và phát triển của EPN Hình 4.1: Ấu trùng BSL Hình 4.2: Nhân nuơi EPN trong bình tam giác Khố luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 1 LỜI MỞ ðẦU Sâu hại luơn là mối đe doạ của nền sản xuất nơng nghiệp. Trong điều kiện nĩng ẩm của Việt Nam, mối nguy hại này càng nặng nề hơn. ðể phịng trừ sâu hại, bảo vệ năng suất cây trồng, trước đây nơng dân chủ yếu dựa vào biện pháp hĩa học. Việc lạm dụng thuốc hĩa học đã gây ra nhiều mối nguy hại cho cho mơi trường và sức khỏe của cộng đồng. Cân bằng sinh thái bị phá vỡ, sâu hại ngày càng kháng lại thuốc, mơi trường đất và nước ơ nhiễm nặng nề nhưng đáng lo ngại hơn là vấn đề tồn lưu thuốc trong sản phẩm nơng nghiệp và động vật ăn chúng gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khoẻ con người. Trước yêu cầu bức thiết đĩ các nhà khoa học đã khơng ngừng nghiên cứu tìm kiếm một phương pháp phịng trừ hiệu quả mà khơng gây nguy hại cho mơi trường và sức khoẻ con người. Chính vì vậy mà phương pháp bảo vệ thực vật bằng biện pháp sinh học đã ra đời. Trong số các tác nhân sinh học dùng trong đấu tranh sinh học thì tuyến trùng được đánh giá cao vì phổ ký chủ rộng, cĩ thể sử dụng phịng trừ nhiều lồi sâu hại. Nhiều nghiên cứu về tuyến trùng đã được tiến hành ở Việt Nam, quy trình cơng nghệ sản xuất tuyến trùng cũng được thử nghiệm. Chế phẩm tuyến trùng cĩ thể hoạt động tốt trên đồng ruộng để phịng trừ sâu hại. Xuất phát từ thực tiễn trên, sinh viên tiến hành “tìm hiểu tuyến trùng ký sinh sâu hại và quy trình cơng nghệ sản xuất tuyến trùng ký sinh sâu hại” nhằm ứng dụng cơng nghệ sinh học để mở rộng chế phẩm này trong sản xuất, bảo vệ cây trồng. Khố luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 2 CHƯƠNG 1: CƠ SỞ LÝ LUẬN CỦA BIỆN PHÁP SINH HỌC 1.1. Vị trí của biện pháp sinh học trong hệ thống tổng hợp bảo vệ cây trồng 1.1.1. Biện pháp hố học giữ vị trí quan trọng trong BVTV từ những năm đầu thế của thế kỷ XX Những năm đầu của thế kỷ XX, ngành hố học trong bảo vệ thực vật đã phát triển với tốc độ nhanh, nhất là sau đại chiến thế giới lần thứ hai, tồn thế giới đã sản xuất ra hơn 15 triệu tấn thuốc hố học để phun trên diện tích hơn 4 tỷ ha cây trồng nơng – lâm nghiệp. Thực tế cho thấy, trên đồng ruộng việc sử dụng hố chất (BVTV) đã giảm hẳn số lượng sâu hại và năng suất, sản lượng nơng nghiệp tăng lên xấp xỉ hai lần. Kết quả này cho thấy chỉ cần cĩ thuốc hố học, con người cĩ thể giải quyết được vấn đề phịng trừ sâu, bệnh hại cây trồng và thời gian đĩ biện pháp hố học giữ vị trí khá quan trọng, gần như là độc tơn trong phịng trừ dịch hại bảo vệ cây trồng. Từ giữa những năm 1950 trở đi, việc sử dụng các loại thuốc trừ sâu hố học đã khơng ngừng được tăng nhanh và phát triển rộng trên mọi đối tượng cây trồng, ở khắp nơi trên thế giới với số lượng ngày càng lớn. Vì vậy, việc sử dụng thuốc hố học phịng trừ sâu, bệnh hại ở nhiều nước đã trở nên lạm dụng, cĩ khi cịn quá tuỳ tiện, rất nhiều nơi chỉ trong một vụ họ đã phun 10 – 12 lần, thậm chí cĩ khi 20 – 24 lần. Sau nhiều năm sử dụng đơn thuần hố chất (BVTV) năng suất cây trồng khơng thể tăng lên được nữa mà bị chững lại và kết quả ngược lại là sâu hại, bênh hại cĩ chiều hướng gia tăng bởi vì chúng đã quen dần với thuốc hố học, thực tế là sâu, bệnh hại cây trồng phát sinh, phát triển ngày một nhiều hơn. chúng đã phá hai cây trồng nhanh hơn và gây thiệt hại đáng kể, cĩ vài lồi sâu hại trước đây chỉ là thứ yếu thì nay lại thành chủ yếu là do chúng đã phát sinh với số lượng lớn, rộng khắp với tồn Khố luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 3 diện tích trồng trọt và phá hại rất mạnh. ðiều đã gây ra những tổn thất và làm mùa màng thiệt hại nghiêm trọng, ảnh hưởng rất lớn đến năng suất và phẩm chất của nơng sản.( Trích dẫn theo Phạm Thị Thuỳ, 2010) 1.1.2. Hạn chế của thuốc hố học và vai trị của biện pháp sinh học trong BVTV vào thập kỷ 80 – 90 thế kỷ XX Do phun thuốc trừ sâu đinh kỳ với liều nồng độ cao nên mơi trường sinh thái chung bị ơ nhiễm trầm trọng, các nơng sản phẩm bị nhiễm độc và ít nhiều cũng để lại dư lượng hố chất trong nơng sản thực phẩm. ðiều tra trên các cây trồng nơng - ngư nghiệp, các nhà khoa học đã phát hiện thấy trên 500 lồi sâu, nhện hại mang tính kháng thuốc, các quần thể con trùng kí sinh, thiên địch cĩ ích như các lồi ăn thịt và bắt mồi tự nhiên đã bị giảm hẳn số lượng. Ong bướm thụ phấn hoa đã bị tiêu diệt khá nhiều, điều này đã gây ảnh hưởng lớn đến năng suất cây trồng, đặt biệt là các lồi con trùng thụ phấn chéo, các lồi giun và cơn trùng trong lớp đất cũng ngày một ít đi rõ rệt, các lồi chim thú ăn sâu cũng dần dần biến mất, cĩ khi bị cạn kiệt. Chính vì vậy, vai trị của các biện pháp sinh học trong đấu tranh sinh học đã được các nhà khoa học trong những năm 80 – 90 của thế kỷ XX đánh giá cao khi mà biện pháp hoa học đã bộc lộ những hạn chế chính như sau : - Thuốc hố học đã tác động lên hệ cơn trùng ký sinh và ăn thịt manh hơn nhiều so với đối tượng sâu hại cần phịng trừ. - Thuốc tích tụ trong các cơ thể động vật, thực vật thơng qua chuỗi mắt xích thức ăn, thuốc cịn đọng lại cả trên đất, nước mà cá, tơm đã ăn phải con người lại ăn cả những lồi cá, tơm trên. Liều lượng thuốc trừ sâu cứ tăng dần nên dẫn đến mơi trường sinh thái ảnh hưởng, sức khoẻ con người bị giảm sút. - Việc sử dụng liên tục một loại thuốc đã gây cho những cá thể bị biến đổi khả năng chụi đựng cao với thuốc trừ sâu làm cho sâu hai nhờn thuốc. Khố luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 4 1.2. ðấu tranh sinh học trong tự nhiên là cơ sở, nền tảng của cơng nghệ sinh học trong BVTV 1.2.1. Khái niệm về đấu tranh sinh học Theo tài liệu của Hồng ðức Nhuận thì cĩ rất nhiều định nghĩa về đấu tranh sinh học, nhưng định nghĩa đơn giản và dễ hiểu hơn cả là :« đấu tranh sinh học là biện pháp sử dụng sinh vật hoặc các sản phẩm của chúng nhằm ngăn chặn, hoặc làm giảm bớt những thiệt hại do các sinh vật hai gây ra ». Sử dụng biện pháp (ðTSH) là vận dụng sự hài hồ những nguyên tắc và biện pháp sinh học phịng trừ sâu, bệnh hại. Trong bảo vệ thực vật nếu biết ứng dụng ðTSH thì hiệu quả phịng trừ cao và hiệu quả được diễn ra liên tục trong thời gian dài, các nhà khoa học thường coi đấu tranh sinh học là sinh thái học ứng dụng. 1.2.2. Cơ sở khoa học của đấu tranh sinh học trong bảo vệ thực vật - Tạo ra mối quan hệ mới khơng thuận lợi cho đối tượng gây hại trên cơ sở vận dụng sáng tạo, nghĩa là đưa vào mơi trường sống của sâu hại một một yếu tố sinh học mới là kẻ thù tự nhiên để phá vỡ điều kiện khơng thuận lợi cho sự phát triển của quần thể sâu hại. Yếu tố sinh học mới đĩ là các lồi ăn thịt, bắt mồi hay ký sinh ong, ruồi và các vi sinh vật gây bệnh con trùng như Bt, Virus. Vi nấm… - Tạo nên hiện tượng nhiều ký sinh cả trong điều kiện tự nhiên cũng như trong nghiên cứu thí nghiệm, dựa trên cơ sở cơn trùng gây hại thường cĩ các lồi sinh vật cĩ ích ký sinh. Bình thường thì chỉ cĩ một lồi ký sinh nhung trong thực tế cũng cĩ những lồi cơn trùng cĩ từ 2 lồi ký sinh trở lên, hiện tượng này được các nhà khoa học gọi nhiều ký sinh. ðiều này dẫn tới sự cạnh tranh thưc ăn trực tiếp giữa các lồi ký sinh, ví dụ như ong Opius sp ký sinh lên ruồi đục quả trong cùng thời gian dẫn đến sự cạnh tranh quyết liệt. Theo (Howard, năm 1911), việc nghiên cứu tác động của hiện tượng nhiều ký sinh Khố luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 5 để tiêu diệt sâu Rĩm đã dẫn đến nhiều lý thuyết tuần tự trong đấu trong sinh học nghĩa là tạo cho mỗi lồi ký sinh tác động vào một giai đoạn phát triển của sâu hại. Hiện nay, hiện tượng nhiều ký sinh tác động cĩ hiêu quả cũng đủ kìm chế khă năng phát triển của sâu hại. - Vai trị của ký sinh và bắt mồi, ăn thịt trong đấu tranh sinh học: Tuỳ điều kiện cụ thể, người ta thường căn cứ vào quan hệ đặc thù giữa sâu hại với kẻ thù tự nhiên mà quyết định sử dụng lồi ký sinh hoặc lồi bắt mồi ăn thịt để phịng trừ trên cơ sở cơng nghệ sinh học. 1.2.3. Các nhĩm vi sinh vật cĩ ích trong ðTSH - Nhĩm bắt mồi ăn thịt như bọ rùa, bọ mắt vàng, kiến vàng, bọ đuơi kìm,... - Nhĩm cơn trùng và nhện ký sinh: ong mắt đỏ, ong ký sinh… - Nhĩm vi sinh vật bao gồm vi khuẩn Bt, Virus (NPV, GV, CPV,...)vì nấm Beauveria, Metarhizum, Nomuraea,tuyến trùng… Ở mỗi nhĩm sinh vật cĩ ích đều phát huy vai trị và tác dụng to lớn trong đấu tranh sinh học, đặc biệt là trong việc phịng trừ các lồi thiên địch hại nguy hiểm trên các cây trồng nơn, lâm nghiệp. (Trích dẫn theo Phạm Thị Thuỳ, 2010) Khố luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 6 CHƯƠNG 2: NHỮNG THÀNH TỰU CƠ BẢN CỦA BIỆN PHÁP ðẤU TRANH SINH HỌC 2.1. Các hướng chính của đấu tranh sinh học: Theo Phạm Thị Thùy (2010, biện pháp đấu tranh sinh học cĩ những hướng chính sau): 2.1.1. Nâng cao khả năng hoạt động của các sinh vật cĩ ích ngồi tự nhiên bao gồm - Xác định thành phần và hiêu quả các lồi cơn trùng ký sinh, ăn thịt cĩ ích và các tác nhân gây bệnh trên cơ thể sinh vật cĩ hại sẵn ngồi tự nhiên, nhằm mục đích duy trì sự xuất hiện của chúng trên đồng ruộng để làm giảm một phần hoặc tiến tới giảm hẳn sự phát triển của thuốc trừ sâu. - Xây dựng cơ cấu cây trồng thích hợp để tạo ra nguồn thức ăn cĩ cơ chế khơng thích hợp với lồi sâu, bệnh hại như gieo trồng các loại cây cĩ khả năng chuyển gen độc, các cây cĩ khả năng miễn dịch, các giống mới cĩ khả năng kháng được sâu hại… - Xác lập các biện pháp canh tác thích hợp để nâng cao hoạt tính của các sinh vật cĩ ích. - Sử dụng các lồi thuốc trừ sâu hố học cĩ ảnh hưởng thấp đối với các quần thể cơn trùng ký sinh, ăn thịt và bắt mồi, cũng như khơng ảnh hưởng tới mơi trường sống cộng đồng. 2.2.2. Nghiên cứu tạo ra các chế phẩm sinh học và các vũ khí sinh học khác để ứng dụng trong phịng trừ các vi sinh vật gây hại bao gồm - Sản xuất và sử dụng rộng rãi các lồi thuốc trừ sâu vi sinh vật: vi khuẩn, virus, vi nấm và các thuốc kháng sinh. Khố luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 7 - Sử dụng các chất cĩ hoạt tính sinh học như các pheromon sinh dục, các hormon sinh trưởng, các chất dẫn dụ ăn uống, các chất gây ngán và các chất xua đuổi cơn trùng… - Sản xuất trên quy mơ cơng nghiệp để phĩng thả các cơn trùng và nhện ký sinh – ăn thịt cĩ ích trên đồng ruộng nhằm hạn chế được quần thể sâu hại. - Phĩng thả các cơn trùng cĩ hại được gây vơ sinh nhằm tạo ra sự cạnh tranh sinh dục với quần thể sâu hại ngồi tự nhiên. - Sử dụng cơn trùng, tuyến trùng và các tác nhân gây bệnh chuyển tính hẹp đã qua kiểm dịch để diệt trừ các lồi cỏ cây hại cho cây trồng. Trong hai hướng trên, hiện nay các nhà khoa học đặc biệc chú ý đến hướng thứ hai, bởi hướng này hầu hết phải dựa trên nền tảng của cơng nghệ sinh học mới cĩ thể phát triển sản xuất ra các loại thuốc trừ sâu sinh học đạt chất lượng cao, mang tính ổn định để sử dụng rộng rãi trong phịng trử dịch hại cây nơng, lâm nghiệp. ðến nay, trên thế giới đã cĩ rất nhiều cơng trình khoa học nghiên cứu về CNSH trong bảo vệ thực vật, nhiều nước đã thu được những kết quả tốt trong quá trình triển khai ứng dụng các chế phẩm sinh học phịng trừ sâu hại, ,bệnh hại.. cỏ dại và chuột hai bảo vệ cây trồng. 2.3. Nhĩm chế phẩm sinh học ứng dụng cho phịng trừ sâu bệnh tại Việt Nam Theo Bộ Nơng nghiệp và PTNT, trong danh mục các loại thuốc BVTV cĩ nguồn gốc sinh học, từ năm 2000 chỉ cĩ 2 sản phẩm trừ sâu sinh học được cơng nhận cho đăng ký. ðến năm 2005 đã cĩ 57 sản phẩm các lọai, đến 6 tháng đầu năm 2007 cĩ 193 sản phẩm được cấp giấy phép đăng ký. Nâng tổng số cĩ 479 sản phẩm sinh học được phép lưu hành, trong đĩ cĩ 300 lọai thuốc trừ sâu và 98 sản phẩm thuốc trừ bệnh. Các sản phẩm này đã gĩp phần khơng nhỏ vào cơng tác phịng trừ dịch hại, gĩp phần thay thế và hạn chế dần nguy Khố luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 8 cơ độc hại do sử dụng thuốc BVTV nguồn gốc hĩa học ảnh hưởng đến sức khỏe con người và gây ơ nhiễm mơi trường. Một số sản phẩm tiêu biểu: + Nguồn gốc thảo mộc: - Các sản phẩm chế biến từ cây Neem hiện nay đã được đưa vào ứng dụng rộng rãi trong cơng tác bảo vệ thực vật, được chiết xuất từ nhân hạt Neem ( Azadirachta indica A. Juss ) cĩ chứa hoạt chất Azadirachtin, cĩ hiệu lực phịng trừ nhiều lồi sâu hại trên cây trồng như lúa, rau màu, cây cơng nghiệp, cây ăn trái, hoa kiểng. Loại thuốc cĩ nguồn gốc thảo mộc này khơng tạo nên tính kháng của dịch hại, khơng ảnh hưởng đến thiên địch và khơng để lại dư lượng trên cây trồng. Thuốc tác động đến cơn trùng gây hại bằng cách gây sự ngán ăn, xua đuổi, ngăn sự lột xác của cơn trùng cũng như ngăn cản sự đẻ trứng là giảm khả năng sinh sản. Các sản phẩm thương mại tương tự từ cây Neem như: Vineem, Neemaza, Neemcide 3000 SP, Neem Cake. - Hoạt chất Rotenone được chiết xuất từ hai lồi cây họ đậu là Derris elliptica Benth và Derris trifoliate, cĩ thể sử dụng như một loại thuốc trừ sâu thảo mộc cĩ tác dụng diệt trừ sâu rầy trên lúa, ốc bươu vàng cũng như các loại cá dữ, cá tạp trong ruộng nuơi tơm. Chế phẩm ðầu trâu Bihopper (hoạt chất Rotenone) đĩng vai trị diệt tuyến trùng và chế phẩm Olicide (Oligo – Sacarit ) đĩng vai trị tăng sức đề kháng bệnh của cây trồng. + Nguồn gốc vi sinh vật - Thuốc trừ sâu cĩ nguồn gốc vi khuẩn BT (Bacilus thuringiensis): phổ diệt sâu rộng và hữu hiệu đối với các lọai sâu như sâu cuốn lá, sâu tơ, sâu xanh, sâu khoang, sâu ăn tạp… Sâu khi ăn phải thuốc sẽ ngừng ăn sau vài giờ và chết sau 1 – 3 ngày. Ở Việt Nam, chế phẩm Bt (Bacillus thuringiensis) đã được nghiên cứu từ năm 1971. Hơn 20 chế phẩm Bt nhập khẩu và nội địa đã cho kết quả tốt trong phịng thí nghiệm và ngồi đồng đối với một số sâu hại chính trên đồng ruộng như sâu xanh bướm trắng, sâu xám, sâu tơ, sâu hại Khố luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 9 bơng, sâu đo. Các lọai sản phẩm thương mại cĩ trên thị trường khá nhiều như Vi-BT 32000WP, 16000WP; BT Xentary 35WDG, Firibiotox P dạng bột; Firibiotox C dạng dịch cơ đặc ... Khoa Nơng nghiệp và sinh học ứng dụng ( ðại học Cần Thơ ) cũng đã nghiên cứu và đưa ra 2 chế phẩm sinh học Biobac và Biosar cĩ khả năng phịng trừ 2 bệnh thường gặp trên lúa là đốm vằn và cháy lá. Chế phẩm Biobac được sản xuất từ một chủng vi khuẩn cĩ sẵn ở địa phương, cĩ khả năng tiêu diệt và ức chế sự phát triển của sợi nấm gây bệnh đốm vằn. Cịn chế phẩm Biosar là sản phẩm được chiết xuất từ một số lồi thực vật, cĩ khả năng kích thích tính kháng bệnh cháy lá lúa (đạo ơn) do nấm Pyricularia gây ra. + Nguồn gốc nấm: ðiều chế từ nấm cĩ sản phẩm thuốc trừ sâu sinh học VIBAMEC với hoạt chất Abamectin được phân lập từ quá trình lên men nấm Steptomyces avermitilis. Diệt trừ được các lọai sâu như sâu vẽ bùa, nhện, sâu tơ, sâu xanh, bọ trĩ, bọ phấn; Ngịai ra cũng trong nhĩm này Vivadamy, Vanicide, Vali… cĩ họat chất là Validamycin A, được chiết xuất từ nấm men Streptomyces hygroscopius var. jingangiesis. ðây là nhĩm thuốc trừ bệnh cĩ nguồn gốc kháng sinh đặc trị các bệnh đốm vằn trên lúa, bệnh nấm hồng trên cao su, bệnh chết rạp cây con trên cà chua, khoai tây, thuốc lá, bơng vải…. - Hai chế phẩm nấm trừ cơn trùng Metarhizium anisopliae và Beauveria bassiana là sản phẩm của đề tài do Viện Lúa đồng bằng sơng Cửu Long thực hiện: Ometar - Metarhizium anisopliae (nấm xanh); Biovip = Beauveria bassiana (nấm trắng). + Nguồn gốc virus: Tiêu biểu là nhĩm sản phẩm chiết xuất từ virus Nucleopolyhedrosisvirus (NPV). ðây là lọai virus cĩ tính rất chuyên biệt, chỉ lây nhiễm và tiêu diệt sâu xanh da láng (Spodoptera exigua) rất hiệu quả trên một số cây trồng như bơng, đậu đỗ, ngơ, hành, nho … Khố luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 10 + Pheromone: Là một nhĩm chế phẩm sinh học cĩ tác dụng dẫn dụ giới tính, được sử dụng rộng rãi trong hệ thống bảo vệ thực vật cây trồng. Với đặc điểm chuyên tính cao với từng lọai sâu hại nên rất an tịan với sản phẩm, sinh vật cĩ ích và mơi trường. Pheromone được dùng như một cơng cụ cĩ hiệu quả Ở Việt nam hiện nay, việc ứng dụng pheromone được tập trung đối với một số cơn trùng sau đây: - Cơn trùng hại rau: Các lọai sâu ăn lá: sâu tơ ( Plutella xylostella) , sâu xanh ( Helicoverpa armigera ), sâu khoang ( Spodoptera litura ) và sâu xanh da láng ( Spodoptera exigua ).. - Cơn trùng hại cây ăn trái: tập trung là chất dẫn dụ ruồi vàng đục trái (Bactrocera dorsalis ). Sản phẩm tiêu biểu là Vizubon – D với họat chất Methyl Eugenol dẫn dụ đối với ruồi đực rất mạnh. Trong sản phẩm cĩ pha trộn thêm chất diệt ruồi Naled. ðối với sâu đục vỏ trái cam quýt (Prays citri) cũng đã được sử dụng pheromone cĩ hoạt chất Z(7)- Tetradecenal. + Nguồn gốc tuyến trùng: Trong các giải pháp sinh học, tuyến trùng EPN (viết tắt tên tiếng Anh Entomopathogenic nematodes của nhĩm tuyến trùng ký sinh và gây bệnh cho cơn trùng) được coi là tác nhân cĩ nhiều triển vọng bởi cĩ khả năng diệt sâu nhanh, phổ diệt sâu rộng, an tồn cho người, động vật và khơng gây khả năng "kháng thuốc" ở sâu hại. Nhĩm các nhà khoa học ở Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Khoa học và Cơng nghệ VN đã điều tra, phân lập nhĩm tuyến trùng EPN - 2 giống Steinernema và Heterorhabditis được coi là Entomopathogenic nematodes (EPN), đưa vào sản xuất thuốc sinh học tuyến trùng. Khố luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 11 CHƯƠNG 3: SINH HỌC CỦA TUYẾN TRÙNG 3.1. Giới thiệu về tuyến trùng kí sinh cơn trùng 3.1.1.khái niệm Tuyến trùng ký sinh gây bệnh cơn trùng (Entomopathogenic nematodes, viết tắt EPN) đã được nhiều nước trên thế giới nghiên cứu và phát triển cơng nghệ để sản xuất chế phẩm sinh học phịng trừ sâu hại cây trồng. Tuyến trùng ký sinh gây bệnh cơn trùng EPN thuộc hai giống Steinernema và Heterohabtidis chúng cộng sinh với vi khuẩn Xenorhadus: Ở heterorhabtidis chúng cộng sinh với Potorhabdus và chuyên ký sinh cơn trùng hại sống trong đất, hoặc những cơn trùng phải qua một phần vịng đời hay một vùng sinh thái trên đất. Khi tiếp cận vật chủ, tuyến trùng thường sâm nhập qua miệng, hậu mơn, lổ thở, tuyến tơ, hoặc nơi cĩ lớp kitin mỏng. Xâm nhập vào vật chủ tuyến trùng giải phĩng ra vi khuẩn cộng sinh, những vi khuẩn này được nhân lên nhanh chĩng và chính những chất độc của chúng là nguyên nhân gây chết cơn trùng trong vịng 48 giờ.(Trích dẫn theo Phạm Thị Thuỳ, ) 3.1.2. Phân loại Trong tự nhiên, nhiều lồi tuyến trùng cĩ mối quan hệ với các lồi cơn trùng ở những mức độ khác nhau. Trong số tuyến trùng ký sinh cơn trùng, nhiều lồi tuyến trùng cĩ thể gây hại cho cơn trùng và trở thành thiên địch của nhiều lồi cơn trùng sâu hại. Nhĩm tuyến trùng ký sinh cơn trùng bao gồm ký sinh tạm thời (facultative) và ký sinh bắt buộc (obligate). Trong số các nhĩm tuyến trùng ký sinh này thì các lồi thuộc giống Heterorhabditis vừa cĩ khả năng ký sinh lại vừa cĩ khả năng gây bệnh và giết chết cơn trùng nên chúng Khố luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 12 được gọi chung là nhĩm tuyến trùng ký sinh gây bệnh cơn trùng (Entomopathogenic Nematodes – EPN). Trong tổng số gần 70 lồi EPN thì cĩ 14 lồi thuộc giống Heterorhabditis được phát hiện và mơ tả thì cĩ 3 lồi cĩ diện phân bố tương đối rộng là H.bacteriophora, H.indica, H.megidis. Các lồi này được tìm thấy ở nhiều vùng khí hậu ơn đới, nhiệt đới và cận nhiệt đới của Châu Á, Châu Âu và Châu Mỹ. Như vậy phần lớn các lồi EPN cĩ diện phân bố rất hẹp. Dựa trên cơ sở phân tích mối quan hệ họ hang và tiến hố của nhiều đại diện tuyến trùng, De Ley & Blaxter, 2002 đã xây dựng hệ thống phân loại tuyến trùng mới, trong đĩ tuyến ký sinh trùng gây bệnh cơn trùng được sắp xếp như sau: Ngành : Nematoda Lớp : Chromadorea Inglis, 1983 Phân lớp : Chromadoria Pearse, 1942 Bộ : Rhabditida Chitwood, 1949 Phân bộ : Rhabditina Chitwood, 1933 Dưới phân bộ : Rhabditomorpha De Ley Blaxter, 2002 Liên họ : Strongyloidea Orley, 1880 Họ : Heterorhabditidae Poinar, 1975 Giống : Heterorhabditis Poinar, 1976 Lồi chuẩn : Heterorhabditis bacteriophora Poinar, 1976 3.1.3. Phổ ký chủ Hoạt động ký sinh gây bệnh của các lồi tuyến trùng thuộc giống Steinernematid và Heterorhabditis đã được chứng minh gây bất lợi cho phổ rộng cơn trùng gây hại trong mơi trường khác nhau. Hỗn hợp tuyến trùng – vi khuẩn giết chết con trùng nhanh chĩng mà khơng cần hình thành mối quan hệ mật thiết, thích nghi cao, mối quan hệ kí chủ - kí sinh đặc trưng cho sự liên Khố luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 13 kết tuyến trùng – cơn trùng. Tỷ lệ tử vong nhanh cho phép tuyến trùng mở rộng phổ kí chủ hầu như ở tất cả các bộ cơn trùng, một phổ hoạt động tốt vượt xa bất kỳ tác nhân nấm gây bệnh cơn trùng nào. Nhưng kiểm tra trong phịng thí nghiệm, S. Carpocapsaae đã tân cơng hơn 250 lồi của hơn 75 họ trong bộ con trùng (Divya và sankar, 2009). Theo Lacey và ctv, (2001) Phổ ký chủ của tuyến trùng EPN gồm: bọ hung , bọ hung đen, sâu đục trái táo, sâu hại rễ mía, sâu xanh, ấu trùng đục gốc nho, sâu dục thân chuối, sâu đục cành và thân cây café , sâu đục thân ngơ, sâu đục thân và cành khoai lang sâu ăn lá, ấu trùng muỗi sốt xuất huyết lồi ve bét. (theo Phạm Thị Mến, 2009). Trong phịng thí nghiệm, hầu hết EPN cĩ thể xâm nhiễm với tất cả các lồi cơn trùng khác nhau, điều kiện mơi trường tối ưu, và khơng bị ngăn cản bởi tác động mơi trường bên ngồi đến quá trình xâm nhiễm. Tuy nhiên ở ngồi đồng ruộng EPN tấn cơng vào phổ kí chủ hẹp hơn so với trong phịng thí nghiệm. Bởi vì tuyến trùng này thích sống trên đất, kí chủ chính là con trùng sống trong đất và hoạt động mạnh trên các lồi thuộc bộ cánh vẩy (dẫn theo Phạm Thị Mến, 2009). Việc phân phân lập lồi giống tuyến trùng thường dựa vào ấu trùng bướm sáp lớn, Galleria mellonella, và do đĩ, phổ kí chủ được biết đến của tuyến trùng đều thiên về những cơn trùng thuộc bộ cách vẩy. Tuy nhiên, nhiều lồi tuyến trùng được phân lập từ xác chết ngồi đồng ruộng thì cĩ phổ kí chủ giới hạn như S. kushidai và S. carabaei thích nghi với ấu trùng bọ hung. S. Scapterosci thích nghi với dế dũi và tấn cơng kèm với những cơn trùng khác, nhưng (Bonifassi và cs 1999) đã chứng minh sự kết hợp của Xenorhabdus dịng UY61 và S. scapterisci dễ dàng tấn cơng G. mellonella (Hazir và cs,2004). 3.2. Cơ chế xâm nhập, ký sinh và gây bệnh của tuyến trùng EPN 3.2.1. ðặc tính sinh học của tuyến trùng EPN Khố luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 14 Mặc dù các tuyến trùng ký sinh gây bệnh cơn trùng thuộc giống Steinernema và Heterorhabdits là những lồi ký sinh bắt buộc ở cơn trùng, nhưng chúng lại cĩ một pha chuyên hố tồn tại bên ngồi vật chủ cơn trùng, thường là mơi trường đất, đĩ là IJs ấu trùng tuổi 3, cịn gọi là ấu trùng xâm nhiễm (infective junveniles), là giai đoạn đặc biệt trong vịng đời phát triển của nhĩm tuyến trùng này. Ở giai đoạn này, chúng khơng cần dinh dưỡng nhưng vẫn cĩ khả năng tồn tại lâu dài trong mơi trường đất khi chưa gặp vật chủ. Thực chất đây là giai đoạn ấu trùng nằm chờ trong đất và sẵn sàng xâm nhập vào vật chủ thích hợp để ký sinh gây bệnh. Mỗi giai đoạn ấu trùng mang trong ruột của chúng một lồi vi khuẩn cộng sinh (VKCS) chuyên hố. ðối với các lồi tuyến trùng Sternernema thì vi khuẩn cộng thuộc giống Xennohabdus, ở IJs phần trước của ruột, phía sau thực quản. Cịn ở IJs của lồi tuyến trùng heterohabditis spp, thì vi khuẩn này khơng tập trung ở phần vỏ bọc của ruột mà chúng nằm rải rác theo chiều dày của ruột. Các VKCS này thường dạng que hoặc dạng ovan dài trong như cái lạp xường kích thước rộng 1-2µm và dài từ 3-5 µm, vì vậy cĩ thể quan sát chúng khá rỏ dưới kính hiển vi quang học dưới độ phĩng đại 1500 lần. Bình thường ở lổ miệng và hậu mơn của IJs ở dạng đĩng kính. ðây là hiện tượng cộng sinh bắt buộc cả tuyến trùng và vi khuẩn khơng cĩ khả năng sống độc lập với nhau trong tự nhiên. Hình 3.1: Tuyến trùng EPN Khố luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 15 Mơt chu kỳ xâm nhập của cơn trùng vào vật chủ và phát triển của tuyến trùng EPN trong xác chết cơn trùng vật chủ bắt đầu từ pha IJs đến pha phát triển ký sinh bên trong cơ thể cơn trùng vật chủ và sau khi kết thúc pha ký sinh lại trở về pha IJs bên ngồi cơn trùng vật chủ. Ấu trùng xâm nhập vào hai tập tính để tiếp cận với cơn trùng: Hầu hết IJs của của các lồi tuyến trùng Heterohabditis và một số lồi của giống sternernema cĩ tập tính săn lùng tìm vật chủ nhờ chúng chúng định hướng và tìm mục tiêu nhanh về phía vất chủ để xâm nhập. Nhĩm cịn lại hầu hết IJs của giống sternernema thì cĩ tập tính phục kích tức là ngồi một chổ trong đất để phục kích , chờ cơn trùng vật chủ đi qua sẻ tiếp nhận và xâm nhập. Khi tìm được vật chủ thích hợp, IJs xâm nhập vào cơ thể cơn trùng qua các lỗ tụ nhiên như miệng, hậu mơn hoặc lổ hở của hậu mơn, mơt số dạng IJs được trang bị mấu bằng kitin cĩ thể đục thủng thành cơ thể cơn trùng tại một nơi xung yếu nào đĩ là ranh giới của các đốt cơ thể để xâm nhập. Sau khi vào cơ thể, IJs nhanh chĩng xâm nhập vào xoang máu, trong 5 giây VKCS được giải phĩng khỏi tuyến trùng qua miệng hoặc qua hậu mơn . Tại đây nhờ mơi trường thích hợp là huyết tương vi khuẩn cộng sinh trong vịng 48h. Giai đoạn đầu trong cơ thể cơn trùng IJs cũng được phát triển nhanh chĩng đạt đến giai đoạn trưởng thành thê hệ 1. Tuyến trùng Steinernema sinh sản theo kiểu phân tính nhờ giao phối giữa đực và cái, trứng con cái được thụ tinh với tinh trùng của con đực. ðiều này cũng cĩ nghĩa là để sinh sản được trong cơ thể cơn trùng vật chủ tuyến trùng cần xâm nhập cả IJs đực và IJs cái, để chúng thâm nhập cả đực và cái trưởng thành cho phép chúng cĩ điều kiện ghép đơi trong vật chủ. Một số nghiên cứu của Gfinfinet at .(2001) cho biết cĩ chủng Steinernema được phân lập ở Indonesea khi nhiễm vào cơn trùng vật chủ cĩ khả năng phát triển thành Khố luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 16 con cái lưỡng tính tự thụ tinh cĩ kích thước lớn. Trong quần thể thế hệ 1 của chúng cũng cĩ con đực nhưng số lượng con đực rất ít. Hình 3.2: Chu trình xâm nhập và phát triển của EPN bên trong cơ thể của cơn trùng vật chủ Ở giai đoạn đầu con cái đẻ trứng vào cơ thể cơn trùng và trứng nở thành ấu trùng tuổi hai, tuy nhiên khi già hơn các con cái này khơng đẻ trứng mà trứng được giữ lại và nở ra ở ấu trùng tuổi hai ngay bên trong cơ thể con cái. Mỗi con cái như thế chứa tới hàng trăm ấu trùng bên trong. Các ấu trùng của thể hệ 1 khơng phát tán ra ngồi mà ở lại bên trong các xác chết cơ thể vật chủ để sử dụng các chất dinh dưỡng chính bằng các mơ của cơn trùng vật chủ để phát triển và đạt đến nhanh chĩng giai đoạn trưởng thành giai đoạn hai. Trong trường hợp xác chết vật chủ vẩn cịn nguồn thức ăn thì chúng vẩn tiếp tục giao phối và phát triển qua thế hệ ba thậm chí thế hệ bốn bên trong cơ thể vật chủ. Cuối cùng chúng dừng lại ở thế hệ hai khi xác chết đã cạn nguồn dinh dưỡng và chúng bắt đầu chui ra bên ngồi và trở thành Khố luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 17 IJs tuổi ba và từ đây chúng bắt đầu cuộc phát triển mới với một cơn trùng vật chủ mới . Theo dõi sự phát triển của tuyến trùng ở Việt Nam steinernema sanggi cho thấy: Một chu kì phát triển của tuyến trùng này ấu trùng BSL là 8-9 ngày, tương đương đến thời gian phát triển của sâu khoang. Khơng giống với steinerma, ở các lồi tuyến trùng Herteroabdits IJs khi xâm nhập vào cơ thể cơn trùng phát triển thành con cái lưỡng tính. Con cái này cĩ khả năng sinh sản ra tinh trùng với trứng và thụ tinh để sinh sản . Từ thế hệ 2 trở về sau IJs mới phát triển thành con trưởng thành phân tích đực cái và sinh sản bằng hình thức giao phối, giai đoạn đầu của con cái cả lưởng tính và phân tính chúng để trứng nhưng ở giai đoạn sau khi con cái về già chúng đẻ trứng thai, lúc này ấu trùng nở ra bên trong cơ thể con mẹ làm nguồn thức ăn để phát triển thành ấu trùng tuổi hai, biến con cái trở thành cái bọc chứa ấu trùng tuổi 2 khi phá vở thành cơ thể con mẹ chui ra ngồi trở thành ấu trùng nhiễm tuổi 3 nhưng chúng vẫn giữ ấu cái võ của ấu trùng tuổi hai. Một chu kì phát triển của tuyến trùng EPN trong cơ thể cơn trùng vật chủ đối với các lồi tuyến trùng giống Steinernema spp, dao động từ 7-10 ngày, cịn đối với các lồi tuyến trùng giống Heterorhabditis spp, từ 12-15 ngày. Như vậy, một chu ky phát triển của tuyến trùng EPN bên trong cơ thể cơn trùng là hồn tồn khác so với một chu kỳ hay một vịng đời phát triển của tuyến trùng. Một vịng đời phát triển của tuyến trùng là chu kỳ khép kìn một thế hệ, cịn một chu kỳ phát triển của EPN bên trong vật chủ cơn trùng cĩ thể gồm một vài thế hệ. Qua mỗi chu kỳ xâm nhập và phát triển như vậy, từ một vài IJs các lồi tuyến trùng Heterorhabditis spp. Và Steinernema spp, cĩ thể sinh sản qua một số thế hệ bên trong xác chết cơn trùng và nhân số lượng chúng lên hàng trăm ngàn IJs mới. ðây là một ưu thế của các lồi tuyến trùng Khố luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 18 EPN trong PTSH sâu hại. Khả năng sinh sản tạo ra số lượng lớn IJs cũng là thế để nhân nuơi sản xuất tuyến trùng, sư dụng cơn trùng làm mơi trường nhân nuơi ( in vivo), sử dụng mơi trường nhân tạo để nhân nuơi (in vitro) sản xuất tuyến trùng ở quy mơ cơng nghiệp. Với cơ chế ký sinh gây bệnh như trên, tuyến trùng khơng những cĩ khả năng tiêu diệt nhanh cơn trùng mà cịn cĩ khả năng sinh sản để nhân nhanh số lượng của chúng sau khi giết chết sâu hại vật chủ và trở thành nguồn thiên địch trên đồng ruộng. Thực tế trong tự nhiên ở đâu cĩ tồn tại EPN thì ở đĩ sâu hại khĩ cĩ khả năng phát triển thành dịch hại được. Sự tồn tại của EPN trong tự nhiên cĩ mối quan hệ chặt chẽ với cơn trùng và các điều kiện mơi trường. Nếu phun nhiều thuốc trừ sâu làm cho sâu hại chết hết thì cũng làm chi nguơng thiên địch tự nhiên EPN của sâu hại khơng cĩ khả năng tồn tại nữa. Nhờ thành cơng trong cơng nghệ nhân nuơi EPN, người ta khơng những chủ động phịng trừ sâu hại mà cồn bổ sung nguồn thiên địch EPN cho đồng ruộng. 3.2.2. Sự xâm nhập vào cơn trùng vật chủ của tuyên trùng Về mặt lý thuyết thì chỉ cần 1 IJs của tuyến trùng xâm nhập vào cơn trùng cũng cĩ thể làm chết vật chủ, mặc dù vậy trong thực tế số lượng IJs vào cơn trùng vật chủ thường nhiều hơn. Do đĩ tỷ lệ xâm nhập cao của IJs vào cơn trùng vật chủ vẫn là yếu tố quan trọng nhất để đánh giá khả năng tấn cơng của một chủng tuyến trùng đối với 1 lồi sâu hại. Mặt khác, đây cũng là chỉ tiêu để đánh giá sự mẫn cảm của một lồi sâu hại đối với một chủng tuyến trùng. Một trong những nguyên nhân cĩ thể cản trở sự xâm nhập của tuyến trùng vào cơ thể vật chủ là cơ chế bảo vệ của cơn trùng . Một số loại cơn trùng cĩ khả năng kháng lại một lượng nhỏ tuyến trùng xâm nhập bằng cơ chế miễn dịch, hoặc bằng cơ chế cơ học với màng lưới bao bọc các lỗ thở. Các cơ chế trên đây cĩ thể ngăn cản tuyến trùng hoặc làm cho tuyến trùng cĩ thể thất Khố luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 19 bại trong nỗ lực xâm nhập và giết chết vật chủ. Mặt khác số chất tiết của cơn trùng vật chủ cũng cĩ khả năng hấp dẫn một số tuyến trùng tìm kiếm, xâm nhập vào cơ thể vật chủ. Khả năng xâm nhập của tuyến trùng càng cao cũng cĩ nghĩa là vật chủ càng mẫn cảm với tuyến trùng và trong trường hợp này cơn trùng vật chủ bị nhiễm độc càng nhanh và bị chết nhanh hơn so với cơn trùng ít mẫn cảm hơn. Ngồi sự, xâm nhập của tuyến trùng vào các phần khác nhau của cơn trùng vật chủ cũng khác nhau phụ thuộc vào chủng tuyến trùng và cơn trùng vật chủ. Vì vậy, ngồi việc đánh giá về số lượng tuyến trùng xâm nhập, tỷ lệ xâm nhập vào các phần khác nhau của cơn trùng cần được xem xét để hiểu rõ ràng về cơ chế và đặc trưng xâm nhập của tuyến trùng đối với cơn trùng đối với cơn trùng vật chủ. Về mặt lý thuyết, IJs cĩ khả năng xâm nhập vào cơ thể cơn trùng vật chủ qua lỗ miệng, hậu mơn, lỗ thở hoặc xuyên qua thành cơ thể tại khớp nối giữa các đốt. Tuy nhiên, tỷ lệ xâm nhập vào các phần cơ thể khác nhau của cơn trùng vật chủ là phân đầu ngực, phần bụng và phần cuối bụng lại khá khác nhau, phụ thuộc vào lồi cơn trùng vật chủ và chủng tuyến trùng ký sinh. So sánh tỷ lệ tuyến trùng xâm nhập vào các phần khác nhau của cơn trùng vật chủ là ấu trùng BSL cho thấy: Trong tổng số IJs cĩ mặt bên trong cơ thể ấu trùng BSL thì chủng tuyến trùng S-TK10 cĩ tỷ lệ IJs xâm nhiễm vào phần đầu ngực nhiều nhất (46,3%), sau đĩ đến phần bụng (41,5%) và phần cuối bụng cĩ tỷ lệ thấp nhất (12,2%). Trong thí nghiệm với chủng S-TX1, cũng cho kết quả tương tự với chủng S-TK10: tỷ lệ 43,2% ở phần đầu + ngực, 41,6% ở phần bụng và 15,2% ở phần cuối bụng. 3.2.3. Thời gian sinh trưởng và phát triển của tuyến trùng Việc nghiên cứu xác đinh thời gian sinh trưởng và phát triển của một chủng tuyến trùng cĩ ý nghĩa quan trọng trong việc xác định thời gian nhân ủ Khố luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 20 tối ưu trong cơng nghệ nhân nuơi in vivo và in vitro để sản xuất sinh khối tuyến trùng. Thời gian sinh trưởng và phát triển của các chuyển tuyến trùng được tác giả Nguyễn Ngọc Châu (2010) cho biết như sau: Bảng.3.1: Thời gian sinh trưởng và phát triển của 4 chủng EPN ( Nhiệt độ: 26,2-29,20C ; độ ẩm: 70-90% ) Thứ tự Chủng EPN Thời gian sinh trưởng phát triển (ngày) Trưởng thành thế hệ 1 Trưởng thành thế hệ 2 Ấu trùng xâm nhiễm mới 1 H.indica MP11 3,5 6,5 9,0 2 H.indica NT3 4,0 7,0 10 3 S. loci TK10 1,5 3,5 4,0 4 S. sangi TK1 2,5 5,0 6,0 3.3. Quan hệ tương tác giữa tuyến trùng và vi khuẩn cộng sinh Do bản chất tự nhiên của các lồi tuyến trùng ký sinh gây bệnh là những tổ hợp cộng sinh giữa tuyến trùng và vi khuẩn, trong đĩ các lồi tuyến trùng giống Steinernema tổ hợp với các lồi vi khuẩn giống Xenorhabdus, cịn các lồi tuyến trùng Heterorhabditis thì tổ hợp với các lồi vi khuẩn giống Photorhabus. Các tổ hợp tuyến trùng của vi khuẩn này cĩ tính chuyển hố khá cao: Mỗi lồi tuyến trùng cĩ thể tổ hợp với một số lồi vi khuẩn, nhưng mỗi loại vi khuẩn chỉ tổ hợp với các lồi tuyến trùng nhất định. 3.3.1.Vai trị của tuyến trùng trong tổ hợp Trong tổ hợp cộng sinh tuyến trùng - vi khuẩn, tuyến trùng EPN cĩ vai trị như sau: - Vector vận chuyển VKCS: một khi đã xâm nhập vào trong cơ thể cơn trùng, tuyến trùng di chuyển thẳng vào xoang máu cơn trùng, tại đĩ vi Khố luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 21 khuẩn cộng sinh trong cơ thể IJs trở nên hoạt động nhanh chĩng được giải phĩng qua hậu mơn tuyến trùng ra xoang máu cơn trùng, vi khuẩn sinh sơi nảy nở một cách nhanh chĩng, đồng thời tiết ra chất độc gây nhiễm xoang máu và giết chết cơn trùng trong vịng 24-48h. - Tuyến trùng bảo vệ vi khuẩn ở 2 mặt : Bảo vệ VKCS ở mơi trường ngồi cơn trùng vật chủ bằng cách để VKCS trong bọc chứa nằm trong ruột chúng do VKCS khơng thể tồn tại trong mơi trường đất, nước. Bảo vệ VKCS ở trong cơ thể cơn trùng. Khi VKCS được giải phĩng từ cơ thể tuyến trùng vào xoang máu cơn trùng, theo phản ứng tự nhiên cơn trùng thường tiết ra một số chất kháng thể (dạng protein) để hạn chế hoặc loại bỏ VKCS. Trong khi đĩ nhờ tuyến trùng cĩ khả năng tiết ra một số chất làm trung hồ và làm mất tác dụng của chất kháng thể. Nhờ vậy, tuyến trùng bảo vệ cho VKCS phát triển bình thường trong cơ thể cơn trùng. Bảng.3.2: Danh sách các lồi vi khuẩn cộng sinh với EPN Các lồi vi khuẩn cộng sinh Các lồi tuyến trùng EPN 1. X. nematophila S. carpocapsae 2. X. bovienlii S. affine, S. Feltiae, S. krausei 3. X poinarii S. cubanum, S. glaseri 4. X beddingii Steinernema sp. 5. X. japonica S. kushudai 6. Xenorhabdus sp S. arenarium, S. Rarum, S. risteri 7. Photorhabus luminescens H. bacteriophora H. brevicaudis 8. P. temperata H. bacteriophora, H. megidis 9. P. asymbiotica Lồi này phân lập từ người 10. Photorhabdus sp H. dawnesi, H. Ponari Khố luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 22 3.3.2.Vai trị của vi khuẩn cộng sinh trong tổ hợp Trong tổ hợp cộng sinh vi khuẩn cĩ vai trị rất lớn đối với tuyến trùng, thể hiện qua các mặt sau: - Sản sinh độc tố giết chết cơn trùng bị nhiễm : ðộc tố do VKCS tiết ra một số protein độc cĩ khả năng nhiễm xoang máu cơn trùng vật chủ và làm cơn trùng vật chủ chết một cách nhanh chĩng trong vịng 24 – 48 giờ. Như vậy, thời gian chết cơn trùng vật chủ khác nhau tuỳ loại tổ hợp tuyến trùng vi khuẩn và cũng phụ thuộc vào loại cơn trùng vật chủ nhưng thường khơng chậm hơn 48 giờ. - Cung cấp nguồn thức ăn cho tuyến trùng: tuyến trùng sử dụng VKCS vừa được giải phĩng từ cơ thể chúng và sinh sơi trong xoang máu cơn trùng như nguồn dinh dưỡng của chúng. Nhờ đĩ mà IJs cũng nhanh chĩng phát triển sang tuổi 4 và đạt đến tuổi trưởng thành. Từ thế hệ 2 tuyến trùng chuyển sang dinh dưỡng hoạt hố xác chết cơn trùng: Nhờ các enzyme do vi khuẩn sinh ra mà các mơ cơ thể cơn trùng trở thành nguồn thức ăn thích hợp cho tuyến trùng. Từ đĩ thế hệ 2 tuyến trùng tiếp tục phát triển, sinh sơi các thế hệ tiếp theo. Thơng thường trong cơ thể cơn trùng, tuyến trùng cĩ thể phát triển 2 đến 4 thế hệ, phụ thuộc vào sinh khối cơn trùng làm nguồn thức ăn cho chúng. Ngăn cản các vi khuẩn khác xâm nhập vào xác chết cơn trùng: VKCS cĩ khả năng sinh ra các hoạt chất kháng sinh để ngăn cản tác nhân sinh học khác như nấm, vi khuẩn xâm nhập và phát triển trên xác cơn trùng. Nhờ vậy mà chúng bảo vệ nguyên vẹn nguồn thức ăn giành cho tuyến trùng cộng sinh của chúng. Như vậy cĩ thể nĩi đây là một trong những mơ hình cộng sinh tuyệt vời và hồn hảo giữa hai lồi vi sinh vật trong tự nhiên. Mơ hình cộng sinh này vừa chuyển hố cao đến mức sự tồn tại của lồi này bắt buộc phải cĩ sự hiện diện và cộng sinh của lồi kia và ngược lại. 3.3.3. Vai trị của tổ hợp chống lại hệ thống bảo vệ của cơn trùng Khố luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 23 ðể phá huỷ cấu trúc ngăn trở các tác nhân gây bệnh hiệu quả cần phải chống lại cơ chế miễn dịch của cơn trùng vật chủ. Một vài cách thức đối phĩ với hệ miễn dịch đĩ là: Sự kháng chịu với cơ chế bảo vệ của vật chủ, phá huỷ hệ thống nhận biết và phản ứng của vật chủ.( Akhurst & Dunphy, 1993) Trong trường hợp một số lồi tuyến trùng và vi khuẩn khơng phải là cộng sinh của nhau thì chúng thường mẫn cảm với các cơ chế bảo vệ của cơn trùng. Một trong những cơ chế của một số cơn trùng hai cách cĩ giai đoạn ấu trùng sống trong mơi trường nước là tao ra thể dịch tức thời bao bọc tuyến trùng trong một nang bọc polyphenol/protein (Dunphy & thurston, 1990). Tuy nhiên phản ứng nang bọc này cũng khơng bảo vệ được sự chết của Aedis spp. Và Culex restuans ngay cả khi tuyến trùng bị mang bọc do VKCS X. nematophilus được nhanh chĩng giải phĩng từ tuyến trùng trước khi bị mang bọc và vi khuẩn đã kịp thời phát triển mà khơng ảnh hưởng bởi phản ứng bảo vệ - chúng đã kịp sản sinh và giết chết vật chủ muỗi này (Welch & Bronkill,1962) Vi khuẩn cộng sinh tạo ra các độc tố giết cơn trùng Mỗi tổ hợp tuyến trùng vi khuẩn cĩ thể tiêu diệt một phổ khá lớn các lồi cơn trùng vật chủ do chúng cĩ khả năng vượt qua các hệ thống bảo vệ của cơn trùng và sản xuất các chất độc tố (toxin) để giết cơn trùng bị nhiễm. Cũng giống như các vi khuẩn gram âm khác các lồi Xenorhabdus spp. Và Photorhabdus spp cĩ khả năng sản sinh ra nội độc tố. Nội độc tố do X. poinarii sinh ra là các hợp chất lipopolisacharide của thành tế bào các chất này gây độc đối với huyết cầu (haemocytes) của cơn trùng (Dunphy &Webster, 1988). Tuy nhiên hiện tại vẫn chưa rõ ràng là chỉ một mình nội độc tố cĩ hiệu lực giết chết cơn trùng vật chủ hay cịn nhiều yếu tố nào khác nữa. Sự gây nhiễm huyết cầu vật chủ cho phép Xenorhabdus nhân nhanh số lượng và sản sinh ra ngoại độc tố (exotoxin), các ngoại độc tố được chứng Khố luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 24 minh trong P. Luminescens (Bowen et,al,.1988,) X. Nematiphilus và X. Bovienii bằng cách tiêm các chất vào phù nổi của dịch nuơi cấy vi khuẩn vảo cơ thể cơn trùng thì cơn trùng chết nhanh chĩng. Mặc dù các vi khuẩn này sản sinh ra các enzyme ngồi tế bào, các chất này được xem như proteases, phospholipase và lipases ở các vi khuẩn khác, các enzyme này chưa được chứng minh nhưng cĩ tác nhân hoạt hố trong việc gây độc của Xenorhabdus đối với cơn trùng. Tuy nhiên, Eisign et al.(1990) đã ghi nhận được một protein ngoại bào ở X. Luminescens là hoạt đơc tố cao khi tiêm vào ấu trùng tuổi 5 của Manduca sexta đã giết chết trong 24 giờ. Bản chất và cơ chế tác dụng của độc tố này cịn chưa được xác định rõ, nhưng chắc chắn độc tố này khơng phải là proteases cũng khơng phải là phospholipase. Vi khuẩn cộng sinh kích hoạt sự sinh sản của tuyến trùng Mặc dù các lồi Steinernema spp, cĩ thể được nhân nuơi đơn giá thể (axenic - chỉ một mình tuyến trùng) bằng mơi trường nhân tạo (in vitro), nhưng chắc chắn chúng khơng thể sinh sản trong cơ thể cơn trùng mà khơng cần sự cĩ mặt của vi khuẩn cộng sinh. Các thí nghiệm của Ponar & Thomas (1966) và Boemare et al (1983) đã cho thấy khi cho nhiễm tuyến trùng S. carpocapsae sinh ra bằng sinh sản đơn giản (axenic) vào cơ thể cơn trùng vật chủ BSL thì tuyến trùng vẫn đạt đến tuổi trưởng thành nhưng khơng sinh sản được. Tuy nhiên, cũng tuyến trùng này nhưng cho nhiễm vào cơ thể cơn trùng vật chủ BSL kết hợp cùng với một số lồi vi khuẩn như Enterobacter aglomerans, Serratia liquefaciens, pseudomonas jlurescens hoặc VKCS của chúng, X .nematophilus thì tuyến trùng cĩ thể sinh sản. Kết quả tương tự cũng đạt được đối với lồi Steinernema khác như S. glaseri và S. feltiae. Mặt dù, về thực chất, VKCS khơng phải là yếu tố cần thiết cho sự sinh sản của tuyến trùng, nhưng nhìn chung chúng rất cần thiết đối với các lồi khác trong sinh Khố luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 25 sản in vivo và in vitro.(boemare et al., 1983: Akhurst, 1983; Dunphy et al 1985; Han et al., 1990). 3.3.4. Cơ chế chống lại các vi sinh vật gây bệnh khác Cĩ một cơ chế bảo vệ khác chống lại vi sinh vật ngoại đa gĩp phần làm cho hệ huyết tương của vật chủ sẽ khơng bị nhiễm các vi khuẩn gây bệnh khác khi tuyến trùng xâm nhập vào cơn trùng vật chủ và giải phĩng VKCS của chúng. ðiều này cũng cĩ nghĩa là các huyết cầu của cơn trùng vật chủ sẵn sàng phá huỷ các vi khuẩn nhiễm bệnh khác, trong đĩ cĩ các vi khuẩn bám trên bề mặt của tuyến trùng và theo tuyến trùng xâm nhập vào xoang máu hoặc chúng cũng cĩ thể xâm nhậm khi tuyến trùng đâm thủng ruột cơn trùng. Một khi huyết cầu bị phá huỷ bằng Xenorhabdus một cơ thể khác chống lại sự nhiễm thứ cấp của vi sinh vật từ ruột hoặc từ mơi trường đất vào xác chết cơn trùng. Các lồi Xenorhabdus spp. Cĩ 2 cơ chế đối với hồn cảnh này: Các chất kháng sinh ngăn cản sự phát triển trên một phổ rộng của vi khuẩn và nấm ngoại biên xâm nhập (Dutky, 1974; Akhurst, 1982) và các chất baterioxin và các thực khuẩn bào (bacteriophages) ngăn cản các lồi Xenorhabdus khác. Một số hợp chất kháng khuẩn được xác định từ Xenorhabdus spp. (Paul et al.,1981; Mclnerney et al,. 1990a,b). Mỗi một chủng VKCS sản xuất mơt vài thành phần của một nhĩm và ít nhất một chủng sản xuất hai nhĩm kháng khuẩn này khơng duy trì trong điều kiện monoxenic trong xác chết cơn trùng một cách vơ hạn định, nhưng chúng thường giữ được hiệu lực trong pha giới hạn của sự sinh sản. Một số tác giả đưa ra giả thuyết rằng hiện tượng hình quan sinh học do VKCS của tuyến trùng Heterorhabditis spp tạo ra đã giúp xác chết cơn trùng được bảo vệ trong mơi trường đất. Phản ứng tạo hình quang sinh học đạt tới đỉnh điểm trong khi tuyến trùng đang sinh sản và cĩ thể chống chọi với sự phá vỡ xác chết. Các Khố luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 26 sinh vật hoại sinh sống ẩn trong đất thường sợ ánh sáng và do đĩ bị khước từ bởi xác chết huỳnh quang. 3.4. Sự di chuyển của tuyến trùng EPN Khả năng di chuyển của tuyến trùng được coi là chỉ tiêu cơ bản của tuyến trùng trong việc tuyển chọn các chủng cĩ tiềm năng sử dụng trong PTSH sâu hại. Khả năng tồn tại cũng như khả năng tìm diệt cơn trùng vật chủ trong mơi trường tự nhiên. Một chủng tuyến trùng khơng cĩ khả năng di chuyển tốt nếu được phun rải để phịng trừ sâu hại trong đất thì chúng sẽ nhanh chĩng bị khơ, cĩ thể bị chết và khả năng diệt các lồi sâu hại trong đất cũng bị hạn chế. Khả năng vận động và di chuyển của tuyến trùng rất khác nhau phụ thuộc các chủng/lồi tuyến trùng khác nhau. Trong mơi trường tự nhiên, tuyến trùng di chuyển theo nhiều hướng, nhưng chúng thường định hướng theo phía cơn trùng vật chủ. Hàng loạt các thử nghiệm đã được tiến hành để nghiên cứu sự di chuyển chủ động cũng như bị động của tuyến trùng (Epsky & Capinera, 1988 ; kaya1990 Nguyen & smart, 1990). Cịn sự di chuyển thụ đơng của EPN cĩ thể do các yếu tố tự nhiên như mưa, giĩ, đất, do con người hoặc do cơn trùng vv…Sự di chuyển chủ động của tuyến trùng chỉ cĩ thể sẩy ra trong khoảng cách rất ngắn, cĩ thể tính được 4 – 90cm từ vị trí ban đầu, trong sự di chuyển thụ động cĩ thể tính đến đơn vị km (Smart & Nguyen, 1994). Nhìn chung, bình thường thì chỉ cĩ một phần nhỏ tuyến trùng là di chuyển chủ động, cịn hầu hết là di chuyển thụ động nhờ yếu tố mơi trường. 3.5. Khả năng sinh sản của một số chủng EPN trong cơn trùng vật chủ Khả năng sinh sản của tuyến trùng là yếu tố quyết định đến sản xuất sinh khối chế phẩm sinh học tuyến trùng. Một trong những ưu thế của tuyến trùng trong phịng trừ sâu hại là khả năng sinh sản của chúng rất cao và chúng cĩ khả năng sản xuất sinh khối lớn bằng vật liệu cơn trùng sống (in vivo) hoặc Khố luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 27 bằng mơi trường nhân tạo (in vitro). Khi xâm nhập vào cơ thể cơn trùng vật chủ từ một vài IJs ban đầu chúng cĩ thể sinh sản qua một vài thế hệ làm tăng số lượng lên đến hàng trăm ngàn cá thể. Một số thí nghiệm ở nước ngồi đã xác định khă năng sinh sản của tuyến trùng S. feltiae trên một vật chủ BSL là 200 x 103 IJs và các lồi H. bacteriophora là 350 x 103 IJs (Wouts, 1991). Tuy nhiên, sản lượng sinh sản trung bình của hầu hết các lồi tuyến trùng khác thì lượng nhỏ hơn khá nhiều, khoảng 30 x 103 đến 50 x 103 IJs của tuyến trùng từ một vật chủ ấu trùng BSL (Wouts, 1991). 3.5.1. Khả năng sinh sản của một chủng EPN trong BSL Sinh sản của Steinernema TK10 và Steinernema TX1 Thí nghiệm xác định khả năng sinh sản của các chủng tuyến trùng bản địa thơng qua việc xác định thời gian phát tán của IJs và số lượng IJs thu được qua từng ngày của các chủng tuyến trùng cho thấy sự khác nhau khá lớn giữa 2 chủng tuyến trùng Steinerema và đặc biệt giữa các chủng Steinernema so với các chủng Heterorhabditis. ðối với chủng tuyến trùng S-TK10, IJs phát tán ra trong khoảng thời gian rất ngắn chỉ trong 4 ngày. Số lượng thu được cao nhất trong ngày đầu tiên là 15,2 x 103 IJs. Số lượng này giảm một nửa chỉ cịn 7,4 x 103 IJs ở ngày thứ 2 và 4.4 x 103 ở ngày thứ 3. Cuối cùng kết thúc ở ngày thứ 4 và thu được thấp nhất ở ngày thứ 4 và thu được thấp nhất chỉ cịn 1,9 x 103 IJs. Sự sinh sản của Heterorhabditis MP11 và Heterorhabdtitis NT3 Với chủng tuyến trùng H-MP11 thời gian phát tán ra ngồi xác chết BSL của IJs là 4 ngày, Bằng với thời gian phát tán của chủng tuyến trùng S- TK10. Tuy nhiên, số lượng IJs phát tán và thu được là khá lớn 53,3 x 103. ðến ngày thứ 2 tăng lên gấp 2 lần 82,4 x 103 IJs cao nhất trong 4 ngày. Sau đĩ số lượng giảm xuống rất nhanh 19,1 x 103 ở ngày thứ 3 và kết thúc ở ngày thứ 4 thu được 7,0 x 103 IJs. Khố luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 28 Như vậy thời gian phát tán của chủng H-MP11 ngắn hơn và số lượng IJs thu được cũng tập trung hơn so với các chủng tuyến trùng Steinernema ở trên. Tính chất phát tán của IJs như vậy được coi như một đặc tính ưu việt của các chủng heterorhabditis nĩi chung và H-MP11 nĩi riêng trong việc sản xuất tuyến trùng bằng nhân nuơi in vivo. Sự phát tán của IJs tập trung trong một thời gian ngắn khơng những tạo ra IJs tập trung trong một thời gian ngắn khơng những tạo ra IJs đồng thời đều về chất lượng mà cịn cho phép xử lý bảo quản IJs tốt hơn. 3.5.2. Tương quan giữa số lượng nhiễm và sản lượng IJs Ngồi yếu tố sự mẫn cảm của cơn trùng vật chủ đối với chủng EPN, thì sản lượng IJs của một chủng EPN cịn phụ thuộc khá lớn vào nồng độ IJs gây nhiễm ban đầu của chủng đĩ đối với cơn trùng vật chủ. Nĩi cách khác, sản lượng IJs của một chủng tuyến trùng luơn cĩ tương quan chặt chẽ với nồng độ gây nhiễm ban đầu. Số liệu thí nghiệm về sự tương quan giữa số lượng gây nhiễm ban đầu và sản lượng IJs thu được đối với chủng S- TK10 trên ấu trùng BSL cho thấy: Ở nồng độ gây nhiễm 10 IJs cĩ sản lượng IJs thấp nhất là 12,1 x 103 IJs. Khi số lượng IJs gây nhiễm tăng lên thì sản lượng IJs cũng tăng lên và đạt giá trị trung bình cao nhất là 34.4 x 103 IJs/BSL. Sản lượng cao nhất trong thí nghiệm này là 40.4 x 103 IJs ở cơng thức gây nhiễm ban đầu 70 IJs. Vượt qua số lượng gây nhiễm này ở các cơng thức gây nhiễm cao hơn là 80, 90, 100IJs thì sản lượng IJs lại cĩ xu hướng giảm dần và sản lượng trung bình chỉ đạt 22.8 x 103 IJs ở số lượng gây nhiễm ban đầu 100 IJs. Trong thí nghiệm với chủng S-TX1, với 10 cơng thức nồng độ gây nhiễm, thấp nhất 10 đến cao nhất là 100 IJs cũng cho kết quả tương tự như thí nghiệm trên với chủng S-TK10. Ở cơng thức gây nhiễm với số lượng 10, 20, Khố luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 29 30 IJs, thì sản lượng IJs chỉ đạt từ 33.4 x 103 – 37,1 x 103 IJs/BSL. Ở các cơng thức gây nhiễm cao hơn, từ 40-70 IJs thì sản lượng thu được đều cao hơn 50,0 x 103 IJs. Sản lượng cao nhất trong thí nghiệm này là 66,6 x 103 IJs / BSL. Khi số lượng IJs gây nhiễm ban đầu tăng lên mức này thì sản lượng thu được cĩ xu hướng giảm dần. Rõ ràng trong cùng một điều kiện thí nghiệm với các cơng thức số lượng gây nhiễm giống nhau, nhưng chủng S-TX1 cĩ sản lượng IJs thu được từ một BSL cao hơn hẳn (gần gấp đơi) so với sản lượng IJs của chủng S-TK10 trong thí nghiệm trên đây, ðiều này cho thấy khả năng sinh sản của tuyến trùng EPN ngồi yếu tố cơn trùng vật chủ và số lượng gây nhiễm ban đầu thì yếu tố nội tại, tức là bản chất di truyền của mỗi EPN cĩ ý nghĩa rất lớn. 3.5.3. Khả năng sinh sản của một số chủng EPN trong sâu hại Khả năng sinh sản của một số chủng tuyến trùng bản địa Việt Nam cịn được thí nghiệm trên đối tượng sâu xanh (Helicopverpa armigera). ðây là đối tượng hại khá phổ biến đối với các vùng trồng thuốc là. Ấu trùng tuổi 3 đến 5 của sâu xanh thuộc loại đối tượng lớn, với sinh khối bằng hoặc lớn hơn so với ấu trùng BSL. Sinh sản của chủng D-TX1 trên sâu xanh Thí nghiệm đánh giá khả năng sinh sản của chủng tuyến trùng của S- TX1 trên sâu xanh cho thấy ở số lượng ban đầu 10 IJs, sản lượng IJs thu được chỉ là 28,0 x 103 IJs. Sau đĩ sản lượng thu được tăng lên 36,7 x 103 IJs và 40,3 x 103 ở số lượng 20 và 30 IJs ban đầu. Sản lượng thu được cao nhất là 83.3 x 103 IJs/sâu xanh ở số lượng 40 IJs ban đầu. Số lượng IJs ban đầu được tăng lên tiếp tục từ 50 đến 100 IJs trong khi đĩ sản lượng lại giảm dần từ 59,6 x 103 (50 IJs ban đầu) xuống cịn 41,3 x 103 (100 IJs ban đầu). sinh sản của chủng H-MP11 trên sâu xanh Khố luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 30 ðối với chủng H-MP11, khả năng sinh sản sâu xanh thực nghiệm cho thấy sản lượng IJs thu được trung bình 54,0 x 103 IJs ở số lượng gây nhiễm ban đầu 10 IJs, tăng lên đến 158,7 x 103 ở số lượng gây nhiễm 50 IJs. Sản lượng cao nhất là 293 x 103 IJs/sâu xanh. Trung bình cao nhất là 213,7 x 103 IJs/sâu xanh ở số lượng 80 IJs ban đầu. Sau đĩ ở số lượng gây nhiễm 100 IJs, sản lượng thu được lại giảm cịn 168 x 103 IJs. Dựa trên số liệu thực nghiệm, qua phân tích hàm bậc hai, sản lượng của chủng H-MP11 trên sâu xanh se đạt cao nhất ở số lượng gây nhiễm ban đầu khoảng 110 IJs, các số lượng IJs khác càng xa giá trị tối ưu này sản lượng IJs sinh ra sẽ càng giảm đi. Khả năng sinh sản tốt của tuyến trùng trên các lồi sâu hại cũng cho biết tuyến trùng cĩ thể nhân nuơi in vivo trên các lồi sâu hại khác khơng phải là cơn trùng mồi BSL. Ngồi ra nĩ cịn cho thấy khả năng duy trì sự sinh trưởng phát triển cua tuyến trùng lần đầu. ðây là một ưu thế của tuyến trùng khi sử dụng phịng trừ sâu hại ngồi thực tế, nĩ giúp cho hiệu quả phịng trừ sâu hại của tuyến trùng kéo dài cĩ thể đến 1 năm sau đĩ (Mracek & Webster, 1993) Kết quả thử nghiệm đánh giá khả năng sinh sản của 4 chủng tuyến trùng trên đây trong cơ thể sâu xanh cũng gần giống với kết quả thử nghiệm về khả năng sinh sản của chủng trên BSL, chỉ khác là ở mức độ về sản lượng thu được ở đều lớn hơn một cách tương ứng so với sản lượng thu được BSL do sinh khối của sâu xanh lớn hơn sinh khối của BSL. Kết quả này thêm một lần nữa cho thấy khả năng sinh sản của các chủng tuyến trùng bản địa là những chủng đáp ứng về mặt độc tố cũng như sinh sản trong cơ thể vật chủ. ðây cũng là những tiêu chí quan trọng khi xem xét việc sử dụng một chủng tuyến trùng cho phịng trừ sâu hại ngồi đồng ruộng. Khố luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 31 CHƯƠNG 4: CƠNG NGHỆ NHÂN NUƠI TUYẾN TRÙNG Ở Việt Nam Ngọc Châu là tác giả của nhiều cơng trình nghiên cứu và đã sản xuất thành cơng chế phẩm EPN trừ sâu hại. Sau đây là quy trình cơng nghệ sản xuất tuyến trùng EPN của tác giả (Nguyễn Ngọc Châu, 2008) 4.1. Lựa chọn cơng nghệ thích hợp Hiện nay trên thế giới đã phát triển 2 hệ thống cơng nghệ nhân nuơi sản xuất tuyến trùng là nhân nuơi in vivo và nhân nuơi in vitro hai cơng nghệ này khác nhau chủ yếu bởi nguồn vật liệu nhân nuơi: vật liệu tự nhiên và vất liệu nhân tạo. Nhân nuơi invivo trên cơ sở sử dụng vật liệu nhân nuơi là cơn trùng sống. Một trong những nguồn cơng nghệ in vivo là ấu trùng tuổi 4 của BSL, một loại vật liệu cĩ sẵn, dễ sản xuất và khá mẫn cảm với các chủng tuyến trùng EPN. Nhân nuơi in vitro trên cơ sở sử dụng nguồn vật liệu nhân nuơi nhân tạo. Trong cơng nghệ này cĩ thể sử dụng hai loại mơi trường, mơi trường nhân nuơi đăc biệt và mơi trường lỏng sản xuất bởi vật liệu khác nhau. Mơi trường nhân nuơi đặc biệt sử dụng tạng động vật làm vật liệu. Một số nội tạng như tim, thận, cĩ thể để nguyên gây nhiễm khơng cần xoay nhuyễn chế biến thành bột nhão. Ngồi ra cịn tận dụng cả gia cầm để chế biến thành dạng bột nhão gọi là chicken offal để nhân nuơi tuyến trùng. ðối với mơi trường nhân nuơi lỏng thường ở dạng dung dịch được phối chế từ các vật liệu dạng lỏng chủ yếu là dầu ăn, dịch men, cholesterol và một số muối khống như: Nacl, Mgso4 , Cacl2 và KCl. Mỗi loại mơi trường sử dụng các thiết bị nhân nuơi khác nhau: nhân nuơi in vivo chủ yếu sử dụng các đĩa petri lớn. nhân nuơi in vitro được sử dụng các Khố luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 32 thiết bị đo khác nhau: bình tam giác miệng rộng , hộp nhựa nylon chịu nhiệt ( đối với mơi trường offal chicken) Tuỳ theo điều kiện cụ thể và mục đích nhân nuơi khác nhau mà cĩ cách sử dụng mơi trường khác nhau Sơ đồ phát triển cơng nghệ Sản xuất chế phẩm sinh học EPN dù theo cơng nghệ in vivo và in vitro cũng bao gồm 5 cơng đoạn chủ yếu như sau: - Sản xuất vật liệu ban đầu là nguồn IJS - Gây nhiễm trùng nhân nuơi - Nhân ủ để tuyến trùng sinh sơi phát triển Ấu trùng In vitro In vivo Gây nhiễm Mơi trường nhân Nhân ủ 12-14 ngày(in vivo) Thu hoạch IJs Xử lý sạch-Phối chế ðĩng gĩi bảo quản Vật liệu ban đầu IJs Khố luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 33 - Thu hoạch tuyến trùng - xử lý làm sạch tuyến trùng Ngồi ra tuỳ mục đích kinh doanh sử dụng hay cần bảo quản vận chuyển đi xa mà cĩ thể cĩ 2 cơng đoạn sau: - Phối chế tuyến trùng - ðĩng gĩi bảo quản tuyến trùng Về nguyên tắc 5 cơng đoạn trên khá giơng nhau về quy trình cơng nghệ, nhưng hai cơng đoạn sau thì cĩ thể khác nhau và cĩ thể là bí quyết của các cơng ty sản xuất chế phẩm sinh học EPN 4.2. Cơng nghệ nhân nuơi in vivo Do khả năng xâm nhiểm và sinh sản của các lồi tuyến trùng Steinernema và Heterohabditis trong vật chủ cơn trùng và đặc biệt là do phổ kí sinh của chúng đối với cơn trùng rất rộng, cĩ thể sử dụng nhiều loại cơn trùng làm vật liệu nhân nuơi, sản xuát tuyến trùng. Trong số cơn trùng vật chủ được sử dụng làm sản xuất tuyến trùng EPN thì ấu trùng bướm sáp lớn – BSL được coi là cơn trùng khá lý tưởng để làm vật liệu nuơi đối với hầu hết các lồi tuyến trùng EPN. BSL là cơn trùng khá mẫn cảm với hầu hết các lồi và chủng lồi tuyến trùng EPN và là mơi trường lý tưởng cho tuyến trùng sinh sản. lồi cơn trùng này sẳn cĩ và dể nuơi bằng vật liệu tự nhiên là sáp ơng hoặc vật liệu nhân tạo. Một ấu trùng bướm sáp lớn cĩ thể cho thu hoạch tới 200000 IJS của S.feltiae và của H. bacteriophora. Tuy nhiên số lượng IJS được sản xuất trên một ấu trùng bướm sáp lớn phụ thuộc vào chủng lồi tuyến trùng và mật độ gây nhiểm ban đầu. các chủng lồi tuyến trùng EPN cĩ kích thước IJs nhỏ như ở hầu hết các lồi Heterohabditis thì sản lượng lơn ngược lại kích thước lớn như ở hầu hết các lồi steinerma thì sản lượng thường nhỏ. Thơng thường đối với các chủng / lồi tuyến trùng Steinerma thì sản lượng nhỏ hơn rất nhiều thường chỉ đạt từ Khố luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 34 30000 – 50000 IJS. Quy trình sản xuất invivo chủ yếu tham khảo theo phương pháp Poinar (1979) với hàng loạt các thay đổi khác nhau. Quy trình sản xuất chế phẩm sinh học EPN bằng in vivo trên cơ sở sử dụng ấu trùng tuổi 5 của BSL làm vật liệu nhân nuơi , gồm các bước như sau: i)nhân nuơi sản xuất ấu trùng BSL ; ii)gây nhiễm IJS cho BSL và nhân ủ trong 12-14 ngày ; iii)thu hoặch IJS bằng kỹ thuật bẫy nước phối chế bảo quản IJs. Cơng nghệ nhân nuơi in vivo khá đơn giản , khơng cần đầu tư lờn, vì vậy cĩ áp dụng quy mơ hộ gia đình, các trang trại hoặc các đơn vị sản xuất nhỏ. Tuy nhiên cơng nghệ này cĩ nhược điểm là năng xuất thấp, chất lượng khơng ổn định và đặc biệt là tơn nhiều cơng lao động nên giá thành cao. Trước khi nhân nuơi sản xuất in vivo tuyến trùng cần tạo vật liệu nguồn ấu trùng BSL. Quy trình nhân nuơi và sản xuất BSL được trình bài ở phần sau. 4.2.1. Xâm nhiễm tuyến trùng vào ấu trùng BSL Tuyến trùng xâm nhiễm IJs thường được bảo quản lạnh từ 12 – 14oC trước khi xâm nhiễm nên để IJs ấm dần lên đến nhiệt độ phịng (20-240C). kiểm tra tuyến trùng dưới kình hiển vi soi nổi. Tuyến trùng cịn sống tốt sẽ chuyển động. Lấy 1ml tuyến trùng và pha trong một lượng nước xác định sao cho cĩ nồng độ tuyến trùng đạt 200IJS/ml. ðếm số lượng IJs bằng hợp đếm dưới kính hiển vi soi nổi để biết chính xác mật độ IJs và trên cơ sở đĩ điều chỉnh nồng độ tuyến trùng đạt 200IJS/ml bằng thêm hay bớt một lượng nước hợp lý để đạt được nồng độ trên. Khi cĩ được nồng độ mong muốn thì hút từng ml dung dịch chứa tuyến trùng và cho vào trên giấy lọc. Mỗi hộp cho vào 10 ấu trùng BSL đã qua xử lý nhiệt để khơng tạo kén. Như vậy nồng độ gây nhiễm là khoảng 200IJs/BSL. nếu nồng độ gây nhiễm cao thì thì nồng độ tuyến trùng sinh ra sẽ ít do bị cạnh Khố luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 35 tranh và bị ơ nhiễm bởi vi khuẩn bên ngồi. đậy nắp hộp chứa tuyến trùng và vi khuẩn bên ngồi. Dán nhãn và để trong túi nilon. ðặt trong tối ở nhiệt độ phịng. Sau khi gây nhiễm hầu hết BSL đều chết, cẩn thận chuyển BSL đã chết vào white trap(white 1927) Thơng thường BSL bị nhiễm EPN và chết sẽ khơng cĩ mùi thúi và cĩ màu sắc khá đặc trưng. BSL bị nhiễm Steinerma sẽ cĩ màu hơi vàng nâu và mềm khi gấp bằng kẹp cịn BSL bị nhiễm Herterohabditis sẽ cĩ màu đỏ gạch và cứng hơn mơt chút. Những con BSL bị chết do nhiễm nặng hay chết bởi các nguyên nhân khác thường màu hơi đen và cĩ mùi thối. tơt nhất là khơng thu tuyến trùng từ những con này vì số lượng ít và chúng cĩ thể gây ơ nhiễm nặng cho cả đợt. 4.2.2. Thu hoạch tuyến trùng IJs Làm bẫy nước (white trap) theo white (1927): ðặt giấy lọc whatman N01- 90mm trên mặt lõm của đĩa đồng hồ trong đĩa petri thuỷ tinh lớn. ðặt vào nồi hấp 20 phút ở 1210C. Cho vào đĩa petri khoảng 70ml nước cất hoặc cho thêm formalin để tạo thành dung dịch 0.1% formalin. Chú ý: khơng được để nước nhỏ vào mặt lõm của đĩa đồng hồ. ðặt giấy lọc lên trên đĩa đồng hồ và gập mép giấp ngược về phía đáy đĩa, sao cho khi đặt vào đĩa petri chứa nước, mép giấy tiếp xúc với bề mặt nước. Mỗi đĩa như vậy khoảng 20-30 BSL sát nhau trên giấy lọc ở sát mép đĩa đồng hồ. Khố luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 36 Hình 4.1. Ấu trùng BSL Thơng thường sau khi nhiễm từ 10-12 ngày, IJs sẽ bắt đầu phát tán ra khỏi BSL và khi chuyển vào nước trong đĩa petri. Cịn xác BSL cịn lại trên đĩa đồng hồ. khi tuyến trùng xuất hiện trong đĩa petri nên tiến hành thu chúng hàng ngày tới khi số lượng giảm (3-4-ngày). ðể thu hoạch, nhấc đĩa cĩ chứa BSL ra, rĩt nước chứa IJs vào cốc (rữa đĩa petri để thu huyết trùng) thêm 70ml nước cất hoặc 0.1% formalin và thay đĩa đồng hồ. Với hầu hết tuyến trừng EPN thì ấu trùng thốt ra khỏi vật chủ BSL cũng là IJs thuần chủng, nhưng với S.glaseri, khi ấu trùng mới thốt ra từ xác chết của cơn trùng thì chúng chỉ là dạng ấu trùng tiền xâm nhiềm và nếu tuyến trùng này di chuyển ngay vào mơi trường lỏng chúng sẽ khơng phát triển hồn tồn thành dạng IJs được. ðể cho chúng thành IJs cần thay đĩa đồng hồ và giấy lọc bằng đĩa petri được chuẩn bị đặc biệt. ðĩa petri này chứa lớp mỏng khoảng 2mm plaster, để lớp laster này khơ và làm ẩm khơng nên sũng ướt. kiểm tra mức độ ẩm trước khi thu hoạch cộng thêm vài giọt nước nếu thầy cần thiết. vật chủ đã nhiễm được đặt trên giấy plaster ẩm này, sao đĩ di Khố luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 37 chuyển trong hai đến ba ngày vào mơi trường nước hoặc 0.1% formalin trong đĩa petri thuỷ tinh lớn hơn. Chúng cĩ thể thu bằng cách thơng thường. 4.2.3. Chuẩn bị cho bảo quản kiểm tra IJs cịn hoạt động, Mơ vật chủ hoặc tuyến trùng khơng phải IJs phải được loại bỏ. nếu cĩ vấn đề phát sinh hoặc số lớn tuyến trùng khơng hoạt động cần được xem xét xử lý hoặc loại bỏ, trong khi tiến hành rửa cuối cùng. Tách IJS ra khỏi xác chết vật chủ, mơi trường nhân nuơi hoặc tạp chất khác bằng cách cho IJs di chuyển qua rây lọc cĩ kích thước lổ thích hợp (60- 60µm) để giữ lại mơ vật chủ và tuyến trùng ở các giai đoạn khơng lây nhiễm. các giai đoạn khơng xâm nhiễm. Các giai đoạn khơng xâm nhiễm cĩ thể bị giết khi rửa tuyến trùng bằng dung dịch Hyamine 0.4% trong 15 phút. Nếu muốn tất cả các giai đoạn khơng xâm nhiễm cũa hai giai đoạn Steinerma và Herterohabditis đều cĩ thể bị chết ở nhiệt độ phịng trong một vài ngày . ðể rửa tuyến trùng, cho chúng vào một cái cốc, để tuyến trùng lắng đọng, gạn phần nước phía trên và cho phần nước sạch vào cho đến khi dung dịch sạch từ 2-4 lần. Nếu dung dịch bị ơ nhiễm nặng chúng cĩ thể rửa một lần bằng dung dịch formalin. Cĩ thể ly tâm ở tốc độ 300 vịng /phút trong 1 phút cĩ thể đẩy nhanh quá trình này. Trong thời gian ngắn tuyến trùng cĩ thể được cất giữ qua đêm trong tủ lạnh nhưng nên rửa ít nhất 1 lần trước khi cho vào tủ lạnh. Cuối cùng chuyển tuyến trùng cho vào lọ bảo quản. 4.3. Cơng nghệ nhân nuơi in vitro Cơng nghệ sản xuất invitro trên cơ sở sử dụng mơi trường nhân tạo để sản xuất sinh khối lớn EPN. Quy trình sản xuất chế phẩm sinh học tuyến trùng gồm năm giai đoạn chủ yếu như sau: i)phân lập VKCS từ xoang máu của ấu trùng bướm sáp lớn đã được gây nhiễm EPN chuyển sang mơi trường laura Broth cho nhân nuơi sơ cấp để tuyển chọn khuẩn lạc chuẩn (pha I); ii)nhân nuơi thứ cấp VKCS trong mơi trường để toạ sinh khơi lớn; iii) gây Khố luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 38 nhiễm vào mơi trường chicken offal để tạo sinh khối lớn VKCS; iv) nhân ủ tổ hợp EPN – VKCS trong vịng 24-28 ngày; v) thu hoạch EPN phối chế và bảo quản. Cơng nghệ này khắc phục được những hạn chế của cơng nghệ in vivo và cĩ khả năng thương mại hố chế phẩm sinh học EPN với giá thành thấp hơn. 4.3.1. Phân lập VKCS. VKCS của EPN rất mẫn cảm với nồng độ Oxy thấp, thay đổi độ thẩm thấu, thiếu nguồn dinh dưỡng và nhân nuơi nhỏ hơn là các chủng thơng thường khác (E.coli). Pha sơ cấp Xenohabdus cĩ thể được hướng dẫn theo bảng 43 dưới đây. Các vi khuẩn sơ cấp cĩ thể được bảo quản 17% trong mơi trường dinh dưỡng glyseron trong chai martney và giữ ở 18oC. Thể treo này được làm tan nhanh ở nước nĩng 60oC. Các vi khuẩn cĩ thể được bảo quản ở 12-24oC và cấy chuyền thường xuyên . Phân lập và nuơi sơ cấp. - Chuyển 10 ấu trùng vào các ẩm 10% vào một đĩa petri cho nhiễm vào khoảng 100IJs trên mỗi BSL. Khơng nên cho quá nhiều nước đề tránh BSL bị ngập nước mà chết trước khi nhiễm tuyến trùng. - Sau 24-48 giời khi ấu trùng BSL Chết chúng sẽ được chuyển vào một cốc thuỷ tinh và rửa bằng cồn trong vịng 5-10 phút. - Mổ xác chết bằng một kéo hoặc bằng kim nhọn sắc đã được khử trùng và lấy một giọt huyết tương lên NBTA sử dụng que cấy platin dạng vịng. Chú ý: khi tác mỗ và lấy mẫu huyết tương và khơng làm vỡ ruột ấu trùng BSL để tránh nhiễm bẩn. - Ủ đĩa mơi trường nhân nuơi ở 25oc trong buồn tối. - Chọn lấy một khuẩn lạc đơn sơ cấp và nhiễm trở lại vào mơi trường NBTA agar. Khố luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 39 - Nếu đĩa nhân nuơi chất lượng và khơng bị nhiễm bẩn (cĩ thể phân loại bằng nhân nuơi thứ cấp này), cĩ thể nhân nuơi bằng cách nhân nuơi tiếp theo. Nhân nuơi thứ cấp - Cấy chuyển một khuẩn lạc vào dịch YS- broth và ủ trong 1-2 ngày ở nhiệt độ 25oc trong 200 vịng trên phút trong tối. - Bổ sung thêm 15% glyserol vào dịch nhân nuơi, trộn lắc đều và lấy 2ml vào ống typ đã khử trùng. - Sau khi san dịch vào các ống typ, chuyển chúng san bảo quản ở -800c. Luu ý: các ống typ cần được ghi nhãn tên chủng, ngày chuẩn bị mẩu. ðể chắc chắn cần thêm mơ tả ngắn nguồn giống nhân nuơi trong hồ sơ đơng lạnh -800c, nghĩa là số thứ tự của khay và hộp chứa mẩu, số chủng nuơi, đặc tính của chủng ( sơ cấp, thứ cấp)… 4.3.2. chuẩn bị mơi trường nhân nuơi tổ hợp tuyến trùng Từ nghiên cứu thành cơng quy trình cơng nghệ in vitro trên mơi trường đặc trong bình tam giác, đề tài đã nghiên cứu, thay thế vật liệu sản xuất mơi trường chicken offal từ nguyên liệu lịng gia cầm, một loại vật liệu khá đắt, khơng sẳn cĩ trên thi trường với khối lượng lớn bằng nguyên liệu mới là lịng gia súc (lịng lợn) một loại vật liệu khá rẻ, với giá trị tồn tại trên thị trường với khối lượng lớn. Giá rẻ khối lượng tồn tại trên thị trường lớn mà hiệu quả khơng thua kém gì lịng gia cầm. chuẩn bị mơi trường chicken offal Các nội quan như tim gan , ruột,… của gia cầm và gia súc đều cĩ thể sử dụng được trong mơi trường nhân nuơi EPN. a. Loại bỏ túi mật ( các muối mật cĩ hại cho sự phát triển của tuyến trùng). Khơng được làm vỡ túi mật khi lấy nĩ ra. b. Cho vật liệu lịng vào nối áp suất để hấp ở 121 độ C trong 20-25 phút. Khố luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 40 C. Xay nghiến cho nhuyễn vật liệu, trước xay nên dùng kéo cắt ruột thành các đoạn ngắn khoảng 15cm. d. Bảo quản lạnh nếu chưa trộn mơi trường ngay. Tốt nhất là trộn xong sau đĩ nếu mới bảo quản để giữ an tồn cho khơng gian trong tủ bảo quản. e. Trộn trong nước và mỡ bị theo các tỷ lệ sau: Mơi trường nhân nuơi các lồi Steinernema : 8 Dung dịch offal + 2 phần nước (khơng mỡ bị). Mơi trường nhân nuơi các lồi Heterorhabditis : 7 Dung dịch offal + 2 phần nước + 1 phần mỡ bị. 4.3.3. Chuẩn bị dụng cụ nhân nuơi Tiến hành cắt xốp thành những miếng nhỏ (kích thước 1cm) sau đĩ trộn với mơi trường chicken offal đã chuẩn bị sẵn với tỷ lệ mơi trường/xốp (tính theo trọng lượng) là 1.25/1. Mỗi bình tam giác cho một lượng 250-300ml (khoảng 100g) mơi trường đã trộn với xốp. Lau sạch miệng bình và bịt kín bằng nút bơng bọc vải thưa và hấp ở 121 độ C trong 20 phút. Bình nhân nuơi được làm lạnh một thời gian trước khi sử dụng. Trường hợp mơi trường cĩ mùi hơi thối do nguyên liệu đã để lâu trước khi chế biến thì cĩ thể sử dụng chất khử mùi. Chú ý: Trong suốt quá trình thao tác cần mang găng tay cao su. ðây là một yêu cầu quan trọng để tránh nhiễm trùng cho mơi trường nhân nuơi. Dùng túi nilon chịu nhiệt thay cho bình tam giác và hộp nhựa để nhân nuơi EPN cĩ thể tiết kiệm chi phí nhân nuơi. Ngồi ra, cĩ thể chuển trực tiếp các tùi nhân nuơi ra đồng ruộng để phun rải mà khơng cần qua khâu tách lọc vừa mất nhiều thời gian vừa bị hao hụt. 4.3.4. Gây nhiễm vi khuẩn Dịch nhân nuơi vi khuẩn sơ cấp nên được ủ trước một ngày trước khi bình nuơi được chuẩn bị. Vi khuẩn được cấy chuyền vào các ống nghiệm (tốt Khố luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 41 nhất nhân nuơi vi khuẩn trong 1 ống týp cho một bình nhân nuơi) cĩ chứa 5ml nutrient broth. Tốt nhất để các ống týp qua đêm trên máy lắc hoặc ít nhất xốy nước trong ống trước khi ủ. Khi nhiễm rĩt một ống dịch vi khuẩn vào mỗi bình nhân nuơi. Lắc đều để trộn lẫn dịch vi khuẩn với mơi trường trong chất xốp nền. Ủ 2-3 ngày ở 250 độ C để vi khuẩn phát triển nhanh. 4.3.5. Gây nhiễm tuyến trùng và nhân giống tổ hợp(monoxenic) Sau khi nhân nuơi vi khuẩn xong tiến hành nhiễm tuyến trùng vào các bình đã chuẩn bị sẵn vi khuẩn. Một bình tam giác ban đầu cĩ thể chia thành 7 bình mới. Dùng pipet hút 1 lượng nước chứa tuyến trùng khoảng 3-4ml và phun vào từng bình tại 3-5 điểm. Sau khi nhiễm tuyến trùng, tốt nhất là tránh rung lắc mạnh bình đang nhân nuơi tuyến trùng. ðể các bình nhân ủ trong phịng tối ở nhiệt độ 25-280C, ẩm độ 75-80% trong thời gian 10-14 ngày cho đến khi thấy tuyến trùng sinh sơi và bám đầy trên thành bình cĩ thể thu hoạch. Hình 4.2: Nhân nuơi EPN trong bình tam giác Khố luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 42 Khi bình nhân nuơi cĩ dấu hiệu khơng tốt hoặc bị nghi ngờ, IJs đã vơ trùng bề mặt cĩ thể phục vụ như chất gây nhiễm ban đầu. Khi chủng IJs khơng nên cho quá nhiều nước cùng với tuyến trùng (tốt nhất là <5ml). Sau 2-3 ngày kiểm tra xem các bình nhân nuơi cĩ thành cơng khơng bằng cách lấy mẫu từ bình nuơi cấy trên MacConkey Agar hoặc NBTA (Nutri agar, bromthymol blue và tetrazolium choloride) và sau đĩ kiểm tra màu sắc vi khuẩn phù hợp và hình thái để biết độ thuần khiết. 4.3.6.Thu hoạch IJs ðể tách lọc lấy IJs từ bọt xốp cho xốp vào một ray lọc kích thước lỗ 1- 2mm. đặt rây vào 1 chậu và cho nước vừa ngập xốp, để yên tĩnh trong thời gian 2-6 giờ hoặc nếu cần cĩ thể để lâu đến 12 giờ, nhưng khơng nên để lâu quá 24 giờ vì thời gian lâu quá sẽ khơng cĩ lợi cho tuyến trùng. Khơng được rĩt nước lên trên xốp vì sẽ rửa mất một phần chất dinh dưỡng (để nuơi tuyến trùng). Thơng thường trong vịng 2 giờ đầu sẽ cĩ khoảng 95% IJs di chuyền qua đáy rây lọc xuống chậu nước. Làm lắng tuyến trùng và rửa tuyến trùng để loại bỏ các phần khác và IJs khơng hoạt động. Cĩ thể dùng rây lọc kích thước lỗ nhỏ 0,5mm để lọc và loại bỏ các phần khơng cần thiết. ðối với các chủng Steinernema cĩ thể sử dụng dung dịch Hyamine để giết các dạng khơng phải IJs trước khi lọc qua rây. Cần phải rửa tuyến trùng nhiều lần tới khi nước sạch. Trong trường hợp cần thiết cĩ thể dùng sục khí để phá vỡ những thành phần nhỏ của dung dịch sau khi rửa IJs. 4.3.7. Xử lý sự cố ðể tránh ơ nhiễm các bình hoặc hộp nhân nuơi cần hết sức chú ý bất kỳ thao tác nào trong quá trình thao tác. Chỉ cần 1 giọt nước nhỏ trong khi sản xuất cũng cĩ thể gây ơi nhiễm, hoặc một sự thay đổi đột ngột cũng cĩ thể tạo ra pha thứ cấp của VKCS. Thậm chí khi nhiệt độ nhân ủ khơng thích hợp, ẩm Khố luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 43 độ khơng phù hợp vì nhiều nguyên nhân hay yếu tố khác. Sự ơ nhiễm cĩ thể được nhận biết dễ dàng khi xuất hiện các màu sắc hoặc mùi hơi khơng bình thường hoặc chất rị rỉ khác lạ từ sinh khối do vi khuẩn và nấm gây ra. Trong bất kỳ trường hợp nào cũng nên được kiểm tra bằng cách gây nhiễm trên NBTA hoặc MacConkey agar. Ở thời điểm trước 2 tuần, bình tam giác nuơi cấy chứa tỷ lệ cao vi khuẩn thứ cấp là bình thường, tuy nhiên 1 điều rất quan trọng là các bình này phải được chủng vi khuẩn sơ cấp lúc ban đầu. Mặc dù nhiệt độ nhân nuơi tối ưu khác nhau ở các lồi tuyến trùng, nhưng nhiệt độ 25-280C là tốt nhất cho việc sản xuất hầu hết các chủng tuyến trùng. ðộ ẩm cĩ thể được điều chỉnh bằng cách thêm vào hay bớt đi một lượng chất lỏng nhất định trong các bước khác nhau của quy trình sản xuất. Nếu mơi trường là quá lỏng hoặc quá nhiều chất lỏng cho vào khi nhiễm, tuyến trùng sẽ bị giữ lại ở chỗ nhiễm và chết. Nếu mơi trường là quá khơ, sự nhân nuơi sẽ mất độ ẩm dần dần trước khi một số lớn tuyến trùng được sản xuất ra. Duy trì độ ẩm cao ở nơi đặt bình tam giác để nhân ủ là rất tốt. Việc sản suất và bảo quản IJs cần tính tốn thời gian phù hợp để khơng làm giảm khả năng xâm nhiễm của IJs. Sản xuất in vitro chỉ nên được tiến hành 4-6 tháng trước khi sử dụng để tránh làm giảm độc tố và khả năng gây bệnh của tuyến trùng đối với vật chủ của nĩ. Mặt khác cũng cần quan tâm thích đáng để duy trì các điều kiện thích hợp cho sinh trưởng, phát triển và bảo quản để làm giảm nguy cơ về vấn đề chất lượng tuyến trùng. Nhìn chung, người sản xuất tuyến trùng cần phải lường trước được các vấn đề cĩ thể xẩy ra. ðể làm được như vậy người nhân nuơi cần được trang bị kiến thức về hệ thống nhân nuơi để chủ động theo dõi và phản ứng hợp lý đối với các thay đổi mang tính thủ tục. Cùng với một vài hiểu biết về sinh học tuyến trùng, các nguyên nhân và giải pháp khắc phục. Thậm chí như vậy sản Khố luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 44 xuất in vitro cũng khơng phải là dễ dàng, vì vậy, các thử thách và sự cố sẽ rất cần thiết cho người tập sự để làm hồn thiện hệ thống sản xuất. 4.3.8. Bảo quản IJs Sau khi thu hoạch và làm sạch, tuyến trùng cĩ thể được chứa trong nước cất với 1 giọt Triton X-100 (Tác nhân làm ẩm và ngăn chặn tuyến trùng dính vào bên trong cốc) hoặc 0.1% formalin (chỉ sử dụng khi sự ơ nhiễm trở thành một vấn đề quan trọng). Nếu bảo quản trong điều kiện khơng sục khí thì nồng độ IJs khơng nên quá 10-20.000 IJs/ml và độ sâu của nước nên duy trì ở mức 1cm hoặc ít hơn. Các bình tam giác hoặc bình nuơi cấy tế bào là dụng cụ lí tưởng bảo quản tuyến trùng. Trong điều kiện được thơng khí (dùng bơm sủi hoặc bất kỳ thiết bị cung cấp khí nào) cĩ thể bảo quản tuyến trùng ở nồng độ 100.000 IJs/ml. Các chủng Steinernema cĩ thể được bảo quản tốt nhất ở nhiệt độ 4-100C trong 6- 12 tháng mà khơng mất hoạt tính. Các chủng Heterorhabditis thường khơng để lâu được như vậy, chỉ từ 2-4 tháng ở 4-100C. Nếu thấy cĩ hiện tượng tạo búi ở Heterorhabditis cần bổ sung với nồng độ 1gr/50ml nước (hoặc nhiều hơn ) để làm tan các búi này mà khơng ảnh hưởng gì đến tuyến trùng. Nhìn chung, các chủng tuyến trùng của việt nam cĩ khả năng bảo quản lâu và cĩ thể bảo quản ở nhiệt độ cao hơn. Kết quả thí nghiệm bảo quản IJs trong nước ở nhiệt độ 120C với mật độ 20.000 IJs/ml, thì 2 chủng S-TX1 và S-TX4 của lồi Sterinerna sangi cĩ thể giữ được 6-12 tháng và động lực diệt sâu vẫn cịn. Trong khi đĩ, với điều kiện bảo quản tương tự, 2 chủng H-MF11 và H-TN3 của lồi Herterohabditis indica cĩ thể sống và giử được động lực trong thời gian 4-8 tháng. Cĩ thể bảo quản IJs bằng xốp Polyerher polyurethane. Dùng xốp ấm đã hấp sạch để chứa IJs của Steinerma với số lượng tuyến trùng bằng 10 lần khối Khố luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 45 lượng của xốp. đặc cốc vào trong bình vơ trùng và xục khí qua một màng lọc vi khuẩn (0.45µm). Vắt xốp cho hết nước đến khi tuyến trùng ra khỏi xốp. Việc tách lọc này thường tốn nhiều thời gian và khơng thích hợp cho việc thương mại nhưng rất thích hợp cho mục đích nghiên cứu. Bảo quản IJs trong than hoạt tính và đặc biệt bảo quản IJs ở trạng thái khơ để IJS khơng hoạt động là một trong những hướng mới khả thi đang được nhiều người quan tâm nghiên cứu (Yukawa & Pitt 1985). Khố luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 46 CHƯƠNG 5: HIỆU LỰC PHỊNG TRỪ SÂU HẠI CỦA MỘT SỐ CHỦNG EPN 5.1. Cơ sở đánh giá hiệu lực gây chết của các chủng EPN Mặc dù hầu hết các chủng /lồi tuyến trùng EPN cĩ thể ký sinh gây bệnh cho nhiều lồi sâu hại khác nhau thuộc một số bộ cơn trùng chính như Lepidoptera, Coleoptera, Diptera, Orthoptera, vv... nhưng khả năng kí sinh gây chết vật chủ của các chủng tuyến trùng trên từng đối tượng sâu hại lại là rất khác nhau. Do vậy, để cĩ cơ sở phịng trừ thành cơng đối với mỗi loại sâu hại cần phải đưa ra các quyết đinh là : i) Sử dụng loại tuyến trùng nào để cho kết quả cao nhất ; ii) nồng độ và liều sử lí; iii) thời điểm nào của sâu hại xuất hiện trên đồng ruộng cần xử lí; iv) cách phun rải tuyến trùng trên đồng ruộng ,trong trường hợp phịng trừ các loại sâu hại các phần cây trồng trên mặt đất, trong thân cây thì cần phối chế với những chất thích hợp để giữ ẩm và tăng khả năng bám dính của tuyến trùng. ðể cĩ được các quyết định như trên cần thiết phải tiến hành thử nghiệm, đánh giá khả năng ký sinh gây chết vật chủ sâu hại của từng chủng tuyến trùng đối với mỗi loại sâu hại. Các chỉ tiêu cần đánh giá bao gồm : i) chỉ số LC50 ( lethal concentraion) - tức là nồng độ tuyến trùng mà ở đây được hiểu là số lượng tuyến trùng cảm nhiễm gây chết 50% sâu hại thử nghiệm (trong trường hợp thử nghiệm tuyến trùng EPN chỉ tiêu LC50 này cũng đồng nghĩa với chỉ tiêu LD50 (Lethal does) hay liều lượng gây chết 50%). Một chủng tuyến trùng cĩ LC50 càng thấp chứng tỏ cĩ độc lực của tổ hợp tuyến trùng vi khuẩn càng mạnh, đồng thời cũng chứng tỏ là lồi sâu hại mẫn cảm với tuyến trùng. ii) chỉ số TL50 (Lethal time) là thời gian gây chết 50% sâu hại thử nghiệm. Thời gian này càng ngắn cũng cĩ nghĩa hoạt tính gây chết của chủng EPN càng mạnh và cũng chứng tỏ là lồi sâu hại mẫn cảm với tuyến trùng iii) một chỉ tiêu nữa cũng cho phép đánh giá về hoạt tính của một chủng tuyến trùng đối với một đối tượng sâu Khố luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 47 hại là khả năng sinh sản của tuyến trùng trong cơ thể cơn trùng. Sản lượng tuyến trùng cảm nhiễm được sinh ra trong xác chết của sâu hại càng lớn chứng tỏ đối tượng sâu hại thử nghiệm là vật chủ thích hợp đối với 1 chủng tuyến trùng ký sinh. Tuy nhiên, trong thực tế chỉ cần xác định LC50 cơ sở để kết luận về độc lực của một chủng EPN. ðể xác định LC50 cần thiết kế thí nghiệm với ít nhất 10 cơng thức thí nghiệm với nồng độ khác nhau từ thấp đến cao và một cơng thức đối chứng. ðối với đa số sâu hại nồng độ phơi nhiễm thường từ 10 – 100 IJs/sâu hại: Mỗi cơng thức thí nghiệm thường sử dụng 5 sâu hại cùng lứa tuổi, mỗi sâu được đặt riêng lẻ trong 1 đĩa petri (35 x 15mm) trên giấy lọc ẩm. Mỗi đĩa sâu thí nghiệm cho một lượng chính xác IJs cần thiết. Thí nghiệm được theo dõi chính xác trong 5 ngày ở điều kiện phịng thí nghiệm. Sau 5 ngày tất cả các sâu chết được chuyển sang bẫy nước (White trap) và ủ 5 – 7 ngày để thu lại tuyến trùng ( Cabanillas & Raulston, 1994). để sử lý thống kê các thí nghiệm như vậy ít nhất phải được lập lại 3 – 5 lần, tuỳ thuộc khả năng cung cấp sâu thí nghiệm. 5.2. Hiệu lực gây chết của một số chủng EPN trong điều kiện phịng thí nghiệm 5.2.1. Hiệu lực gây chết sâu hại của chủng S-TK10 Khả năng kí sinh và hiệu lực gây chết của chủng tuyến trùng S-TK10 đã được thử nghiệm với 5 đối tượng sâu hại quan trọng và rất phổ biến đối với các cây trồng ở việt nam. Khố luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 48 Bảng 5.1: Hiệu lực gây chết sâu khoang của chủng S-TK10 (nhiệt độ : 21,3-26,10C; độ ẩm: 80-86%) Số lượng IJs Số sâu TN Số sâu chết Tỷ lệ chết % 10 20 3 15.0 20 20 7 35.0 30 20 9 45.0 40 20 12 60.0 50 20 13 65.0 60 20 12 60.0 70 20 13 65.0 80 20 15 75.0 90 20 15 75.0 100 20 17 85.0 Bảng 5.2: Hiệu lực gây chết sâu xanh bướm trắng của chủng S-TK10 (nhiệt độ: 21,1-25,40C: độ ẩm: 77-90%) Số lượng IJs Số sâu TN Số sâu chết Tỷ lệ (%) 5 20 5 25.0 10 20 7 35.0 15 20 8 40.0 20 20 12 60.0 25 20 13 65.0 30 20 17 85.0 35 20 18 90.0 40 20 20 100 Khố luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 49 Kết quả thí nghiệm cho thấy S-TK10 cĩ khả năng ký sinh gây chết sâu xanh bướm trắng rất cao, chỉ với những nồng độ phơi nhiễm ban đầu rất thấp là 5 và 10 IJs thì tỷ lệ sâu chết đã đạt 25 và 35%. Ở cơng thức nồng độ phơi nhiễm 35 và 40 IJs thì tỷ lệ chết của sâu xanh bướm trẵng đã đạt tới 90 và 100%. Bảng 5.3: Hiệu lực gây chết bọ hung đen của chủng S-TK10 (nhiệt độ: 25,2-28,30C: độ ẩm :71-87%) Số lượng IJs Số sâu TN Số sâu chết Tỷ lệ chết (%) 100 50 5 10.0 200 50 10 20.0 400 50 15 30.0 600 50 17 34.0 800 50 15 30.0 1000 50 20 40.0 1200 50 20 40.0 1600 50 22 44.0 2000 50 29 58.0 5000 50 40 80.0 Thí nghiệm trên bọ hung đen trưởng thành được bố trí 10 cơng thức nồng độ cao từ 100 đến 5000 IJs và mỗi cơng thức thí nghiệm sử dụng 10 bọ hung đen, nhắc lại 5 lần. Tổng cộng cĩ 500 bọ hung đen được sử dụng cho thí nghiệm này. Sau 5 ngày phơi nhiễm, tỷ lệ bọ hung chết là 10% ở cơng thức nồng độ 100 IJs. Tỷ lệ chết tăng lên mức 30% trở lên ở các cơng thức nồng độ phơi nhiễm 400, 600, 800 IJs. Sau đĩ tỷ lệ chết tăng chậm và đến số lượng 2000 Khố luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 50 IJs thì mới gây chết được 58%. Ở cơng thức nồng độ cao nhất là 5000 IJs thì tỷ lệ bọ hung chết đạt 80%. 5.2.2. Hiệu lực phịng trừ sâu của S-TX1 Chủng tuyến trùng S-TX1 cũng được thủ nghiệm trên 3 lồi sâu hại là sâu xanh (Helicoverpa armigera Hubner), sâu tơ (Plutella xylostella Linnaeus) và bọ hung đen (Alissonotum impressicolle Arrow). Thí nghiệm trên sâu xanh, được thiết kế với 10 cơng thức nồng độ, từ 1 đến 100 IJs. Mỗi cơng thức 5 sâu xanh, lặp lại 4 lần và tất cả 255 sâu xanh được sử dụng cho thí nghiệm. Kết quả thí nghiệm cho thấy sau 5 ngày theo dõi, ở cơng thức nồng độ phơi nhiễm 1 IJs đã khơng cĩ sâu chết được ghi nhận, tỷ lệ sâu chết được ghi nhận là 10% ở cơng thức nồng độ phơi nhiễm IJs và tỷ lệ này tăng lên đến 15% rồi 30% ở các cơng thức số lượng 10 và 20 IJs. ðến các cơng thức nồng độ phơi nhiễm 80 và 100 IJs thì tỷ lệ chết đạt 100%. Bảng 5.4: Hiệu lực gây chết sâu xanh của chủng S-TX1 Số lượng IJs Số sâu TN Số sâu chết Tỷ lệ (%) 1 20 0 0 5 20 2 1 0.0 10 20 3 15.0 20 20 6 30.0 30 20 11 55.0 40 20 15 75.0 50 20 14 70.0 60 20 18 90.0 80 20 20 100 100 20 20 100 LC50 = 18 Khố luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 51 Giá trị LC50 của chủng S-TX1 là 18 IJs cho thấy sâu xanh khá mẫn cảm đối với chủng tuyến trùng này, mặc dù đây là đồi tượng cĩ khả năng kháng mạnh với các lồi thuốc hố học. Thí nghiệm hiệu quả diệt sâu của chủng S-TX1 được tiến hành trong 10 cơng thức từ 10- 50 IJS. Và với bốn lần lặp lại như thế thì tỷ lệ sâu chết là 95% và 100% ở nồng độ 50IJs. Kết quả trên cũng phù hợp với các kết quả nghiên cứu gần đây sử dụng một số chủng EPN để phịng trừ sâu tơ hại rau ở Malaysia CHLBð và Anh cũng cĩ kết quả khá tốt. Các thử nghiệm xác định hiệu lực gây chết của chủng S-TX1 đối với bọ hung đen trưởng thành được tiến hành với 10 cơng thức nồng độ từ 100-5000IJS mỗi cơng thức lập lại 5 lần. Kết quả cho thấy bọ hung bắt đầu chết với tỷ lệ 10% ở nồng độ 100IJS và tỷ lệ chết 82% của bọ hung là ở nồng độ 5000IJS. Giá trị LC50 = 1286 IJS là thấp hơn so với chủng S-TK10; như vậy mặc dù cả hai điều diệt được bọ hung nhưng chủng tuyến trùng S-TX1 hiệu quả hơn so với tuyền trùng trưởng thành. 5.2.3. Hiệu lực gây chết của chủng H-MP11 Hiệu lưc gây chết của chủng H-MP11 được đánh giá với bốn đơi tượng sâu hại: sâu xanh (helicoverpa armigera huber), sâu keo da láng (Spodoteraexigua hubner), sâu tơ (plutella xylostella linnaeus), bọ hung đen (Alissonotum impressicolle Arrow). Thử nghiện trên được tiến hành với 10 cơng thức từ 1-100IJS. kết quả như sau:15% sâu xanh chết với cơng thức 5IJS, đến tỷ lệ 50IJS thì sâu xanh chết ở 50%, tỷ lệ chết này đạt cao nhất là 75% ở nồng độ 100IJS. Bảng 5.5: Hiệu lực gây chết sâu xanh của H-MP11. (Nhiệt độ:24.3-27.90C: độ ẩm:80-90%) Khố luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 52 Số lượng IJs Số sâu TN Số sâu chết Tỷ lệ (%) 1 20 0 0 5 20 3 15.0 10 20 5 25.0 20 20 6 30.0 30 20 5 40.0 50 20 11 55.0 60 20 11 55.0 80 20 11 55.0 Giá trị LC50 của M-MP11 đối với sâu xanh trong thí nghiệm này là 45IJS cao hơn nhiều so với LC50 của S-TX1 chứng tỏ khả năng ký sinh của H-MP11 thấp hơn so với S-TX1. Tuy nhiên trong thực tế cho thấy chủng H-MP11 chúng rất mẫn cảm với sâu xanh da láng chúng diệt khoảng 93-100% sâu. Bảng 5.6: Hiệu lực diệt sâu xanh da láng của H-MP11 Số lượng IJs Số sâu TN Số sâu chết Tỷ lệ chết (%) 10 16 10 62.5 20 16 9 56.3 30 16 13 81.3 40 16 12 75.0 50 16 13 81.3 60 16 13 81.3 70 16 14 87.5 80 16 16 100 90 16 15 93.8 100 16 16 100 LC50=12 Khố luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 53 Thử nghiệm với sâu tơ đã được kiểm chứng với 10 cơng thức nồng độ phơi nhiễm từ 5 đến 50 IJs. Mỗi cơng thức 5 sâu, nhắc lại 4 lần với nồng độ số là 225 sâu. Thí nghiệm cho thấy nồng độ phơi nhiễm IJs là 50%. Ở cơng thức cao nhất 50 IJs thì tỷ lệ sâu tơ đạt cao nhất là 95%. 5.2.4. Hiệu lực gây chết của chủng H-NT3 Chủng tuyến trùng H-NT3 là một trong 2 chủng của lồi tuyến trùng Heterorhabditis indica ở Việt Nam được coi là một trong những chủng tuyến trùng bản địa cĩ rất nhiều ưu điểm nổi bật như khả năng di chuyển tốt và năng sinh sản cao trong cơ thể cơn trùng vật chủ. Nghiên cứu khả năng gây chết sâu hại của chủng H-NT3 được tiến hành trên 5 đối tượng sâu hại là sâu keo da láng, sâu xám, sâu khoang, sâu tơ, và bọ hung đen. Thử nghiệm đánh giá khả năng gây chết của sâu da láng của chủng H- NT3 được tiến hành với 9 cơng thức nồng độ gây nhiễm từ 10 đến 100 IJs. Mỗi cơng thức gồm 8 sâu, Lặp lại 4 lần với tổng số 320 sâu trong thử nghiệm này. Bảng 5.7: Hiệu lực gây chết sâu keo da láng ở chủng H-NT3 (Nhiệt độ: 27,9-28,90C: ðộ ẩm: 79-84%) Số lượng IJs Số sâu TN Số sâu chết Tỷ lệ chết (%) 10 32 20 62.5 20 32 20 62.5 30 32 20 62.5 40 32 20 62.5 50 32 22 68.7 60 32 22 75.0 70 32 28 87.5 80 32 32 100 100 32 32 100 Khố luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 54 Trong thí nghiệm này sâu keo da láng bắt đầu chết ở các cơng thức nồng độ 10, 20, 30, 40 IJs đều với tỷ lệ khá cao là 62,5 % cơng thức 80 và 100 IJs thì tỷ lệ chết là 100%. Giá trị LC50=14 IJs đối với sâu keo da láng cho thấy sự mẫn cảm của sâu này đối với chủng tuyến trùng H-TN3. Giá trị này mặt dù cao hơn một chút so với chủng H-MP11 nhưng đều là chủng cĩ tiềm năng lớn trong đề phịng sâu keo da láng. ðánh giá khả năng gây chết của H-NT3 trên sâu xám được tiến hành với 10 cơng thức nồng độ từ 20 đến 200 IJs. Mỗi cơng thức sử dụng 10 sâu, lặp lại 3 lần với tổng số 300 sâu cho thử nghiệm. Kết quả thử nghiệm cho thấy, ở cơng thức nồng độ thấp nhất 10 IJs mới chỉ cĩ 17,6% số lượng sâu xám chết và tỷ lệ chết tăng lên ở các cơng thức nồng độ cao hơn và đạt giá trị cực đại là 88,2% ở cơng thức nồng độ phơi nhiễm 200 IJs. Giá trị LC50 đối với sâu xám là 80 IJs. Mặc dù giá trị này tương đối cao so với một số sâu hại khác được thử nghiệm nhưng cũng thể hiện được độc lực của các chủng H-NT3 đối với sâu xám khá cao, cũng cĩ nghĩa là sâu xám là đối tượng khá mẫn cảm với chủng H-NT3. Bảng 5.8: Hiệu lực gây nhiễm sâu xám của chủng H-NT3 (Nhiệt độ: 25,2-27,70C: ðộ ẩm:84-87%) Số lượng IJs Số sâu TN Số sâu chết Tỷ lệ chết (%) 20 34 6 17.6 40 34 10 29.4 60 34 12 35.3 80 34 14 41.2 100 34 17 50.0 120 34 20 58.8 140 34 23 67.6 LC50=80 Khố luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 55 ðối với bọ hung đen, thử nghiệm xác định hiệu lực gây chết của chủng H-NT3 được tiến hành với 10 cơng thức nồng độ từ 100 đến 5000 IJs. Mỗi cơng thức nồng độ gồm 10 bọ hung được sử dụng cho thử nghiệm. kết quả thí nghiệm đã ghi nhận: Cĩ 12% bọ hung đen chết sau 5 ngày phơi nhiễm ở nồng độ phơi nhiễm 100 IJs và tỷ lệ này tăng lên 52% ở cơng thức nồng độ 1200 IJs. Tỷ lệ bọ hung chết cao nhất à 90% ở cơng thức nồng độ phơi nhiễm 5000 IJs. Bảng 5.9: Hiệu lực gây chết bọ hung đen của chủng H-TN3 ( Nhiệt độ: 25,2-27,40C: ðộ ẩm: 79-92%) Số lượng IJs Số sâu TN Số sâu chết Tỷ lệ chết (%) 100 50 6 12.0 200 50 8 16.0 400 50 13 26.0 600 50 15 30.0 800 50 18 36.0 1000 50 21 42.0 1200 50 26 52.0 1600 50 29 58.0 2000 50 32 64.0 5000 50 45 90.0 LC50=1070 Giá trị LC50 của H-NT3 đối với bọ hung đen là 1070 IJs là tương đương với LC50 của MP11 (1077IJs) là thấp hơn so với các chủng Steinernema đã thử nghiệm. Các kết quả đánh giá hiệu lực gây chết một số lồi sâu hại của 4 chủng tuyến trùng bản địa Việt Nam đều cĩ chỉ số LC50 khá thấp. Thơng thường một chủng tuyến trùng cĩ chỉ số LC50 nhỏ hơn 100 IJs đối với một lồi sâu hại Khố luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 56 được coi là tiềm năng để trở thành tác nhân sinh học trong phịng trừ lồi sâu hại. Các thử nghiệm trên đây cho thấy cả 4 chủng tuyến trùng ở Việt Nam đều là những chủng cĩ tiềm năng phịng trừ một số lồi sâu hại quan trọng ở Việt Nam. ðối với bọ hung đen, mặc dù giá trị LC50 của cả 4 chủng EPN đều cao hơn 1000 IJs, nhưng kết quả này cũng phù hợp với cơng bố của các tác giả ở Trung Quốc (Wang & Li, 1987). Mặc dù, nghiên cứu khơng chỉ ra được LC50 nhưng đã cho biết kết quả thử nghiệm với nồng độ phơi nhiễm 2500 IJs trên một bọ hung đen thì cĩ 5 trong số 9 chủng EPN của trung quốc đã gây chết bọ hung đen với tỷ lệ 56,5-100% sau 7 ngày phơi nhiễm. So với kết quả này thì cả 4 chủng EPN của Việt Nam cũng đều cĩ tiềm năng trở thành tác nhân sinh học trong phịng trừ bọ hung đen. Việc xác định LC50 cho mỗi chủng tuyến trùng đối với loại sâu hại khơng những cho biết lực của mỗi EPN đối với mỗi loại sâu hại mà cịn chỉ ra liều xử lý thích hợp cho từng loại sâu. Trên cơ sở xác định LC50 của các chủng tuyến trùng thử nghiệm, cho phép thiết kế các thử nghiệm phịng trừ tiếp theo ở quy mơ nhà kính trước khi tiến hành các thử nghiệm ngồi đồng. Khố luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 57 CHƯƠNG 6: KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 6.1. Kết luận Khĩa luận đã tổng hợp được vai trị của biện pháp sinh học trong phịng trừ tổng hợp sâu hại cây trồng. Trong số các tác nhân sinh học ứng dụng trong phịng trừ sâu hại thì tuyến trùng cĩ vị trí khá quan trọng vì phổ ký chủ rộng. Tuyến trùng ký sinh cĩ thể sản xuất theo phương pháp in vivo và in vitro. Cả hai phương pháp này cĩ thể thực hiện và phát triển được trong điều kiện của Việt Nam vì đều dựa trên những nguyên vật liệu dễ tìm và trang thiết bị khá đơn giản. Với vốn kiến thức về Cơng nghệ Sinh học đã được trang bị, sinh viên cĩ thể tự sản xuất hoặc tham gia sản xuất tuyến trùng để trừ sâu hại. 6.2. ðề nghị Mở rộng và khuyến khích các đề tài nghiên cứu về tuyến trùng kí sinh gây bệnh con trùng. ðưa các chế phẩm sinh học từ tuyến trùng vào sử dụng rộng rải thay thế và giảm dần các biện pháp phịng trừ hố học khơng tốt cho mơi trường sinh thái và sức khoẻ con người. Khố luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt 1. Nguyễn Ngọc Châu, 2008. Tuyến trùng kí sinh gây bệnh cơn trùng ở Việt Nam, NXB Khoa học Tự nhiên và Cơng nghệ. 2. Nguyễn văn Tuất, 2004. Nghiên cứu sử dụng thuốc sâu sinh học đa chức năng cho một loại cây trồng bằng kỹ thuật cơng nghệ sinh học. 3. Phạm Thị Mến, 2009. Nghiên cứu mơi trường nhân nuơi tuyến trùng kí sinh gây bệnh con trùng và đánh giá hiệu lực ứng dụng ngồi đồng, luận văn ðH-NL,TP.HCM. 4. Phạm Thị Thuỳ, 2010. Cơng nghệ sinh học trong bảo vệ thực vật, NXB giáo dục Việt Nam. Trang 19 – 26 Tiếng nước ngồi 5. Norberto Chavarr´ia-Hernandez & Mayra de la Torre´. 2001. Population growth kinetics of the nematode, Steinernema feltiae, in submerged