Khóa luận Sử dụng kỹ thuật RFLP khảo sát sự đa dạng di truyền của nấm Rhizoctonia solani phân lập từ nhiều cây ký chủ khác nhau

1 Phần I MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Rhizoctonia solani (R. solani) là một trong những loài nấm gây hại điển hình, chúng có thể tồn tại lâu trong đất và gây thiệt hại khá nghiêm trọng đối với rất nhiều loài cây trồng khác nhau, đặc biệt chúng thường xuyên tấn công vào giai đoạn cây con và làm chết cây con hàng loạt khiến nhiều diện tích phải gieo trồng lại. R. solani không những gây bệnh đốm vằn phổ biến ở lúa mà còn gây hại cho nhiều cây trồng khác, từ các cây dài ngày như thông, cà phê, tiêu, sầu riêng đến các cây ngắn ngày như các cây họ đậu, bắp, các cây họ cải, v.v.. kể cả trên cỏ dại như cỏ ống, cỏ lá tre, cỏ gừng, cỏ lá rộng, cỏ chỉ. Phòng trừ bệnh do R. solani gây ra bằng biện pháp sử dụng giống kháng là rất khó bởi nấm này có phổ ký chủ quá rộng. Thêm vào đó sự biến động trong độc tính gây bệnh giữa các dòng phân lập của nấm này đã làm phức tạp đáng kể sự sàng lọc giống kháng. Mặt khác, việc thiếu kiến thức về cấu trúc di truyền của R. solani trong các quần thể tự nhiên đã làm cản trở sự phát triển các biện pháp phòng trừ an toàn cho môi truờng với tác nhân gây bệnh này. Ngày nay với sự phát triển của công nghệ sinh học, nhiều kĩ thuật mới ra đời như kĩ thuật PCR, RFLP, AFLP, Southern blot, sequence v.v.. giúp cho quá trình nghiên cứu cấu trúc di truyền của quần thể nấm R. solani nhanh và chính xác hơn. Trên thế giới, các kĩ thuật này đã được áp dụng thành công trong việc nghiên cứu về sự đa dạng di truyền của nấm R. solani. Ở nước ta, những nghiên cứu như vậy còn rất ít. Xuất phát từ tình hình trên, được sự phân công của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, chúng tôi đã thực hiện đề tài “Sử dụng kỹ thuật RFLP khảo sát sự đa dạng di truyền của nấm Rhizoctonia solani phân lập từ nhiều cây ký chủ khác nhau”. 1.2. Mục tiêu Cung cấp các thông tin về sự đa dạng di truyền trong các quần thể nấm R. solani làm dễ dàng cho việc phát triển các chiến lược phòng trừ bệnh do R. solani gây ra. 2 1.3. Yêu cầu của đề tài - Phục hồi và nhân sinh khối các dòng nấm R. solani. - Ly trích DNA của các dòng nấm R. solani. - Thực hiện phản ứng PCR để khuếch đại vùng rDNA-ITS của nấm R. solani. - Thực hiện phản ứng cắt đoạn rDNA-ITS đã được khuếch đại. - Đánh giá sự đa dạng của các dòng nấm R. solani dựa trên phân tích RFLP của vùng rDNA-ITS. 1.4. Giới hạn của đề tài Chỉ tiến hành cắt giới hạn với 3 enzyme cắt giới hạn và 9 dòng nấm đại diện. 3 Phần II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Giới thiệu về nấm Rhizoctonia solani Nấm Rhizoctonia là một nhóm nấm lớn, đa dạng và phức tạp, phân bố khá rộng và được chia thành nhiều nhóm nấm khác nhau. Giai đoạn hữu tính liên quan đến 3 giống: Thanatephorus (giai đoạn vô tính là Rhizoctonia solani Kuhn), Ceratobasidium (giai đoạn vô tính là loài Rhizoctonia hai nhân), và Waitea (giai đoạn vô tính là loài R. zeae Voorhees, R. oryzae Ryker và Gooch và những loài khác) (Carling và Sumner, 1992). Rhizoctonia solani thuộc bộ nấm trơ Mycelia sterilia, lớp nấm bất toàn Fungi imperfecti. Giai đoạn sinh sản hữu tính được gọi là Thanatephorus cucumeris (Frank) Donk, thuộc lớp nấm đảm Basidiomycetes, là nấm kí sinh không chuyên tính, có phổ kí chủ rộng. 2.1.1. Đặc điểm hình thái Ở giai đoạn vô tính, nấm phát triển ở dạng sợi, tạo hạch. Sợi nấm khi còn non không màu, khi già chuyển sang màu nâu do sự tích lũy sắc tố nâu. Sợi nấm đa bào, có đường kính từ 8 - 13µm, phân nhánh tương đối thẳng góc, chỗ phân nhánh hơi thắt lại, và hình thành vách ngăn gần vị trí phân nhánh (Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề, 1998). R. solani có 3 loại sợi nấm: sợi nấm bò (runner hyphae), sợi nấm phân nhánh (lobate hyphae), và các tế bào dạng chuỗi (moniloid cells) (dẫn theo Phan Minh Sang, 2003). Lúc già, các tế bào tách ra và biến thành hạch. Đặc điểm của hạch rất thay đổi. Hạch nấm khi còn non có màu trắng nhưng khi về già có thể có màu nâu, nâu đen, nâu xám, trên vỏ có lông. Hạch nấm có hình dạng phức tạp, ít khi hình cầu, đáy phẳng, bề mặt hạch không trơn mà lồi lõm (Đường Hồng Dật, 1976). Đường kính hạch nấm từ 1- 6 mm. Từng hạch nấm có thể liên kết lại với nhau tạo thành hạch nấm to (Ou, 1983). Hạch nấm khi còn non có thể chìm dưới nước nhưng khi già nổi lên do tế bào phía ngoài hạch trở nên rỗng (dẫn theo Phạm Minh Sang, 2003). Bào tử hậu ít gặp, chỉ phát sinh khi có ẩm độ rất cao. Sinh sản hữu tính tạo đảm đơn bào, không màu, hình bầu dục, có từ 2 - 4 bào tử đảm, hình trứng hoặc hình bầu dục dẹt. Ở nước ta chưa thấy dạng sinh sản hữu tính (Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề, 4 1998). Bào tử đảm không có khả năng tồn tại lâu nhưng có vai trò lớn trong sự biến đổi di truyền của nấm (dẫn theo Hồ Viết Thế, 2005). 2.1.2. Đặc điểm sinh lý Theo Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề (1998), nấm sinh trưởng thích hợp ở nhiệt độ 28 – 32oC, ở nhiệt độ dưới 10oC và cao hơn 38oC nấm ngừng sinh trưởng. Hạch nấm hình thành nhiều ở nhiệt độ 30 – 32oC. Khi nhiệt độ quá thấp (12oC) và quá cao (40 oC), nấm không hình thành hạch. Nấm có thể phát triển được trong phạm vi pH rộng từ 3,4 - 9,2, thích hợp nhất ở độ pH 6 - 7. Hạch nấm hình thành nhiều nhất ở ngoài ánh sáng và khi nhiệt độ môi trường giảm đột ngột. Các hạch nấm này nảy mầm ở nhiệt độ 16 – 30oC, nhiệt độ tối ưu 28 – 30 oC. Ẩm độ tương đối 95 - 96% thích hợp cho hạch nấm nảy nầm (Ou, 1983). Hạch nấm có kích thước càng lớn, số lượng hạch càng nhiều thì độc tính càng cao. Hạch nấm có thể sống được 4 - 5 tháng trong đất khô, 7 tháng trong điều kiện ngập nước (Đường Hồng Dật, 1976). R. solani có thể được lưu trữ ở nhiệt độ phòng (20 - 300C) từ 6 - 12 tháng trong ống nghiệm chứa môi trường PDA (potato dextrose agar), PDYA (potato dextrose yeast extract agar) hoặc các vật liệu cây trồng tự nhiên. Nấm có thể tồn trữ trên môi trường hạt đậu khô đến 9 năm mà không làm mất tính độc. Tính độc của chúng bị mất trong vòng 2 - 3 tháng khi tồn trữ ở nhiệt độ từ 0 - 70C (Carling và Sumner, 1992). 2.1.3. Đặc điểm nuôi cấy Nấm R. solani không đòi hỏi nhu cầu dinh dưỡng chuyên biệt, nó có thể phát triển tốt trên nhiều loại môi trường khác nhau. Hạch nấm thường hình thành sau 3-4 ngày nuôi cấy. Hạch nấm hình thành nhiều hay ít, có hình thành hay không phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy, điều kiện ngoại cảnh cũng như phụ thuộc vào các nhóm nấm khác nhau. Hạch nấm thường mọc rải rác khắp đĩa, có loài mọc rời, cũng có loài mọc thành từng mảng liên kết với nhau. Tuy nhiên cũng có loài không hình thành hạch (Nguyễn Minh Nguyệt, 2003). Hạch nấm mọc trên môi trường nuôi cấy có kích thước lớn hơn so với hạch nấm mọc trên cây kí chủ tự nhiên (Ou, 1983). 2.2. Điều kiện phát sinh bệnh R. solani xâm nhập ký chủ và gây bệnh mạnh nhất trong điều kiện nhiệt độ tương đối cao (25 - 300C), ẩm độ 90% đến bão hòa, mưa liên tục. Kỹ thuật canh tác: mật độ cây, chăm sóc, phân bón, thủy lợi,…đều liên quan đến việc phát sinh bệnh. 5 Nấm xâm nhập vào mô cây qua khí khổng hoặc có thể xuyên trực tiếp qua cutin (Ou, 1983). Nấm có khả năng gây bệnh trong phạm vi nhiệt độ 23 - 310C, nhiệt độ tối thích là 310C, ẩm độ tương đối 70 - 90% (dẫn theo Nguyễn Việt Long, 2001). Hình 2.1 Chu kỳ gây bệnh của nấm Rhizoctonia solani (Nguồn: Agrios, 1997) 2.3. Phạm vi ký chủ của nấm R. solani Nấm R. solani phổ biến ở nhiều nơi và có thể gây bệnh cho trên 180 loại cây thuộc 60 họ thực vật khác nhau (Đường Hồng Dật, 1976). Quốc gia nào cũng có bệnh do nấm này gây ra. Ngoài cây lúa, nấm còn gây bệnh trên lúa miến, bắp, mía, đậu nành, đậu xanh. Nấm còn gây bệnh lở cổ rễ trên cà phê, trà, héo rũ dưa chuột và bầu bí, gây lở cổ rễ hại bông, héo vàng trên khoai tây (dẫn theo Nguyễn Việt Long, 2001). Haque (1975) đã phát hiện ra đậu phộng (Arachis hypoaea), ớt (Capcicum annum), cà rốt (Daucus carota), đậu nành (Glycine max), bông vải (Gossypium sp.), đại mạch (Hordeum vulgar), xà lách (Lactuca savita), lúa (Oryzae sativa), bắp (Zea mays), cà chua (Lycopersicum esculentum) đều nhiễm R. solani (dẫn theo Hồ Viết Thế, 2005). 6 Theo Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề (1998), nấm R. solani là loại nấm bán ký sinh, có tính chuyên hóa rộng, phạm vi ký chủ bao gồm trên 180 loài cây trồng khác nhau. Ở Việt Nam, đậu nành, bắp, lúa miến (Shorgum vulgare), mía, và 27 loài cỏ dại khác ở đồng bằng sông Cửu Long đều là ký chủ của nấm R. solani. Trong khi đó ở Mỹ, có khoảng 550 loài ký chủ của nấm R. solani đã được ghi nhận (dẫn theo Nguyễn Việt Long, 2001). 2.4. Sự phân nhóm của nấm R. solani R. solani Kuhn là loài nấm phức tạp, không đồng nhất. Nhiều nghiên cứu cho thấy có sự khác biệt giữa các dòng phân lập của nấm này về mặt hình thái học, sinh lý học và khả năng gây bệnh cho các loại cây trồng. Có hai kiểu phân loại R. solani: (i) Phân loại dựa trên sự khác nhau về tốc độ tăng trưởng, sự hình thành hạch nấm và đặc điểm phát triển khuẩn lạc. Theo cách phân loại này, Watanabe và Matsuda (1966) đã xếp các dòng phân lập của nấm R.solani thành 6 nhóm: 1A, 1B, II, IIIA, IIIB,và IIIC (dẫn theo Phạm Minh Sang, 2003). (ii) Phân loại dựa trên sự tiếp hợp (Anastomosis) của sợi nấm. Chúng được sắp xếp theo các nhóm AG (Anastomosis Group) khác nhau trên cơ sở phản ứng tiếp hợp của chúng. Xác định nhóm liên hợp AG của các dòng phân lập giúp cho việc nhận biết và phân nhóm các dòng nấm R. solani nấm được thực hiện dễ dàng (Carling và ctv, 1992). Dựa vào sự liên hợp của sợi nấm, R. solani (T. cucumeris) được phân chia làm 11 nhóm tiếp hợp từ AG-1 đến AG-11 và AG-BI (Carling và Sumner, 1992).  AG-1: nhóm này phân bố khắp thế giới, dựa trên hình thái nuôi cấy và sự gây bệnh, những dòng phân lập AG-1 đã được phân thành 3 tiểu nhóm: - AG-1-IA: còn được gọi là kiểu 2 hay kiểu “sasakii”, gây bệnh cho các bộ phận cây trên mặt đất như bệnh đốm vằn trên lúa, gây cháy lá ở nhiều ký chủ, và bệnh đốm nâu trên cỏ thảm (turfgrass). - AG-1-IB: còn được gọi là kiểu 1 hay kiểu “hạch nấm nhỏ”, cũng gây bệnh cho các bộ phận trên mặt đất như bệnh tàn rụi lá và bệnh cháy lá ở nhiều cây trồng. 7 - AG-1-IC: có ở trong đất, gây chết cây con (damping-off) trên nhiều ký chủ. Không thể phân biệt một cách rõ ràng giữa ba tiểu nhóm này bằng phản ứng tiếp hợp.  AG-2: Dựa trên khả năng gây bệnh và nhu cầu dinh dưỡng, nhóm này cũng được phân chia thành 3 tiểu nhóm. - AG-2-1: còn được gọi là kiểu “vụ đông”, có ở trong đất, gây chết cây con, thối rễ trên rất nhiều cây ký chủ và lở cổ rễ cho cây họ thập tự. - AG-2-2 IIIB: còn gọi là kiểu “cây cói” (rush), gây bệnh cho rễ và các bộ phận trên mặt đất, gây chết cây con trên nhiều cây ký chủ, bệnh đốm nâu trên cỏ và bệnh khô vằn trên cây cói. - AG-2-2 IV: còn gọi là kiểu “thối rễ”, gây bệnh cho rễ và các bộ phận trên mặt đất, gây bệnh cháy lá và thối rễ ở củ cải đường (Beta vulgaris L.), gây bệnh thối rễ ở nhiều cây trồng khác và bệnh đốm lớn trên cỏ thảm.  AG-3: được tìm thấy ở những nơi trồng khoai tây, là một nhóm nấm thuần nhất và không chia thành các nhóm nhỏ. Những dòng AG-3 mọc chậm hơn và nói chung chịu đựng được nhiệt độ lạnh hơn những nhóm tiếp hợp khác của R. solani, gây bệnh thối rễ và thân trên cây khoai tây (Solanum tuberosum L.)  AG-4: còn được gọi là kiểu “praticola”, AG-4 có thể được phân chia thành hai nhóm HG-I và HG-II, dựa trên sự khác nhau về tính tương đồng của DNA, nhưng không dựa trên phản ứng liên hợp. AG-4 là nhóm nấm đất, làm thối rễ và chết cây con ở nhiều loại cây trồng. Bệnh do AG-4 xảy ra trên toàn thế giới.  AG-5: là một nhóm nấm đất thuần nhất, gây bệnh thối rễ và thân khoai tây nhưng nói chung là ít độc hơn nhóm AG-3. Những dòng AG-5 đòi hỏi thiamine trong môi trường dinh dưỡng. Bệnh do AG-5 xuất hiện ở châu Âu, châu Á và Bắc Mỹ.  AG-6: nhóm này không gây bệnh, AG-6 chỉ có ở Nhật Bản, và được chia thành hai tiểu nhóm HG-I và GV. Hai tiểu nhóm này phân biệt với nhau dựa trên sự khác nhau về tính tương đồng của DNA, nhưng không dễ dàng phân biệt bằng phản ứng tiếp hợp.  AG-7: là một nhóm nấm đất, gây thiệt hại không đáng kể cho một số loại rau. Nhóm này cũng chỉ mới tìm thấy ở Nhật Bản. 8  AG-8: là một tác nhân gây bệnh trong đất, gây bệnh đốm lá trên ngũ cốc và cũng có thể là nguyên nhân gây bệnh thối rễ khoai tây. AG-8 được tìm thấy ở nước Úc, Tây Bắc nước Mỹ và nước Anh.  AG-9: được tìm thấy ở Alaska và Oregon, khả năng gây bệnh yếu, có thể tấn công vào khoai tây và rau xanh.  AG-10: được tìm thấy ở Tây Bắc Thái Bình Dương, khả năng gây bệnh chưa được biết rõ.  AG-BI: còn được gọi là nhóm “bridging isolate”, được tìm thấy ở Nhật Bản. Những dòng thuộc AG-BI có khả năng liên hợp ở một mức nào đó với những dòng phân lập của AG-2, AG-3, AG-6, và AG-8. AG-BI là một nhóm nấm đất đòi hỏi thiamine trong môi trường nuôi cấy, khả năng gây bệnh của nó chưa được biết rõ. Theo Carling (1996); Carling và ctv (1999); Sneh và ctv (1991), R. solani là một loài tập hợp, không đồng nhất, được chia thành 14 nhóm tiếp hợp (AGs) bao gồm từ AG-1 tới AG-13 và AG-BI (bridging isolate). Trong 14 dòng AGs được công nhận, có ít nhất 24 tiểu nhóm đã được mô tả (dẫn theo Priyatmojo và ctv, 2001). 2.5. Các phƣơng pháp phân tử thƣờng dùng để nghiên cứu sự đa dạng di truyền của nấm R. solani 2.5.1. Phƣơng pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) Phương pháp PCR là phương pháp khuếch đại nhanh nhiều bản sao của các đoạn DNA mà không cần phải qua tạo dòng. Phương pháp này được K. Mullis đưa ra năm 1985 và Saiki hoàn thiện năm 1988. Đây là phương pháp được thực hiện hoàn toàn trong ống nghiệm và trong một thời gian ngắn có thể thu rất nhiều bản sao DNA. 2.5.1.1. Nguyên tắc của phƣơng pháp PCR Phương pháp này được thực hiện trong ống nghiệm với sự hiện diện của enzyme DNA-polymerase, theo nguyên tắc bán bảo tồn trong nhân bản DNA. Sự khuếch đại được thực hiện nhờ các chu trình nhiệt lặp lại. Phản ứng xảy ra nhờ enzyme DNA-polymerase. DNA sẽ tách thành hai mạch và từ 2 mạch DNA thành 4 mạch DNA, 4 mạch DNA thành 8 mạch DNA và cứ như thế nhân lên đến vô cùng. 2.5.1.2. Các thành phần cần thiết để thực hiện phản ứng PCR Trong một phản ứng PCR cần những thành phần cơ bản như: DNA khuôn, primer, DNA polymerase chịu nhiệt, dNTPs, dung dịch đệm, và MgCl2. 9 - DNA khuôn: chứa trình tự cần khuếch đại, có thể sợi đơn hoặc sợi kép. - Primer: thường có độ dài từ 20 – 30 nucleotide, còn được gọi là nhân tố khuếch đại (amplifer). - DNA polymerase chịu nhiệt: được tách từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermus aquaticus, loài vi khuẩn này có thể phát triển ở điều kiện nhiệt độ từ 80 – 95oC. Chỉ những enzyme chịu nhiệt mới hoạt động được trong điều kiện nhiệt độ cao của phản ứng PCR. - dNTPs: Gồm 4 loại nucleotide ATP, TTP, CTP, và GTP cần cho sự tổng hợp chuỗi DNA mới. - MgCl2: Trong phản ứng PCR, MgCl2 có 3 mục đích: ion Mg 2+ tạo thành phức với dNTP để gắn dNTP với enzyme; kích thích hoạt tính polymerase; tăng Tm (melting temperature) của DNA và sự tương hỗ primer với khuôn. Nồng độ cuối cùng trong phản ứng PCR thường 0,5 – 5 mM, mức tối ưu là 1 – 1,5 mM. - Dung dịch đệm: Môi trường KCl đã và đang được áp dụng rộng rãi, là dung dịch đệm rất hữu dụng cho phản ứng PCR. pH của dung dịch đệm cũng được xem xét trong phản ứng PCR. Hầu hết các dung môi phản ứng được đệm trong môi trường 10 – 200 mM Tris-HCl ở pH = 8,3, nhiệt độ 20oC. Tuy nhiên, pH sẽ giảm khi nhiệt độ tăng. Theo chu kỳ nhiệt độ của PCR, pH sẽ thay đổi từ 7,8 đến 6,8. 2.5.1.3. Tiến hành phản ứng PCR Một phản ứng PCR thường được tiến hành qua 3 giai đoạn. - Giai đoạn 1: nâng nhiệt độ lên cao, thường từ 94 – 95oC. Ở nhiệt độ này tất cả các mạch xoắn kép của DNA được tách ra. - Giai đoạn 2: nhiệt độ được hạ nhanh xuống khoảng từ 50 – 60oC, phụ thuộc vào Tm của primer. Ở nhiệt độ này hai primer sẽ bắt cặp với hai sợi DNA cùng theo hướng 5’ – 3’. - Giai đoạn 3: nhiệt độ của phản ứng được nâng lên 72oC. Ở nhiệt độ này DNA polymerase sẽ hoạt động trong việc kéo dài các mạch DNA. Nguyên liệu dùng trong giai đoạn này là 4 loại dNTP. Cứ sau một chu kỳ gồm 3 giai đoạn như trên từ 1 DNA khuôn sẽ tạo được 2 DNA khuôn. Như vậy, sau 30 chu kỳ ta sẽ có khoảng 100 triệu DNA khuôn. 10 Ngoài 3 giai đoạn chính, người ta còn thực hiện một chu kỳ khởi động trước khi thực hiện các giai đoạn trên và một chu kỳ kết thúc sau khi thực hiện các chu kỳ lặp lại 2.5.1.4. Các nhân tố ảnh hƣởng đến phản ứng PCR DNA khuôn: có vai trò rất quan trọng, ảnh hưởng rõ rệt đến hiệu quả PCR. Phản ứng PCR tối ưu với các đoạn khuôn hoàn toàn tinh sạch, khi các đoạn khuôn không sạch còn lẫn protein, hiệu quả PCR giảm theo độ tinh sạch của DNA khuôn. Enzyme DNA polymerase càng mạnh, phản ứng PCR càng triệt để. Tùy các đặc tính của enzyme DNA polymerase, tùy thuộc nguồn gốc tách chiết enzyme, hiệu quả các phản ứng PCR khác nhau. Primer là yếu tố quan trọng nhất quyết định hiệu quả của phản ứng PCR. Chọn primer cần tính toán bảo đảm Tm của primer xuôi và ngược không chênh lệch nhau quá lớn. Nồng độ các loại nucleotide khoảng 20 – 200 M mỗi loại, khi nồng độ nucleotide quá thấp thì hiệu quả PCR giảm mạnh. Nồng độ Mg2+ cũng ảnh hưởng nhiều đến hiệu quả PCR, để có hiệu quả PCR cao cần lưu ý bảo đảm các thành phần dịch đệm, nhiệt độ và các thành phần cần thiết khi thực hiện phản ứng PCR. 2.5.1.5. Lợi ích của phản ứng PCR Phương pháp PCR có ý nghĩa rất lớn đối với khoa học và thực tiễn. Đây thực sự là một cuộc cách mạng lớn trong kĩ thuật di truyền. - Thời gian thực hiện rất nhanh. Ta chỉ cần khoảng 3 giờ để khuếch đại một trình tự DNA. Trong khi đó với phương pháp tạo dòng ta phải cần ít nhất 1 tuần. - Đơn giản và ít tốn kém. Phương pháp này được thực hiện trong ống epffendorf nhỏ. Trong khi đó phương pháp tạo dòng cần rất nhiều vật liệu đắt tiền như màng, NTP mang dấu hiệu phóng xạ và đòi hỏi phải thành thạo trong thao tác. - Độ tinh sạch của mẫu không cần cao. Phản ứng PCR có thể thực hiện được với mẫu DNA thô. Trong khi đó phương pháp tái tổ hợp DNA cần đoạn gen và vectơ tương đối tinh khiết. Khó khăn nhất của phương pháp này là phải biết trình tự nucleotide của một đoạn DNA cần được khuếch đại. Phương pháp này không thay thế phương pháp tái tổ hợp DNA mà nó góp phần bổ sung cho phương pháp tái tổ hợp DNA. 11 Hiện nay phương pháp PCR được ứng dụng trong các lĩnh vực sau: - Phân tích di truyền vệt máu khô. - Chẩn đoán các bệnh lây truyền, di truyền. - Dự báo sai hỏng về di truyền. - Nghiên cứu DNA từ các mẫu khảo cổ (Nguyễn Đức Lượng, 2002) 2.5.2. Phƣơng pháp RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) 2.5.2.1. Restriction endonuclease Trong phân tích genome, restriction endonuclease là nhóm enzyme có nhiệm vụ cực kỳ quan trọng. Đó là nhóm của DNase, ghi nhận các trình tự đặc biệt của nucleotide, và cắt DNA tại tại vị trí rất đặc biệt. Người ta xem nó như là chìa khóa để nghiên cứu kỹ thuật DNA tái tổ hợp (recombinant). Các enzyme này được nghiên cứu lần đầu tiên vào những năm 1950. Nó bao gồm một phần của tính chất giới hạn (restriction) viết tắt R, và một phần của tính chất cải tiến (modification) viết tắt là M. Hệ thống R-M trong vi khuẩn giúp nó bảo vệ chống lại sự xâm nhập của thực khuẩn thể, và những nhân tố di truyền lạ. Hệ thống R- M của vi khuẩn có xu hướng tạo ra một thế cân bằng ở sinh vật tiền nhân (prokaryote) như là một hệ thống miễn dịch. Hệ thống R-M thường có hai hoạt động chính: - Một là restriction endonuclease, viết tắt là R-Enase, rất chuyên tính tại một vị trí nào đó, nó có nhiệm vụ phân hủy DNA ngoại sinh (exogenus DNA). - Hai là modification methylase của DNA, còn được gọi là methyltranferase, viết tắt là M-MTase, có sự chuyên tính về chuỗi mã rất đồng nhất. M-MTase có nhiệm vụ cải tiến và bảo vệ DNA nội sinh (endogenus DNA) không bị phân hủy bởi R-ENase. 2.5.2.2. Nguyên tắc của phƣơng pháp RFLP Phương pháp RFLP – đa hình chiều dài các đoạn DNA cắt bởi các enzyme giới hạn (restriction enzyme), là phương pháp tạo nên các đoạn cắt khác nhau phân biệt được bằng điện di đồ, các đoạn cắt còn được gọi là các fingerprinting đặc trưng cho từng phân tử DNA. Xử lý các mẫu DNA bằng cùng một enzyme cắt giới hạn, các gen có cấu trúc khác nhau tạo nên số lượng đoạn cắt có chiều dài khác nhau, còn những gen có cấu trúc hoàn toàn giống nhau tạo nên các đoạn cắt giống nhau. 12 2.5.2.3. Quy trình của phƣơng pháp RFLP Quy trình phương pháp RFLP thông thường: - Tách chiết và tinh sạch DNA. - Cắt các mẫu DNA cần phân tích bởi cùng một enzyme cắt giới hạn. - Điện di và thực hiện phản ứng lai Southern blot. Tuy nhiên, DNA của genome là rất lớn, nên khi cắt bởi enzyme và điện di trên gel ta không thể quan sát được trực tiếp mà phải thông qua kỹ thuật Southern blot rất tốn kém và phức tạp. Do đó khi đã biết sự khác nhau trong trình tự của các loài lân cận chỉ xảy ra ở một vùng nào đó trong genome thì RFLP dựa trên PCR có thể được sử dụng để phân biệt các sản phẩm PCR. Quy trình phương pháp RFLP dựa trên PCR (phương pháp RFLP-PCR): - Tách chiết DNA tổng số. - Thực hiện phản ứng PCR để khuếch đại trình tự đích. - Xử lý các sản phẩm PCR bằng enzyme cắt giới hạn. - Phân tích trên gel các sản phẩm PCR đã được cắt. Ưu điểm của phương pháp RFLP-PCR so với phương pháp RFLP thông thường: - Cần lượng nguyên liệu DNA ít. - Có thể đọc được kết quả trực tiếp bằng mắt thông qua điện di trên gel. - Không cần phải sử dụng các đầu dò phức tạp và tốn kém. - Khi đọc kết quả dùng ánh sáng huỳnh quang thay cho chất phóng xạ. 2.6. Cơ sở khoa học của việc sử dụng đoạn rDNA-ITS trong nghiên cứu sự đa dạng di truyền của nấm R. solani 2.6.1. Giới thiệu về vùng rDNA Những gen mã hóa rRNA được tìm thấy trong vùng rDNA. Sản phẩm của những gen này (rRNA) kết hợp với những phân tử protein hình thành những ribosom có chức năng tổng hợp protein. Do nhu cầu tổng hợp protein cao, có nhiều bản sao của gen này trong các genome khác nhau (E. coli có 7 bản sao, và người có khoảng 200 bản sao trong tế bào đơn bội). Ở eukaryote, có hai tiểu đơn vị gồm 1 tiểu đơn vị nhỏ (small subunit – SSU tổng hợp từ gen 18S) và 1 tiểu đơn vị lớn (large subunit – LSU tổng hợp từ gen 28S, 5,8S và một gen 5S, nhưng thường chỉ có gen 28S được nhắc đến như là gen tổng hợp LSU). 13 Ribosom DNA chứa vùng 18S, ITS1, 5,8S (một tiểu đơn vị ribosom nhỏ hơn trở thành một phần của LSU), ITS2, 28S và vùng IGS (intergenic spacer). Vùng phiên mã 18S kết thúc tiểu đơn vị nhỏ (SSU), trong khi 28S cộng với 5,8S và một gen 5S thêm vào từ những phần khác của genome hình thành tiểu đơn vị lớn (LSU) của ribosom RNA. Những vùng ITS được phiên mã (tổng hợp từ RNA), nhưng bị cắt trước khi rRNA hoàn thiện được hình thành, mặc dù chúng có thể có một chức năng trong sự hình thành ribosom (Alberts và ctv., 1994). Ở đầu kết thúc 5' của 18S và đầu kết thúc 3' của 28S, cũng có một vùng được biết đến là ETS (external transcribed spacer). Toàn bộ vùng này bao gồm ETS-18S-ITS1-5,8S-ITS2-28S-ETS dài khoảng 13000 bp ở người và lặp lại 200 lần trong mỗi genome đơn bội, và hình thành tiền rRNA 45S. Giữa mỗi cassette của gen có một vùng gọi là IGS (intergenic spacer). Vùng này kém bảo tồn nhất của rDNA. Thành phần vùng không gian không phiên mã của IGS là quan trọng bởi vì nó chứa trình tự kết thúc phiên mã của những gen rRNA. Hình 2.2. Sơ đồ của các vùng trên rDNA và các primer đƣợc sử dụng để nghiên cứu rDNA của nấm (xem phụ lục) ( Những gen rRNA ở sinh vật có nhân điển hình (còn được gọi là ribosomal DNA hoặc rDNA) được tìm thấy như những phần đơn vị lặp lại được sắp xếp thành cặp, nằm tại vùng chromosom. Vùng này được biết đến như vùng tổ chức nhân 14 (NORs). Mỗi đơn vị lặp lại chứa một vùng phiên mã (có những gen rRNAs như 18S, 5,8S, và 26S và những vùng phiên mã bên ngoài như ETS1và ETS2) và một vùng không phiên mã (NTS). Trong vùng phiên mã, ITS được tìm thấy trên gen 5,8S rRNA bao gồm ITS1 và ITS2. 2.6.2. Sử dụng vùng rDNA để nghiên cứu sự đa dạng di truyền rDNA chứa những vùng bảo tồn (18S, 28S, 5,8S) cũng như những vùng ít bảo tồn (ITS) và những vùng biến động hơn (IGS). Những vùng này có thể được sử dụng để phân tích sự phát sinh loài và sự đa dạng di truyền của sinh vật. Trình tự của vùng này cũng được sử dụng để tìm ra và xác định sự biến thiên số lượng của nhiều loài hoặc nhóm nấm (Carbone và Kohn, 1993; Rehner và Uecker, 1994; Lloyd-MacGilp và ctv., 1996; Hallenberg và ctv., 1996; Hirata và Takamatsu, 1996; Sreenivasaprasad và ctv., 1996). Vùng ITS1 và ITS2 được tìm thấy giữa gen của tiểu đơn vị ribosom nhỏ (18S) và tiểu đơn vị ribosom lớn (28S) chỉ ra sự biến thiên trong cùng loài. Khuếch đại vùng ITS này sau đó phân tích bằng các enzyme cắt giới hạn, được sử dụng để khám phá sự khác nhau của các loại nấm (Bernier và ctv., 1994; Fabre và ctv., 1995; Arora và ctv., 1996; Buscot và ctv., 1996; Gac và ctv., 1996; Redecker và ctv., 1997). Vùng ITS2 khám phá sau vùng ITS1, và vùng ITS2 có tính bảo tồn cao hơn ở một vài vùng tương đồng của vùng 18S (Hershkovitz và ctv., 1999). Vùng IGS thậm chí cho thấy sự biến động lớn hơn và IGS-RFLP (giống với ITS-RFLP) đã được sử dụng để nghiên cứu sự đa đạng di truyền trong cùng loài. Hình 2.3. Sơ đồ của vùng rDNA-ITS của nấm ( ) 15 Gen rDNA 16S mã hóa một phân tử RNA hình thành tiểu đơn vị ribosom nhỏ của vi khuẩn điển hình (thành phần protein của tế bào). Trình tự của gen này thích hợp là một mô hình phổ biến để nghiên cứu sự tiến hóa và phân loại vi khuẩn. Gene rDNA được tìm thấy ở hầu hết các dạng sống (ngoại trừ virus và prion). Các thành phần của trình tự rDNA từ những sinh vật có quan hệ với nhau được đánh dấu giống nhau. Điều này có nghĩa , trình tự của những sinh vật thân cận đã được sắp xếp chính xác, làm cho những khác biệt dễ dàng để đánh giá. Điều đó cũng có nghĩa là chỉ một vài nhóm primer PCR là cần thiết để khuếch đại gene rDNA từ bất cứ loài vi khuẩn nào. Trình tự của rDNA 16S đã được xác định cho nhiều loài. Sự thật, không có bất kỳ gen nào khác đặc trưng cho nhiều loài như vậy (Laboratory Surveillance for Agents of Emerging Infectious Disease). Chiều dài và trình tự của những vùng ITS của rDNA được cho rằng là vùng tiến hóa nhanh nhất và vì vậy có thể rất biến đổi. Những universal primer được thiết kế từ những vùng bảo tồn nằm hai đầu vùng ITS và vùng ITS có kích thước nhỏ (600 – 700 bp) dễ dàng được khuếch đại bởi vì số bản sao lớn (lên tới 30000 bản trong mỗi tế bào (Dubouzet and Shinoda,1999) của vùng lặp lại trên rDNA. Điều này làm cho vùng ITS trở thành một đề tài được quan tâm cho việc nghiên cứu về sự tiến hóa và phát sinh loài (Baldwin và ctv., 1995; Hershkovitz và ctv., 1996, 1999) cũng như các nghiên cứu về địa lý sinh vật (biogeographic) (Baldwin, 1993; Suh và ctv., 1993; Hsiao và ctv., 1994; Dubouzet và Shinoda, 1999). Dữ liệu về trình tự của vùng ITS cũng được nghiên cứu sớm hơn để đánh giá sự đa dạng di truyền ở lúa mạch (Petersen và Seberg, 1996) (dẫn theo Sharma và ctv., không rõ năm). 2.7. Một số nghiên cứu trong nƣớc và ngoài nƣớc về sự đa dạng của nấm R .solani 2.7.1. Nghiên cứu ngoài nƣớc Gần đây, những kỹ thuật phân tử như phân tích tính tương đồng của trình tự dựa trên DNA (DNA base sequence homology), đa hình chiều dài đoạn giới hạn (RFLP) của rDNA trong vùng ITS (internal transcribed spacer), và RAPD-PCR (random amplified polymorphic DNA polymerase chain reaction) đã và đang được sử dụng để phân biệt những dòng R. solani với nhau và giữa các AG. Liu and Sinclair (1993) đã phân biệt AG-1 thành 6 nhóm cùng loài (ISG 1A, 1B, 1C, 1D, 1E, và 1F) dựa trên kỹ thuật RFLP của rDNA-ITS và phân tích isozyme. 16 Trong nghiên cứu về sự đa dạng di truyền của R. solani AG-2, Liu và Sinclair (1992), dựa trên phân tích sự đa hình isozyme và cắt giới hạn DNA, đã phân chia 70 dòng phân lập thuộc AG-2 thành 5 nhóm trong loài (ISGs) là ISG 2A, ISG 2B, ISG 2C, ISG 2D, và ISG 2E. Bản đồ giới hạn DNA đã chỉ ra rằng những nhóm này có cùng kiểu gen của rDNA tiểu ti thể và mức độ giống nhau cao trong rDNA nhân của vùng ITS, bao gồm gen RNA ribosom 5,8S. Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) đã khuếch đại những đoạn DNA khác nhau trong 5 nhóm. Trong vùng ITS, nhóm 2A và 2E có cùng chiều dài (690 bp) nhưng khác nhau tại một vị trí cắt của Eco RI, nhóm 2B, 2C, và 2D có cùng chiều dài (740 bp) nhưng khác nhau ít nhất tại một vị trí cắt giới hạn của Msp I hoặc Taq I. Matsumoto và ctv. (1996), dựa trên phân tích RFLP của gen rDNA 28S đã chỉ ra sự khác nhau trong đoạn rDNA giữa 3 nhóm tiếp hợp AG-1, AG-2, và AG-4 khi cắt với các enzyme giới hạn Bam HI, Hae III, Hha I và Hpa II. Kunigana và ctv. (1997), dựa trên phân tích trình tự vùng rDNA bao gồm vùng ITS và trình tự mã hóa rDNA 5,8S, đã chỉ ra rằng tính tương đồng trong trình tự của vùng ITS là trên 96% đối với những dòng ở cùng tiểu nhóm, 66 – 100% đối với những dòng khác tiểu nhóm nhưng cùng một nhóm tiếp hợp, và từ 55 – 96% đối với những dòng khác nhóm tiếp hợp. Schneider và ctv. (1997), khi sử dụng 25 enzyme (Alu I, BamH I, Bgl II, Cla I, Dde I, Dra I, EcoR I, EcoR V, Hae III, Hinc II, Hinf I, Hha I, Kpn I, Mbo I, Msp I, Pst I, Pvu II, Rsa I, Sau3A I, Sst I, Sst II, Sty I, Taq I, Xba I, và Xho I) cắt đoạn rDNA-ITS được khuếch đại bằng 2 primer ITS1 và ITS4, đã xác định được 13 enzyme (Msp I, Hae III, Hinc II, EcoR I, Cla I, Hinf I, Sau3A I, Dde I, Alu I, Hha I, Dra I, Sty I, và Taq I) có thể cho thấy sự đa hình các đoạn cắt giới hạn giữa các nhóm tiếp hợp của nấm R. solani. Priyatmojo và ctv. (2001), đã phân tích RFLP trên vùng rDNA-ITS, RAPD (random amplified polymorphism DNA), và về các acid béo của những dòng R. solani gây bệnh đốm hoại lá (Necrotic Leaf Spot) trên cà phê. Kết quả cho thấy đây là một quần thể AG-1 khác với các tiểu nhóm AG-1-IA, 1-IB, và 1-IC và các tác giả đã đề xuất rằng những dòng R. solani phân lập từ cà phê đại diện một tiểu nhóm mới trong AG-1là AG-1-ID. 17 Meinhardt và ctv. (2002), bằng phương pháp RFLP trên đoạn rDNA-ITS được khuếch đại bằng cặp primer ITS 1 và ITS 4 cho biết, khi cắt bằng 4 enzyme Taq I, Hha II, Hae III và Mse I cho ra những băng có kích thước khác nhau. Mbo I là enzyme duy nhất phân cắt sản phẩm khuếch đại thành 5 băng giống nhau ở tất cả các dòng được kiểm tra. Fenille và ctv. (2003), dựa trên việc giải trình tự rDNA vùng ITS, đã chỉ ra mức độ giống nhau của trình tự nucleotide giữa những dòng AG-1 IA, nguyên nhân gây bệnh cháy lá (foliar bright) trên đậu nành, là 95,1 – 100% trong vùng ITS1 và 98,5 – 100% trong vùng ITS2. Mức độ giống nhau của trình tự nucleotide giữa các tiểu nhóm IA, IB, và IC từ 84,3 – 89% trong vùng ITS1 và từ 93,3 – 95,6% trong vùng ITS2. Mức độ giống nhau của trình tự nucleotide giữa những dòng AG-4 (gây bệnh thối trụ hạ diệp ở đậu nành) và tiểu nhóm chuẩn AG-4 HGI là 99,1% trong vùng ITS1 và 99,3 – 100% trong vùng ITS2. Mức độ giống nhau trong trình tự của vùng ITS-5,8S rDNA đã chứng minh rằng những dòng R. solani ở Brazil gây bệnh cháy lá đậu nành là AG-1 IA và những dòng gây triệu chứng thối trụ hạ diệp là AG-4 HGI. 2.7.2. Nghiên cứu trong nƣớc Nguyễn Thị Nghiêm (1997) bằng phương pháp đánh dấu phân tử với kỹ thuật PCR sử dụng 2 primer chuyên biệt ERIC 1 và ERIC 2, đã chia 137 dòng nấm R. solani Kuhn thu thập ở đồng bằng sông Cửu Long thành 33 nhóm nấm mang tính đa dạng di truyền khác nhau (dẫn theo Nguyễn Việt Long , 2001). Nguyễn Thị Huệ (2003), dựa trên kỹ thuật RFLP của vùng rDNA-ITS cho biết hai dòng nấm R. solani phân lập từ cây húng quế và cây bông cho các đoạn cắt giới hạn có kích thước khác nhau khi được cắt bởi enzyme Mbo I. Hồ Viết Thế (2005), khi cắt bằng enzyme Hae III trên vùng rDNA-ITS của 4 dòng R. solani (KT-63-01, BN-61-01, BC 63-01 và ĐX-61-01) đều cho hai đoạn cắt giới hạn có kiểu gen giống nhau. Do đó, không phân tích được tính đa hình về mặt di truyền của 4 dòng này khi cắt bằng enzyme Hae III. 18 Phần III VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 3.1. Thời gian và địa điểm - Thời gian: từ 01/03/2005 đến 30/08/2005 - Địa điểm: Phòng thực tập Bệnh cây Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, khoa Nông Học, và Trung tâm Phân Tích Thí Nghiệm, Trường Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. 3.2. Nội dung nghiên cứu Phân tích sự đa dạng di truyền của các dòng nấm R. solani bằng kĩ thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) trên đoạn rDNA-ITS được khuếch đại bằng cặp primer ITS 4 và ITS 5 thông qua phản ứng PCR. 3.3. Nguồn nấm Rhizoctonia solani Các dòng nấm R. solani do Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, khoa Nông Học cung cấp. 3.4. Phƣơng pháp tiến hành 3.4.1. Phục hồi và nhân sinh khối nấm R. solani Hóa chất và vật liệu - Đường glucose - Agar - Khoai tây - Cồn 96%, và cồn 70% - Kháng sinh. Dụng cụ và thiết bị - Autoclave - Bếp điện - Tủ cấy vô trùng - Đĩa peitri 5 mm và 9 mm - Bình tam giác 200 ml - Becher 100ml 19 - Giấy thấm vô trùng - Buồng lắc định ôn. Phục hồi và nhân sinh khối nấm R. solani Các dòng nấm được giữ trong môi trường ống nghiệm lâu ngày có thể bị nhiễm hoặc mọc yếu. Cho nên trước khi sử dụng, chúng tôi cấy chuyền nấm ra môi trường thạch đĩa để phục hồi và loại bỏ nhiễm. - Phục hồi: môi trường PGA (Potato-glucose-agar). Thành phần để nấu một lít môi trường PGA. + Khoai tây: 200 g + Glucose: 20 g + Agar: 18-20 g + Nước cất: 1lít Môi trường được hấp khử trùng bằng Autoclave ở 121oC, 20 phút. Sau đó được đổ vào đĩa peitri sạch, khoảng từ 15 – 20 ml mỗi đĩa. Nấm từ các ống giống được cấy trên môi trường thạch đĩa và ủ ở nhiệt độ 25 oC trong vòng 1 – 2 ngày. - Nhân sinh khối: môi trường PGB (potato-glucose broth). + Môi trường PGB sau khi nấu được lọc qua giấy thấm hoặc bông gòn. + Cho vào mỗi bình tam giác 50 ml môi trường và hấp khử trùng bằng Autoclave ở 121oC trong 20 phút. + Nấm đã phục hồi trên môi trường PGA được cho vào các bình tam giác chứa môi trường lỏng và nuôi lắc 4 ngày ở điều kiện từ 27 – 28oC, và 120 – 150 vòng/phút. + Sợi nấm sau khi nuôi lắc được rửa lại nhiều lần với nước cất hai lần, lọc thu sợi nấm qua vải lọc hoặc giấy thấm và làm khô, giữ ở - 80oC. 3.4.2. Ly trích DNA tổng số (isolation of DNA) của nấm R. solani Quy trình ly trích DNA tổng số: dựa trên quy trình được đề xuất bởi Lee và Taylor (1990), có sự thay đổi. Các hóa chất đƣợc sử dụng để ly trích DNA - Nitơ lỏng - Lysis buffer: 50 mM Tris-HCl, pH 7.2, 50 mM EDTA, 3% SDS, 1% β- mercaptoethanol. 20 - Hỗn hợp phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1) - Hỗn hợp chloroform:izoamyl alcohol (24:1) - Natri acetate 3 M, pH 8.0 - Isopropanol 100% - Ethanol 70% - TE 1X: 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0. Các dụng cụ và thiết bị đƣợc sử dụng để ly trích DNA - Khay đựng nitơ - Cối và chày đá - Epffendorf 1,5 ml - Micropipette các loại - Đầu tip các loại - Bồn ủ nhiệt (water bath) - Máy vortex - Máy ly tâm lạnh - Giấy thấm - Tủ 4oC và - 20oC Quy trình ly trích DNA tổng số - Nghiền 0,1 – 0,3 g sợi nấm đã được làm khô kiệt trong nitơ lỏng. - Thêm 600 µl lysis buffer và vortex cho tới khi hỗn hợp đồng nhất. Nếu hỗn hợp quá đặc thì cho thêm lysis buffer (cho tới 700 µl). - Ủ 1h ở 65oC. - Thêm một thể tích tương ứng (600 µl) hỗn hợp phenol, chloroform và isoamyl alcohol (tỉ lệ 25:24:1), và lắc nhẹ. - Ly tâm 20 phút với tốc độ 13500 vòng/phút ở nhiệt độ phòng. - Chuyển dịch nổi (khoảng 400 µl) vào một ống eppendorf mới. - Thêm 400 µl hỗn hợp chloroform, izoamyl alcohol (24:1), lắc nhẹ. Ly tâm 20 phút với tốc độ 13500 vòng/phút ở nhiệt độ phòng (25 – 28oC). - Hút lấy dịch nổi (khoảng 200 µl) vào một epffendorf mới. - Kết tủa DNA bằng cách thêm 0,03 thể tích natri acetate 3M (6 µl) và 0,5 thể tích isopropanol (100 µl). Trộn nhẹ nhàng nhưng cẩn thận. - Ly tâm 5 phút (14000 vòng/phút ở 4oC) 21 - Loại bỏ dịch nổi, rửa phần kết tủa 3 lần với ethanol 70% lạnh. - Làm khô DNA kết tủa, hòa tan DNA với một thể tích TE 1X (từ 50-100 µl) và trữ ở 4oC hoặc -20oC cho đến khi sử dụng. - Kiểm tra sự có mặt và độ tinh sạch của DNA bằng cách điện di trên gel agarose. Đo hàm lượng DNA bằng máy đo quang phổ OD. 3.4.3. Khuếch đại vùng rDNA-ITS của các dòng nấm R. solani Các hóa chất đƣợc sử dụng để thực hiện phản ứng PCR - Dung dịch đệm PCR 10X (amplification buffer): 200 mM Tris-HCl (pH 8,4), 500 mM KCl) (Bio-rad) - MgCl2 50 mM (Bio-rad) - dNTP 10 mM (gồm dATP, dTTP, dGTP, dCTP) (Promega) - Taq DNA polymerase 5 UI/µl (Bio-rad) - Primer: ITS4 và ITS5 Các dụng cụ và thiết bị đƣợc sử dụng thực hiện phản ứng PCR - Hộp đá khô -20oC - Eppendorf 0,2 ml - Micropipette 10 µl, 100 µl và các loại đầu tip tương ứng - Máy luân nhiệt - Tủ thao tác vô trùng Quy trình thực hiện phản ứng PCR - Sử dụng hai primer ITS 4 và ITS 5 (White và ctv, 1990) để khuếch vùng rDNA-ITS của nấm R. solani có kích thước khoảng 700 bp. - Trình tự hai primer như sau: ITS4: 5’ TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC 3’ ITS5: 5’ GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G 3’ Bảng 3.1. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR Các bƣớc của phản ứng Nhiệt độ Thời gian Giai đoạn khởi động Chạy chu kỳ (30 chu kỳ) Tách DNA khuôn Ủ bắt cặp Kéo dài 94 o C 94 o C 56 o C 72 o C 3 phút 1 phút 30 giây 1 phút 22 Giai đoạn kết thúc 72oC 7 phút Bảng 3.2. Hỗn hợp để thực hiện phản ứng PCR Thành phần Nồng độ cuối cùng Dung dịch đệm PCR MgCl2 dNTPs Primer ITS4 Primer ITS5 Taq DNA polymerase DNA khuôn mẫu Nước cất vô trùng 1X 1,5 mM 160 µM mỗi dNTP 2 pmol/µl 2 pmol/µl 0,04 UI <100 ng vừa đủ thể tích yêu cầu 3.4.4. Điện di và đọc kết quả PCR trên gel agarose Các hóa chất đƣợc sử dụng để điện di và đọc kết quả - Agarose - TAE 0,5X - Loading dye 6X - Ethidium bromide Các dụng cụ và thiết bị đƣợc sử dụng để điện di và đọc kết quả - Cân kĩ thuật 4 số - Lò viba - Khay đổ gel - Bồn và máy điện di (Bio-rad) - Giấy parafin - Máy chụp hình gel (Gel doc). - Ống đong Quy trình thực hiện - Cho 0,1875 g agarose vào 12,5 ml dung dịch TAE 0,5X (nồng độ 1,5%). - Đun sôi hỗn hợp trên khoảng hai phút trong lò viba. - Để nguội ở nhiệt độ phòng còn khoảng 50oC. - Đổ gel vào khay (đặt lược tạo giếng trước khi đổ gel), chú ý tránh bọt khí khi đổ gel. 23 - Để gel đông đặc lại ở nhiệt độ phòng, rút lược ra khỏi gel, cho gel vào bồn điện di chứa dung dịch TAE 0,5X. - Trộn 2-3 µl sản phẩm PCR với 1µl loading dye và cho vào giếng của gel. - Vận hành máy điện di ở 50V trong khoảng 50 – 60 phút. Đọc kết quả điện di Sau khi điện di, gel được nhuộm trong dung dịch ethidium bromide từ 5 - 15 phút. Vớt ra, rửa lại nhiều lần với nước và đọc kết quả dưới tia UV. DNA liên kết với ethidium bromide sẽ phát sáng dưới tia UV. Chụp ảnh kết quả điện di bằng máy Gel doc thông qua phần mềm Quantity one. 3.4.5. Phân tích RFLP vùng rDNA-ITS của các dòng nấm R. solani Sản phẩm PCR được cắt bởi ba enzyme giới hạn Alu I, Hae III, và Taq I để phát hiện hiện tượng đa hình trong phạm vi vùng ITS của rDNA đã được khuếch đại của 9 dòng nấm R. solani (RM-61, BV-61-02, CX-8-02, CTĐ-77, BV-62-03, KT-63- 01, XL-4, L-73, và ĐHL-63). Phản ứng cắt được thực hiện như sau: - Ủ khoảng 1 g DNA đã được khuếch đại với 1U enzyme cắt dưới những điều kiện nhà sản xuất (Roche) hướng dẫn. Thành phần của phản ứng xem bảng 3.3. - Những đoạn DNA đã cắt được phân tách bằng điện di trên gel agarose 2%, sau đó gel được nhuộm ethidium brommide. Đọc kết quả và chụp hình dưới tia UV. Bảng 3.3. Thành phần phản ứng enzyme cắt Thành phần phản ứng Nồng độ đầu Thể tích SuRE/cut Buffer DNA Restriction enzyme Nước cất vô trùng 10X 100 – 150 ng 10 UI 2,5 l 6 – 10 l 0,1 l Vừa đủ thể tích 25 l 24 Phần IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Ly trích DNA tổng số của nấm R. solani Tách chiết DNA là bước quan trọng đầu tiên để cho phép phản ứng PCR có thành công hay không. Việc tách chiết phải đảm bảo thu nhận được lượng DNA có trong mẫu. Mặt khác, DNA thu được cũng phải có độ tinh sạch nhất định. Theo quy trình ly trích như phương pháp đã nêu ở mục 3.3.2, chúng tôi đã ly trích được DNA tổng số của các dòng nấm Rhizoctonia solani. DNA đã được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose (Hình 4.1). Do không xử lý RNAse nên vẫn còn lẫn RNA nhưng DNA thu được tương đối sạch để thực hiện phản ứng PCR. Hình 4.1. Ảnh điện di DNA tổng số của một số dòng nấm R. solani chƣa xử lý RNase. 1. ĐHL-63; 2. BV-61-01; 3. CP-50-02; 4. BN-61-01 5. ĐT-77; 6. BV-50-01; 7. BV-61-05; 8. BĐ-TL 9. CLV-72-02; 10. CX-8-02; 11. TL-72; 12. CTĐ-77 Nguyễn Thị Huệ (2003), áp dụng quy trình ly trích DNA của Raeder và Broda (1985), đã thu được DNA tổng số của nấm R. solani. Nhưng quy trình cần 1 giờ để ly tâm loại bỏ cặn nấm và sử dụng RNase để xử lý RNA. Như vậy quy trình ly trích chúng tôi đã thực hiện là đơn giản, ít tốn kém, và tiết kiệm thời gian hơn so với phương pháp của Nguyễn Thị Huệ (2003) đã sử dụng. DNA tổng số Phần tạp 25 Hồ Viết Thế (2005), khi sử dụng phương pháp ly trích DNA của Lee và Taylor cũng thu được DNA tổng số của nấm R. solani. Chúng tôi cũng sử dụng quy trình này nhưng đã thêm bước ly trích với hỗn hợp chloroform: isoamyl alcohol sau khi ly trích với hỗn hợp phenol: chloroform: isoamyl alcohol. Kết quả, quy trình ly trích có cải tiến của chúng tôi đã thu được DNA tổng số tinh sạch hơn phương pháp của Hồ Viết Thế (2005) đã thực hiện. 4.2. Khuếch đại vùng rDNA-ITS thông qua phản ứng PCR 4.2.1. Lƣợng DNA khuôn Lượng DNA khuôn mẫu (DNA template) dùng trong phản ứng PCR khoảng từ 10 – 100 ng. Nếu lượng DNA khuôn quá cao sẽ tạo ra những sản phẩm phụ không mong muốn. Do đó, trước khi thực hiện phản ứng PCR, chúng tôi đã định lượng DNA bằng máy đo quang phổ. Dựa vào kết quả định lượng, chúng tôi pha loãng DNA gốc trong nước cất vô trùng để nồng độ đạt khoảng 100 ng. Sau khi pha loãng, DNA được điện di lại trên gel agarose. Kết quả điện di (Hình 4.2) cho thấy, các mẫu sau khi pha loãng có nồng độ DNA tương đối ngang bằng với mẫu DNA chuẩn 100 ng. Như vậy, phương pháp đo huỳnh quang để đánh giá nồng độ DNA là đáng tin cậy. Hình 4.2. Ảnh điện di DNA tổng số của một số dòng R. solani sau khi pha loãng 1. BV-61-06; 2. BV-61-05; 3. BV-50-01; 4.BV-62-03; 5. BV-71-01 6. BV-50-02; 7. BV-71-02; 8. BV-61-04; 9. DNA chuẩn 100 ng 26 4.2.2. Khảo sát chu trình nhiệt Chúng tôi tiến hành khảo sát 4 chu trình nhiệt để tìm ra chu trình nhiệt thích hợp cho phản ứng PCR để khuếch đại đoạn rDNA-ITS của nấm R. solani với hai primer ITS 4 và ITS 5 (White và ctv. 1990). Bảng 4.1. Các chu trình nhiệt đƣợc khảo sát Chu trình 1 Chu trình 2 Chu trình 3 Chu trình 4 94 oC: 3 phút 94 oC: 30 giây 56 oC: 1 phút 72 oC: 1 phút 72 oC: 7 phút 94 oC: 3 phút 94 oC: 1 phút 56 oC: 45 giây 72 oC: 1 phút 72 oC: 7 phút 94 oC: 3 phút 94 oC: 30 giây 56 oC: 45 giây 72 oC: 1 phút 72 oC: 7 phút 94 oC: 3 phút 94 oC: 1 phút 56 oC: 30 giây 72 oC: 1 phút 72 oC: 7 phút Chúng tôi đã nhận được kết quả thể hiện qua Hình 4.3. Hình 4.3. Ảnh điện di sản phẩm PCR với các chu trình nhiệt khác nhau (A). Chu trình 1; (B). Chu trình 2; (C). Chu trình 3; (D). Chu trình 4 Kết quả điện di trên agarose cho thấy, cả 4 chu trình, chúng tôi đều khuếch đại được vùng rDNA-ITS của nấm R. solani. Sản phẩm có kích thước khoảng 700 bp. Tuy nhiên, ở chu trình 1, phần dư rất rõ bên dưới và có một băng mờ bên trên băng chính. Ở chu trình 4, mặc dù phần dư không thể hiện nhưng băng sản phẩm mờ hơn băng sản phẩm của chu trình 2 và chu trình 3. Mặt khác, tỉ lệ thành công của phản ứng khi áp dụng chu trình 4 thấp (tỉ lệ là 2 lần thành công trên 5 lần thực hiện). Giữa chu 30 chu kỳ 30 chu kỳ 30 chu kỳ 30 chu kỳ 700bp (A) (B) (C) (D) 700bp 27 trình 2 và chu trình 3, chúng tôi quyết định chọn chu trình 2 vì chu trình 2 cho băng sản phẩm khuếch đại rõ nét hơn chu trình 3. Do đó, chúng tôi sử dụng chu trình nhiệt thứ 2 để tiến hành các thử nghiệm tiếp theo. 4.2.3. Khảo sát nồng độ primer Những phần dư không mong muốn trong sản phẩm PCR (Hình 4.3) được dự đoán có thể là do primer dư. Vì theo Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang (1999), nồng độ primer quá cao sẽ dẫn đến sự hình thành Primer – dimer và hiện tượng priming nhầm. Nên chúng tôi quyết định tiến hành khảo sát tìm nồng độ primer thích hợp cho phản ứng PCR khuếch đại đoạn rDNA-ITS của nấm R. solani. Chúng tôi khảo sát 3 nồng độ primer là 2 pmol/µl, 1 pmol/µl, và 0,4 pmol/µl. Kết quả được thể hiện qua hình 4.4. (A) (B) (C) Hình 4.4. Ảnh điện di sản phẩm PCR với các nồng độ primer khác nhau (A). 2 pmol/µl; (B). 1 pmol/µl; (C). 0,4 pmol/µl Kết quả cho thấy, với primer có nồng độ 2 pmol/µl, phần dư vẫn còn thể hiện rõ. Với primer có nồng độ 1 pmol/µl, và 0,4 pmol/µl, phần dư giảm hẳn xuống. Giữa hai nồng độ primer 1 pmol/µl, và 0,4 pmol/µl, chúng tôi lựa chọn nồng độ 0,4 pmol/µl để tiết kiệm primer. Như vậy, chúng tôi đã chọn được quy trình PCR để khuếch đại đoạn rDNA – ITS của nấm R. solani cho kết quả tốt nhất. Quy trình này được thể hiện qua Bảng 4.2 và Bảng 4.3. 700bp 28 Bảng 4.2. Điều kiện cho phản ứng PCR Thành phần phản ứng Nồng độ đầu Nồng độ cuối Thể tích PCR Buffer MgCl2 dNTPs Primer ITS4 Primer ITS5 Taq DNA polymerase DNA khuôn mẫu Nước cất vô trùng 10X 50 mM 2 mM 10 pmol/µl 10 pmol/µl 1UI < 100 ng 1X 1,5 mM 0,2 mM 0,4 pmol/µl 0,4 pmol/µl 0,04 UI 2,5 µl 0,75 µl 2 µl 1 µl 1 µl 1 µl 1 µl vừa đủ V 25 µl Bảng 4.3. Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR Các bƣớc của phản ứng Nhiệt độ Thời gian Giai đoạn khởi động Chạy chu kỳ (30 chu kỳ) Tách DNA khuôn Ủ bắt cặp Kéo dài Giai đoạn kết thúc 94 0 C 94 0 C 56 0 C 72 0 C 72 0 C 3 phút 1 phút 45 giây 1 phút 7 phút 4.2.4. Kết quả khuếch đại vùng rDNA-ITS của nấm R. solani Primer ITS 4 và ITS 5 là các universal primer được White và ctv. (1990) thiết kế để khuếch đại vùng ITS nằm trong vùng rDNA của ti thể và nhân của nấm. Vùng rDNA-ITS (gồm ITS1-5,8S-ITS2) có chiều dài khoảng 700 bp. Sau khi chọn được quy trình thích hợp cho phản ứng PCR, chúng tôi đã tiến hành khuếch đại đoạn rDNA-ITS của các dòng nấm R. solani phục vụ cho mục đích tiếp theo. Kết quả được thể hiện qua hình 4.5. Kết quả điện di sản phẩm PCR của chúng tôi trên gel agarose cho thấy, chúng tôi đã thu được một sản phẩm có kích thước khoảng 700 bp. Như vậy, chúng tôi đã khuếch đại thành công vùng rDNA-ITS của nấm R. solani 29 Hình 4.5. Ảnh điện di sản phẩm khuếch đại đoạn rDNA-ITS của các dòng nấm R. solani 1. XL-4; 2. RM-61; 3. BV-61-02; 4. CX-8-02; 5. CTĐ-77; 6. BV-62-03; 7. ĐHL-63; 8. KT-63 4.3. Phân tích RFLP vùng rDNA-ITS của các dòng nấm R. solani Schneider và ctv (1997), khi sử dụng kỹ thuật RFLP trên vùng rDNA-ITS của nấm R. solani đã xác định được 13 enzyme (Msp I, Hae III, Hinc II, EcoR I, Cla I, Hinf I, Sau3A I, Dde I, Alu I, Hha I, Dra I, Sty I, và Taq I) có thể cho thấy sự đa hình các đoạn cắt giới hạn giữa các nhóm liên hợp của nấm R. solani. Trong điều kiện giới hạn của đề tài, chúng tôi chỉ chọn 3 enzyme Hae III, Alu I, và Taq I để cắt đoạn rDNA-ITS đã được khuếch đại của 9 dòng nấm R. solani. Ba enzyme cắt giới hạn Hae III, Alu I và Taq I đều cắt vùng rDNA-ITS của nấm R. solani thành các phân đoạn DNA nhỏ hơn và cho các kiểu cắt khác nhau phụ thuộc vào dòng nấm. Mỗi kiểu cắt khác nhau được tính là một kiểu gen. Các dòng nấm có bao nhiêu kiểu cắt khác nhau được tính là bấy nhiêu kiểu gen. Với enzyme Alu I, vùng rDNA-ITS của 9 dòng nấm R. solani được cắt thành một trong 4 kiểu cắt sau: kiểu A1 gồm có hai phân đoạn DNA có kích thước khoảng 500 bp và 220 bp; kiểu A2 gồm có ba phân đoạn DNA có kích thước khoảng 410 bp, 220 bp, và 80 bp; kiểu A3 gồm có ba phân đoạn DNA có kích thước khoảng 430 bp, 220 bp, và 70 bp; và kiểu A4 gồm có 3 phân đoạn DNA có kích thước khoảng 480 bp, 200 bp và 50 bp (Hình 4.6 và Bảng 4.4). 700bp 1 2 3 4 30 Hình 4.6. Ảnh điện di sản phẩm cắt vùng rDNA-ITS của nấm R. solani bằng enzyme hạn chế Alu I 1. RM-61; 2. BV-61-02; 3. CX-8-02; 4. CTĐ-77; 5. BV-62-03; M. Ladder 100 bp; 6. KT-63-01; 7. XL-4; 8. L-73; 9. ĐHL-63. Kết quả cho thấy, vùng rDNA-ITS của 3 dòng nấm R. solani (RM-61, BV-61-02, và L-73) có một vị trí cắt của Alu I, và 6 dòng (CX-8-02, CTĐ-77, BV-62-03, KT-63- 01, XL-4, và ĐHL-63) có hai vị trí cắt của Alu I, tạo ra các đoạn cắt có chiều dài khác nhau. Với enzyme Hae III, vùng rDNA-ITS của tất cả 9 dòng nấm R. solani nói trên đều có hai vị trí cắt của enzyme này và cho ra ba phân đoạn DNA với chiều dài các đoạn cắt khác nhau tùy theo dòng nấm. 9 dòng nấm này cho ra 5 kiểu cắt RFLP: kiểu H1 (dòng RM-61, BV-61-02, CTĐ-77, BV-62-03, và L-73) với các băng có kích thước khoảng 510 bp, 120 bp, và 90 bp; kiểu H2 (dòng CX-8-02) với các băng có kích thước khoảng 500 bp, 120 bp, và 90 bp; kiểu H3 (dòng KT-63-01) với các băng có kích thước khoảng 580 bp, 490 bp, và 120 bp; kiểu H4 (dòng XL-4) với các băng có kích thước khoảng 510 bp, 120 bp, và 80 bp; và kiểu H5 (dòng ĐHL-63) với các băng có kích thước khoảng 530 bp, 120 bp, và 80 bp (Hình 4.7 và Bảng 4.4) 1 2 3 4 5 M 6 7 8 9 500bp 1 2 LD 3 4 5 6 7 LD 8 9 200bp 31 Hình 4.7. Ảnh điện di sản phẩm cắt vùng ITS rDNA của nấm R. solani bằng enzyme hạn chế Hae III 1. RM-61; 2. BV-61-02; M: ladder 100 bp; 3. CX-8-02; 4. CTĐ-77; 5. BV-62-03; 6. KT-63-01; 7. XL-4; M. Ladder 100 bp; 8. L-73; 9. ĐHL-63. . s Hình 4.8. Ảnh điện di sản phẩm cắt vùng rDNA-ITS của nấm R. solani bằng enzyme hạn chế Taq I 1. RM-61; 2. BV-61-02; 3. CX-8-02; M: ladder 100 bp; 4. CTĐ-77; 5. BV-62-03; 6. KT-63-01; 7. XL-4. Với enzyme Taq I, chúng tôi chỉ thực hiện trên 7 dòng (hai dòng L-73 và ĐHL- 63 chưa được thực hiện). Tất cả 7 dòng được cắt đều có hai vị trí cắt của Taq I và tạo thành 3 phân đoạn DNA. Kết quả, 7 dòng cho ra 4 kiểu cắt RFLP: kiểu T1 (dòng RM- 61, BV-61-02, BV-62-03, và KT-63) với các phân đoạn DNA có kích thước khoảng 350 bp, 310 bp, và 60 bp; kiểu T2 (dòng CX-8-02) với các phân đoạn DNA có kích thước khoảng 360 bp, 290 bp, và 60 bp; kiểu T3 (dòng CTĐ-77) với các phân đoạn 100bp 500bp 100bp 500bp 1 2 3 M 4 5 6 7 1 2 M 3 4 5 6 7 M 8 9 32 DNA có kích thước 340 bp, 320 bp, và 60 bp; và kiểu T4 (dòng XL-4) với các phân đoạn DNA có kích thước khoảng 340 bp, 310 bp, và 60 bp (Hình 4.8 và Bảng 4.4) Kết hợp các kiểu cắt enzyme giới hạn bởi 3 enzyme (Hae III, Alu I và Taq I), 7 dòng nấm R. solani (trừ 2 dòng L-73 và ĐHL-63) có 6 dạng (rDNA-ITS): Dạng 1 (A1, H1, T1), dạng 2 (A2, H2, T2), dạng 3 (A3, H1, T3), dạng 4 (A3, H1, T1), dạng 5 (A3, H3, T1), và dạng 6 (A2, H4, T4). Dạng 1 có hai dòng RM-61 và BV-61-02; dạng 2 chỉ có một dòng là dòng CX-8-02, dạng 3 – dòng XL-4; dạng 4 – dòng CTĐ-77; dạng 5 – dòng BV-62-03; và dạng 6 – dòng XL-4 (Bảng 4.4). Riêng 2 dòng L-73 và ĐHL-63 vì chỉ mới cắt với 2 enzyme Alu I và Hae III, nên chưa xác định được dạng rDNA-ITS của chúng. Tóm lại khi cắt bằng 3 enzyme Hae III, Alu I và Taq I, chúng tôi đã nhận thấy có sự đa hình các đoạn cắt giới hạn trong vùng rDNA-ITS của các dòng nấm R. solani phân lập từ các cây ký chủ khác nhau. Bảng 4.4. Chiều dài các đoạn cắt giới hạn vùng rDNA-ITS đƣợc ƣớc tính (bp) của 9 dòng nấm R. solani khi cắt với 3 enzyme Alu I, Hae III, và Taq I Enzyme Dạng 1 (RM-61 và BV-61-02) Dạng 2 (CX-8- 02) Dạng 3 (CTĐ- 77) Dạng 4 (BV- 62-03) Dạng 5 (KT- 63-01) Dạng 6 (XL-4) Dạng ? L-73 Dạng ? ĐHL- 63 Alu I A1* A2 A3 A3 A3 A2 A1 A4 500 220 410 220 (80)** 430 220 (70) 430 220 (70) 430 220 (70) 410 220 (80) 500 220 480 200 (50) Hae III H1 H2 H1 H1 H3 H4 H1 H5 510 120 (90) 500 120 (90) 510 120 (90) 510 120 (90) 580 490 120 510 120 (80) 510 120 (90) 530 120 (80) Taq I T1 T2 T3 T1 T1 T4 350 310 (60) 360 290 (60) 340 320 (60) 350 310 (60) 350 310 (60) 340 310 (60) Chưa thực hiện Chưa thực hiện * : A1 – T4 chỉ tên các kiểu RFLP với các enzyme Alu I, Hae III, hoặc Taq I. ** : Những băng (band) không nhìn thấy rõ trên ảnh điện di. 33 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận 1. Có thể sử dụng quy trình ly trích DNA của Lee và Taylor (1990) có cải tiến để ly trích DNA tương đối tinh sạch sử dụng cho phản ứng PCR khuếch đại đoạn rDNA- ITS của nấm R. solani. 2. Đã cải tiến được chu trình nhiệt và các thành phần phản ứng PCR để khuếch đại thành công vùng rDNA-ITS của các dòng nấm R. solani với cặp primer ITS 4 và ITS 5. 3. Tính đa hình các đoạn cắt giới hạn giữa 9 dòng nấm R. solani (RM-61, BV-61- 02, CX-8-02, CTĐ-77, BV-62-03, KT-63-01, XL-4, L-73, và ĐHL-63) đã được nhận thấy khi cắt vùng rDNA-ITS với enzyme Alu I, Hae III, và Taq I. Phân tích ITS-RFLP cho thấy, 7 dòng nấm R. solani nói trên (trừ 2 dòng L-73, và ĐHL-63) thuộc 6 nhóm khác nhau. 5.2. Đề nghị 1. Hoàn thiện quy trình điện di để đọc được kết quả phản ứng cắt một cách chính xác hơn. 2. Tiếp tục phân tích ITS-RFLP với nhiều enzyme cắt hạn chế hơn và trên nhiều dòng nấm hơn để có thể đánh giá được chính xác hơn sự đa dạng di truyền của các dòng nấm R. solani ở nước ta. 3. Nghiên cứu đọc trình tự vùng rDNA-ITS của 9 dòng nấm R. solani đã được sử dụng trong đề tài để xác định chính xác kiểu gen có thể có của các dòng nấm này. 34 Phần VI TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999. Di truyền phân tử: Những nguyên tắc cơ bản trong chọn giống cây trồng. NXB Nông Nghiệp, Tp. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 2. Đƣờng Hồng Dật, 1976. Sổ tay bệnh hại cây trồng tập 1. NXB Nông Thôn, Việt Nam. 3. Nguyễn Thị Huệ, 2003. Khảo sát một số đặc tính và đánh giá sự đa dạng của các mẫu phân lập Rhizoctonia solani thu thập từ một số cây kí chủ khác nhau. Luận văn tốt nghiệp ngành Nông Học. Đại học Nông Lâm, Tp.Hồ Chí Minh, Việt nam. 4. Nguyễn Thị Hƣơng, 2005. Một số đặc tính của các dòng nấm Rhizoctonia solani phân lập từ nhiều cây kí chủ khác nhau. Luận văn tốt nghiệp ngành Nông Học. Đại học Nông Lâm, Tp.Hồ Chí Minh, Việt Nam. 5. Nguyễn Việt Long, 2001.Hiệu quả phòng trừ bệnh đốm vằn trên lúa của hai chủng vi khuẩn đối kháng với nấm Rhizoctonia solani trên ruộng lúa nước ở Đồng Tháp. Luận văn thạc sĩ ngành Nông Học, Đại học Nông Lâm, Tp. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 6. Nguyễn Đức Lƣợng, 2001, Công nghệ sinh học, NXB Đại học Quốc Gia, Tp. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 7. Nguyễn Đức Lƣợng và ctv., 2002. Công nghệ gen. NXB Đại học Quốc Gia, Tp. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 8. Vũ Triệu Mân và Lê Lƣơng Tề, 1998. Giáo trình bệnh cây nông nghiệp, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội, Việt Nam. 9. Nguyễn Minh Nguyệt, 2003. Khảo sát một số đặc tính của nấm Rhizoctonia solani phân lập từ cây bông (Gossypium sp.) và cây bắp (Zea may L.). Luận văn tốt nghiệp ngành Nông Học. Đại học Nông Lâm, Tp. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 10. Ou S. H., 1983. Bệnh hại lúa (Viện Bảo Vệ Thực Vật dịch). Nhà xuất bản Nông Nghiệp, Hà Nội, Việt Nam. 11. Phạm Minh Sang, 2003. Hiệu lực của chế phẩm vi khuẩn đối kháng và kích thích sinh trưởng trong phòng trừ bệnh khô vằn (Rhizoctonia solani Kuhn) 35 trên lúa. Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp. Đại học Nông Lâm, Tp. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 12. Khuất Hữu Thanh, 2003. Cơ sở di truyền phân tử và kỹ thuật gen. NXB Khoa Học và Kỹ Thuật, Hà Nội, Việt Nam. 13. Lê Duy Thành, 2000. Cơ sở di truyền chọn giống thực vật. NXB Khoa Học và Kỹ Thuật, Hà Nội, Việt Nam. Tiếng Anh: 14. Carling D.E. and Sumner D.R., 1992. Rhizoctonia pp 157-165. In: Singlton L., Mihail J.D. and Rush C.M. (eds), Methods for research on soilborne phyto-pathologenic fungi. APS Press, St. Paul, Minnesota. 15. Fenille R. C., Ciampi M. B., Kuramae E. E., and Souza N. L., 2003. Identification of Rhizoctonia solani associated with soybean in Brazil by rDNA-ITS sequences. Fitopatol. bras. vol 28. 16. Hsiang T. and Dean J. D., 2001. DNA sequencing for anastomosis grouping of Rhizoctonia solani isolates from Poa annua. International turfgrass society 9: 674-678. 17. Kunigana S., Natsuaki T., Takeuchi T., and Yokosawa R., 1997. Sequence variation of the rDNA ITS regions within and between anastomosis groups in Rhizoctonia solani. Curr Genet 32: 237 – 243. 18. Lee S.B., and Taylor J.W., 1990. Isolation of DNA from fungal mycelia and single spores, In: Weising K., Nybom H., Wolff K., and Meyer W., 1995, DNA fingerprinting in plants and fungi. CRC Press, Boca Raton, Ann Arbor, London, Tokyo.p. 70-71. 19. Liu, Z. L. và Sinclair, J. B., 1992. Genetic Diversity of Rhizoctonia solani anastomosis group 2. Phytopathology 82: 778 – 787. 20. Liu, Z. L. và Sinclair, J. B., 1993.Differentiation of intraspecific groups within anastomosis group 1 of Rhizoctonia solani using ribosomal DNA internal transcribed spacer and isozymecomparisions. Can. J. Plant Phathol 15: 272 – 280. 21. Matsumoto M., Furuya N., Takanami Y. and Matsuyama N., 1996. RFLP analysis of the PCR-amplified 28S rDNA in Rhizoctonia solani. Mycoscience 37: 351 – 356. 22. Meinhardt L. W., Wulff N. A., Bellato C. M., and Tsai S. M., 2002. Genetic analyses of Rhizoctonia solani isolates from Phaseolus vulgaris grown in the Atlantic Rainforest of Sao Paulo, Brazil. Fitopalogia Brasileira 27: 259 – 267. 36 23. Priyatmojo A., Escopalao V. E., Tangonan N. G., Pascual C. B., Suga H., Kageyama K. and Hyakumachi M., 2001. Characterization of a new subgroup of Rhizoctonia solani Anastomosis Group 1 (AG-1-ID), Causal agent of a necrotic leaf spot on coffee. Phytopathology 91:1054-1061. 24. Reader U., and Broda, 1985. Rapid preparation of DNA from filamentous fungi. Letter in Applied Microbiology 1: 17-20. 25. Schneider J. H. M., Salazar O., Rubio V., and Keijer, 1997. Identification of Rhizoctonia solani associated with field-grown tulips using ITS rDNA polymormphism and pectic zymograms. Plant Pathology 103: 607 – 622. 26. Sharma S., Rustgi S., Balyan H. S., and Gupta P. K., (unknown year). Internal transcribed spacer (ITS) sequences of ribosomal DNA of wild barley and their comparsion with ITS sequences in common wheat. Molecular Biology Laboratory, Department of Agricultural Botany Ch. Sharan University, Meerut-250 004, India. 27. White, T.J., Bruns, T., Lee, S., and Taylor, J., 1999. Amplification anhd direct sequencing of fungal ribosome ARN genes for phylogenetics. P 315 - 322. In: Innis M. A., Gelfanhd D. H., White J. J. (eds) PCR protocols, a guide to methods and applications. Academic Press, New York. Web 37 PHẦN VII PHỤ LỤC 7.1. Danh sách các dòng nấm Rhizoctonia solani đƣợc sử dụng trong đề tài Bảng 7.1. Danh sách các dòng nấm Rhizoctonia solani đƣợc sử dụng trong đề tài STT Tên dòng nấm Cây kí chủ Nơi thu thập 1 B-34-01 Bắp Song Phượng, Hoài Đức, Hà Tây 2 B-61-01 Bắp Phước Tân, Long Thành, Đồng Nai 3 B-38 Bắp HTX Quỳnh Vinh, Quỳnh Lưu, Nghệ An 4 BC-63-01 Cải bắp Đà Lạt, Lâm Đồng 5 BN-61-01 Bồ ngót Định Quán, Đồng Nai 6 BĐ-TL Bí đao Thái Lan 7 BV-50-01 Bông vải Cư M Nga, Daklak 8 BV-50-02 Bông vải Cư Jút, Daklak 9 BV-61-01 Bông vải Sông Trầu, Thống Nhất, Đồng Nai 10 BV-61-02 Bông vải Vĩnh Tân, Thống Nhất, Đồng Nai 11 BV-61-04 Bông vải Vĩnh Tâm, Vĩnh Cửu, Đồng Nai 12 BV-61-05 Bông vải Xã lộ 25, Thống Nhất, Đồng Nai 13 BV-61-06 Bông vải Cẩm Đường, Long Thành, Đồng Nai 14 BV-62-01 Bông vải Bình Thuận 15 BV-62-02 Bông vải Ninh Thuận 16 BV-62-03 Bông vải Ninh Thuận 17 BV-71-01 Bông vải Ô Môn, Cần Thơ 18 BV-71-02 Bông vải Phụng Hiệp, Cần Thơ 19 CB-34-02 Cải bắp Song Phượng, Hà Tây 20 CC-79-01 Cỏ chỉ Sóc Trăng 21 CC-72 Cỏ chỉ Đức Huệ, Long An 22 CG-73 Cỏ gừng Chợ Gạo, Tiền Giang 23 CLV-72-02 Cỏ lồng vực Đức Huệ, Long An 38 24 CN1 Cải ngọt Nhập 25 CO-79-01 Cỏ ống Sóc Trăng 26 CO-61-02 Cỏ ống Phước Thiền, Nhơn Trạch, Đồng Nai 27 CP-50-02 Cà phê Eakmak, Daklak 28 CTĐ-77 Cam thảo đất Rạch Giá, Kiên Giang 29 CX-76 Cải xanh Chợ Mới, An Giang 30 CX-8-02 Cải xanh Tp.Hồ Chí Minh 31 KT-63-01 Khoai tây Đà Lạt, Lâm Đồng 32 Đcv-63-02 Đậu cove Đơn Dương, Lâm Đồng 33 ĐHL-63 Đậu hà lan Đà Lạt, Lâm Đồng 34 ĐP-34 Đậu phộng Chương Mỹ, Hà Tây 35 ĐP-38 Đậu phộng Nam Thịnh, Diễn Châu, Nghệ An 36 ĐT-77 Đậu trắng Vĩnh Thuận, Kiên Giang 37 ĐX-61-01 Đậu xanh Thống Nhất, Đồng Nai 38 PT-66 Phát tài Tây Ninh 39 RM-61 Rau muống Phước Tân, Long Thành, Đồng Nai 40 SR-61-01 Sầu riêng Phước Tân, Long Thành, Đồng Nai 41 SR-650 Sầu riêng Phú Giáo, Bình Dương 42 T-651 Tiêu Bình Phước 43 TL-72 Thuốc lá Đức Hòa, Long An 44 XL-4 Xúp lơ Đông Anh, Hà Nội 45 XL-76 Xà lách Chợ Mới, An Giang 7.2. Danh sách các primer đƣợc sử dụng để nghiên cứu rDNA nhân của nấm Bảng 7.2. Những trình tự primer trên tiểu đơn vị nhỏ của rDNA Những trình tự primer trên tiểu đơn vị nhỏ của rDNA ssu ref. nb pb BMB-'A' (Lan) GWA TTA CCG CGG CKG CTG 583-566 18 BMB-'B' (Lan) CCG TCA ATT CMT TTR AGT TT 1147- 1128 20 BMB-'C' (Lan) ACG GGC GGT GTG TRC 1641- 15 39 1637 BMB-BR (Lan) CTT AAA GGA ATT GAC GGA A 1131- 1149 19 BMB-CR (Lan) GTA CAC ACC GCC CGT CG 1637- 1643 17 nssu97a (Kau) TAT ACG GTG AAA CTG CGA ATG GC 75-97 23 nssu97b (Kau) CGG TGA AAC TGC GAA TGG C 79-97 19 nssu634 (Kau) CCC CAG AAG GAA AGI CCC GIC C 705-684 22 nssu897R (Kau) AGA GGT GAA ATT CTT GGA 897-914 18 nssu1088 (Kau) TGA TTT CTC GTA AGG TGC CG 1088- 1069 20 nssu1088R (Kau) CGG CAC CTT ACG AGA AAT CA 1069- 1088 20 nssu131 (Kau) CAG TTA TCG TTT ATT TGA TAG TAC C 107-131 25 NS1 (Whi) GTA GTC ATA TGC TTG TCT C 20-38 19 NS2 (Whi) GGC TGC TGG CAC CAG ACT TGC 573-553 21 NS3 (Whi) GCA AGT CTG GTG CCA GCA GCC 553-573 21 NS4 (Whi) CTT CCG TCA ATT CCT TTA AG (sim. to BMB- b) 1150- 1131 20 NS5 (Whi) AAC TTA AAG GAA TTG ACG GAA G (sim. to BMB-BR) 1129- 1150 22 NS6 (Whi) GCA TCA CAG ACC TGT TAT TGC CTC 1436- 1413 24 NS7 (Whi) GAG GCA ATA ACA GGT CTG TGA TGC 1413- 1436 24 NS8 (Whi) TCC GCA GGT TCA CCT ACG GA 1788- 1769 20 NS17 (Gar) CAT GTC TAA GTT TAA GCA A 54-72 19 NS18 (Gar) CTC ATT CCA ATT ACA AGA CC 516-497 20 NS19 (Gar) CCG GAG AAG GAG CCT GAG AAA C 381-402 22 NS20 (Gar) CGT CCC TAT TAA TCA TTA CG 871-852 20 NS21 (Gar) GAA TAA TAG AAT AGG ACG 802-819 18 NS22 (Gar) AAT TAA GCA GAC AAA TCA CT 1312- 1297 20 NS23 (Gar) GAC TCA ACA CGG GGA AAC TC 1184- 1203 20 NS24 (Gar) AAA CCT TGT TAC GAC TTT TA 1769- 1750 20 SR1 (VilU) ATT ACC GCG GCT GCT (similar to BMB-'A') 581-567 15 40 SR1R (Vil0) TAC CTG GTT GAT TCT GC 21-1 21 SR2 (Elw) CGG CCA TGC ACC ACC 1277- 1263 15 SR3 (VilU) GAA AGT TGA TAG GGC T 321-306 16 SR4 (VilU) AAA CCA ACA AAA TAG AA 841-825 17 SR5 (VilU) GTG CCC TTC CGT CAA TT 1155- 1139 17 SR6 (VilU) TGT TAC GAC TTT TAC TT 1763- 1747 17 SR7 (VilU) GTT CAA CTA CGA GCT TTT TAA 637-617 21 SR7R (VilU) TTA AAA AGC TCG TAG TTG AAC 617-637 21 SR8R (VilU) GAA CCA GGA CTT TTA CCT T 732-750 19 SR9R (Elw) YAG AGG TGA AAT TCT 896-910 15 SR10R (VilU) TTT GAC TCA ACA CGG G 1181- 1196 16 SR11R (Spa) GGA GCC TGA GAA ACG GCT AC 389-408 20 1 (DeP) GCT CTT TCT TGA TTT TGT 1241- 1258 18 3 (DeP) TTT GAG GCA ATA ACA GGT 1410- 1427 18 4 (DeP) CAT CTA AGG GCA TCA CAG 1445- 1428 18 5 (DeP) TTG TCT CTG TCA GTG TAG 1482- 1465 18 6 (DeP) CAA CGA GGA ATT CCT AGT 1566- 1583 18 9 (DeP) AAT GAT CCT TCC GCA GGT 1797- 1780 18 Bảng 7.3. Những trình tự primer trên tiểu đơn vị lớn của rDNA Những trình tự primer trên tiểu đơn vị lớn của rDNA lsu ref. nb pb GUADET P1 (Gua) GAG TCG AGT TGT TTG GGA ATG CAG C 275-300 25 GUADET P2 (Gua) GAA AAG AAC TTT GAA AAG AGA GTG AA 379-403 26 GUADET P3 (Gua) CCC GTC TTG AAA CAC GGA CCA AGG 661-685 24 P2R (Reh) CTC TCT TTT CAA AGT TCT TTT CAT 1412- 17 41 CT 1396 LR0R (VilU) ACC CGC TGA ACT TAA GC 26-42 17 LR0R (Reh) GTA CCC GCT GAA CTT AAG C 24-42 19 LR1R (Mon) AGG AAA AGA AAC CAA CC 57-73 17 LR2 TTT TCA AAG TTC TTT TC 395-379 17 LR2R AAG AAC TTT GAA AAG AG 382-398 17 LR3 (Vil0) GGT CCG TGT TTC AAG AC 677-661 17 LR3R GTC TTG AAA CAC GGA CC 664-680 17 LR4 ACC AGA GTT TCC TCT GG 887-871 17 LR5 (Vil0) ATC CTG AGG GAA ACT TC 997-981 17 LR5R (VilU) GAA GTT TCC CTC AGG AT 981-997 17 LR6 (Vil0) CGC CAG TTC TGC TTA CC 1173- 1157 17 LR7 (Vil0) TAC TAC CAC CAA GAT CT 1483- 1467 17 LR7R (Vil0) AGA TCT TGG TGG TAG TA 1465- 1481 17 LR8 CAC CTT GGA GAC CTG CT 1917- 1901 17 LR8R AGC AGG TCT CCA AGG TG 1901- 1917 17 LR9 AGA GCA CTG GGC AGA AA 2292- 2276 17 LR10 AGT CAA GCT CAA CAG GG 2508- 2492 17 LR10R GAC CCT GTT GAG CTT GA 2490- 2506 17 LR11 GCC AGT TAT CCC TGT GGT AA 2919- 2900 20 LR12 (Vil0) GAC TTA GAG GCG TTC AG 3221- 3204 17 LR12R (VilU) CTG AAC GCC TCT AAG TCA GAA 3205- 3225 21 LR13 CAT CGG AAC AAC AAT GC 3464- 3448 17 LR14 AGC CAA ACT CCC CAC CTG 2701- 2694 18 LR15 TAA ATT ACA ACT CGG AC 161-145 17 LR16 (Mon) TTC CAC CCA AAC ACT CG 716-700 17 42 LR17R TAA CCT ATT CTC AAA CTT 1066- 1083 18 LR20R GTG AGA CAG GTT AGT TTT ACC CT 3058- 3080 23 LR21 ACT TCA AGC GTT TCC CTT T 442-424 19 LR22 CCT CAC GGT ACT TGT TCG CT 371-352 20 F377 AGA TGA AAA GAA CTT TGA AAA GAG AA 375-400 26 R377 CTC TCT TTT CAA AGT TCT TTT CAT CT 400-375 26 LIC15R (Mia2) GGA GGA AAA GAA ACC AAC AG 55-74 20 * LIC24R (Mia1) GAA ACC AAC AGG GAT TG 64-80 17 LIC2044 (Kau) ACG CCT GCC TAC TCG CC 26-42 17 Bảng 7.4. Những trình tự primer trên vùng IGS và 5S của rDNA Những trình tự primer trên vùng IGS và 5S của rDNA 5S RNA (VilU) ATC AGA CGG GAT GCG GT 17 5S RNAR (VilU) ACQ GCA TCC CGT CTG AT 17 NS1R GAG ACA AGC ATA TGA CTA C 38-20 (SSU) 19 LR13R GCA TTG TTG TTC CGA TG 3448- 3464(lsu) 17 Bảng 7.5. Những trình tự primer trên vùng ITS và 5,8S của rDNA Những trình tự primer trên vùng ITS và 5,8S của rDNA ITS1 (Whi) TCC GTA GGT GAA CCT GCG G 1769- 1787(ssu) 19 ITS1F (Gad) CTT GGT CAT TTA GAG GAA GTA A 22 ITS2 (Whi) GCT GCG TTC TTC ATCG ATG C (sim. to 5.8S) 20 ITS3 (Whi) GCA TCG ATG AAG AAC GCA GC (sim. to 5.8SR) 20 ITS4 (Whi) TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC 60-41(lsu) 20 ITS4B CAG GAG ACT TGT ACA CGG TCC AG 23 43 (Gad) ITS4S (Kre) CCT CCG CTT ATT GAT ATG CTT AAG 59-36 (lsu) 24 ITS5 (Whi) GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G (sim. to SR6R) 1745- 1766(ssu) 22 ITS5R CCT TGT TAC GAC TTT TAC TTC C 1766-1745 (ssu) 22 5.8S (Vil0) CGC TGC GTT CTT CAT CG 17 5.8SR (Vil0) TCG ATG AAG AAC GCA GC 18 SR6R (VilU) AAG TAP AAG TCG TAA CAA GG 1747- 1766(ssu) 20 LR1 (Vil0) GGT TGG TTT CTT TTC CT 73-57(lsu) 17 SLG-1 (Gro) TTG CGC AAC CTG CGG AAG GAT 1773- 1793(ssu) 21 NS24R TAA AAG TCG TAA CAA GGT TT 1750- 1769(ssu) 20 ssu ref. Mankin et al., 1986. Gene 44:143-145 lsu ref. Lapeyre et al., 1993. Nucleic Acids Res. 21:3322-3322 Những primer được thiết kế trong phòng thí nghiệm của Lutzoni: - (DeP) DePriest,1993. Gene 134:67-74 - (Elw) Elwood et al., 1985. Mol. Biol. Evol. 2:399-410 - (Gad) Gardes and Bruns, 1993. Mol. Ecol. 2:113-118 - (Gar) Gargas and Taylor, 1992. Mycologia 84(4): 589-592 - (Gro) Groner and LaGreca, 1997. Lichenologist 29(5):441-454 - (Gua) Guadet et al., 1989. Mol. Biol. Evol. 6:227-242 - (Kau) Kauff and Lutzoni, 2002. Mol. Phylogen. Evol. 25:138-156 - (Kre) Kretzer et al., 1996. Mycologia 88(5): 776-785 - (Lan) Lane et al., 1985. PNAS USA 82:6955-6959 - (Mia1) Miadlikowska and Lutzoni, 2000. Int. J. Plant Sci. 161(6) - (Mia2) Miadlikoska, McCune, Lutzoni,2001. Bryologist 105:1-10 - (Mon) Moncalvo et al., 1993. Mycologia 85(5):788-794 - (Reh) Rehner and Samuels, 1994. Mycol. Res. 98(6):625-634 - (Spa) Spatafora et al, 1995. J. Clinical Microbiol. 33:1322-1326 44 - (Vil0) Vilgalys and Hester, 1990. Journal of bacteriology 172:4238-4246 - (VilU) Vilgalys unpublished [] - (Whi) White et al., 1990. pp 315-322 in PCR protocols: A guide to methods and applications 7.3. Nuôi thu sinh khối nấm R. solani Hình 7.1. Ảnh của sợi nấm R. solani sau khi nuôi lắc 4 ngày