Khóa luận Nghiên cứu ứng dụng một số kỹ thuật chẩn đoán nhanh vibrio cholerae gây dịch tiêu chảy cấp tại tỉnh Thái Nguyên năm 2008

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM ------------------------------- PHẠM THẾ VŨ NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG MỘT SỐ KỸ THUẬT CHẨN ĐOÁN NHANH VIBRIO CHOLERAE GÂY DỊCH TIÊU CHẢY CẤP TẠI TỈNH THÁI NGUYÊN NĂM 2008 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM ------------------------------- PHẠM THẾ VŨ NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG MỘT SỐ KỸ THUẬT CHẨN ĐOÁN NHANH VIBRIO CHOLERAE GÂY DỊCH TIÊU CHẢY CẤP TẠI TỈNH THÁI NGUYÊN NĂM 2008 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.30 GIÁO VIÊN HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. LƢU THỊ KIM THANH THÁI NGUYÊN - 2009 Lời cam đoan Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa có ai công bố trong một công trình nào khác. Tác giả Phạm Thế Vũ Lời cảm ơn Để hoàn thành luận văn này tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các thầy cô: Khoa Sau đại học, Khoa sinh - KTNN Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương, Viện Khoa học – Công nghệ Việt Nam. - TS. Lưu Thị Kim Thanh đã tận tình hướng dẫn giúp đỡ giao đề tài, trực tiếp hướng dẫn tôi hoàn thành luận văn này. - Bs. Nguyễn Lê Minh giám đốc Trung tâm Y tế Dự phòng Thái Nguyên đã giúp đỡ động viên và tạo mọi điều kiện cho tôi về tinh thần cũng như vật chất trong quá trình học tập. - NCVC.Ts. Nghiêm Ngọc Minh Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam đã tận tình giúp đỡ trong quá trình thực hiện luận văn Tôi xin cảm ơn tới : - Cán bộ khoa xét nghiệm Trung tâm Y tế Dự phòng Thái Nguyên, đặc biệt nhóm cán bộ xét nghiệm vi sinh đã không quản ngày, đêm cũng như các ngày nghỉ giúp đỡ tôi thu thập mẫu bệnh phẩm, phân lập vi khuẩn tả, pha chế các loại môi trường, xử lý sấy hấp dụng cụ ... - Các Bác sỹ, kỹ thuật viên khoa lây, khoa xét nghiệm của các bệnh viện trực thuộc tỉnh Thái Nguyên (Bệnh viện Đa khoa Trung Ương, Bệnh viện A, Bệnh viện C, Bệnh viện Gang thép, Trung tâm y tế các huyện thành) đã cùng tham gia thu phập mẫu khi có bệnh nhân nhập viện. Thái nguyên, ngày 30 tháng 9 năm 2009 Tác giả Phạm thế Vũ MỤC LỤC Trang ĐẶT VẤN ĐỀ 1. Lý do chọn đề tài 1 2. Mục tiêu nghiên cứu 3 3. Những đóng góp mới của đề tài 3 4. Giới hạn nghiên cứu 3 5. Cấu trúc của luận văn 3 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tình hình dịch tả trên thế giới và Việt Nam 4 1.1.1. Tình hình dịch tả trên Thế giới 4 1.1.2. Tình hình bệnh tả ở Việt Nam 8 1.2. Căn nguyên gây bệnh 11 1.2.1. Ổ chứa và nguồn bệnh 11 1.2.2. Tác nhân gây bệnh 11 1.2.3. Phương thức lây truyền 12 1.2.4. Tính cảm nhiễm 13 1.2.5. Diễn biến bệnh 13 1.2.6. Kháng nguyên và cấu trucas lớp vi khuẩn 14 1.2.7. Độc tố của vi khuẩn tả 16 1.2.8. Một số phương pháp phát hiện Vibrio cholerrae trong phòng thí nghiệm 18 Chƣơng 2. ĐÓI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Địa điểm, thời gian nghiên cứu 19 2.2. Nguyên liệu nghiên cứu 19 2.3. Hóa chất thiết bị 20 2.4. Đối tƣợng và phƣơng pháp nghiên cứu 21 2.4.1. Đối tượng nghiên cứu 21 2.4.2. Cỡ mẫu và cách chọn mẫu 21 2.4.3. Phương pháp nghiên cứu 22 2.4.3.1. Các kỹ thuật lấy mẫu và vận chuyển bệnh phẩm 22 2.4.3.2. Các phương pháp chẩn đoán Vibrio cholerrae 24 2.4.3.3. Tiêu chuẩn đánh giá Vibrio cholerrae dương tính trong nghiên cứu 27 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Đặc điểm chung của các đối tƣợng nghiên cứu 29 3.1.1. Phân bố đối tượng nghiên cứu theo giới, tuổi 29 3.1.2. Phân bố lấy mẫu bệnh phẩm theo địa điểm lấy mẫu 33 3.2. Đánh giá phƣơng pháp nghiên cứu phát hiện Vibrio cholerae O1 35 3.2.1. Nhận biết vi khuẩn di động bằng kỹ thuật soi tươi 34 3.2.2. Nhận biết hình thể và tính chất bắt maufcuar vi khuẩn bằng kỹ thuật nhuộm Gram 37 3.2.3. Phát hiện Vibrio cholerrae bằng kỹ thuật nuôi cấy 38 3.2.4. Nhận biết Vibio cholerrae bằng phương pháp test nhanh 52 3.2.5. Chẩn đoán Vibio cholerrae bằng kỹ thuật PCR 54 3.3. Đánh giá các kỹ thuật chẩn đoán Vibrio cholerae O1 3.3.1. Kỹ thuật soi tươi với kháng huyết thanh đặc hiệu 56 3.3.2. Kỹ thuật soi tươi và kỹ thuật nhuộm Gram 57 3.3.3. Kỹ thuật soi tươi với kỹ thuật nuôi cấy 58 3.3.4. Kỹ thuật nhuộm Gram với kỹ thuật nuôi cấy 58 3.3.5. Phương pháp test nhanh với kỹ thuật nuôi cấy 59 3.3.6. Kỹ thuật nuôi cấy với phương pháp PCR 60 3.4. Tổng hợp kết quả các phƣơng pháp và thời gian 61 KẾT LUẬN 66 ĐỀ NGHỊ 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO 69 NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN CT Cholerae Toxi ( Độc tố tả ) RNA Acid deroxy ribonucleic DNA Acid deoxy nucleic E.coli Escherichia coli (Vi khuẩn Ecoli ) KIA Kligler Iron Agar ( Môi trường song đường ) N.A.G Non Aglutinable Vibrios PCR Polymerase Chain Reaction ( Phát hiện độc tố V.cholerae) RAPD Random Amplified Polymorphic DNA TCBS Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose ( Môi trường chọn lọc nuôi cấy vi khuẩn tả ) V.cholerae Vibriocholerae (Vi khuẩn tả ) DANH MỤC CÁC BẢNG 1 Bảng 1.1 Tình hình dịch tả ở Việt Nam từ tháng 10/2007 đến tháng 5/2008 9 2 Bảng 1.2 Phân lập V.cholerae typ cổ điển và typ Eltor 15 3 Bảng 2.1 Danh mục một số dụng cụ, hóa chất 20 4 Bảng 3.1 Phân bố đối tượng nghiên cứu theo giới, tuổi 29 5 Bảng 3.2 Tỷ lệ bệnh nhân theo tuổi 31 6 Bảng 3.3 Phân bố bệnh nhân dương tính Vibrio cholerrae theo giới tính 33 7 Bảng 3.4 Tỷ lên thu thập mẫu các địa điểm nghiên cứu 34 8 Bảng 3.5 Tỷ lệ vi khuẩn di động quan sát trên lam kính 36 9 Bảng 3.6 Tỷ lệ vi khuẩn Gram âm quan sát dưới kính hiển vi 37 10 Bảng 3.7 Phần đánh giá chung trong việc xác định các vi khuẩn 38 11 Bảng 3.8 Tỷ lệ Vbrio cholerrae dương tính bàng kỹ thuật nuôi cấy 39 12 Bảng 3.9 Nhận xét tính chất khuẩn lạc trên môi trường TCBS 41 13 Bảng 3.10 Nhận xét tính chất khuẩn lạc trên môi trường thạch kiềm 43 14 Bảng 3.11 Thời gian mọc khuẩn lạc trên 2 loại môi trường nuôi cấy 44 15 Bảng 3.12 Bảng đọc kết quả trên môi trường sinh vật hóa học 45 16 Bảng 3.13 Phản ứng Oxidase 47 17 Bảng 3.14 Đặc điểm nuôi cấy trên môi trường peptone kiềm 49 18 Bảng 3.15 Phân biệt vi khuẩn tả với các phẩy khuẩn khác thuộc nhóm N.A.G trên 3 loại đường 51 19 Bảng 3.16 Kết quả ngưng kết kháng huyết thanh đa giá và đơn giá 52 20 Bảng 3.17 Phát hiện Vibrio cholerrae O1 bằng kỹ thuật test nhanh 54 21 Bảng 3.18 Tỷ lệ Vibrio cholerrae O1 bằng kỹ thuật PCR 55 22 Bảng 3.19 Đánh giá kỹ thuật soi tươi với kháng huyết thanh đặc hiệu 57 23 Bảng 3.20 So sánh kỹ thuật soi tươi và kỹ thuật nhuộm Gram 57 24 Bảng 3.21 Bảng so sánh kỹ thuật soi tươi với kỹ thuật nuôi cấy 58 25 Bảng 3.22 Bảng so sánh kỹ thuật nhuộm Gram với kỹ thuật nuôi cấy 59 26 Bảng 3.23 Bảng so sánh phương pháp test nhanh với kỹ thuật nuôi cấy 59 27 Bảng 3.24 Đánh giá kết quả của phương pháp thử Oxidase với kỹ thuật soi tươi 60 28 Bảng 3.25 Bảng so sánh phương pháp nuôi cấy và PCR 61 29 Bảng 3.26 Tổng hợp kết quả các phương pháp và thời gian được áp dụng 61 30 Bảng 3.27 Một số phương pháp có thể áp dụng chẩn đoán nhanh Vibrio cholerrae 62 31 Bảng 3.28 Bảng so sánh kỹ thuật nuôi cấy với (bảng 3.27) 64 DANH MỤC CÁC HÌNH 1 Hình 1.1 Biểu đồ khu trú vi khuẩn tả ở ruột non 17 2 Hình 2.1 Sơ đồ phân lập chẩn đoán Vibrio cholerrae O1 24 3 Biểu đồ 3.1 Đánh giá độ tuổi trong thu thập mẫu 30 4 Biểu đồ 3.2 Phân bố đối tượng nghiên cứu theo giới tính 32 5 Biểu đồ 3.3 Số mẫu thu thập tại 6 bệnh viện trong quá trình thu thập mẫu 35 7 Hình 3.4 Hình thể Vibrio cholerrae soi tươi 36 8 Hình 3.5 Hình thể vi khuẩn nhuộm Gram 37 9 Biểu đồ 3.6 Tỷ lệ dương tính Vibrio cholerrae bằng kỹ thuật nuôi cấy 40 10 Hình 3.7 Hình ảnh khuẩn lạc Vparaheamoliticus và Vibrio cholerrae 42 11 Hình 3.8 Hình ảnh khuẩn lạc Vibrio cholerrae trên môi trường thạch kiềm 42 12 Hình 3.9 Các môi trường sinh vật hóa học trong chẩn đoán Vibrio cholerrae 45 13 Hình 3.10 Hình ảnh phản ứng oxidase 47 14 Hình 3.11 Hình ảnh test nhanh Crystan VC 53 15 Hình 3.12 Phản ứng PCR 56 16 Biểu đồ 3.13 Tổng hợp các phương pháp chẩn đoán Vibrio cholerrae 63 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên MỞ ĐẦU 1. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI Dịch tiêu chảy cấp đang có chiều hướng gia tăng ở các địa phương, tính từ 23/10/2007 miền Bắc đã xảy ra ba đợt dịch tiêu chảy cấp nguy hiểm, số bệnh nhân tiêu chảy cấp đã lên đến 1.335 người, có 136 trường hợp dương tính với phẩy khuẩn tả tại 18 tỉnh / thành phố trong cả nước trong đó có tỉnh Thái Nguyên [13]. Khống chế dịch tả là mục tiêu lớn trong chương trình quốc gia phòng chống bệnh tiêu chảy của Việt Nam. Với những thành tựu và kinh nghiệm phòng chống dịch tả trong nhiều năm qua, ngày nay bệnh tả không còn là nỗi khiếp đảm của mỗi người dân, của các tổ chức chính quyền và xã hội. Các điều kiện chuẩn mực về kiểm soát môi trường ở nước ta còn lạc hậu. Các vấn đề cung cấp nước, vệ sinh thực phẩm, dinh dưỡng an toàn và vấn đề xử lý vệ sinh chất thải chưa làm được bao nhiêu, nhiều nơi còn bị buông lỏng hoặc quên lãng. Trong thời kỳ giao lưu phát triển kinh tế và ngoại giao trong quan hệ hợp tác giữa các nước trong khu vực và toàn cầu ngày càng được mở rộng thì bên cạnh đó là những điều kiện rất dễ bùng phát các vụ dịch nói chung, trong đó có dịch tả nói riêng [30]. Thái Nguyên là tỉnh miền núi phía Bắc tiếp giáp với các tỉnh: Lạng Sơn, Bắc Giang, Bắc Kạn, Tuyên Quang, Vĩnh Phúc, Hà Nội, là cửa ngõ giao lưu Kinh tế - Văn hoá – Xã hội thuận lợi giữa các tỉnh miền núi phía Bắc với đồng bằng Bắc Bộ, là trung tâm đào tạo quan trọng đứng thứ 3 trong cả nước. Trường Đại học Thái Nguyên với 6 trường đại học thành viên và trên 20 trường cao đẳng trung học dạy nghề. Toàn tỉnh hiện có gần 4000 cơ sở sản xuất kinh doanh và chế biến dịch vụ phục vụ, trong số 1.150 cơ sở sản xuất kinh doanh công nghiệp có hàng ngàn bếp ăn tập thể của công nhân, học sinh, sinh viên… Hội tụ nhiều điều kiện thuận lợi như vậy tuy nhiên vẫn còn rất Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên nhiều khó khăn nếu không được quản lý chặt chẽ đó sẽ là nguồn lây nhiễm gây ngộ độc thực phẩm hoặc nguồn chứa mầm gây nên bệnh dịch. Thực hiện công điện khẩn của Cục Y tế dự phòng và Môi trường, Bộ y tế gửi các Trung tâm y tế Dự phòng các tỉnh thành trong cả nước “Tăng cường giám sát vệ sinh an toàn thực phẩm trên địa bàn, giám sát chặt chẽ và phát hiện sớm nhất căn nguyên gây tiêu chảy, xử lý khoanh vùng ổ dịch và triển khai điều trị kịp thời, không để bệnh nhân tử vong” [30]. Cần phải báo cáo khẩn cấp khi có ít nhất một ca bệnh (kể cả ca đã xác định hoặc nghi ngờ), dù ở khu vực dịch xâm nhập hay bệnh lưu hành, y tế cơ sở nơi phát hiện phải báo cáo ngay theo chế độ báo cáo khẩn cấp của Bộ Y tế. Bệnh nhân mắc bệnh tả nếu không được phát hiện sớm và điều trị kịp thời sẽ bị mất nước và chất điện giải dẫn đến tử vong. Bệnh tả lây truyền rất nhanh qua đường tiêu hoá và môi trường (nước, chất nôn, phân, rác...) do vậy việc phát hiện sàng lọc mẫu âm tính ngay tại cơ sở có ý nghĩa hết sức quan trọng, không những giúp đỡ bệnh nhân có ngay phác đồ điều trị mà còn giúp các nhà dịch tễ có hướng xử lý khoanh vùng, chủ động trong phòng chống dịch, không để dịch lây lan rộng trong cộng đồng [4], [6]. Đáp ứng với tình hình thực tiễn kể trên, chúng tôi tiến hành đề tài: " Nghiên cứu ứng dụng một số kỹ thuật chẩn đoán nhanh Vibrio cholerae gây dịch tiêu chảy cấp tại tỉnh Thái Nguyên năm 2008" Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU - Xác định tỷ lệ bệnh nhân dương tính với Vibrio cholerae (V. cholerae ) trong giai đoạn từ tháng 3 năm 2008 đến tháng 7 năm 2008. - Đánh giá hiệu quả các kỹ thuật phát hiện Vibrio cholerae (soi tươi, nhuộm soi, test nhanh, nuôi cấy, PCR) - Lựa chọn những kỹ thuật phù hợp để áp dụng sàng lọc chẩn đoán nhanh Vibrio cholerae tại labo tuyến huyện khi có dịch tiêu chảy cấp. 3. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI - Đề tài nghiên cứu đã đánh giá các kỹ thuật phát hiện Vibrio cholerae trên mẫu phân của bệnh nhân mắc bệnh tiêu chảy cấp tại tỉnh Thái Nguyên. - Đáp ứng tính ứng dụng và hiệu quả tại labo tuyến huyện. 4. GIỚI HẠN NGHIÊN CỨU - Thời gian nghiên cứu ngắn nên ứng dụng đánh giá hiệu quả sau phân tích chưa có số liệu đánh giá cụ thể. 5. CẤU TRÚC CỦA LUẬN VĂN Ngoài phần mở đầu và kết luận, luận văn có 3 chương: Chương 1: Tổng quan tài liệu Chương 2: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu Chương 3: Kết quả và bàn luận Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.Tình hình dịch tả trên thế giới và Việt Nam 1.1.1. Tình hình dịch tả trên thế giới Bệnh tả được cho là xuất hiện cách đây hàng thế kỷ tại đồng bằng sông Hằng của các tiểu lục địa Ấn Độ. Thế kỷ thứ XI những đợt dịch tả đã lan tràn tới nhiều vùng trên thế giới từ Nam Á theo con đường buôn bán, hành hương và di tản. Trong thời gian có đại dịch, nhiều vụ dịch lớn có tỷ lệ tử vong cao đã xảy ra ở khắp thành thị châu Âu, châu Mỹ. Năm 1849, có một cuộc điều tra nổi tiếng của John Snow (Bác sỹ người Anh) đã chứng minh nước là môi trường truyền bệnh tả [48], [51]. Năm 1817 bệnh xuất hiện tại Châu Âu và Mỹ. Đến đầu thế kỷ 20 đã có 6 "làn sóng bệnh tả" lan khắp thế giới, tiếp đó đến những năm 60 phạm vi "tung hoành" của vi khuẩn tả đã được "khoanh vùng" và cho đến những năm gần đây chủ yếu bệnh xuất hiện ở Đông nam Á. Năm 1961 týp "El Tor" gây dịch tại Philippin và tạo "làn sóng thứ bảy". Từ đó trở đi týp vi khuẩn này tiếp tục gây những vụ dịch tại châu Á, vùng Trung Đông, châu Phi và một phần châu Âu [2], [5], [10], [57]. Năm 1883, Robert Koch (nhà vi sinh vật người Đức) phân lập thành công vi khuẩn từ phân của bệnh nhân biểu hiện các triệu chứng của bệnh này. Có tài liệu cho rằng trước đó 30 năm nhà giải phẫu học người Ý đã phát hiện ra phẩy khuẩn là nguyên nhân gây bệnh [43]. Các vụ đại dịch đều bắt nguồn từ châu Á, sau đó lan tới các châu lục khác ở nhiều nước, trong nhiều năm. Qua các vụ dịch, có một số ghi nhận đáng chú ý về dịch tễ học, sinh bệnh học, điều trị và phòng chống bệnh tả được tóm tắt như sau: Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên - Vụ đại dịch thứ nhất: Lần đầu tiên ghi nhận bệnh tả xảy ra dưới dạng một đại dịch, vụ đại dịch này bắt đầu vào năm 1817 tại khu vực châu thổ sông Hằng, sau đó lan tới nhiều nước thuộc châu Á vá châu Phi [5]. - Vụ đại dịch thứ hai: Lần đầu tiên bệnh tả gây dịch ở Bắc Mỹ năm 1832 tại khu vực Quebec ( Canada), New York, Philadelphia, Washington. Trong vụ đại dịch này, đầu những năm 1930, O’Shaughnessy là người đầu tiên chứng minh phân của bệnh nhân bị bệnh tả có tính kiềm và có nồng độ điện giải rất cao. sau phát hiện có ý nghĩa này, Latta đã điều trị thành công một số bệnh nhân tả mất nước nặng bằng phương pháp tiêm tĩnh mạch dung dịch chứa muối và điện giải [5], [47]. - Vụ đại dịch thứ 3: Dịch tả lan tới nước Anh, tại Luân Đôn, John Snow đã phát hiện rất quan trọng về dịch tễ học là bệnh tả lan truyền theo đường nước sinh hoạt bị ô nhiễm và từ đó đã đề ra biện pháp chống dịch hiệu quả là loại bỏ nguồn nước sinh hoạt không hợp vệ sinh [17], [27], [61]. - Vụ đại dịch thứ 4: Dịch tả hoành hành dữ dội ở New Orleans và các thành phố, thị trấn dọc theo triền sông Missippi, Missouri và Ohio của nước Mỹ [1], [5], [62]. - Vụ đại dịch thứ 5: Dịch tả lan tới vùng trung cận đông, sau đó lan tới Nam Mỹ, gây ra các vụ dịch lớn với tỷ lệ tử vong cao ở các nước Argentina, Chilê và Peru. Tại Ai Cập và Calcutta (Ấn Độ), Robert Koch đã phân lập được vi khuẩn tả từ phân của bệnh nhân bị bệnh tả , chỉ một năm sau khi Koch phân lập được vi khuẩn tả, Ferran là người đầu tiên đã gây miễn dịch dự phòng tả bằng vaccin [12], [45]. - Vụ đại dịch 6: Gây ra các vụ dịch lớn ở vùng Trung Cận Đông và bán đảo Ban Căng, từ năm 1921 đến năm 1961, ngoài một vụ dịch tả lớn xảy ra ở Ai Cập năm 1961 với 32.978 trường hợp tả, gây tử vong 20.472 người, dịch tả chủ yếu lưu hành ở các nước thuộc khu vực Đông Nam Á và châu Á, trong 6 vụ đại dịch đầu tiên tác nhân gây bệnh là V. cholerae O1, typ sinh học cổ điển Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên do Pacini mô tả đầu tiên phân lập được năm 1854 và được nhà vi trùng học người Đức Robert Koch khảng định lại năm 1883[5], [46], [59]. - Vụ đại dịch thứ 7: Tác nhân gây bệnh là V. cholerae O1, týp sinh học El Tor, do Goschlich lần đầu tiên phân lập được năm 1905 được chia làm 4 giai đoạn sau: Từ năm 1961-1962 dịch tả khu trú ở các đảo thuộc Indonesia và các nước Đông Nam Á, với tổng số 13.393 người mắc, tử vong 1.977 người [49], [55]. Năm 1963-1969 chỉ trong thời gian ngắn dịch xuất hiện nhiều nước châu Á: Ấn Độ, Pakistan, Liên Xô cũ, I-Rắc, Việt Nam bắt đầu có dịch tả El Tor vào tháng 1 năm 1964. Giai đoạn tiếp theo từ năm 1970-1990 theo số liệu của Tổ chức Y tế Thế giới có 36 nước có dịch tả, điều đáng chú ý là tại Li Băng, Syri chủng gây dịch là El Tor Ogawa, trong khi đó ở các nước liền kề như Ả rập-Xê út, Israel chủng gây dịch lại là El Tor Inaba.Tiếp theo những năm 1991 đến nay điều đáng chú ý ở nước Trung Mỹ và Nam Mỹ 21/23 nước có bệnh tả, năm 1994 châu Mỹ La Tinh chiếm 50% số bệnh nhân tả trên toàn thế giới.Tháng 7/1994 xảy ra một vụ dịch tả thảm khốc tại trại tỵ nạn ở Uganda với 58.057 trường hợp bị bệnh tả, tử vong 23.800 người, năm 1996 số người mắc tả ở châu Phi chiếm 60% tổng số các trường hợp mắc tả trên thế giới [58], [60]. Tháng 12 năm 1992 một vụ dịch lớn lại sảy ra ở nước này. Vi khuẩn gây bệnh được xác định là V. cholerae O139 "Bengal". Về mặt di truyền, O139 "Bengal" hình thành từ El Tor nhưng cấu trúc kháng nguyên của chúng cũng biến đổi. Tất cả mọi lứa tuổi (kể cả trong vùng đã có dịch ) đều có thể bị nhiễm. Chủng O139 đã gây bệnh tại ít nhất 11 nước ở Đông nam Á (tính đến năm 2005). Không có số liệu chính xác số người bị bệnh do O139 vì các nước không thông báo cụ thể các trường hợp bệnh do O1 hay O139 riêng rẽ. Trong những năm cuối thế kỷ 20 dịch tả ngày càng trở nên nghiêm trọng, bệnh tả xảy ra ở tất cả các châu lục, tập trung chủ yếu ở những nước đang phát triển, mặc dù y học có những hiểu biết đáng kể về sinh bệnh học và điều Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên trị bệnh tả nhưng tỷ lệ tử vong do bệnh tả vẫn ở mức độ cao, đặc biệt là khu vực châu Phi [3], [8], [53]. Những đặc điểm của týp El Tor giúp nó khẳng định khả năng "tiếp tục gây nguy hiểm" bao gồm: Tỷ lệ nhiễm El Tor thấp hơn nhiều so với tỷ lệ nhiễm týp cổ điển, thời gian mang trùng sau khi bị bệnh do El Tor dài hơn so với trường hợp nhiễm týp cổ điển, El Tor có khả năng tồn tại ngoài môi trường tốt hơn, dài hơn týp cổ điển. Chính vì vậy El Tor có khả năng gây dịch tại cả những nơi Týp cổ điển từng "tung hoành" [7], [36], [50]. Tháng 4 năm 1997, dịch bùng phát trong cộng đồng 90 ngàn người tị nạn Ruanđa ở Cộng Hoà Công gô. Chỉ trong 22 ngày đầu đã có 1.521 người chết. Đa số các trường hợp chết đều do không được can thiệp kịp thời. Tại Mỹ, dịch tả xuất hiện vào những năm 1800 sau đó được khống chế do đảm bảo vệ sinh nguồn nước sinh hoạt. Tuy vậy, giao thông và du lịch tạo điều kiện để bệnh xuất hiện lẻ tẻ. Đa số trường hợp do đi du lịch tại các nước Mỹ La tinh, châu Phi, châu Á. Một số trường hợp nhiễm bệnh do ăn thức ăn mang về từ các quốc gia còn lưu hành bệnh [44], [52]. Theo Nguyễn Anh Dũng, tính đến năm 1991, đại dịch tả lần thứ 7 đã có 91 nước có dịch [6], đến năm 1992 theo Tổ chức Y tế thế giới đã có ít nhất 98 nước có dịch tả. Nhờ những hiểu biết đáng kể về căn nguyên gây bệnh, về điều trị và cơ chế miễn dịch bệnh tả mà tỷ lệ tử vong do tả đã giảm xuống một cách đáng kể chỉ còn 1% - 3% [6]. Phẩy khuẩn V. cholerae O1 bao gồm hơn 60 nhóm huyết thanh, nhưng chỉ có một nhóm huyết thanh O1 là gây được bệnh tả, V. cholerae O1 lại gồm 2 sinh týp là sinh týp cổ điển và sinh týp El-Tor, mỗi sinh týp lại gồm 2 týp huyết thanh (Ogawa và Inaba) [8], [22]. Sinh týp El-Tor gây nên hầu hết các vụ dịch tả gần đây, tuy vẫn còn nhiều vụ dịch xảy ra ở tiểu lục địa Ấn Độ là do sinh týp cổ điển. Sinh týp El- Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Tor có thể sống kết hợp với một sinh vật dưới nước, làm cho nước trở thành một kho tàng lưu trữ gây nhiễm [31], [54]. Từ cuối năm 1992, dịch tả do V. cholerae O139 đã xuất hiện ở một số nơi thuộc Đông nam Ấn Độ, sau đó nhanh chóng lan tới Đông Bắc nước này thuộc vịnh Belgan.Tháng 3/1993 dịch lớn sảy ra ở Bangladesh, tiếp đó xuất hiện ở Miama, Trung Quốc (Tân Cương,7/1993), Thailand (8/1993) đến tháng 9 cùng năm đã có nhiều trường hợp mắc tả V. cholerae O139 ở Malaysia [34]. Người ta đã phân lập được V. cholerae non O1 ở các bệnh nhân tiêu chảy nặng thuộc 2 cộng đồng ở Florida.Tính gây bệnh đường tiêu hoá ở người và sự đồng nhất hoá của những chủng này làm nảy sinh những câu hỏi về sự tương quan của những chủng V. cholerae O1 độc và không độc dọc bờ biển Gulf của hoa Kỳ [39], [56]. Một đánh giá khảo sát trên tất cả các bệnh viện tư nhân ở Recife cho kết quả trong 1.435 mẫu chỉ có 1 mẫu dương tính với V. chlerae El-Tor Inaba (0.07%), 17 mẫu dương tính (1.2%) gồm V. cholerae non O1, V. fluvialis, V. fumissii, V. parahaemolyticus, V. spp. và rất ít gặp ở những người có điều kiện xã hội khá, ngay cả khi dịch đang xảy ra [49]. 1.1.2.Tình hình bệnh tả ở Việt Nam Bệnh tả là nguyên nhân quan trọng gây tiêu chảy cấp ở Việt Nam từ hơn một thế kỷ qua với 2 triệu trường hợp mắc bệnh tả được thông báo. Năm 1937-1938 dịch tả từ Hồng Kông theo đường biển xâm nhập vào các tỉnh miền Bắc là Hải Phòng, Móng Cái, từ đó dịch lan sang theo đường sắt và đường bộ tới nhiều tỉnh đồng bằng Bắc Bộ và Trung Bộ. Số người mắc lên tới 20.678 người, trong đó số chết là 14.992 người, tỷ lệ tử vong tới 70%. Bệnh tả Eltor lần đầu tiên xuất hiện ở miền Nam năm 1964 với 20.009 người mắc bệnh, trong đó 821 người tử vong. Từ đó đến nay, ở miền Trung và miền Nam bệnh tả xảy ra dưới dạng lưu hành, hàng năm có hàng trăm bệnh nhân bị bệnh tả được thông báo. Năm 1994 sau hàng chục năm vắng bóng, bệnh tả xuất Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên hiện lại ở khu vực Tây Nguyên ( các tỉnh Đắc Lắc, Lâm Đồng, Gia Lai ) với 1.459 bệnh nhân mắc bệnh tả được thông báo [5], [11], [16]. Dịch tả hiện nay vẫn là gánh nặng đối với ngành y tế và toàn xã hội. năm 1993 dịch xảy ra ở 21 tỉnh với 3.460 người mắc bệnh. Năm 1994 dịch xuất hiện ở cả miền Bắc, Trung, Nam và Tây Nguyên với 4.123 trường hợp bị bệnh. Năm 1995 có 29 tỉnh, thành phố báo cáo có bệnh nhân mắc tả với 6.088 trường hợp mắc bệnh tả. Năm 1996, cả nước có 630 trường hợp mắc bệnh tả ElTor ở 19 tỉnh, thành phố. Vài năm gần đây từ 2001-2002 nước ta vẫn có các trường hợp tả xảy ra, tuy nhiên bệnh không bùng phát thành các dịch lớn mà chủ yếu là những ca lẻ tẻ ở khắp cả nước [5]. Bảng 1.1. Tình hình dịch tả ở Việt Nam từ 10/2007 - 5/2008 Đợt 1 Đợt 2 Đợt 3 Tổng Ngày xuất hiện 23/10/2007 24/12/2007 5/3/2008 Tổng số mắc 1.907 58 3.480 5.445 Số dương tính (+) với tả 295 32 581 908 Số tỉnh/thành có tả (+) 14 1 18 Tập trung nhiều nhất tại Hà Nội Hà Nội Hà Nội Số tử vong 0 0 0 0 Ngày kết thúc 06/12/2007 5/2/2008 22/5/2008 (Nguồn số liệu: Cục Y tế Dự phòng và Môi trường Việt Nam) Nguyễn Phú Quý (1993) đã thông báo về những đặc điểm sinh học của V. cholerae O139 và quy trình kỹ thuật phân lập xác định mầm bệnh với kháng huyết thanh đặc hiệu của Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương [36]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Kết quả xét nghiệm phân lập được V. cholerae El-Tor có sự dao động lớn giữa các tác giả, thấp nhất là 1,52 % và cao nhất là 45,70 %. Phan Đạo và cộng sự cho rằng thời gian đỉnh của vụ dịch tỷ lệ phân lập cao trên 50% [9]. Một số tác giả còn đưa ra tỷ lệ phân lập theo nhóm tuổi, tỷ lệ phân lập vi khuẩn tả dương tính ở nhóm tuổi 6-16 tuổi là 15,08 %, 17-50 tuổi là 44,56 %, điều này càng chứng tỏ dưới 50 tuổi có tỷ lệ mắc tả cao [6], [7]. Tỷ lệ người lành mang trùng, khi phân lập vi khuẩn tả ở những người lành trong các vụ dịch, các tác giả trong nước cho thấy rất thấp là 1% và cao nhất là 15% [9], [14]. So với nhiều dịch bệnh mới xuất hiện và đang diễn biến phức tạp hiện nay, bệnh tiêu chảy cấp nguy hiểm không phải là bệnh khó kiểm soát, dịch bệnh có thể bùng phát khi có đủ ba mắt xích liên kết với nhau (nguồn bệnh, đường lây, sức cảm thụ), cả 3 mắt xích này đã được xác định rất rõ bởi các nhà dịch tễ học. Mặc dù chưa khẳng định được nguyên nhân gây bệnh, nhưng qua số liệu nghiên cứu của Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, có thể khẳng định vi khuẩn tả xuất phát từ thực phẩm. Chưa bao giờ có một vụ dịch nào phức tạp như bây giờ, gần như đồng loạt tất cả các Quận huyện của Hà Nội đều có dịch. Trong khi đó các ổ dịch lại không liên quan đến nhau, các bệnh nhân không sống cùng nhau, không ăn cùng nhau [13]. Tại tỉnh Thái Nguyên, sau nhiều năm không xuất hiện bệnh tả, đến ngày 13/11/2007 có 23 bệnh nhân mắc bệnh tiêu chảy cấp trong đó có 01 bệnh nhân dương tính với V. cholerae O1. Dịch bệnh xuất hiện sau khi đã được phát hiện tại nhiều tỉnh lân cận, hầu hết các trường hợp mắc bệnh là do đến các vùng có dịch ăn uống phải thức ăn nhiễm khuẩn sau đó về địa phương và phát bệnh, tuy vậy dịch đã được khống chế thành công không lan rộng thêm và không truờng hợp nào tử vong. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1.2. Căn nguyên gây bệnh 1.2.1. Ổ chứa và nguồn bệnh Người là ổ chứa vi khuẩn tả quan trọng và cũng là nguồn bệnh, bao gồm người mắc bệnh thể điển hình hoặc các thể nhẹ, không điển hình và người mang mầm bệnh không triệu chứng (còn gọi là người lành mang trùng). Sau vụ dịch tả có một tỷ lệ nhỏ (khoảng 3-5%) bệnh nhân các thể có khả năng mang vi khuẩn tả kéo dài một vài tháng, đôi khi kéo dài hàng năm nếu không được điều trị đặc hiệu đúng quy định. Vi khuẩn tả có thể tồn tại lâu dài ở một số loài nhuyễn thể (trai, sò, ngao...) vùng cửa sông hay ven biển. Đây là ổ chứa thiên nhiên của vi khuẩn tả ngoài ổ chứa quan trọng là người [15], [24]. 1.2.2. Tác nhân gây bệnh Tác nhân gây bệnh tả là V. cholerae lần đầu tiên được Pacini người Ý mô tả năm 1854 khi ông tìm thấy rất nhiều vi khuẩn hình cong trong ruột của bệnh nhân bị tả. Năm 1883 Robert Koch cũng tìm thấy tác nhân có hình thể tương tự khi ông nghiên cứu bệnh tả ở Ai Cập, ông mô tả vi khuẩn có hình dấu phẩy và Koch đặt tên là Vibrio comma, tên này được dùng mấy chục năm trước khi người ta đổi tên là V. cholerae, để tưởng nhớ ông Pacini, V. cholerae được xác định rất rõ thông qua các tính chất sinh vật, hoá học và sự đồng nhất của DNA, tuy nhiên chúng không đồng nhất về khả năng gây bệnh, điều này đặc biệt quan trọng vì các chủng gây bệnh mới có khả năng sinh độc tố ruột và gây dịch. Một sự phân biệt đơn giản trong y tế cộng đồng là V. cholerae thuộc nhóm huyết thanh O1 có khả năng sinh được độc tố, còn lại tất cả các nhóm khác thì không có khả năng gây bệnh hoặc rất hiếm khi gây bệnh. V. cholerae O1 thuộc nhóm huyết thanh O1 có khả năng sinh độc tố và gây thành đại dịch tả, tuy nhiên có một số ít chủng không sinh ra độc tố và không có gen mã hoá độc tố. Các chủng ở môi sinh không có khả năng sinh độc tố và không gây bệnh, ngoại lệ có một só chủng V. cholerae O1 phân lập được ở một số bệnh nhân tiêu chảy hoặc nhiễm trùng ngoài đường tiêu hóa, Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên V. cholerae O1 gồm 3 týp huyết thanh là Inaba, Ogawa và Hikojima và bao gồm hai sinh týp khác nhau là sinh typ cổ điển và sinh týp El tor [23], [35]. Những năm gần đây, khi các vụ dịch tả do V.cholerae O139 gây ra, việc định danh tất cả các chủng V. cholerae đều dựa trên tính chất sinh vật hoá học, sau đó nếu chủng nào không ngưng kết với O1 thì được gọi là “Vibrio cholerae - không O1”, sau này được đổi thành Vibrio không gây tả hoặc “nhóm Vibrio không ngưng kết”. Hiện nay các nhóm này thuộc các nhóm huyết thanh từ O2 - O138, không có khả năng gây dịch tả. Nhóm Vibrio này đôi khi gây tiêu chảy do liên quan đến ăn hải sản, hoặc các nhiễm trùng ngoài đường tiêu hoá như vết thương... Vụ dịch tả xảy ra vào đầu năm 1993 tại Ấn Độ và Bangladaesh do một loại Vibrio non O1 gây ra, đó là V. cholerae O139 còn gọi là Vibrio Bengal. Nhìn chung đây là một chủng lai giữa V. cholerae O1 và Vibrio cholerae - non O1 và điều quan trọng là độc lực của nó là độc tố ruột và kháng nguyên nhung mao đồng điều hoà độc tố, tuy nhiên chủng O139 giống với sinh týp ElTor hơn [38], [41]. Dựa vào độc tính vi khuẩn V. cholerae O1 có thể chia thành 2 nhóm chính theo huyết thanh (serogroups) đó là O1 và O139. Nhóm O1 có hai týp sinh học (biotype) ElTor và cổ điển, El Tor là tên của một trạm y tế ở Ai cập nơi mà týp vi khuẩn này được phát hiện trong đại dịch năm 1907, hiện nay Eltor là thủ phạm chính của các trận dịch tả trên thế giới. Mỗi týp sinh học Eltor hay cổ điển có thể chia thành 3 nhóm nhỏ theo huyết thanh là Ogawa, Inaba, Hikojima, mỗi nhóm còn có thể chia thành nhóm nhỏ hơn dựa vào kháng nguyên (antigen) A, B hay C [21], [33], [40]. 1.2.3. Phƣơng thức lây truyền Bệnh tả lây theo đường tiêu hóa, chủ yếu qua ăn uống. Vi khuẩn tả xâm nhập vào đường tiêu hóa của người lành từ 2 nguồn chính: Thức ăn, nước Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên uống ô nhiễm phân có vi khuẩn tả và thức ăn có nguồn gốc thủy hải sản cửa sông, ven biển có chứa các thể tiềm sinh lâu dài của vi khuẩn tả. Bệnh tả lây mạnh nhất ở giai đoạn toàn phát của bệnh. Thời gian thải vi khuẩn thường kéo dài khoảng 1 tuần sau khi hết tiêu chảy cấp. Một số ít bệnh nhân có thể gây nhiễm sau mắc bệnh nhiều tuần, thậm chí nhiều tháng do khả năng đào thải vi khuẩn tả từng đợt theo phân. Các yếu tố lây truyền vi khuẩn tả là nước, thực phẩm tươi sống, thực phẩm đã qua chế biến, bàn tay, dụng cụ ăn uống, đồ dùng cá nhân và ruồi nhặng bị nhiễm phẩy khuẩn tả. Những yếu tố nguy cơ làm tăng khả năng lan truyền bệnh tả là mật độ dân cư đông đúc, đời sống kinh tế, xã hội và dân trí thấp, điều kiện vệ sinh an toàn thực phẩm không đảm bảo, nguồn nước sinh hoạt khan hiếm, thiếu nhà vệ sinh hợp tiêu chuẩn, vệ sinh môi trường không tốt, thực hành vệ sinh cá nhân kém, khu vực bị lũ lụt và sau lũ lụt [32], [41]. 1.2.4. Tính cảm nhiễm Mọi người đều có thể nhiễm vi khuẩn tả. Cơ thể sau khi mắc bệnh tả hoặc nhiễm khuẩn không triệu chứng có miễn dịch đặc hiệu với chủng tả gây nhiễm nhưng thời gian miễn dịch thường ngắn, trung bình 6 tháng, không có miễn dịch chéo giữa nhóm V. cholerae O1 với nhóm O139. Những nhóm người có nguy cơ cao với tả là những người tiếp xúc gần gũi (cùng ăn, uống, sinh hoạt) với bệnh nhân tả, dân cư tại vùng có tập quán ăn uống không hợp vệ sinh, sử dụng thức ăn đường phố, hải sản chưa chín, nước chưa qua khử trùng, dùng phân tươi trong trồng trọt, khu vực đồng bằng cửa sông, ven biển, vùng bị ngập lụt [31]. 1.2.5. Diễn biến bệnh Thời kỳ ủ bệnh từ vài giờ tới 5 ngày, thường từ 2-3 ngày, thời kỳ khởi phát rất ngắn, bệnh nhân bắt đầu cảm thấy đầy bụng và sôi bụng; tiếp theo đó tiêu chảy, lúc đầu có phân, sau chỉ toàn nước và kiệt sức nhanh chóng. Bệnh nhân thường chỉ nôn sau khi đã tiêu chảy nhiều lần, thời kỳ toàn phát thường Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên có các triệu chứng tiêu chảy liên tục, nhiều lần, phân toàn nước, nước phân lờ lờ đục như nước vo gạo, trong đó có những vẩy màng màu trắng (là mảnh tế bào thượng bì niêm mạc ruột lẫn phẩy khuẩn tả). Bệnh nhân không đau bụng, mót rặn và không có nhày máu mũi. Số lần tiêu chảy và số lượng nước mất thay đổi tùy từng trường hợp nặng nhẹ khác nhau như nôn dễ dàng, lúc đầu nôn ra thức ăn, sau chỉ toàn nước trong hoặc vàng nhạt, tiếp theo các triệu chứng khác bệnh nhân không sốt, người mệt lả, có thể bị chuột rút, biểu hiện tình trạng mất nước từ độ I đến độ III như khát nước, da khô, nhăn nheo, hốc hác, mắt trũng, mạch nhanh, huyết áp hạ, có khi không đo được, tiểu tiện ít hoặc vô niệu, chân tay lạnh... Ngoài ra bệnh nhân có thể bị rối loạn thăng bằng điện giải như hạ kali máu [5], [19]. 1.2.6. Kháng nguyên và cấu trúc lớp vỏ vi khuẩn Sự thay đổi tính chất kháng nguyên là yếu tố quan trọng trong nghiên cứu dịch tễ và độc lực của vi khuẩn. Đối với vi khuẩn tả, khả năng gây thành dịch của chủng Bengal nói trên là môt ví dụ minh hoạ. Nhiều loại vi khuẩn khác trong môi trường nước cũng có kháng nguyên roi như vi khuẩn tả vì vậy không thể căn cứ vào loại kháng nguyên này để phân biệt. Týp huyết thanh phẩy khuẩn đã được phân biệt dựa trên đặc điểm vào kháng nguyên O ( kháng nguyên vỏ). Hầu hết các chủng vi khuẩn tả đều không có độc tính. Chủng Bengal gây thành dịch được định danh là O1. Tuy vậy có tới 3 týp sinh học của O1 được gọi tên Ogawa, Inaba và Hikojima. Mỗi chủng trong 3 loại này có khả năng thể hiện đặc tính của chủng cổ điển hay của El Tor. Chủng Bengal O139 là chủng huyết thanh mới có kháng nguyên O đặc thù. Đặc tính kháng nguyên đặc thù của Bengal O139 có thể giúp chúng ta giải thích vì sao cơ thể không có miễn dịch sau khi bị bệnh [5]. Các kháng nguyên vỏ của phẩy khuẩn gồm: Týp Ogawa có kháng nguyên A và B; Týp Inaba có kháng nguyên A và C; Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Týp Hikojima có kháng nguyên A, B, C. Týp sinh vật: Chủng V. cholerae O1 được chia thành 2 týp sinh vật là týp cổ điển và týp ElTor. Bảng 1.2. Phân lập V. cholerrae týp cổ điển và týp Eltor Tính chất V. cholerae týp cổ điển V. cholerae týp Eltor Làm tan hồng cầu cừu Nhậy Kháng Ngưng kết hồng cầu gà - + Polymixin B 50đv - + Phage IV Nhậy Kháng Nội độc tố có mặt trong phẩy khuẩn cũng như trong các vi khuẩn Gram âm khác. Chúng ta còn biết ít về cấu trúc lớp vỏ liposaccharide của phẩy khuẩn. Tuy nhiên, một số đặc điểm đặc thù của lớp vỏ phẩy khuẩn cũng đã được nghiên cứu. Điều quan trọng nhất là sự thay đổi cấu trúc lớp vỏ có thể xảy ra trong cả điều kiện in vitro lẫn in vivo. Đây có thể là một nguyên nhân dẫn đến sự biến đổi của các chủng không có độc lực trong tự nhiên thành chủng cổ điển có khả năng gây thành dịch và ngược lại. Phân nhóm V. cholerae O1 là các vi khuẩn gây dịch tả và V. cholerae không phải nhóm O1 / không phải O139 ( gọi tắt V. cholerae non – O1 / non - O139) hay nhóm N.A.G ( Non Aglutinable Vibrios ) các phẩy khuẩn không ngưng kết, gồm các vi khuẩn có tính chất sinh vật hoá học giống V. cholerae nhóm O1, nhưng không ngưng kết với kháng huyết thanh O1, nhóm này có thể gây bệnh nhẹ không thành dịch. Đặc điểm chủ yếu của những chủng này là không sản xuất độc tố tả và không liên quan tới dịch tiêu chảy. Những chủng này được phân lập tình cờ từ những trường hợp tiêu chảy do ăn tôm cua hoặc từ những nhiễm trùng ngoài ruột khác như: Vết thương, tai, đờm, Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên nước tiểu, dịch não tuỷ. Phẩy khuẩn thuộc nhóm này được tìm thấy ở cửa sông, các nhiễm trùng do các chủng này thường bắt nguồn từ ngoại cảnh, V. cholerae O139 ( chủng Bengal ) lúc đầu, vi khuẩn gây vụ dịch này liên quan tới vi khuẩn tả non-O1 vì nó không ngưng kết với kháng huyết thanh O1 nhưng triệu chứng lâm sàng rất dữ dội và giống tả. Chủng V. cholerae O139 được cho là chủng lai của chủng V. cholerae O1 và chủng non ( có tính chất sinh vật hoá học giống V.cholerae nhóm O1, nhưng không ngưng kết với kháng huyết thanh O1). CácVibrio khác: V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, các Vibrio nhóm F.V. parahaemolyticus được coi là một trong những nguyên nhân quan trọng gây ngộ độc thực phẩm do ăn hải sản sống hoặc chưa được nấu kỹ với các triệu chứng viêm ruột và tiêu chảy cấp tính [5], [44]. 1.2.7. Độc tố của vi khuẩn tả V. cholerae sinh ra rất nhiều sản phẩm ngoại tế bào. Đặc điểm tiêu chảy mất nhiều nước là do độc tố ruột gây ra được gọi là độc tố tả cholerae toxin (CT). Những nghiên cứu trên người tình nguyện cho thấy CT là nguyên nhân chủ yếu gây bệnh tả, tuy nhiên các chủng tả nếu loại bỏ gen mã hoá CT vẫn có thể xảy ra tiêu chảy nhẹ hoặc vừa ở nhiều cá thể. Điều này có thể suy ra còn có những yếu tố nào đó hay loại độc tố nào khác ngoài CT. Độc tố tả được Robert Koch mô tả từ năm 1884 khi ông cho đó là một chất độc đặc biệt tác động lên tế bào biểu mô ruột. Năm 1959 có hai nhà khoa học nghiên cứu độc lập tại Ấn Độ là De và Dutta đã đưa canh khuẩn tả vào ruột thỏ và 10 năm sau Finkelstein và LoSpalluto đã tinh chế được độc tố này cho phép nhiều nhà khoa học nghiên cứu về lĩnh vực cấu trúc, thụ thể bám và cơ chế tác dụng của CT [43]. Cấu trúc độc tố tả bao gồm hai tiểu phần A và B, tiểu phần B có tác dụng bám dính vào thụ thể đặc hiệu của tế bào biểu mô ruột, tiểu phần A có chức năng enzym đặc hiệu có khả năng chui vào tế bào chủ. Độc tố CT bao Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên gồm 5 tiểu phần B và một tiểu phần A, tiểu phần B trưởng thành có 103 acid amin và có trọng lượng phân tử 11.5 KDa, tiểu phần A có trọng lượng phân tử 29 KDa gồm 2 chuỗi polypeptide (A1 có trọng lượng phân tử 23.5.KDa và A2 có trọng lượng phân tử 5.5 Kda), hai tiểu phần nối với nhau bằng cầu disulfit. Bản chất miễn dịch học của độc tố tả CT giống hệt độc tố ruột không chịu nhiệt của E.coli sinh độc tố [5]. Hình 1.1. Biểu đồ khu trú của vi khuẩn trong ruột non (Phẩy khuẩn tả tiếp xúc và gắn với các tế bào niêm mạc ruột thỏ qua thí nghiệm quan sát dưới kính hiển vi điện tử). Khi theo nước uống hay thức ăn vào trong dạ dày, vi khuẩn chịu tác động của dịch dạ dày có độ pH thấp ( môi trường axit ). Những vi khuẩn sống xót sẽ tiếp tục xuống ruột non. Ở ruột non, vi khuẩn có khả năng tồn tại rất Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên tốt. Phẩy khuẩn có khả năng kháng tác động của muối mật, xâm nhập qua lớp màng nhầy trên niêm mạc ruột. Quá trình xâm nhập được hỗ trợ bởi men tan nhầy và các men phân cắt protein thành các peptide. Do khả năng "tự bơi", vi khuẩn có thể chuyển động ngược chiều với nhu động ruột để tiếp cận với niêm mạc ruột nhờ đặc điểm hoá hướng động của chúng. Khả năng gắn kết và cố định vào tế bào niêm mạc có thể được hỗ trợ bởi các "sợi lông" của chúng kết lại thành bó ở một đầu vi khuẩn. Các sợi này được gọi là toxin coregulated pili là các sợi phối hợp điều hoà độc tố. Biểu hiện các gene của các lông này liên quan đến gene quyết định độc tố của vi khuẩn. Chúng ta chưa có hiểu biết đầy đủ về tác động qua lại giữa các toxin coregulated pili với tế bào vật chủ. Các thụ quan trên về mặt tế bào tiếp nhận các sợi này cũng chưa được xác định. Chuỗi amino acid của coregulated pili tương tư như N-methylphenylalamine pili của Pseudomonas và Neisseria. Men tan nhầy của phẩy khuẩn giúp chúng phân giải các protein như fibronectin, lactoferrin và phân giải chính độc tố của nó. Vai trò của men trong cơ chế gây độc vẫn còn là câu hỏi vì đột biến gene của men này vẫn không làm giảm độc lực của vi khuẩn. Có giả thuyết cho rằng men tan nhầy có tác dụng giúp vi khuẩn tách khỏi tế bào chứ không hỗ trợ quá trình gắn kết vì vi khuẩn có xu hướng tách khỏi các tế bào trần để tìm đến những tế bào khác mới [26]. 1.2.8. Một số phƣơng pháp phát hiện V. cholerae trong phòng thí nghiệm Phương pháp soi kính hiển nền đen; Phương pháp nuôi cấy; Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang dùng kháng huyết thanh O1; Phản ứng đồng ngưng kết dùng kháng thể đơn dòng kháng kháng nguyên O1; Phản ứng ELISA dùng hạt nhiễm từ để tìm CT; Kít chẩn đoán nhanh Cholera Screen; Chẩn đoán bằng phương pháp sinh học phân tử ( PCR); Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Phương pháp Real-time PCR. CHƢƠNG II NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Đề tài được tiến hành từ tháng 3 năm 2008 đến tháng 9 năm 2009. Thu thập mẫu nghiên cứu từ những bệnh nhân mắc bệnh tiêu chảy cấp nghi ngờ mắc tả tại các khoa lây của 6 bệnh viện trên địa bàn tỉnh Thái Nguyên. Chẩn đoán xác định V. cholerae tại phòng thí nghiệm vi sinh Trung tâm Y tế Dự phòng Thái Nguyên. Thực hiện kỹ thuật PCR tại phòng vi khuẩn đường ruột Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương. 2.2. Nguyên liệu nghiên cứu Gồm các chủng V. Cholerae phân lập được từ bệnh nhân trong quá trình nghiên cứu. Bao gồm các dụng cụ thông thường được sử dụng trong phòng thí nghiệm vi sinh và sinh học phân tử (Đèn cồn, tăm bông, que cấy, hộp petri, pipette pasteur, ống nghiệm, pipette man, đầu col các loại, ống eppendorf các cỡ, dung dịch glycerin, nước muối sinh lý, lọ đựng mẫu 100ml vô trùng, găng tay cao su, khẩu trang, túi ninol các loại, hộp bảo quản mẫu, phích lạnh…) 2.3. Hóa chất thiết bị Các loại hóa chất sử dụng trong thí nghiệm khi thực hiện luận văn là các sản phẩm của các công ty hóa chất có uy tín trên thế giới và có độ tinh khiết cao. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Bảng 2. 1. Danh mục một số dụng cụ, hóa chất sử dụng trong nghiên cứu TT Tên hóa chất, môi trƣờng Hãng sản xuất (1) (2) (3) 1 Môi trường Carry-blair Mecrk – Đức 2 Môi trường TCBS Mecrk – Đức 3 Môi trường Thạch kiềm pH 8,5-9,5 Mecrk – Đức 4 Kligler Iron Agar ( KIA) Mecrk – Đức 5 Môi trường mannit - di động Mecrk – Đức 6 Môi trường Ure - Indol Mecrk – Đức 7 Môi trường basikow Mecrk – Đức 8 Thuốc thử Kovacs Mecrk – Đức 9 Kháng huyết thanh đa giá O1, O139 Anh 10 Kháng huyết thanh đơn giá (Ogawa, Inaba) Anh 11 Thuốc nhuộm Gram Mecrk – Đức 12 Kính hiển vi Đức 13 Máy PCR Mỹ 14 Máy đo pH Mettler – Thụy Sỹ 15 Bộ chạy điện di Đức 16 Máy chụp ảnh gel Mỹ 17 Máy trộn vortex Anh 18 Máy ly tâm Anh 19 Lò vi sóng Sanyo 20 Máy lắc ổn nhiệt Anh Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 21 Tủ lạnh sâu Sanyo 22 Cân phân tích Mettler – Thụy Sỹ 23 Tủ cấy vô trùng Việt Nam 24 Nồi khử trùng Mỹ 25 Tủ ấm 37oC Memmect – Đức 2.4. Đối tƣợng và phƣơng pháp nghiên cứu. 2.4.1. Đối tƣợng nghiên cứu: Bệnh nhân tiêu chảy cấp nghi ngờ mắc bệnh tả được hệ thống giám sát bệnh truyền nhiễm ghi nhận trước khi tiến hành lấy mẫu. 2.4.2. Cỡ mẫu và cách chọn mẫu Tính cỡ mẫu : Áp dụng công thức tính cỡ mẫu cho nghiên cứu mô tả p x (1-p) n = Z(1-/2) -------------- d 2 n: cỡ mẫu α = 0,05 ; độ tin cậy 95% z1-α/2 : hệ số tin cậy. Với độ tin cậy là 95% thì hệ số tin cậy z(1-α/2) = 1,96 p = 0,5 : Tỷ lệ bệnh nhân bị tiêu chảy cấp phải nằm viện (giả định). d : sai số tuyệt đối chấp nhận = 6 % = 0,06 Thay vào công thức (1) có n = 266 Cỡ mẫu thu thập được là: 270 Chọn mẫu có chủ đích là những bệnh nhân bị bệnh tiêu chảy cấp có triệu chứng lâm sàng nghi mắc bệnh tả. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Xử lý số liệu bằng phần mềm SPSS 12.0 với các test thống kê thường dùng trong y tế, gồm: tần xuất, tỷ lệ %, tỷ suất chênh OR, so sánh sự khác nhau giữa các phương pháp bằng test 2. 2.4.3. Phƣơng pháp nghiên cứu - Phương pháp dịch tễ học mô tả cắt ngang: Nhằm đánh giá tình hình dịch tễ liên quan đến yếu tố mắc bệnh của bệnh nhân, mô tả hiện tượng sức khỏe và các yếu tố nguy cơ có liên quan đến sức khỏe đó một cách chính xác để tiến hành thu thập mẫu bệnh phẩm, điều tra cắt ngang sự phân bố tình trạng mắc bệnh tại thời điểm đang xảy ra dịch [37]. - Nghiên cứu thực nghiệm labo để đánh giá tỷ lệ phát hiện V.cholerae O1 đồng thời phân tích đánh giá hiệu quả của các phương pháp nghiên cứu để đưa ra tính ưu việt, phù hợp nhằm áp dụng thực tiễn tại cơ sở [37]. 2.4 3.1. Các kỹ thuật lấy mẫu và vận chuyển bệnh phẩm * Kỹ thuật lấy mẫu Thu thập và vận chuyển bệnh phẩm là một bước quan trọng trong quá trình phân lập và phát hiện các vi khuẩn gây bệnh đường ruột. Thu thập và vận chuyển bệnh phẩm không đúng cách sẽ ảnh hưởng đến kết quả chẩn đoán tác nhân gây bệnh và điều trị, mẫu bệnh phẩm là phân hoặc chất nôn, thức ăn, chất chứa trong ruột non, ruột già sau khi mổ tử thi, và người tiếp xúc với bệnh nhân, mẫu được thu thấp càng sớm càng tốt trước khi điều trị kháng sinh. Mẫu bệnh phẩm là phân phải được lấy càng sớm vì vi khuẩn ở trong phân rất nhiều trong những ngày đầu của bệnh và trước khi bắt đầu điều trị kháng sinh, sau khi lấy cho vào lọ không có chất khử khuẩn hoặc chất tẩy rửa, nút lọ được đậy chặt chống rò rỉ, có thể lấy phân bằng ống thông trực tràng hoặc tăm bông vô trùng, bệnh phẩm cần được giữ nhiệt độ 4oC - 8oC và đưa ngay đến phòng xét nghiệm trong vòng 2 giờ, nếu ở ổ dịch xa phòng xét nghiệm, bệnh phẩm cần lấy bằng tăm bông vô trùng sau đó cho vào lọ có Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên chứa môi trường vận chuyển Carry - Blair và đưa về phòng xét nghiệm sớm trong điều kiện không cần giữ lạnh [4], [20]. Mẫu thực phẩm cần đảm bảo tính đại diện, thu thập mẫu tại nhiều vị trí trên thực phẩm, khối lượng mỗi mẫu khoảng 25 gam, mẫu được chuyển về phòng xét nghiệm sớm. Mẫu nước thu thập có tính đại diện cho khối nước cần kiểm nghiệm, chọn nhiều vị trí mẫu khác nhau, tránh gây tạp nhiễm mẫu trong lúc thu thập, lấy nước vào bình thuỷ tinh vô trùng 500-1000ml, nếu lấy ở sông cần chọn nơi nước chảy giữa dòng độ sâu 20-30 cm. Giám sát người lành mang trùng trong một vụ dịch tả, tất cả những người tiếp xúc gần gũi với bệnh nhân tả đều được coi là có thể mang mầm bệnh và vì vậy cần được theo dõi sức khỏe liên tục trong vòng 5 ngày kể từ lần tiếp xúc cuối cùng, để kịp thời phát hiện ca bệnh mới. Với những người tiếp xúc ở đầu vụ dịch cần được lấy phân xét nghiệm tìm vi khuẩn tả. Những người tiếp xúc gần và người lành mang vi khuẩn tả (phát hiện qua xét nghiệm phân) phải được điều trị dự phòng bằng kháng sinh. Mẫu bệnh phẩm là huyết thanh được lấy 2 lần trong giai đoạn cấp tính và giai đoạn hồi phục. * Bảo quản bệnh phẩm Cần được giữ vào môi trường bảo quản và vận chuyển khi ở xa phòng xét nghiệm và bệnh phẩm không được làm xét nghiệm sau 2 giờ (tính từ khi thu thập mẫu). Môi trường vận chuyển Carry-Blair là môi trường tốt nhất để bảo quản và vận chuyển, có thể dùng dung dịch đệm glyxerin, môi trường vận chuyển đã thu thập mẫu được chuyển sớm tới phòng xét nghiệm hoặc giữ ở tủ lạnh 4oC ( nếu chưa được xét nghiệm ngay ). Trong vụ dịch tả nguy hiểm mẫu bệnh phẩm cần được lưu giữ trong hộp sắt kín để tránh lây lan trong quá trình vận chuyển [34]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2.4.3.2. Các phƣơng pháp chẩn đoán V. cholerae Sơ đồ các phƣơng pháp chẩn đoán V. cholerae trong phòng thí nghiệm [13]. Hình 2.1. Sơ đồ phân lập chẩn đoán V. cholerae TCBS, Th¹ch KiÒm 370C/ 24 giê TÝnh chÊt sinh ho¸ 370C/3-6 giê Soi T•¬i Pepton kiÒm 370C/3-6 giê TCBS, Th¹ch KiÒm Oxidaza (+) KIA: Glucoza(+); Lactoza (-); H¬i(-); H2S (-) Mannit (+); di ®éng (+) Urea (-); Indol (+) LDC: (+) Saccaroza: (+) Arabinoza:(-) Mannoza: (+) Ng•ng kÕt kh¸ng huyÕt thanh §a gi¸ O1 §a gi¸ O139 §¬n gi¸ Ogawa §¬n gi¸ Inaba 370C/3-6 giê Pepton kiÒm BÖnh phÈm Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên * Kỹ thuật soi tƣơi trực tiếp Hòa mẫu phân vào nước muối sinh lý, nhỏ một giọt lên lam kính, đậy la men, soi tiêu bản trực tiếp bằng kính hiển vi ( Hình 3.4 ) kết quả cho thấy vi khuẩn di động rất nhanh theo những đường thẳng từ đầu đến cuối vi trường, soi tiêu bản trên kính hiển vi nền đen, phẩy khuẩn di động như sao đổi ngôi. Tiến hành soi tươi trực tiếp mẫu phân và chất nôn của bệnh nhân nhằm phát hiện vi khuẩn di động. Soi tiêu bản trên kính hiển vi nền đen vi khuẩn tả có một lông ở đầu nên khả năng di động rất mạnh như sao đổi ngôi. Trong quá trình nghiên cứu chúng tôi thực hiện các bước như sau: - Lam kính 1: Hoà mẫu phân vào nước muối sinh lý, nhỏ 1 giọt lên lam kính, đậy phiến kính mỏng (lamen) lên trên. Soi tiêu bản trực tiếp trên kinh hiển vi nếu nghi ngờ V. cholerae vi khuẩn di động rất nhanh theo những đường thẳng từ đầu đến cuối vi trường (tuy nhiên có một số vi khuẩn đường ruột khác cũng di động khi soi tươi trên kính hiển vi). - Lam kính 2: Nhỏ một giọt huyền dịch phân lên lam kính, nhỏ một giọt kháng huyết thanh tả đa giá. Phương pháp soi tiêu bản trực tiếp trên kính hiển vi nền đen đã được sử dụng từ lâu, nhưng không được phù hợp với điều kiện của các phòng xét nghiệm tuyến huyện, trên kính hiển vi nền đen phẩy khuẩn tả di động như sao đổi ngôi. Hình 2.2. Hình vẽ lam kính và la men soi tƣơi bằng kính hiển vi Lam kính Lamen Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Phương pháp soi tươi trên kính hiển vi nền đen hoặc phản pha dùng để phát hiện tính di động của V. cholerae, đặc biệt khi phân của bệnh nhân chứa >10 5 vi khuẩn/gam phân. Hơn nữa kỹ thuật này còn dùng kết hợp kháng huyết thanh V. cholerrae để ức chế sự di động trên nền khi soi và chỉ trong vòng từ 3 - 5 phút khoảng 50% vi khuẩn V. cholerae bị tụ lại, vì vậy kỹ thuật này có giá trị để chẩn đoán nhanh trong vùng có dịch, độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật này tùy thuộc vào kinh nghiệm của kỹ thuật viên. * Kỹ thuật nhuộm Gram Kỹ thuật nhuộm Gram phát hiện hình thể và tính chất bắt màu của vi khuẩn, với thành phần thuốc nhuộm gồm có tím gentian, dung dịch lugol, Fucsin kiềm bằng cách cố định tiêu bản sau đó nhỏ thuốc nhuộm tím gentian lên trong 2 phút, rửa nước, sau đó nhỏ dung dịch lugol lên trong 2 phút, hất đi, tẩy mầu bằng cồn 90o tới khi bạc màu, rửa nước, nhỏ dung dịch Fucsin kiềm ( pha loãng tỷ lệ 1/10 ) lên trong 1/2 phút, rửa nước, để tiêu bản khô trong không khí hoặc dùng giấy thấm, soi tiêu bản bằng vật kính dầu. Nhận biết vi khuẩn Gram âm bắt màu đỏ, có hình thể mảnh, cong, hình dấu phẩy, không có vỏ, không sinh nha bào, khi nuôi cấy lâu ngày sẽ có sự thay đổi về hình thể so với ban đầu. * Phƣơng pháp dùng kít nhanh Dựa trên nguyên lý sắc ký miễn dịch, màng nitrocellulose được gắn với kháng thể đơn dòng đặc hiệu với V. cholerae O1 và O139 thành hai băng riêng biệt, khi mẫu thử đi qua màng nitrocellulose, Colloidal Gold (chất keo vàng) cặp đôi với kháng thể đơn dòng, cặp đôi này gắn với kháng nguyên của mẫu thử. Hỗn hợp kháng nguyên - kháng thể sẽ thấm qua màng nitrocellulose và gắn với kháng thể kháng V. cholerae O1 và O139 và hình thành các băng màu đỏ. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên * Kỹ thuật nuôi cấy Chọn lọc những khuẩn lạc thuần khiết qua các bước cấy chuyển khác nhau do vậy tính chất môi trường nuôi cấy phải có tính chọn lọc ức chế loại vi khuẩn này nhưng lại phù hợp với loại vi khuẩn kia, phương pháp nuôi cấy được coi là “tiêu chuẩn vàng” tuy nhiên vẫn có mặt hạn chế là thời gian trả lời kết quả khảng định lâu phải mất thời gian từ 24 giờ - 48 giờ và không phát hiện được V. cholerae nếu bệnh nhân đã dùng thuốc kháng sinh. * Kỹ thuật PCR ( Polymerase Chain Reaction ) Dùng để phát hiện gen ctx, kỹ thuật này có độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn các kỹ thuật khác, ngoài ra áp dụng kỹ thuật PCR để tìm độc tố CT trong thực phẩm, PCR là một kỹ thuật được sử dụng phổ biến trong công nghệ sinh học hiện đại và đã đóng góp rất lớn cho những tiến bộ về sinh học phân tử, đánh dấu một bước tiến vô cùng quan trọng tương đương với việc khám phá ra các enzyme hạn chế và kỹ thuật Southern blot. Kỹ thuật PCR dựa trên cơ sở phản ứng mở rộng primer nhờ Taq polymerase để khếch đại in vitro các nucleic acid đặc trưng. PCR cho phép khếch đại theo hàm mũ lên đến hàng triệu lần các đoạn DNA có chiều dài từ 200 – 3000 bp. Đoạn DNA được khếch đại ( DNA đích ) được nhận diện nhờ cặp primer đặc trưng thường có chiều dài khoảng 20 nucleotide. Taq polymerase là một loại enzyme chịu nhiệt được dùng để tổng hợp các đoạn DNA mới trong môi trường có 4 loại deoxy nucleotide (dATP, dCTP, dGTP và dTTP) và hai primer, trên cơ sở khuôn mẫu của một đoạn DNA nhất định đã biết hoặc chưa biết trình tự. Các đoạn DNA mới hình thành lại được sử dụng làm khuôn mẫu. Sau nhiều chu kỳ, số lượng đoạn DNA nói trên được nhân lên gấp nhiều lần, nhờ vậy có thể đủ số lượng để tách ra, phân tích trình tự hoặc tạo dòng [21], [25]. 2.4.3.3. Tiêu chuẩn đánh giá V. cholerae dƣơng tính trong nghiên cứu * Soi tươi : Hình thể nhỏ, di động nhanh trên lam kính; * Nhuộm Gram: Gram âm, hình cong dấu phẩy; Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên * Nuôi cấy: + Trên môi trường pepton kiềm mặn, mọc đục 3-6 h, có váng nổi mặt môi trường; + Trên môi trường thạch kiềm khuẩn lạc nhỏ, trong, tròn, bờ đều, vi khuẩn mọc sau 6-24 giờ; + Trên môi trường thạchTCBS nếu nghi ngờ V. cholerae khuẩn lạc màu vàng, nhỏ, trong, thời gian mọc khuẩn lạc 12 – 24 giờ; + Phản ứng Oxidaza : Dương tính khi chuyển màu xanh tím; + Sinh vật hoá học: Lên men đường Mannoza, Sacaroza, Arabinoza; + Ngưng kết KHT đa giá và đơn giá; * Test nhanh : Xuất hiện 2 vạch là vạch chứng và vạch mẫu thử; * Phương pháp PCR dương tính. CHƢƠNG III Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Đặc điểm chung của đối tƣợng nghiên cứu 3.1.1. Phân bố đối tƣợng nghiên cứu theo giới, tuổi Giới tính và lứa tuổi là một trong những đặc điểm được chúng tôi quan tâm kết hợp với yếu tố dịch tễ khi tiến hành lấy mẫu xem khả năng bị mắc bệnh tả ở giới nào hoặc độ tuổi bao nhiêu. Nên trong quá trình tiến hành thu thập mẫu bệnh phẩm trên bệnh nhân, chúng tôi thu thập được một số thông tin về sự phân bố theo giới tính và nhóm tuổi như sau: Bảng 3.1. Phân bố đối tƣợng nghiên cứu theo giới, tuổi Giới n X ± SD Trung vị min - max Nữ 164 34,2±14,5 34(24-45) 8 - 67 P> 0,05 Nam 106 31,8±15,5 34(17-44) 5 - 68 Tổng 270 33,3±14,9 34(21-45) 5 - 68 Bảng phân bố đối tượng nghiên cứu ( Bảng 3.1; bảng 3.2; biểu đồ 3.1) cho thấy nhóm tuổi thấp nhất đối với nữ là 8 và đối với nam là 5; độ tuổi cao nhất đối với nữ là 67 đối với nam là 68. Kết quả cho thấy sự khác biệt về tuổi giữa các bệnh nhân nam và nữ không có ý nghĩa thống kê ( P > 0,05 ) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 10 18 22 46 79 95 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 5-10 Tuổi > 50 Tuổi 11-20 Tuổi 41 - 50 Tuổi 31-40 Tuổi 21-30 Tuổi Số mẫu thu thập tính theo độ tuổi Biểu đồ 3.1. Đánh giá độ tuổi trong thu thập mẫu Nghiên cứu của Nguyễn Đăng Hiền và cộng sự (2008 ) cho kết quả trong tổng số 1.808 trẻ em nhập viện do tiêu chảy có tới 1.018 trẻ tiêu chảy cấp do virut Rota và hầu hết các trường hợp này thường xuất hiện chủ yếu trong 3 năm đầu khi trẻ mới sinh [12]. Trong nghiên cứu chúng tôi không đánh giá tác nhân do virut Rota, chỉ tham khảo qua điều trị của thầy thuốc, chủ yếu dựa vào các biểu hiện lâm sàng để loại bỏ nguyên nhân gây tiêu chảy do vi rút nên lứa tuổi 5-10 thu thập được 10 bệnh nhân chiếm tỷ lệ 3,6 % , Lứa tuổi này có tỷ lệ nghi mắc tả thấp cũng phù hợp với các nghiên cứu khác vì sự biến động của lứa tuổi này không lớn mọi sinh hoạt phụ thuộc gia đình, nếu có thời gian chúng tôi đánh giá thêm tác nhân do virut Rota ở lứa tuổi mới sinh đến 10 tuổi thì ý nghĩa nghiên cứu sẽ mở rộng hơn. Nghiên cứu của M.Ehara và cộng sự (2004) cho rằng nguy cơ mắc bệnh tả của trẻ em dưới 15 tuổi thường tăng vào đầu vụ dịch [55]. Nghiên cứu của Thẩm Chí Mục (1994) cho kết quả ngược lại cho rằng nhóm tuổi này lại tăng vào cuối vụ dịch [28]. Tuy nhiên các kết quả trên cũng chỉ dừng lại đánh giá một vụ dịch nhưng cũng có thể là những gợi mở cho các nghiên cứu tiếp theo trong chương trình phòng chống các bệnh tiêu chảy ở nhóm tuổi này. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Bảng 3.2. Tỷ lệ bệnh nhân theo tuổi Tuổi Số mẫu Tỷ lệ (%) 5 -10 10 3,60 11-20 22 8,15 21 -30 95 35,17 31-40 79 29,15 41-50 46 17,36 >50 18 6,57 Tổng cộng 270 100 Lứa tuổi từ 21- 30 thu thập được 95 mẫu chiếm tỷ lệ 35,17 % lứa tuổi 31- 40 thu thập được 79 bệnh nhân chiếm tỷ lệ 29,15 % sau đến lứa tuổi 41 – 50 chiếm tỷ lệ 17,36 % ( Bảng 3.2 ). Đây là những lứa tuổi lao động quan trọng trong xã hội và có tỷ lệ mắc tả cao nhất so với các lứa tuổi khác, ở lứa tuổi này có nhiều mối liên quan về yếu tố dịch tễ như đi học, đi công tác, đi làm…và điều đặc biệt sinh hoạt ăn uống ở quán cơm bình dân nên yếu tố vệ sinh không đảm bảo. Nghiên cứu Thẩm Chí Mục (1996) đã đánh giá vai trò của thực phẩm và vệ sinh của người phục vụ kết quả là 28,7 % số mẫu thực phẩm không đạt tiêu chuẩn vệ sinh và 20 % mẫu bàn tay nhân viên không đạt tiêu chuẩn [27]. Phan Đạo và cộng sự cho rằng trong thời gian đỉnh của vụ dịch tỷ lệ phân lập được vi khuẩn tả cao trên 50% [9]. Với nghiên cứu của chúng tôi tỷ lệ phân lập dương tính vi khuẩn tả là 5,93 %. Qua điều tra yếu tố dịch tễ của các bệnh nhân trước khi vào viện có 11 bệnh nhân mắc bệnh tả có nguồn lây nhiễm mầm bệnh từ Hà Nội chiếm tỷ lệ 68,75 %. Phải chăng tại tỉnh Thái Nguyên chưa đến điểm đỉnh của vụ dịch mà tỷ lệ mắc bệnh do yếu tố bên ngoài đưa đến sau đó được phát hiện. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Phân bố nhóm đối tượng theo giới tính 39.30% 60.70% Nữ Nam Biểu đồ 3.2. Phân bố đối tƣợng nghiên cứu theo giới tính Nhìn chung bệnh tả không phân biệt theo giới tính, mọi người đều có thể mắc bệnh. Nghiên cứu của Vũ Minh Hương và cộng sự (1994 ) cho biết tỷ lệ dương tính ở nữ là 57,88 % và ở nam giới là 42,12 % [16]. Theo nghiên cứu của Dalsgaard A và cộng sự (1997) ở Peru đã xảy ra vụ dịch tả tác nhân do V. cholerae O1 đã có 230 người mắc tiêu chảy cấp trong đó tỷ lệ nữ mắc bệnh là 59,24 % và nam giới mắc bệnh là 40,76 % [54]. Kết quả ( Biểu đồ 3.2) cho thấy tỷ lệ nữ mắc tiêu chảy cấp là 60,7 % và nam 39,3 % cũng phù hợp với nhận xét của các tác giả trên ( Biểu đồ 3.2 ). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Bảng 3.3. Phân bố bệnh nhân dƣơng tính V. cholerae theo giới tính Giới tính Mắc tả Tỷ lệ % Nam 9 56,25 Nữ 7 43,75 Tổng 16 100 Phân bố bệnh nhân dương tính V. cholerae theo giới tính cho kết quả 9 bệnh nhân nam mắc chiếm tỷ lệ 56,25 % trong khi đó nữ có 7 bệnh nhân chiếm tỷ lệ 43,75 % ( Bảng 3.3 ) Tất cả các lứa tuổi đều có thể mắc tả, nhưng có tác giả cho rằng ở lứa tuổi trẻ và tuổi cao trên 50 tuổi có tỷ lệ mắc cao [18], [45], nghiên cứu của CDC (2004) nhận xét khi không kiểm soát yếu tố dịch tễ dịch sẽ lan rộng trong cộng đồng lúc đó lứa tuổi từ 26-50 tỷ lệ mắc sẽ thấp hơn so với lứa tuổi từ 1-18 tuổi hoặc tuổi trên 50 [49], phải chăng sức đề kháng của trẻ em và người cao tuổi yếu nên tỷ lệ mắc bệnh cao. Hiện nay chưa có nghiên cứu nào đưa ra một thang tuổi nhất định có tính chất mẫu về các trường hợp mắc tả. Nhận xét của chúng tôi cũng phù hợp với nhận xét nghiên cứu của Thẩm Chí Mục về đánh giá đặc điểm dịch tễ học bệnh tả qua các vụ dịch ở Nam Hà tỷ lệ nam giới chiếm tỷ lệ 54,38 % [27]. 3.1.2. Phân bố lấy mẫu bệnh nhân theo địa điểm lấy mẫu Các mẫu trong nghiên cứu được thu thập là lấy mẫu phân của những bệnh nhân đến điều trị tại 6 khoa lây của bệnh viện trên địa bàn tỉnh với tiêu chuẩn lựa chọn là những bệnh nhân mắc bệnh tiêu chảy cấp, với các triệu chứng lâm sàng điển hình nghi mắc tả, không sốt. Kết quả được trình bày tại ( Bảng 3.4 ) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Bảng 3.4. Tỷ lệ thu thập mẫu các địa điểm nghiên cứu Mã hóa Địa điểm lấy mẫu Tỷ lệ (%) BV1 Bệnh viện Đa khoa Trung ương Thái Nguyên 45,19 BV2 Bệnh viện Đa khoa huyện Đồng Hỷ 14,07 BV3 Bệnh viện C 12,59 BV4 Bệnh viện A 10,74 BV5 Bệnh viện Đa khoa huyện Đại Từ 8,89 BV6 Bệnh viện Đa khoa huyện Định Hóa 8,52 Tổng: 100 Trên 6 bệnh viện lấy mẫu cho thấy: BV1 là bệnh viện trực thuộc Trung ương nằm trung tâm tỉnh Thái Nguyên, Thành phố Thái Nguyên có diện tích 177 km 2, dân số 294.759 người với một trường Đại học Thái Nguyên gồm 6 trường Đại học thành viên và hơn 20 trường trung cấp, cao đẳng, số giường bệnh trên 500 giường do vậy số bệnh nhân nhân nghi mắc tả cũng chiếm tỷ lệ cao. Trong nghiên cứu của chúng tôi cho thấy số bệnh nhân mắc bệnh tiêu chảy cấp nghi tả ở BV1 chiếm tỷ lệ cao nhất 45,19 %. Ngược lại ở BV6 là huyện Định Hóa số mắc tiêu chảy cấp nghi tả chiếm tỷ lệ thấp 8,52 % điều này cũng phù hợp với tình hình mắc chung vì huyện Định Hóa cách trung tâm Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên tỉnh Thái Nguyên 50 km, có diện tích rộng 520,75 km2 với dân số 90.000 người, số giường bệnh trên 200, phải chăng với diện tích rộng mật độ dân cư thưa yếu tố dịch tễ không nhiều nên khả năng lây nhiễm cũng giảm. 122 38 34 29 24 23 0 20 40 60 80 100 120 140 Số luợng BV1 BV2 BV3 BV4 BV5 BV6 Khu vực nghiên cứu Phân bố đối tượng nghiên cứu theo địa điểm lấy mẫu Biểu đồ 3.3. Số mẫu thu thập tại 6 bệnh viện trong quá trình nghiên cứu Kết quả (Biểu đồ 3.3 ) cho thấy tại BV1 thu thập được mẫu của 122 bệnh nhân, các bệnh viện còn lại thu thập được từ 23 – 38 bệnh nhân. 3.2. Đánh giá phƣơng pháp nghiên cứu phát hiện V. cholerae 3.2.1. Nhận biết vi khuẩn di động bằng kỹ thuật soi tƣơi Đây là tiêu chí để đánh giá các phương pháp trong quá trình nghiên cứu, việc phát hiện vi khuẩn tả di động trên kính hiển vi nền đen đã được áp dụng từ lâu, tuy nhiên nhiều phòng thí nghiệm không có kính hiển vi nền đen để thực hiện phương pháp này. Với lý do đó chúng tôi đã trực tiếp soi tươi tìm vi khuẩn trên kính hiển vi thường để xem tính chất di động. Bảng 3.5. Tỷ lệ vi khuẩn di động quan sát trên lam kính Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Soi tƣơi n % Di động 28 10,37 Không di động 242 89,63 Tổng 270 100 Vi khuẩn di động quan sát được trên lam kính khi soi trên kính hiển vi, đây là kỹ thuật thực hiện đầu tiên trong quá trình phân tích, có ý nghĩa đánh giá định hướng ban đầu. Kỹ thuật này tuy đơn giản nhưng đòi hỏi kỹ thuật viên có kinh nghiệm cũng như kỹ năng thực hành. Nghiên cứu của chúng tôi khi quan sát soi kính cho thấy vi khuẩn di động ( Hình 3.4 ) là 28 mẫu trên 270 mẫu thu thập chiếm tỷ lệ 10,37% ( Bảng 3.5 ). Như vậy nếu thực hiện tốt kỹ thuật soi tươi mẫu ngay tại cơ sở sẽ giúp cho thầy thuốc có hướng điều trị. Thực hiện một kỹ thuật đơn giản kết hợp với tập huấn kỹ thuật hàng năm chúng tôi nghĩ rằng các kỹ thuật viên sẽ thực hiện tốt kỹ thuật soi tươi. Hình 3.4. Hình thể V. cholerae soi tƣơi 3.2.2. Nhận biết hình thể và tính chất bắt màu của vi khuẩn bằng kỹ thuật nhuộm Gram Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Hình 3.5. Hình thể vi khuẩn V. cholerae nhuộm Gram Bảng 3.6. Tỷ lệ vi khuẩn Gram âm quan sát dƣới kính hiển vi Nhuộm Gram n Tỷ lệ % Gram âm 45 16,66 Gram dƣơng 225 94,44 Tổng 270 100 Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy 45 mẫu bắt màu Gram âm chiếm tỷ lệ 16,66% ( Bảng 3.6 ), kỹ thuật nhuộm cho kết quả nhanh, đơn giản, thực tế đã góp phần đáng kể trong việc phát hiện nhanh vi khuẩn tả ngay tại cơ sở. Kỹ thuật nhuộm soi là nhận biết Gram âm nhưng kết hợp nhận biết hình thể là mảnh cong, không có vỏ, điều đặc biệt dễ nhận biết là có hình dấu phẩy thì khả năng phát hiện sẽ cao hơn, kỹ thuật nhuộm soi được dùng để sàng lọc có hướng điều trị kịp thời sau đó vẫn phải chẩn đoán khảng định bằng phương pháp nuôi cấy. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 3.2.3. Phát hiện V. cholerae bằng kỹ thuật nuôi cấy Quá trình nhận biết khuẩn lạc và xác định rõ vi khuẩn trong quá trình nuôi cấy là rất cần thiết, kết quả nghiên cứu thể hiện ( Bảng 3.7 ) Bảng 3.7. Phần đánh giá chung trong việc xác định các vi khuẩn Các loại vi sinh vật Nuôi cấy Số mẫu (+) / 270 mẫu Tỷ lệ (%) V. cholerae O1 16 5,92 E. coli 47 17,40 N.A.G 4 1,49 Nghiên cứu của tác giả Đinh Sỹ Hiển và cộng sự tại 25 xã của huyện Từ Liêm, Hà Nội với 2.601 mẫu trong 5 năm cho thấy tỷ lệ dương tính của các loại vi khuẩn gây tiêu chảy là 11,54% [11]. Phải chăng V. cholerae xuất hiện khi các căn nguyên khác phát triển hay V. cholerae là yếu tố mồi từ đó xuất hiện các căn nguyên khác. Nghiên cứu của Lê Lan Hương và cộng sự (1995) đã nghiên cứu trên 121 mẫu phân bệnh nhân có 32 mẫu dương tính với một số vi khuẩn gây tiêu chảy (V.cholerae O1 , Shigella, Salmonella, E. coli ) chiếm tỷ lệ 26,45 % [15], kết quả khảo sát của Nguyễn Thị Thế Trâm và cộng sự (1985) tại phường Vĩnh Phước, Nha Trang cho thấy tỷ lệ dương tính đối với các vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy là 11,34% [42]. Còn tại các bệnh viện có ổ dịch ở khu vực 5 tỉnh Duyên Hải miền Trung qua kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Thế Trâm, Nguyễn Thị Kê với 5.171 mẫu thu thập cho thấy tỷ lệ dương tính với 4 tác nhân gây bệnh là 24,34% (V. cholerae O1, Shigella, Salmonella, Echerichia coli ) [42]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Đánh giá nghiên cứu của chúng tôi về phân lập các loại vi khuẩn trong quá trình nuôi cấy mẫu phân ở bệnh nhân tiêu chảy cấp nghi mắc tả trên 270 mẫu bệnh phẩm cho thấy đối với chủng V. cholerae O1 có 16 mẫu dương tính, với vi khuẩn E. coli có 47 mẫu dương tính, các phẩy khuẩn không phải vi khuẩn tả (N.A.G) có 4 mẫu, trong nghiên cứu chúng tôi các vi khuẩn gây tiêu chảy có tỷ lệ phát hiện dương tính tương đương với các công bố của các tác giả khác. Ngoài ra có một số loaị vi khuẩn khác nhưng vì điều kiện và thời gian ngắn nên chúng tôi chưa đánh giá hết được. Bảng 3.8. Tỷ lệ V. cholerae O1 dƣơng tính bằng kỹ thuật nuôi cấy Kết quả Nuôi cấy Tỷ lệ % Âm tính 254 94,07 Dương tính 16 5,93 Tổng 270 100 Tỷ lệ V. cholerae O1 phát hiện bằng kỹ thuật nuôi cấy cho kết quả 16 mẫu dương tính trên 270 mẫu chiếm tỷ lệ 5,93% ( Bảng 3.8; biểu đồ 3.6 ), kỹ thuật này cho kết quả rất chính xác nhưng phải qua nhiều bước khác nhau, đặc biệt phải có phòng xét nghiệm vi sinh hợp lý đúng tiêu chuẩn, đủ môi trường nuôi cấy, cán bộ xét nghiệm phải có kinh nghiệm phán đoán để có các hướng cấy chuyển cần thiết tiếp theo, khâu cuối cùng của kỹ thuật là khẳng định bằng ngưng kết kháng huyết thanh đa giá, đơn giá trước khi kết luận. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Tỷ lệ phát hiện dương tính V.cholerae O1bằng kỹ thuật nuôi cấy 5.93% 94.07% Âm tính Dương tính Biểu đồ 3.6. Tỷ lệ dƣơng tính V. cholerae bằng kỹ thuật nuôi cấy Phương pháp nuôi cấy được coi là " tiêu chuẩn vàng” tuy nhiên vẫn còn mặt hạn chế đó là thời gian trả lời kết quả khẳng định lâu phải mất thời gian từ 24 giờ - 48 giờ và không phát hiện được V. cholerae khi bệnh nhân đã dùng kháng sinh. Kỹ thuật nuôi cấy đã chọn lọc được khuẩn lạc thuần khiết và đặc hiệu ngoài kinh nghiệm của cán bộ xét nghiệm thì yếu tố môi trường nuôi cấy đóng vai trò rất quan trọng, môi trường phải đảm bảo chất lượng. Trên môi trường thạch kiềm rất tốt cho sự phát triển của V. cholerae nhưng ngược lại các loại vi khuẩn khác lại không phù hợp do vậy tính chất môi trường nuôi cấy phải có tính chọn lọc ức chế loại vi khuẩn này nhưng lại tốt với loại vi khuẩn khác. Môi trường thạch TCBS ( Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose) là môi trường chọn lọc tốt nhất để phân lập V. cholerae và được dùng rộng rãi trên thị trường, môi trường đã được thương mại hoá đông khô nên dễ pha chế, môi trường có màu xanh sau khi pha chế nhưng chỉ lưu giữ được một thời gian ngắn (3 - 5 ngày ) những khuẩn lạc mọc trên môi trường này không thích hợp cho phản ứng ngưng kết với phản ứng kháng huyết thanh, khuẩn lạc nghi ngờ mọc sau 12 giờ có khuẩn lạc tròn, hơi dẹt, bóng, màu vàng do lên men đường Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên saccharose, những vi khuẩn không lên men saccharose có khuẩn lạc màu xanh lơ có thể là V. parahaemolyticus, khuẩn lạc nghi ngờ là V. cholerae cần phải cấy trên các môi trường ít chất ức chế như thạch thường, môi trường KIA. Chọn những khuẩn lạc nghi ngờ V. cholerae trên môi trường TCBS để xác định các tính chất sinh hoá, các tính chất sinh hoá rất quan trọng để phát hiện và phân biệt V. cholerae. Bảng 3.9. Nhận xét tính chất khuẩn lạc trên môi trƣờng TCBS Kích thƣớc khuẩn lạc Màu sắc khuẩn lạc n Tỷ lệ % nhỏ 2-3 mm vàng, bóng 67 24,81 nhỏ 1-3 mm không màu 203 75,19 Nghiên cứu của chúng tôi cho kết quả 67 mẫu có khuẩn lạc màu vàng trên môi trường TCBS chiếm tỷ lệ 24,81 % ( Bảng 3.9 ). Môi trường TCBS ( Hình 3.7 ) là môi trường chọn lọc rất tốt trong việc phân lập V. cholerae tuy nhiên khuẩn lạc này không trực tiếp thực hiện phản ứng Oxidase tiếp theo. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Hình 3.7. Hình ảnh khuẩn lạc V. parahemoliticus và V. cholerae O1 Hình 3.8. Khuẩn lạc V. cholerae trên môi trƣờng thạch kiềm * Nhận xét tính chất khuẩn lạc trên môi trƣờng thạch kiềm: Là môi trường thạch thường nhưng có pH kiềm ( pH = 9 ) thích hợp cho V. cholerae phát triển, khuẩn lạc V. cholerae nhỏ, tròn, trong, long lanh như hạt sương, có thể dùng khuẩn lạc này để ngưng kết phản ứng Oxidase. Bảng 3.10. Nhận xét tính chất khuẩn lạc trên môi trƣờng thạch kiềm Kích thƣớc Màu sắc khuẩn n Tỷ lệ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên khuẩn lạc lạc % nhỏ 1-3 mm Nhỏ, trong, không màu. 62 22,96 nhỏ 1-3 mm Đục, hoặc có các màu khác nhau 218 80,74 Tính chất khuẩn lạc trên môi trường thạch kiềm ( Hình 3.8 ) cho thấy môi trường thạch kiềm thích hợp cho V. cholerae O1 phát triển, khuẩn lạc nhỏ, tròn, trong, long lanh như hạt sương, có thể dùng khuẩn lạc này để ngưng kết phản ứng Oxidase nên khi tiến hành nghiên cứu chúng tôi cấy cả 2 loại môi trường kết hợp là TCBS và thạch kiềm và luôn ưu tiên cấy trên thạch kiềm nhiều hơn vì môi trường này V. cholerae O1 mọc nhanh hơn từ 6-24h đã mọc khuẩn lạc và khuẩn lạc này được dùng để thực hiện phản ứng Oxidase và các bước tiếp theo. Trong khi đó trên môi trường TCBS thời gian mọc khuẩn lạc muộn hơn so khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch kiềm, nhưng khi mọc đã bổ sung cho nhau về ưu điểm của mỗi loại môi trường, trong kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho 62 mẫu quan sát khuẩn lạc nhỏ trong không màu chiếm tỷ lệ 22,96 % ( Bảng 3.10 ) * Thời gian mọc khuẩn lạc trên 2 loại môi trƣờng nuôi cấy Thời gian mọc khuẩn lạc đóng vai trò quan trọng trong nuôi cấy chẩn đoán nhanh V. cholerae O1. Như đã đề cập trong phần tổng quan, nếu có điều kiện nên cấy trên cả 2 loại môi trường là TCBS và thạch kiềm, đặc biệt trên Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên môi trường thạch kiềm sau 6 giờ khuẩn lạc đã mọc sẽ được dùng trong phản ứng Oxidase và ngưng kết kháng huyết thanh. Bảng 3.11. Thời gian mọc khuẩn lạc trên 2 loại môi trƣờng nuôi cấy Theo dõi thời gian mọc khuẩn lạc trên môi trường TCBS và môi trường thạch kiềm chúng tôi nhận thấy trên môi trường thạch kiềm khuẩn lạc mọc 6 giờ sau khi cấy có 21 mẫu mọc chiếm tỷ lệ 7,78 % trong khi đó trên môi trường TCBS chưa có khuẩn lạc nào mọc ( Bảng 3.11 ). Trong phần phương pháp nghiên cứu chúng tôi đã đề cập với thời gian mọc khuẩn lạc trên 2 môi trường không giống nhau nhưng có ý nghĩa rất quan trọng cho việc khảng định tính chất sinh hóa sau này. Khuẩn lạc nghi ngờ là V. cholerae được định hướng dựa vào tính chất sinh vật hóa học để phân biệt được các vi khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn đường ruột bằng cách chọn những khuẩn lạc nghi ngờ V. cholerae trên môi trường TCBS để xác định các tính chất sinh hoá. Các tính chất sinh hoá rất quan trọng để phát hiện và phân biệt các loài V. cholerae, đánh giá tính chất sinh vật hóa học chúng tôi chọn 31 mẫu có phản ứng Oxidase dương tính để thực hiện nuôi cấy tiếp trên môi trường sinh vật hóa học. Môi trƣờng Thời gian mọc khuẩn lạc n Tỷ lệ % Môi trường TCBS < 6h 0/270 0 Môi trường thạch kiềm < 6h 21/270 7,78 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Hình 3.9. Các môi trƣờng sinh vật hóa học trong chẩn đoán V. cholerae Bảng 3.12. Bảng đọc kết quả trên môi trƣờng sinh vật hoá học Kết quả thực hiện trên môi trường sinh vật hóa học với 24 mẫu glucoza dương tính, 21 mẫu âm tính đường lactoza, trên môi trường ma nit có 27 mẫu dương tính và 23 mẫu quan sát đường cấy thấy di động, môi trường Indol có 2 mẫu dương tính, đặc biệt trong 3 loại đường thì Arabinoza có 21 mẫu âm tính, mannoza có 20 mẫu dương tính, saccaroza có 20 mẫu dương tính (Bảng 3.12 ) Tính chất sinh vật hóa học có thể phân biệt được các vi khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn đường ruột, tuy nhiên để rút ngắn quá trình chẩn đoán ta cần STT Sinh vật hóa học Tiêu chuẩn đánh giá dƣơng tính Kết quả 1 Oxidaza + 31 2 Glucoza / H2S + / + 24 / 23 3 Lactoza - 21 4 Manit + 27 5 Di động + 23 6 urê - 22 7 Indol + 21 8 Arabinoza - 21 9 Mannoza + 20 10 Saccaroza + 21 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên dùng một số đặc điểm chính để phân biệt (loại trừ ngay các vi khuẩn âm tính với oxidase ). * Nhận biết phản ứng dƣơng tính Oxidase Khuẩn lạc trên môi trường không chọn lọc được dùng để thực hiện phản ứng Oxidase, đây là phản ứng rất quan trọng để phân biệt V. cholerae với các vi khuẩn đường ruột khác, V. cholerae có phản ứng oxidase (+). Cách tiến hành đơn giản khi có khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch kiềm bằng cách nhỏ một giọt dung dịch Oxidase lên mảnh giấy lọc, dùng que cấy lấy khuẩn lạc từ ống thạch nghiêng dàn đều trên giấy lọc đã thấm thuốc thử, quan sát sự đổi màu trong vài phút, có thể coi phản ứng Oxidase như chìa khóa để chẩn đoán vi khuẩn tả vì nếu âm tính thì sẽ loại tìm theo hướng khác, nếu phản ứng dương tính sẽ thực hiện các bước để chẩn đoán vi khuẩn tả. Để rút ngắn quá trình chẩn đoán chúng tôi đã thực hiện một số đặc điểm chính để phân biệt bằng thử phản ứng Oxidase bằng cách nhỏ một giọt dung dịch Oxidase lên mảnh giấy lọc, dùng que cấy lấy khuẩn lạc từ ống thạch nghiêng dàn đều trên giấy lọc đã thấm thuốc thử, quan sát sự đổi màu trong vài phút kết quả thể hiện ở ( Hình 3.10 ) Bảng 3.13. Phản ứng Oxidase Kết quả Oxidase Tỷ lệ % Dương tính 31 11,48 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Âm tính 239 88,52 Tổng cộng 270 100 V. cholerae có phản ứng Oxidase (+), không nên lấy khuẩn lạc trực tiếp từ môi trường TCBS để làm phản ứng Oxydase từ đó có thể cho kết quả không chính xác mà nên cấy chuyển khuẩn lạc nghi ngờ từ môi trường TCBS sang môi trường không chọn lọc như thạch thường hoặc thạch máu rồi từ đó tiếp tục làm phản ứng Oxidase. Kết quả nghiên cứu chúng tôi cho thấy có 31 mẫu dương tính với phản ứng Oxidase chiếm tỷ lệ 11,48 % ( Bảng 3.13), nếu so kỹ thuật soi tươi phát hiện mẫu nghi ngờ dương tính V. cholerae O1 là 28 mẫu chiếm tỷ lệ 10,37 %. Vấn đề đặt ra trong thực tế nếu các phòng thí nghiệm chưa hoàn chỉnh để thực hiện các bước nuôi cấy thì có thể áp dụng cấy bệnh phẩm từ môi trường tăng sinh vào môi trường thạch kiềm sau 6 giờ ta có thể chọn khuẩn lạc thực hiện phản ứng Oxidase. Hình 3.10. Hình ảnh phản ứng Oxidase * Nhận biết vi khuẩn mọc trên môi trƣờng pepton kiềm Môi trường pepton kiềm được dùng để vận chuyển V. cholerae trong một thời gian ngắn nếu không có môi trường Carry – Blair. Không thể dùng được lâu nếu việc vận chuyển chậm quá 6 giờ vì các vi khuẩn khác như Pseudomonas sẽ mọc lấn át V. cholerae. Pepton kiềm mặn là môi trường tăng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên sinh nên được cấy chuyển liên tiếp 3 lần, mỗi lần 3 giờ ở nhiệt độ 370C. Đây là môi trường tăng sinh tốt nhất cho sự phát triển V. cholerae, vì vi khuẩn này mọc rất nhanh trong pepton kiềm do pH của nó rất thích hợp (pH 8,4-9,2). Khi xét nghiệm mẫu thực phẩm hoặc mẫu nước tìm V. cholerae trong vụ dịch tả người ta thường dùng hai bước tăng sinh bằng pepton kiềm, bước tăng sinh thứ hai nhằm loại bớt các tạp khuẩn, hơn nữa người ta còn dùng môi trường Monsur tellurit-taurocholat để tăng sinh vì môi trường này có nhiều chất ức chế hơn. Theo dõi tính chất mọc của V. cholerae trên môi trường pepton kiềm (môi trường tăng sinh) chúng tôi có một số nhận xét về tính chất mọc váng của V. cholerae trên môi trường pepton kiềm mặn là môi trường tăng sinh có ý nghĩa quan trọng trong các bước của quá trình nuôi cấy vì nếu trong mẫu bệnh phẩm có ít vi khuẩn tả như một số mẫu thực phẩm thì việc cấy môi trường tăng sinh càng đóng vai trò quyết định nếu không sẽ không bao giờ phân lập được vi khuẩn tả trong nước, thực phẩm, là môi trường có độ kiềm cao pH = 8,5 và lượng muối mặn đến 30g trên một lít môi trường, nên khi cấy ở 2-3 giờ đầu các vi khuẩn khác bị ức chế chưa mọc được thì vi khuẩn tả mọc lấn át, do vậy nuôi cấy trên môi trường này có ý nghĩa làm tăng sinh lượng vi khuẩn lên nhiều mặt khác làm thuần khiết đồng nhất khuẩn lạc. Nếu bị nhiễm khuẩn trong quá trình lấy mẫu hoặc nuôi cấy bị nhiễm cũng như bệnh nhân đã điều trị bằng kháng sinh phải sau 3 lần cấy chuyển mỗi lần 3 giờ lúc đó mới có thể phân lập được vi khuẩn tả. Trong nhiều mẫu phân có mật độ vi khuẩn cao ( 107-108/ml phân ) việc tăng sinh là không cần thiết. Canh thang giàu dinh dưỡng thường được sử dụng để phục hồi vi khuẩn, nước pepton kiềm thường được sử dụng nhất, pH của canh thang từ 8,4 - 9,2 thuận lợi cho vi khuẩn phát triển. V. cholerae là vi khuẩn hiếu khí, nhiệt độ thích hợp là 37oC, phát triển tốt trong môi trường kiềm có độ pH 8,5 - 9,5 và nồng độ muối đến 15%. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Bảng 3.14. Đặc điểm nuôi cấy trên môi trƣờng pepton kiềm Môi trƣờng tăng sinh Môi trƣờng thạch kiềm 1 Môi trƣờng thạch kiềm 2 Môi trƣờng thạch kiềm 3 Kết luận Pepton 1 8 8 Pepton 2 0 6 6 Pepton 3 0 0 2 2 Tổng cộng 16 Kết quả nghiên cứu chúng tôi nhận thấy nếu bệnh nhân nào mới vào viện chưa điều trị kháng sinh thì việc nuôi cấy phân lập rất dễ và trả lời kết quả nhanh hơn nhiều so với các bệnh nhân đã điều trị thuốc kháng sinh. Qua theo dõi phiếu điều tra và kết quả phân lập trên môi trường pepton kiềm mặn chúng tôi có một số nhận xét ( Bảng 3.14) với 8 bệnh nhân khi vào viện được lấy bệnh phẩm ngay trước khi điều trị bằng kháng sinh thì nhận thấy trên môi trường peptone cấy lần thứ nhất xuất hiện váng nghi tả hơi xám, mỏng, lắc khó tan, sau 4 giờ xen lẫn với váng của tạp khuẩn, sau 8 giờ bằng các phương pháp khác nhau chúng tôi đã trả lời dương tính với V. cholerae. Đồng thời có 6 bệnh nhân phân lập được vi khuẩn tả phải sau 2 lần cấy tăng sinh và 2 bệnh nhân phải sau 3 lần cấy tăng sinh như vậy mới phân lập được điều đó hoàn toàn giống các nghiên cứu khác vì bệnh nhân đã điều trị bằng kháng sinh nên tỷ lệ vi khuẩn ít do vậy khó phân lập hơn. Nếu lấy bệnh phẩm sau 2 ngày sử dụng kháng sinh thì khả năng phát hiện mầm bệnh là rất khó. Một số nhận xét của Thẩm Chí Mục, Phạm Trọng Năm nhận xét về khuẩn lạc trên môi trường đặc và váng của V. cholerae mọc trên môi trường lỏng sẽ dẫn tới sự nhanh chóng chính xác trong khâu trả kết quả. Trong đó có Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên đưa ra trên những bệnh nhân có bệnh cảnh lâm sàng điển hình không phải cấy chuyển giai đoạn 2. Những bệnh nhân đã dùng kháng sinh và người lành trong ổ dịch mang vi khuẩn thì phải tăng sinh đến giai đoạn 3 hoặc 4 mới phát hiện được. Trong quá trình nuôi cấy nếu kết hợp quan sát váng của vi khuẩn và khuẩn lạc nghi ngờ trên thạch kiềm thì tỷ lệ phát hiện dương tính rất cao. Ở tuyến huyện chỉ cần môi trường pepton kiềm qua cấy truyền nhiều lần theo dõi váng của vi khuẩn tả, lấy váng nghi ngờ làm phản ứng ngưng kết sơ bộ nếu ngưng kết gửi lên tuyến trên xác định đồng thời có biện pháp chống dịch ngay [29]. * Phân biệt vi khuẩn tả với các phẩy khuẩn khác thuộc nhóm N.A.G trên 3 loại đƣờng Mannoza, Sacaroza, Arabinoza Thử nghiệm khả năng lên men đường bằng cách dùng que cấy lấy khuẩn lạc nghi ngờ V. cholerae cấy vào ống môi trường basicop, sau đó ủ nhiệt độ 37oC/ 18-24 giờ . Đối với V. cholerae thử nghiệm khả năng lên men của 3 loại đường (saccaroza 30%, mannoza 10%, arabinoza 30%), vi khuẩn lên men đường sẽ làm axít hoá môi trường và môi trường chuyển từ xanh lá cây sang vàng. Do vậy khi tiến hành đọc kết quả môi trường chuyển sang màu vàng là dương tính và giữ nguyên màu môi trường xanh lá cây là âm tính. Bảng 3.15. Phân biệt vi khuẩn tả với các phẩy khuẩn khác thuộc nhóm N.A.G trên 3 loại đƣờng Mannoza, Sacaroza, Arabinoza Nhóm Mannoza Sacaroza Arabinoza Tổng số I + + - 16 II - + - 0 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên III + + + 2 IV - + + 2 V + - - 0 VI - - - 0 Kết quả phân biệt vi khuẩn tả với các phảy khuẩn khác thuộc 6 nhóm N.A.G trên 3 loại đường với mục đích phân biệt tính chất lên men trên 3 loại đường Mannoza, Sacaroza, Arabinoza nhằm phân biệt các phẩy khuẩn thuộc nhóm N.A.G. Vi khuẩn tả thuộc nhóm I, từ nhóm II đến nhóm VI thuộc các phẩy khuẩn nhóm N.A.G. Có 16 mẫu dương tính nhóm I, trong đó 2 mẫu dương tính nhóm III và 2 mẫu dương tính nhóm IV ( Bảng 3.15). * Kết quả phản ứng kháng huyết thanh Kết quả nghi ngờ trên môi trường sinh vật hóa học và khả năng lên men 3 loại đường là 20 mẫu do vậy từ khuẩn lạc trên môi trường thạch kiềm chúng tôi thực hiện bước định danh cuối cùng và quan trọng là ngưng kết kháng huyết thanh đa giá và đơn giá như sau: Bảng 3.16. Kết quả ngƣng kết kháng huyết thanh đa giá và đơn giá Kết quả Kháng huyết thanh đa giá Kháng huyết thanh đơn giá Ogawa Inaba Âm tính 4 0 0 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Dương tính 16 16 0 Tổng 20 16 0 Phản ứng ngưng kết trên phiến kính đủ để xác định sơ bộ là V. cholerae hay không mà không phải làm thử nghiệm nào thêm. Tuy nhiên việc sàng lọc bằng thử nghiệm sinh hóa rất có lợi trước khi thử nghiệm với kháng huyết thanh. Kết quả nhận được từ 2-3 phút sau khi trộn khuẩn lạc với kháng huyết thanh đa giá nếu dương tính các hạt ngưng kết sẽ nổi lên trên nền nước trong, nếu âm tính không thấy hạt nổi và nước sẽ đục. Sau khi ngưng kết với kháng huyết thanh đa giá chúng tôi tiếp tục thực hiện với 2 loại kháng huyết thanh đơn giá là Ogawa và Inaba. Phản ứng ngưng kết kháng huyết thanh là bước định danh cuối cùng và quan trọng nhất là ngưng kết với kháng huyết thanh đặc hiệu sau khi đã sơ bộ bằng các tính chất sinh vật hóa học. ( Bảng 3.16) cho thấy 16 mẫu dương tính với kháng huyết thanh đa giá sau đó ngưng kết tiếp với kháng huyết thanh đơn giá cho kết quả 16 mẫu dương tính Ogawa. 3.2.4. Nhận biết V. cholerae O1 bằng phƣơng pháp test nhanh Chẩn đoán nhanh chính xác bệnh tả là bước rất quan trọng để bước đầu có hướng điều trị bệnh nhân nhanh chóng hiệu quả và biện pháp dịch tễ hợp lý nhằm khống chế bệnh tả. Kit Crystal VC xác định kháng nguyên lipopolysaccharid (LPS) của cả hai nhóm huyết thanh V. cholerae O1 và O139, sử dụng dễ dàng không đòi hỏi trang thiết bị phức tạp, có kết quả nhanh sau 10 phút, độ nhạy của kít theo công bố của nhà sản xuất là 94% đối với khả năng phát hiện ra V. cholerae O1 và 99% đối với khả năng phát hiện ra V. cholerae O139. Độ đặc hiệu 84% với V. cholerae O1 và 96 % với O139 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên [23], rất có ý nghĩa cho những phòng xét nghiệm tuyến huyện, đặc biệt trong thời gian đầu của vụ dịch. Với nguyên lý Kit Crystal VC là thử nghiệm định tính, dựa trên nguyên tắc miễn dịch sắc ký kỹ thuật rất đơn giản, cho kết quả nhanh, dễ đọc kết quả bằng mắt thường, thời gian 15-20 phút quan sát vạch chứng dương xuất hiện màu đỏ, nếu dương tính ở mẫu thử xuất hiện thêm vạch đỏ thứ hai ( Hình 3.11). Hình 3.11. Hình ảnh test nhanh Crystal VC Bảng 3.17. Phát hiện V. cholerae bằng kỹ thuật test nhanh Kết quả Test nhanh Tỷ lệ % Dƣơng tính 17 6,29 Âm tính 253 93,71 * Phản ứng dương tính(+): Xuất hiện 2 vạch màu đỏ * Phản ứng âm tính(-): Xuất hiện một vạch kiểm chứng màu đỏ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Tổng 270 100 Nghiên cứu của chúng tôi ( Bảng 3.17 ) nhận thấy trong 270 mẫu thu thập có 17 mẫu dương tính bằng test nhanh chiếm tỷ lệ 6,29%, kết quả này phù hợp với các nghiên cứu khác và cũng phù hợp với độ nhạy của kít như đã công bố. Nguyễn Bình Minh và cộng sự đánh giá kít chẩn đoán nhanh V. cholerae cho thấy tổng số 65 mẫu thu thập từ bệnh nhân tiêu chảy của Viện Y học lâm sàng các bệnh nhiệt đới Quốc gia và Bệnh viện Bạch Mai Hà Nội so sánh giữa 2 phương pháp test nhanh và nuôi cấy cho thấy 15 mẫu dương tính cả hai phương pháp, 43 mẫu âm tính, có 6 mẫu kết quả dương tính bằng phương pháp nuôi cấy nhưng lại âm tính với test nhanh. Do vậy test nhanh tuy phát hiện nhanh nhưng vẫn còn tỷ lệ nhỏ âm tính giả nên không thể thay thế phương pháp nuôi cấy để xác định týp huyết thanh [23]. Việc áp dụng test nhanh có ý nghĩa quan trọng trong việc chẩn đoán nhanh V. cholerae sử dụng tương đối đơn giản, không đòi hỏi trang thiết bị phức tạp, có kết quả nhanh sau 10 phút, kít bảo quản dễ dàng ở nhiệt độ phòng thí nghiệm, dễ vận chuyển, tuy nhiên trên thị trường chưa phổ biến rộng rãi do vậy trong nghiên cứu này chúng tôi vẫn phải đề cập áp dụng các phương pháp khác tùy điều kiện cụ thể của từng phòng xét nghiệm. 3.2.5. Chẩn đoán V. cholerae bằng kỹ thuật PCR Kỹ thuật PCR dùng để phát hiện gen ctx, kỹ thuật này có độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn nhiều kỹ thuật khác. Kỹ thuật PCR là phương pháp hiện đại, nhanh sau 4-5 giờ, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao nhưng đòi hỏi trang thiết bị hiện đại sinh phẩm đắt tiền, kỹ thuật PCR ưu việt hơn các kỹ thuật khác có Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên thể phát hiện bệnh nhân dương tính với V. cholerae ngay khi đã dùng thuốc kháng sinh . * Tỷ lệ V. cholerae O1 dƣơng tính bằng kỹ thuật PCR Việc áp dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán bệnh tả đã cung cấp một công cụ nhiều triển vọng đáp ứng nhu cầu cấp thiết phương pháp chẩn đoán nhanh có hiệu quả, khắc phục những nhược điểm của phương pháp nuôi cấy. Kỹ thuật PCR xác định vi khuẩn tả trực tiếp trong mẫu phân nhờ khả năng sao chép khuếch đại số lượng đoạn trình tự đặc hiệu trên genome của vi khuẩn, kết quả cuối cùng của phản ứng PCR là sau n chu kỳ, tính theo lý thuyết từ một đoạn khuôn mẫu sẽ có 2n bản sao, từ một đoạn có thể lên tới hàng tỷ sau 30 đến 40 chu kỳ, các bản sao này do có cùng kích thước phân tử và đủ lớn về mặt số lượng nên có thể phát hiện dễ dàng nhờ điện di trên gel agarose. Bảng 3.18. Tỷ lệ V. cholerae O1 dƣơng tính bằng kỹ thuật PCR Kết quả PCR Tỷ lệ % Âm tính 254 94,07 Dương tính 16 5,93 Tổng 270 100 Kết quả nghiên cứu của chúng tôi ( Bảng 3.18) trên 20 mẫu nghi ngờ dương tính, bằng phương pháp nuôi cấy và kỹ thuật PCR cho kết quả 16 mẫu dương tính với V. cholerae O1, còn lại 4 mẫu không phải là V. cholerae O1. Tỷ lệ V.cholerae O1 dương tính bằng kỹ thuật PCR, cho kết quả chính xác, kết quả mẫu dương tính V. cholerae O1 của kỹ thuật PCR giống như kết quả của kỹ thuật nuôi cấy đều là 16 trường hợp và tỷ lệ dương tính V. cholerae O1 bằng kỹ thuật PCR chiếm tỷ lệ 5,93 % ( Hình 3.12 ) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Hình 3.12. Band 2 đến 12 là V. cholerae , band 13 đến 16 là âm tính 3.3. Đánh giá các kỹ thuật chẩn đoán V. cholerae 3.3.1. Kỹ thuật soi tƣơi với kháng huyết thanh đặc hiệu So sánh kỹ thuật soi tươi kết hợp kháng huyết thanh đặc hiệu cho thấy vi khuẩn di động trên vi trường khi soi tươi bằng kính hiển vi, nếu kết hợp nhỏ kháng huyết thanh đặc hiệu vi khuẩn tả đa giá hoặc đơn giá thì khả năng sàng lọc nhanh V. cholerae hiệu quả hơn, sau khi tiến hành nhỏ vài giọt kháng huyết thanh lên lam kính vi khuẩn đang di động, sau đó quan sát vài phút, nếu là vi khuẩn tả sẽ không thấy di động nữa tức vi khuẩn bị bất hoạt bởi kháng huyết thanh tả đặc hiệu. Bảng 3.19. Đánh giá kỹ thuật soi tƣơi với kháng huyết thanh đặc hiệu 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Kết quả Phƣơng pháp Âm tính Dƣơng tính Tỷ lệ dƣơng tính (%) Soi tươi di động 242 28 10,37 P > 0,05 Bất hoạt di động với kháng huyết thanh đặc hiệu 252 18 6,66 Sử dụng kháng huyết thanh đặc hiệu bất động vi khuẩn tả, kết quả soi trên kính hiển vi thường cũng cho kết quả tốt phù hợp với nền kinh tế tại các cơ sở. Nghiên cứu của chúng tôi phát hiện 28 mẫu di động khi soi tươi, nhưng sau khi nhỏ kháng huyết thanh đặc hiệu cho kết quả 18 mẫu dương tính ( Bảng 3.19). , không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê trong việc chẩn đoán vi khuẩn V. cholera giữa phương pháp soi tươi di động kết hợp với bất hoạt của kháng huyết thanh đặc hiệu ( P > 0,05 ) Tuy nhiên không phải cơ sở nào cũng có kháng huyết thanh chẩn đoán vi khuẩn tả vì hạn sử dụng ngắn và phải bảo quản 4-8oC điều quan trọng là gần 10 năm nay không có dịch tả nên việc duy trì luôn có kháng huyết thanh sẽ gặp nhiều khó khăn. 3.3.2. Kỹ thuật soi tƣơi và kỹ thuật nhuộm Gram Bảng 3.20. So sánh kỹ thuật soi tƣơi và kỹ thuật nhuộm Gram Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Phƣơng pháp Dƣơng tính Âm tính Tổng Soi tươi 28 242 270 P < 0,05 Nhuộm Gram 45 225 270 So sánh kỹ thuật soi tươi và kỹ thuật nhuộm Gram cho thấy phương pháp nhuộm Gram phát hiện 45 mẫu nghi ngờ dương tính, phương pháp soi tươi phát hiện 28 mẫu nghi ngờ dương tính ( Bảng 3.20). Phương pháp soi tươi kết hợp với bất hoạt kháng huyết thanh tả tỷ lệ sàng lọc phát hiện là 6,66% nếu kết hợp với phương pháp nhuộm Gram chúng tôi nghĩ rằng sự bổ trợ các phương pháp với nhau sẽ làm tăng thêm ý nghĩa khoa học cho việc sàng lọc mẫu bệnh phẩm, có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê trong chẩn đoán V. cholerae ( P < 0,05 ). 3.3.3. Kỹ thuật soi tƣơi với kỹ thuật nuôi cấy Nếu có điều kiện kết hợp 2 phương pháp soi tươi với kỹ thuật nuôi cấy này thì hướng chẩn đoán sẽ được áp dụng đúng theo sơ đồ phân lập. Nghiên cứu chúng tôi ( Bảng 3.20) cho kết quả 16 mẫu dương tính bằng phương pháp nuôi cấy, trong khi đó phương pháp soi tươi phát hiện 28 mẫu nghi ngờ dương tính, có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê trong việc chẩn đoán V. cholerae giữa phương pháp soi tươi và nuôi cấy ( P < 0,05 ). Bảng 3.21. Bảng so sánh kỹ thuật soi tƣơi với kỹ thuật nuôi cấy Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Phƣơng pháp Dƣơng tính Âm tính Tổng Soi tươi 28 242 270 P<0,05 Nuôi cấy 16 254 270 3.3.4. Kỹ thuật nhuộm Gram với kỹ thuật nuôi cấy So sánh kỹ thuật nhuộm Gram với kỹ thuật nuôi cấy ( Bảng 3.22 ) cho thấy kỹ thuật nhuộm Gram phát hiện 45 mẫu nghi ngờ dương tính trong khi đó phương pháp nuôi cấy cho kết quả khảng định dương tính 16 mẫu, có sự khác biệt ý nghĩa thống kê trong việc chẩn đoán vi khuẩn tả giữa phương pháp nhuộm Gram và phương pháp nuôi cấy ( P < 0,05 ). Bảng 3.22. Bảng so sánh kỹ thuật nhuộm Gram với kỹ thuật nuôi cấy Phƣơng pháp Dƣơng tính Âm tính Tổng Nhuộm Gram 45 225 270 P < 0,05 Nuôi cấy 16 254 270 3.3.5.Phƣơng pháp test nhanh với kỹ thuật nuôi cấy Bảng 3.23. Bảng so sánh phƣơng pháp test nhanh với nuôi cấy Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Phƣơng pháp Dƣơng tính Âm tính Tổng Test nhanh 17 253 270 P > 0,05 Nuôi cấy 16 254 270 So sánh kỹ thuật nuôi cấy với kỹ thuật test nhanh ( Bảng 3.23 ) cho thấy sự khác biệt giữa 2 kỹ thuật không đáng kể, kỹ thuật nuôi cấy khảng định 16 mẫu dương tính, kỹ thuật test nhanh phát hiện 17 mẫu nghi ngờ dương tính, không có sự khác biệt về ý nghĩa thống kê trong việc chẩn đoán V. cholera O1 giữa phương pháp test nhanh và phương pháp nuôi cấy ( P > 0,05 ). Vấn đề đặt ra nếu tại các phòng xét nghiệm tuyến huyện chưa thực hiện phương pháp nuôi cấy thì nên dùng phương pháp test nhanh cho kết quả sàng lọc nhanh, độ chính xác cũng tương đối chính xác. Chúng tôi không so sánh kỹ thuật soi tươi với thử nghiệm oxidase nhưng trong quá trình nghiên cứu chúng tôi đã ghi lại số liệu mang tính chất tham khảo cho thấy không có sự khác biệt về ý nghĩa thống kê trong việc chẩn đoán V. cholerae giữa thử nghiệm oxidase và phương pháp soi tươi ( P > 0,05 ) tuy nhiên nếu soi tươi thấy vi khuẩn di động và kỹ thuật nuôi cấy chỉ dừng lại ở mức độ quan sát khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch kiềm thì kết quả oxydase dương tính kết hợp với soi tươi cũng có ý nghĩa trong việc phát hiện V. cholerae. Kỹ thuật nuôi cấy khâu đầu tiên là cấy trên môi trường tăng sinh và khâu cuối cùng là khảng định bằng kháng huyết thanh đặc hiệu, oxidase là phản ứng đặc trưng ở giữa giai đoạn nuôi cấy mà oxidaza dương tính có thể đưa ra chỉ điểm trong chẩn đoán nhanh V. cholerae có nếu chưa đủ điều kiện thực hiện toàn bộ phương pháp nuôi cấy. Bảng 3.24. Đánh giá kết quả của phƣơng pháp thử Oxidase với kỹ thuật soi tƣơi Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Phƣơng pháp Dƣơng tính Âm tính Oxidase 31 239 P > 0,05 Soi tƣơi 28 242 3.3.6. Kỹ thuật nuôi cấy với phƣơng pháp PCR So sánh phương pháp nuôi cấy và phương pháp PCR( Bảng 3.25 ) cho 2 kết quả giống nhau, tuy nhiên mỗi kỹ thuật lại có mặt mạnh và yếu khác nhau, kỹ thuật PCR cho kết quả nhanh trong 4 giờ đã phát hiện mầm bệnh nhưng không phù hợp với tuyến cơ sở vì giá thành cao, trang thiết bị phức tạp, kỹ thuật cũng như trình độ của cán bộ chưa đáp ứng được. Kỹ thuật nuôi cấy cho kết quả khảng định từ 24 – 48 giờ mới trả lời kết quả và cần một số môi trường nuôi cấy cũng như trang thiết bị phòng vô khuẩn nhưng giá thành phù hợp chỉ cần cán bộ xét nghiệm có kinh nghiệm và có khả năng phân tích kết quả, kết quả nuôi cấy với kỹ thuật PCR cho kết quả dương tính như nhau là 16 mẫu. Bảng 3.25. Bảng so sánh phƣơng pháp nuôi cấy và PCR Phƣơng pháp PCR Nu«i cÊy D•¬ng tÝnh 16 16 ¢m tÝnh 254 254 Tổng 270 270 3.4. Tổng hợp kết quả các phƣơng pháp và thời gian đƣợc áp dụng các kỹ thuật xét nghiệm trong chẩn đoán V. cholerae Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Kêt quả phân tích, so sánh đánh giá các phương pháp và thời gian áp dụng các kỹ thuật chẩn đoán V. cholerae chúng tôi tổng hợp ( Bảng 3.26) Bảng 3.26. Tổng hợp kết quả các phƣơng pháp và thời gian thực hiện Phƣơng pháp XN Đánh giá Dƣơng tính Tỷ lệ % Thời gian thực hiện 1 Soi tươi Di động nhanh 28 10,37 20 phút Bất động kháng huyết thanh 18 6,66 15 phút 2 Nhuộm Gram Gram âm, hình cong 45 16,66 20 phút 3 Test nhanh Dương tính 17 6,29 15 phút 4 Nuôi cấy Ngưng kết KHT 16 5,93 24 – 48 giờ 5 PCR Dương tính 16 5,93 4 giờ Tổng hợp kết quả giữa các phương pháp và thời gian áp dụng các kỹ thuật xét nghiệm trong chẩn đoán V. Cholera ( Bảng 3.26; biểu đồ 3.13 ) có ý nghĩa quan trọng trong việc lựa chọn các kỹ thuật phù hợp theo điều kiện của từng phòng xét nghiệm. Với bảng tổng hợp này chúng tôi đã đưa ra chỉ tiêu đánh giá, tỷ lệ dương tính, thời gian thực hiện, với mục đích làm cơ sở để cán bộ xét nghiệm nghiên cứu áp dụng sàng lọc nhanh nhất các mẫu nghi ngờ dương tính. Nếu mẫu âm tính sẽ có ngay phác đồ điều trị theo hướng chẩn đoán khác, nếu nghi ngờ sẽ có phác đồ điều trị ngay đồng thời phải tìm hiểu ngay yếu tố dịch tễ nguồn lây bệnh. Kỹ thuật nuôi cấy và kỹ thuật PCR có tỷ lệ phát hiện dương tính là 5,93% sau đến kỹ thuật test nhanh tỷ lệ phát hiện dương tính là 6,29%. Bảng 3.27. Một số phƣơng pháp có thể áp dụng để chẩn đoán nhanh V. cholerae O1 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Phƣơng pháp XN Đánh giá Tỷ lệ Thời gian thực hiện Soi tươi Di động nhanh 10,37 20 phút Bất động KHT Không di động 6,66 15 phút Nhuộm Gram Gram âm, hình cong 16,66 20 phút Test nhanh Dương tính 6,29 15 phút Tổng thời gian thực hiện:  75 phút Bảng các kỹ thuật ( Bảng 3.27 ) đưa ra để các cán bộ xét nghiệm nghiên cứu có thể áp dụng, các kỹ thuật đơn giản, thời gian thực hiện nhanh, giá thành phù hợp, nếu áp dụng các phương pháp nêu trong bảng thời gian 1giờ cho phép đưa ra kết quả có ý nghĩa sàng lọc mẫu nghi ngờ rất tốt. Phương pháp soi tươi đánh giá dương tính bằng quan sát tính di động cho thấy tỷ lệ dương tính là 10,37% thời gian thực hiện 20 phút đây là kỹ thuật đơn giản dễ thực hiện, dụng cụ là lam kính, kính hiển vi là đã thực hiện được. Phương pháp nhuộm Gram đánh giá dương tính bằng quan sát hình thể cong và bắt màu Gram âm, thời gian thực hiện 20 phút, tỷ lệ phát hiện dương tính 16,66% là kỹ thuật dễ thực hiện có ý nghĩa trong việc sàng lọc mẫu tại cơ sở. Phương pháp test nhanh có độ nhạy và độ đặc hiệu tương đối cao dùng để áp dụng sàng lọc mẫu rất tốt, trong nghiên cứu tỷ lệ phát hiện nghi ngờ dương tính là 6,29% cho kết quả nhanh sau 15 phút. Tổng thời gian thực hiện của 4 phương pháp xét nghiệm trên là 75 phút với tỷ lệ phát hiện cao nhất là 6,29 %. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 16 16 17 18 28 45 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Nuôi cấy PCR Test nhanh Soi tươi + Kháng huyết thanh Soi tươi Nhuộm Gram Biểu đồ 3.13. Biểu đồ tổng hợp các phƣơng pháp chẩn đoán V. cholerae Bảng 3.28. Bảng so sánh kỹ thuật nuôi cấy với bảng lựa chọn ƣu tiên chẩn đoán nhanh V. cholerae O1 Phƣơng pháp XN n Dƣơng tính Âm tính 1 Kỹ thuật nuôi cấy ( Tiêu chuẩn vàng ) 270 16 254 P > 0,05 2 Bảng áp dụng chẩn đoán nhanh (bảng 3.27) 270 17 253 So sánh phương pháp nuôi cấy với bảng ngắn gọn của 4 phương pháp ( Bảng 3.27 ) với P > 0,05 không có sự khác biệt ý nghĩa thống kê trong việc chẩn đoán V. cholera giữa 2 bảng. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Qua nghiên cứu cho thấy mỗi phương pháp đều có mặt mạnh nhưng vẫn có mặt hạn chế, vì vậy cần phối hợp đồng thời các phương pháp chẩn đoán trong phòng thí nghiệm như vậy sẽ tăng thêm hiệu quả tỷ lệ phát hiện dương tính. Trong 10 năm gần đây dịch tả hầu như không xuất hiện, đôi khi có một vài bệnh nhân dương tính nhưng mang tính rải rác không thành dịch, nên tài liệu tham khảo gần như không có tài liệu mới. Các tài liệu phần lớn đánh giá về đặc điểm dịch tễ của các vụ dịch, về nghiên cứu ứng dụng các phương pháp chẩn đoán nhanh V. cholerae áp dụng thực tế tại các phòng xét nghiệm tuyến huyện thì chưa có đề tài nào đánh giá đầy đủ, nếu có thì cũng chỉ đưa ra số liệu đánh giá một phương pháp nhưng chỉ phù hợp với phòng thí nghiệm tuyến Trung ương hoặc tuyến tỉnh. Với kết quả nghiên cứu của chúng tôi thực hiện trên địa bàn của phòng thí nghiệm tuyến tỉnh, việc đánh giá so sánh hiệu quả các phương pháp có ý nghĩa rất quan trọng từ đó sẽ lựa chọn được phương pháp phù hợp nhất nhằm sàng lọc mẫu ngay tại cơ sở. Chúng tôi hy vọng trong thời gian tới sẽ ứng dụng triển khai được những phương pháp đã nghiên cứu để giúp các phòng xét nghiệm tuyến huyện làm được một số kỹ thuật, từ đó sẽ có số liệu đánh giá rộng hơn, đáp ứng thực tiễn, tiết kiệm chi phí ít nhất cho đơn vị, giúp cho thầy thuốc có hướng điều trị bệnh kịp thời, đặc biệt giúp các nhà dịch tễ có hướng xử lý nhanh và khoanh vùng ổ dịch giảm lây lan trong cộng đồng. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên KẾT LUẬN Nghiên cứu, đánh giá các phương pháp phát hiện Vibrio cholerae O1 trên 270 mẫu phân của bệnh nhân mắc bệnh tiêu chảy cấp có triệu chứng lâm sàng nghi mắc bệnh tả thời gian từ tháng 3 đến tháng 7 năm 2008, chúng tôi có một số kết luận sau: 1. Tỷ lệ bệnh nhân dương tính Vibrio cholerae O1 được chẩn đoán xác định là 5,93 %. 2. Đánh giá các kỹ thuật phát hiện V. cholerae O1 cho thấy: 2.1. Kỹ thu