Khóa luận Nghiên cứu phương pháp chiết xuất dịch từ sinh khối vi khuẩn lam spirulina platensis bổ sung vào nước giải khát

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU PHƢƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT DỊCH TỪ SINH KHỐI VI KHUẨN LAM Spirulina platensis BỔ SUNG VÀO NƢỚC GIẢI KHÁT Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: THANH GIA NGỌC HÂN Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************************* NGHIÊN CỨU PHƢƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT DỊCH TỪ SINH KHỐI VI KHUẨN LAM Spirulina platensis BỔ SUNG VÀO NƢỚC GIẢI KHÁT Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: Th.S. Nguyễn Tiến Dũng Thanh Gia Ngọc Hân K.S. Lƣơng Đình Quát Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 i LỜI CẢM ƠN Hoàn thành khóa luận tốt nghiệp niên khóa 2003-2007, em chân thành gởi lời cảm ơn sâu sắc: Ban Giám Hiệu Trƣờng Đại học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh. Ban chủ nhiệm Bộ môn Công Nghệ Sinh Học. Thầy Nguyễn Tiến Dũng. Anh Lƣơng Đình Quát – Chi cục Đo lƣờng Tiêu chuẩn Chất lƣợng tỉnh Bình Thuận. Anh Nguyễn Văn Tân – Chi cục Đo lƣờng Tiêu chuẩn Chất lƣợng tỉnh Bình Thuận. Chị Nguyễn Thị Thu Hƣơng – Chi cục Đo lƣờng Tiêu chuẩn Chất lƣợng tỉnh Bình Thuận. Đã tận tâm dạy dỗ, truyền đạt những tri thức khoa học, hƣớng dẫn và giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập, rèn luyện tại trƣờng và thực tập tốt nghiệp. Đặc biệt xin gởi lời cảm ơn gia đình, những ngƣời thân và những bạn bè thân yêu của lớp Công nghệ sinh học 29 đã quan tâm, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi để em hoàn thành khóa luận này. Tp. Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2007 Sinh viên Thanh Gia Ngọc Hân ii TÓM TẮT THANH GIA NGỌC HÂN, Đại học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh. Đề tài “NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG SINH KHỐI VI KHUẨN LAM Spirulina platensis BỔ SUNG VÀO NƢỚC GIẢI KHÁT” đƣợc tiến hành tại Chi cục Đo lƣờng Tiêu chuẩn Chất lƣợng tỉnh Bình Thuận, thời gian thực hiện từ tháng 4 đến tháng 8 năm 2007. GVHD: Th.S. Nguyễn Tiến Dũng. Ngày nay thực phẩm không chỉ đáp ứng cho việc ăn và uống mà còn đƣợc dùng để chữa bệnh. Vì vậy con ngƣời đã không ngừng nghiên cứu để tìm ra các loại thực phẩm có đủ các yêu cầu trên. Một trong những đối tƣợng đang đƣợc chú ý hiện nay là loài vi khuẩn lam Spirulina, với đặc điểm ƣu việt là chứa nguồn protein dồi dào, hấp thu dễ, có 18/22 loại axit amin không thay thế và các chất dinh dƣỡng có giá trị khác. Trên cơ sở đó, những đề tài tốt nghiệp này nhằm mục đích bƣớc đầu nghiên cứu bổ sung vi khuẩn lam Spirulina platensis vào một số thực phẩm nhƣ: nƣớc khoáng, nƣớc tinh khiết và rƣợu trái cây. Kết quả khảo sát ban đầu cho thấy thành phần dinh dƣỡng trong các mẫu tảo là: hàm lƣợng protein khoảng 60 %, hàm lƣợng tro khoảng 10 - 12 %. Trong các mẫu tảo thí nghiệm không phát hiện có vi sinh vật có hại. Cùng với việc khảo sát thành phần dinh dƣỡng của tảo, chúng tôi tiến hành nghiên cứu các phƣơng pháp phá vỡ tế bào để thu đƣợc lƣợng protein hoà tan lớn nhất. Khảo sát đƣợc thực hiện với hai phƣơng pháp: phƣơng pháp khuếch tán (PPKT) và phuơng pháp vật lý (PPVL). Kết quả khảo sát cho thấy PPKT có hiệu suất cao hơn so với PPVL, trong đó hiệu suất phá vỡ cao nhất là ở nồng độ đƣờng 0,4 %. Đề tài cũng đã tiến hành thử nghiệm các tỉ lệ bổ sung dịch tảo vào một số loại nƣớc uống. Kết quả khảo sát cho thấy tỉ lệ bổ sung thích hợp là 1:17. Do thời gian có hạn, nên nghiên cứu vẫn chƣa đi đến kết quả cuối cùng. Tuy vậy kết quả bƣớc đầu này cũng tạo đƣợc cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo. iii SUMMARY Full name: THANH GIA NGOC HAN, Nong Lam University Ho Chi Minh City. Thesis “STUDYING FOR USING EXTRACTION OF Spirulina platensis TO COMPLETE IN DRINKING WATER”. This subject was conducted at Standard and Quality measurement Department of Binh Thuan province from April to August, 2007. Supervisor: Nguyen Tien Dung, M.D. Today, food not only uses to eat or drink but also use such as drug. Therefore, scientist is continuous research to find out object which have all above attribute. Spirilina have caught food researcher’s attention, because this alga contains more than 70% easily absorption protein, and 18/22 human essential amino acid and other nutrients. The goal of this thesis is initially studying for using extraction of Spirulina platensis to complete into some kind of drinking water such as fresh water, mineral water or wine. First result showed that protein content in Vinh Hảo’s Spirulina is 60% and ash content is about 10-12%. There is no harmful bacteria were detected in the algae samples. For algae extraction, we studied two methods: by endosmosis and physical. The result showed that the endosmosis method with 0,4% sucrose gave the highest protein content in extraction. We also research to find out the algae extraction rate to complete into any drinking water. The result showed that the rate 1:17 is the best. Because of the short time to research, the results are not going to the end, but these are base to later experiment. iv MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang tựa Lời cảm ơn ................................................................................................... iii Tóm tắt ..........................................................................................................iv Summary ........................................................................................................ v Mục lục ..........................................................................................................vi Danh sách các chữ viết tắt .............................................................................. x Danh sách các hình ........................................................................................xi Danh mục các bảng ..................................................................................... xii Chƣơng 1. MỞ ĐẦU ...................................................................................... 1 Chƣơng 2.TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................. 3 2.1. Lịch sử phát hiện và sử dụng Spirulina platensis .............................. 3 2.1.1. Lịch sử phát hiện .......................................................................... 3 2.1.2. Tình hình nghiên cứu Spirulina platensis trong – ngoài nƣớc .... 4 2.1.2.1. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam ....................................... 4 2.1.2.2. Tình hình nghiên cứu trên Thế Giới ..................................... 5 2.2. Spirulina và những vấn đề liên quan ................................................. 7 2.2.1. Giới thiệu về Spirulina................................................................. 7 2.2.2. Đặc điểm sinh lí của Spirulina platensis .................................... 8 2.2.2..1 Phân loại ................................................................................. 8 2.2.2.2. Đặc điểm sinh lý .................................................................... 9 2.3. Kỹ thuật sản xuất Spirulina platensis .............................................. 11 2.3.1. Sơ đồ qui trình sản xuất Spirulina platensis .............................. 11 2.3.2. Các yếu tố ảnh hƣởng đến Spirulina.......................................... 11 2.4. Thành phần dinh dƣỡng và công dụng của Spirulina platensis ...... 17 2.4.1. Thành phần dinh dƣỡng ............................................................. 17 v 2.4.2. Công dụng của vi khuẩn lam Spirulina platensis ...................... 18 2.5. Ứng dụng Spirulina platensis trong thực phẩm, xử lý môi trƣờng y học và mỹ phẩm .................................................................................. 20 2.5.1. Ứng dụng trong thực phẩm ........................................................ 20 2.5.2. Ứng dụng trong xử lí môi trƣờng .............................................. 21 2.5.3. Ứng dụng trong y học ................................................................ 23 2.5.4. Ứng dụng trong mỹ phẩm .......................................................... 24 2.6. Kỹ thuật sản xuất nƣớc giải khát .................................................... 24 2.6.1 Khái niệm về nƣớc giải khát ....................................................... 24 2.6.2 Quy trình sản xuất nƣớc giải khát ............................................. 25 2.6.2.1 Nguyên liệu ........................................................................... 25 2.6.2.2 Diễn giải quy trình công nghệ ............................................... 26 2.6.3. Kỹ thuật sản xuất nƣớc khoáng Vĩnh Hảo ................................. 27 2.6.4. Kỹ thuật sản xuất nƣớc tinh khiết .............................................. 27 2.6.5. Kỹ thuật sản xuất rƣợu trái cây .................................................. 27 Chƣơng 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ............................................. 28 3.1. Thời gian và địa điểm tiến hành đề tài ............................................ 28 3.1.1. Thời gian .................................................................................... 28 3.1.2. Địa điểm ..................................................................................... 28 3.2. Nguồn cung cấp nguyên liệu ........................................................... 28 3.3. Đối tƣợng nghiên cứu ...................................................................... 28 3.4. Vật liệu ............................................................................................ 28 3.4.1. Thiết bị ....................................................................................... 28 3.4.2. Hoá chất ..................................................................................... 29 3.5. Các phƣơng pháp phân tích ............................................................. 29 3.5.1. Phƣơng pháp xác định nitơ tổng số bằng phƣơng pháp Kjeldahl 3.5.1.1. Nguyên tắc ........................................................................... 29 3.5.1.2. Quá trình thực hiện .............................................................. 30 3.5.2. Phƣơng pháp xác định protein bằng phƣơng pháp Lowry ........ 33 vi 3.5.2.1. Nguyên tắc ........................................................................... 33 3.5.2.2. Thực hành............................................................................. 34 3.5.3. Phƣơng pháp xác định tro tổng số ............................................. 35 3.5.3.1. Nguyên tắc ........................................................................... 35 3.5.3.2. Thực hành............................................................................. 35 3.5.4. Phƣơng pháp phân tích vi sinh................................................... 36 3.5.4.1. TPC ...................................................................................... 36 3.5.4.2. Coliforms .............................................................................. 37 3.5.4.3. E.coli .................................................................................... 37 3.5.4.4. Staphylococcus aureus ......................................................... 37 3.5.4.5. Salmonella ............................................................................ 37 3.6. Phƣơng pháp phá vỡ tế bào ............................................................. 38 3.6.1. Phƣơng pháp vật lí ..................................................................... 38 3.6.2. Phƣơng pháp khuếch tán ............................................................ 38 3.7. Phƣơng pháp bổ sung ...................................................................... 39 3.8. Phƣơng pháp cảm quan ................................................................... 39 3.9. Bố trí thí nghiệm .............................................................................. 39 3.10. Phƣơng pháp xử lý số liệu ............................................................. 39 Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 40 4.1. Thành phần dinh dƣỡng vi khuẩn lam Spirulina platensis ............. 40 4.1.1. Xác định hàm lƣợng protein theo phƣơng pháp Kjeldahl ........ 40 4.1.1.1. Xác định hàm lƣợng protein trong bột tảo khô .................... 40 4.1.1.2. Xác định hàm lƣợng protein trong bã tảo ............................ 41 4.1.2. Xác định hàm lƣợng protein theo phƣơng pháp Lowry ........... 41 4.1.2.1. Protein Chuẩn ....................................................................... 41 4.1.2.2. Hàm lƣợng protein trong dịch tảo ........................................ 43 4.1.3. Xác định hàm lƣợng tro tổng số trong bột tảo khô .................... 44 4.2. Nghiên cứu các phƣơng pháp phá vỡ tế bào ................................... 45 vii 4.2.1. Đánh giá hiệu quả phá vỡ tế bảo bằng cách xác định hàm lƣợng protein theo phƣơng pháp Kieldahl .......................................... 45 4.2.1.1. Phá vỡ tế bào theo phƣơng pháp khuếch tán (PPKT) .......... 45 4.2.1.2. Theo phƣơng pháp vật lý (PPVL) ........................................ 45 4.2.2. Đánh giá hiệu quả phá vỡ tế bào bằng cách xác định hàm lƣợng protein theo kết quả thu nhận protein theo phƣơng pháp Lowry .............................................................................................................. 46 4.2.2.1. Phá vỡ tế bào theo phƣơng pháp khuếch tán ....................... 46 4.2.2.2. Phá vỡ tế bào theo phƣơng pháp vật lý ............................... 48 4.3. So Sánh Kết Quả Protein ................................................................. 51 4.3.1. Phá vỡ và không phá vỡ tế bào .................................................. 51 4.3.2. Phá vỡ theo nồng độ đƣờng và thời gian .................................. 53 4.3.3. Phá vỡ theo nồng độ đƣờng (phƣơng pháp khuếch tán) ............ 54 4.3.4. Phá vỡ theo thời gian (phƣơng pháp vật lí) ............................... 55 4.4. Kết quả phân tích vi sinh ................................................................. 55 4.5. Hiệu suất phá vỡ tế bào tảo Spirulina platensis .............................. 56 4.6. Nghiên cứu chọn tỉ lệ bổ sung vi khuẩn lam Spirulina platensis .... 58 4.7. Đánh giá chất lƣợng sản phẩm ........................................................ 59 Chƣơng 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................ 60 Chƣơng 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................... 61 Phụ Lục ........................................................................................................ 64 viii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT BGBL Brilliant Green Bile Lactose BPA Baird Parker Agar CTV Cộng tác viên Ecoli Escherichia coli EMB Eosin Methylene Blue lactose F.A.O Food Agriculture Organization NU Nƣớc uống PCA Plate Count Agar PPKT Phƣơng pháp khuếch tán PPVL Phƣơng pháp vật lí PV Phá vỡ RV Rappaport – Vassiliadis soya pepton S. aureus Staphylococcus aureus SPW Saline Pepton Water TPC Tổng vi sinh vật hiếu khí VRB Violet Red Bile agar WTO World Trade Organization ix DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1. Hình dạng của vi khuẩn lam Spirulina platensis .......................... 7 Hình 2.2. Hình dạng của vi khuẩn lam Spirulina platensis đƣợc nhìn dƣới kính hiển vi ........................................................................... 9 Hình 2.3. Hình dạng của vi khuẩn lam Spirulina platensis dƣới kính hiển vi ..................................................................................................... 9 Hình 2.4. Các mô hình nuôi tảo Spirulina công nghiệp ............................. 14 Hình 2.5. Nuôi Spirulina trong phòng thí nghiệm ....................................... 14 Hình 2.6. Các sản phẩm có bổ sung tảo trong thực phẩm ........................... 20 Hình 2.7. Các sản phẩm từ tảo trong y học ................................................. 23 Hình 2.8. Các sản phẩm từ tảo trong mỹ phẩm ........................................... 24 Hình 3.9. Máy cất đạm ................................................................................ 30 Biểu đồ 4.1. Đƣờng chuẩn protein trong dịch tảo ....................................... 42 Biểu Đồ 4.2. Nồng độ protein ứng với chỉ số OD xác định của tảo ............ 43 Biểu Đồ 4.3. Nồng độ protein thu đƣợc tƣơng ứng với hàm lƣợng đƣờng sử dụng trong thí nghiệm ............................................................................ 47 Biểu Đồ 4.4. Nồng độ protein ứng với OD xác định của tảo ở các thời gian khác nhau ............................................................................................. 49 Biểu đồ 4.5. Hàm lƣợng protein trong mẫu tảo trƣớc và sau khi phá vỡ .... 52 Biểu đồ 4.6. Hiệu suất phá vỡ tế bào giữa PPKT và PPVL ........................ 57 x DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1. Chuẩn bị dung dịch protein chuẩn .............................................. 34 Bảng 4.2. Hàm lƣợng protein trong tảo ....................................................... 40 Bảng 4.3. Kết quả chỉ số OD tƣơng ứng với nồng độ protein chuẩn .......... 42 Bảng 4.4. Giá trị OD – protein trong 0,2g bột tảo ....................................... 43 Bảng 4.5. Hàm lƣợng tro theo phần trăm có trong tảo ................................ 44 Bảng 4.6. Lƣợng protein trong bã tảo sau khi phá vỡ theo PPKT ............. 45 Bảng 4.7. Hàm lƣợng protein trong bã tảo sau khi phá vỡ theo PPVL ...... 46 Bảng 4.8. Giá trị OD – protein trong dịch tảo phá vỡ theo nồng độ đƣờng ............................................................................................................ 48 Bảng 4.9. Giá trị OD – protein trong dịch tảo phá vỡ theo PPVL .............. 50 Bảng 4.10. So sánh kết quả protein khi phá vỡ và không phá vỡ tế bào tảo ...................................................................................................... 51 Bảng 4.11. So sánh kết quả protein khi phá vỡ tế bào theo nồng độ đƣờng và theo thời gian .......................................................................................... 53 Bảng 4.12. So sánh kết quả protein khi phá vỡ tế bào theo nồng độ đƣờng ...................................................................................................................... 54 Bảng 4.13. So sánh kết quả protein khi phá vỡ tế bào theo thời gian ......... 55 Bảng 4.14. Kết quả phân tích vi sinh các sản phẩm nghiên cứu ................. 56 Bảng 4.15. Hiệu suất phá vỡ tế bào trong mẫu tảo ...................................... 57 Bảng 4.16. Chất lƣợng sản phẩm về mặt cảm quan .................................... 58 B ảng 4.17. Chất lƣợng sản phẩm về mặt vi sinh ........................................ 59 1 Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Trong hàng nghìn năm nay, cũng nhƣ trong tƣơng lai, để trái đất và loài ngƣời chúng ta tồn tại và phát triển. Đó chính là nhờ vào sự tuần hoàn của một chu trình đặc biệt quan trọng, thiếu nó trái đất sẽ trở thành một kho rác khổng lồ, loài ngƣời chúng ta sẽ không còn khoảng không riêng của mình, mà nơi ăn, chốn ở, chốn ngủ sẽ đƣợc bao quanh chỉ là "rác với rác". Vậy chu trình nào mang tính thiết yếu nhƣ thế ? Đó chính là chu trình vật chất. Nó bao gồm ba đối tƣợng cấu kết mà thành, đó là động vật - thực vật - vi sinh vật, ba đối tƣợng này có mối quan hệ gắn bó và tác động qua lại với nhau. Nhìn chung, một trong ba đối tƣợng trên không thể tách rời và chúng là nguồn sống, nguồn năng lƣợng của chúng ta. Một minh chứng điển hình là, cùng với sự phát triển nhƣ vũ bão của khoa học và công nghệ, loài ngƣời chúng ta đã không ngừng nghỉ để kiếm tìm và tạo ra các sản phẩm mới có giá trị cao cung cấp cho con ngƣời, đó chính là việc sử dụng sinh khối của vi khuẩn lam Spirulina platensis hay còn gọi là tảo xoắn Spirulina platensis. Nhƣ chúng ta đã nói, chu trình vật chất là chu trình thiết yếu cho sự tồn tại của loài ngƣời, trong khi đó Spirulina platensis lại tồn tại giữa hai ranh giới thực vật và vi sinh vật. Bởi lẽ, Spirulina platensis vừa mang bản chất của vi khuẩn, vừa mang bản chất quang hợp của thực vật. Spirulina đã đƣợc nghiên cứu từ nhiều năm nay, chúng có nhiều ƣu việt và giá trị dinh dƣỡng cao. Nên phạm vi sản xuất Spirulina trên thế giới đã đƣợc tăng lên, Spirulina trở nên kinh tế hơn và đƣợc chế biến cho nhiều ngƣời hơn. Đƣợc chấp nhận ở các nƣớc phát triển, loại thực phẩm mới này có thể đƣa sang những khu vực chậm phát triển hơn. Tại những nơi đó protein là một trong những yếu tố cần thiết nhất cho những ngƣời đang đói. Việc tăng năng suất Spirulina là một bƣớc đột phá trong năng suất thực 2 phẩm. Trong tƣơng lai việc nuôi trồng Spirulina dƣới đại dƣơng sẽ mở ra những diện tích sản xuất thực phẩm rộng lớn hơn. Tóm lại, Spirulina là một trong những giải pháp mới cho các vấn đề của hành tinh chúng ta. Đó là sự trở lại với cơ sở của dây chuyền thức ăn và với nguồn gốc đơn giản của sự sống. 1.2. Yêu cầu Đƣợc sự đồng ý của Chi cục Đo lƣờng Tiêu chuẩn Chất lƣợng tỉnh Bình thuận và Bộ môn Công nghệ sinh học, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu sinh khối vi khuẩn lam Spirulina platensis bổ sung vào nƣớc giải khát” - Xác định thành phần dinh dƣỡng của tảo Spirulina platensis. - Nghiên cứu các phƣơng pháp phá vỡ tế bào để thu dịch chiết. - Nghiên cứu và theo dõi sản phẩm sau khi bổ sung dịch chiết tảo. 1.3. Mục đích Tạo các sản phẩm chứa các thành phần dinh dƣỡng có trong tảo Spirulina platensis. 1.4. Nội dung thực hiện Chọn mẫu tảo đáp ứng yêu cầu đem phân tích các thành phần dinh dƣỡng và chỉ tiêu nhƣ: - Protein. - Tro. - Vi sinh. Từ các thành phần dinh dƣỡng phân tích đƣợc tiến hành phá vỡ tế bào theo hai phƣơng pháp: Phƣơng pháp khuếch tán và phƣơng pháp vật lí. Đánh giá hiệu suất phá vỡ tế bào. Tiến hành kiểm nghiệm vi sinh các sản phẩm làm nền nhƣ: nƣớc khoáng Vĩnh Hảo, nƣớc uống tinh khiết – Aquafina, rƣợu trái cây. Nghiên cứu chọn tỉ lệ bổ sung giữa dịch tảo và các sản phẩm. Theo dõi chất lƣợng sản phẩm sau khi đã phối trộn. 3 Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Lịch sử phát hiện và sử dụng Spirulina platensis 2.1.1. Lịch sử phát hiện [25, 29] Tảo Spirulina đã là thức ăn bổ dƣỡng từ thời cổ xƣa của ngƣời Aztec ở Mêhicô - Châu Mỹ và thổ dân Kanembu - Trung Phi. Tảo xoắn Spirulina là một loại vi tảo dạng sợi xoắn màu xanh lục, chỉ có thể quan sát thấy hình xoắn sợi do nhiều tế bào đơn cấu tạo thành dƣới kính hiển vi. Tảo Spirulina đã đƣợc nghiên cứu từ nhiều năm nay. Chúng có những đặc tính ƣu việt và giá trị dinh dƣỡng cao. Các nhà khoa học trên thế giới đã coi tảo Spirulina là sinh vật có ích cho loài ngƣời. Loại tảo này do tiến sĩ Clement ngƣời pháp tình cờ phát hiện vào những năm 1960 khi đến Trung Phi. Nhà khoa học này không khỏi kinh ngạc khi vùng đất cằn cỗi, đói kém quanh năm nhƣng những thổ dân ở đây rất cƣờng tráng và khỏe mạnh. Khi Clement tìm hiểu về thức ăn của họ, Clement phát hiện trong mùa không săn bắn, họ chỉ dùng một loại bánh màu xanh mà nguyên liệu chính là thứ họ vớt lên từ hồ. Qua phân tích, Clement phát hiện ra loại bánh có tên Dihe này chính là tảo Spirulina. Hai mƣơi năm sau, vào những năm cuối thập kỷ tám mƣơi thế kỷ 20 - nhiều giá trị dinh dƣỡng và chức năng sinh học của tảo Spirulina đã đƣợc khám phá và công bố rộng rãi không chỉ ở Pháp mà ở cả nhiều nƣớc khác trên thế giới nhƣ Mỹ, Nhật, Canada, Mêhicô, Đài Loan. Hầu hết các nghiên cứu đều đã chỉ ra rằng tảo Spirulina rất giàu protein có tới 60 – 70% trọng lƣợng khô của tảo.Chỉ số hóa học của protein tảo cũng rất cao trong đó các loại axit amin chủ yếu nhƣ leucin, isoleucin, valin, lysin, methionin và tryptophan đều có mặt với tỉ lệ vƣợt trội so với chuẩn của tổ chức lƣơng nông quốc tế quy định. Hệ số tiêu hóa và hệ số sử dụng protein rất cao có thể đến 80 – 85% protein của tảo đƣợc hấp thu sau 18 giờ. 4 Trong nhiều thập kỷ qua, nhiều nhà nghiên cứu đã chú ý tới Spirulina không chỉ nhƣ một loại thực phẩm giàu dinh dƣỡng chứa 50 – 70% protein và có năng suất gấp 20 lần so với đậu nành trên 1 ha mà còn chiết xuất đƣợc từ Spirulina nhiều thành phần có dƣợc tính quý nhƣ chống oxy hóa, chống dị ứng, tăng khả năng miễn dịch, có tác dụng làm giảm lƣợng mỡ trong máu và chống ung thƣ. 2.1.2. Tình hình nghiên cứu Spirulina platensis trong – ngoài Nƣớc 2.1.2.1. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam [26,27,28,29] Tảo Spirulina đƣợc giáo sƣ Ripley D.Fox - nhà nghiên cứu về tảo và các chế phẩm của tảo tại "Hiệp hội chống suy dinh dƣỡng bằng các sản phẩm từ tảo" tại Pháp đƣa vào Việt Nam từ 1985. Trong những năm 1985 – 1995 đã có những nghiên cứu thuộc lĩnh vực công nghệ sinh học cấp nhà nƣớc nhƣ nghiên cứu của GS.TS. Nguyễn Hữu Thƣớc và cộng sự - Viện Công nghệ Sinh học thuộc Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam với đề tài "Công nghiệp nuôi trồng và sử dụng tảo Spirulina". Hay đề tài cấp thành phố của Bác sĩ Nguyễn Thị Kim Hƣng - TP Hồ Chí Minh và cộng sự với đề tài "Nghiên cứu sản xuất và sử dụng thức ăn có tảo Spirulina trong dinh dƣỡng điều trị". Cho đến nay, nhiều cơ sở nuôi trồng, sản xuất và chế biến các sản phẩm từ tảo Spirulina đã đƣợc thành lập. Đó là các cơ sở nhƣ Vĩnh Hảo - Bình Thuận, Châu Cát, Lòng Sông - Thuận Hải, Suối Nghệ - Đồng Nai, Đắc Min - Đắc Lắc. Nguồn CO2 từ lò nung vôi sau khi đã lọc bụi và các hầm khí bioga cũng đã đƣợc nghiên cứu tận dụng để phát triển nuôi trồng tảo và cũng đã thu đƣợc một số kết quả khả quan. Ngoài các sản phẩm Spirulina nhập từ Thái Lan, Trung Quốc với nhiều tên gọi khác nhau, bán hàng theo phƣơng thức phân phối đa cấp với tỉ lệ chiết khấu cao gây thiệt thòi cho ngƣời tiêu dùng. Các sản phẩm đƣợc chế biến từ tảo Spirulina tại Việt Nam cũng đã xuất hiện ngày càng nhiều và đa dạng. Trƣớc đây đã từng có bột dinh dƣỡng Enalac, Sonalac có 5% tảo. Nay đã có 5 sản phẩm Spir@ của Công ty DETECH - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đƣợc 5 Cục An toàn vệ sinh thực phẩm - Bộ Y tế cấp phép lƣu hành trên thị trƣờng. Đó là các sản phẩm: 1.Spir@ B - Tảo bồi bổ: Tảo xoắn Spirulina dùng cho ngƣời suy dinh dƣỡng, ngƣời mới ốm dậy cần bồi bổ phục hồi sức khoẻ. 2.Spir@ HA - Tảo điều hoà huyết áp: Tảo xoắn Spirulina kết hợp tinh chất hoa hòe, hoa cúc dùng cho ngƣời bị tăng huyết áp, giảm stress và tăng cƣờng trí nhớ cho ngƣời già. 3.Spir@ CĐ - Tảo phòng chống độc: Tảo xoắn Spirulina kết hợp tinh chất Cao hạt nho: dùng để tăng sức đề kháng, chống độc, khử gốc tự do. 4.Dia-Spir@ - Tảo phòng chống tiểu đƣờng: Tảo xoắn Spirulina kết hợp vitamin, khoáng chất dùng cho ngƣời bị bệnh đái tháo đƣờng týp 1 và týp 2. 5.Spir@ Cid - Tảo phòng chống ung thƣ: Tinh nghệ nguyên chất kết hợp với tảo xoắn Spirulina, Cao hạt nho dùng hỗ trợ cho việc phòng và chữa các bệnh ung thƣ. Tất cả các sản phẩm trên có thể không phải là “thần dƣợc”. Nhƣng với xu thế hòa nhập cùng thế giới, nhất là sau khi đã tham gia vào WTO chúng ta cũng không thể phủ nhận những tác dụng của thực phẩm chức năng mà thế giới đã thừa nhận. Do vậy ngƣời tiêu dùng, nhất là ngƣời bệnh và những ngƣời có điều kiện về kinh tế nên tìm hiểu và nên sử dụng ngày càng nhiều hơn các loại thực phẩm chức năng nhƣ là tảo Spirulina vì sức khoẻ của chính mình. 2.1.2.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới [29,30] Trƣớc những năm 1960, việc cấy trồng Spirulina làm thực phẩm chƣa có một khái niệm thực sự. Năm 1960 Spirulina mới bắt đầu đƣợc biết đến, loại tảo này do tiến sĩ Clement ngƣời Pháp tình cờ phát hiện khi đến hồ Sat ở Trung Phi. Năm 1963 Viện dầu hoả Pháp đã bắt đầu quan tâm đến báo cáo về loại bánh tảo Dihe. Đƣợc biết đó là tảo Spirulina platensis, họ đã tiến hành nghiên cứu loại tảo này trong phòng thí nghiệm rồi xây dựng quy trình sản xuất thử. Tuy nhiên điều kiện tự nhiên của nƣớc Pháp không thuận lợi cho việc nuôi trồng loại tảo này. 6 Durand, Giám đốc công ty sản xuất soda ở hồ Texcoco - Mêhicô đã ứng dụng quy trình của viện dầu hoả Pháp tiến hành nuôi tảo Spirulina trên một phần diện tích của hệ thống bay hơi nhờ năng lƣợng mặt trời của hồ Texcoco. Từ năm 1970 Công ty Soda – Texcoco vừa sản xuất soda vừa sản xuất tảo trên diện tích khoảng 12 ha với sản lƣợng mỗi ngày là trên 1 tấn tảo khô. Năm 1973, Tổ chức Lƣơng nông quốc tế và Tổ chức Y tế thế giới đã chính thức công nhận Spirulina là nguồn dinh dƣỡng và dƣợc liệu quý, đặc biệt trong chống suy dinh dƣỡng và chống lão hóa. Đáng lƣu ý trƣớc hết là công trình nghiên cứu phòng chống ung thƣ gây ra bởi tia phóng xạ hạt nhân cho các nạn nhân của sự cố Nhà máy Điện hạt nhân Chernobul đã thu đƣợc kết quả rất tốt khi điều trị bằng Spirulina nguyên chất. Khi uống Spirulina, lƣợng chất phóng xạ đã đƣợc đào thải khỏi đƣờng tiểu của ngƣời bị nhiễm xạ rất cao. Kết quả này đã đƣợc biểu dƣơng tại hội nghị quốc tế về tảo năm 1998 ở cộng hòa Czech. Tại Ấn Độ, một nghiên cứu năm 1995 đã chứng tỏ với liều 1g Spirulina/ngày, có tác dụng trị ung thƣ ở những bệnh nhân ung thƣ do thói quen nhai trầu thuốc. Ở Nhật Hiroshi Nakamura cùng Christopher Hill thuộc Liên đoàn vi tảo quốc tế cùng một số nhà khoa học bắt đầu nghiên cứu Spirulina từ năm 1968. Hiện nay trong các đề tài nghiên cứu chống HIV/AIDS của Nhật, có đề tài sử dụng Spirulina. Sản lƣợng Spirulina hiện nay trên thế giới khoảng 1000 tấn khô/năm. Những nƣớc đi đầu sản xuất đại trà loại tảo này là Mêhicô, Mỹ, Nhật, Đài Loan, Ấn Độ, Israel. Trại tảo lớn nhất là ở Hawaii có khoảng 25 ha và mới đây là Trung Quốc có khoảng 16 ha. Nhu cầu Spirulina trên thế giới là rất lớn, tuy nhiên sản lƣợng chƣa nhiều, nên giá bán những chế phẩm Spirulina rất đắt. Gần đây việc phát hiện và đƣa vào sử dụng một số chất có hoạt tính sinh học ở Spirulina đã góp phần không nhỏ thúc đẩy quá trình nghiên cứu, sản xuất cũng nhƣ ứng dụng có hiệu quả sinh khối tảo này. 7 2.2. Spirulina và những vấn đề liên quan 2.2.1. Giới thiệu về Spirulina [31,32] Tảo lam hay còn đƣợc gọi là vi khuẩn lam theo tiếng Hy lạp thì cyanos - blue là một ngành vi khuẩn mà có khả năng hấp thu năng lƣợng qua quá trình quang hợp. Trong số các cơ thể tự dƣỡng đƣợc thì tảo lam đƣợc xem là nhóm nguyên thủy nhất. Di tích hóa thạch của chúng phát hiện đƣợc cách nay khoảng 3,8 tỷ năm. Chúng đƣợc xếp liền sau các vi khuẩn, riêng với các nhóm khác vì ngoài những đặc điểm chƣa có nhân thật, chƣa có lạp, chỉ chứa diệp lục tố a, sắc tố phụ trội bản tính protein thƣờng làm cho chúng có màu lam ra thì chúng cũng chƣa có sự sinh dục hữu phái, tản có cấu tạo đơn bào, hoặc hình sợi. Tảo lam không có tiêm mao di chuyển bằng cách trƣợt trên bề mặt. Hầu hết đƣợc tìm thấy trong nƣớc ngọt, đất ẩm ƣớt, một số ít loài đƣợc tìm thấy trong nƣớc mặn. Spirulina là vi khuẩn lam dạng sợi thuộc ngành vi khuẩn lam hay tảo lam. Spirulina còn có tên thƣơng mại là Arthrospira platensis mà đƣợc nuôi trồng trên thế giới nhƣ một nguồn thực phẩm, chúng rất giàu dinh dƣỡng. Hiện nay đƣợc phổ biến nhƣ là thực phẩm bổ dƣỡng tại US và Europe. Tảo Spirulina (Spirulina platensis) là một loài vi tảo có dạng xoắn hình lò so, màu xanh lam với kích thƣớc chỉ khoảng 0,25 mm. Chúng sống trong môi trƣờng nƣớc giàu bicarbonat và độ kiềm cao pH từ 8,5 - 11. Hình 2.1. Hình dạng của vi khuẩn lam Spirulina platensis.[18,38] Do hình thái “lò so xoắn” dễ nhận biết qua kính hiển vi, ngƣời ta cũng thƣờng gọi tảo này là “tảo xoắn”. Tảo Spirulina vẫn tiếp tục đƣợc nghiên cứu sử 8 dụng nhƣ thức ăn - vị thuốc nhân loại trong tƣơng lai do khả năng phát triển cực kì nhanh của một sinh vật đơn bào. Môi trƣờng nuôi trồng tảo từ không khí cho đến dung dịch nuôi cần tránh mọi nguồn ô nhiễm – vì vi tảo Spirulina rất nhạy bén và rất dễ thu hút các kim loại nặng, độc hại, bất cứ từ đâu đến. Về mặt này nƣớc khoáng Vĩnh Hảo và không khí vùng Bình Thuận gần đạt mức tối ƣu nên các kết quả xét nghiệm các mẫu tảo thu hoạch đƣợc tại đây, hoàn toàn không bị nhiễm bất cứ kim loại nặng nào đáng lo ngại. 2.2.2. Đặc điểm sinh lí của Spirulina platensis 2.2.2.1. Phân loại [10,12,21] Spirulina phân bố rất rộng trong các môi trƣờng khác nhau và có thể phát triển tốt trong các môi trƣờng các loài tảo khác không thể sinh sống. Một vài loài Spirulina tiêu biểu nhƣ Spirulina platensis, Spirulina maxima, Spirulina geilleri F. geiller. Ngành tảo lam sắp liền sau ngành vi khuẩn và đƣợc tách riêng với các nhóm tảo khác là vì: Chƣa có nhân rõ rệt, không có sự sinh sản hữu tính, có chứa sắc tố, tản đơn sơ, đơn bào hoặc hình sợi. Vị trí phân loại khoa học Lãnh giới Bacteria Ngành Cyanobacterium Lớp Chroobacteria Bộ Oscillatorriales Họ Phormidiaceaea Chi Arthospira Các loài S. maxima S. platensis 9 2.2.2.2. Đặc điểm sinh lý [11,15.23] Hình 2.2. Hình dạng của vi khuẩn lam Spirulina platensis được nhìn dưới kính hiển vi [38] Tảo xoắn Spirulina là một loại vi tảo dạng sợi xoắn màu xanh lục, chỉ có thể quan sát thấy hình xoắn sợi do nhiều tế bào đơn cấu tạo thành dƣới kính hiển vi. Hình 2.3. Hình dạng của vi khuẩn lam Spirulina platensis dưới kính hiển vi.[38] Giống nhƣ các thực vật khác, Spirulina cần có chất dinh dƣỡng để phát triển, nhƣ nƣớc, cacbon, nitơ, photpho, kali, lƣu huỳnh, sắt và các khoáng chất khác. Khi có ánh sáng mặt trời quá trình quang hợp xảy ra và loài vi tảo này 10 chuyển hoá các chất dinh dƣỡng kể trên thành chất nuôi tế bào, đồng thời thải ra khí oxy. Các tế bào sản sinh một cách đơn giản là tự phân và một số loài có khả năng tăng gấp đôi số tế bào trong vòng vài giờ đồng hồ trong điều kiện phòng thí nghiệm. Trong hồ tự nhiên và dƣới nƣớc biển, tảo phát triển mau chóng và sau đó chết theo từng mùa. Việc chất ding dƣỡng sẳn có trong hồ tự nhiên hoặc tại các hệ thống thuỷ sinh thái thƣờng là nhân tố chủ yếu hạn chế sự tăng trƣởng. Mƣa làm trôi chất dinh dƣỡng của đất xuống hồ ao, sông ngòi tạo điều kiện cho tảo mùa phát triển. Ở đại dƣơng, chỉ có những đụn giàu dinh dƣỡng do các luồng nƣớc chính tạo ra gặp vùng đất rộng mới có thể làm hình thành những vùng tăng trƣởng thƣờng xuyên cho quần lạc thực vật phù du. Chính quần lạc thực vật phù du này là cơ sở của mạng lƣới thực phẩm và hỗ trợ cho mọi sự sống dƣới nƣớc thuộc hình thái cao hơn. Tại các hồ cấy vi tảo ngƣời ta không cần đất màu. Tuy nhiên, do vi tảo phát triển với tốc độ lớn nhƣ vậy, nên phải cung cấp chất dinh dƣỡng nhanh hơn so với cây trồng trên cạn. Phải bơm xuống nƣớc đủ lƣợng CO2 và phải luôn luôn cung cấp chất dinh dƣỡng có khả năng hoà tan khác để các hồ luôn luôn có vi tảo đƣợc thu hoạch. 11 2.3. Kỹ thuật sản xuất Spirulina platensis [7,11] 2.3.1. Sơ đồ qui trình sản xuất Spirulina platensis 2.3.2. Các yếu tố ảnh hƣởng đến Spirulina Công nghệ nuôi trồng vi khuẩn lam Spirulina đƣợc xây dựng trên cơ sở Spirulina là loài sinh vật quang tự dƣỡng và có khả năng dị dƣỡng không lớn, nên phải tạo điều kiện để Spirulina quang hợp đạt hiệu quả cao, nhất là: Về điều kiện ngoại cảnh: nhiệt độ, ánh sánh, pH và nồng độ các chất dinh dƣỡng của môi trƣờng để Spirulina đạt năng suất cao và phẩm chất tốt. Sử dụng năng lƣợng, thiết bị và nguyên liệu có hiệu quả kinh tế cao. - Chọn địa điểm xây dựng cơ sở nuôi trồng Cần chọn vùng có nắng nhiều, nhiệt độ cao, có ít mƣa hoặc tập trung theo mùa để sản xuất đƣợc nhiều tháng trong năm. Chất khoáng Nƣớc CO2 hoặc HCO - 3 Nhiệt độ (20-40 0 C) Spirulina giống Ánh sáng Bể nuôi Spirulina chứa môi trƣờng có pH 8,5 - 10 Khuấy sục Lọc Spirulina khô Phơi khô hoặc sấy Ly tâm loại nƣớc Môi trƣờng Thu khoáng chất còn lại 12 - Nƣớc Thƣờng nuôi trồng Spirulina trong các bể có mức nƣớc sâu trung bình 10 cm. Tính ra 1 ha mặt bể sản xuất Spirulina thƣờng xuyên chứa 1000 m3 nƣớc. Chất lƣợng nƣớc có ý nghĩa quan trọng để đảm bảo độ sạch, nguồn nƣớc không bị nhiễm các loài Spirulina khác và các vi trùng gây bệnh. Nƣớc khoáng trong lòng đất nếu là kiềm và giàu ion HCO-3 là những nguồn nƣớc có giá trị để trồng Spirulina và nguồn nƣớc khoáng này có chứa các nguyên tố khoáng khác rất cần cho Spirulina. - Môi trƣờng dinh dƣỡng + Nguồn cacbon: Sử dụng môi trƣờng nuôi trồng Spirulina là nguồn nƣớc giàu bicacbonat. Có thể sử dụng nhiều loại môi trƣờng khác nhau. Môi trƣờng Zarrouk có thành phần NaHCO3 16,00 g/l K2SO4 1,00g/l K2HPO4 0,50 g/l CaCl2 0,40g/l NaNO3 2,50 g/l EDTA 0,08g/l NaCl 1,00g/l Dung dịch A5 1ml/l MgSO4.7H2O 0,2g/l Dung dịch A6 1ml/l FeSO4 0,01g/l pH 8 – 10 Trong quá trình nuôi, Spirulina sử dụng các chất dinh dƣỡng trong môi trƣờng nên hàm lƣợng của chúng giảm xuống. Vì vậy cần bổ sung kịp thời để duy trì năng suất và phẩm chất của Spirulina. + Môi trƣờng hữu cơ: bột xƣơng là nguồn cung cấp các muối photphat và canxi. - Độ pH: Các môi trƣờng nuôi Spirulina sau khi pha thƣờng có pH 8,1 – 8,5. Nhƣng trong quá trình nuôi trồng pH ngày càng kiềm hơn, có thể lên đến 11 hoặc hơn. Để điều chỉnh pH nằm trong vùng tối ƣu đối với sinh trƣởng của Spirulina có thể dùng biện pháp bổ sung đều đặn NaHCO3 và phun khí CO2 vào môi trƣờng nuôi. - Bể nuôi Spirulina và phƣơng pháp khuấy sục: 13 Các bể nuôi để nuôi Spirulina thƣờng xây bằng gạch và xi măng hoặc bằng tấm chất dẻo. Bể nuôi Spirulina đầu tiên do các nhà khoa học Viện dầu hoả Pháp thiết kế. Chọn các bể có bề mặt lớn nhƣng không sâu nhằm vận chuyển khí CO2 thành ion HCO3 - và khuấy sục. Spirulina nuôi ở Mêhicô đƣợc nuôi trong hồ Texcoco, là một hồ nƣớc mặn giàu soda. Ở Ấn Độ Spirulina đƣợc nuôi trong các bể có diện tích 5 m2, 11 m2 và 55 m2 có thể tích 500 lít, 2000 lít và 10000 lít. Dịch Spirulina đƣợc khuấy sục nhờ guồng để Spirulina không bị lắng và phân bố ánh sáng, chất khoáng đều. Ở Việt Nam, tại công ty Vĩnh Hảo Đinh Văn Sâm và cộng sự đã thiết kế các bể gạch và xi măng có diện tích 40 – 50 m2 theo kiểu hở một vòng tuần hoàn. Kết cấu bể theo dạng tấm phẳng có gân chịu lực. Mực nƣớc lúc làm việc 10 cm. Thiết bị khuấy sục là dùng bơm trục vít loại 2 đƣờng xoắn. Nguồn động lực bơm là một động cơ gió kiểu sovonius một tầng 3 cánh có r = 1,5 m và h = 2,5 m. Khi tốc độ gió w = 5 m/giây và tốc độ quay của động cơ là n = 30 vòng/phút thì tốc độ quay của bơm là 200 vòng/phút. Lƣu lƣợng nƣớc tuần hoàn Q = 175 m3/giờ và tốc độ dòng chảy đạt đƣợc 0,2 m/giây khi độ sâu lớp nƣớc 0,12 m. Sự lựa chọn loại động cơ kiểu sovonius phù hợp với sự đổi chiều của gió tại Vĩnh Hảo. Việc khuấy sục môi trƣờng có vai trò quan trọng trong nuôi trồng Spirulina vì làm cho tế bào Spirulina đƣợc tiếp xúc đều với ánh sáng, dịch Spirulina không bị lắng xuống đáy bể, các chất dinh dƣỡng đƣợc phân bố đều và nguồn CO2 đƣợc tế bào sử dụng tốt hơn. 14 (a) (b) Hình 2.4: Các mô hình nuôi tảo Spirulina công nghiệp [44] (a) Bể nuôi Spirulina tại Vĩnh Hảo (b) Bể nuôi Spirulina tại Ấn Độ - Nuôi trồng Spirulina công nghiệp + Nuôi trồng Spirulina trong phòng: Để đảm bảo cung cấp giống ban đầu cho các bể ở ngoài. Cần có Spirulina sinh trƣởng tốt, màu lục, không bị vàng do thiếu các chất dinh dƣỡng và không bị nhiễm các loài khác. Hình 2.5. Nuôi Spirulina trong phòng thí nghiệm [41] 15 Giữ giống trên môi trƣờng gốc chứa thạch nghiêng hoặc trên môi trƣờng lỏng đƣợc chuẩn bị nhƣ sau: môi trƣờng Zarrouk hoặc môi trƣờng hỗn hợp của Viện nghiên cứu trung tâm công nghệ thực phẩm - Ấn Độ với thạch để cấy. NaHCO3 và các chất dinh dƣỡng còn lại đƣợc tiệt trùng riêng. Hỗn hợp hai thứ trên theo tỉ lệ 1:1. Thạch (nồng độ cuối cùng là 2%) đƣợc tiệt trùng rồi thêm vào hỗn hợp trên. Dùng 1 – 2 giọt môi trƣờng chứa Spirulina cấy lên thạch nghiêng. Giữ giống cũng có thể tiến hành trên môi trƣờng lỏng chuẩn bị nhƣ trên nhƣng không có thạch. Các ống thạch nghiêng hoặc các bình tam giác chứa môi trƣờng lỏng giữ giống Spirulina có thể cất giữ ở nơi có nhiệt độ mát <150C hoặc ở nhiệt độ 40C nhƣng cƣờng độ ánh sáng phải thấp 300 – 500 lux sau 30 – 40 ngày thì cấy lại. Nhân giống chuẩn bị trồng ngoài trời. Cho môi trƣờng đã chuẩn bị vào bình thuỷ tinh có thể tích từ 2 - 5 lít. Lấy 10 ml dịch Spirulina hay lấy Spirulina từ 2 ống thạch nghiêng thêm vào mỗi bình trên. Giữ các bình này dƣới đèn huỳnh quang và đèn sợi đốt hay ngoài trời đƣợc che bóng có cƣờng độ ánh sáng khoảng 3 – 10 Klux. Các bình trên mỗi ngày lắc vài lần. Sau 8 – 10 ngày là có lƣợng Spirulina để nhân ra bể ngoài trời. + Nuôi trồng Spirulina ra bể: Dùng 20 lít Spirulina nhân giống trong bình để nhân ra bể 20 m3. Các bể mới cấy Spirulina ra có mật độ loãng phải che bớt ánh sáng để ánh sáng còn lại khoảng 5000 lux. Khi Spirulina trong bể đặc thì không cần che nữa. Để không phải che bể lúc mới gieo Spirulina vào thì phải tiến hành cấy với mật độ cao và khuấy sục để môi trƣờng di chuyển với tốc độ 20 cm/giây. Từ bể này lại nhân Spirulina sang bể tiếp theo, cần nhân Spirulina vào bể sau khi mặt trời lặn để Spirulina thích nghi qua đêm trƣớc khi quang hợp của ngày hôm sau. - Thu hoạch Spirulina: Sau khi các bể đã nhân đủ Spirulina thì chúng sẽ sinh trƣởng tăng sinh khối và tăng mật độ. Định kỳ khoảng 2 ngày hoặc hơn tuỳ theo tình trạng của các bể mà thu hoạch bớt và giữ lại mật độ không thấp hơn 0,6 – 0,8 g/l. Mỗi lần thu 16 hoạch cần tiến hành bổ sung chất dinh dƣỡng cho môi trƣờng. Cần bổ sung nƣớc đến độ sâu đã quy định. Sau thời gian sinh trƣởng từ 1 – 2 tháng do môi trƣờng bị thay đổi vì các chất dinh dƣỡng không còn giữ đƣợc cân bằng giữa các yếu tố dinh dƣỡng nhƣ ban đầu, mặt khác Spirulina tiết ra môi trƣờng các chất kích thích sinh trƣởng và các chất kìm hãm sinh trƣởng nên năng suất và phẩm chất của Spirulina giảm dần, lúc đó phải thay môi trƣờng và nhân Spirulina lại từ đầu. Tại hồ Texcoco ở Mêhicô Spirulina trồng diện tích lớn nên thu hoạch theo quy mô công nghiệp, gồm các công đoạn: Làm đặc sơ bộ. Lọc bằng trọng lực và chân không. Làm vỡ tế bào. Sấy khô. Nghiền. Đóng gói. Tại Vĩnh Hảo - Bình Thuận Spirulina sau thu hoạch sẽ đƣợc lọc qua vải sợi bông và rửa sạch bằng máy rồi đem ly tâm tốc độ 800 vòng/phút loại bớt nƣớc để thu sinh khối. Sấy khô: là công đoạn quan trọng và là khâu cuối cùng của quá trình sản xuất Spirulina nói chung. Spirulina có thành tế bào mỏng nên thuận lợi cho việc sấy sẽ nhanh khô. Ấn độ đã tiến hành thử nghiệm nhiều phƣơng pháp sấy khác nhau, trong đó phơi nắng cho thấy sản phẩm sau khi sấy đều tốt và đẹp. Tại Vĩnh Hảo, đã sử dụng phƣơng pháp phơi khô ngoài nắng. Buổi sáng thu hoạch và phơi khô suốt ngày. Trong điều kiện không thuận lợi về thời tiết phải phơi bổ sung ngày hôm sau. Spirulina thu đƣợc theo phƣơng pháp này còn 7 – 8% độ ẩm, sau đó đem nghiền thành bột và cất giữ lâu hàng năm mà vẫn không bị mốc. 17 - Xử lý nƣớc thải sau thu hoạch: Sau mỗi lần lọc để thu hoạch, nƣớc qua lọc cần cho lại vào bể để tiết kiệm môi trƣờng. Lúc thay toàn bộ môi trƣờng và nhân Spirulina lại từ đầu cần tận thu Spirulina còn lại trong môi trƣờng đó. 2.4. Thành phần dinh dƣỡng và công dụng của Spirulina platensis 2.4.1. Thành phần dinh dƣỡng [18,33] Spirulina còn có tên thƣơng mại là Arthrospira platensis mà đƣợc nuôi trồng trên thế giới nhƣ một nguồn thực phẩm, chúng rất giàu dinh dƣỡng. Hiện nay đƣợc phổ biến nhƣ là thực phẩm bổ dƣỡng tại US và Europe. Protein: 55% - 70% Giàu các vitamin: vitamin A, B1, B2, B3, B6, B12, vitamin C, vitamin D, vitamin E, folate, vitamin K, biotin, axit pantothenic, beta carotene - tiền chất của vitamin A, inositol. Giàu các chất khoáng: Canxi, mangan, sắt, chromium, photpho, magiê, selen. Giàu các sắc tố: phycocyanin, chlorophyll, carotenoid và xanthophyll và các sắc tố khác. Các hợp chất hữu cơ: axit gamma linoleic, glycolipid, các polysaccharide. Các axit amin: isoleucine, phenylalanine, leucine, threonine, lysine, tryptophan, methionine, valine, alanine, glycine, arginine, histidine, axit aspartic, proline, cystine, serine, axit glutamic, tyrosine. Đặc biệt chúng chứa nhiều axit amine không thay thế mà động vật không thể tự tổng hợp đƣợc. Vì vậy Spirulina đƣợc nuôi trồng rất phổ biến trên thế giới, đƣợc sử dụng vào nhiều mục đích khác nhau: Y - Dƣợc, mỹ phẩm, thực phẩm, nông nghiệp, thủy sản và đƣợc coi là thức ăn con ngƣời trong tƣơng lai. 18 2.4.2. Công dụng của vi khuẩn lam Spirulina platensis [34,35,36,37] Protein chất lƣợng cao Spirulina là một loại tảo đơn bào nhỏ dạng xoắn ốc, chứa protein cân bằng, hoàn chỉnh và nhiều chất dinh dƣỡng có giá trị. Spirulina chứa khoảng 70% protein dễ tiêu, lƣợng protein này cao hơn bất kì loại thực phẩm nào khác. Ngoài ra thành phần của tảo Spirulina còn chứa 18/22 axit amin, tất cả những axit amin cần thiết này tạo thành nguồn thực vật duy nhất hoàn chỉnh về protein. Hơn nữa, protein trong Spirulina dễ tiêu hóa hơn so với các nguồn thịt. Thực vậy, protein thịt bò đƣợc ƣớc lƣợng chỉ dễ tiêu 20%, trong khi protein Spirulina là 95%. Spirulina không những là thực phẩm tuyệt vời giúp cơ thể dễ dàng hấp thụ protein chất lƣợng cao mà còn chứa các men tự hỗ trợ quá trình tiêu hóa. Chất giàu dinh dƣỡng tự nhiên Nguồn dinh dƣỡng thực phẩm tự nhiên hoàn chỉnh đƣợc tìm thấy trong thực phẩm này là Spirulina cho ta những điều lợi ích vô tận về sức khỏe, Spirulina có lƣợng beta-carotene cao - tiền chất của vitamin A gấp 25 lần cà rốt, đây là chất chống oxy hóa mạnh, bảo vệ cơ thể khỏi những tổn hại cơ bản. Không giống vitamin A tổng hợp và dầu gan cá, beta-carotene hoàn toàn không độc hại, thậm chí khi sử dụng với số lƣợng lớn. Spirulina giàu vitamin A dễ chuyển hóa, cần thiết cho mắt, làn da, răng, móng, tóc, xƣơng và một hệ thống miễn dịch tốt, bảo vệ cơ thể khỏe mạnh. Spirulina là một nguồn cung cấp vitamin B tuyệt vời, cụ thể là vitamin B12, quan trọng với ngƣời ăn chay, gấp 2 – 6 lần gan bò sống. Thực phẩm dinh dƣỡng này cũng chứa vitamin E, là nguồn sắt cao, chứa 14 chất khoáng tự nhiên và nhiều nguyên tố vi lƣợng. Siêu thực phẩm cho ngƣời ăn kiêng Spirulina là một trong những thực phẩm giàu dinh dƣỡng nhất, chứa ít chất béo và cholesterol. Nhiều ngƣời nhận thấy rằng khi họ dùng Spirulina trƣớc bữa ăn sẽ làm giảm sự thèm ăn của họ, cho phép họ giảm nhu cầu ăn thêm thức ăn 19 nhƣng vẫn không thấy đói, cách này thích hợp cho ngƣời ăn kiêng. Đối với những ngƣời suy dinh dƣỡng, cần tăng trọng cách tốt nhất là bổ sung Spirulina sau mỗi bữa ăn. Chất dinh dƣỡng sẽ đƣợc tích lũy lại, giúp ngƣời suy dinh dƣỡng mau chóng phục hồi. Loại siêu thực phẩm này có thể là một thành phần giá trị của bất kì chƣơng trình tăng hoặc giảm cân sức khỏe nào. Spirulina cũng là nguồn cung cấp carbohydrate phức hợp tuyệt vời, nó chứa glycogen và rhamnose, dễ đƣợc cơ thể hấp thu và biến đổi nhanh chóng thành năng lƣợng. Thực phẩm dinh dƣỡng protein cao, ít calo này cung cấp năng lƣợng chúng ta cần mỗi ngày. Hỗ trợ miễn nhiễm tự nhiên Spirulina chứa đựng nhiều chất dinh dƣỡng cần thiết cho sự miễn nhiễm tối ƣu nhƣ GLA, beta-carotene và các carotenoid khác. Lƣợng dầu chứa GLA gấp 3 lần so với dầu cây anh thảo. Nghiên cứu đã tìm ra GLA giúp làm giảm bệnh huyết áp cao và giảm lƣợng cholesterol trong máu, làm dễ chịu các trƣờng hợp viêm khớp, các cơn đau tiền kinh nguyệt, bệnh chàm và các bệnh khác về da. Spirulina đƣợc nghiên cứu rộng rãi nhằm công bố đặc tính tăng cƣờng miễn nhiễm, các nghiên cứu cho thấy Spirulina có thể làm tăng mức độ kháng thể và hoạt động đại thực bào, cả hai đều quan trọng đối với một hệ thống miễn nhiễm mạnh mẽ, nó cũng giúp cân bằng hoạt động hệ thống miễn nhiễm của bạn. Lọc và giải độc Còn một lí do khiến Spirulina quan trọng vì chúng chứa diệp lục gấp nhiều lần so với cỏ linh lăng hoặc lúa mì. Chất diệp lục là sắc tố giúp thực vật có màu xanh và rất trong sạch, với nhiệm vụ là làm sạch hệ thống kim loại nặng và các độc tố khác trong cơ thể có hại cho sức khỏe. Những năm qua, nhiều ngƣời mong muốn làm thanh khiết cơ thể đã ăn kiêng định kì bằng Spirulina. 20 2.5. Ứng dụng Spirulina platensis trong thực phẩm, xử lý môi trƣờng y học và mỹ phẩm [37,45] 2.5.1. Ứng dụng trong thực phẩm Từ những năm 1970, ở Nhật Bản và ở Mỹ, tảo Spirulina đã đƣợc xem là một loại siêu thực phẩm. Đến những năm 1990 vấn đề tiêu thụ Spirulina đã phát triển vƣợt bậc tại Trung Quốc, Ấn Độ, Châu Á, Bắc Mỹ làm cho Spirulina ngày càng trở nên phổ biến Hình 2.6. Các sản phẩm có bổ sung tảo [26] Gần đây, trên thị trƣờng Việt Nam xuất hiện nhiều chế phẩm bán ở cửa hàng thực phẩm, siêu thị hoặc cả trong nhà thuốc với thành phần và công dụng rất gần với thực phẩm dinh dƣỡng và thuốc chữa bệnh. Những chế phẩm đó là sản phẩm giao thoa giữa thực phẩm và thuốc - còn gọi là thực dƣợc, dƣỡng dƣợc hay thực phẩm chức năng. Đặc biệt trong những tháng giữa năm 2005 tới nay, các chế phẩm chứa tảo Spirulina đang bán trong nhóm sản phẩm nêu trên đƣợc khá nhiều ngƣời chú ý. Thực phẩm dinh dƣỡng đƣợc dùng ở dạng nƣớc uống, siro, yaourt, bột dinh dƣỡng. Có thể dùng tảo nguyên chất để uống hoặc trộn vào thức ăn nhƣ nấu canh, làm bánh. Một số nƣớc còn có trà Spirulina. Ở Đức, ngƣời ta đã bắt đầu đƣa tảo vào bia, gọi là bia xanh. 1 ngƣời dùng 1 ngày 5g tảo là đủ các chất thiết yếu. Cơ thể có thể hấp thụ mỗi ngày 30 – 45g. Dùng thừa cũng vô hại. Ngƣời bị bệnh nặng không ăn đƣợc có thể bơm tảo thẳng vào dạ dày là đủ các chất dinh dƣỡng. 21 2.5.2. Ứng dụng trong xử lí môi trƣờng Ở Việt Nam hiện nay, quy mô và mức độ ô nhiễm kim loại nặng trong nƣớc thải công nghiệp đang gia tăng với tốc độ đáng lo ngại. Việc áp dụng các biện pháp hóa lý nhƣ đã nêu thƣờng có giá thành cao, khiến nhiều hoạt động công nghiệp vẫn tiếp tục thải nƣớc thải chứa kim loại nặng vào môi trƣờng. Các điều tra cho thấy các nhà máy ô tô, sản xuất pin và ắc qui, nhà máy thuộc da, các xí nghiệp mạ thải nƣớc thải chứa các kim loại nặng nguy hiểm nhƣ Ni, Cr, Fe, Hg, Cu, Pb. Vì vậy nghiên cứu sử dụng vi tảo để loại trừ kim loại nặng trong nƣớc thải công nghiệp ở nƣớc ta là một hƣớng công nghệ đáng đƣợc quan tâm. Tuy nhiên đây là một lĩnh vực còn rất mới mẻ ở Việt Nam. Đã có một vài công trình nghiên cứu liên quan đến lĩnh vực này đạt đƣợc một số kết quả trong việc sử dụng chất hấp thu sinh học để xử lý ô nhiễm Cr, Ni, và Pb trong nƣớc thải công nghiệp. Thử nghiệm cố định tế bào tảo Spirulina platensis trên các chất mang khác, xây dựng đƣợc phƣơng pháp cố định tế bào vi tảo trên các chất mang khác nhau nhƣ polyurethane, agar và carageenan. Tế bào tảo sau khi cố định vẫn có khả năng hoạt động sống bình thƣờng trong một thời gian dài. Sự hấp thu kim loại nặng phụ thuộc trạng thái của tảo khi đói dinh dƣỡng có khả năng hấp thu cao hơn. Nhƣ vậy triển vọng sử dụng sinh khối vi tảo sống hay chết, tự do hay cố định vào việc loại trừ kim loại nặng trong nƣớc thải là to lớn. 22 Trên cơ sở các thông tin đã nêu chúng ta có thể hình dung sơ đồ công nghệ xử lý ô nhiễm kim loại nặng trong nƣớc thải bằng cách sử dụng vi tảo nhƣ sau: Nƣớc thải sinh hoạt sau khi xử lý sinh học đƣợc tách bùn và dùng nhƣ là môi trƣờng để nuôi cấy tảo, sinh khối đƣợc tách ra và đem đi xử lý nhiệt hoặc đem đi cố định trong chất mang, sau đó sinh khối này đƣợc sử dụng nhƣ chất hấp phụ sinh học để thu nhận kim loại nặng. Nƣớc thải công nghiệp nặng có nồng độ kim loại cao và các chất độc sẽ đƣợc xử lý bằng các phƣơng pháp hóa lý trƣớc sau đó hoặc đƣợc trộn với nƣớc thải sinh hoạt đã xử lý và tiến hành nuôi cấy các chủng tảo đã chọn lọc trong hồ nuôi tảo hoặc cho tiếp xúc với chất hấp thụ sinh học làm từ sinh khối vi tảo trong bể hay cột hấp phụ. Sinh khối tảo sau khi thu hồi đƣợc xử lý theo chế độ xử lý bùn: phân giải yếm khí để tạo biogas hoặc làm khô rồi thiêu hủy nhiệt hoặc chôn lấp; còn nƣớc thải sau xử lý sẽ thải vào nguồn tiếp nhận nƣớc. Xử lý nhiệt Nƣớc thải sinh hoạt Xử lý sinh học Tách bùn Môi trƣờng nuôi cấy vi tảo Tách sinh khối Thải vào nguồn tiếp nhận nƣớc Hấp phụ sinh học Nuôi cấy tảo Xử lý bùn Thu hồi sinh khối tảo Phối trộn Xử lý hoá lý Nƣớc thải xử lý Nƣớc thải xử lý Nƣớc thải công nghiệp nặng (Kim loại và chất độc cao) Hấp phụ sinh học Cố định trong chất mang 23 Qua sơ đồ này chúng ta thấy việc sử dụng sinh khối vi tảo đã kết hợp xử lý cả nƣớc thải sinh hoạt và nƣớc thải công nghiệp chứa kim loại nặng. Sử dụng sinh khối vi tảo để loại bỏ kim loại nặng là một hƣớng công nghệ có nhiều tiềm năng. Tuy nhiên còn rất nhiều thách thức phải vƣợt qua để có thể hình thành và làm chủ đƣợc công nghệ này. Cần có nhiều sự quan tâm hơn nữa của các khoa học cũng nhƣ các nhà quản lý đối với lĩnh vực nghiên cứu đang còn mới mẻ này. 2.5.3. Ứng dụng trong y học Các yếu tố cấu tạo nên tảo lam gồm 75% là chất hữu cơ và 25% là khoáng chất. Vì thế tảo chứa các chất căn bản trong việc trị liệu. Hình 2.7. Các sản phẩm từ tảo trong y học [42,43] Các đặc tính trị bệnh của tảo rất nhiều nhƣ tái bổ sung nƣớc, muối khoáng và dinh dƣỡng cho cơ thể. Thời gian ngâm mình trong nƣớc tảo thƣờng kéo dài khoảng 20 phút. Ngoài ra ngƣời ta thƣờng dùng tảo lam dƣới dạng cao dán nóng đắp lên toàn cơ thể hay trên những vùng đặc biệt trong 30 phút. Trong các trƣờng hợp khác, ngƣời ta xoa bóp thân thể với dƣợc liệu là tảo, có tác dụng làm dịu làn da hoặc dùng cả trong việc mát xa mặt. Chất chiết từ tảo lam đƣợc dùng làm chất tá dƣợc bao viên thuốc, thuốc sủi hoặc thuốc viên nang 24 và cả những loại thuốc không tan trong dạ dày, chỉ phóng thích hoạt chất ở ruột non. Ngoài ra tảo lam còn đƣợc nghiên cứu làm thuốc cầm máu và sát trùng. Sau sự kiện này hàng loạt tập đoàn dƣợc phẩm thế giới đã nhảy vào phát triển tảo thành thuốc. Hiện nay loài tảo này đã đƣợc trồng ở nhiều nƣớc nhƣ Mỹ, Nhật, Thái Lan, Trung Quốc, Ấn Độ, Pháp, Nigiêria, Nam Phi, Kênya. 2.5.4. Ứng dụng trong mỹ phẩm Trong mỹ phẩm tảo lam làm phóng thích các hoạt chất tác động hiệu quả trong nƣớc tắm, trong kem xoa mặt và toàn thân nhờ hàm lƣợng magie và kali cao, là thành trì giúp cơ thể chống lại các khối u xơ ở cơ bắp. Chất chiết từ tảo còn đƣợc sử dụng trong một số sản phẩm nhƣ thuốc đắp, thuốc làm mặt nạ, kem hoặc để dùng tắm trong liệu pháp biển. Hình 2.8. Các sản phẩm từ tảo trong mỹ phẩm [39,40] 2.6. Kỹ thuật sản xuất nƣớc giải khát 2.6.1 Khái niệm về nƣớc giải khát: Nƣớc giải khát là nƣớc uống đóng chai hoặc đồ uống đƣợc pha chế từ nƣớc với các chất có nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng hợp. 25 2.6.2 Quy trình sản xuất nƣớc giải khát: 2.6.2.1 Nguyên liệu: Nƣớc: là nguyên liệu chính trong sản xuất nƣớc giải khát, vì vậy các tiêu chuẩn cho nƣớc đƣợc tuân thủ nghiêm ngặt. Đƣờng saccharose hoặc glucose : lựa chọn loại đƣờng khi đƣa vào cơ thể dễ hấp thu, mặt khác dễ hoà tan. Chất bảo quản: Muối benzoat, axit benzoit có tác dụng ức chế hoặc khử hoạt tính của enzym, làm ngừng các quá trình trao đổi chất trong tế bào vi sinh. Phá vỡ tế bào Saccharose Nƣớc Axit Citric Nấu syrup Làm nguội Lọc Chất bảo quản, hƣơng liệu chất còn lại Cặn Thu dịch lọc Phối trộn Xử lý hoàn thiện Thanh trùng Sản phẩm Bài khí Rót chai Phá vỡ tế bào Spirulina Ly tâm, lọc 26 Axit citric: dùng để điều chỉnh pH và tạo vị. Ngoài ra còn có tác dụng nhƣ một chất xúc tác cho quá trình nghịch đảo đƣờng tạo đƣờng khử, tăng độ ngọt và chống sự kết tinh. 2.6.2.2 Diễn giải quy trình công nghệ: - Hoà tan đƣờng: Đƣờng trƣớc khi đƣa vào nƣớc uống phải đƣợc hoà tan bằng hệ thống khuấy sục để tạo thành dung dịch syrup, nhiệt độ của dịch syrup từ 50 – 600C nấu trong thời gian 20 – 30 phút nhằm tránh hiện tƣợng lại đƣờng. - Lọc syrup: Sử dụng lọc thô hoặc lọc tinh nhằm tách các tạp chất. - Phá vỡ tế bào Spirulina: Sinh khối Spirulina đƣợc phá vỡ bằng phƣơng pháp sốc nhiệt (PPVL) hoặc thẩm tích (PPKT) nhằm thu đƣợc lƣợng dịch chứa hàm lƣợng protein tối đa. - Phối trộn: Các thành phần sẽ đƣợc đƣa vào phối trộn và bổ sung chất phụ gia, sử dụng thiết bị phối trộn cơ học, nhiệt độ trong quá trình phối trộn 50 – 60 0 C. - Thanh trùng: Dung dịch đƣợc đƣa vào thanh trùng ở nhiệt độ 500C trong thời gian 30 phút. - Bài khí: Hạn chế ảnh hƣởng xấu đến sản phẩm trong quá trình bảo quản, làm tăng hiệu quả truyền nhiệt. - Rót chai: Sản phẩm sẽ đƣợc đƣa vào máy rót chai, đóng nắp tự động. 27 2.6.3. Kỹ thuật sản xuất nƣớc khoáng Vĩnh Hảo Sơ đồ: Sản xuất nước khoáng Vĩnh Hảo. 2.6.4. Kỹ thuật sản xuất nƣớc tinh khiết Nƣớc tinh khiết đƣợc khai thác từ nguồn nƣớc ngầm, đảm bảo độ tinh khiết nhờ đƣợc xử lý qua hệ thống thẩm thấu ngƣợc và ozon. Thanh trùng bằng tia cực tím. 2.6.5. Kỹ thuật sản xuất rƣợu trái cây Hỗn hợp trái cây đƣợc cho phối trộn với đƣờng và ủ ở nhiệt độ bình thƣờng. Sau 10 – 15 ngày lên men tạo sản phẩm rƣợu. Bơm trực tiếp nƣớc từ nguồn Lọc tinh Chiết rút Chuyển vào nhà máy Lọc thô Chai Khử trùng Súc rửa Sấy Đóng chai Dán nhãn Thành phẩm Kiểm tra chất lƣợng 28 Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài 3.1.1. Thời gian: Từ 4/2007 – 8/2007. 3.1.2. Địa điểm: Chi cục Đo lƣờng Tiêu chuẩn Chất lƣợng tỉnh Bình Thuận, đƣờng Nguyễn Hội, Tp.Phan Thiết 3.2. Nguồn cung cấp nguyên liệu Nguồn sinh khối vi khuẩn lam Spirulina platensis đƣợc sản xuất bởi sản phẩm thƣơng mại của Công ty Vĩnh Hảo. 3.3. Đối tƣợng nghiên cứu - Đối tƣợng nghiên cứu: Vi khuẩn lam Spirulina Platensis. - Đối tƣợng thử nghiệm: Nƣớc khoáng, nƣớc tinh khiết - Aquafina, rƣợu trái cây. 3.4. Vật liệu 3.4.1. Thiết bị - Máy cất đạm. - Ống chuẩn độ. - Lò nung. - Lò siêu âm. - Tủ hút. - Tủ sấy. - Nồi hấp khử trùng. - Máy đo OD. - Cân điện tử. - Máy lắc. 29 3.4.2. Hoá chất - Axit H2SO4 đậm đặc, axit ascorbic, axit nitric. - Muối Na2CO3, CuSO4. - Hỗn hợp thuốc thử methyl đỏ và xanh. - Hỗn hợp xúc tác CuSO4/K2SO4, nƣớc cất, NaOH, thuốc thử Folin. 3.5. Các phƣơng pháp phân tích [1,2,3,4,5,6,7,8,9] 3.5.1. Phƣơng pháp xác định protein bằng phƣơng pháp Kjeldahl 3.5.1.1. Nguyên tắc Dƣới tác dụng của H2SO4 đặc ở nhiệt độ cao, các hợp chất chứa nitơ bị phân huỷ và bị oxi hoá đến CO2 và H2O, còn nitơ chuyển thành amoniac (NH3) và tiếp tục kết hợp với H2SO4 tạo thành muối amoni sulfat. Quá trình đƣợc thực hiện theo các bƣớc sau Bƣớc 1: Vô cơ hoá nguyên liệu t o R – CH – COOH + H2SO4 CO2 + H2O + (NH4)2SO4 Chất xúc tác NH2 Bƣớc 2: Cất đạm Phản ứng xảy ra trong máy cất đạm (NH4)2SO4 + 2NaOH Na2SO4 + 2NH3 + 2H2O Phản ứng xảy ra trong bình hứng NH3 + H2SO4 (NH4)2SO4 + H2SO4dƣ Bƣớc 3: Chuẩn độ lƣợng H2SO4 còn thừa trong bình hứng bằng NaOH. 30 3.5.1.2. Quá trình thực hiện Hình 3.8. Máy cất đạm (A): Bình phát hơi nƣớc, (B): Hệ thống hút chất thử từ bình C sau khi đã cất xong thải ra ngoài, (C): Bình chứa chất thử đã vô cơ hóa (bình phản ứng), (D): Phễu cho chất thử đã vô cơ hóa và chất NaOH vào bình (C), (E): Ống sinh hàn, (F): Bình chuẩn độ, bình hứng NH3, (P2): Khóa dẫn nƣớc từ phễu D xuống bình C, (P1): Khóa dẫn nƣớc từ bình B thải ra ngoài. Quá trình thực hiện theo các bƣớc: Bƣớc 1: Vô cơ hoá nguyên liệu quá trình đƣợc tiến hành trong tủ hút để tránh khí độc SO2, CO2. Nếu mẫu ở dạng bột khô: Cân chính xác 0,2g nguyên liệu, dùng một ống giấy cuộn tròn cho mẫu cẩn thận vào tận đáy bình Kjeldahl, thêm vào vài giọt nƣớc cất vô đạm. Tiếp tục cho 0,2g hỗn hợp xúc tác K2SO4/CuSO4 và 5 ml H2SO4 đặc. Tiếp tục cho 0,2g hỗn hợp xúc tác K2SO4/CuSO4 và 5 ml H2SO4 đặc. Để nghiêng bình Kjeldahl trên bếp đặt trong tủ hút và đun từ khoảng 2 – 3 giờ. cho đến khi dung dịch trở nên trong suốt và có màu xanh da trời nhạt. Để 31 nguội. Chuyển dịch sang bình định mức 100 ml, tráng bình Kjeldahl nhiều lần bằng nƣớc cất vô đạm đến vạch định mức. Bƣớc 2: Cất đạm Rửa máy: Đun sôi bình A và mở nƣớc vào ống làm lạnh lúc khoá P1 và P2 đều đóng, sau đó cho vào phễu trong một ít nƣớc cất (khoảng 10 ml) và cho chảy xuống bình C bằng kẹp P2. Hơi nƣớc của bình A, sẽ từ từ qua erlen F, cứ để nhƣ vậy cho đến khi ở F có khoảng 5 ml nƣớc. Lấy đèn khỏi bình A, hơi nƣớc trong máy sẽ nguội lại, làm giảm áp suất ở A và B, do đó nƣớc trong bình C sẽ rút qua B. Khi nƣớc rút hết, thêm nƣớc vào phễu D và mở kẹp P2 cho nƣớc chảy vào C, kế đó nƣớc sẽ rút qua B. Ta có thể làm nhƣ vậy vài lần. Nếu nƣớc ở bình B đầy, mở kẹp P1 cho nƣớc rút đi. Khoá kẹp P1 và P2 đẩy bếp vào dƣới bình A. Chuẩn bị dung dịch ở bình hứng NH3 (bình F): cho vào bình hứng F (erlen 250 ml) 10 – 20 ml H2SO4 N/100 và ba giọt thuốc thử hỗn hợp thuốc thử methyl đỏ - methyl xanh, dung dịch có màu tím đỏ. Đặt bình hứng sao cho đầu mút của ống sinh hàn E ngập trong dung dịch H2SO4 N/100 của bình hứng. Quá trình lôi cuốn bằng hơi nƣớc: Lúc này bình A đang đƣợc đun sôi, kẹp P1 và P2 đóng. Đổ vào phễu D 10 ml dung dịch đạm đã vô cơ hoá và pha loãng, mở kẹp P2 để dung dịch này chảy từ từ xuống C, đóng P2 lại. Đổ nƣớc tráng vào bình D và cũng mở kẹp P2 thật nhẹ nhàng để nƣớc chảy từ từ xuống C từng giọt cho đến khi mực nƣớc trong D xuống gần sát đến kẹp P2 thì khoá P2 lại. Sau đó tráng D với một ít nƣớc cất và cũng mở kẹp P2 thật nhẹ nhàng để nƣớc chảy từ từ xuống C từng giọt cho đến khi mực nƣớc trong D xuống gần sát tới kẹp P2 thì khoá P2 lại. Rửa một lần nữa với thao tác tƣơng tự nhƣ trên. Thêm vào phễu D 10 ml NaOH đậm đặc. Mở khoá P2 từ từ để cho NaOH chảy xuống C từng giọt một. Nếu nƣớc trong C chảy mạnh quá thì khoá P2 lại, rồi tiếp tục cho chảy từ từ cho đến khi NaOH chảy gần hết xuống C. Tráng phễu D hai lần với một ít nƣớc cất. Nên nhớ chỉ cho nƣớc chảy xuống gần sát tới kẹp P2 mà thôi. 32 Tiếp tục lôi cuốn trong 5 phút, hạ erlen F xuống sao cho đầu mút của ống sinh hàn nằm trong không khí, đun tiếp 3 phút. Rửa đầu nhọn của ống làm lạnh E bằng một tia nƣớc của bình sịt. Lấy erlen F ra để định phân lƣợng thừa H2SO4. Đem đèn ra khỏi bình A, rửa sạch C (rửa máy) vài lần nhƣ đã hƣớng dẫn ở phần trên. Thực hiện hai lần thử không 3 lần thử thật Bƣớc 3: Chuẩn độ Lƣợng H2SO4 N/100 còn thừa trong bình F đƣợc chuẩn độ bằng NaOH N/100. Quá trình chuẩn độ kết thúc khi dung dịch chuyển từ tím đỏ sang xanh lá mạ. Xác định hệ số hiệu chỉnh k: lấy hai erlen, cho vào mỗi erlen 20 ml H2SO4 N/100 và vài giọt methyl đỏ - methyl xanh. Sau đó chuẩn độ bởi NaOH N/100 lấy giá trị trung bình của hai lần chuẩn độ. Hệ số hiệu chỉnh K sẽ đƣợc tính theo công thức: 20mlH2SO4 N/100 K = (1) VNaOH N/100 Tính kết quả Gọi Vo là trị số trung bình của 2 lần thử không Vt là trị số trung bình của 3 lần thử thật. Vậy ∆V = Vo – Vt là lƣợng NaOH tƣơng ứng với NH3 phóng thích bởi 10 ml dung dịch đạm đã vô cơ hoá và pha loãng là: ∆V x K = ∆V x K x 10-5 (mol) (2) 100 x 1000 Số gram đạm có trong 10 ml dung dịch đạm đã vô cơ hoá và pha loãng là: 14 x ∆V x K x 10-5 (g) 33 Số gram đạm có trong 100 ml dung dịch đạm vô cơ hoá là: 14 x ∆V x K x 10-5 x 100 = 14 x ∆V x K x 10-4 (g) (3) 10 Vậy: 14 x ∆V x K x 10-4 x 100 A = (4) m Trong đó: A: hàm lƣợng nitơ tổng số. m: lƣợng mẫu đem xác định protein Suy ra lƣợng protein (P) = A x 6,25 (5) 3.5.2 Phƣơng pháp xác định protein bằng phƣơng pháp Lowry 3.5.2.1. Nguyên tắc: Dựa vào cƣờng độ màu xanh của phức chất đồng protein khử hỗn hợp photphocolphramat để xác định protein. Phức chất màu xanh có độ hấp thu cực đại ở bƣớc sóng 750nm. Phƣơng pháp Lowry sử dụng phối hợp phản ứng Biure (tác dụng lên liên kết peptid) và phản ứng với thuốc thử folin để tạo phức màu đặc trƣng. Ngoài ra, cƣờng độ màu của phức chất có thể tăng lên trong môi trƣờng phản ứng có chứa muối amon, phenol, vòng imizadol pirimidin, axit uric, các ion kim loại hoặc cƣờng độ màu của phức chất có thể bị giảm khi có mặt etanol, aceton, TCA, axit pecloric. Vì vậy, để đạt cƣờng độ chính xác của dung dịch protein với thuốc thử folin đòi hỏi protein phải đƣợc tinh sạch. Phƣơng pháp Lowry có độ nhạy tƣơng đối cao, cho phép xác định dung dịch mẫu chứa vài chục gam protein. Tuy nhiên phƣơng pháp này không dùng để định lƣợng các protein không chứa các axit amin vòng thơm nhƣ gelatin. 34 3.5.2.2. Thực hành Cho vào ống nghiệm 1ml dung dịch mẫu thí nghiệm, tính toán sao cho khối lƣợng protein có trong dung dịch khoảng 0,02 – 0,2 mg/ml (20 µg – 200 µg) protein. Thêm vào ống nghiệm 4 ml dung dịch C, lắc đều, để yên trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó thêm 0,5 ml thuốc thử folin, lắc đều, để yên từ 30 – 90 phút, màu của phản ứng sẽ chuyển từ màu vàng sang màu xanh so màu trên máy quang phổ hoặc máy so màu ở bƣớc sóng 750 nm. Xác định trị số mật độ quang học của dung dịch nghiên cứu. Cần thực hiện một sự thử không: thay 1ml dung dịch mẫu thí nghiệm bằng 1ml nƣớc cất. Lập đồ thị chuẩn Chuẩn bị dung dịch protein chuẩn có các nồng độ: 0, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 µg/ml từ dung dịch albumin chuẩn 0,1% pha loãng với nƣớc cất theo các tỉ lệ khác nhau: Lấy 10 ống nghiệm, đánh số 1 – 10, cho vào đó các chất tham gia phản ứng nhƣ sau: Bảng 3.1. Chuẩn bị dung dịch protein chuẩn Ống số Protein 0,1% (ml) H2O (ml) Nồng độ protein (µg/ml) Dung dịch C (ml) Thuốc thử Folin (ml) OD 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 10 9,5 9,0 8,5 8,0 7,5 7,0 6,5 6,0 5,5 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 Khi cho các chất tham gia phản ứng vào các ống nhƣ: dung dịch C, thuốc thử folin phải theo trình tự và thao tác tƣơng tự nhƣ phần dung dịch mẫu thí 35 nghiệm ở trên. Xác định trị số mật độ quang của các ống, từ đó xây dựng đồ thị chuẩn. Tính kết quả Trị số mật độ quang của các ống chứng (từ ống 2 – 10) sau đi trừ đi trị số của ống thử không (ống 1) sẽ xây dựng đƣợc đồ thị chuẩn biễu diễn sự biến thiên của mật độ quang (∆OD) theo nồng độ protein chuẩn (µg/ml). Tƣơng tự vậy, trị số mật độ quang của mẫu thí nghiệm cũng trừ đi trị số mật độ quang của ống thử không, rồi chiếu vào đƣờng cong mẫu để suy ra lƣợng protein có trong dung dịch mẫu thí nghiệm (µg/ml). C x a x V x 100 Ta có: Protein (P) = (%) (6) m x 1000 Trong đó : C: lƣợng protein trong dịch mẫu thí nghiệm (µg/ml). a: hệ số pha loãng. V: thể tích pha loãng mẫu (ml). m: khối lƣợng mẫu thử (mg). 3.5.3. Phƣơng pháp xác định tro tổng số 3.5.3.1. Nguyên tắc Dùng sức nóng ( 550 – 600oC) nung cháy hoàn toàn các chất hữu cơ, phần còn lại đem cân và tính ra phần trăm tro có trong nguyên liệu. 3.5.3.2. Thực hành Nung chén sứ đã rửa sạch ở lò nung tới 550 – 600oC đến trọng lƣợng không đổi. Để nguội ở bình hút ẩm và cân (G). Cho thêm váo chén nung khoảng 5g mẫu (G). Cân trọng lƣợng chén có mẫu thử với độ chính xác nhƣ trên, thêm vào chén 5 giọt HNO3 đặm đặc và 1 – 2 giọt H2O2 30%. Cho vào lò nung và tăng nhiệt độ từ từ cho đến 50 – 600 o C. Nung cho 36 đến khi nguyên liệu biến thành tro trắng nhƣ tàn thuốc (thƣờng trong khoảng thời gian 5 – 6 giờ). Sau đó lấy chén sứ ra, cho ngay vào bình hút ẩm, để nguội và cân với độ chính xác nhƣ trên. Tiếp tục nung thêm ở nhiệt độ trên trong 30 phút rồi để nguội trong bình hút ẩm và cân tới trọng lƣợng không đổi. Kết quả giữa hai lần nung và cân liên tiếp không đƣợc cách nhau quá 0,0005g cho một gam mẫu thử. Xác định trọng lƣợng chén chứa nguyên liệu đã biến thàng tro trắng sau khi nung và cân đến trọng lƣợng không đổi (G2). Tính kết quả Tổng lƣợng tro đƣợc tính nhƣ sau : (G2 – G) Tổng lƣợng tro (%) = x 100 (%) (7) (G1 – G) Trong đó : G: trọng lƣợng của chén nung (mg) G1: trọng lƣợng của chén và trrọng lƣợng của mẫu thử (mg) G2 : trọng lƣợng của chén và trọng lƣợng của tro trắng sau khi đã nung và cân đến trọng lƣợng không đổi (mg). 3.5.4. Phƣơng pháp phân tích vi sinh 3.5.4.1. TPC Nguyên tắc: Để xác định số lƣợng vi sinh vật trong một đơn vị khối lƣợng thực phẩm bằng phƣơng pháp đếm số lƣợng khuẩn lạc phải qua quá trình đồng nhất, pha loãng mẫu thành các nồng độ xác định. Chuyển một thể tích xác định các độ pha loãng đã đồng nhất vào trong môi trƣờng nuôi cấy. Các khuẩn lạc đƣợc hình thành trong môi trƣờng sau khi ủ đƣợc xem nhƣ là chúng hình thành từ một tế bào đơn lẻ. Các đĩa môi trƣờng sau khi cấy mẫu đƣợc ủ ở điều kiện nhiệt độ 37oC/24 giờ. 37 3.5.4.2. Coliforms Nguyên tắc: Cấy một lƣợng mẫu xác định trên môi trƣờng thạch chọn lọc. Sau khi ủ ở 37oC/48 giờ, đếm số lƣợng khuẩn lạc Coliforms điển hình. Xác định lại bằng các phản ứng đặc trƣng. Môi trƣờng chọn lọc cho Coliforms là môi trƣờng chứa lactose, đây là nguồn carbon duy nhất, đồng thời trong môi trƣờng còn chứa muối mật là tác nhân chỉ thị chọn lọc cho vi khuẩn gram âm, chứa các tác nhân chỉ thị các dấu hiệu điển hình khi vi sinh vật trao đổi các thành phần trong môi trƣờng nuôi cấy. Khẳng định các dòng vi khuẩn cho hình dạng khuẩn lạc điển hình bằng môi trƣờng canh chọn lọc Brilliant green bile lactose. Xác định Coliform phân ở nhiệt độ 44oC/48 giờ. Số lƣợng Coiliform hay Coliform phân đƣợc xác định bằng số lƣợng khuẩn lạc điển hình đếm đƣợc, hệ số xác nhận và độ pha loãng mẫu trƣớc khi cấy vào đĩa. 3.5.4.3. E.coli Nguyên tắc: Phƣơng pháp này dùng để định tính và kết luận phát hiện hay không phát hiện E.coli trong một khối lƣợng mẫu xác định. Cấy mẫu vào môi trƣờng tăng sinh (BGBL), phân lập trên môi trƣờng phân lập (EMB) và khẳng định bằng các thử nghiệm sinh hoá phù hợp (nghiệm pháp IMViC). 3.5.4.4. Staphylococcus aureus Nguyên tắc: Cấy trang một lƣợng mẫu xác định trên bề mặt môi trƣờng thạch chọn lọc. Sau khi ủ, đếm số khuẩn lạc có những đặc điểm đặc trƣng và không đặc trƣng của Staphylococcus aureus. Xác nhận các khuẩn lạc đã đếm bằng phản ứng coagulase và các phản ứng đặc trƣng khác. Kết quả đƣợc xác định bằng số lƣợng khuẩn lạc đã đếm, thể tích cấy, độ pha loãng và hệ số xác nhận. 3.5.4.5. Salmonella Nguyên tắc: Để đạt hiệu quả cao, quy trình kiểm tra Salmonella bắt buộc phải qua giai đoạn tiền tăng sinh. Điều này cần thiết vì Salmonella thƣờng có mặt trong mẫu với số lƣợng nhỏ, bị tổn thƣơng nặng qua quá trình chế biến và sự tồn tại một số lƣợng lớn các loại vi khuẩn khác thuộc họ Enterobacteriaceae, các 38 dòng này cạnh tranh và ức chế sự phát triển của Salmonella. Bốn giai đoạn cần tiến hành để phát hiện Salmonella: tiền tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, phân lập và khẳng định. Việc khẳng định dựa trên các kết quả thử nghiệm sinh hoá phù hợp đặc trƣng cho Salmonella spp. 3.6. Phƣơng pháp phá vỡ tế bào 3.6.1. Phƣơng pháp vật lí Huyền phù tế bào đƣợc đông lạnh trong nƣớc đá. Sau đó nâng nhiệt một cách đột ngột ở 40oC, với phƣơng pháp này các tế bào bị trƣơng lên và vỡ ra do sự hình thành và tan ra của các tinh thể đá trong quá trình đông lạnh. Sơ đồ: Phá vỡ tế bào theo PPVL 3.6.2. Phƣơng pháp khuếch tán Tiến hành phá vỡ tế bào ở các nồng độ đƣờng 0,2%, 0,4%, 0,6%, 0,8%. 0,2%: 0,2g đƣờng trong 100 ml dung dịch + 0,2g tảo. 0,4%: 0,4g đƣờng trong 100 ml dung dịch + 0,2g tảo. 0,6%: 0,6g đƣờng trong 100 ml dung dịch + 0,2g tảo. 0,8%: 0,8g đƣờng trong 100 ml dung dịch + 0,2g tảo. Tủ đông Mẫu tảo Bổ sung 100ml nƣớc cất Lắc Bã Kiểm đạm Phân tích protein Thu dịch Lò siêu âm Lọc (ly tâm) Lấy ra 39 Sơ đồ: Phá vỡ tế bào theo PPKT. 3.7. Sơ đồ phƣơng pháp bổ sung 3.8. Phƣơng pháp cảm quan Sản phẩm thực phẩm phân tích cảm quan đƣợc cho điểm theo phƣơng pháp TCVN 3215 – 79. 3.9. Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên (Completely Randomized Design, CRD), một yếu tố, lặp lại 3 lần trong cùng một điều kiện thí nghiệm. Gồm hai nội dung - Nội dung 1: Không phá vỡ tế bào tảo. - Nội dung 2: Phá vỡ tế bào tảo. Chỉ tiêu theo dõi: Protein. Tro. Vi sinh. 3.10. Phƣơng pháp xử lý số liệu Số liệu đƣợc xử lý bằng phần mềm Statgraphics và phần mềm Excel. Bổ sung 100ml nƣớc cất Lắc đều Ủ 24h Lọc Thu dịch Kiểm protein Kiểm đạm Bã Tả o + Đ ư ờ ng Nƣớc giải khát Bổ sung dịch tảo PV Axit ascorbic 40 Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Thành phần dinh dƣỡng vi khuẩn lam Spirulina platensis 4.1.1. Xác định hàm lƣợng protein theo phƣơng pháp Kjeldahl 4.1.1.1. Xác định hàm lƣợng protein trong bột tảo khô Cân 0,2g bột tảo chứa trong giấy lọc không đạm, cuộn tròn giấy lọc chứa mẫu cho vào bình kenđan, thêm một ít nƣớc cất, cho thêm 0,2g hỗn hợp xúc tác CuSO4/K2SO4 vào bình, cho thêm 20 ml dung dịch H2SO4 đặm đặc, để yên 10 phút sau đó đặt lên bếp vô cơ hóa trong 3 giờ. Mẫu vô cơ đƣợc để nguội, tráng nhiều lần bằng nƣớc cất và chuyển sang bình cầu chứa hỗn hợp thuốc thử methyl đỏ - methyl xanh. Tiến hành chƣng cất cho đến khi dung dịch trong bình hứng có màu tím đỏ, sau đó chuẩn độ lại lƣợng H2SO4 N/100 đã dùng bằng NaOH N/100 với hỗn hợp thuốc thử nhƣ trên đến khi dung dịch có màu xanh lá mạ. Bảng 4.2. Hàm lượng protein trong bột tảo Khối lƣợng bột tảo (mg) Thể tích NaOH N/100 chuẩn độ (ml) Hàm lƣợng protein (%) 0,2000 13,72 60,03 0,2019 14,25 61,75 0,2042 14,45 61,91 Vậy từ Bảng 4.2 cho thấy hàm lƣợng protein trong tảo lam Spirulina platensis chiếm khoảng 60,03%. Kết quả phân tích này đƣợc sử dụng làm cơ sở để xác định lƣợng protein bổ sung vào nƣớc giải khát sau này và dựa vào kết quả này để đánh giá hiệu quả phá vỡ tế bào khi phá vỡ tế bào tảo bởi phƣơng pháp khuếch tán và phƣơng pháp vật lí. 41 4.1.1.2. Xác định hàm lƣợng protein trong bã tảo Cân 0,2g bột tảo, pha loãng trong 100 ml nƣớc cất, lắc đều, đem lọc, bã lọc đem phân tích protein. Quá trình phân tích đƣợc thực hiện tƣơng tự mục 4.1.1.1. Kết quả: ∆VNaOH = 1,938 ml, K = 1 và hàm lƣợng protein trong bã tảo đƣợc tính theo biểu thức (5) – mục 3.5.1.2. 14 x ∆V x K x 10-4 x 100 Hàm lƣợng nitơ tổng số = m 14 x 1,938 x 1 x 10 -4 x 100 = 0,2 = 1,357% Vậy hàm lƣợng protein trong bã tảo P = 6,25 x 1,357 = 8,48% Kết quả phân tích hàm lƣợng protein trong bã tảo nhằm mục đích để đánh giá hiệu suất phá vỡ tế bào trong mẫu tảo khi phá vỡ tế bào tảo bởi các phƣơng pháp khác nhau. 4.1.2. Xác định hàm lƣợng protein theo phƣơng pháp Lowry 4.1.2.1. Protein chuẩn Đƣờng chuẩn tƣơng quan giữa giá trị OD và hàm lƣợng protein là cơ sở để để định lƣợng hàm lƣợng protein trong mẫu tảo. Qui trình xây dựng đƣờng chuẩn protein đƣợc thể hiện ở mục 3.5.2.2. Kết quả quá trình xây dựng đƣờng chuẩn đƣợc thể hiện trên Bảng 4.3 và Biểu đồ 4.1. Giá trị OD càng cao thì hàm lƣợng protein trong mẫu tảo càng cao. 42 Bảng 4.3. Kết quả chỉ số OD tương ứng với nồng độ protein chuẩn Nồng độ protein µg/ml Chỉ số OD 0 0 50 0,144 100 0,235 150 0,320 200 0,400 250 0,456 300 0,520 350 0,590 400 0,647 450 0,728 y = 0.0015x + 0.0498 R 2 = 0.99 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0 100 200 300 400 500 Protein (µg/ml) O D (7 50 nm ) Biểu đồ 4.1. Đường chuẩn protein Từ kết quả xây dựng đƣờng chuẩn protein trên Bảng 4.3 và Biểu đồ 4.1 thu đƣợc các dữ liệu nhƣ sau: Phƣơng trình hồi qui: y = 0,0015x + 0.0498 Hệ số tƣơng quan: R = 0,99 Chỉ số R = 0,99 chứng tỏ sự hồi qui của các số liệu thực nghiệm trên đồ thị của phƣơng trình hồi qui tốt, mô hình toán học đƣợc thiết lập càng gần với bản chất của đối tƣợng đƣợc thử nghiệm – kết quả thu đƣợc đáng tin cậy hơn. 43 4.1.2.2. Hàm lƣợng protein trong dịch tảo Cân 0,2g bột tảo, pha loãng trong 100 ml nƣớc cất, lắc đều, đem lọc, hút 5 ml dịch lọc định mức lên 50 ml, từ 50 ml dịch lọc định mức này hút 1 ml vào ống nghiệm, thêm 4 ml dung dịch C, để yên trong 10 phút, thêm 0,5 ml thuốc thử Folin, để yên từ 30 – 90 phút, đến khi dung dịch mẫu có màu xanh. Tiến hành đo OD, kết quả đo OD đƣợc trình bày trong Bảng 4.4. Bảng 4.4. Giá trị OD - protein trong 0,2g bột tảo Khối lƣợng tảo (mg) Số lần lập lại Chỉ số OD 200 1 2 3 0,2420 0,2420 0,2430 Trung bình cộng 0,2423 Nồng Độ Protein y = 0.0015x + 0.0498 R 2 = 0.99 0 0.2423 0.4846 0.7269 0.9692 0 100 200 300 400 500 Protein (µg/ml) O D (7 50 nm ) Biểu Đồ 4.2. Nồng độ protein ứng với chỉ số OD xác định Từ giá trị OD trung bình trên Bảng 4.4 tham chiếu lên biểu đồ đƣờng chuẩn protein ta đƣợc nồng độ protein trong dung dịch mẫu thí nghiệm là 103,11 µg/ml (Biểu đồ 4.2). Hàm lƣợng protein trong mẫu tính theo tỉ lệ phần trăm là: 44 C x a x V x 100 103,11 x 10 x 100 x 100 Ta có: P = = m x 1000 200 x 1000 = 51,55% Kết quả phân tích hàm lƣợng protein trong bã tảo và dịch tảo trƣớc khi phá vỡ tế bào tảo là cơ sở để đánh giá hiệu suất phá vỡ tế bào trong mẫu tảo trƣớc khi phá vỡ tế bào tảo và sau khi phá vỡ tế bào tảo bởi các phƣơng pháp khác nhau. 4.1.3. Xác định hàm lƣợng tro tổng số trong bột tảo khô Tiến hành cân chén sứ (G), cho vào lò nung ở nhiệt độ 600-650oC/3 giờ, lấy ra cho vào bình hút ẩm rồi cân cho đến khi trọng lƣợng không đổi, cân mẫu tảo ở trọng lƣợng xác định (G1). Cho chén nung chứa mẫu vào lò nung, nung cho đến khi tảo biến thành tro trắng, lấy ra cho vào bình hút ẩm rồi cân đến trọng lƣợng không đổi (G2). Kết quả thu đƣợc thể hiện trên Bảng 4.5 và đƣợc tính theo biểu thức (7) – mục 3.5.3.2. Bảng 4.5. Hàm lượng tro theo phần trăm có trong tảo G (mg) m (mg) G1 (mg) (G + m) G2 (mg) Tổng lƣợng tro (%) 28.323 2.000 28.575 30.423 12,600 28.575 2.013 30.5879 28.836 12,949 29.932 2.016 31.9483 30.194 12,966 31.115 2.015 33.1294 31.376 12,961 32.071 2.029 34.0997 32.335 12,996 Quá trình xác định hàm lƣợng tro tổng số nhằm mục đích xác định hàm lƣợng muối khoáng có trong tảo Spirulina platensis. Do tro là thành phần còn lại của nguyên liệu khi đốt cháy hết các chất hữu cơ. 45 4.2. Nghiên cứu các phƣơng pháp phá vỡ tế bào 4.2.1. Đánh giá hiệu quả phá vỡ tế bào bằng cách xác định hàm lƣợng protein theo phƣơng pháp Kieldahl 4.2.1.1. Hàm lƣợng protein khi phá vỡ tế bào theo phƣơng pháp khuếch tán (PPKT) Tiến hành phá vỡ mẫu tảo bằng cách phối trộn với đƣờng ở các nồng độ đƣờng 0,2%, 0,4%, 0,6%, 0,8% và 200 mg tảo pha loãng trong 100 ml nƣớc cất, lắc đều, ủ 24 giờ ở nhiệt độ thƣờng. Mẫu ủ đƣợc lọc, bã lọc đem vô cơ, chƣng cất và chuẩn độ. Quá trình phân tích đƣợc thực hiện tƣơng tự mục 4.1.1.1. Ngoại trừ bƣớc vô cơ hóa 20 phút đầu khi đặt lên bếp vô cơ phải trực tiếp theo dõi, để tránh hiện tƣợng mẫu vô cơ bị phun trào làm hao hụt lƣợng protein, sự phun trào này là do sự hiện diện của đƣờng. Hàm lƣợng protein trong dịch thu đƣợc trình bày trong Bảng 4.6 và hàm lƣợng protein trong bã tảo đƣợc tính theo biểu thức (5) – mục 3.5.1.2. Bảng 4.6. Lượng protein trong bã tảo sau khi phá vỡ theo PPKT Nồng độ đƣờng ∆VNaOH (ml) Hàm lƣợng protein (%) 0,2 % 1,714 7,50 0,4 % 1,808 7,91 0,6 % 1,753 7,67 0,8 % 1,726 7,55 Kết quả phân tích hàm lƣợng protein trong bã tảo sau khi phá vỡ bằng phƣơng pháp khuếch tán nhằm mục đích để đánh giá hiệu suất phá vỡ tế bào trong mẫu tảo. 4.2.1.2. Hàm lƣợng protein khi phá vỡ tế bào theo phƣơng pháp vật lý (PPVL) Tiến hành phá vỡ mẫu tảo bằng cách ủ trong tủ đông ở các thời gian khác nhau 2 ngày, 5 ngày, 7 ngày, 10 ngày. Sau đó, sốc nhiệt bằng lò siêu âm, đem 46 lọc, bã lọc đem vô cơ, chƣng cất và chuẩn độ. Quá trình phân tích đƣợc thực hiện tƣơng tự mục 4.2.1.1. Kết quả thí nghiệm đƣợc thể hiện trên Bảng 4.7 và hàm lƣợng protein trong bã tảo đƣợc tính theo biểu thức (5) – mục 3.5.1.2. Bảng 4.7. Hàm lượng protein trong bã tảo sau khi phá vỡ bằng PPVL. Thời gian phá vỡ tế bào ∆VNaOH (ml) Hàm lƣợng protein (%) 2 ngày 1,703 7,45 5 ngày 1,723 7,54 7 ngày 1,723 7,54 10 ngày 1,751 7,66 Kết quả phân tích hàm lƣợng protein trong bã tảo sau khi phá vỡ bằng phƣơng pháp vật lí nhằm mục đích để so đánh giá hiệu suất phá vỡ tế bào trong mẫu tảo. Vậy kết quả thu nhận protein khi phá vỡ theo hai phƣơng pháp khuếch tán và vật lí đều thu đƣợc lƣợng protein hòa tan trong tảo Spirulina platensis. 4.2.2. Đánh giá hiệu quả phá vỡ tế bào bằng cách xác định hàm lƣợng protein theo kết quả thu nhận protein theo phƣơng pháp Lowry 4.2.2.1. Hàm lƣợng protein khi phá vỡ tế bào theo phƣơng pháp khuếch tán Tiến hành phá vỡ mẫu tảo bằng cách phối trộn với đƣờng ở các nồng độ đƣờng 0,2%, 0,4%, 0,6%, 0,8% pha loãng trong 100 ml nƣớc cất, lắc đều, ủ 24 giờ ở nhiệt độ thƣờng. Mẫu ủ đƣợc lọc, hút 5 ml dịch lọc định mức lên 50 ml, hút 1 ml vào ống nghiệm, thêm 4 ml dung dịch C, để yên trong 10 phút, thêm 0,5 ml dung dịch Folin để yên từ 30 – 90 phút, đến khi dung dịch mẫu có màu xanh. Tiến hành đo OD. Chỉ số đo OD đƣợc tham chiếu lên đƣờng chuẩn ở Biểu đồ 4.1. Kết quả hàm lƣợng protein thu nhận đƣợc từ sự phá vỡ tế bào theo PPKT đƣợc trình bày trên Bảng 4.8 và đƣợc tính theo biểu thức (6) - mục 3.5.2.2. 47 Nồng Độ Protein y = 0.0015x + 0.0498 R 2 = 0.99 0 0.2497 0.4994 0.7491 0.9988 0 100 200 300 400 500 Protein (µg/ml) O D (7 50 nm ) Nồng Độ Protein y = 0.0015x + 0.0498 R 2 = 0.99 0 0.2633 0.5266 0.7899 0 100 200 300 400 500 Protein (µg/ml) O D (7 50 nm ) a) b) Nồng Độ Protein y = 0.0015x + 0.0498 R 2 = 0.99 0 0.2553 0.5106 0.7659 1 0212 0 100 200 300 400 500 Protein (µg/ml) O D ( 7 5 0 n m ) Nồng Độ Protein y = 0.0015x + 0.0498 R 2 = 0.99 0 0.251 0.502 0.753 1.004 0 100 20 30 400 500 Protein (µg/ml) O D ( 7 5 0 n m ) c) d) Biểu Đồ 4.3. Nồng độ protein thu được tương ứng với hàm lượng đường sử dụng trong thí nghiệm a) Nồng độ protein ở 0,2 % đường,b) Nồng độ protein ở 0,4 % đường, c) Nồng độ protein ở 0,6 % đường, d) Nồng độ protein ở 0,8 % đường. 48 Bảng 4.8. Giá trị OD – protein trong dịch tảo phá vỡ theo nồng độ đường Mẫu phá vỡ ở nồng độ Chỉ số OD Trung bình cộng OD Hàm lƣợng P (%) 0,2 % đƣờng 0,248 0,250 0,251 0,2497 53,13 0,4 % đƣờng 0,263 0,263 0,264 0,2634 56,04 0,6 % đƣờng 0,255 0,255 0,256 0,2553 54,33 0,8 % đƣờng 0,251 0,251 0,251 0,2510 53,41 Nhận xét: Từ kết quả nhận đƣợc ở Biểu đồ 4.3 và Bảng 4.8 cho thấy hàm lƣợng protein thu đƣợc ở nồng độ 0,4% đƣờng là cao nhất. 4.2.2.2. Hàm lƣợng protein khi phá vỡ tế bào theo phƣơng pháp vật lý Tiến hành phá vỡ mẫu tảo bằng cách ủ trong tủ đông ở các thời gian khác nhau 2 ngày, 5 ngày, 7 ngày, 10 ngày. Sau đó, sốc nhiệt bằng lò siêu âm, đem lọc, hút 5 ml dịch lọc định mức lên 50 ml, hút 1ml vào ống nghiệm, thêm 4 ml dung dịch C, để yên trong 10 phút, thêm 0,5 ml dung dịch Folin để yên từ 30 - 90 phút, đến khi dung dịch mẫu có màu xanh. Tiến hành đo OD. Chỉ số đo OD đƣợc tham chiếu lên đƣờng chuẩn ở biểu đồ 4.1. Kết quả hàm lƣợng protein thu nhận đƣợc từ sự phá vỡ tế bào theo PPVL đƣợc trình bày trên Bảng 4.9 và tính theo biểu thức (6) - mục 3.5.2.2. 49 Nồng Độ Protein y = 0.0015x + 0.0498 R 2 = 0.99 0 0.2477 0.4954 0.7431 0.9908 0 100 200 300 400 500 Protein (µg/ml) O D (7 50 nm ) Nồng Độ Protein y = 0.0015x + 0.0498 R 2 = 0.99 0 0.2507 0.5014 0.7521 1.0028 0 100 200 300 400 500 Protein (µg/ml) O D ( 7 5 0 n m ) a) b) Nồng Độ Protein y = 0.0015x + 0.0498 R 2 = 0.99 0 0.2507 0.5014 0.7521 1 0028 0 100 200 300 400 500 Protein (µg/ml) O D ( 7 5 0 n m ) Nồng Độ Protein y = 0.0015x + 0.0498 R 2 = 0.99 0 0.255 0.51 0.765 1.02 0 100 200 300 400 500 Protein (µg/ml) O D ( 7 5 0 n m ) c) d) Biểu Đồ 4.4. Nồng độ protein ứng với OD xác định: a) Nồng độ protein trong 2 ngày, b) Nồng độ protein trong 5 ngày, c) Nồng độ protein trong 7 ngày, d) Nồng độ protein trong 10 ngày. 50 Bảng 4.9. Giá trị OD – protein trong dịch tảo phá vỡ theo PPVL Mẫu phá vỡ ở thời gian Chỉ số OD Trung bình cộng OD Hàm lƣợng P (%) 2 ngày 0,247 0,248 0,248 0,2477 52,71 5 ngày 0,250 0,251 0,251 0,2507 53,33 7 ngày 0,250 0,251 0,251 0,2507 53,32 10 ngày 0,255 0,255 0,255 0,2550 54,25 Nhận xét: Từ kết quả nhận đƣợc ở Biểu đồ 4.4 và Bảng 4.9 cho thấy hàm lƣợng protein thu đƣợc trong thời gian 10 ngày là cao nhất. Vậy theo phƣơng pháp Kjeldahl chúng ta có thể xác định đƣợc hàm lƣợng protein trong bột tảo, bã tảo và cả dịch tảo. Nhƣng để kết quả đƣợc đồng nhất trong cùng một thời gian thí nghiệm, trong cùng một mẫu sử dụng, cần phải sử dụng phƣơng pháp Lowry để xác định hàm lƣợng protein trong dịch tảo. Từ tổng hàm lƣợng protein của dịch tảo đƣợc xác định theo phƣơng pháp Lowry và bã tảo theo phƣơng pháp Kjeldahl so sánh với hàm lƣợng protein trong bột tảo nguyên đƣợc xác định theo phƣơng pháp Kjeldahl, nếu hai giá trị đồng nhất hoặc mức độ sai số chỉ khoảng ± 0,1 thì kết quả đáng tin cậy. Đây là cơ sở để đánh giá hiệu suất phá vỡ tế bào theo phƣơng pháp khuếch tán và theo phƣơng pháp vật lí. 51 4.3. So sánh kết quả protein 4.3.1. Hàm lƣợng protein trong mẫu tảo trƣớc phá vỡ và sau khi phá vỡ tế bào Bảng 4.10. Hàm lượng protein trong các mẫu tảo khác nhau. Mẫu Nghiệm thức Chỉ số OD trung bình Hàm lƣợng protein (%) Bột tảo T0 0,2423a 51,55 0,2% đƣờng T1 0,2497c 53,13 0,4% đƣờng T2 0,2634f 56,04 0,6% đƣờng T3 0,2553e 54,33 0,8% đƣờng T4 0,2510d 53,41 2 ngày T5 0,2477b 52,71 5 ngày T6 0,2507cd 53,33 7 ngày T7 0,2507cd 53,33 10 ngày T8 0,2550e 54,25 Ghi chú: : Trong cùng một cột, các giá trị trung bình có kí tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê, T0: không phá vỡ tế bào mẫu, T1 – T8: phá vỡ tế bào mẫu 52 51,55% 53,13% 56,04% 54,33% 53,41% 52,71% 53,33% 54,25% 49 50 51 52 53 54 55 56 57 T0 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 Nghiệm thức H àm lư ợn g pr ot ei n (% ) Biểu đồ 4.5. Hàm lượng protein trong mẫu tảo trước và sau khi phá vỡ. Qua Bảng 4.10 và Biểu đồ 4.5 cho thấy giữa các nghiệm thức có sự khác biệt về mặt thống kê (phụ lục 1). Hàm lƣợng protein thu đƣợc trong dịch tảo khi phá vỡ tế bào bằng phƣơng pháp vật lý hay phƣơng pháp thẩm thấu đều cho giá trị tƣơng đƣơng hay cao hơn so với trong bột tảo nguyên. Kết quả này cho phép kết luận rằng các phƣơng pháp trên có khả năng phá tế bào tảo hoàn toàn. 53 4.3.2. Hàm lƣợng protein trong mẫu tảo khi phá vỡ tế bào tế bào theo nồng độ đƣờng và thời gian Bảng 4.11. Hàm lượng protein trong mẫu tảo Mẫu Nghiệm thức Chỉ số OD trung bình Hàm lƣợng protein (%) 0,2% đƣờng T1 0,2497b 53,13 0,4% đƣờng T1 0,2634b 56,04 0,6% đƣờng T1 0,2553b 54,33 0,8% đƣờng T1 0,2510b 53,41 2 ngày T2 0,2477a 52,71 5 ngày T2 0,2507a 53,33 7 ngày T2 0,2507a 53,32 10 ngày T2 0,2550a 54,25 Ghi chú: Trong cùng một cột, các giá trị trung bình có kí tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê, T1: phá vỡ tế bào mẫu theo nồng độ đường, T2: phá vỡ tế bào mẫu theo thời gian. Qua Bảng 4.11 cho thấy giữa các nghiệm thức có sự khác biệt về mặt thống kê (phụ lục 2). Nhận xét: Từ Bảng 4.11 cho thấy phá vỡ tế bào tảo theo phƣơng pháp khuếch tán sẽ cho hàm lƣợng protein cao hơn so với phƣơng pháp vật lí. 54 4.3.3. Hàm lƣợng protein trong mẫu tảo khi phá vỡ theo các nồng độ đƣờng khác nhau (PPKT) Bảng 4.12. Hàm lượng protein trong mẫu tảo Mẫu Nghiệm thức Chỉ số OD trung bình Hàm lƣợng protein (%) 0,2% đƣờng T1 0,2497a 53,13 0,4% đƣờng T2 0,2634c 56,04 0,6% đƣờng T3 0,2553b 54,33 0,8% đƣờng T4 0,2510a 53,41 Ghi chú: Trong cùng một cột, các giá trị trung bình có kí tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê, T1: phá vỡ tế bào mẫu theo nồng độ 0,2% đường, T2: phá vỡ tế bào mẫu theo nồng độ 0,4% đường, T3: phá vỡ tế bào mẫu theo nồng độ 0,6% đường, T4: phá vỡ tế bào mẫu theo nồng độ 0,8% đường. Qua Bảng 4.12 cho thấy giữa các nghiệm thức có sự khác biệt về mặt thống kê (phụ lục 3). Trong đó hàm lƣợng protein trong dịch tảo cao nhất là ở nồng độ đƣờng 0,4%. Vậy theo PPKT nồng độ đƣờng 0,4 % là nồng độ thích hợp nhất để cho hàm lƣợng protein cao nhất. 55 4.3.4. . Hàm lƣợng protein trong mẫu tảo khi phá vỡ theo các thời gian khác nhau (PPVL) Bảng 4.13. Hàm lượng protein trong mẫu tảo Mẫu Nghiệm thức Chỉ số OD trung bình Hàm lƣợng protein (%) 2 ngày T1 0,2477a 52,71 5 ngày T2 0,2507b 53,33 7 ngày T3 0,2507b 53,32 10 ngày T4 0,2550c 54,25 Ghi chú: Trong cùng một cột, các giá trị trung bình có kí tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê, T1: phá vỡ tế bào mẫu theo thời gian 2 ngày, T2: phá vỡ tế bào mẫu theo thời gian 5 ngày, T3: phá vỡ tế bào mẫu theo thời gian 7 ngày, T4: phá vỡ tế bào mẫu theo thời gian 10 ngày. Qua Bảng 4.13 cho thấy giữa các nghiệm thức có sự khác biệt về mặt thống kê (phụ lục 4). Trong đó hàm lƣợng protein trong dịch tảo cao nhất là ở thời gian 10 ngày. Tất cả các kết quả so sánh protein đều đƣợc xử lý trên phần mềm Statgraphics. 4.4. Kết quả phân tích vi sinh Đồng thời với đánh giá cảm quan, chúng tôi tiến hành phân tích vi sinh trong sản phẩm: nƣớc khoáng Vĩnh Hảo, nƣớc tinh khiết và rƣợu trái cây. Mỗi sản phẩm thử nghiệm ba lần, trên một nồng độ, mỗi nồng độ lặp lại trên ba đĩa. Mẫu đƣợc phân tích tại phòng thử nghiệm vi sinh Chi cục Đo lƣờng Tiêu chuẩn Chất lƣợng tỉnh Bình Thuận Cân 25g bột tảo vào trong bao PE, thêm vào dung dịch pha loãng mẫu Buffered Pepton Water, đồng nhất mẫu và tiến hành qui trình phân tích Salmonella. Đồng thời cân 10g bột tảo vào một bao PE khác, thêm dung dịch pha loãng mẫu SPW để đạt đến 100g, đồng nhất để đƣợc nồng độ pha loãng 10-1. 56 Mẫu này đƣợc dùng để phân tích tổng vi sinh vật hiếu khí (TPC), E. coli, Coliforms và S. aureus. Kết quả sau khi phân tích đƣợc trình bày trên Bảng 4.14. Bảng 4.14. Kết quả phân tích vi sinh các sản phẩm nghiên cứu Mẫu TPC (CFU/g) Coliforms (CFU/g) E.coli S. aureus (CFU/g) Salmonella Bột tảo 0 0 - 0 - Nƣớc uống Vĩnh Hảo 0 0 - 0 - Aquafina 0 0 - 0 - Rƣợu trái cây 30 0 - 0 - Ghi chú: (-): không có sự hiện diện của vi sinh vật Từ Bảng 4.14 cho thấy sinh khối tảo, nƣớc uống Vĩnh Hảo và nƣớc tinh khiết không có sự hiện của các vi sinh vật đƣợc khảo sát, rƣợu trái cây có sự hiện diện của TPC. Chứng tỏ các sản phẩm làm nền đảm bảo an toàn về mặt vi sinh 4.5. Hiệu suất phá vỡ tế bào tảo Spirulina platensis Từ các kết quả phân tích lƣợng protein trong dịch lọc và trong bã tảo chúng tôi tiến hành đánh giá hiệu quả của các phƣơng pháp phá màng tế bào tảo và thu hồi hàm lƣợng protein. Kết quả đƣợc tổng hợp trong Bảng 4.15. 57 Bảng 4.15. Hiệu suất phá vỡ tế bào và thu hồi protein trong tảo Mẫu Nghiệm thức Hàm lƣợng P bã lọc Hàm lƣợng P dịch lọc Tổng (%) Hiệu suất phá vỡ (%) Dịch tảo T0 8,48 51,55 60,03 PPKT 0,2% đƣờng T1 7,50 53,13 60,63 88,4 0,4% đƣờng T2 7,91 56,04 63,95 93,3 0,6% đƣờng T3 7,67 54,33 62,00 90,4 0,8% đƣờng T4 7,55 53,41 60,96 89,0 PPVL 2 ngày T5 7,45 52,71 60,16 87,9 5 ngày T6 7,54 53,33 60,87 88,9 7 ngày T7 7,54 53,33 60,87 88,9 10 ngày T8 7,66 54,25 61,91 90,3 90,3% 88,9% 87,9% 89% 90,4% 93,3% 88,4% 85 86 87 88 89 90 1 92 93 94 T0 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 Nghiệm thức H iệ u su ất p há v ỡ tế b ào Biểu đồ 4.6. Hiệu suất phá vỡ tế bào giữa PPKT và PPVL. 58 Kết quả trên Bảng 4.15 cho thấy hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch sau khi phá tế bào đạt cao nhất là 56,04 % khi phá vỡ tế bào tảo bằng phƣơng pháp khuếch tán. Phuơng pháp này đơn giản, chi phí thấp. Theo chúng tôi đây là phƣơng pháp khá hiệu quả để thu protein hòa tan dùng để bổ sung vào trong các sản phẩm nƣớc uống sau này Nhận xét: Mỗi phƣơng pháp phá vỡ tế bào tảo Spirulina pltensis đều làm tăng lƣợng protein hòa tan, trong đó hiệu suất phá vỡ tế bào cao nhất là ở nồng độ hòa tan 0,4 % đƣờng (Bảng 4.15). 4.6. Nghiên cứu chọn tỉ lệ bổ sung vi khuẩn lam Spirulina platensis Chúng tôi cùng với cán bộ kỹ thuật của Chi cục Đo lƣờng Tiêu chuẩn Chất lƣợng tỉnh Bình Thuận tiến hành khảo sát nhiều tỉ lệ phối trộn vào các loại nƣớc uống và dịch tảo khác nhau. Sau khi khảo sát chúng tôi nhận thấy tỉ lệ thích hợp để bổ sung giữa nƣớc uống và dịch tảo là 17:1 là đảm bảo cho chất lƣợng sản phẩm về mặt phẩm cảm quan. Để đánh giá chất lƣợng của sản phẩm phối trộn này chúng tôi đã đánh giá chất lƣợng cảm quan và chất lƣợng về mặt vi sinh. Theo dõi chất lƣợng sản phẩm về mặt cảm quan: Chúng tôi tiến hành theo dõi sự biến đổi của sản phẩm sau 4 tuần. Kết quả đƣợc trình bày ở Bảng 4.16. Bảng 4.16. Chất lượng sản phẩm về mặt cảm quan. Thời gian Màu Mùi Vị Sau 1 ngày Đục hơn Mùi tảo Vị của các sản phẩm làm nền Sau 1 tuần Đục hơn Mùi tảo Vị của các sản phẩm làm nền Sau 2 tuần Trong hơn Mùi nhẹ hơn Vị chanh Sau 3 tuần Có sự thay đổi thêm một mức Sau 4 Tuần Trong Không mùi Vị chanh 59 Theo dõi chất lƣợng về mặt vi sinh: Các sản phẩm sau 4 tuần cho phối trộn với dịch tảo, đƣợc thử nghiệm vi sinh. Kết quả thử nghiệm đƣợc trình bày trong Bảng 4.17. Bảng 4.17. Chất lượng sản phẩm về mặt vi sinh. Mẫu TPC (CFU/g) Coliforms (CFU/g) E.coli S. aureus (CFU/g) Salmonella Vihaspi 0 0 - 0 - Aquaspi 0 0 - 0 - Spiwine 30 0 - 0 - Ghi chú: Vihaspi: là sản phẩm được tạo ra từ nước khoáng Vĩnh Hảo có bổ sung dịch tảo Spirulina platensis, Aquaspi: là sản phẩm được tạo ra từ nước tinh khiết Aquafina có bổ sung dịch tảo Spirulina platensis, Spiwine: là sản phẩm được tạo ra từ nước rượu trái cây có bổ sung dịch tảo Spirulina platensis Vậy kết quả thử nghiệm vi sinh sau khi bổ sung dịch tảo vào các sản phẩm làm nền so với trƣớc khi bổ sung dịch tảo không có sự khác biệt. Điều này chứng tỏ sự bổ sung dịch tảo vào các sản phẩm không làm thay đổi chất lƣợng sản phẩm về mặt vi sinh. 4.7. Đánh giá chất lƣợng sản phẩm Sau 4 tuần theo dõi chất lƣợng sản phẩm, kết quả thu đƣợc nhƣ sau: Chất lƣợng về mặt cảm quan: Màu: Màu tự nhiên của các sản phẩm làm nền. Mùi: Không mùi. Vị: Vị chanh. Chất lƣợng về mặt vi sinh: Không có sự hiện diện của các loài vi sinh vật có hại, đảm bảo an toàn cho ngƣời tiêu dùng về mặt vi sinh. Nhận xét: Sau các kết quả đánh giá chất lƣợng sản phẩm vế mặt vi sinh và cảm quan đều cho thấy sản phẩm đảm bảo về mặt vi sinh và cảm quan. 60 Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Từ các kết quả thử nghiệm trên cho phép rút ra kết luận nhƣ sau: Mẫu tảo phá vỡ tế bào giúp phá vỡ protein không hòa tan thành protein hòa tan. Trong phƣơng pháp phá vỡ mẫu bằng phƣơng pháp khuếch tán, thì ở nồng độ đƣờng 0,4% sẽ cho hiệu suất phá vỡ tế bào cao nhất. Trong phƣơng pháp phá vỡ tế bào bằng phƣơng pháp vật lí thì hiệu suất phá vỡ tế bào tỉ lệ thuận với thời gian xử lý. Trong đó phá vỡ ở thời gian 10 ngày cho hiệu suất phá vỡ cao nhất. Trong hai phƣơng pháp phá vỡ tế bào theo phƣơng pháp khuếch tán và theo phƣơng pháp vật lí thì phƣơng pháp khuếch tán cho hiệu suất phá vỡ tế bào cao hơn. Để đảm bảo về chất lƣợng sản phẩm, thì tỉ lệ bổ sung thích hợp nhất là 1:17 tức là tỉ lệ giữa dịch tảo và sản phẩm làm nền. 5.2. Đề nghị Do giới hạn về thời gian và điều kiện thí nghiệm nên chƣa hoàn chỉnh một số vấn đề trong nghiên cứu này. Nếu đề tài đƣợc tiếp tục, chúng tôi có các đề xuất sau: Thử nghiệm thêm các chỉ tiêu về các axit amin, các sắc tố và chất khoáng. Nghiên cứu thêm các phƣơng pháp phá vỡ tế bào khác để thu đƣợc lƣợng protein cao nhất có trong tảo. Nghiên cứu các phƣơng pháp khử mùi và khử màu tảo để có tỉ lệ bổ sung sinh khối tảo với một lƣợng lớn bổ sung vào thực phẩm. 61 Chƣơng 6 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1. Nguyễn Thành Đạt, 1996. Vi Simh Vật Học. Nhà Xuất bản Giáo Dục. 2. Nguyễn Tiến Dũng, 2006. Giáo trình Kiễm phẩm Tủ sách Trƣờng Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh. 3. Vƣơng Thị Việt Hoa, 2003. Giáo trình thực tập vi sinh thực phẩm. Tủ sách Trƣờng Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh. 4. Nguyễn Đức Lƣợng. Thí Nghiệm Công Nghệ sinh học Tập 1. Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh. 5. Lƣơng Đức Phẩm, 2002. Vi sinh vật học và an toàn vệ sinh thực phẩm. Nhà xuất bản Nông nghiệp – Hà Nội. 6. Lê Hữu Thƣớc, 1988. Tảo Spirulina - Nguồn dinh dưỡng và dược liệu quý. NXB KHKT Hà Nội. 7. Lê Ngọc Tú, 1999. Hóa học thực phẩm. Nhà xuất bản Khoa Học Kỹ Thuật Hà Nội. 8. Nguyễn Thị Ánh Tuyết. Kỹ thuật sinh hóa. Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh. 9. Lê Bạch Tuyết, 1996. Các quá trình Công nghệ cơ bản trong sản phẩm. Nhà xuất bản Giáo Dục. TIẾNG ANH 10. Golbeck. J. H, 1994. The Molecular Biology of Cyanobacteria (Bryant, D. A., ed.) 11. Mahasin G.Tadros. Characterization of Spirulina Biomass for Celss Diet Potential – 11/1988 12. Schmetterer. G, 1994. The Molecular Biology of Cyanobacteria (Bryant, D. A., ed.) Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, pp. 409-435. 62 TÀI LIỆU TRÊN MẠNG 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. &cat_id=1 24. 25. ảo_xoắn - 35k 26. - 34k 27. =10565 28. 29. 30. - 77k 31. 32. www20.24h.com.vn/news.php/62/157533 - 131k 33. www.nea.gov.vn/thongtinmt/noidung/vnn1_25_4_04.htm - 14k 34. www.webtretho.com/forum/archive/index.php/t-27258.htm 35. www.vnfa.com/bqsk/sk_rxoc.html 36. www.austrapharmvn.com/vietnam/product.php?mode=detail&id=33 - 33k 37. www.vnn.vn/khoahoc/tintuc/2004/05/135084/ - 13k 38. microbewiki.kenyon.edu/index.php/Spirulina 63 39. www.markastore.ro/os/catalog/catalog/popup_im... 40. www.terapeut.ro/commerce/crema-antirid-coenzi... 41. www.scielo.br/scielo.php?pid=S0104-6632200600... 42. www.shop-spirulina.com/.../190?osCsid=179400117 43. e-shop.herbalcreations.gr/catalog/product_inf... 44. www.thanhnien.com.vn/Suckhoe/2005/7/26/116925.tno 45. www.nea.gov.vn/tapchi/Toanvan/05-2k1-24.htm 64 PHỤ LỤC: Kết quả xử lí số liệu. Phụ Lục 1. Khảo sát sự khác biệt hàm lƣợng protein khi không phá vỡ và phá vỡ tế bào mẫu tảo theo nồng độ đƣờng và theo thời gian. 1.1. Bảng ANOVA One-Way Analysis of Variance -------------------------------------------------------------------------------- Data: H.p Level codes: H.nt Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- Between groups 8.10519E-004 8 1.01315E-004 210.423 .0000 Within groups 8.66667E-006 18 4.81481E-007 -------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 8.19185E-004 26 0 missing value(s) have been excluded. 65 1.2. Trắc nghiệm LSD giữa các nghiệm thức Multiple range analysis for H.p by H.nt -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 0 3 .2423333 X 5 3 .2476667 X 1 3 .2496667 X 6 3 .2506667 XX 7 3 .2506667 XX 4 3 .2510000 X 8 3 .2550000 X 3 3 .2553333 X 2 3 .2633333 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference limits 0 - 1 -0.00733 0.00119 * 0 - 2 -0.02100 0.00119 * 0 - 3 -0.01300 0.00119 * 0 - 4 -0.00867 0.00119 * * denotes a statistically significant difference. 66 Phụ lục 2. Khảo sát sự khác biệt hàm lƣợng protein khi phá vỡ tế bào mẫu tảo theo n