Khóa luận Nghiên cứu kỹ thuật vi ghép cây bưởi (citrus grandis)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT VI GHÉP CÂY BƢỞI (Citrus grandis) Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khoá: 2001-2005 Sinh viên thực hiện: HÀ THANH VÕ Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2005 ii BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT VI GHÉP CÂY BƢỞI (Citrus grandis) Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khoá: 2001-2005 Sinh viên thực hiện: HÀ THANH VÕ Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2005 iii LỜI CẢM TẠ Tôi xin chân thành cảm tạ:  Ban Giám Hiệu trƣờng Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh.  Ban chủ nhiệm Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tại trƣờng.  TS Trần Thị Dung đã hết lòng hƣớng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp.  KS Trần Ngọc Tống đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực tập tốt nghiệp.  Cử nhân Trần Thị Bích Chiêu, Kỹ sƣ Nguyễn Thị Thu Hằng, cử nhân Lƣu Phúc Lợi đã tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp.  Ông Nguyễn Văn Hòa, bác Ba Lắm, ông Phạm Văn Y cùng các nhà vƣờn đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp.  Các bạn bè thân yêu của lớp CNSH K27, các sinh viên đàn em K28, K29 đã giúp đỡ và chia sẻ cùng tôi những vui buồn trong thời gian học cũng nhƣ hết lòng hỗ trợ trong thời gian thực tập tốt nghiệp. iv TÓM TẮT HÀ THANH VÕ, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Tháng 9/2005. “NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT VI GHÉP CÂY BƢỞI (Citrus grandis)”. Giáo viên hƣớng dẫn: TS. TRẦN THỊ DUNG Ở nƣớc ta hiện nay dịch bệnh vẫn đang tiềm ẩn và khó phòng ngừa trên cây thuộc họ cam quýt. Đặc biệt là bệnh do nòi virus tristeza với tác nhân truyền bệnh do các loại côn trùng chích hút và bệnh vàng lá gân xanh do vi khuẩn Liberobacter asiaticum đã gây thiệt hại rất lớn cho các nhà vƣờn ở khắp nƣớc ta. Vì vậy, nhu cầu có đƣợc cây sạch virus và có khả năng kháng bệnh tốt là yêu cầu cần thiết phải làm của công tác giống. Đề tài đƣợc thực hiện trên đối tƣợng là các giống bƣởi khác nhau, bƣởi dùng làm gốc ghép gồm hai giống: bƣởi Xim Vang ở Đồng Nai và bƣởi Bồng ở Huế. Chồi ghép là các giống bƣởi khác nhau: bƣởi Năm Roi, bƣởi Da Xanh và bƣởi Đƣờng Lá Cam. Mỗi chồi ghép đƣợc ghép lên một loại gốc ghép và mỗi cặp gốc ghép và chồi ghép đƣợc ghép với ba kiểu ghép khác nhau (ghép chữ T ngƣợc (T), ghép mặt cắt (M), ghép hàm ếch (E)). Kết quả đạt đƣợc: Tỷ lệ sống của gốc ghép là bƣởi Bồng (77,03%) cao hơn tỷ lệ sống của gốc ghép là bƣởi Xim Vang (60%). Chồi ghép Năm Roi (77,78%) và Da Xanh (72,22%) cho tỷ lệ sống cao hơn chồi ghép là bƣởi Đƣờng Lá Cam (55,55%). Cách ghép hàm ếch (E) cho tỷ lệ sống 75.55% tƣơng đồng với cách ghép chữ T ngƣợc (71,11%) và cao hơn với cách ghép mặt cắt (58,89%). Tỷ lệ sống của các cây ghép có gốc ghép là bƣởi Bồng, chồi ghép Năm Roi và cách ghép chữ T ngƣợc tƣơng đồng với cây ghép có gốc ghép là bƣởi Bồng, chồi ghép Da Xanh và cách ghép hàm ếch và đạt cao nhất (93,33%) so với các loại cây ghép còn lại. v MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang tựa Lời cảm tạ .......................................................................................................................... iii Tóm tắt ............................................................................................................................... iv Mục lục ...............................................................................................................................v Danh sách các chữ viết tắt ............................................................................................... viii Danh sách các hình .............................................................................................................x Danh sách các bảng .......................................................................................................... xii Danh sách các biểu đồ ...................................................................................................... xiii 1. GIỚI THIỆU ...................................................................................................................1 1.1 Đặt vấn đề .....................................................................................................................1 1.2 Mục đích - yêu cầu .......................................................................................................1 1.2.1 Mục đích ............................................................................................................1 1.2.2 Yêu cầu .............................................................................................................1 1.3 Đối tƣợng nghiên cứu ...................................................................................................2 1.4 Phạm vi nghiên cứu ......................................................................................................2 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...............................................................................................3 2.1 Giới thiệu về cây bƣởi ..................................................................................................3 2.1.1 Nguồn gốc và phân loại .................................................................................... 3 2.1.1.1 Nguồn gốc ..............................................................................................3 2.1.1.2 Phân loại ................................................................................................4 2.1.2 Đặc điểm hình thái của cây bƣởi .......................................................................4 2.1.3 Các giống bƣởi dùng trong thí nghiệm .............................................................6 3.1.3.1 Các giống bƣởi dùng làm chồi ghép ......................................................6 3.1.3.2 Các giống bƣởi dùng làm gốc ghép .......................................................7 2.2 Các loại bệnh virus và môi giới truyền bệnh trên cây thuộc họ cam quýt ...................8 2.2.1 Các loại bệnh do virus .......................................................................................8 2.2.1.1 Citrus Tristeza virus (CTV) ...................................................................8 vi 2.2.1.2 Citrus tatter leaf virus ( CTLV) .............................................................9 2.2.1.3 Citrus exocortis virus (CEV) ................................................................10 2.2.2 Môi giới truyền bệnh trên cây thuộc họ cam quýt ...........................................10 2.2.2.1 Rệp muội hại cây trồng .........................................................................10 2.2.2.2 Rệp sáp hại cây trồng ..........................................................................11 2.3 Các cách nhân giống của cây bƣởi ..............................................................................13 2.3.1 Nhân giống cổ điển ..........................................................................................13 2.3.1.1 Nhân giống bằng hạt .............................................................................13 2.3.1.2 Nhân giống bằng cách chiết cành .........................................................13 2.3.1.3 Nhân giống bằng cách giâm cành .........................................................14 2.2.1.4 Nhân giống bằng cách ghép ..................................................................15 2.3.2 Nhân giống bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô ...................................................19 2.3.2.1 Các yếu tố ảnh hƣởng đến vi ghép ........................................................20 2.3.2.2 Chuyển cây ra vƣờn ƣơm ......................................................................22 2.3.2.3 Lịch sử hình thành và phát triển nuôi cấy mô tế bào thực vật .............22 2.3.2.4 Một số kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật ..................................................23 2.4 Các nghiên cứu trong và ngoài nƣớc về kỹ thuật vi ghép ...........................................24 2.4.1 Nghiên cứu trong nƣớc .....................................................................................24 2.4.2 Nghiên cứu ngoài nƣớc ....................................................................................25 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................................28 3.1 Vật liệu ........................................................................................................................28 3.1.1 Trang thiết bị và dụng cụ .................................................................................28 3.1.1.1 Trang thiết bị .........................................................................................28 3.1.1.2 Dụng cụ .................................................................................................28 3.1.2 Mẫu cấy ............................................................................................................28 3.1.3 Môi trƣờng nuôi cấy .........................................................................................28 3.2 Điều kiện nuôi cấy .......................................................................................................29 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................................................30 3.3.1 Bố trí thí nghiệm ..............................................................................................30 3.3.2 Chỉ tiêu theo dõi ...............................................................................................31 3.3.3 Xử lý số liệu .....................................................................................................31 3.3.4 Quy trình thí nghiệm ........................................................................................31 vii 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................................................35 4.1 Tỷ lệ sống của cây vi ghép ..........................................................................................35 4.2 Khả năng hình thành chồi mới của cây vi ghép ..........................................................40 4.3 Chiều cao chồi của cây vi ghép ...................................................................................44 4.4 Số lá của cây vi ghép ...................................................................................................51 4.5 Nhận xét chung ............................................................................................................56 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ...........................................................................................57 5.1 Kết luận........................................................................................................................57 5.2 Đề nghị ........................................................................................................................57 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................................58 viii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT 2,4-D: 2,4 – Dichlorophenoxyacetic Acid B: Bồng BNR: Bƣởi Năm Roi B-NR-E:Gốc ghép bƣởi Bồng, chồi ghép Năm Roi và cách ghép hàm ếch. B-NR-T: Gốc ghép bƣởi Bồng, chồi ghép Năm Roi và cách ghép chữ T ngƣợc. B-NR-M: Gốc ghép bƣởi Bồng, chồi ghép Năm Roi và cách ghép mặt cắt. B-DX-E: Gốc ghép bƣởi Bồng, chồi ghép Da Xanh và cách ghép hàm ếch. B-DX-T: Gốc ghép bƣởi Bồng, chồi ghép Da Xanh và cách ghép chữ T ngƣợc. B-DX-M: Gốc ghép bƣởi Bồng, chồi ghép Da Xanh và cách ghép mặt cắt. B-ĐLC-E: Gốc ghép bƣởi Bồng, chồi ghép Đƣờng Lá Cam và cách ghép hàm ếch. B-ĐLC-T: Gốc ghép bƣởi Bồng, chồi ghép Đƣờng Lá Cam và cách ghép chữ T ngƣợc. B-ĐLC-M: Gốc ghép bƣởi Bồng, chồi ghép Đƣờng Lá Cam và cách ghép mặt cắt. CEV: Citrus exocortis virus CTLV: Citrus tatter leaf virus CTV: Citrus tristeza virus DF: Độ tự do DNA: Acid desoxyribonucleic DX: Da Xanh ĐLC: Đƣờng Lá Cam E: Cách ghép hàm ếch F: Fitted values (giá trị lý thuyết) FAO: Food and Agrculture Organization FFTC: Food and fertilizer technology center IAA: Indol-3-Acetic Acid IBA: Indole – 3 - Butyric Acid M: Cách ghép mặt cắt MS: Mean square ix Mt MS: Môi trƣờng Murashige&Skoog NAA: α – Naphthaleneacetic Acid NR: Năm Roi P: Prob. Level SS: Sum of Squares T: Cách ghép chữ T ngƣợc XV: Xim Vang XV-NR-E: Gốc ghép Xim Vang, chồi ghép Năm Roi và cách ghép hàm ếch XV-NR-T: Gốc ghép Xim Vang, chồi ghép Năm Roi và cách ghép chữ T ngƣợc. XV-NR-M: Gốc ghép Xim Vang, chồi ghép Năm Roi và cách ghép mặt cắt. XV-DX-E: Gốc ghép Xim Vang, chồi ghép Da Xang và cách ghép hàm ếch. XV-DX-T: Gốc ghép Xim Vang, chồi ghép Da Xanh và cách ghép chữ T ngƣợc. XV-DX-M: Gốc ghép Xim Vang, chồi ghép Da Xanh và cách ghép mặt cắt. XV-ĐLC-E: Gốc ghép Xim Vang, chồi ghép Đƣờng Lá Cam và cách ghép hàm ếch. XV-ĐLC-T: Gốc ghép Xim Vang, chồi ghép Đƣờng Lá Cam và cách ghép chữ T ngƣợc. XV-ĐLC-M: Gốc ghép Xim Vang, chồi ghép Đƣờng Lá Cam và cách ghép mặt cắt. x DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1: Quả bƣởi Đƣờng Lá Cam .................................................................. 6 Hình 2.2: Quả bƣởi Đƣờng Lá Cam xẻ dọc ...................................................... 6 Hình 2.3: Quả bƣởi Da Xanh ............................................................................. 7 Hình 2.4: Quả bƣởi Da Xanh xẻ dọc ................................................................. 7 Hình 2.5: Vƣờn cây bị tàn phá do virus tristeza (cành chết khô và không có trái) ........................................................ 8 Hình 2.6: Cây bƣởi bị nhiễm bệnh virus tristeza (cây lùn và lá bị vàng) .......... 8 Hình 2.7: Triệu chứng bệnh “nổ lá” .................................................................. 9 Hình 2.8: Gốc cây bị bệnh bong vỏ gốc thân .................................................... 10 Hình 2.9: Các môi giới truyền bệnh trên cây thuộc họ cam quýt……………...11 Hình 2.10: Hạt bƣởi nảy mầm…………………………………………………13 Hình 2.11: Cách thực hiện chiết cành ............................................................... 14 Hình 2.12: Thân cây hai lá mầm ....................................................................... 16 Hình 2.13: Cách ghép áp ................................................................................... 17 Hình 2.14: Cách ghép cành ............................................................................... 17 Hình 2.15: Chồi nách trên thân cây ................................................................... 18 Hình 2.16: Cách ghép cửa sổ ............................................................................. 18 Hình 2.17: Cách ghép chữ T .............................................................................. 18 Hình 2.18: Cách ghép mắt dạng mảnh .............................................................. 19 Hình 3.1: Vi giâm cành bƣởi Da Xanh trên môi trƣờng MS ............................. 32 Hình 3.2: Cấu trúc chồi đỉnh…………………………………………………..32 Hình 3.3: Hạt bƣởi Bồng đã khử trùng………….……………………………..33 Hình 3.4: Gốc ghép với ba cách ghép mắt cắt, chữ T ngƣợc và ghép vào lỗ trên thân (hàm ếch)………………………………………....34 Hình 4.1: Cây vi ghép hình thành rễ mới sau 21 ngày ..................................... 36 Hình 4.2: Cây vi ghép ở tuần thứ 3 (XV-NR-M): gốc ghép Xim Vang, xi chồi ghép Năm Roi, cách ghép mặt cắt ............................................. 37 Hình 4.3: Chồi ghép bật mầm ở tuần 3 (B-NR-T): gốc ghép bƣởi Bồng, chồi ghép Năm Roi, cách ghép chữ T ngƣợc .................................... 41 Hình 4.4 Cây ghép B-DX-T: gốc ghép bƣởi Bồng, chồi ghép Da Xanh, cách ghép chữ T ngƣợc……………………………………………..41 Hình 4.5: Cây ghép B-DX-M: gốc ghép bƣởi Bồng, chồi ghép Da Xanh, cách ghép mặt cắt ở tuần 3………...………………………………..43 Hình 4.6: Gốc bƣởi Xim Vang (trái) và gốc bƣởi Bồng (phải) với chồi ghép Năm Roi và cách ghép chữ T ngƣợc ở tuần 1……………………....44 Hình 4.7: Cây ghép ở tuần 1……………………………………………………44 Hình 4.8: Chồi ghép Năm Roi trên gốc ghép bƣởi Bồng ở tuần 2 (trái) và tuần 3 (phải)..……………………………………..46 Hình 4.9: Lá chồi ghép Năm Roi trên gốc ghép bƣởi Bồng ở tuần 4………….52 Hình 4.10: Chồi ghép Da Xanh trên gốc ghép bƣởi Bồng ở tuần 2 (trái) và tuần 3 (phải)……………………………………………….53 Hình 4.11: Chồi ghép Da Xanh trên gốc ghép bƣởi Xim Vang ở tuần 1 (trái) và tuần 3( phải)……………………………………..54 xii DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng Trang Bảng 2.1 : Thành phần rệp hại cây trồng thuộc họ cam quýt chủ yếu ở Việt Nam…………………………………………………………12 Bảng 3.1: Thành phần môi trƣờng MS (Murashige & Skoog) .......................... 29 Bảng 3.2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm ..................................................................... 30 Bảng 4.1: Ảnh hƣởng của kỹ thuật vi ghép đến tỷ lệ sống của cây vi ghép ..... 35 Bảng 4.2: Ảnh hƣởng của kỹ thuật vi ghép đến khả năng hình thành chồi mới của cây vi ghép ................................................ 40 Bảng 4.3: Ảnh hƣởng của kỹ thuật vi ghép đến chiều cao chồi của cây vi ghép ................................................................................ 45 Bảng 4.4: Ảnh hƣởng của kỹ thuật vi ghép đến số lá đƣợc hình thành của cây vi ghép ................................................................................ 51 xiii DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ Biểu đồ Trang Biểu đồ 4.1: Tỷ lệ sống của 18 nghiệm thức……………………..……………39 Biểu đồ 4.2: Tỷ lệ chồi bật mầm của 18 nghiệm thức………………………...43 Biểu đồ 4.3: Chiều cao chồi của 18 nghiệm thứ.………………………………50 Biểu đồ 4.4: Số lá của 18 nghiêm thức………………………………………....55 1 Chƣơng 1 GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Khí hậu Việt Nam là khí hậu nóng ẩm nhiệt đới rất thuận lợi cho các loại cây trồng khác nhau sinh trƣởng và phát triển. Trong nhiều loại cây trồng khác nhau ấy thì cây có múi là một chủng loại cây ăn trái chiếm vị thế quan trọng trên thế giới. Thật vậy, ngoài vai trò cung cấp một lƣợng vitamin dồi dào cho sức khỏe con ngƣời, cây có múi còn là loại cây mang lại giá trị kinh tế cao và làm tăng ngoại tệ đáng kể nhờ xuất khẩu. Việt Nam là một trong những nƣớc bản địa của vùng phát sinh cây có múi, và cho đến nay cây có múi giữ vị trí quan trọng trong ngành sản xuất trái cây. Tuy nhiên những năm gần đây, dịch bệnh vàng lá greening cùng nhiều loại bệnh truyền nhiễm khác đã lây lan mạnh làm suy yếu cây, từ đó làm giảm năng suất và phẩm chất quả. Để có giống tốt cung cấp cho các nhà vƣờn, công tác giống có vai trò rất quan trọng trong việc cung cấp giống cho các nhà vƣờn. Để có đƣợc giống sạch virus cũng nhƣ sạch các bệnh khác, thỏa mãn yêu cầu cấp thiết về chất lƣợng thì vi ghép cây là điều cần thực hiện trong sản xuất cây có múi hiện nay. Đƣợc sự phân công của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học Trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu kỹ thuật vi ghép cây Bƣởi (Citrus grandis)”. 1.2 Mục đích - yêu cầu 1.2.1 Mục đích Nghiên cứu các kỹ thuật vi ghép cây bƣởi nhằm tạo ra cây bƣởi in vitro sạch bệnh. 1.2.2 Yêu cầu  Theo dõi sự sinh trƣởng của cây bƣởi in vitro nuôi cấy từ hạt đƣợc dùng làm gốc ghép.  Theo dõi sự sinh trƣởng của cây bƣởi vi ghép sau khi ghép. 2 1.3 Đối tƣợng nghiên cứu Thực hiện vi ghép trên cây bƣởi với gốc ghép là cây bƣởi Bồng ở Huế và bƣởi Xim Vang ở huyện Vĩnh Cữu, tỉnh Đồng Nai. Cành ghép là các giống bƣởi cao sản đƣợc ƣa chuộng trên thị trƣờng hiện nay cụ thể là bƣởi Năm Roi ở Vĩnh Long, bƣởi Da Xanh ở Bến Tre, bƣởi Đƣờng Lá Cam ở Đồng Nai. 1.4 Phạm vi nghiên cứu Nghiên cứu đƣợc tiến hành ở quy mô phòng thí nghiệm. 3 Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu về cây bƣởi Bƣởi là cây đặc sản quý, có giá trị dinh dƣỡng cao, ngoài chất đƣờng (8 – 10%, trong đó saccharose là chủ yếu), bƣởi đặc biệt rất giàu vitamine C (khoảng 40 mg/100g thịt quả), acid hữu cơ (0,2 – 1,0%), pectin (0,45 – 0,5%) có tác dụng tốt đối với sức khoẻ. Pectin của bƣởi có tác dụng chống nhiễm kim loại nặng và nhiễm phóng xạ, tham gia vào quá trình bài tiết cholesterol, chống xơ cứng động mạch và có tác dụng chữa bệnh đƣờng ruột [4]. Theo Đƣờng Hồng Dật (2000), ở Trung Quốc các thầy thuốc đã dùng vỏ quả cam quýt để phòng ngừa dịch hạch, chữa trị bệnh phổi và bệnh chảy máu dƣới da. Bƣởi còn là loại quả có tiềm năng kinh tế cao, trọng lƣợng quả lớn, cây có thể cho thu hoạch quả đạt năng suất cao. Theo Nguyễn Văn Kế (1990), sản lƣợng bƣởi toàn cầu khoảng 5 triệu tấn trên tổng số 65 triệu tấn quả của họ cam quýt. Riêng tại Việt Nam, Nam Bộ có khoảng 2000 hecta trồng cây họ có múi. Theo FAO (Tổ chức an toàn lƣơng thực thế giới, 2002) thì diện tích trồng cam quýt và bƣởi trên toàn thế giới khoảng 7.330.000 ha với sản lƣợng 103.300.000 tấn/năm, mang lại giá trị khoảng 3 tỷ USD. Và cũng theo dự báo của FAO trong thời kỳ 2001 đến 2010, nhu cầu tiêu thụ cây cam quýt tăng cao hơn tốc độ tăng sản lƣợng, theo đó nhu cầu thị trƣờng tiêu thụ tăng bình quân 3,6%/năm. Trong khi sản lƣợng chỉ đạt 2,8%/năm (Viện nghiên cứu cây ăn quả miền nam, 2001). Ngoài ăn tƣơi, quả bƣởi còn có thể chế biến thành nhiều sản phẩm có giá trị kinh tế nhƣ các loại nƣớc giải khát, lấy tinh dầu từ vỏ và hạt. 2.1.1 Nguồn gốc và phân loại 2.1.1.1 Nguồn gốc Alphonse de Candle (1886) cho rằng có một số giống bƣởi tại quần đảo Malaysia cho thấy nơi đây có nguồn gốc canh tác bƣởi lâu đời. Roxburgh (1983) cho rằng bƣởi đã đƣợc di thực đến Calcutta (Ấn Độ) từ quần đảo Java (Indonesia). 4 Theo Webber và ctv (1967), trong quần đảo Friendly và Fiji còn tồn tại rất nhiều giống bƣởi hoang dại, cho thấy đây có thể là vùng khởi nguyên của bƣởi. Tuy nhiên, Webber và ctv (1967) cũng cho rằng dựa trên các dữ liệu hiện có. Bƣởi cũng có thể là cây bản địa của quần đảo Malaysia và Indonesia, từ hai nơi này bƣởi đã lan truyền sang Trung Quốc, Ấn Độ rồi đến Iran, Palestin và vào Châu Âu. Theo Saunt (1990), bƣởi có nguồn gốc ở Miền Nam Trung Quốc nơi chúng đƣợc trồng rộng rãi và phân bố tới khắp các nƣớc Đông Nam Á, nơi đây có nhiều giống bƣởi đã và đang đƣợc phát triển. Jorgenson (1984) cho rằng bƣởi và nhóm cây có múi khác đã đƣợc mang đến vùng Đông Nam Á, bởi những ngƣời Trung Quốc đi lập nghiệp và do đó bƣởi đã trở thành tự nhiên hoá trong vùng. Theo Nguyễn Văn Kế (1997), bƣởi thuộc họ cam quýt có nguồn gốc Đông Nam Á (Thái Lan và Malaysia) sau đó lan rộng qua Ấn Độ, Trung Quốc, Iran. Tóm lại, bƣởi đƣợc trồng nhiều nơi trên thế giới, có khả năng sinh trƣởng ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, trải rộng từ 35 vĩ độ nam đến 35 vĩ độ bắc, từ đó phân bố rộng ra khắp thế giới. Và cho đến nay, ngƣời ta vẫn chƣa thể xác định chính xác nơi xuất xứ của cây bƣởi. 2.1.1.2 Phân loại Ngành hạt kín: Angiospermae Lớp hai lá mầm: Dicotyledones Bộ: Rutales Họ: Rutaceae Tên khoa học: Citrus grandis Osbeck 2.1.2 Đặc điểm hình thái của cây bƣởi Theo Nguyễn Văn Kế (1997), so với các cây khác trong họ cam quýt thì bƣởi là cây lớn nhất, có gai, có thể cao đến 15 m, lá to, xanh đậm với cành lá to hơn cam quýt. Thân và tán cây bƣởi: Bƣởi thuộc dạng thân gỗ, là loại cây cao to nhất trong họ citrus, cây cao 6 – 7 m, trong một năm có thể cho ra 3 – 4 đợt cành. Hình thái tán rất đa dạng: tán rộng, tán thƣa, tán hình cầu, hình tròn hay hình tháp. Phần lớn các giống bƣởi có tán xòe nhƣ bƣởi Chùm, bƣởi Chua, bƣởi Đƣờng…nhƣng cũng có tán đứng nhƣ bƣởi Thanh Trà, bƣởi Ổi. Khi còn nhỏ cành có gai và rụng khi lớn. 5 Lá bƣởi: Lá có cánh tiếp giáp hay chồng lên phiến lá, số lá trên cành có liên quan đến trọng lƣợng quả, ảnh hƣởng đến năng suất, kích thƣớc lá thay đổi tùy theo giống. Hoa bƣởi: Hoa lƣỡng tính mọc từ nách lá, hoa màu trắng, thơm có 5 cánh và 3 – 5 lá đài, 20 – 40 nhị đực hợp thành từng nhóm dính liền ở đáy, bao phấn có 4 ngăn, màu vàng mọc bằng hay nhô cao hơn đầu nƣớm nhụy cái. Đầu nƣớm nhụy cái to, bầu noãn có 8 – 15 ngăn dính liền nhau tại một trục ở giữa, thƣờng thì hoa tự thụ phấn, tuy nhiên hoa bƣởi cũng có khả năng thụ phấn chéo. Quả bƣởi: Thƣờng nặng từ 0.8 – 3.8 kg nhƣng thƣờng biến động từ 0.9 – 1.5 kg với nhiều dạng: da sần, da láng, quả tròn, quả dẹp, dạng quả lê, núm cao. Thịt quả từ trắng đến hồng, vàng, xanh vàng, quả bƣởi gồm có 3 phần:  Ngoại quả bì: Là phần vỏ ngoài của trái gồm có biểu bì, lớp cutin dày và các khí khổng. Bên dƣới lớp biểu bì là lớp nhu mô mỏng giàu lục lạp, nên khi trái còn xanh vẫn có thể quang hợp đƣợc. Giai đoạn chín diệp lục bị phân huỷ, nhóm sắc tố caroten trở nên chiếm ƣu thế, màu sắc trái thay đổi từ xanh sang vàng.  Trung quả bì: Giáp phần phía trong ngoại quả bì, lớp này gồm nhiều tầng tế bào hợp thành, có màu trắng, vàng nhạt hay hồng nhạt. Trái càng lớn thì phần mô này càng xốp.  Nội quả bì: Gồm có tâm bì hay múi đƣợc bao quanh bởi lớp vách mỏng trong. Bên trong vách là tép phát triển và chứa đầy dịch nƣớc, dịch nƣớc chứa đƣờng và acid (chủ yếu là acid citric). Phạm Hoàng Hộ (1992), đã phân biệt bƣởi ra 2 loài khác nhau: bƣởi và bƣởi chùm. Bƣởi: Citrus grandis (L.) Osb. var. grandis (Shaddock, Pumelo, Pamplemousse): Đại mộc cao vào khoảng 10 m; gai ngay dài đến 10 cm, ở thân rộng đến 1 cm. Lá có phiến to, dày, gân phụ 5 – 6 cặp, cũng có cánh rộng và có đốt gắn vào phiến. Chùm hoa ngắn, trục có lông, cánh hoa trắng, dài 2 – 3.5 cm; tiểu nhị nhiều, dính nhau. Bƣởi chùm, bƣởi đắng: Citrus grandis var. racemose (Roem) B. C. Stone - Citrus paradisi Mcf. (Grape fruit): Đại mộc dạng cũng nhƣ bƣởi, trái nhỏ hơn, vàng, to 6 Hình 2.1: Quả bƣởi Đƣờng Lá Cam Hình 2.2: Quả bƣởi Đƣờng Lá Cam xẻ dọc 10 – 14 cm, vỏ quả mỏng hơn 5 – 7 mm, múi không tróc dễ dàng, song chua và đắng, 2n = 28. Bƣởi này đƣợc trồng ở Đà Lạt, ngƣời xứ lạnh ƣa ăn bƣởi đắng này với đƣờng. 2.1.3 Các giống bƣởi dùng trong thí nghiệm 3.1.3.1 Các giống bƣởi dùng làm chồi ghép (a) Bƣởi Năm Roi: Lá lớn, phiến lá dạng trứng ngƣợc. Cánh lá to dạng tam giác, trái to (trọng lƣợng trung bình 1 kg/trái), dạng quả lê. Trái có 11 – 16 múi, vỏ trái màu xanh đến vàng nhạt, khá ráo nƣớc, còn tép bó chặt nhau, ngon ngọt, có vị chua ít, không đắng, tróc vỏ, múi tốt. Đặc biệt có dòng bƣởi năm roi đƣợc trồng hiện nay không hạt hoặc ít hạt. Bƣởi Năm Roi đƣợc trồng nhiều ở Bình Minh (Vĩnh Long) và Phú Hữu (Cần Thơ). Bƣởi Năm Roi có nhiều giống: bƣởi năm roi 01 (BNR01), BNR02, BNR25, BNR04. Riêng cá thể giống bƣởi năm roi 25 của ông Tô Văn Nho ở Mỹ Hoà - Bình Minh – Vĩnh Long đã đƣợc bộ Nông Nghiệp công nhận cho phép đƣa vào sản suất ở các tỉnh phía Nam, theo quyết định số 2767 NN-KHCN/QĐ vào ngày 29/10//1997 [16]. (b) Bƣởi Đƣờng Lá Cam: Bƣởi này có nguồn gốc ở Biên Hòa (Đồng Nai), hiện nay là một trong những giống bƣởi chủ lực trong các nhà vƣờn bƣởi miền Đông Nam Bộ, đƣợc trồng khá tập trung ở huyện Vĩnh Cữu và huyện Tân Uyên. Tán cây tròn đều, phân bố thấp, cành đều, lá xanh đậm, phiến hình mác, lá hình tim, bìa lá có khía tròn. Quả hình quả lê thấp, màu xanh vàng khi chín, vỏ láng, dễ bóc, tép quả rất dễ tróc, màu vàng nhạt hoặc đồng nhất. Nƣớc quả nhiều hƣơng vị thơm, rất ngon. Khối lƣợng quả 1.300 g. Năng suất 400 quả/cây. Đây là giống đã đƣợc hai giải thƣởng: giải I năm 1995 kỳ hội chợ Nông Nghiệp Quốc Tế tổ chức tại Cần Thơ và giải B trong kỳ hội thi “Cây có múi giống tốt” năm 1996 do VNCCAQMN tổ chức. Cá thể 7 Hình 2.3: Quả bƣởi Da Xanh Hình 2.4: Quả bƣởi Da Xanh xẻ dọc thuộc giống đƣờng lá cam mã số BC12 của ông Trần Văn Hoà ở Tân Bình - Vĩnh Cữu - Đồng Nai, đã đƣợc Bộ NNKH công nhận theo QĐ ngày 29/10/1997. Nhƣợc điểm của giống này là số hạt khá cao (trung bình 60 – 90 hạt/ trái). Giống bƣởi này dùng để lấy chồi ghép. (c) Bƣởi Da Xanh: Bƣởi có nguồn gốc ở tỉnh Bến Tre, đƣợc biết đến trong những năm gần đây do phẩm chất rất ngon nên đƣợc sự chú ý của nhà vƣờn và ngƣời tiêu dùng. Do mới phát triển nên diện tích còn khá nhỏ, chỉ tập trung ở xã Mỹ Thạnh An thuộc thị xã Bến Tre - tỉnh Bến Tre. Theo Phạm Ngọc Liễu (1998), trái của bƣởi Da Xanh dạng hình cầu, màu sắc vỏ khi chín vẫn xanh, còn tép tróc khỏi vách múi tốt, có màu hồng đến đỏ không đều, tép bó khá chắc, nƣớc quả khô, có vị ngon, ngọt và rất thơm. Năng suất vƣợt trội với cá thể khác. Nhƣợc điểm là số hạt trên trái cao hơn các giống khác. Giống bƣởi này dùng để lấy chồi ghép. 3.1.3.2 Các giống bƣởi dùng làm gốc ghép (a) Bƣởi Xim Vang: Phân cành thấp, kích thƣớc lá dài trung bình 3,0 cm chiều rộng 2.5 cm. Đây là giống có kích thƣớc quả khá cao so với các giống khác cao 24,5 cm. Hàm lƣợng vitamin C đứng hàng thứ 3, sau bƣởi Đƣờng Hồng và bƣởi Đƣờng Da Láng 37,8%, trọng lƣợng quả 1,999g. Hiện nay, bƣởi Xim Vang đƣợc trồng nhiều ở Đồng Nai (Nguyễn Văn Kế, 1995). (b) Bƣởi Bồng: Là giống bƣởi ở Huế, theo những nghiên cứu khác nhau thì đây là giống bƣởi lai, có hệ gen gần với chanh và quýt hơn là bƣởi. Do có khả năng chống chịu với điều kiện khắc nghiệt của thời tiết cũng nhƣ khả năng chịu ngập đứng hàng thứ ba sau bƣởi Ổi và bƣởi Hồng Đƣờng, khả năng chịu mặn đứng hàng thứ nhất trong 41 giống bƣởi ở Việt Nam nên giống bƣởi này dùng làm gốc ghép. 8 Hình 2.5: Vƣờn cây bị tàn phá do virus tristeza (cành chết khô và không có trái) Hình 2.6: Cây bƣởi bị nhiễm bệnh virus tristeza (cây lùn và lá bị vàng) 2.2 Các loại bệnh virus và môi giới truyền bệnh trên cây thuộc họ cam quýt 2.2.1 Các loại bệnh do virus Loài virus citrus là loài rất nhỏ, chỉ có thể nhân lên trong tế bào sống, thƣờng là tế bào của citrus nhƣng nó cũng có thể nhân trong cơ thể của aphid hoặc một vài loài làm vector khác. Bệnh virus thì không chữa đƣợc, khi một cây nhiễm thì nó có thể tái nhiễm đến khi chết. Khi cây nhiễm, nó có thể là tác nhân nhiễm cho các cây khác. Bệnh virus thƣờng không lây qua hạt. Một vài loài virus chỉ nhiễm trên một vài loài citrus. Virus có thể nhiễm vài tháng hoặc vài năm trƣớc khi có một vài triệu chứng. Trong một vài trƣờng hợp, triệu chứng có thể nhanh chóng đƣợc phát hiện [27]. 2.2.1.1 Citrus Tristeza virus (CTV) Virus gây bệnh này có nguồn gốc từ nhiều năm trƣớc ở Trung Quốc. Tristeza là bệnh tàn phá rất lớn trên citrus ở Bắc và Nam Mỹ, mặc dù có khoảng phân bố rất rộng trên thế giới. Bệnh hiện không còn ở Argentina, Brazil và Uruguay, đây cũng là bệnh nguy hiểm ở Nhật Bản. Bệnh cũng đƣợc xác định là có hiện diện ở nƣớc ta [27]. Bệnh do virus dạng sợi dài (2 x 10 – 11 nm), tập trung và làm hỏng mạch dẫn nhựa libe trong cây, xuống rễ và làm suy dinh dƣỡng nhƣ rụng lá, chết đọt, lùn cây và thƣờng thối rễ. Bệnh có thể lộ ra ở cây con mới trồng hay ở cây lớn bị 9 Hình 2.7: Triệu chứng bệnh “nổ lá” suy dinh dƣỡng. Cây có mang mầm bệnh có thể vẫn thấy khỏe mạnh trong liếp ƣơm nhƣng sớm lộ triệu chứng ngay sau khi trồng. Cây mang bệnh mãn tính sẽ bị lùn, phù gốc do mắt tháp phát triển quá khổ. Hầu hết các giống cam quýt đều có triệu chứng sọc lõm ở gỗ thân và cành (stem pitting). Một dạng đặc trƣng của bệnh là triệu chứng tổ ong khi dùng cam chua làm gốc ghép: khi tách vỏ ở vùng bên dƣới mắt tháp sẽ thấy nhiều lỗ nhỏ xếp cụm trong gỗ [27]. Bệnh đƣợc truyền bởi một loài aphid có tên là Toxoptera citricida Kirkaldy. Ngƣời ta kiểm tra thấy rằng nếu 5 aphid tấn công cây thì 50% cây sẽ bị nhiễm và nếu 15 aphid tấn công cây thì 70% sẽ bị nhiễm. Ngƣời ta cũng nhận thấy rằng các type khác nhau của virus này đều gây bệnh đƣợc [27]. CTV nhiễm trên tất cả các loài (nhân giống và tháp ghép) của cây citrus. Nó đƣợc tìm thấy trên toàn thế giới và có nhiều giống khác nhau, trong các type khác nhau đó có các type tàn phá rất lớn. Bệnh chịu ảnh hƣởng của điều kiện môi trƣờng, các dạng khác nhau của cây citrus và các nòi virus khác nhau. Khi cây đƣợc ghép trên gốc kháng thì cây có khả năng phục hồi lại sau đó [27]. 2.2.1.2 Citrus tatter leaf virus ( CTLV) CTLV đƣợc phát hiện đầu tiên 1962, trên cây chanh Mayer thuộc Trung Quốc. Sau đó một vài loài virus cũng đƣợc phát hiện trên giống chanh đó ở Australia và ở phía Nam châu Phi [27]. Bệnh do virus dạng sợi tóc và truyền bệnh bằng côn trùng hoặc các vector khác. Con đƣờng chủ yếu là lây qua nhân giống và tồn tại ở chồi. Loại virus này đƣợc truyền qua nhựa cây, có thể truyền khi cắt cành và công cụ làm vƣờn khi cắt cây bệnh trƣớc [7]. Hầu hết các loài citrus khi nhân từ giống có chứa loài virus này không thấy triệu chứng. Tuy nhiên, cây nhiễm đều bị lùn, chậm tăng trƣởng, lá biến dạng và nổi u (sƣng tấy), cành non thì ngoằn ngèo. Ảnh hƣởng rõ ràng nhất là chồi vàng (khi chồi non ghép trên gốc ghép) [27]. 10 Hình 2.8: Gốc cây bị bệnh bong vỏ gốc thân 2.2.1.3 Citrus exocortis virus (CEV) CEV đƣợc phát hiện đầu tiên năm 1948, ở Australia và bây giờ nó có ở khắp nơi trên thế giới. Bệnh làm chậm tăng trƣởng trên cam. Bệnh rất dễ lây qua ghép, ở các chồi ghép và không thấy triệu chứng khi nhân giống. Thể viroid truyền qua cơ giới công cụ cắt và tỉa cành [27]. Mầm bệnh do một loài viroid của virus, viroid làm chết vỏ, khô, vỡ ra và có thể bóc vỏ đƣợc dễ dàng. Nhựa thì không có dƣới lớp vỏ của cây nhƣ vậy. Bệnh có thể nhiễm ở hầu hết loài citrus khi nhân giống và luôn tiềm ẩn trong cây [27]. 2.2.2 Môi giới truyền bệnh trên cây thuộc họ cam quýt Đối với cây thuộc họ cam quýt thì nguyên nhân truyền bệnh do công cụ làm cắt tỉa cành trong vƣờn, do các loại côn trùng truyền bệnh mà trong đó rệp là tác nhân chủ yếu. Rệp sống chủ yếu bằng cách hút nhựa và chất kích thích sinh trƣởng ở các bộ phận non của cây do đó thƣờng làm cho cây giảm quang hợp, nếu tấn công trên trái thì làm trái nhỏ sẽ bị rụng, bị đen, kích thƣớc trái nhỏ, dị dạng, giảm chất lƣợng quả từ đó làm giãm giá trị thƣơng mại. Đồng thời, rệp còn là tác nhân truyền bệnh virus gây hại rất lớn cho các cây thuộc họ cam quýt nói riêng và nhiều loại cây trồng khác nói chung. Phân của các loài rệp này thải ra quyến rũ nấm bồ hống đến cộng sinh làm giảm khả năng quang hợp của cây, do phân của chúng chứa một lƣợng đƣờng rất cao. Đồng thời phân của chúng còn có thể hấp dẫn các loài kiến khác nhau đến tha chúng đi nơi khác để tiếp tục gây hại cho cây trồng [3, 7]. Rệp hại cây trồng đƣợc phân ra làm hai nhóm chủ yếu là nhóm rệp muội hay còn gọi là rầy mềm, nhóm thứ hai là nhóm rệp sáp. 2.2.2.1 Rệp muội hại cây trồng Nhóm rệp này chỉ có một họ duy nhất là Aphididae thuộc bộ cánh đều, có thân mềm, dài từ 1 – 2 mm, dạng hình quả lê, trần trụi, cuối bụng có phiến đuôi và hai ống bụng hai bên. Có thể có cánh hoặc không có cánh tuỳ theo điều kiện sinh sống (thời 11 Hình 2.9: Các môi giới truyền bệnh trên cây thuộc họ cam quýt A: Rệp muội xanh Aphis citricola B: Rệp muội nâu Toxoptera citricidus C: Rệp muội đen Toxoptera aurantii A B C tiết và dinh dƣỡng, nếu không thích hợp thì số có cánh sẽ nhiều hơn và di chuyển đi nơi khác sinh sống) [3]. Trên cam quýt có ba dạng rệp chủ yếu sau và cũng là tác nhân thuyền bệnh virus tristeza:  Rệp muội xanh Aphis citricola  Rệp muội nâu Toxoptera citricidus  Rệp muội đen Toxoptera aurantii 2.2.2.2 Rệp sáp hại cây trồng  Gồm có 5 họ với 91 loài khác nhau phân bố rộng khắp các vƣờn cây ăn trái. Asterolecaniidae có 2 loài Coccidae với 19 loài (rệp sáp) Diaspididae với 53 loài (rệp sáp vảy và rệp sáp dính) Margarodidae với 3 loài (rệp sáp trắng và sáp bông) Pseudococcidae với 14 loài (rệp sáp giả) 12  Thành phần rệp hại cây trồng đã đƣợc thống kê tại Việt Nam Bảng 2.1 : Thành phần rệp hại cây trồng thuộc họ cam quýt chủ yếu ở Việt Nam Tên khoa học Họ Hình ảnh minh họa theo họ Toxoptera aurantii Aphididae Toxoptera citricidus Aphididae Toxoptera citricola Aphididae Icerya purchasi Margarodidae Planocuccus citri Pseudococcidae Planococcus citriculus Pseudococcidae Chloropulvinaria aurantii Coccidae Saissetia coffeae Coccidae Anonidiella aurantii Diaspididae Chrysonphalus aonidium Diaspididae (Theo Nguyễn Mạnh Chinh, 2002). 13 Hình 2.10: Hạt bƣởi nảy mầm 2.3 Các cách nhân giống của cây bƣởi Để nhân giống các cây cam quýt nói chung và cây bƣởi nói riêng ta có thể sử dụng các cách nhân giống khác nhau nhƣ gieo hạt, chiết cành, giâm cành, ghép. 2.3.1 Nhân giống cổ điển 2.3.1.1 Nhân giống bằng hạt Đây là cách nhân giống đƣợc bắt đầu khi loài ngƣời biết trồng cây ăn quả. Đây là quá trình tạo cây con từ hạt, hạt đƣợc hình thành do sự thụ tinh của tế bào hạt phấn và tế bào noãn, cây mới mọc mang đặc tính của cả bố và mẹ hoặc nghiêng hẳn về bố hoặc mẹ. Cách nhân giống này áp dụng chủ yếu để lấy cây con làm gốc ghép. Rất ít vùng dùng cây con làm giống vì phải 8 – 10 năm mới có thể cho quả đƣợc [6 – 12].  Các yêu cầu khi chọn hạt làm gốc ghép để nhân giống:  Chọn những hạt mẩy không sâu bệnh từ quả tốt để làm giống.  Chọn cây thích hợp với điều kiện tự nhiên của địa phƣơng có năng suất cao, phẩm chất tốt.  Chọn cây là những cây ổn định về mặt sinh trƣởng, có từ 6 – 7 năm tuổi trở lên.  Chọn cây sinh trƣởng khỏe, có bộ rễ phát triển mạnh, cành phân tán cân đối, lá tƣơi tốt, không sâu bệnh. 2.3.1.2 Nhân giống bằng cách chiết cành Cây có múi nói chung đều dễ nhân giống bằng phƣơng pháp chiết nhánh bó bầu. Nguyên liệu nhân giống là cành đã có búp sinh trƣởng, chỉ cần bóc một khoảnh vỏ bó đất, khi cành ra rễ mới cắt khỏi cây mẹ. Ƣu điểm của phƣơng pháp là vì chƣa cắt khỏi cây mẹ nên cành đƣợc nuôi một phần bằng nhựa cây mẹ nên cành dễ sống hơn [14, 15]. 14  Bó chổ cắt bằng rêu ẩm  Dùng bọc và dây buột chặt lại Hình 2.11: Cách thực hiện chiết cành Cách thực hiện gồm các bƣớc chủ yếu sau đây:  Chọn cành dài khoảng 15 – 30 cm, cũng có thể làm vào mùa hè lúc đó vỏ cây còn cứng. Sau đó, cắt lột bỏ lớp một lớp vỏ và cạo bỏ lớp vỏ cứng bên ngoài một cách nhẹ nhàng, có thể bổ sung indolebutyric acid lên bề mặt lát cắt (là một loại hormon tạo rễ). 2.3.1.3 Nhân giống bằng cách giâm cành Phƣơng pháp này dựa trên khả năng hình thành rễ phụ (rễ bất định) của các đoạn cành đã cắt rời khỏi thân mẹ (hoặc các đoạn rễ). Ngày nay, phƣơng pháp này đƣợc ứng dụng rộng rãi nhằm nhân giống các cây công nghiệp, cây lâm nghiệp. Ở nƣớc ta, việc nhân giống chanh bằng phƣơng pháp giâm cành rất phổ biến nhằm tạo cây lùn, nhanh thu hoạch quả và chu trình kinh doanh khai thác ngắn nhƣng hiệu quả cao [15]. Nhà giâm cành nói chung phải thoáng mát, kín gió, trao đổi không khí tốt. Cành để thực hiện nhân giống là những cành bánh tẻ, phần lớn là những cành ra trong năm, có khi ra cùng trong vụ xuân hoặc hè. Nguyên tắc chung là chọn những cành lƣng chừng tán, ngoài bìa tán và những cành ở cấp cành cao (những cành không mang hoa, quả và những cành ổn định sinh trƣởng chƣa lâu). Cắt cành giống vào thời gian không có nắng trong ngày: sáng sớm hay chiều tối vì cành lá sẽ mất nƣớc đột ngột, tỉ lệ ra rễ kém. Cành cắt xong cần đƣợc phun nƣớc cho ƣớt lá rồi dựng đứng vào trong xô hoặc thùng có chứa nƣớc sạch, đậy lại bằng vải màu tối đã thấm ƣớt. 15 Cành sau đó đƣợc xử lý lại, đối với cành dễ ra rễ có thể cắm thẳng vào nền giâm, hoặc xử lý hóa chất ra rễ ở nồng độ thấp (NAA, IAA hay IBA). Phải thƣờng xuyên duy trì độ ẩm từ lúc cắm cành cho đến lúc ra rễ. Nhiệt độ thích hợp cho quá trình tạo rễ ở cây ăn quả là 21 – 26oC. Khi rễ của cành giâm mọc đủ dài, hơi chuyển từ màu trắng sang màu vàng và dẻo thì phải ra ngôi kịp thời trong vƣờn ƣơm hay túi polymer. 2.2.1.4 Nhân giống bằng cách ghép Ghép là phƣơng pháp đem cành hay mầm nhánh của cây mẹ có nhiều ƣu điểm nhƣ phẩm chất tốt, năng suất cao… gắn sang gốc một loại cây khác để tạo thành một thể mới thống nhất [12].  Ƣu điểm  Cây sau khi ghép giữ đƣợc đặc tính của cây mẹ, mau cho trái, tuổi thọ cao.  Nhân đƣợc nhiều cây giống.  Cây có bộ rễ ăn sâu, chống đƣợc gió bão va chạm tốt hơn so với giâm cành, chiết cành.  Sử dụng đƣợc các đặc tính tốt của cây mẹ làm gốc ghép nhƣ chịu hạn, chịu úng, chịu lạnh …..  Cây cao có thể làm thấp xuống nhờ ghép.  Áp dụng đƣợc với những cây không hạt.  Phục tráng cho những cây già, quý hiếm.  Thay đổi đƣợc tính trạng đực khi ghép cây cái lên cây đực.  Nhƣợc điểm  Kỹ thuật ghép tiến hành phức tạp hơn giâm cành, chiết cành.  Cần phải có kiến thức nhất định về cây tiến hành ghép.  Cần phải nghiên cứu khi ghép khác họ khác loài.  Có khoảng 30 loại bệnh lây lan qua đƣờng ghép do mycoplasma, virus, viroid, vi khuẩn. 16 Biểu bì Nhu mô Cƣơng mô Libe Tƣợng tầng Nhu mô tủy Thân cây hai lá mầm Mộc Hình 2.12: Thân cây hai lá mầm (a) Cơ sở kết hợp của gốc ghép và cành ghép Cấu trúc thân cây cắt ngang có ba phần chính: lớp vỏ ngoài cùng có nhiệm vụ dẫn nhựa luyện từ lá xuống rễ, phần gỗ phía trong dẫn nhựa nguyên từ gốc lên cành lá, phần giữa gỗ và vỏ là tƣợng tầng mô phân sinh rất mỏng, có khả năng phân chia nhanh, tạo nên gỗ bên trong và vỏ bên ngoài. Việc kết hợp giữa gốc và cành ghép gồm 4 bƣớc nhƣ sau:  Áp sát phần tƣợng tầng của gốc với cành ghép.  Lớp tế bào tƣợng tầng ngoài của gốc và cành ghép tạo ra những tế bào nhu mô dính lại với nhau gọi là mô sẹo.  Các tế bào nhu mô của mô sẹo phân hoá thành những tế bào tƣợng tầng mới, kết hợp với tƣợng tầng nguyên thủy của gốc và cành ghép.  Các tế bào tƣợng tầng mới tạo ra những mô mạch mới, gỗ bên trong và libe bên ngoài, hình thành sự kết hợp mạch giữa gốc và cành ghép giúp dinh dƣỡng và nƣớc đƣợc vận chuyển qua lại. (b) Điều kiện để ghép cành Để đảm bảo việc ghép cành thành công cần phải lƣu ý một số yếu tố sau [12, 14, 15]:  Các cây ghép với nhau phải cùng một họ để có khả năng kết hợp cao, tốt nhất là cùng loài, cùng thứ.  Gốc ghép, cành ghép cần có mức sinh trƣởng tƣơng đƣơng nhau để có khả năng kết hợp tốt.  Hai bộ phận ghép phải đƣợc áp chặt nhau để tăng khả năng kết dính, chỗ ghép không đƣợc dơ, nóng hay bị ẩm ƣớt. 17 Cành ghép Gốc ghép Cài hai lƣởi gà vào với nhau Dùng kẹp kẹp lại Cắt rời cành ghép khỏi gốc ghép Hình 2.13: Cách ghép áp A : Gốc ghép B : Tạo lƣỡi gà cho gốc ghép C : Cành ghép cũng đƣợc tạo lƣỡi gà D : Áp cành ghép và gốc ghép lại E : Dùng dây quấn chặt cành ghép vào gốc ghép. Hình 2.14: Cách ghép cành  Muốn cho cành ghép tiếp hợp vào gốc ghép, nhất thiết phải có một bộ phận của mô phân sinh ở cành ghép tiếp xúc tƣơng đối chặt với một bộ phận tƣợng tầng của gốc ghép. (c) Các phƣơng pháp ghép  Ghép áp Khi gốc ghép và cành ghép có đƣờng kính tƣơng đƣơng nhau ta đem chúng lại gần nhau và áp lại với nhau. Dùng dao vát một miếng nhỏ để lộ tƣợng tầng ở gốc ghép và cành ghép, buộc chặt cành ghép và gốc ghép lại với nhau theo vị trí vết cắt. Sau 40 – 50 ngày vết cắt sẽ liền sẹo, cắt bỏ ngọn gốc ghép và cắt rời gốc cành ghép. Phƣơng pháp này cho tỷ lệ sống rất cao (90 – 95%) nhƣng rất công phu và hệ số nhân thấp [12, 15].  Ghép cành Ghép cành là một phƣơng pháp khá phổ biến trong nhân giống cây ăn quả, áp dụng trong các trƣờng hợp cây khó lấy mắt hoặc trong những thời vụ mà nhiệt độ và ẩm độ thấp, sự chuyển động của nhựa trong cây kém. Nhiều khi kết hợp giữa ghép đoạn cành và ghép mắt để tận dụng cành ghép [12, 15]. 18 A : Gốc ghép đƣợc cắt chữ T B : Lấy mắt ghép từ cành ghép C : Mắt ghép đã sẵn sàng để ghép D : Mắt ghép đƣợc ghép vào vết cắt E : Buộc chặt mắt ghép vào gốc ghép Hình 2.17: Cách ghép chữ T Mắt Hình 2.15: Chồi nách trên thân cây  Ghép mắt Ngƣời ta bóc lấy một mắt ở nách lá trên một cành bánh tẻ của cây mẹ và một mảnh vỏ trên gốc ghép. Áp mắt ghép vào chỗ đã bóc vỏ trên gốc ghép rồi buột lại. Khi mắt ghép nảy mầm sẽ tạo một cây ghép. Ghép mắt có ƣu điểm là hiệu suất lao động cao, thao tác đơn giản. Ghép mắt gồm các phƣơng pháp ghép chủ yếu sau:  Ghép cửa sổ    Ghép chữ T B C D A: Gốc ghép B: Gốc ghép đƣợc tạo “cửa sổ” C: Mắt ghép đƣợc đặt vào “cửa sổ” D: Dùng dây buộc chặt mắt ghép vào gốc ghép Hình 2.16: Cách ghép cửa sổ A 19 A B C A : Gốc ghép đƣợc lấy một mảnh cả vỏ và thân B : Mắt ghép cũng đƣợc lấy một mảnh tƣơng tự C : Áp mắt ghép vào gốc ghép và buộc dây Hình 2.18: Cách ghép mắt dạng mảnh  Ghép mắt dạng mảnh Ƣu điểm nhất của phƣơng pháp này là thao tác đơn giản, không cần bóc vỏ cành ghép và gốc ghép, nhƣng nếu cây chuyển nhựa tốt thì tỷ lệ sống cao hơn. Dùng dao cắt hai lát trên gốc ghép lấy đi một mảnh cả gỗ và vỏ thêm hai lát ở cành ghép để lấy mắt có cả cuống lá, lắp vừa khít vào gốc ghép, buộc chặt bằng dây. Sau một thời gian nhất định ta có thể mở dây ra và cắt ngọn gốc ghép [12, 15]. 2.3.2 Nhân giống bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô Trong trƣờng hợp cây ăn quả lâu năm, kỹ thuật ghép đang chiếm vị trí hàng đầu trong nhân giống vì kết hợp đƣợc khả năng chống chịu của gốc hoang dã với mắt ghép có ƣu điểm năng suất và phẩm chất tốt. Tuy nhiên trong lúc ghép theo kỹ thuật truyền thống, do thời gian trồng gốc ghép kéo dài và kích thƣớc mắt ghép khá lớn nên bệnh virus có thể truyền lây. Để khắc phục nhƣợc điểm trên, kỹ thuật ghép đỉnh sinh trƣởng gọi tắt là vi ghép đƣợc thử nghiệm và mang lại kết quả tốt. Về nguyên tắc, vi ghép là nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng nhƣng qua dinh dƣỡng của gốc ghép. Đỉnh sinh trƣởng làm mắt ghép có kích thƣớc từ 0,2 – 0,5 mm, đƣợc tách từ búp non đang sinh trƣởng mạnh của cây mẹ trƣởng thành, gốc ghép là cây mới nảy mầm từ hạt của giống hoang dại, toàn bộ cây ghép đƣợc nuôi dƣỡng trong điều kiện ống nghiệm vô trùng. Những cây ghép thu đƣợc 20 bằng phƣơng pháp này hoàn toàn sạch bệnh và mang đặc điểm di truyền của cây mẹ cho mắt ghép [14]. 2.3.2.1 Các yếu tố ảnh hƣởng đến vi ghép  Chất điều hòa sinh trƣởng Sẽ có lợi hơn nếu các chồi ghép đƣợc đặt nuôi cấy trong môi trƣờng MS có chứa chất điều hòa sinh trƣởng. Jonal và ctv (1983) đã chứng minh, thêm Cytokinin vào môi trƣờng nuôi cấy (0,1 mg Zeatin/l nếu chồi nuôi cấy trong 48 giờ; 0,01 mg Zeatin/l nếu nuôi thêm 48 – 240 giờ) có hiệu quả đặc biệt kích thích sự tiếp hợp nhanh chóng của gốc ghép và chồi ghép. Để mỗi lần ghép thành công, có một cách là nuôi chồi ghép trong môi trƣờng nuôi cấy có chất điều hòa sinh trƣởng trong một thời gian ngắn trƣớc khi ghép 5 – 10 phút trong môi trƣờng 10 mg/l 2,4 D hoặc 1 mg/l BAP làm tăng tỷ lệ thành công đối với cây có múi (Edriss và Burger, 1984). Starratino và Caruso (1998), đạt tỷ lệ cây ghép sống khá cao khi nhúng chồi ghép và mặt cắt gốc ghép vào môi trƣờng có 0,5 mg/l BAP trong 20 phút trƣớc khi cả hai ghép lại với nhau.  Sự hóa nâu và khô dần của chồi ghép. Chồi khô dần là nguyên nhân dẫn đến sự thất bại của kỹ thuật. Để ngăn cản quá trình này, Piego Alfaro và Murashige (1987) đã dùng lớp vỏ mỏng môi trƣờng dinh dƣỡng có agar để liên kết nơi ghép. Agar sẽ làm tăng sự phát triển của chồi và chất dinh dƣỡng từ khối agar đƣợc tiết ra nuôi chồi trong suốt tuần thứ nhất đến tuần thứ ba sau khi ghép; nếu không sẽ có kết quả là cây ghép rất yếu. Chồi bị hóa nâu nguyên nhân do các chồi ghép quá nhỏ hay thao tác quá chậm, có thể hạn chế bằng cách ngâm chồi trong dung dịch chống oxy hóa 2g/l Sodium Diethyldithiocarabamate (DIECA) hoặc nhỏ một giọt dung dịch lên trên mặt cắt của gốc ghép ngay trƣớc khi ghép chồi lên. Theo Navarro (1988) thì thao tác nhanh kỹ thuật ghép nhanh sẽ ngăn cản quá trình oxy hóa phenol và có hiệu quả hơn những chất chống oxy hóa. Với 0,5 mg/l NAA đã làm tăng đáng kể tỷ lệ sống của tổ hợp ghép (37,5%) cao hơn rất nhiều so với môi trƣờng không có NAA (10,43%) Hơn nữa khi có NAA thì không cần thƣờng xuyên khử chồi phụ so với khi không có NAA phải khử chồi phụ mỗi tuần hoặc 15 ngày một lần vì NAA ức chế sự hình thành 21 và phát triển của các chồi phụ nhƣng kích thích gốc ghép mọc nhiều rễ phụ và phát triển rất tốt. Khi kết hợp NAA và Kinetin với nồng độ trên, chồi ghép mau liền sẹo và phát triển tốt, sau 3 tuần kích thƣớc chồi đạt 8 mm. Tuy nhiên gốc có hiện tƣợng hình thành mô sẹo và không hình thành rễ cho dù ta cấy chuyền sang môi trƣờng không có chất điều hoà sinh trƣởng sau 2 tuần. Với 3 mg/l Adenin cây ghép có tác dụng ngƣợc lại. Hiện tƣợng mắt ghép bị nâu đen hay bị khô đều thấy ở tất cả độ tuổi gốc ghép  Tuổi của gốc ghép Thí nghiệm với gốc ghép ở độ tuổi khác nhau 15, 21, và 60 ngày cho thấy gốc già, cứng nên khó cắt và dễ bị dập nơi vết cắt nhƣng ngƣợc lại do vỏ dầy cứng nên giữ đƣợc mắt ghép khi ta đặt vào, mắt ghép ít bị rơi khỏi nơi ghép và dễ liền sẹo sau khi ghép. Tuy nhiên chú ý phải nhẹ nhàng khi đặt mắt ghép vào tránh kẹp chặt làm tổn thƣơng cành ghép. Tuổi gốc ghép còn nhỏ thì nơi ghép dễ bị mô sẹo hoá và tốt nhất là gốc ghép ở độ tuổi 15 ngày sau nảy mầm. Các tác giả đã chứng minh rằng: Gốc ghép non, mắt ghép dễ bị mô sẹo hóa, khả năng nảy chồi thấp. Gốc già, mắt ghép khó liền, tỷ lệ mắt ghép nâu đen cao. Thích hợp nhất là từ 14 – 16 ngày tuổi của gốc ghép sau khi hạt nảy mầm. Kết quả cụ thể tính theo % ghép thành công là: 15,2; 16,6; 40,0; 37,1; 36,6; và 14,3% với tuổi gốc ghép tƣơng ứng là 10; 12; 14; 16; 18 và 20 ngày (17).  Độ lớn của mắt ghép Chồi ghép có thể lấy trực tiếp hoặc nuôi cấy một thời gian ngắn trƣớc khi ghép. Tỷ lệ ghép thành công sẽ cao hơn khi nuôi lớn những đỉnh sinh trƣởng độc lập cho đến khi chúng có kích thƣớc lớn hơn trƣớc khi chúng đƣợc ghép (17, 1). Khi thử với gốc ghép có độ tuổi thích hợp là 14 ngày, mắt ghép gồm 3 kích thƣớc tƣơng ứng với tỷ lệ thành công: 0,10 – 0,15 mm (2 mầm lá): 20% 0,20 – 0,30 mm (4 mầm lá): 30% 0,40 – 0,60 mm (6 mầm lá): 55% Nhƣ vậy, ghép mắt lớn dễ thành công nhƣng để đảm bảo tính sạch bệnh virus không nên dùng mắt ghép lớn hơn 0.5 mm. 22  Khử chồi phụ Trong nách lá mầm của gốc ghép có mắt ngủ, bình thƣờng thì bị ƣu thế ngọn ức chế. Khi ghép, chồi ngọn bị khử nên chúng phát sinh rất nhanh, gây ức chế phát triển của mắt ghép. Để tránh tình trạng này cần khử mắt chồi ngủ bằng cách khoét vào thân khi cắt bỏ hai lá mầm để loại chồi ngủ. Chồi ngủ cũng có thể phát sinh từ tƣợng tầng của mặt cắt trên gốc ghép, cần phải loại bỏ chúng ngay khi phát hiện để tạo điều kiện cho chồi ghép phát triển nhanh. 2.3.2.2 Chuyển cây ra vƣờn ƣơm Cây ghép trong ống nghiệm có bộ rễ tự nhiên rất khoẻ, vì vậy khi đƣa ra ngoài đất dễ sống. Cần lƣu ý rửa sạch môi trƣờng dinh dƣỡng để bộ rễ không bị nấm bệnh. Đất phân làm bầu nên khử trùng để tránh gây nhiễm bệnh và trồng ở khu vực cách ly tốt. 2.3.2.3 Lịch sử hình thành và phát triển nuôi cấy mô tế bào thực vật Năm 1838, hai nhà thực vật học ngƣời đức Schleiden và Schwann đã đề xƣớng thuyết tế bào và nêu rõ: Mọi cơ thể sinh vật đều gồm nhiều tế bào tạo thành. Các tế bào đã phân hoá đều mang các thông tin di truyền có trong các tế bào đầu tiên, tế bào là những đơn vị độc lập, từ đó có thể xây dựng lại toàn bộ cơ thể. Năm 1902, Haberlandt là ngƣời đầu tiên đƣa các giả thuyết của Schlieden và Schwann vào thực nghiệm. Năm 1922, Kotte học trò của Haberlandt là Robbins đã lập lại thực nghiệm của Haberlandt với đỉnh sinh trƣởng tách từ đầu rễ của một cây hòa thảo. Trong môi trƣờng lỏng gồm có muối khoáng và glucose, đầu rễ sinh trƣởng khá mạnh tạo nên một hệ rễ nhỏ có cả rễ phụ. Năm 1934, bắt đầu giai đoạn thứ hai của nuôi cấy mô thực vật, khi White nuôi cấy thành công trong một thời gian dài đầu rễ cà chua (Lycopercium esculentum L.) với môi trƣờng lỏng chứa muối khoáng, glucose và nƣớc chiết nấm men. Sau đó ít lâu White chứng minh là có thể thay thế nƣớc chiết nấm men bằng ba loại hỗn hợp vitamine nhóm B: Thiamine (B1), Pyridoxine (B6), và Nicotinic acid. Từ đó việc nuôi cấy đầu rễ trong thời gian vô hạn đã đƣợc tiến hành ở nhiều loại cây khác nhau. Cũng trong thời gian này Gautheret ở Pháp đã tiến hành nuôi cấy mô tƣợng tầng một số cây gỗ. Sau khi Went và Thimann phát hiện chất điều hoà sinh trƣởng (hormone) đầu tiên, acid – indol acetic (IAA) và đã kết tinh đƣợc chất này. 23 Năm 1939, Gautheret đã thành công trong duy trì sự sinh trƣởng trong thời gian vô hạn của mô sẹo cà rốt (Daucus carota) trên môi trƣờng bằng thạch, bằng cách cấy chuyền 6 tuần 1 lần. Năm 1941, Overbeck chứng minh tác dụng kích thích sinh trƣởng của nƣớc dừa trong nuôi cấy mô họ cà (Datura). Sau đó vào năm 1948, Steward xác nhận tác dụng của nƣớc dừa lên mô sẹo cà rốt. Trong thời gian này, nhiều chất sinh trƣởng nhân tạo thuộc nhóm auxin đã đƣợc nghiên cứu và tổng hợp thành công. Chất napthyl acetic acid (NAA) và chất 2,4 – dichloro phenoxy acitic acid (2,4 – D) đƣợc bắt đầu sử dụng để trừ cỏ lá rộng trong nông nghịêp. Nhiều tác giả nhận thấy cùng với nƣớc dừa, 2,4 – D và NAA đã giúp tạo mô sẹo, gây phân chia tế bào ở nhiều đối tƣợng thực vật trƣớc đó rất khó nuôi cấy. Năm 1954, Skoog tình cờ thấy nếu thêm một ít chế phẩm đã đƣợc để lâu của acid desoxyribonucleic (DNA) lấy từ tinh dịch cá bẹ vào môi trƣờng nuôi cấy các mảnh mô thân cây thuốc lá thì tác dụng kích thích sinh trƣởng trở nên rất rõ rệt. Năm 1955, chất này đƣợc xác nhận là 6-furfurylaminopurine và đƣợc Skoog đặt tên là kinetin, có tác dụng kích thích sự phân bào. Sau này, ngƣời ta chứng minh rằng sự phân bào ở thực vật trong tự nhiên cũng do các chất hoá học tƣơng tự kinetin điều khiển và gộp chung các chất này vào nhóm cytokinin. Chất cytokinin đầu tiên đƣợc tách từ thực vật bậc cao là zeatin từ mầm ngô. Năm 1957, Skoog và Miller công bố kết quả nghiên cứu của tỷ lệ kinetin/auxin trong môi trƣờng nuôi cấy đối với sự hình thành cơ quan của mô sẹo thuốc lá. Khi giảm tỷ lệ kinetin/auxin mô sẹo có khuynh hƣớng phát triển rễ, ngƣợc lại thì khi tỷ lệ kinetin/auxin tăng thì dẫn đến khuynh hƣớng tạo chồi ở mô sẹo. Hiện tƣợng này đƣợc xác nhận trên nhiều loại cây trồng khác nhau và đóng góp rất lớn vào quá trình điều khiển sinh trƣởng phát triển, phát sinh cơ quan của mô tế bào trong nuôi cấy. Thành công của Skoog và Miller dẫn đến nhiều phát hiện quan trọng khác, mở đầu cho giai đoạn thứ ba của lịch sử nuôi cấy mô thực vật là nhân giống cây trồng. 2.3.2.4 Một số kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật  Nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng  Nuôi cấy mô sẹo  Nuôi cấy tế bào đơn và protoplast (tế bào trần)  Nuôi cấy hạt phấn 24  Nuôi cấy mô phân sinh  Nuôi cấy tế bào lát mỏng  Nuôi cấy hạt 2.4 Các nghiên cứu trong và ngoài nƣớc về kỹ thuật vi ghép 2.4.1 Nghiên cứu trong nƣớc Lê Trần Bình (1993), thực hiện thành công vi ghép trong nhân giống cam chanh. Đoàn Thị Ái Thuyền và Nguyễn Văn Uyển (1999), vi ghép thành công cây cam quýt. Kết quả đạt đƣợc qua 2 nghiên cứu trên nhƣ sau:  Cách ghép chữ T ngƣợc cho kết quả tốt nhất trong thực hiện vi ghép  Tuổi cây ghép từ 10 – 20 ngày sau khi nảy mầm là tuổi gốc ghép cho kết quả tốt nhất.  Mắt ghép càng lớn sẽ cho khả năng sống của cây ghép càng cao, mắt ghép có kích thƣớc từ 0,1 – 0,15 mm cho tỷ lệ thành công của cây ghép là 20%; mắt ghép có kích thƣớc từ 0,2 – 0,3 mm cho tỷ lệ thành công 30%; mắt ghép có kích thƣớc từ 0,4 – 0,6 mm cho tỷ lệ cây sống 55%.  Trong một tuần mắt ghép đã đạt kích thƣớc 1,2 – 2 mm và sau 4 tuần chồi ghép đã có kích thƣớc 15 x 20 mm, rễ của gốc cũng mọc thêm nhiều rễ phụ. Cây ghép có thể trồng ra đất đƣợc. Viện nghiên cứu cây ăn quả miền nam (1995) đã tiến hành vi ghép thành công cây thuộc họ citrus và tiến hành trồng thử nghiệm ở 6 tỉnh khác nhau. Gốc ghép thứ nhất là cây Troyer và đỉnh sinh trƣởng đƣợc ghép lên là các loại cây ăn quả có giá trị kinh tế. Cây ghép đƣợc nuôi trong môi trƣờng MS lỏng với 7,5% đƣờng sau 40 – 60 ngày nuôi cây thì cây có từ 2 – 3 lá tuỳ theo giống, với cách ghép hình tam giác và đỉnh sinh trƣởng có kích thƣớc 0,1 – 0,16 mm. Gốc ghép lần hai là gốc Volkameriana đƣợc gieo trên giá thể đất. Cây ghép lần hai đƣợc nuôi trong thời gian từ 4 – 6 tháng thì có thể đem trồng ra vƣờn đƣợc. Lê Thị Thu Hồng (1997) đã tiến hành vi ghép trên cây thuộc họ cam quýt và kiểm tra tính chất sạch bệnh của cây vi ghép, kết quả cho thấy 52/53 cây đem kiểm tra đều sạch bệnh. Từ nguồn vật liệu ban đầu đến năm 1998 đã sản xuất 5.755 cây sạch 25 bệnh trên gốc Volkameriana gồm 960 cây quýt Đƣờng, 880 cây quýt Tiều, 240 cây Cam ngọt và 525 cây bƣởi Năm Roi. 2.4.2 Nghiên cứu ngoài nƣớc Năm 1952, Morel và Martin đã thành công khi tạo đƣợc cây sạch virus bằng nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng từ chồi nhiễm virus. Roistacher, 1972 đã xử lý cành ghép ở 500C bằng hơi nuớc nóng và loại bỏ đƣợc virus gây bệnh “nổ lá”, đồng thời ông cũng chứng minh đƣợc rằng có thể xử lý nhiệt để loại bỏ bệnh lùn cây không rõ nguyên nhân ở cam. Huang và Millikan, 1980; Ke và ctv 1993; Mantel và ctv, 1997; Navarro va Juarez, 1997; Perrin và ctv, 1994 đã ứng dụng thành công kỹ thuật vi ghép trên cây táo để tái sinh cây mới và tạo đƣợc cây sạch virus. Năm 1991, Navarro và ctv chứng minh rằng bệnh loét, bệnh greening và các dòng độc của virus tristeza đều có thể loại bỏ bằng kỹ thuật vi ghép. Năm 1992, Duran và cộng tác viên đã thành công khi tiến hành vi nhân giống và nuôi cấy mô cây cam ngọt. Năm 1995, Bowman đã thành công khi vi nhân giống gốc của cây citrus. Năm 1997, Turbull và ctv đã ứng dụng kỹ thuật vi ghép để kiểm tra khả năng tạo chồi trên cây thuộc họ Arabidopsis. Họ đã sử dụng kỹ thuật vi ghép đơn giản (1 gốc ghép – 1 chồi ghép) để kiểm tra sự tƣơng tác giữa gốc ghép với chồi ghép và kỹ thuật vi ghép hai chồi trên gốc để nghiên cứu tƣơng tác giữa hai chồi ghép với nhau. Qua nghiên cứu này, họ đã kết luận đƣợc rằng khả năng tạo chồi trên cây ghép do sự di chuyển từ gốc ghép sang chồi ghép và không có con đƣờng ngƣợc lại. Với phƣơng pháp vi ghép nhóm nghiên cứu có thể xác định những gen có liên quan đến các đặc tính của cây nhƣ thời gian ra hoa, hệ thống gen kháng và các phản ứng sinh học với stress. Cùng với kỹ thuật vi ghép này, A. Starrantino và ctv đã ứng dụng để phục hồi các cây citrus bị nhiễm bệnh virus bằng cách vi ghép đỉnh sinh trƣởng lên gốc đƣợc tạo từ hạt và thu đƣợc tỷ lệ sống 40%. Sau khi nghiên cứu các phƣơng pháp ghép khác nhau và dùng các chất kích thích tăng trƣởng họ đã cải thiện đƣợc tỷ lệ sống của cây vi ghép. Theo nhóm này nếu nhúng đỉnh sinh trƣởng và gốc ghép vào dung dịch 6-BAP ở 26 nồng độ 0.5 ppm trong 10 phút trƣớc khi ghép thì có thể nâng tỷ lệ sống của cây lên 73% – 91%, nhƣng thƣờng đạt 63%. Năm 1999, Carimi và ctv đã tái sinh đƣợc phôi vô tính và hình thành cây khi nuôi cấy lớp mỏng tế bào nhụy của cây citrus. Ở Jamaica, Potluri và Sasikala đã tiến hành ghép đỉnh chồi (0.1 – 1 mm) lên gốc cây kháng và đã thu đƣợc kết quả rất tốt. J. Dobranszki và ctv, 2000 đã nghiên cứu tìm ra phƣơng pháp làm tăng tỷ lệ sống của cây táo vi ghép và tạo đƣợc điều kiện duy trì sự tiếp xúc tốt giữa gốc và chồi ghép. Kết quả nghiên cứu cho thấy khi nhúng mặt cắt của gốc ghép và chồi ghép vào hỗn hợp acid citric 0.15 mg/l, ascorbic acid 0.1 mg/l và gibberellic acid 0.1 mg/l trƣớc khi ghép sẽ tăng tỷ lệ sống của cây vi ghép lên đến 95%. Một kết quả khác của nhóm là chồi ghép trƣớc khi đặt vào vị trí ghép trên gốc ghép nếu đƣợc nhúng vào dung dịch agar 0.1% thì khả năng dính của chồi ghép vào gốc ghép tốt hơn, agar làm cho sự dung hợp giữa gốc và chồi ghép tốt hơn cây ghép thích nghi nhanh và đạt tỷ lệ sống 100%. Năm 2001, Emmarol E .Mneney và Sinclair H .Mantell đã thành công khi tiến hành vi ghép trên cây điều thu đƣợc kết quả tỷ lệ thành công của cách ghép là 60% - 80 %, vị trí ghép không có sự khác biệt nhau khi xét trên khă năng thành công. Đồng thời các nhà khoa học đã tìm ra nồng độ các chất khống chế hoạt chất phenol của cây điều: với 200 µM ascorbic acid cho tỷ lệ thành công là 73%, 2mg/l Diethyl – dithocarabamate (DIECA) cho tỷ lệ thành công 55% và 3% (w/v) Polyvinyl purrolidone (PVP) cho tỷ lệ thành công 41%. Năm 2002, A .Onay và ctv đã thành công khi tiến hành vi ghép trên cây đào lạc kết quả thu đƣợc tỷ lệ thành công khi ghép là 70% khi cây ở 1 năm tuổi và 90% cây sống khi đem ra ngoài trồng. Năm 2003, trƣờng đại học Rajshahi ở Bangladesh đã thành công khi tiến hành tái sinh cây bƣởi từ mô sẹo và kết quả thu đƣợc khi nuôi cấy trên môi trƣờng MS có chất kích thích sinh tƣởng BAP với nồng độ 1 mg/l kết hợp với NAA 5 mg/l cho khả năng hình thành mô sẹo tốt nhất và các cây đạt 95% sống khi trồng ra đất. Năm 2003, tổ chức FFTC (Food and fertilizer technology center) ở châu Á đã thành công khi vi ghép trong nhà kính tạo cây cam sạch virus ở tỉnh Nghệ An. 27 Tháng 3 năm 2004, trƣờng đại học của California đã thành công khi tiến hành ghép chồi lên gốc cây kháng và đã thu đƣợc kết quả rất tốt cũng nhƣ việc xác định ảnh hƣởng của 2,4 – D, ABA và kinetin lên sự hình thành mô sẹo. Năm 2003 Bash, Jonh và ctv đã dùng kỹ thuật vi ghép kết hợp với xử lý nhiệt và hóa chất để tạo ra những cây citrus sạch bệnh. Kết quả đã tạo ra những cây citrus sạch bệnh mặc dù trƣớc đó họ đã dùng các đỉnh sinh trƣởng dƣơng tính với Citrus Tristeza Virus. 28 Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Thí nghiệm đƣợc tiến hành từ 1/3/2005 đến 1/8/2005 tại Bộ môn Công Nghệ Sinh Học trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh. 3.1 Vật liệu 3.1.1 Trang thiết bị và dụng cụ 3.1.1.1 Trang thiết bị Tủ cấy, nồi hấp, kính hiển vi, máy đo pH, cân điện tử, máy nƣớc cất, máy lạnh.. 3.1.1.2 Dụng cụ Dao ghép, dao cắt mẫu, kẹp, đĩa cấy, kéo, đèn cồn, nhíp... 3.1.2 Mẫu cấy Bƣởi dùng làm chồi ghép đƣợc lấy ở các nhà vƣờn trồng giống bƣởi có giá trị kinh tế cao (bƣởi Năm Roi ở Cần Thơ, bƣởi Da Xanh ở Bến Tre và bƣởi Đƣờng Lá Cam ở Đồng Nai). Bƣởi dùng làm gốc ghép đƣợc lấy từ các giống bƣởi có khả năng sinh trƣởng mạnh và sức chống chịu tốt nhƣ giống bƣởi Bồng ở Huế và giống bƣởi Xim Vang ở Đồng Nai. 3.1.3 Môi trƣờng nuôi cấy Môi trƣờng MS là môi trƣờng đƣợc dùng trong thí nghiệm kết hợp với các nồng độ khác nhau của chất kích thích sinh trƣởng. Môi trƣờng dùng để ƣơm hạt nảy mầm: môi trƣờng MS với 7g agar và không có chất kích thích nảy mầm. Môi trƣờng dùng để giâm cành và lấy chồi ghép: môi trƣờng MS kết hợp với 7g agar và 3 mg/l BA cùng với 0.1 mg/l NAA. Môi trƣờng dùng để nuôi cây sau khi ghép: môi trƣờng MS với nồng độ đƣờng cao 75 g/l kết hợp với chất kích thích ra rễ 0.5 mg/l. Môi trƣờng đƣợc chuẩn bị và hấp khử trùng ở 1210C, áp suất 1 atm, trong 25 phút. 29 Thành phần môi trƣờng MS (Murashige&Skoog, 1962) Bảng 3.1: Thành phần môi trƣờng MS (Murashige & Skoog) 3.2 Điều kiện nuôi cấy Cây ghép đƣợc đặt ở điều kiện nhiệt độ là 250C – 280C , ánh sáng đèn huỳnh quang (cƣờng độ ánh sáng: 50 – 100 µmol m-2 s-1), ẩm độ 60 – 65%, với thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày đêm. Đa lƣợng KNO3 1900 mg/l NH4NO3 1650 mg/l MgSO4 . 7H2O 370 mg/l CaCl2 .2H2O 440 mg/l KH2PO4 170 mg/l FeSO4 .7H2O 27.8 mg/l Na2EDTA 37.3 mg/l Vi lƣợng MnSO4 .4H2O 22.3 mg/l KI 0.83 mg/l H3BO3 6.2 mg/l ZnSO4 .7H2O 8.6 mg/l CuSO4 .5H2O 0.025 mg/l Na2MoO4 .2H2O 0.25 mg/l CoCl2 .6H2O 0.025 mg/l Vitamine Nicotinic acid 0.5 mg/l Pyridoxine-HCl 0.5 mg/l Thiamine-HCl 0.1 mg/l myo-Inositol 100 mg/l Aminoacid Glycine 3.0 mg/l Agar Agar 7 g/l Đƣờng Sucrose 75 g/l 30 Đối với giai đoạn tạo cây con làm gốc ghép thì hạt đƣợc ƣơm trong điều kiện tối hoàn toàn cho đến khi hạt nảy mầm thì chuyển ra điều kiện ở phòng nuôi cây bình thƣờng. 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 3.3.1 Bố trí thí nghiệm Thực hiện thí nghiệm vi ghép trên cây bƣởi với 3 yếu tố đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên. Yếu tố 1: Gốc ghép với 2 loại là gốc bƣởi Bồng và gốc bƣởi Xim Vang. Yếu tố 2: Chồi ghép với 3 loại là chồi bƣởi Năm Roi, chồi bƣởi Da Xanh và chồi bƣởi Đƣờng Lá Cam. Yếu tố 3: Cách ghép, có 3 cách ghép là cách ghép hàm ếch (E), cách ghép mặt cắt (M) và cách ghép chữ T ngƣợc (T). Tổ hợp 3 yếu tố ta có 18 nghiệm thức với 3 lần lặp lại, mỗi nghiệm thức tiến hành trên 5 cây, mỗi cây đƣợc nuôi cấy trong một ống nghiệm. Tổng cộng có 18*3*5 = 270 cây. Bảng 3.2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm NT Gốc ghép Chồi ghép Cách ghép 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Xim Vang (XV) Năm Roi (NR) Năm Roi (NR) Năm Roi (NR) Da Xanh (DX) Da Xanh (DX) Da Xanh (DX) Đƣờng Lá Cam (ĐLC) Đƣờng Lá Cam (ĐLC) Đƣờng Lá Cam (ĐLC) E T M E T M E T M Bồng (B) Năm Roi (NR) Năm Roi (NR) Năm Roi (NR) Da Xanh (DX) Da Xanh (DX) E T M E T 31 15 16 17 18 Da Xanh (DX) Đƣờng Lá Cam (ĐLC) Đƣờng Lá Cam (ĐLC) Đƣờng Lá Cam (ĐLC) M E T M Ghi chú: NT: Nghiệm thức 3.3.2 Chỉ tiêu theo dõi Thí nghiệm đƣợc theo dõi với các chỉ tiêu sau: (a) Tỷ lệ sống của cây vi ghép Cây vi ghép sống: là cây vi ghép (chồi trên gốc ghép) còn xanh và có mô sẹo hình thành nơi vết cắt sau 7 ngày vi ghép. Tỷ lệ sống của cây vi ghép (%) = (số cây vi ghép sống/tổng số cây vi ghép)*100. (b) Số chồi bật mầm của cây vi ghép Chồi mới đƣợc hình thành: là chồi mới bật lên từ chồi ghép ban đầu khi cây vi ghép còn sống (sau 7 ngày vi ghép). Tỷ lệ chồi mới đƣợc hình thành (%) = (số chồi mới đƣợc hình thành/số cây vi ghép sống). (c) Chiều cao chồi cây vi ghép (mm) Chiều cao chồi của cây vi ghép là chiều cao của chồi ghép đƣợc ghép lên gốc ghép. Tốc độ tăng trƣởng chiều cao (mm/7 ngày) = (chiều cao chồi 28 ngày sau vi ghép) – (chiều cao chồi 21 ngày sau vi ghép)/7 ngày. (d) Số lá của chồi ghép Số lá của chồi ghép là số lá có trên chồi ghép của cây vi ghép. Tốc độ ra lá (lá/7 ngày) = (số lá 28 ngày sau vi ghép) – (số lá 21 ngày sau vi ghép)/7 ngày 3.3.3 Xử lý số liệu Số liệu đƣợc xử lý dựa trên phần mềm Statgraphics 7.0 và Excel 3.3.4 Quy trình thí nghiệm Thí nghiệm đƣợc thực hiện theo quy trình sau: 32 Hình 3.1: Vi giâm cành bƣởi Da Xanh trên môi trƣờng MS a. Chuẩn bị chồi ghép Chồi bƣởi đƣợc nuôi cấy in vitro bằng phƣơng pháp vi giâm cành để tạo chồi ghép, dùng dao mổ cắt lấy đỉnh sinh trƣởng có kích thƣớc từ 0.1 – 1 mm, cắt nhọn phần gốc. Các cành non của các giống bƣởi dùng tạo chồi đƣợc cắt bỏ hết lá, cắt từng đoạn 2 – 3 cm, cho vào erlen rửa sạch bằng nƣớc xà phòng loãng, sau đó rửa sạch xà phòng bằng nƣớc cất nhiều lần. Đƣa mẫu vào tủ cấy vô trùng, lắc với cồn 700 trong 1 phút. Rửa sạch cồn bằng nƣớc cất vô trùng. Xử lý bằng nƣớc javel trong 30 phút, sau đó rửa sạch bằng nƣớc cất vô trùng. Cành mẫu sau đó đƣợc cắt bỏ cuống lá và hai đầu của phần thân đã bị chất khử trùng tẩy trắng và cắm các cành đó vào môi trƣờng MS có BA 3 mg/l + NAA 0.1 mg/l, cho phần cuống hƣớng lên trên, chồi ngủ phải nằm trên mặt môi trƣờng. 33 Hình 3.3: Hạt bƣởi Bồng đã khử trùng Nách lá chứa chồi Đỉnh sinh trƣởng Lá đầu tiên Biểu bì Biểu bì Mạch dẫn Mạch dẫn Hình 3.2: Cấu trúc chồi đỉnh Nuôi mẫu ở điều kiện ánh sáng 2000 lux, chiếu sáng 16 giờ/ngày, nhiệt độ 25 oC. Sau 3 tuần, các chồi ngủ bật mầm đƣợc tách ra và lấy chồi đỉnh nuôi trong môi trƣờng MS có BA 2 mg/l, sau 7 ngày lấy đỉnh sinh trƣởng để ghép. b. Chuẩn bị gốc ghép Gốc ghép đƣợc tạo ra bằng cách gieo hạt, cây mầm tạo ra đƣợc dùng làm gốc ghép. Hạt lấy trực tiếp từ trái chín, rửa sạch bằng nƣớc xà phòng loãng, sau đó rửa lại nhiều lần bằng nƣớc cất cho đến khi sạch hết lớp nhớt bám trên vỏ hạt, rồi cho vào erlen vô trùng, chuyển vào tủ cấy. Ngâm hạt trong cồn 700 trong 2 – 3 phút, sau đó rửa sạch cồn bằng nƣớc cất vô trùng 3 lần. Xử lý hạt bằng dung dịch nƣớc javel trong 30 phút. Rửa sạch lại bằng nƣớc cất khoảng 3 lần cho đến khi không còn mùi javel nữa. 34 Hình 3.4: Gốc ghép với ba cách ghép mắt cắt, chữ T ngƣợc và ghép vào lỗ trên thân (hàm ếch) Từng hạt đƣợc tách lớp vỏ trấu, vỏ lụa sau đó gieo vào các ống nghiệm Cây mầm cao 5 – 8 cm có thể chọn làm gốc ghép. Gốc ghép ở độ tuổi từ 14 – 20 ngày sau khi nảy mầm thì đƣợc cắt bỏ phần thân trên và rễ sao cho phần thân trên hai lá mầm còn khoảng 3 cm và phần rễ còn rễ trụ dài khoảng 2 cm. Gốc ghép đó đƣợc nuôi trong môi trƣờng MS có 75 g đƣờng và chất kích thích sinh trƣởng NAA 0.5 mg/l, sau 1 tuần gốc ghép sẵn sàng để ghép. c. Thực hiện vi ghép  Tạo chồi ghép: Chồi ghép là các đỉnh sinh trƣởng có kích thƣớc 0,1 – 1 mm đƣợc cắt từ đỉnh chồi của các giống bƣởi NR, DX và ĐLC sau khi nuôi cấy trong ống nghiệm.  Tạo gốc ghép: Các cây mầm B và XV đƣợc tạo ra trong ống nghiệm đƣợc cắt bỏ phần trụ trên lá mầm để lại phần thân cao khoảng 2 – 3 cm mang 2 lá mầm và rễ. Dùng dao nhọn cắt vào đƣờng kính thân, nơi vòng tƣợng tầng khoảng 1 mm chiều sâu, đặt chồi ghép vào. Mỗi cách cắt gốc ghép sẽ tạo ra một cách ghép khác nhau. Có các cách ghép chủ yếu sau: Ghép áp mặt cắt (M): đặt mắt ghép trực tiếp lên bề mặt vết cắt, ngay trên vòng tƣợng tầng. Ghép chữ T ngƣợc (T): dùng lƣỡi dao cắt vết ghép hình chữ T ngƣợc, chân chữ T đẻ lộ vùng tƣợng tầng là nơi đặt mắt ghép. Ghép hàm ếch (E): tạo vết ghép lõm hình hàm ếch sâu đến vùng tƣợng tầng, mắt ghép đặt vào đáy hàm ếch.  Ghép: chồi ghép đƣợc ghép lên vị trí cắt trên gốc ghép, tạo nên cây vi ghép. 35 d. Nuôi cây ghép Vi ghép là một kỹ thuật phối hợp giữa ghép và nuôi đỉnh sinh trƣởng. Cây vi ghép đƣợc nuôi trong môi trƣờng MS có bổ sung 0.5 mg/l NAA, nồng độ đƣờng là 7,5%, agar đƣợc dùng 7 g/l. Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Tỷ lệ sống của cây vi ghép Kỹ thuật vi ghép tạo cây có múi sạch bệnh và có khả năng chống chịu điều kiện khắc nghiệt của thời tiết đã đƣợc nhiều tác giả khác nhau trong và ngoài nƣớc tiến hành. Mỗi tác giả thu đƣợc một kết quả khác nhau và tỷ lệ sống của cây đƣợc nâng dần lên thông qua các kỹ thuật ngày càng tối tân hơn và việc dùng các chất kích thích khác nhau. Sau 4 tuần thí nghiệm, chúng tôi thu đƣợc kết quả sau: Bảng 4.1: Ảnh hƣởng của kỹ thuật vi ghép đến tỷ lệ sống của cây vi ghép NT Số cây vi ghép Số cây vi ghép sống Tỷ lệ sống của cây vi ghép (%) T1, 7 NSG T2, 14 NSG T3, 21 NSG T4, 28 NSG T1, 7 NSG T2, 14 NSG T3, 21NSG T4, 28 NSG 1 15 15 15 15 15 15 15 15 12 14 10 13 11 14 10 13 11 13 8 13 100 100 100 100 80,00 ab 93,33 a 66,67 ab 86,67 ab 73,33 abc 93,33 a 66,67 abc 86,67 ab 73,33 abcd 86,66 ab 53,33 bcd 86,66 ab 2 3 4 36 5 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 12 11 9 11 11 13 14 12 14 12 12 12 13 12 10 9 7 8 9 13 14 11 14 11 11 10 11 10 8 8 7 7 6 12 14 8 14 10 10 8 8 7 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 80,00 ab 73,33 ab 60,00 b 73,33 ab 73,33 ab 86,67 ab 93,33 a 80,00 ab 93,33 a 80,00 ab 80,00 ab 80,00 ab 86,67 ab 80,00 ab 66,67 abc 60,00 bc 46,67 c 53,33 c 60,00 bc 86,67 ab 93,33 a 73,33 abc 93,33 a 73,33 abc 73,33 abc 66,67 abc 73,33 abc 66,67 abc 53,33 bcd 53,33 bcd 46,67 cd 46,67 cd 40,00 d 80,00 abc 93,33 a 53,33 bcd 93,33 a 66,67 abcd 66,67 abcd 53,33 bcd 53,33 bcd 46,67 cd 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Ghi chú: NT: Nghiệm thức T1, 7 NSG: Tuần 1, 7 ngày sau ghép. T2, 14 NSG: Tuần 2, 14 ngày sau ghép. T3, 21 NSG: Tuần 3, 21 ngày sau ghép. T4, 28 NSG: Tuần 4, 28 ngày sau ghép. Các giá trị trung bình theo sau không cùng mẫu tự trong cùng một cột có sự khác biệt rất có ý nghĩa ở mức 0.05 dựa theo trắc nghiệm DUNCAN. Qua bảng ảnh hƣởng của kỹ thuật vi ghép đến tỷ lệ sống của cây vi ghép có thể nhận xét sau: Đối với gốc ghép  Ở tuần 1 (từ ngày 1 đến ngày thứ 7 sau vi ghép), các cây vi ghép sống toàn bộ (100%) và không có sự khác biệt về mặt thống kê giữa các loại cây vi ghép đƣợc tạo ra. Điều này có thể đƣợc giải thích do chồi ghép đƣợc Hình 4.1: Cây vi ghép hình thành rễ mới sau 21 ngày 37 Hình 4.2: Cây vi ghép ở tuần thứ 3 (XV-NR-M): gốc ghép Xim Vang, chồi ghép Năm Roi, cách ghép mặt cắt (M) nuôi cấy trƣớc một thời gian trên môi trƣờng có chất kích thích sinh trƣởng BA, dinh dƣỡng đƣợc chồi ghép hấp thụ có thể nuôi chồi ghép trong những ngày đầu vi ghép mà không bị ảnh hƣởng bởi dinh dƣỡng của gốc ghép.  Tuần thứ 2 (từ ngày 8 đến 14 sau vi ghép), tỷ lệ sống của cây vi ghép có giảm so với tuần 1 chứng tỏ có sự liên kết giữa chồi ghép và gốc ghép để hình thành hệ thống mạch dẫn. Gốc ghép XV đạt 76,29% sống và gốc ghép B đạt 84,44%, tuy nhiên sự khác biệt về tỷ lệ sống của hai loại gốc ghép này là không có ý nghĩa về mặt thống kê.  Sau 21 ngày vi ghép tỷ lệ sống của cây vi ghép có giảm và đều giảm ở cả hai loại gốc ghép. Sau 28 ngày vi ghép tỷ lệ sống của cây vi ghép đã ổn định, gốc ghép XV đạt 60% tỷ lệ sống và gốc ghép B đạt 77%. Chúng tôi nhận thấy rằng các cây vi ghép bị mất từ ngày 21 đến ngày 28 chủ yếu là do bị nhiễm nấm (điều kiện khách quan). Sự khác biệt về tỷ lệ sống của hai loại gốc ghép này là sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê và thấy rằng gốc ghép bƣởi B cho tỷ lệ sống 77% tốt hơn gốc ghép XV 60%. Đối với chồi ghép  Tỷ lệ thành công của cây vi ghép chủ yếu phụ thuộc vào tỷ lệ sống của chồi ghép. Nhận thấy ở tuần 1 tỷ lệ sống của chồi ghép đều đạt 100% và lý do nhƣ đã giải thích ở trên. Sự khác biệt về tỷ lệ sống của cây ghép ở tuần 2 (NR: 83,33%, DX: 82,22%, ĐLC: 75,56%) không có ý nghĩa về mặt thống kê. Tuy nhiên tỷ lệ sống của cây vi ghép ở tuần 3 lại có sự khác biệt về mặt thống kê, chồi NR: 81,11% và chồi DX: 75,56% tỷ lệ sống, tuy nhiên chồi ghép ĐLC chỉ đạt 61,12%.  Nhìn chung cả ba loại chồi ghép đều giảm tỷ lệ sống nhƣng có sự khác biệt của ba loại chồi ghép này, sự khác biệt này do nhiều điều kiện tác động mà trong đó sự tiếp xúc 38 giữa gốc ghép và chồi ghép để hình thành mô dẫn là điều kiện tiên quyết đến tỷ lệ sống của cây vi ghép. Tùy theo đặc tính di truyền của mỗi loại gốc, mỗi loại chồi khác nhau mà khả năng sinh trƣởng của cây vi ghép sẽ khác nhau ở tuần 4 để kết quả cuối cùng chồi ghép ĐLC đạt tỷ lệ sống 55,5%, chồi ghép DX đạt 72,22% và chồi ghép NR đạt 77,78%. Vậy thông qua phân tích thống kê nhận thấy chồi ghép NR và DX có tỷ lệ sống tốt hơn chồi ghép ĐLC và sự khác biệt này có ý nghĩa về mặt thống kê. Đối với cách ghép  Tỷ lệ sống của cây vi ghép phụ thuộc vào khả năng sinh trƣởng của gốc ghép để nuôi cây ghép. Đặc tính di truyền và khả năng hấp thu dinh dƣỡng của gốc ghép để nuôi chồi ghép cũng nhƣ cấu trúc di truyền và khả năng hấp thu dinh dƣỡng của chồi ghép, khả năng tiếp xúc của gốc ghép và chồi ghép để tạo hệ thống mạch dẫn vững chắc là điều kiện quyết định tỷ lệ sống của cây vi ghép. Mỗi cách ghép khác nhau cho khả năng tiếp xúc khác nhau của chồi ghép và gốc ghép, vậy có thể nói rằng cách ghép cũng góp phần vào tỷ lệ sống của cây vi ghép.  Chúng tôi nhận thấy từ tuần 1 đến tuần 3 tỷ lệ sống của cây vi ghép giảm dần và tỷ lệ sống của mỗi cách ghép mang lại có khác nhau nhƣng sự khác nhau này không có ý nghĩa về mặt thống kê. Tuy nhiên, ở tuần 2 và tuần 3 cách ghép chữ T cho tỷ lệ sống cao nhất và cao hơn hai cách ghép còn lại. Các cách ghép đều cho tỷ lệ sống nhƣ nhau, điều này chứng tỏ 3 cách ghép đều cho khả năng kết dính của gốc ghép và chồi ghép là nhƣ nhau.  Ở tuần 4 có sự khác biệt về tỷ lệ sống của cách ghép mang lại và sự khác nhau giữa ba cách ghép này là sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê. Với cách ghép E cho tỷ lệ sống cao nhất 77,55%, cách ghép chữ T cho tỷ lệ sống 71,11% và đây là hai cách ghép có sự tƣơng đồng về tỷ lệ sống. Cách ghép mặt cắt cho tỷ lệ sống thấp nhất 58,88% khác biệt với cách ghép chữ T và có sự tƣơng đồng với cách ghép E.  Thông qua sự quan sát về tỷ lệ sống của cây vi ghép, chúng tôi nhận thấy gốc ghép B cho tỷ lệ sống cao hơn gốc ghép XV; chồi ghép NR và DX cho tỷ lệ sống tốt hơn ĐLC; cách ghép E, chữ T cho tỷ lệ sống tốt hơn cách ghép M. Kết 39 quả này phù hợp với kết quả những nghiên cứu trƣớc đây của Viện CAQMN và các tác giả ngoài nƣớc. Về sự tƣơng tác của các yếu tố  Tƣơng tác của yếu tố gốc ghép và chồi ghép Khi xét về tỷ lệ sống của cây ghép thì sự tƣơng tác giữa gốc ghép và chồi ghép không có sự khác biệt về mặt thống kê trên các cây vi ghép tạo ra. Tuy nhiên, kết quả tƣơng tác giữa chúng cho thấy khả năng sống của gốc B và chồi ghép NR là tốt nhất (84%), kế đến là gốc B và chồi ghép DX (80%), và đây có thể là những cây có triển vọng tốt nhất khi xét về mặt sinh học.  Tƣơng tác giữa gốc ghép với cách ghép Kết quả tƣơng tác giữa gốc ghép với cách ghép không có sự khác biệt ở các cây ghép đƣợc tạo ra. Hay các cách ghép đƣợc tạo ra trên gốc ghép thì có tỷ lệ sống nhƣ nhau khi ghép chồi vào. Tuy không có sự khác biệt về mặt thống kê nhƣng kết quả tƣơng tác giữa chúng cho thấy gốc ghép B và cách ghép E, gốc ghép B và cách ghép T đạt tỷ lệ sống tốt hơn 4 loại cây ghép còn lại (>80%).  Tƣơng tác giữa chồi ghép và cách ghép Kết quả tƣơng tác giữa chồi ghép và cách ghép không có sự khác biệt về mặt thống kê. Tuy nhiên về mặt sinh học tỷ lệ sống của chồi ghép NR và cách ghép T, chồi ghép DX và cách ghép E đạt cao nhất là 90%, chồi ghép NR và cách ghép E đạt tỷ lệ sống 80%. Điều này cho thấy cách ghép E và T thích hợp hơn cho các loại chồi ghép.  Tƣơng tác giữa gốc ghép, chồi ghép và cách ghép Kết quả tƣơng tác giữa gốc ghép, chồi ghép và cách ghép là kết quả của cây vi ghép đƣợc sống qua sự tác động của các điều kiện ngoại cảnh nhƣ nhau và yếu tố di truyền hoàn toàn khác nhau, cũng nhƣ đó là kết quả cho những cây vi ghép tạo ra đƣợc sống. Kết quả tƣơng tác của gốc ghép, chồi ghép và cách ghép cho thấy các cây vi ghép đƣợc tạo ra có sự khác biệt về tỷ lệ sống và sự khác biệt này có ý nghĩa về mặt thống kê. Kết quả cho thấy cây ghép B-NR-T, B-DX-E, B-NR-E, đạt 93,33%, XV- NR-T, XV-DX-E đạt 86,67%. Đây là các loại cây ghép cho tỷ lệ sống cao nhất so với các cây còn lại. Cây XV-ĐLC-E, XV-ĐLC-T, XV-ĐLC-M cho tỷ lệ sống thấp nhất 40%. Các cây còn lại cho tỷ lệ sống trên 50%. Từ kết quả này cho thấy gốc ghép có 40 khả năng sinh trƣởng mạnh kết hợp với chồi ghép tốt và cách ghép phù hợp sẽ cho kết quả rất khả quan và ngƣợc lại. Vậy tỷ lệ sống của cây vi ghép là kết quả tƣơng tác của cả ba yếu tố gốc ghép, chồi ghép và cách ghép tạo nên. Tùy theo đặc tính của những loại chồi ghép mà có cách ghép phù hợp trên gốc ghép sẽ cho những kết quả về tỷ lệ sống khác nhau. 4.2 Khả năng hình thành chồi mới của cây vi ghép Cây vi ghép đƣợc tạo ra từ gốc ghép và chồi ghép thông qua cách ghép. Chồi đƣợc nuôi dƣỡng và lớn lên để hình thành cây ghép, sự sinh trƣởng của chồi ghép rất phức tạp và có nhiều dấu hiệu khác nhau thể hiện sự sinh trƣởng đó trên gốc đƣợc ghép. Khả năng hình thành chồi mới là một trong những dấu hiệu đáng đƣợc quan tâm. Bảng 4.2: Ảnh hƣởng của kỹ thuật vi ghép đến khả năng hình thành chồi mới của cây vi ghép NT Số cây vi ghép bật mầm Tỷ lệ bật mầm của cây vi ghép (%) T1 T2 T3 T1 T2 T3 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 3 2 0 0 1 3 2 0 2 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 b 0 b 0 b 33,33 ab 50 a 33,33 ab 0 b 0 b 16,67 ab 50 a 33,33 ab 0 b 33,33 ab 33,33 ab 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 41 Các giá trị trung bình theo sau không cùng mẫu tự trong cùng một cột có sự khác biệt rất có ý nghĩa ở mức 0.05 dựa theo trắc nghiệm DUNCAN Về gốc ghép 15 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 b 0 b 0 b 16,67 ab 16 17 18 42 Hình 4.3: Chồi ghép bật mầm ở tuần 3 (B-NR-T): gốc ghép bƣởi Bồng, chồi ghép năm Roi, cách ghép chữ T ngƣợc. Hình 4.4: Cây ghép B-DX-T: gốc ghép bƣởi Bồng, chồi ghép Da Xanh, cách ghép chữ T ngƣợc ở tuần 3  Chúng tôi nhận thấy rằng sự hình thành chồi mới của những chồi đƣợc ghép ở tuần 1 và tuần 2 thì không có. Điều này có thể do ở tuần 1 và tuần 2 là khoảng thời gian gốc ghép và chồi ghép thích nghi, tiếp xúc và hình thành mô dẫn thông qua sự hình thành mô sẹo giữa mặt cắt của gốc ghép với chồi ghép. Tất cả cây ghép trong giai đoạn này đều không có chồi mới. Ở tuần thứ 3, bắt đầu nhận thấy có một vài chồi mới xuất hiện và lớn dần. Tuy có sự chênh lệch về tỷ lệ bật mầm giữa các tuần nhƣng sự chênh lệch này không có ý nghĩa về mặt thống kê. Chồi đƣợc hình thành ổn định và lớn dần từ tuần thứ 3 sang tuần 4 và tiếp tục sự tăng trƣởng của nó. Về chồi ghép  Chồi ghép ở tuần 1 và 2 không có sự nảy mầm mới và lý do đƣợc giải thích tƣơng tự nhƣ trên. Nhận thấy rằng có sự khác nhau về tỷ lệ nảy chồi của chồi ghép (NR: 13,88%, DX: 30,55%, ĐLC: 5,55%) và sự khác biệt này có ý nghĩa về mặt thống kê.  Trong 3 loại chồi ghép thì chồi ghép DX cho tỷ lệ bật mầm cao nhất (30,55%) và sự khác biệt này có ý nghĩa về mặt thống kê so với hai loại chồi còn lại. Điều này có thể giải thích do đây là loại chồi ghép ở độ tuổi sinh trƣởng 43 mạnh nhất nên khả năng hình thành chồi mới rất tốt. Mặt khác do các chồi đƣợc nuôi trong một thời gian trƣớc khi ghép trên môi trƣờng có kích thích sinh trƣởng, chồi ghép hấp thu, tích tụ dinh dƣỡng cũng nhƣ chất kích thích sinh trƣởng. Kết quả là thúc đẩy sự bật mầm mới. Dinh dƣỡng đƣợc cung cấp tốt thông qua gốc ghép cũng tạo điều kiện thuận lợi cho cây ghép hình thành chồi mới. Khả năng biến dƣỡng của gốc ghép tốt cũng là điều kiện thuận lợi cho cây sinh trƣởng tốt hơn. Về cách ghép Cách ghép khác nhau cho khả năng tiếp xúc giữa chồi ghép và gốc ghép khác nhau, và đây cũng có thể là điều kiện quyết định sự nảy mầm. Tỷ lệ nảy mầm của cách ghép E và T là 19,44%, cao hơn so với cách ghép M: 11,11%. Tuy khả năng hình thành chồi mới có sự khác biệt giữa các cách ghép nhƣng sự khác biệt này không có ý nghĩa về mặt thống kê. Vậy có thể thấy rằng cách ghép E và T cho tỷ lệ nảy mầm nhƣ nhau và cao hơn cách ghép M. Tuy vậy khi xét về mặt thống kê thì ba cách ghép này đều tƣơng đồng nhau. Về sự tƣơng tác của các yếu tố  Tƣơng tác giữa gốc ghép và chồi ghép Chúng tôi nhận thấy rằng khi gốc ghép kết hợp với chồi ghép, sẽ có sự khác biệt về mặt thống kê giữa các gốc ghép và chồi ghép với nhau và sự khác biệt này có ý nghĩa về mặt thống kê. Cây ghép XV- DX cho 38,89% cây ghép nảy mầm mới, tuy nhiên đây chỉ là một trƣờng hợp đặc biệt trong khi XV-NR, XV-ĐLC lại cho tỷ lệ nảy mầm khá thấp. Xét trên cây B-NR, B-DX cho tỷ lệ nảy mầm 27,77% đồng đều nhau và B-ĐLC đạt 5,55% nảy mầm. Qua đó chúng tôi có thể nhận kết luận nhƣ sau: chồi ghép NR không phù hợp với gốc XV, cây ghép đều cho tỷ lệ nảy mầm là 0%.  Tƣơng tác của gốc ghép và cách ghép Kết quả cho thấy rằng có sự tƣơng đồng giữa các cách ghép và gốc ghép khi kết hợp với nhau khi xét về tỷ lệ nảy mầm. Tuy vậy, xét thấy rằng khi gốc B và cách ghép E cho tỷ lệ bật mầm 27,77% tốt hơn B-T (22,22%). Tuy nhiên XV-T đều cho tỷ lệ nảy mầm lớn hơn 10%. 44 Hình 4.5: Cây ghép B-DX-M: gốc ghép bƣởi Bồng, chồi ghép Da Xanh, cách ghép mặt cắt ở tuần 3  Tƣơng tác chồi ghép và cách ghép Qua bảng kết quả chúng tôi nhận thấy sự tƣơng tác giữa chồi ghép và cách ghép tạo nên các dạng cây ghép khác nhau khi trên cùng gốc ghép có sự tƣơng đồng nhau khi xét về mặt thống kê. Tuy nhiên, khi xét sự tƣơng tác của chồi ghép với cách ghép thì kết quả cho thấy chồi ghép DX với cách ghép T cho tỷ lệ nảy chồi là 41,67% và chồi ghép DX với cách ghép E cho tỷ lệ nảy chồi là 33,33%, tỷ lệ nảy chồi này cao hơn các cây còn lại. Nhận thấy chồi NR đƣợc ghép bằng cách ghép E cũng cho 25% cây bật mầm mới.  Tƣơng tác giữa gốc ghép, chồi ghép và cách ghép về tỷ lệ nảy mầm Ở tuần 3 tỷ lệ chồi bật mầm đã có sự khác biệt và sự khác biệt này có ý nghĩa về mặt thống kê học, kết quả tƣơng tác tuần 4 cho thấy không có sự khác biệt giữa chúng. Vậy ta thấy rằng chồi mới đƣợc hình thành chủ yếu ở tuần 3 và đó là kết quả tích tụ dinh dƣỡng cũng nhƣ đƣợc nuôi dƣỡng đầy đủ của gốc ghép. Kết quả cho thấy cây vi ghép B-NR-E và XV-DX-T cho tỷ lệ bật mầm cao nhất là 50%, cao hơn so với rất nhiều cây ghép khác. Tuy nhiên ta cũng thấy rằng cây B-NR-T, B-DX-E, B-DX-T, B-ĐLC-E, XV-DX-M, XV- DX-E cũng cho tỷ lệ nảy mầm là 33,33%. Chúng tôi nhận thấy rằng cây ghép có tỷ lệ bật mầm cao hơn 30% thì có chồi bật mầm chủ yếu là chồi DX và NR. Điều này cho thấy tỷ lệ bật mầm là kết quả tƣơng tác của gốc ghép và chồi ghép với vai trò nhƣ nhau, kết quả này cũng đã đƣợc chứng minh thông qua bảng kết quả ở phần trên. Vậy cây ghép XV-DX-T, B-NR-E là hai loại cây cho tỷ lệ bật mầm cao nhất so với các cây còn lại, tỷ lệ sống của hai loại cây này lớn hơn 50% (C5: 53,33%; C10: 86,67%). 45 A B Hình 4.6: Gốc bƣởi Xim Vang (trái) và gốc bƣởi Bồng (phải) với chồi ghép Năm Roi và cách ghép chữ T ngƣợc ở tuần 1 A: Gốc ghép Xim Vang, chồi ghép Năm Roi và cách ghép hàm ếch B: Gốc ghép Bồng, chồi ghép Da Xanh và cách ghép hàm E ếch Hình 4.7: Cây ghép ở tuần 1 4.3 Chiều cao chồi của cây vi ghép Chồi ghép đƣợc ghép lên gốc ghép và đƣợc gốc ghép nuôi dƣỡng, lớn lên và trở thành cây vi ghép hoàn chỉnh. Sự tăng về kích thƣớc và chiều cao của chồi ghép là kết quả tất yếu để tạo đƣợc cây vi ghép. Để chồi ghép tăng kích thƣớc và chiều cao thì sự liên kết của chồi ghép và gốc ghép là cần thiết để tạo thành mạch dẫn nuôi dƣỡng chồi. Ngoài ra khả năng biến dƣỡng của gốc ghép cũng là điều kiện quyết định sự biến đổi về chiều cao của chồi ghép. 46 Bảng 4.3: Ảnh hƣởng của kỹ thuật vi ghép đến chiều cao chồi của cây vi ghép NGHIỆM THỨC Chiều cao chồi của cây vi ghép (mm) T1 (7 NSG) T2 (14 NSG) T3 (21 NSG) T4 (28 NSG) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 0,75 0,83 0,75 0,83 0,87 0,80 0,83 0,83 0,83 0,87 0,79 0,83 0,79 0,83 0,83 0,87 0,83 0,83 1,21 a 1,16 bc 1,04 bc 1,50 a 1,29 ab 1,12 bc 1,25 abc 1,16 bc 1,25 abc 1,00 c 1,25 abc 1,16 bc 1,20 bc 1,29 ab 1,29 ab 1,29 ab 1,29 ab 1,25 abc 2,12 bcdefg 2,04 cdefg 1,62 h 2,41 ab 2,67 a 1,67 h 1,95 defgh 1,87 fgh 1,83 gh 1,87 fgh 2,30 bcdef 1,91 efgh 2,33 abc 2,12 bcdefg 2,29 bcd 2,25 bcde 2,41 ab 2,25 bcde 2,91 d 2,79 de 2,62 ef 3,58 b 3,83 a 2,37 g 2,45 fg 2,79 de 2,95 cd 2,87 d 3,87ª 3,62 b 3,96ª 2,91 d 3,86 a 2,83 d 3,12 c 3,83ª Các giá trị trung bình theo sau không cùng mẫu tự trong cùng một cột có sự khác biệt rất có ý nghĩa ở mức 0.05 dựa theo trắc nghiệm DUNCAN Về gốc ghép  Chúng tôi nhận thấy rằng chiều cao chồi trên hai loại gốc ghép ở tuần 1 là nhƣ nhau và đạt 0.8 mm. Điều này cho thấy các chồi có sự tƣơng đồng nhau về chiều cao ở tuần 1. Sau khi ghép đƣợc 1 tuần chiều cao chồi bắt đầu có sự biến đổi, tuy nhiên sự biến đổi này rất ít khi chồi đạt kích thƣớc 1.2 mm ở tuần 2. Với chiều cao chồi trên gốc XV là 1,22 mm và trên gốc B là 1,21 mm thì 47 không có sự khác biệt về chiều cao chồi trên 2 loại gốc ghép khi xét về mặt thống kê. Có thể thấy trong vòng 14 ngày sau khi ghép, chồi ghép có sự biến đổi rất chậm, tốc độ tăng trƣởng sau 14 ngày là 0,4 mm. Đây có thể là giai đoạn chồi ghép và gốc ghép thích nghi với nhau.  Tuy nhiên ở tuần 3, chiều cao chồi có sự khác biệt khi xét trên 2 loại gốc ghép và sự khác biệt này có ý nghĩa về mặt thống kê, chiều cao chồi trên gốc XV là 2,023 mm và chiều cao chồi trên gốc B là 2,18 mm. Qua kết quả này có thể nhận thấy rằng gốc B cho khả năng kéo dài chồi tốt hơn XV, tuy cả hai đều cho chiều cao chồi lớn hơn 2 mm sau 3 tuần vi ghép.  Chiều cao chồi ở tuần 4 trên 2 loại gốc ghép tiếp tục có sự khác biệt về mặt thống kê học và sự khác biệt này rất có ý nghĩa về mặt thống kê. Chiều cao chồi trung bình ở tuần 4 là 3.18 mm, chiều cao có sự tăng trƣởng rất nhanh so với tuần 3 chỉ là 2.11 mm. Có thể sau 3 tuần thích nghi giữa gốc ghép và chồi ghép, hệ thống mô dẫn đƣợc ổn định và sự tăng trƣởng về chiều cao của chồi ghép và cách ghép là tất yếu. Cũng có thể do cây ghép đƣợc nuôi dƣõng trong môi trƣờng có kích thích sinh trƣởng nên khả năng kéo dài chồi rất tốt sau giai đoạn thích nghi của chồi ghép và gốc ghép.  Chiều cao chồi trên gốc XV đạt 2,93 mm trong khi chiều cao chồi trên gốc B đạt 3,435 mm. Kết quả này càng chứng tỏ khả năng kéo dài chồi trên gốc B tốt hơn gốc XV và sự khác biệt này Hình 4.8: Chồi ghép Năm Roi trên gốc ghép bƣởi Bồng ở tuần 2 (trái) và tuần 3 (phải) 48 có ý nghĩa về mặt thống kê. Về chồi ghép  Sự tăng trƣởng về chiều cao chồi của chồi ghép là kết quả của gốc ghép nuôi dƣỡng chồi ghép và do đặc tính di truyền của chồi hay khả năng hấp thu chất kích thích sinh trƣởng và hấp thu dinh dƣỡng của chồi ghép tạo nên.  Chúng tôi nhận thấy chiều cao chồi ở tuần 1 của 3 loại chồi ghép có sự tƣơng đồng nhau và đạt 0.8 mm. Chồi tiếp tục tăng trƣởng chiều cao và sau 14 ngày vi ghép, chiều cao chồi ghép đã bắt đầu có sự khác biệt và sự khác biệt này có ý nghĩa về mặt thống kê học (chiều cao chồi NR đạt 1,14 mm, thấp hơn hai loại chồI DX và ĐLC là 1,25 mm và 1,27 mm). Sự khác biệt này chƣa thể kết luận điều gì vì đây chỉ là kết quả quan sát ở tuần thứ 2, sự chênh lệch chiều cao là 0,11mm.  Ở tuần 3 chiều cao của 3 loại chồi ghép có khác biệt và khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê học. Chồi ghép DX đạt chiều cao tốt nhất là 2,25 mm, cao hơn so với chiều cao chồi NR và ĐLC đạt 1,96 mm và 2,09 mm. Tuy nhiên, chúng tôi cũng nhận thấy rằng có sự tƣơng đồng về chiều cao của chồi NR và ĐLC, ở tuần 3 thì chiều cao chồi NR đạt 1,96 mm tuy thấp nhất trong 3 loại chồi ghép nhƣng ở đây có sự tăng trƣởng khá đồng đều về chiều cao của 3 loại chồi.  Qua kết quả đó có thể nói rằng chồi NR thích nghi chậm hơn hai loại chồi ghép còn lại và chồi DX là loại chồi thích nghi tốt nhất. Ở tuần 4 sự khác biệt về chiều cao 3 loại chồi ghép là sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê, chiều cao chồi DX đạt 3,42 mm cao nhất so với chồi NR 3,12 mm và ĐLC là 3 mm sau 28 ngày vi ghép. Sự khác biệt về chiều cao của 3 loại chồi ghép cho thấy chồi DX là chồi ghép tốt nhất, chồi NR tốt hơn ĐLC và sự khác biệt này có ý nghĩa về mặt thống kê. Về cách ghép: cách ghép quyết định khả năng kết dính của gốc ghép và chồi ghép, đồng thời có thể ảnh hƣởng đến chiều cao chồi vì những loại cách ghép khác nhau tạo một không gian và khả năng tiếp xúc khác nhau. 49  Chiều cao chồi trên 3 cách ghép ở tuần 1 và tuần 2 không có sự khác biệt về thống kê và mỗi cách ghép cho một chiều cao khác nhau. Ở tuần 2 cách ghép E đạt 1,24 mm, cách ghép T đạt 1,23 mm và cách ghép M đạt 1,2 mm.  Ở tuần 3 chúng tôi nhận thấy có sự khác biệt về chiều cao chồi trên 3 cách ghép khác nhau và sự khác biệt này có ý nghĩa về mặt thống kê. Chiều cao chồi ở cách ghép E đạt 2.16 mm có sự tƣơng đồng với cách ghép T là 2.22 mm và khác biệt với cách ghép M là 1.93 mm. Sự khác biệt này chứng tỏ cách ghép khác nhau sẽ tạo khả năng kéo dài chồi khác nhau.  Ở tuần 4 chiều cao chồi có sự biến đổi khi xét trên các cách ghép khác nhau. Sự khác biệt giữa chúng là sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê, cách ghép E đạt 3,104 mm thấp hơn cách ghép T là 3,22 mm và cách ghép T có sự tƣơng đồng với cách ghép M: 3,24 mm. Qua đó chúng tôi nhận thấy sự biến đổi về chiều cao chồi trên cách ghép E thấp hơn trên cách ghép T và M sau 28 ngày vi ghép. Điều này có thể do cách ghép E không tạo thuận lợi cho chồi phát triển vì sự giới hạn về kích thƣớc khi tạo hàm ếch. Cách ghép T và M có thể tạo thuận lợi hơn cho sự tăng trƣởng của chồi do tạo không gian tốt cho sự tăng trƣởng của chồi ghép. Về sự tƣơng tác của các yếu tố  Tƣơng quan giữa gốc ghép và chồi ghép: chúng tôi nhận thấy ở tuần 1 và tuần 2, sự tƣơng tác này không có sự khác biệt về mặt thống kê học. Tuy nhiên ở tuần 2, các chồi đều có chiều cao đạt 1,14 đến 1,3 mm.  Ở tuần 3 sự tƣơng tác giữa gốc và chồi ghép tạo những cây khác nhau và những cây ghép đƣợc tạo ra có sự khác biệt có ý nghĩa về chiều cao. Gốc XV và B tƣơng tác với chồi DX đều cho chiều cao chồi là 2,25 mm. Tuy nhiên cây ghép B-ĐLC cho chiều cao chồi là 2,3 mm và giữa các cây ghép này có sự tƣơng đồng nhau. Trong khi cây ghép XV-ĐLC chỉ cho chiều cao chồi 1,88 mm, chiều cao chồi của loại cây ghép này có sự khác biệt về mặt thống kê so với 3 loại cây B-DX, B-ĐLC và XV-ĐLC. Từ kết quả này cho thấy gốc ghép XV phù hợp với chồi ghép ĐLC.  Ở tuần 4, sự tƣơng tác tạo ra các cây với chiều cao chồi khác nhau và sự khác biệt này có ý nghĩa về mặt thống kê. Kết quả cho thấy B-NR và B-DX cho chiều cao chồi (3,458 mm) tốt hơn các loại cây ghép còn lại. Cây ghép B-ĐLC 50 và XV-DX có sự tƣơng đồng về chiều cao chồi (3,263 mm). Cây ghép XV-NR và XV-ĐLC có chiều cao chồi thấp nhất trong 6 loại cây ghép (2,7 mm) và sự khác biệt giữa 3 nhóm này là sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê.  Tƣơng tác giữa cách ghép và gốc ghép Cách ghép tạo thuận lợi cho chồi ghép tiếp xúc với gốc ghép để tạo nên chiều cao chồi ghép. Chúng tôi nhận thấy ở tuần 1 sự tƣơng tác này tạo ra các cây có chiều cao khác nhau nhƣng không có sự khác biệt về mặt thống kê. Tuy nhiên ở tuần 2 sự tƣơng tác này tạo ra các cây ghép có sự khác biệt có ý nghĩa về chiều cao chồi, (XV-E: 1,32 mm, XV-M: 1,14 mm).  Ở tuần 3 sự khác biệt về chiều cao chồi có ý nghĩa về mặt thống kê, B-T: 2,25 mm, XV-E: 2,16 mm, tuy nhiên XV-M cho chiều cao là 1,7 mm. Sở dĩ ở tuần 2 XV-E cho chiều cao chồi tốt hơn là do khả năng phát triển tốt của loại chồi đó. Ở tuần 4 sự khác biệt chiều cao chồi của các loại cây ghép là sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê. Kết quả cho thấy cây B-M có chiều cao chồi là 3,77 mm cao hơn cây B-T: 3.3 mm và cao hơn cây B-E: 3,22 mm, tuy nhiên cây XV-T có chiều cao chồi là 3,14 mm. Qua kết quả này cho thấy cây B-M cho sự tăng trƣởng của chiều cao chồi tốt hơn các cách ghép khác trên cùng gốc ghép. Do đó chúng ta có thể nói rằng cách ghép có ý nghĩa quyết định phần nào chiều cao chồi và gốc ghép cũng có ảnh hƣởng đến chiều cao chồi (B-T: 3,458 mm, XV-T: 3,26 mm).  Tƣơng tác giữa chồi ghép và cách ghép Nhƣ chúng ta đã biết cách ghép quyết định phần nào tỷ lệ sống của chồi ghép và cách ghép cũng quyết định khả năng hình thành chiều cao chồi ghép. Chúng tôi nhận thấy ở tuần 1, tuần 2 và tuần 3 sự tƣơng tác giữa chồi ghép và cách ghép tạo nên sự đa dạng về chiều cao của chồi ghép nhƣng không có sự khác biệt về mặt thống kê. Tuy vậy sự kết hợp đó tạo ra các chiều cao khác nhau, DX-T và DX-E thì tạo chiều cao chồi tốt hơn DX-M và kết quả này cũng tƣơng tự cho hai loại chồi ghép còn lại. Sự khác biệt về chiều cao chồi ở tuần 4 khi xét sự tƣơng tác của chồi ghép và cách ghép là sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê. Xét trên sự tƣơng tác này thì chồi DX-E cho kết quả tốt nhất về khả năng tăng trƣởng chiều cao chồi (3,77 mm). Tƣơng 51 tác của NR-T, DX-T, ĐLC-M cho khả năng kéo dài chồi tƣơng tự nhau là 3.3 mm. Tƣơng tác giữa NR-E, NR-M, DX-M, ĐLC-T cho khả năng kéo dài chồi tƣơng tự nhau ( 2,89 – 3,12 mm), ĐLC-E cho chiều cao chồi thấp nhất là 2,64 mm. Và sự tƣơng tác này khá phức tạp khi xét về mặt sinh học.  Tƣơng tác giữa gốc ghép, chồi ghép và cách ghép Kết quả sự tƣơng tác của gốc ghép, chồi ghép và cách ghép tạo ra các loại cây khác nhau và khả năng kéo dài chồi ghép cũng khác nhau. Chiều cao chồi ghép của các loạicây ghép khác nhau ở tuần 3 có sự khác biệt về chiều cao chồi có ý nghĩa về mặt thống kê. Loại cây ghép XV-DX-T, B-ĐLC-T, B-DX-E là những loại cây có sự tăng trƣởng khá tốt về chiều cao chồi, tƣơng ứng với 2,67 mm, 2,41 mm và 2,42 mm và có sự tƣơng đồng nhau về chiều cao chồi. Tuy nhiên cũng có những cây XV-NR-M, XV- DX-M, XV-ĐLC-M có chiều cao chồi khá thấp tƣơng ứng 1,625 mm, 1,67 mm và 1,83 mm. Hai nhóm cây này có sự khác biệt chiều cao chồi có ý nghĩa về mặt thống kê.  Ở tuần 4 sự khác biệt về chiều cao chồi có ý nghĩa về mặt thống kê và cho thấy đây là kết quả tƣơng tác của các yếu tố khác nhau. Cây B-DX-E, B-DX-M, B- NR-T, B-ĐLC-M, XV-DX-T đều đạt chiều cao từ 3,83 mm đến 3,958 mm. Sự tƣơng đồng của các loại cây này cho thấy đây là những loại cây có mức sinh trƣởng nhƣ nhau và đa số là cây ghép có gốc B, chồi ghép là NR và DX. Chiều cao thấp nhất của chồi ghép ở loại cây XV-DX-M và XV-ĐLC-E có thể do hạn chế về kỹ thuật ghép hay do sự khác nhau của hệ thống di truyền và điều kiện khác nhau mà cây có chiều cao khá thấp (2,375 mm) sau 28 ngày vi ghép. 52 4.4 Số lá của cây vi ghép Số lá cây ghép đƣợc hình thành là một trong những dấu hiệu chứng tỏ có sự liên kết và tác động qua lại của gốc ghép, chồi ghép và cách ghép Bảng 4.4: Ảnh hƣởng của kỹ thuật vi ghép đến số lá đƣợc hình thành của cây vi ghép NGHIỆM THỨC Số lá của cây vi ghép (số lƣợng) T1 (7 NSG) T2 (14 NSG) T3 (21 NSG) T4 (28 NSG) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 2,00 a 1,67 ab 1,33 b 1,33 b 1,67 ab 1,33 b 1,67 ab 1,67 ab 1,67 ab 1,67 ab 1,67 ab 1,5 ab 1,33 b 2,00 a 1,67 ab 1,33 b 1,83 ab 1,67 ab 2,50 abc 1,83 cd 1,50 d 2,33 abc 2,17 bcd 2,17 bcd 2,67 ab 2,33 abc 2,17 bcd 2,33 abc 2,33 abc 2,17 bcd 2,17 bcd 2,00 bcd 2,17 bcd 2,17 bcd 2,17 bcd 3,00 a 3,33 abc 2,83 bcd 2,16 d 2,83 bcd 3,83 ab 2,83 bcd 2,67 cd 2,50 cd 2,83 bcd 2,67 cd 4,16 a 2,83 bcd 4,33 a 2,83 bcd 2,83 bcd 2,50 cd 2,83 bcd 3,83 ab 3,83 abcde 3,80 abcde 2,00 g 3,70 bcdef 4,50 ab 3,10 def 3,67 bcdef 3,00 ef 3,00 ef 4,00 abcd 4,67ª 3,33 cdef 4,67ª 4,20 abc 3,20 def 2,80 fg 4,00 abcd 3,80 abcde 53 Các giá trị trung bình theo sau không cùng mẫu tự trong cùng một cột có sự khác biệt rất có ý nghĩa ở mức 0.05 dựa theo trắc nghiệm DUNCAN. Về gốc ghép  Số lá trung bình ở tuần 1 trên cả hai loại gốc ghép đạt 1,61 lá. Số lá của chồi trên gốc XV là 1,29 lá và trên gốc B là 1,62 lá. Giữa hai gốc ghép này có sự tƣơng đồng về số lá của chồi ghép. Số lá trung bình ở tuần 2 trên cả hai loại gốc ghép đạt 2,23 lá. Ở đây chúng tôi nhận thấy rằng có sự khác biệt về số lá trên gốc XV và gốc B khi xét về mặt thống kê học.  Ở tuần 3 số lá trung bình đạt 3,04 lá. Tuy không có sự khác biệt về mặt thống kê học, số lá trên gốc XV là 2,88 lá, thấp hơn số lá trên gốc B là 3,2 lá, mặc dù số lá ban đầu của hai loại gốc ghép này là nhƣ nhau. Sau 28 ngày vi ghép số lá của chồi ghép có sự tăng trƣởng và tốc độ tăng trƣởng trung bình là 2,019 lá. Vậy ta thấy rằ