Khóa luận Nghiên cứu kỹ thuật tạo hạt nhân tạo từ phôi cây lan vanda

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  NỘI DUNG 1: NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT TẠO HẠT NHÂN TẠO TỪ PHÔI CÂY LAN VANDA NỘI DUNG 2: KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA MYCORRHIZA TRÊN MỘT SỐ GIỐNG LAN Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khoá: 2003-2007 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN HOÀNG QUÂN Thành phố Hồ Chí Minh -2007- BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  NỘI DUNG 1: NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT TẠO HẠT NHÂN TẠO TỪ PHÔI CÂY LAN VANDA NỘI DUNG 2: KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA MYCORRHIZA TRÊN MỘT SỐ GIỐNG LAN Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện TS.TRẦN THỊ DUNG NGUYỄN HOÀNG QUÂN ThS.TỪ THỊ MỸ THUẬN Thành phố Hồ Chí Minh -2007- ii LỜI CẢM ƠN Thành kính khắc ghi công ơn cha mẹ đã tận tụy suốt đời vì con để con có được ngày hôm nay. Xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Trần Thị Dung và ThS. Từ Thị Mỹ Thuận đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành luận văn tốt nghiệp này. Chân thành cảm ơn: - Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nông Lâm - Quý thầy cô trường Đại Học Nông Lâm - Quý thầy cô Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học. Đã tận tình truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập cũng như thực hiện luận văn này. Xin gởi lời cảm ơn đến: KS Nguyễn Thị Thu Hằng, KS Lê Hồng Thuỷ Tiên cùng tập thể cán bộ nhân viên Trung Tâm Công Nghệ Sinh Học và Phòng Thực Tập Bệnh Cây trường Đại Học Nông Lâm, cùng tất cả bạn bè trong và ngoài lớp Công Nghệ Sinh Học 29 đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong thời gian học tập và thực hiện đề tài. TP. Hồ Chí Minh, Ngày 25 tháng 8 năm 2007 Sinh viên Nguyễn Hoàng Quân iii TÓM TẮT NGUYỄN HOÀNG QUÂN, sinh viên bộ môn Công Nghệ Sinh Học khoá 29, Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2007 ĐỀ TÀI: NỘI DUNG 1: NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT TẠO HẠT NHÂN TẠO TỪ PHÔI CÂY LAN VANDA. NỘI DUNG 2: KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA MYCORRHIZA TRÊN MỘT SỐ GIỐNG LAN Giảng viên hƣớng dẫn: TS. TRẦN THỊ DUNG ThS. TỪ THỊ MỸ THUẬN Đề tài đƣợc tiến hành tại Trung Tâm Công Nghệ Sinh Học- Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh, thời gian thực hiện từ tháng 3/2007 đến tháng 8/2007 Nội dung 1: Nghiên cứu kỹ thuật tạo hạt nhân tạo từ phôi cây lan Vanda Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ sodium alginate đến sự hình thành hạt nhân tạo. Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên 1 yếu tố, gồm 5 nghiệm thức, lặp lại 3 lần. Kết quả thu đƣợc ở nồng độ 30 g/l cho vỏ hạt nhân tạo tròn, đều, đẹp và tỷ lệ nẩy mầm cao. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của môi trƣờng tạo hạt nhân tạo Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên 1 yếu tố, gồm 4 nghiệm thức, lăp lại 3 lần Kết quả thu đƣợc ở môi trƣờng dinh dƣỡng ½ MS, hạt nhân tạo c ủa phôi lan Vanda cho tỷ lệ sống sót và nẩy mầm cao. iv Thí nghiệm 3: Khảo sát môi trƣờng bảo quản hạt nhân tạo Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên 1 yếu tố, gồm 6 nghiệm thức, 3 lần lặp lại. Môi trƣờng MS bảo quản hạt tốt nhất, cho hạt nhân tạo có tỷ lệ nẩy mầm cao nhất sau khi bảo quản. Thí nghiệm 4: Khảo sát sự nẩy mầm của hạt nhân tạo trên các giá thể khác nhau Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên 1 yếu tố, gồm 3 nghiệm thức, 3 lần lặp lại. Tỷ lệ hạt nhân tạo nẩy mầm trên bông gòn cao nhất (khoảng 100%) Nội dung 2: Khảo sát sự hiện diện của mycorrhiza trên một số giống lan Kết quả khảo sát cho thấy mycorrhiza có các dạng sau: -Sợi nấm ăn màu xanh, phân nhiều nhánh ăn xuyên qua nhiều lớp tế bào -Sợi nấm cuộn tròn trong 1 tế bào -Sợi nấm là các cuộn tròn nằm ở các tế bào, nối với nhau bằng sợi nấm Giữa các giống lan trồng, tỷ lệ hiện diện của mycorrhiza có sự khác nhau do nguồn gốc của giống v SUMMARY NGUYEN HOANG QUAN, student of Biotechnological faculty chronology 29, Nong Lam University of Ho Chi Minh City, 8 -2007. TOPIC: CONTENT 1: RESEACHING TECHNOLOGY DOES ARTIFICIAL SEED FROM SOMATIC EMBRYONIC VANDA ORCHID. CONTENT 2: EXAMINING PRESENCE OF MYCORRHIZA ON SOME ORCHID GENUS Supervisor: TRAN THI DUNG, ph.D TU THI MY THUAN, M.D Topic was doen at Biotechnological Centre- Nong Lam University of Ho Chi Minh City, doen from 3-2007 to 8-2007. CONTENT 1: RESEACHING TECHNOLOGY DOES ARTIFICIAL SEED FROM SOMATIC EMBRYONIC VANDA ORCHID. Experiment 1: Examining sodium alginate strength influenced artificial seed formation. Experimentation was set quite accident one factor, include 5 assays, 3 times repetition. Resulting in 30 g/l strength gave full, nice artificial seed shell and ratio of germination highly Experiment 2: Examining influence of nutritional environment do artificial seed. Experimentation was set quite accident one factor, include 4 assays, 3 times repetition. vi Resulting in ½ MS nutritional environment gave ratio of life and germination highly, consist with artificial seed from embryonic Vanda. Experiment 3: Examining maintainable environment arfiticial seed. Experimentation was set quite accident one factor, include 6 assays, 3 times repetition. MS environment maintained seed better, gave germinant ratio higher after maintenance. Experiment 4: Examining germination of arfiticial seed on different substances. Experimentation was set quite accident one factor, include 3 assays, 3 times repetition. Ratio of germinant arfiticial seed on the silk- coton was highest. CONTENT 2: EXAMINING PRESENCE OF MYCORRHIZA ON SOME ORCHID GENUS. Resulting in mycorrhiza had forms: - The hyphae was dyed with blue, divided many branches across root cells. - The hyphae scrolled in one cell. - Hypha cirumvolutions entered into cells, allyed each other by the hyphae. The present ratio of mycorrhiza had difference among orchid genus because of growing simulant origin. vii MỤC LỤC Trang Trang tựa .......................................................................................................... i Lời cảm ơn ....................................................................................................... ii Tóm tắt ............................................................................................................. iii Summary .......................................................................................................... v Mục lục ............................................................................................................. vii Danh sách các bảng .......................................................................................... x Danh sách các biểu đồ ...................................................................................... xi Danh sách các hình ........................................................................................... xii 1 GIỚI THIỆU ................................................................................................. 1 1.1 Đặt vấn đề .................................................................................................. 1 1.2 Mục tiêu nghiên cứu ................................................................................... 2 1.2.1 Mục đích .................................................................................................. 2 1.2.2 Yêu cầu .................................................................................................... 3 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................. 4 2.1 Khái quát về cây lan ................................................................................... 4 2.1.1 Phân loại thực vật học ............................................................................. 4 2.1.2 Lịch sử cây lan ....................................................................................... 4 2.1.3 Tình hình sản xuất lan ............................................................................. 5 2.1.4 Đặc điểm thực vật học của cây lan .......................................................... 6 2.1.4.1 Cơ quan dinh dƣỡng ............................................................................. 6 2.1.4.2 Cơ quan sinh dục của lan- tổ chức hoa ................................................ 7 2.1.5 Các điều kiện cơ bản cho cây lan ............................................................ 8 2.1.6 Các phƣơng pháp nhân giống lan ............................................................ 8 2.1.6.1 Gieo hột ................................................................................................ 8 2.1.6.2 Tách chiết ............................................................................................. 9 viii 2.2 Phƣơng pháp nuôi cấy mô lan …………………………………………...10 2.2.1 Khái quát về lịch sử nuôi cấy mô ............................................................ 10 2.2.2 Các phƣơng pháp nuôi cấy ...................................................................... 10 2.2.3 Chất dinh dƣỡng trong môi trƣờng nuôi cấy in vitro .............................. 12 2.2.4 Các bƣớc nhân giống in vitro .................................................................. 14 2.2.5 Các yếu tố ảnh hƣởng nhân giống in vitro .............................................. 15 2.3 Công nghệ tạo hạt nhân tạo……………………………………….. 16 2.3.1 Khái niệm ................................................................................................ 16 2.3.2 Mục đích .................................................................................................. 16 2.3.3 Các nhân tố tạo hạt nhân tạo ................................................................... 17 2.3.3.1 Tạo phôi vô tính ................................................................................... 17 2.3.3.2 Cơ chế phát sinh phôi soma ................................................................. 18 2.3.3.3 Tạo vỏ bọc bằng sodium alginate ........................................................ 19 2.3.3.4 Quy trình tạo hạt nhân tạo .................................................................... 21 2.4 Nấm rễ cộng sinh- mycorrhiza………………………………………….. 22 2.4.1 Khái niệm ................................................................................................ 22 2.4.2 Các dạng mycorrhiza ............................................................................... 23 2.4.2.1 Ectomycorrhiza ................................................................................... 23 2.4.2.2 Endomycorrhiza ................................................................................... 23 2.4.3 Tác động có ích của mycorrhiza ............................................................. 24 2.4.3.1 Mở rộng diện tích hấp thu của rễ cây ................................................... 24 2.4.3.2 Sự trao đổi dinh dƣỡng ......................................................................... 24 2.4.3.3 Sự hình thành chất kích thích sinh trƣởng mycorrhiza ........................ 24 2.4.3.4 Nâng cao sức chống chịu của cây ........................................................ 25 2.4.3.5 Tăng khả năng kháng bệnh của cây trồng ............................................ 25 2.4.4 Sự xâm nhập của mycorrhiza .................................................................. 25 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................... 26 3.1 Đối tƣợng thí nghiệm .................................................................................. 26 3.2 Thời gian thực hiện ..................................................................................... 26 3.3 Nội dung nghiên cứu ................................................................................... 26 3.4 Vật liệu nghiên cứu ..................................................................................... 27 ix 3.4.1 Trang thiết bị và dụng cụ nghiên cứu………………………………. 27 3.4.2 Mẫu sử dụng và điều kiện nuôi cấy………………………………….. 27 3.4.3 Môi trƣờng sử dụng……………………………………………… 27 3.5 Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................. 28 3.5.1 Chuẩn bị môi trƣờng……………………………………………….. 28 3.5.2 Bố trí thí nghiệm ……………………………………………………29 3.6 Xử lý số liệu …………………………………………………………..32 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................................... 33 4.1 Nội dung 1: Nghiên cứu kỹ thuật tạo hạt nhân tạo từ phôi cây lan ............ 33 4.1.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ sodium alginate đến sự hình thành hạt nhân tạo .............................................................................. 36 4.1.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của môi trƣờng tạo hạt nhân tạo… 39 4.1.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát môi trƣờng bảo quản……………………. 41 4.1.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát khả năng nẩy mầm của hạt……………. 43 4.2 Nội dung 2: Khảo sát sự hiện diện của mycorrhiza ở các giống lan........... 45 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................... 49 5.1 Kết luận ...................................................................................................... 49 5.2 Đề nghị ....................................................................................................... 50 6 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................. 51 7 PHỤ LỤC ...................................................................................................... 53 x DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1: Sự phát triển của mô trên môi trƣờng nuôi cấy ....................................... 17 Bảng 4.1: Nồng độ alginate ảnh hƣởng lên hình thái vỏ hạt nhân tạo ..................... 36 Bảng 4.2: Tỷ lệ sống của hạt nhân tạo ở các nồng độ alginate ................................ 38 Bảng 4.3: Tỷ lệ nẩy mầm của hạt nhân tạo ở các nồng độ alginate khácnhau… .... 39 Bảng 4.4: Tỷ lệ sống của hạt nhân tạo ở các môi trƣờng dinh dƣỡng khác nhau… 40 Bảng 4.5: Tỷ lệ nẩy mầm của hạt nhân tạo ở các môi trƣờng dinh dƣỡng .............. 42 Bảng 4.6: Khảo sát ảnh hƣởng của môi trƣờng bảo quản hạt nhân tạo ................... 42 Bảng 4.7: Tỷ lệ nẩy mầm của hạt nhân tạo sau khi bảo quản .................................. 43 Bảng 4.8: Tỷ lệ hạt nhân tạo nẩy mầm trên các giá thể ........................................... 44 Bảng 4.9: Sự hiện diện của mycorrhiza trên các giống lan ..................................... 45 xi DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 4-1: Tỷ lệ sống của hạt nhân tạo ở các nồng độ alginate khác nhau . 38 Biểu đồ 4-2: Tỷ lệ sống sót của hạt nhân tạo ở môi trƣờng khác nhau .......... 40 Biểu đồ 4-3: Sự hiện diện của mycorrhiza trên các giống lan ........................ 46 xii DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2-1: Cấu tạo hoa lan ............................................................................... 8 Hình 2-2: Cấu tạo hạt nhân tạo ....................................................................... 16 Hình 2-3: Các giai đoạn phát sinh phôi soma ................................................. 19 Hình 2-4: Công thức hoá học của alginate ...................................................... 20 Hình 2-5: Các dạng phôi soma ............................................................................................ 21 Hình 2-6: Quy trình tạo hạt nhân tạo .............................................................. 22 Hình 4-1: Các dạng phôi vô tính ..................................................................... 33 Hình 4-2: Cấu trúc của phôi vô tính ................................................................. 34 Hình 4-3: Môi trƣờng tạo hạt nhân tạo ............................................................ 34 Hình 4-4: Các bƣớc tạo hạt nhân tạo................................................................ 35 Hình 4-5: Sự hình thành hạt nhân tạo ............................................................. 35 Hình 4-6: Cấu tạo vi thể của hạt nhân tạo ........................................................ 36 Hình 4-7: Hạt nhân tạo ở các nồng độ alginate ............................................... 37 Hình 4-8: Hạt nhân tạo nẩy mầm .................................................................... 39 Hình 4-9: Hạt nhân tạo trên các môi trƣờng bảo quản .................................... 42 Hình 4-10: Hạt nhân tạo nẩy mầm trên các giá thể ......................................... 44 Hình 4-11: Vùng mô có mycorrhiza ................................................................ 47 Hình 4-13: Các dạng mycorrhiza .................................................................... 47 Hình 4-12: Dạng mycorrhiza cuộn tròn .......................................................... 48 1 CHƢƠNG I GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Hiện nay, xã hội chúng ta ngày càng phát triển và hiện đại. Cuộc sống thƣờng bị áp lực nặng nề từ công việc.Vì vậy nhu cầu giải trí và vui chơi lành mạnh là rất cần thiết đối với mỗi ngƣời. Trong đó chơi hoa, cây cảnh cũng là một thú vui tao nhã, giúp chúng ta hoà quyện vào thiên nhiên, nâng cao chất lƣợng đời sống, giúp ta sống lâu sống khoẻ. Hoa là biểu tƣợng cho vẻ đẹp và điều thánh thiện. Mỗi loài hoa có màu sắc, hƣơng thơm đặc trƣng cho từng loài, cho từng vùng, từng miền.Từng loài hoa lại tƣợng trƣng cho tính cách của mỗi ngƣời, mỗi biểu tƣợng trong cuộc sống, đại diện cho tình yêu, tình bạn, tình cảm con ngƣời. Hiện nay hoa đã trở nên phổ biến rộng rãi đối với tất cả mỗi ngƣời, là món quà, là thông điệp trao nhau trong những ngày lễ, ngày kỉ niệm, ngày họp mặt. Hoa cũng đƣợc xem nhƣ một vật trang trí trong nhà tăng vẻ mỹ quan, gần gũi với thiên nhiên. Nhiều lễ hội về hoa đã đƣợc tổ chức ở các quốc gia. Trong đó, hoa lan hiện đƣợc nhiều ngƣời rất quan tâm và không những cảm mến trƣớc vẻ đẹp của hoa mà còn thắc mắc, tìm hiểu cách sinh tồn của lan trong tự nhiên. Lan rất đa dạng phong phú về màu sắc, hƣơng thơm, chủng loại và đặc biệt là phân bổ rộng khắp thế giới. Ngƣời trồng lan thƣờng đƣợc ví nhƣ một nghệ nhân, còn ngƣời thƣởng thức vẻ đẹp của chúng đƣợc xem nhƣ là nghệ sĩ. Về mặt kinh tế, trồng và kinh doanh hoa lan là một ngành đem lại lợi nhuận cao. Giá trị sản lƣợng hoa lan thế giới ngày nay lên tới hàng tỷ đô la. Vì vậy các nƣớc Hà Lan, Đức, Thái Lan, Philippin, Malaysia… vốn đã nổi tiếng về nghề trồng lan thì nay họ phát triển hơn nữa quy trình sản xuất lan nhanh hiệu quả hơn. Đồng 2 thời, đẩy mạnh lai tạo giống để chọn ra những giống mới lạ, khả năng chịu đựng với hoàn cảnh khắc nghiệt của tự nhiên.Việt Nam chúng ta cũng nghiên cứu rất nhiều về lan, đặc biệt là kỹ thuật nhân giống nhanh bằng kĩ thuật nuôi cấy mô. Đặc biệt, cây lan rất khó gieo hạt ngoài tự nhiên, đa phần muốn nhân giống nhanh thƣờng áp dụng tách chiết hoặc nuôi cấy in vitro. Với sự phát triển của kỹ thuật tạo hạt nhân tạo, chúng ta có thể ứng dụng lấy phôi soma cho bọc vỏ nhân tạo có chứa môi trƣờng dinh dƣỡng, nhằm bảo quản phôi và tạo điều kiện cho hạt nhân tạo nẩy mầm. Với kỹ thuật này, thì khắc phục hạn chế nẩy mầm của hạt lan trong tự nhiên, và giúp nhân nhanh các giống lan trồng và các loài thực vật khó nẩy mầm trong tự nhiên. Trong hệ sinh thái nông nghiệp, rất nhiều nấm có lợi cho cây trồng, nấm cộng sinh với rễ là rất phổ biến, chúng giúp cây nhận đƣợc một số chất khoáng từ đất, nhất là tăng cƣờng hấp thụ photpho dễ dàng, giúp cây tăng trƣởng nhanh, đồng thời cây lại cung cấp nguồn cacbon cho nấm, thƣờng đƣợc gọi là mycorrhiza. Nắm bắt đƣợc mối quan hệ đó, chúng ta có thể ứng dụng vào lĩnh vực sản xuất cây in vitro. Vì vậy, cần phải có nhiều nghiên cứu hơn nữa về mycorrhiza, đặc biệt là trên rễ lan. Đƣợc sự đồng ý của bộ môn Công Nghệ Sinh Học cùng với sự hƣớng dẫn tận tình của TS Trần Thị Dung, ThS Từ Thị Mỹ Thuận, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài này gồm hai nội dung: NỘI DUNG 1: NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT TẠO HẠT NHÂN TẠO TỪ PHÔI CÂY LAN VANDA NỘI DUNG 2: BƢỚC ĐẦU KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA MYCORRHIZA TRÊN MỘT SỐ GIỐNG LAN 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.2.1 Mục đích -Bảo quản phôi soma hiệu quả và lƣu trữ giống dễ dàng hơn. -Tạo cơ sở cho việc phân lập mycorrhiza trên cây lan đồng thời thử nghiệm trong nuôi cấy in vitro. 3 1.2.2 Yêu cầu Theo dõi tỷ lệ sống, tỷ lệ nẩy mầm của hạt nhân tạo. Thu thập mẫu rễ lan, nhuộm và quan sát mycorrhiza 4 CHƢƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1.Khái quát về cây lan 2.1.1 Phân loại thực vật học Ngành: Angiospermae (hạt kín) Lớp:Monocotyledonae Bộ: Orchidales Họ: Orchidaceae Họ phụ: Orchidoideae 2.1.2 Lịch sử cây lan Ngƣời ta tƣởng rằng cây lan đƣợc biết đến trƣớc tiên ở châu Âu qua bản viết tay bằng tiếng Hy Lạp” Xem Xét Cây Cỏ” (Enquiry intoPlants) của Theophrastus (khoảng năm 370-285 TCN). Kỳ thực thì cây lan đã đƣợc biết đến đầu tiên ở phƣơng Đông: Khổng Tử (551-479 TCN) sau khi đi chu du thiên hạ, không đƣợc nƣớc nào sử dụng, nên về lại nƣớc Lỗ. Trên đƣờng về, ông thấy hoa lan mọc chen với cây cỏ ở rừng sâu bèn than rằng: “Ôi, hoa lan có mùi thơm vƣơng giả, nay tƣơi tốt một mình ở chốn sơn lâm, mọc xen lẫn với loài cỏ hoang dại, chẳng khác nào bậc hiền giả không gặp thời, đứng chung với bọn bỉ phu”, mà từ đó các bài thơ, phú, vịnh về hoa lan sau này của các thi nhân Trung Hoa đều bị ít nhiều ảnh hƣởng. Ở phƣơng Đông, lan đựơc chú ý đến vẻ đẹp duyên dáng của lá và hƣơng thơm tuyệt diệu của hoa. Vì vậy trên thực tế lan chủ yếu chiêm ngƣỡng trƣớc tiên là lá chứ không phải màu sắc của hoa. Ở phƣơng Tây, lan đƣợc biết đến trƣớc hết là công dụng về dƣợc liệu và sau đó là sức hấp dẫn của hoa cùng các đặc tính về thực vật của nó.Theophrastus đƣợc xem là ông tổ của thực vật học và là cha đẻ của ngành học về lan và đến năm 1836 John Lindley đặt tên cho họ lan là Orchidaceae. 5 Ở Việt Nam, năm 1789 Joanis Loureiro, nhà truyền giáo ngƣời Bồ Đào Nha lần đầu tiên mô tả trong cuốn”Flora Cochinchinesis” và chỉ đến khi ngƣời Pháp đến mới có nhiều công trình công bố. H.Lecomte mô tả 101 giống gồm 750 loài lan cho cả 3 nƣớc Đông Dƣơng. Năm 1993 Phạm Hoàng Hộ phát hiện và mô tả khoảng 653 loài. 2.1.3 Tình hình sản xuất lan Trên thế giới Châu Âu, Hà Lan là quốc gia duy nhất có công nghệ trồng lan xuất khẩu sớm, ứng dụng trồng trong nhà kính nên xuất khẩu đƣợc quanh năm, đặc biệt là lan Cymbidium. Còn Italia là quốc gia nhập khẩu lan nhiều nhất Châu Âu, chủ yếu từ các nƣớc: Thái Lan 64 triệu cành, Hà Lan 10 triệu cành vào năm 1993. Mỹ nhập từ Thái Lan 16,4 triệu cành, Singapore 289 ngàn cành Dendrobium vào năm 1994. Châu Á, đứng đầu thế giới về nhập khẩu lan vẫn là Nhật, chủ yếu là Dendrobium, Oncidium, Cymbidium, Phalaenopsis từ Malaysia, Singapore và Thái Lan là nhiều nhất Ở Việt Nam Do chúng ta ở vùng có khí hậu nhiệt đới gió mùa, vì vậy phong lan rất đa dạng. Bên cạnh các loại lan rừng nổi tiếng về màu sắc và hƣơng thơm còn có các giống lan nhập ngoại nhƣ Dendrobium, Vanda, Mokara, Phalaenopsis, Cattleya… còn phân bổ lan rừng thì khắp cả nƣớc: Vùng khí hậu lạnh: Cao Nguyên và các tỉnh phía Bắc có thể trồng đƣợc các loài lan nhƣ Dendrobium, Cymbidium, Phalaenopsis, Cattleya, Paphiopedilum…) Vùng khí hậu nóng ẩm nhƣ ở Nam và Trung Trung Bộ, nhất là miền Đông Nam Bộ có các loại lan nhƣ: Cattleya, Vanda, Mokara, Cymbidium, Ngọc Điểm… Tuy nhiên có những khó khăn của ngƣời trồng lan ở nƣớc ta: -Nông dân trồng lan còn nhỏ lẻ, thiếu quy hoạch chiến lƣợc, kỹ thuật so với nƣớc ngoài -Chƣa tạo đƣợc giống lan riêng biệt cho Việt Nam có thể cạnh tranh với các giống lan nhập ngoại, nhất là Thái Lan. 6 -Thị trƣờng tiêu thụ còn nhiều khó khăn, chƣa ổn định kinh tế lâu dài cho ngƣời trồng lan. Tuy nhiên, thành phố Hồ Chí Minh đã có nhiều chính sách, nguồn vốn đầu tƣ để xây dựng và mở rộng khu nông nghiệp cao, chuyển đổi đổi cơ cấu nông nghiệp cho phù hợp với tình hình và xu hƣớng phát triển của thành phố, trong đó cây lan cũng là cây chủ lực. 2.1.4 Đặc điểm thực vật học của cây lan 2.1.4.1 Cơ quan dinh dƣỡng a) Sự phát triển ở cây đa thân Trƣờng hợp lan Cau diệp (Spathoglottis plicata Bl.) Đây là loài địa lan, giả hành là một thân ngắn phù mập. Mỗi giả hành có một số lá bao che và mang rễ ở đáy. Đáy lá to ra tạo thành bẹ bao quanh giả hành. Ở nách của mỗi bẹ lá có thể có các chồi mà mỗi chồi có thể phát triển thành cành mang hoa (phát hoa) hay tạo ra cơ quan dinh dƣỡng mới (giả hành mới). Các chồi ở nách lá ấy đƣợc che chở bởi những lá ngắn không có phiến lá bên trên. Khi chồi bắt đầu phù to có dạng một giả hành sơ khởi thì các lá ló ra về phía đỉnh, sau đó các rễ mới xuất hiện ở về phía đáy. Cuối cùng các lá phát triển lớn lên, tích trữ dƣỡng chất về phía đáy làm cho giả hành lớn dần ra. Trƣờng hợp lan Bạch câu (Dendrobium crumenatum Sw.) Xuất hiện từ đồng bằng đến núi cao, phụ sinh sống bám trên cây hay trên hốc đá, rễ chúng không luôn bị ẩm ƣớt nhƣ ở trong đất nhƣ lan Cau diệp.Cành lan mới sinh ra từ gốc của cành cũ: Gồm gốc nhỏ mang rễ, tiếp là đoạn phù mập không rễ, không lá, kế trên là đoạn dài lỏng khỏng mang lá mọc xen hai hàng, trên cùng là đoạn dài nhỏ lỏng y nhƣ vậy nhƣng không có lá, tất cả gọi là giả hành. Nhƣ vậy Bạch câu sống nhiều năm (cây đa niên) nhờ các đơn vị nối tiếp nhau, chồi mới sinh ra từ chồi bên ở gốc của đơn vị trƣớc đó và cứ thế tiếp tục phát triển theo chiều ngang. 7 b) Sự phát triển ở cây đơn thân Ở kiểu phát triển độc trụ, nếu ta cắt một đoạn ở phía ngọn của thân thì đoạn bị cắt rời này vẫn phát triển về phía đỉnh. Còn nếu cắt đoạn thân của cây (đỉnh giả hành) thì đoạn cắt rời ấy không thể phát triển về phía đỉnh.Ví dụ nhƣ cây Vanda, Ngọc Điểm (Rhynchostys gigantea), Hồ Điệp (Phalaenopsis)… Lá có phiến hình trụ dài và có bẹ bọc kín thân. Thân luôn luôn mọc cao lên về phía đỉnh. Sự mọc dài của đỉnh không có giới hạn nên cây chỉ có một thân phát triển vô hạn. Sự phát triển ngừng lại khi đỉnh bị tổn thƣơng, lúc đó chồi bên sẽ xẻ rách bẹ lá để mọc dài ra thành nhánh, nhánh này cũng sinh trƣởng không giới hạn nhƣ đỉnh ban đầu. 2.1.4.2 Cơ quan sinh dục của lan- tổ chức hoa Hoa lan kiểu tam phân (chia 3): 3 lá đài, 3 cánh hoa, 3 tâm bì Phấn hoa dính lại thành phấn khối, ít khi rời từng hạt nhƣ ở các loài hoa khác Sự hiện diện của trụ là phần hợp nhất của bộ phận sinh dục đực và bộ phận sinh dục cái. Đó là đặc điểm quan trọng chỉ có ở hoa lan. Hình dạng, kích thƣớc của môi, cộng thêm vị trí của nhuỵ đực đã làm cho hoa lan không đều, có sự đối xứng hai bên rõ rệt. Tuy cấu trúc chung nhƣ vậy nhƣng trong chi tiết từng bông hoa lan cũng có những khác biệt mà từ đó ta chia chúng ra những giống loài khác nhau, chỉ cần đề cập đến cánh môi thôi cũng đã rất phong phú. Nhƣng 99% các cây lan có 1 nhuỵ đực thụ mà thôi số còn lại có 2-3 nhuỵ đực thụ (Nguyễn Thiện Tịch,1996). Về phái tính thì đại đa số cây lan là hoa lƣỡng tính, nhƣng ở giống Catasetum và Cycnoches hoa lại là đơn tính. Cánh môi: Ở một số loài thì rất lớn so với hai bên cánh, một số loài có cánh môi rất nhỏ. Hình dạng: Môi có thể nguyên hay có thuỳ, có rìa, có tua, cuộn hay nhăn…có cấu trúc rất kỳ lạ nhƣ có sọc, có sóng, có gai, có lông, trơn láng hay nhăn..có cựa, móc, túi ở đằng sau.. Màu sắc: Thƣờng khác hai bên, hoặc có sọc, điểm, những màu khác biệt 8 Hình 2-1: Cấu tạo hoa lan 2.1.5 Các điều kiện cơ bản cho cây lan Ẩm độ: Thông thƣờng tối thiểu là 70% thích hợp cho sự tăng trƣởng của nhiều loài. Tuy nhiên ẩm độ lý tƣởng vẫn là ẩm độ của vùng bản xứ pH của nƣớc: pH của nƣớc phù hợp cho lan tăng trƣởng là 5-6, nếu lên 7 hoặc trên 7 thì không nên tƣới nƣớc cho cây. Nhiệt độ: Tuỳ thuộc vào nhiệt độ của điều kiện địa lý, vùng cao độ thì sẽ có sự phân bổ giống lan phù hợp. Ánh sáng: Yếu tố quyết định cho sự quang hợp, hô hấp và nhất là cho sự trổ hoa.  Vanda lá tròn cần 100% ánh sáng  Vanda lá sắp thành hàng cần 70% ánh sáng  Dendrobium cần 70% ánh sáng  Cattleya cần 50% ánh sáng  Phalaenopsis cần khoảng 30% ánh sáng Độ thông gió: Lan có 2 nhóm chính là phong lan và địa lan, tốc độ gió khoảng 10-15 km/giờ, nghĩa là gió làm lá và các cành nhỏ hơi rung động, nếu trồng ở nơi thông gió và mát mẻ, cây lan sẽ tăng trƣởng nhanh và ít bị bệnh hơn (Nguyễn Minh Trực, 1996). 2.1.6 Các phƣơng pháp nhân giống lan 2.1.6.1 Gieo hột Trong thiên nhiên, sự thụ phấn ở lan do côn trùng thực hiện, do cấu trúc của hoa lan thích ứng với điều này. Có 2 phƣơng cách thụ phấn: 9 - Sự tự thụ phấn: Khi phấn hoa ở hoa này đƣợc rơi vào nuốm của chính hoa ấy, điều này không thể xảy ra ngoài tự nhiên đối với hoa lan đƣợc. - Sự thụ phấn chéo: Khi phấn hoa ở hoa này đƣợc để vào nuốm của hoa khác trên cùng cây hay cùng một loài, hay khác loài, khác giống (chỉ con ngƣời mới làm đƣợc). Hạt lan quá nhỏ, không chứa chất dự trữ và chỉ có một phôi chƣa phân hoá nên không thể phát triển theo cách bình thƣờng mà việc làm cho hạt lan nẩy mầm thành cây lan trƣởng thành là vấn đề khó khăn. Năm 1844, Neumann- ngƣời Pháp- đã cho nẩy mầm thành công hạt lan khi ông liệng hạt lan quanh gốc cây lan lớn, nhƣng không hiểu vì sao. Năm 1899, Noel Bernard- ngƣời Pháp- đã khám phá bí mật đó, vì những hạt lan nẩy mầm đều bị nhiễm nấm. Năm 1904, ông cô lập các nấm rễ lan và cho nhiễm lên hạt lan thì 100% hạt nẩy mầm. Ngƣời ta đã khám phá ra 3 loài nấm giúp hạt lan nẩy mầm: - Rhizoctonia repens giúp hạt lan Cattleya, Laelia nẩy mầm. - Rhizoctonia mucoroides giúp hạt lan Vanda, Phalaenopsis nẩy mầm. - Rhizoctonia lanugiosa giúp hạt lan Oncidium, Miltonia nẩy mầm. Năm 1922, Knudson ở Mỹ, đã thành công khi gieo hạt lan trên môi trƣờng thạch có bổ sung dinh dƣỡng (thêm 2% đƣờng ) 2.1.6.2 Tách chiết a) Tách bụi Dùng cho các giống lan đa thân nhƣ Cattleya, Dendrobium….Ở gốc của mỗi giả hành có ít nhất một mắt ngủ nên có thể tách mỗi hàng giả hành thành một đơn vị để trồng, nhƣng để cây sau khi tách khoẻ hơn thì tốt nhất mỗi đơn vị có ít nhất hai giả hành, và có mắt ngủ. b) Tách cây con Ở Dendrobium, Thunia… thƣờng tạo ra cây con trên giả hành, khi cây con này khoẻ mạnh, có rễ tốt, có thể tách ra khỏi giả hành để trồng. 10 Ở Phalaenopsis có lúc cây con mọc trên cọng phát hoa đến khi có rễ tốt thì tách ra để trồng. Với những loài đơn thân nhƣ Vanda, Hồ Điệp, Ngọc Điểm… khoẻ mạnh, hoặc bị tổn thƣơng ở đỉnh ngọn, chúng sẽ sinh ra cây con từ chồi bên ở gần gốc, các chồi này có rễ dài ra, có thể tách ra để trồng riêng. 2.2 Phƣơng pháp nuôi cấy mô lan 2.2.1 Khái quát về lịch sử nuôi cấy mô Năm 1838, hai nhà sinh vật học ngƣời Đức, Schleiden và Schwann đƣa ra thuyết tế bào và nêu rõ mọi cơ thể sinh vật có phức tạp tới đâu thì đều có cấu tạo đơn vị rất nhỏ là tế bào. Năm 1902, Haberlandt thực hiện nuôi cấy tế bào thực vật đầu tiên từ lá một số cây một lá mầm nhƣ: Errythronium, Orrnithogalum… Năm 1922, Kotte và Robins lập lại thí nghiệm của Haberlandt nhƣng trên đỉnh sinh trƣởng của rễ một cây hoà thảo, trên môi trƣờng lỏng có muối khoáng và glucose. Tuy nhiên sự sinh trƣởng này chỉ kéo dài trong thời gian ngắn. Năm 1934, White và Gautheret đã nuôi cấy thành công rễ cà chua trên môi trƣờng muối khoáng và dich chiết nấm men. Năm 1934, Nobecourt và Gautheret duy trì sự sinh trƣởng của mô sẹo cà rốt. Năm 1955, Các chất kích thích sự phân bào đƣợc Skoog đặt tên là kinetin, và gộp với các chất kích thích phân bào tự nhiên gọi là cytokinin. Năm 1956, Morel, học trò của Gautheret, áp dụng thành công nuôi cấy mô vào cây lan (Cymbidium) tạo ra các protocorm. Đến nay, hầu hết các giống lan đã đƣợc nhân giống nhanh bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô nhƣ: Cattleya, Hồ Điệp, Ngọc Điểm, ngay cả lan Hài nổi tiếng của Việt Nam (Câu lạc bộ học viên hoa lan, 1999) . 2.2.2 Các phƣơng pháp nuôi cấy a) Nuôi cấy nốt đơn thân Sử dụng mẫu cấy là chồi ngọn hoặc chồi bên có mang một đoạn thân ngắn. Chồi này đƣợc kích thích tăng trƣởng, ra rễ tạo cây nguyên vẹn, nhiều chồi và lá 11 đƣợc hình thành, tiếp tục cấy chuyền trên môi trƣờng dinh dƣỡng thích hợp, phƣơng pháp này dùng nhân giống vô tính in vitro và có thể áp dụng đƣợc in vivo (Nguyễn Đức Lƣợng, 2002). b) Nhân chồi bên Giống nhƣ nuôi cấy nốt đơn thân về nguyên tắc nhƣng khác là nuôi cấy nốt đơn thân có sự kéo dài chồi, thân và thƣờng không cần đến cytokinin để phát triển. Còn phƣơng pháp nhân chồi bên, chồi ngọn đƣợc cô lập trên môi trƣờng dinh dƣỡng và các chồi bên từ các nách lá phát triển dƣới tác dụng của cytokinin nồng độ cao. Cytokinin có tác dụng hạn chế ƣu tính ngọn để các chồi bên phát triển (Nguyễn Đức Lƣợng, 2002). c) Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Chồi ngọn đƣợc rửa sạch và khử trùng bằng cồn, hypoclorite calcium. Sau đó dùng dao mổ tách rời đỉnh sinh trƣởng (gồm vùng mô phân sinh và cả phần dƣới ngọn) ra khỏi ngọn và cấy trên môi trƣờng tái sinh cây hoàn chỉnh. Với phƣơng pháp này, chúng ta tạo đƣợc cây sạch bệnh, sạch virus. d) Nuôi cấy mô sẹo Tạo mô sẹo đƣợc tiến hành lần đầu tiên vào năm 1920, mô sẹo là một khối tế bào không có tổ chức, hình thành từ các mô hoặc cơ quan đã phân hoá dƣới các điều kiện đặc biệt (vết thƣơng, xử lý hoá chất, tia phóng xạ...).Các tế bào của mô sẹo phải chịu sự phản phân hoá trƣớc lần phân chia đầu tiên (Halperin, 1969). Mô sẹo tăng trƣởng nhanh trên môi trƣờng có chất auxin và trong môi trƣờng không có chất kích thích thì mô sẹo có thể tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Cụm mô sẹo có thể tái sinh cùng một lúc nhiều chồi hơn là nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng, nhƣng khả năng bị biến dị tế bào soma lại cao hơn. e) Nuôi cấy huyền phù tế bào Huyền phù tế bào đƣợc tạo từ các mảnh mô sẹo nuôi cấy trong môi trƣờng lỏng lắc liên tục. Trong môi trƣờng lỏng, mô sẹo phóng thích ra những tế bào riêng lẻ hay những cụm tế bào dính nhau để hấp thụ dinh dƣỡng. Sau đó tế bào đƣợc chuyển sang môi trƣờng đặc để tái sinh thành cây. 12 f) Nuôi cấy thể đơn bội Cây thể đơn bội mang bộ nhiễm sắc thể giảm đi một nửa, sử dụng những phần sau cho việc nuôi cấy in vitro: Túi phấn: Thu túi phấn từ chồi hoa thì chỉ khử trùng chồi hoa. Còn thu túi phấn của hoa đã nở thì phải khử trùng túi phấn. Hạt phấn: Đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng để tạo mô sẹo. Cụm hoa: Thƣờng nuôi cấy trong môi trƣờng lỏng. g) Nuôi cấy protoplast( tế bào trần) Tế bào thực vật đƣợc xử lý bằng hoá lý để tách lớp vỏ cenlulose, nhƣng vẫn còn giữ chức năng của tế bào. Trong môi trƣờng thích hợp, protoplast có thể phân chia tế bào hay tái sinh thành cây (Nguyễn Đức Lƣợng, 2002) Với cách nuôi cấy này, ta có thể áp dụng để chuyển gene vào tế bào trần hay tạo cây đa bội bằng cách dung hợp hai tế bào trần với nhau. 2.2.3 Chất dinh dƣỡng trong môi trƣờng nuôi cấy in vitro Về nguyên tắc, mô thực vật nuôi cấy trong môi trƣờng in vitro cũng cần các chất dinh dƣỡng giống nhƣ cây trồng trên đất. a) Các chất vô cơ Chất vô cơ ở nồng độ lớn hơn 0,5 mM/l đƣợc xếp vào nhóm đa lƣợng, còn nồng độ thấp hơn 0,05 mM/l đƣợc xếp vào nhóm vi lƣợng. Nguồn đạm trong môi trƣờng in vitro đƣợc cung cấp ở hai dạng ion NH4 + và NO3 - . Lƣợng đạm tổng số cần trong khoảng từ 12-60 mM/l, trong đó có NH4 + biến thiên từ 6-20 mM/l và NO3 - từ 6-40 mM/l ( Bùi Bá Bổng, 1995). Phần lớn cây ƣa NO3 - hơn NH4 + nhƣng cũng có những trƣờng hợp ngƣợc lại. Lƣợng K+ cần trong môi trƣờng biến thiên từ 2-25 mM/l. Còn các ion khác Ca2+, H2PO4 - , SO4 2- , Mg 2+ , thƣờng thấp hơn khoảng 1-5 mM/l Khoáng vi lƣợng thƣờng đƣợc dùng ở nồng độ 0,1-100 µM/l b) Nguồn carbon Mô cấy trong môi trƣờng tự dƣỡng không có khả năng tự dƣỡng (autotrophic), do không tiến hành đƣợc quang hợp đầy đủ trong điều kiện không thuận lợi nhƣ 13 thiếu sự trao đổi khí bên trong chai và bên ngoài chai. Do đó nguồn carbon phải đƣợc cung cấp cho môi trƣờng nuôi cấy nhƣ các dạng đƣờng, chủ yếu là đƣờng sucrose, thƣờng chiếm khoảng 2-3%. c) Vitamin và amino acid Các vitamin thƣờng dùng là thiamine (B1), nicotinic acid (B3), pyridoxine (B6), calcium pentothenate (B5) và myo- inositol. Nồng độ từ 0,1 đến 10 mg/l. Các amino acid thƣờng dùng là L- asparagine (100 mM/l), L-glycine (2mM/l), L-arginine (10 mM/l), L-cysteine (10 mM/l). Khác với đạm vô cơ, các amino acid thƣờng đƣợc tế bào hấp thụ nhanh hơn. Tuy nhiên, có thể dùng các chất hữu cơ trong nuôi cấy nhƣ nƣớc dừa (5-20%), các chất trích từ khoai tây, cam, cà chua, chuối. d) Các chất điều hoà sinh trưởng Auxin: Các dạng auxin thƣờng dùng trong nuôi cấy in vitro là 2,4-D,NAA, IBA và IAA ở nồng độ 0,1-5 mg/l. NAA và IBA thƣờng dùng để cho ra rễ và dùng phối hợp với cytokinin trong sự nhân chồi. Còn 2,4-D rất hữu hiệu trong tạo ra mô sẹo.c Cytokinin: Có tác dùng trong sự phân chia tế bào, sự phân hoá chồi, sự nhân chồi. Các cytokinin thông dụng là kinetin, BAP, nồng độ khoảng 1-10 mg/l, kích thích sự ra chồi bên, làm giảm ảnh hƣởng ngọn và ức chế sự thành lập rễ. Gibberellin: Có khoảng 20 loại nhƣng GA3 là loại thông dụng nhất, có tác dụng làm tăng sự vƣơn lóng và sự phát triển của đỉnh sinh trƣởng hoặc chồi. Tuy nhiên gibberellin không đƣợc dùng phổ biến trong nuôi cấy mô e) Agar (thạch) Đƣợc bào chế từ rong biển, dùng làm chất nền cho môi trƣờng nuôi cấy, có nguồn gốc thực vật tự nhiên, không gây độc đối với cây. Agar hoà tan thành một thể keo có thể bám nƣớc và hấp thụ các hợp chất. Lƣợng agar thƣờng dùng từ 0,6- 0,8%, nếu nồng độ thấp (0,4%) môi trƣờng mềm loãng. Nồng độ cao (1%) môi trƣờng bị cứng, khó cấy và mô khó tiếp xúc với môi trƣờng. 14 f) Nước Nên sử dụng nƣớc cất để bảo đảm chất lƣợng nƣớc, chiếm khoảng 95% môi trƣờng nuôi cấy. Ngoài nƣớc cất có thể dùng nƣớc khử ion nhƣng không dùng nƣớc máy. g) Yêu cầu pH pH môi trƣờng cấy mô từ 5,0-6,5 và thƣờng đƣợc điều chỉnh để đạt khoảng 6,0. Môi trƣờng có pH thấp (thấp hơn 4,5) hoặc cao (cao hơn 7,0) ức chế sự phát triển của mô. Nếu pH bắt đầu khoảng 5,0-7,0, sau khi hấp sẽ giảm đi 0,3-0,5 đơn vị. 2.2.4 Các bƣớc nhân giống in vitro Bước 1: Nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng. Mẫu cấy thƣờng là chồi, mắt lóng, đỉnh sinh trƣởng, lá, rễ... đem rửa sạch và khử trùng bằng cồn, natri hypochlorit, calci hypochlorit. Sau đó, mẫu đƣợc đƣa vào môi trƣờng tạo điều kiện phân chia và phân hoá mạnh. Đối với mẫu dễ bị hoá nâu, môi trƣờng thƣờng bổ sung than hoạt tính hoặc ngâm mẫu với ascorbic acid và citric acid (25-150 mg/l mỗi loại) trƣớc khi cấy (Bùi Bá Bổng, 1995). Bước 2: Tạo thể nhân giống in vitro Thể chồi (multiple shoot) và thể cắt đốt (cutting) cấy vào môi trƣờng có chất kích thích sinh trƣởng (cytokinin, GA3...) để tạo mô sẹo, tạo cụm chồi. Bước 3: Nhân giống in vitro Đây là giai đoạn quan trọng nhất nhằm mục đích tăng sinh khối thể nhân giống. Sự nhân giống này tuỳ thuộc vào khả năng tạo chồi nách hoặc phát khởi chồi bất định từ những khối giống nhƣ callus dƣới gốc chồi, rồi ra rễ. Bước 4: Tái sinh cây hoàn chỉnh in vitro Các chồi, callus hay mô sẹo sẽ đƣợc cấy vào môi trƣờng có auxin để tạo rễ, tạo thân, lá đầy đủ. Cây phải đƣợc nuôi cấy trong điều kiện giống nhƣ bên ngoài vƣờn ƣơm để thuần hoá cho đến khi cây con khỏe mạnh. 15 Bước 5: Chuyển cây in vitro ra vƣờn ƣơm Cây con phát triển tốt trong môi trƣờng in vitro đƣợc lấy ra và rửa sạch môi trƣờng nhân tạo bám ở gốc rễ, rồi đem trồng ra vƣờn ƣơm. Do thay đổi về điều kiện sống, cây con dễ bị tress, mất nƣớc và mau héo nên vƣờn phải mát, ẩm độ cao. 2.2.5 Các yếu tố ảnh hƣởng nhân giống in vitro a) Lựa chọn mẫu cấy Mô non (chồi đỉnh), chồi nách hay chồi bất định tái sinh tốt hơn so với mô già của cùng một cây. b) Môi trường nuôi cấy Môi trƣờng MS (Murashige và Skoog) cho kết quả tốt trong nhân giống cây ban đầu và nhân chồi tiếp theo. Để tạo chồi nách nồng độ auxin và cytokinin tƣơng đối thấp, còn tạo chồi bất định cần nồng độ cytokinin cao và auxin thấp; Còn tạo mô sẹo thì ngƣợc lại. Môi trƣờng rắn hay lỏng cũng ảnh hƣởng đến khả năng phát triển rễ. Agar giúp cây đứng vững và tăng khả năng thoáng khí tạo điều kiện hấp thu dƣỡng chất. Đối với cây tiết các độc tố nhƣ phenol thì cần thêm than hoạt tính hay PVP (polyvinyl pyrrolidone) để hấp thụ các chất này giúp cây tăng trƣởng tốt hơn. Môi trƣờng có thể bổ sung các chất ngăn cản sự oxyt hoá phenols nhƣ citric acid, ascorbic acid, thiourea hoặc L- cystine. Hoặc bổ sung thêm amino acid nhƣ glutamine, arginine và asparagine. Thƣờng xuyên cấy chuyền vào môi trƣờng mới nhằm tạo điều kiện dinh dƣỡng đầy đủ cho cây nuôi cấy in vitro sinh dƣỡng tốt. c) Ánh sáng và nhiệt độ Ánh sáng: Cƣờng độ ánh sáng phù hợp trong khoảng 1000-5000 lux. Thời gian chiếu sáng thƣờng 16 giờ sáng/8 giờ tối. Nhiệt độ: Ảnh hƣởng rất lớn đến sự sinh trƣởng và phát triển của cây in vitro. Nhiệt độ tối ƣu khoảng 20-250C. 16 2.3 Công nghệ tạo hạt nhân tạo 2.3.1 Khái niệm Năm 1978, Murashige phát hiện đầu tiên về kỹ thuật hạt nhân tạo. Năm 1987, Redenbaugh và cộng sự đã phát triển thành công kỹ thuật tạo hạt nhân tạo. Về cơ bản, hạt nhân tạo giống hạt tự nhiên, có cấu tạo là phôi vộ tính đƣợc bọc bởi lớp áo bên ngoài bởi lớp gel và có khả năng nẩy mầm nhƣ hạt tự nhiên, nhƣng khác biệt là hạt nhân tạo không có phôi nhũ. Hình 2-2: Cấu tạo hạt nhân tạo Năm 1988, McKersie và cộng sự đã tạo thành công hạt nhân tạo cây cỏ linh lăng, 65% hạt biến đổi sau bƣớc làm khô. Năm 1985, Kitto và Janick bọc hạt nhân tạo cà rốt bằng polyxyethylene đạt tỷ lệ sống 3%. Janick (1988), tạo hạt nhân tạo thành công trên cần tây. Gray (1987) thành công trên nho và cây cỏ nón. Năm 1988, lúa mì đƣợc tạo hạt nhân tạo do Carman và cộng sự. 2.3.2 Mục đích Sự phát triển của công nghệ nuôi cấy in vitro, tái sinh thành cây hoàn chỉnh từ phôi vô tính, đã mở rộng phạm vi ứng dụng mới cho việc tạo hạt nhân tạo nhằm mục đích vận chuyển, bảo quản, lƣu trữ giống dễ dàng hơn. Trong điều kiện tối ƣu thì hạt sẽ nẩy mầm khỏi lớp vỏ nhân tạo còn không sẽ chuyển sang trạng thái ngừng sinh trƣởng cho đến khi gặp điều kiện thuận lợi. Ngoài ra, còn có nhiều lợi ích cho việc nhân giống nhanh những thực vật nhƣ: 17 - Không tạo đƣợc hạt - Hạt tạo thành nẩy mầm với một số lƣợng thấp - Khả năng hạt sống sót rất thấp sau khi bảo quản 2.3.3 Các nhân tố tạo hạt nhân tạo 2.3.3.1 Tạo phôi vô tính Phôi soma đƣợc hình thành không thông qua quá trình tạo mô sẹo đƣợc gọi là phôi vô tính, phôi vô tính có thể tái sinh cây hoàn chỉnh hoặc nhân sinh khối trực tiếp bằng hệ thống nuôi cấy phù hợp. Phôi soma khác với phôi hợp tử, phôi hợp tử thành lập do sự phối hợp giữa giao tử đực và giao tử cái, khởi đầu đƣợc thành lập có cấu trúc đơn cực nối liền với các mô mạch của mô sẹo. Con phôi soma thành lập từ mô tế bào , có cấu trúc lƣỡng cực và không có mạch nối liền với mô sẹo. Năm 1958, khi những tế bào phôi thực vật đầu tiên đƣợc thu nhận từ mô dinh dƣỡng của cây cà rốt (Daucus carota). Sau đó, hàng loạt các mô thực vật khác sử dụng để nuôi cấy tạo phôi (Triticum aestivum và Glycine max) Giai đoạn trƣớc khi hình thành tế bào soma gọi là tiền phôi (PEDC- preembryogenic determined cell) (Sharp và csv, 1980). Vì tế bào tiền phôi có thể phân chia để hình thành tế bào phôi trực tiếp, gọi là phát sinh phôi trực tiếp. Bảng 2.1: Sự phát triển của mô trên môi trƣờng nuôi cấy 18 Tuy có nhiều tế bào phát sinh tế bào phôi không cần các chất kích thích sinh trƣởng nhƣ tế bào cây cà rốt, đậu ván… nhƣng cũng có nhiều tế bào lại cần auxin để phân bào trƣớc khi phát sinh tế bào phôi (IEDC- induced embryonic determined cell) (Sharp và scv, 1980). Và có nhiều tế bào hình thành phôi từ mô sẹo, sự phát sinh phôi tiến hành gián tiếp. Ngoài ra, còn sử dụng tế bào phôi hợp tử để tạo phôi, ngoại trừ hạt đƣợc tạo trong quá trình thụ phấn mà kiểu di truyền không xác định. 2.3.3.2 Cơ chế phát sinh phôi soma Những quan sát chi tiết về quá trình phát sinh phôi phát hiện có 4 pha : 0, 1, 2 và 3, đƣợc nhận thấy trong giai đoạn đầu của tiến trình phát sinh phôi trong hệ thống nuôi cấy nói trên (Fujimura và Komamine, 1979). Ở pha 0, những tế bào đơn (giai đoạn 0) hình thành những cụm tế bào có khả năng phát sinh phôi (giai đoạn 1) trên môi trƣờng có auxin. Trong suốt giai đoạn này, những cụm tế bào hình thành từ những tế bào đơn có khả năng tạo phôi khi môi trƣờng nuôi cấy không có auxin, để hình thành những cụm tế bào giai đoạn 1. Sau đó, pha 1 xuất hiện khi cấy chuyển những cụm tế bào giai đoạn 1 qua môi trƣờng không có auxin. Trong suốt pha 1, những cụm tế bào tăng sinh chậm và dƣờng nhƣ không biệt hóa. Sau pha 1 sự phân bào xuất hiện nhanh trên một phần của những cụm tế bào, dẫn đến việc hình thành những tế bào phôi hình cầu. Pha này đƣợc gọi là pha 2. Pha tiếp theo sau, pha 3, cây con in vitro phát triển từ những phôi hình cầu qua phôi hình tim và phôi hình thủy lôi. 19 Hình 2-3: Các giai đoạn phát sinh phôi soma 2.3.3.3 Tạo vỏ bọc bằng sodium alginate Có rất nhiều tác nhân tạo gel đƣợc sử dụng làm vỏ bọc cho phôi. Đó có thể là agar, alginate, polyco 2133 (Bordon Co.), carboxyl methyl cellulose, carrageenan, gelrite (Kelko. Co.), guargum, sodium pectate, tragacanth gum, dextran, xanthan gum … những hợp chất này sẽ đông lại thành gel khi đƣợc cho vào môi trƣờng có chất điện phân thích hợp nhƣ đồng sulphate, calcium chloride hoặc ammonium chloride nhờ vào những liên kết ion. Phƣơng pháp đƣợc sử dụng rộng rãi nhất để tạo vỏ bọc cho phôi đó là sử dụng sodium alginate (Bajaj, 1995; Jeon và csv, 1986; Redenbaugh và csv, 1993). Alginate đƣợc sử dụng nhiều do nó có những đặc tính rất thuận lợi nhƣ tính dính vừa phải, không gây độc cho phôi sinh dƣỡng, có các đặc tính tƣơng hợp sinh học, khả năng tạo thành gel nhanh, rẻ tiền, để đƣợc lâu, độ cứng của gel vừa phải để có thể vừa tạo thuận lợi cho sự hô hấp của phôi và vừa bảo vệ đƣợc phôi khỏi những tổn thƣơng bên ngoài. 20 Hình 2-4: Công thức hoá học của alginate Alginate, chất hữu cơ mạch thẳng, kỵ nƣớc, muối của acid alginic, là một polyuronic bao gồm -D-mannuronate (M) và mảnh bên C5 -L-guluronate (G) (Aoyagi và csv, 1998). Nguyên tắc chính trong quá trình tạo vỏ bọc alginate đó là sodium alginate chứa phôi sẽ tạo thành từng hạt nhỏ, tròn và cứng khi nhỏ vào trong hỗn hợp NaCl2.2H2O nhờ vào sự trao đổi ion giữa ion Na + có trong hỗn hợp sodium alginate với Ca2+ có trong hỗn hợp CaCl2.2H2O. Vỏ bọc cứng nhiều hay ít là phụ thuộc vào số lƣợng ion Na+ trao đổi với ion Ca2+. Do đó nồng độ của hai tác nhân tạo gel, sodium alginate và CaCl2.2H2O, và thời gian cho việc tạo liên kết ion phải thật tối ƣu để có thể tạo thành vỏ bọc ở một độ cứng thích hợp nhất. Không nhƣ phôi hợp tử, phôi vô tính thiếu lớp nội nhũ chứa chất dinh dƣỡng bên ngoài nuôi phôi, do đó bằng việc thêm vào chất nền gel những chất dinh dƣỡng, chất điều hòa tăng trƣởng, carbohydrate sẽ tạo một nội nhũ nhân tạo thích hợp tối đa cho tăng trƣởng và sống sót của phôi (Gray, 1990; Gray và Purohit, 1991; Redenbaugh và Walker, 1990). Ngoài ra nhằm tránh cho phôi bị mất nƣớc, hay các tổn thƣơng cơ học, tăng sức đề kháng cho phôi ngƣời ta có thể thêm vào chất nền gel chất kháng sinh, thuốc trừ nấm, trừ sâu, vi sinh vật. Mặc dù việc tạo hạt nhân tạo từ cách bọc phôi vô tính bằng sodium alginate cho thấy có một số thành công nhất định trong việc tái sinh cây con, vẫn còn nhiều vấn đề khó khăn khi sử dụng vỏ bao alginate này, chất dinh dƣỡng có thể bị mất đi khỏi vỏ bao (Redenbaugh và csv, 1987), sự trao đổi khí kém (Redenbaugh và csv, 1993)… Đã có một số đề nghị cho rằng, việc thêm vào than hoạt tính sẽ giúp nâng 21 cao khả năng sống sót, phát triển của phôi vô tính hơn. Nguyên nhân là do than hoạt tính tăng cƣờng khả năng hô hấp của phôi, và nó giữ lại những chất dinh dƣỡng nhiều hơn trong vỏ bọc, phóng thích chúng rất chậm dùng cho sự phát triển của phôi. 2.3.3.4 Quy trình tạo hạt nhân tạo Hình cầu Hình tim Hình thuỷ lôi Hình lá mầm Hình 2-5: Các dạng phôi soma Bƣớc 1: Dùng dao cắt chồi (shootbud) có kích thƣớc 2-3 mm từ cây nuôi cấy in vitro. Sau đó, dùng dao tách rời các phôi hình tim. Bƣớc 2: Dùng pipette hay ống tiêm hút dung dịch sodium alginate rồi cho nhỏ từng giọt rơi xuống. Bƣớc 3: Dùng pince gắp chồi hay phôi đƣa vào trong giọt alginate đƣợc nhỏ xuống dung dịch CaCl2.2H2O 100 mM trong 15 phút. Bƣớc 4: Dùng pince gắp hạt cho vào nƣớc cất vô trùng trong 5 phút để làm sạch lƣợng CaCl2.2H2O còn sót lại. 22 Hình 2-6: Quy trình tạo hạt nhân tạo 2.4 Nấm rễ cộng sinh- mycorrhiza 2.4.1 Khái niệm Các loài thực vật khai thác từ đất trồng từ sự giúp ích của vi sinh vật có lợi đƣợc gọi là mycorrhiza (nấm vùng rễ). Các sợi nấm len lõi giữa các hạt đất, phát triển bên trong chất hữu cơ, thậm chí chúng còn xâm nhập vào vỏ côn trùng chết, từ đó sử dụng các dƣỡng chất hữu cơ và photphorus, sau đó trả lại cho cây trồng. Nhƣ vậy, có sự kết hợp cao độ giữa nấm đất và rễ cây trồng trong đó các nấm tạo nên mycorrhiza thƣờng là một số nấm Basidiomycetes, Ascomycetes, và Zygomycetes (theo Harley & Smith 1983, Kendrrick 1992, Brundrett 1992) Nấm rễ là một thuật ngữ đƣợc Frank sử dụng lần đầu vào năm 1885 khi phát hiện mối liên hệ giữa sợi nấm và rễ trên cây thông và một số cây lá rộng, đƣợc lấy từ chữ Hy Lạp “Mykes” và “Rhiza”. Sau đó ghép từ tiếng Anh “Myco” vào thành từ “Mycorrhiza” Ngƣời ta dự đoán, trên thế giới ngày nay có 1000 chi 200 họ thực vật có nấm rễ. Theo thống kê của Trappe năm 1962 có 535 loài nấm thuộc 81 chi 30 họ 10 bộ nấm có thể cộng sinh với trên 1500 loài cây gỗ khác nhau. Dung dịch sodium alginate Đƣa phôi/chồi vào giọt sodium alginate Rửa hạt trong nƣớc cất 5 phút để sạch CaCl2.2H2O Ngâm trong dung dịch CaCl2.7H2O 100 mM trong 15 phút 23 2.4.2 Các dạng mycorrhiza 2.4.2.1 Ectomycorrhiza Đƣợc hình thành chủ yếu trên cây rừng do nhiều loài nấm đảm và một vài loài nấm túi. Hầu hết bào tử của Ectomycorrhiza đƣợc sinh ra trên mặt đất và đƣợc phát tán nhờ gió. Sợi nấm của Ectomycorrhiza thƣờng sinh ra một lớp nấm phủ chung quanh phía ngoài của các rễ dinh dƣỡng. Các nấm này cũng đi vào bên trong rễ nhƣng chỉ phát triển xung quanh các tế bào vỏ rễ thay thế một phần phiến mỏng và hình thành cái gọi là mạng lƣới Hartig (Hartig net). Tuỳ thuộc vào màu sắc của nấm phát triển trên rễ mà Ectomycorrhiza có màu vàng, nâu, trắng, đen. 2.4.2.2 Endomycorrhiza Đƣợc hình thành trên hầu nhƣ tất cả cây trồng và trên một số cây rừng bởi các nấm tiếp hợp, chủ yếu là giống Glomus và một số nấm khác nhƣ Acaulospora. Endomycorrhiza cũng đƣợc hình thành bởi một vài nấm đảm, rễ cây có Endomycorrhiza bên ngoài giống với rễ không có mycorrhiza về hình dạng và màu sắc (Agrios, 1997) a)Vesicular –arrbuscular mycorrhiza (=arrgbusular mycorrhiza, VAM hoặc AM) Đây là nhóm phổ biến, hiện diện trên cả cây thân gỗ, là nhóm mycorrhiza quan trọng nhất trong Endomycorrhiza. Các sợi nấm mọc bên trong tế bào vỏ của rễ dinh dƣỡng hình thành vòi hút gọi là bụi (arbuscules) hoặc hình thành các u sƣng lớn dự trữ thức ăn gọi là túi nang (vesicules). Bào tử đƣợc hình thành trong đất. b)Erioid mycorrhiza Sợi nấm xoắn cuộn bên trong tế bào lông rễ của cây thuộc bộ Ericales. Sợi nấm mọc thƣa không lan rộng vào môi trƣờng đất, chúng có thể mọc từ bào tử nhƣng ít có khả năng tái sinh. c)Orchid mycorrhiza Sợi nấm xoắn cuộn bên trong rễ hoặc thân của các cây thuộc họ lan. Những cây lan nhỏ và một số cây trƣởng thành không có diệp lục tố (chlorophyll) đều cần cho sự sinh tồn của chúng. 24 2.4.3 Tác động có ích của mycorrhiza Mối quan hệ giữa lan và nấm là mối quan hệ mật thiết, trên 80% loài lan đều có mối quan hệ với nấm. Theo Currah et al (1997), nhóm nấm chính ở rễ lan là Basidiomycetes mặc dù cũng có Ascomycetes, tuy nhiên Ba sidiomycetes cũng là tác nhân gây bệnh trên những cây khác nhƣ nấm Rhizoctonia solani (theo Harley, 1982). Thậm chí, nấm cộng sinh trên loài lan này là tác nhân gây bệnh cho loài lan khác, và lan có khả năng điều tiết sự xâm nhiễm và phát triển của nấm cộng sinh. 2.4.3.1 Mở rộng diện tích hấp thu của rễ cây Sợi nấm cộng sinh là cơ quan hấp thu chủ yếu của rễ nấm, sợi nấm có thể kéo dài ra xung quanh rễ làm tăng tốc độ hút P lên gấp 6 lần. Tuổi thọ của thể sợi nấm cũng vƣợt xa lông hút. 2.4.3.2 Sự trao đổi dinh dƣỡng Do hạt lan không dự trữ chất dinh dƣỡng nên sự nẩy mầm của hạt phụ thuộc vào mycorrhiza. Mycorrhiza ở lan khác với loại mycorrhiza khác về bản chất trao đổi dinh dƣỡng. Sau khi hình thành mycorrhiza, cacbon hữu cơ và những chất dinh dƣỡng đi vào hạt. Bởi vì sự nẩy mầm của hạt lan khi không có sự cộng sinh với nấm đòi hỏi phải có các chất đƣờng, acid amin và vitamin nên ngƣời ta giả định rằng hạt lan nhận đƣợc các chất này từ nấm để nẩy mầm. Sau đó, nấm tiếp tục cung cấp nguồn năng lƣợng cho cây lan. Còn đối với các cây trong đất, do lƣợng P cố định, thƣờng các gốc phosphat kết hợp với Fe, Na, Al khó di động. Do đó, nấm rễ ngoại cộng sinh làm nhiệm vụ sản sinh enzyme phosphorase chuyển P không tan thành P hòa tan, tăng khả năng hấp thụ của rễ, cung cấp cho cây trồng. 2.4.3.3 Sự hình thành chất kích thích sinh trƣởng mycorrhiza Trong quá trình cộng sinh với rễ cây, nấm hình thành nhiều chất kích thích sinh trƣởng nhƣ auxin, cytokinin, gibberellin, vitamin B1, indole-3acetic acid (IAA). 25 2.4.3.4 Nâng cao sức chống chịu của cây Nhiều nghiên cứu đều chứng minh, sau khi nhiễm nấm cho cây, cây chủ có khả năng chống khô hạn, chống chịu mặn, nhiệt độ, độ ẩm và pH cực đoan, kim loại nặng. 2.4.3.5 Tăng khả năng kháng bệnh của cây trồng Năm 1942, Davis phát hiện nấm rễ cộng sinh có thể làm giảm bớt bệnh hại rễ. Năm 1968, 1982, 1994 nhiều tác giả đều đề cập đến nấm cộng sinh có thể giảm bệnh thối rễ thông xuống 25%, còn làm giảm bệnh do tuyến trùng, bệnh mốc sƣơng, bệnh bƣớu rễ (Trần Văn Mão, 1999) 2.4.4 Sự xâm nhập của mycorrhiza Nấm có thể xâm nhập qua hạt, rễ, hoặc thân. Đối với hạt, nấm mọc xuyên qua hạt vào bên trong lông biểu bì. Còn ở rễ, nấm thƣờng mọc xuyên qua vỏ rễ nơi gần đầu rễ lối vào là một tế bào “cửa” của ngoại bì. Nấm nhanh chóng lan rộng khắp vỏ. Trong mỗi tế bào vỏ rễ, sợi nấm xoắn cuộn dày đặc, đƣợc gọi là “ peleton” (Harley, 1982) 26 CHƢƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Đối tƣợng thí nghiệm Cả hai nội dung đều làm thí nghiệm trên cây lan 3.2 Thời gian thực hiện Thời gian thực hiện đề tài từ tháng 3/2007 đến tháng 8/2007 tại phòng nuôi cấy mô_ Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học và phòng thực tập bệnh cây _ khoa Nông Học_ trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh. 3.3 Nội dung nghiên cứu Nội dung 1: Nghiên cứu kỹ thuật tạo hạt nhân tạo từ phôi cây lan Vanda Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ sodium alginate đến sự hình thành hạt nhân tạo Phôi soma đem bọc vỏ hạt ở các nồng độ alginate khác nhau xác định ảnh hƣởng lên tính chất vỏ hạt nhân tạo. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của môi trƣờng tạo hạt nhân tạo Sử dụng môi trƣờng MS có nồng độ khoáng đa lƣợng khác nhau  xác định tỷ lệ sống của hạt nhân tạo. Thí nghiệm 3: Khảo sát môi trƣờng bảo quản hạt nhân tạo. Hạt nhân tạo sau khi tạo xong đem lƣu trữ ở các môi trƣờng khác nhau  Xác định điều kiện môi trƣờng bảo quản tối ƣu. Thí nghiệm 4: Khảo sát sự nẩy mầm của hạt nhân tạo trên các giá thể khác nhau Hạt nhân tạo cho nẩy mầm trên các giá thể khác nhau  xác định tỷ lệ nẩy mầm của hạt nhân tạo. 27 Nội dung 2: Khảo sát sự hiện diện của mycorrhiza trên một số giống lan Lấy mẫu rễ lan Dendrobium lai, Dendrobium rừng, Catleya, Ngọc Điểm đem nhuộm quan sát hình dạng và sự có mặt của mycorrhiza trên các giống lan. 3.4 Vật liệu nghiên cứu 3.4.1 Trang thiết bị và dụng cụ nghiên cứu Thiết bị: Tủ cấy vô trùng, nồi hấp (autolave), máy đo pH, cân điện tử, đèn neon.... Dụng cụ: Pince, kéo, dao cấy, chai nƣớc biển, đĩa petri, đèn cồn, ống đong, pipet... 3.4.2 Mẫu sử dụng và điều kiện nuôi cấy Mẫu: Dùng phôi vô tính hay chồi cây lan. Điều kiện phòng nuôi cấy: Cƣờng độ ánh sáng 2000 lux Nhiệt độ 26 ± 20C Ẩm độ 60-80% Thời gian chiếu sáng:16 giờ/ngày 3.4.3 Môi trƣờng sử dụng Môi trƣờng sử dụng trong thí nghiệm: Môi trƣờng MS (Murashige và Skoog 1962) Thành phần Dang sử dụng nồng độ (mg/l) Khoáng đa lƣợng (Macro MS) NH4NO3 1650 KNO3 1900 KH2PO4 170 MgSO4.7H2O 370 CaCl2.2H2O 440 Khoáng vi lƣợng H3BO3 6,2 MnSO4.4H2O 22,3 28 (Micro MS) CoCl2.6H2O 0,025 CuSO4.5H2O 0,025 ZnSO4.4H2O 8,6 Na2MoO4.2H2O 0,25 KI 0,83 Fe_EDTA FeSO4.7H2O 27,8 Na2EDTA.2H2O 37,3 Vitamine Myo-Inositol 100 Nicotinic acid 0,5 Thiamine-HCl (B1) 0,1 Glycine 2 Pyridoxine-HCl (B6) 0,5 Các chất khác: Nƣớc cất Đƣờng: 30 g/l Agar: 8 g/l pH môi trƣờng trƣớc khi hấp: 5,8 Ngoài ra còn sử dụng thêm môi trƣờng MS có bổ sung thêm sodium alginate và CaCl2.2H2O 7mM để bọc vỏ nhân tạo Nhuộm rễ: Nƣớc cất, Alkaline H2O2, HCl 1%, Acid Glycerol, Trypan blue. 3.5 Phƣơng pháp nghiên cứu 3.5.1 Chuẩn bị môi trƣờng Tất cả môi trƣờng đều phải đƣợc khử trùng bằng nồi hấp autoclave ở 1210C trong 25 phút, kể cả CaCl2.2H2O 29 3.5.2 Bố trí thí nghiệm Nội dung 1: Nghiên cứu kỹ thuật tạo hạt nhân tạo từ phôi cây lan Vanda Các thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, lập lại 3 lần. Hạt nhân tạo sau khi bọc vỏ xong cho nẩy mầm trên môi trƣờng MS không có chất kích thích sinh trƣởng. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ sodium alginate đến sự hình thành hạt nhân tạo Nghiệm thức Môi trƣờng Nồng độ alginate 1 MS 10 g/l 2 MS 20 g/l 3 MS 30 g/l 4 MS 40 g/l 5 MS 50 g/l Ghi chú: Số nghiệm thức: 5 Số bình mỗi nghiệm thức: 1 Số hạt mỗi bình: 10 Tổng số bình: 15 Tổng số hạt: 150 hạt Chỉ tiêu theo dõi: Theo dõi tính chất vỏ hạt, tỷ lệ sống của phôi sau khi bọc vỏ hạt Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của môi trƣờng tạo hạt nhân tạo Nghiệm thức Môi trƣờng Nồng độ alginate 1 MS 30 g/l 2 ½ MS 30 g/l 3 ¼ MS 30 g/l 4 1/8MS 30 g/l 30 Ghi chú Số nghiệm thức: 4 Số bình mỗi nghiệm thức:1 Số hạt mỗi bình: 10 Tổng số bình: 12 Tổng số hạt: 120 Chỉ tiêu theo dõi: Theo dõi tỷ lệ sống của hạt nhân tạo trên môi trƣờng MS Thí nghiệm 3: Khảo sát môi trƣờng bảo quản hạt nhân tạo Nghiệm thức Môi trƣờng tao hạt Nồng độ alginate Môi trƣờng bảo quản 1 ½ MS 30 g/l Không có dinh dƣỡng 2 ½ MS 30 g/l Nƣớc cất 3 ½ MS 30 g/l Nƣớc đƣờng 4 ½ MS 30 g/l Agar 5 ½ MS 30 g/l Agar có đƣờng 6 ½ MS 30 g/l MS Ghi chú: Số nghiệm thức:6 Số bình mỗi nghiệm thức: 1 Số hạt mỗi bình: 10 Tổng số bình: 18 Tổng số hạt: 180 Các dạng môi trƣờng bảo quản hạt nhân tạo: Môi trƣờng không dinh dƣỡng: Bình nƣớc biển không, đem hấp khử trùng sau đó cho hạt nhân tạo vào. Môi trƣờng nƣớc cất: Nƣớc cất cho vào mỗi bình 150 ml đem hấp khử trùng Môi trƣờng nƣớc đƣờng: Nƣớc cất bổ sung 30 g/l đƣờng sucrose, cho vào mỗi bình 150 ml đem hấp khử trùng cho hạt nhân tạo vào. Môi trƣờng agar: Nƣớc cất cho vào 8,6 g/l agar, cho vào mỗi bình 70- 80ml đem hấp khử trùng. 31 Môi trƣờng agar đƣờng: Nƣớc cất có 8,6 g/l agar và bổ sung thêm 30 g/l đƣờng cho vào mỗi bình 70-80 ml đem hấp khử trùng. Chỉ tiêu theo dõi: Theo dõi màu sắc của phôi khi bảo quản, tỷ lệ sống của hạt nhân tạo khi bảo quản và khi cho nảy mầm trên môi trƣờng MS Thí nghiệm 4: Khảo sát sự nẩy mầm của hạt nhân tạo trên các giá thể khác nhau Nghiệm thức Môi trƣờng tạo hạt Nồng độ alginate Điều kiện nẩy mầm 1 ½ MS 30 g/l MS 2 ½ MS 30 g/l Cầu giấy 3 ½ MS 30 g/l Bông gòn Ghi chú: Số nghiệm thức: 3 Số bình mỗi nghiệm thức: 1 Số hạt mỗi bình:10 Tổng số bình: 9 Tổng số hạt: 90 Phƣơng pháp tạo giá thể cầu giấy, bông gòn Cầu giấy: Giấy thấm xếp thành 4 lớp cho vào bình đem hấp khử trùng, sau đó cho vào thêm 40 ml nƣớc cất đã hấp tiệt trùng, cho hạt nhân tạo nằm trên bề mặt giấy. Bông gòn: Bông gòn cắt lớp dày 2 cm cho vào bình đem hấp khử trùng, sau đó cho 40 ml nƣớc cất đã tiệt trùng , cho bông gòn thấm ƣớt rồi bỏ hạt nhân tạo lên bề mặt bông gòn Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ hạt nhân tạo nẩy mầm trên các giá thể Nội dung 2: Khảo sát sự hiện diện của Mycorrhiza trên một số giống lan Lấy mẫu rễ lan Dendrobium lai, Dendrobium rừng, Cattleya, Ngọc Điểm bảo quản trong túi nylon. Mỗi giống lan thu 15 mẫu rễ. Rễ sau khi lấy xong phải cắt mỏng rồi đem nhuộm theo quy trình sau: Rửa sạch rễ thấm khô hấp trong nồi autoclave ở 1210 C-3’ Rửa rễ làm nhiều lần trong nƣớc cất 32 Ngâm rễ trong dung dịch Alkaline H2O2 từ 10’ – 30’ (tuỳ theo màu nâu của rễ ) Rửa rễ nhiều lần Ngâm rễ trong dung dịch HCl 1% trong 1-2 giờ. Khi ngâm trong hoá chất cần phải làm ngập mẫu rễ và lƣợng hoá chất gấp 20 thể tích rễ. Nhuộm rễ trong Acid Glycerol/Trypan Blue 30’ tại 900C trong tủ sấy. Tồn trữ mẫu trong Acidic Glycerol Quan sát hình thái và đánh giá tỷ lệ hiện diện của mycorrhiza trên các giống lan. 3.6 Xử lý số liệu Số liệu đƣợc xử lý thống kê bằng phần mềm STATGRAPHIS 7.0 và phần mềm Excel 33 CHƢƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Nội dung 1: Nghiên cứu kỹ thuật tạo hạt nhân tạo từ phôi cây lan A: Phôi hình tim B: Phôi hình cầu C: Phôi hình lá D: Phôi hình thuỷ lôi Hình 4-2: Các dạng phôi vô tính Phôi soma là cấu trúc lƣỡng cực với cả đỉnh ngọn và vùng mô phân sinh cơ bản, mà khả năng tái sinh hình thành cành non và rễ. Tế bào có khả năng sinh phôi là những tế bào đẳng kính, nhân to, tế bào chất đậm đặc và nhiều hạt tinh bột (Nguyễn Đức Lƣợng, 2002). Những tế bào này có hàm lƣợng protein và RNA cao và trải qua các bƣớc: -Sự biệt hoá các tế bào có khả năng sinh phôi thành tế bào phôi. -Sự phát triển của những tế bào phôi mới hình thành thông qua các giai đoạn sau Phôi hình cầu Phôi hình thuỷ lôi Phôi hình tim Phôi hình lá Sau 4 tuần nuôi cấy, bắt đầu xuất hiện những tế bào có cấu trúc giống phôi, phôi hình cầu có cấu tạo non hơn, có màu xanh lá ít hơn so với những dạng phôi khác. 34 A: Phôi hình cầu B: Phôi hình tim C: Phôi hình thuỷ lôi D: Phôi hình lá Hình 4.2: Cấu trúc của phôi vô tính A: Nƣớc cất B: CaCl2.2H2O C: Sodium alginate Hình 4.3: Môi trƣờng tạo hạt nhân tạo A B C 35 A: Hút sodium alginate B: Lấy phôi C: Đƣa phôi vào giọt alginate D: Nhỏ giọt phôi xuống CaCl2 Hình 4.4: Các bƣớc tạo hạt nhân tạo A: Hạt nhân tạo ngâm trong CaCl2.H2O 100 mM trong 20 phút B: Hạt nhân tạo rửa trong nƣớc cất 5 phút Hình 4.5: Sự hình thành hạt nhân tạo 36 Hình 4.6: Cấu tạo vi thể của hạt nhân tạo 4.1.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ sodium alginate đến sự hình thành hạt nhân tạo * Ảnh hƣởng lên hình thái vỏ hạt nhân tạo Hạt nhân tạo sau khi tạo ở các nồng độ sodium alginate 10 g/l, 20 g/l, 30 g/l, 40 g/l, 50 g/l cho ra các hạt nhân tạo có hình thái vỏ khác nhau. Hạt nhân tạo ở nồng độ 10 g/l không định hình đƣợc rõ ràng, vỏ alginate không bọc đƣợc phôi. Bảng 4.1: Nồng độ alginate ảnh hƣởng lên hình thái vỏ hạt nhân tạo NT Môi trƣờng Sodium alginate Hình thái vỏ hạt 1 ½ MS 10 g/l Rất mềm, rất dễ vỡ 2 ½ MS 20 g/l Mềm, không bọc toàn phôi 3 ½ MS 30 g/l Vừa, bọc hạt tròn đẹp 4 ½ MS 40 g/l Dày, hạt tròn đều 5 ½ MS 50 g/l Rất dày, hạt tròn không đều Lớp alginate Phôi vô tính 37 A: Nồng độ alginate 10 g/l B: Nồng độ alginate 20 g/l C: Nồng độ alginate 30 g/l D: Nồng độ alginate 40 g/l E: Nồng độ alginate 50 g/l Hình 4-7: Hạt nhân tạo ở các nồng độ alginate khác nhau *Ảnh hƣởng lên khả năng bảo quản Hạt nhân tạo ở nồng độ sodium alginate 20 g/l,30 g/l, 40 g/l, 50g/l tạo hình dạng hạt rõ ràng, đƣa những hạt nhân tạo này lên môi trƣờng MS không có chất kích thích sinh trƣởng, theo dõi tỷ lệ sống của hạt nhân tạo trong khoảng thời gian dãn cách 1 tuần. 38 Bảng 4.2: Tỷ lệ sống của hạt nhân tạo ở các nồng độ alginate NT Nồng độ alginate Tỷ lệ sống (%) 1tuần 1tuần 3tuần 1 10 g/l - - - 2 20 g/l 80,43 B 78,02 B 71,63B 3 30 g/l 75,41 AB 70,25 AB 69,82 B 4 40 g/l 62,68 A 58,02 A 55,28 A 5 50 g/l 60,66 A 58,98 A 55,59 A CV 18,82 23,25 17,87 Các giá trị theo sau bởi chữ cái không cùng ký tự có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê học Biểu đồ 4-1: Tỷ lệ sống của hạt nhân tạo ở các nồng độ alginate khác nhau *Ảnh hƣởng lên tỷ lệ nẩy mầm Ngoài theo dõi tỷ lệ sống của hạt nhân tạo, tỷ lệ nẩy mầm của hạt nhân tạo trên môi trƣờng MS cũng quan trọng 1 2 3 Tuần 39 Bảng 4.3: Tỷ lệ nẩy mầm của hạt nhân tạo ở các nồng độ alginate khác nhau NT Nồng độ alginate Tỷ lệ nẩy mầm sau 3 tuần Tỷ lệ nẩy mầm sau 4 tuần 1 10 g/l - 2 20 g/l 61% B 66,41 B 3 30 g/l 56 % B 71,60 B 4 40 g/l 31% A 39,68 A 5 50 g/l 26% A 42,62 A CV 14,66% 20,8% Các giá trị theo sau bởi chữ cái không cùng ký tự có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê học Kết luận sơ bộ: Ở nồng độ alginate 10 g/l, 20 g/l vỏ hạt nhân tạo rất dễ vỡ, không hình thành vỏ hạt rõ ràng. Với nồng độ alginate 30 g/l, 40 g/l, 50 g/l vỏ hạt nhân tạo cứng và bọc toàn bộ phôi/chồi. Trong đó, nồng độ 30 g/l làm cho hạt nhân tạo tròn đẹp, có độ cứng vừa phải. Ở nồng độ 20 g/l và 30 g/l, tỷ lệ hạt nhân tạo sống sót và nẩy mầm cao hơn so với 40 g/l và 50 g/l có sự khác biệt về mặt thống kê. Do đó, có thể sử dụng nồng độ alginate 30 g/l để tạo hạt nhân tạo, vừa có hình thái đẹp và tỷ lệ nẩy mầm cao. Hình 4-8: Hạt nhân tạo nẩy mầm 4.1.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của môi trƣờng tạo hạt nhân tạo * Khảo sát khả năng bảo quản hạt trên môi trƣờng MS Vỏ hạt nhân tạo bên cạnh bị ảnh hƣởng bởi nồng độ sodium alginate còn bị ảnh hƣởng bởi môi trƣờng dinh dƣỡng bổ sung trong vỏ hạt. Vì nhờ môi trƣờng này mà cung cấp dinh dƣỡng cho phôi sống và nẩy mầm khi gặp điều kiện thuận lợi 40 Môi trƣờng sử dụng bổ sung cho vỏ hạt nhân tạo là môi trƣờng MS và môi trƣờng MS giảm dần khoáng đa lƣợng nhƣ môi trƣờng ½ MS, ¼ MS, 1/8 MS. Hạt nhân tạo sau đó đƣợc đem gieo trên môi trƣờng MS, theo dõi tỷ lệ sống của phôi hạt nhân tạo sau khoảng thời gian 1 tuần. Bảng 4.4: Tỷ lệ sống của hạt nhân tạo ở các môi trƣờng dinh dƣỡng khác nhau NT Môi trƣờng Tỷ lệ sống (%) 1 tuần 2 tuần 3 tuần 1 MS 91,00 NS 73,33 NS 49,67 B 2 ½ MS 86,00NS 70,67NS 55,67B 3 ¼ MS 87,33NS 81,00NS 34,67A 4 1/8 MS 77,33 NS 70,00 NS 36,67 A CV 9,42% Các giá trị theo sau bởi chữ cái không cùng ký tự có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê học Biểu đồ 4-2: Tỷ lệ sống sót của hạt nhân tạo ở môi trƣờng khác nhau 41 *Khảo sát tỷ lệ hạt nẩy mầm Khoáng đa lƣợng có trong vỏ hạt nhân tạo cũng ảnh hƣởng đến tỷ lệ nẩy mầm của hạt nhân tạo trên môi trƣờng MS Bảng 4.5: Tỷ lệ nẩy mầm của hạt nhân tạo ở các môi trƣờng dinh dƣỡng khác nhau NT Môi trƣờng Tỷ lệ nẩy mầm sau 3 tuần (%) Tỷ lệ nẩy mầm sau 4 tuần (%) 1 MS 52,33 B 53,80 A 2 ½ MS 71,67A 71,42B 3 ¼ MS 40,00B 50,40A 4 1/8 MS 39,00 B 47,78 A CV 18,05 14,65 Các giá trị theo sau bởi chữ cái không cùng ký tự có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê học Kết luận sơ bộ: Ở thí nghiệm 2, chúng tôi nhận thấy hạt nhân tạo của phôi cây lan có vỏ bọc môi trƣờng nhân tạo MS,1/2MS có tỷ lệ sống sót cao hơn các môi trƣờng tạo hạt khác (1/4 MS, 1/8MS) có sự khác biệt về mặt thống kê. Còn ở môi trƣờng ½ MS tỷ lệ nẩy mầm của hạt nhân tạo cao nhất (72%), thích hợp cho việc tạo hạt nhân tạo phôi cây lan Vanda. 4.1.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát môi trƣờng bảo quản hạt nhân tạo * Ảnh hƣởng đến vỏ hạt Hạt nhân tạo có vỏ bọc tối ƣu (1/2 MS, 30 g/l alginate) đƣợc thí nghiệm bảo quản ở các môi trƣờng khác nhau. 42 Bảng 4.6:Khảo sát ảnh hƣởng của môi trƣờng bảo quản hạt nhân tạo NT Môi trƣờng Nồng độ alginate Môi trƣờng bảo quản Hình thái vỏ hạt 1 ½ MS 30 g/l Không dinh dƣỡng Vỏ hạt khô cứng, màu xanh 2 ½ MS 30 g/l Nƣớc cất Vỏ hạt mềm vỡ ra, màu xanh 3 ½ MS 30 g/l Nƣớc đƣờng Vỏ hạt mềm nở ra, màu xanh 4 ½ MS 30 g/l Agar Hạt màu vàng, nâu đen 5 ½ MS 30 g/l Agar có đƣờng Hạt xanh vàng, 6 ½ MS 30 g/l MS Hạt vẫn giữ đƣợc hình dạng cũ A: Nƣớc cất B: Nƣớc đƣờng C: Không có chất dự trữ D: Agar E: Agar đƣờng F: Môi trƣờng MS Hình 4-9: Hạt nhân tạo trên các môi trƣờng bảo quản Kết luận sơ bộ:Trong môi trƣờng lỏng (nƣớc cất và nƣớc đƣờng), vỏ hạt bị nƣớc thẩm thấu mềm và vỡ ra, không bao đƣợc phôi, hạt nhân tạo vẫn giữ đƣợc màu xanh đậm. Trong môi trƣờng không có chất dinh dƣỡng, vỏ hạt nhân tạo khô bám chặt vào phôi. Còn môi trƣờng agar và agar có đƣờng, hạt bị vàng hoặc nâu đen. Môi trƣờng MS, hạt nhân tạo vẫn giữ đƣợc nguyên hình thái ban đầu, màu sắc và hình thái đều không thay đổi. 43 *Khảo sát tỷ lệ nẩy mầm sau khi bảo quản Hạt nhân tạo sau khi bảo quản trong 3 tuần, đem tất cả hạt nhân tạo ở mỗi loại cho nẩy mầm trên môi trƣờng MS, theo dõi tỷ lệ nẩy mầm của hạt nhân tạo. Bảng 4.7: Tỷ lệ nẩy mầm của hạt nhân tạo sau khi bảo quản NT Môi trƣờng Nồng độ alginate Môi trƣờng bảo quản Tỷ lệ nẩy mầm (%) 1 ½ MS 30 g/l Không dinh dƣỡng 18,67A 2 ½ MS 30 g/l Nƣớc cất 15,33A 3 ½ MS 30 g/l Nƣớc đƣờng 20,00A 4 ½ MS 30 g/l Agar 10,00A 5 ½ MS 30 g/l Agar có đƣờng 24,67A 6 ½ MS 30 g/l MS 71,67B CV 2,6 Các giá trị theo sau bởi chữ cái không cùng ký tự có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê học Kết luận sơ bộ: Qua bảng trên, chúng tôi nhận thấy hạt nhân tạo từ phôi cây lan bảo quản trên môi trƣờng MS có tỷ lệ nẩy mầm cao hơn trên các môi trƣờng bảo quản khác về mặt thống kê học. 4.1.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát sự nẩy mầm của hạt nhân tạo trên các giá thể khác nhau Hạt sau khi tạo xong cho nẩy mầm ở 3 môi trƣờng khác nhau cầu giấy, bông gòn, MS 44 Bảng 4.8: Tỷ lệ hạt nhân tạo nẩy mầm trên các giá thể NT Môi trƣờng tạo hạt Nồng độ alginate Điều kiện nẩy mầm Tỷ lệ nẩy mầm (%) 1 ½ MS 30 g/l MS 65,00A 2 ½ MS 30 g/l Cầu giấy 86,33AB 3 ½ MS 30 g/l Bông gòn 94,33B CV 17,08 % Các giá trị theo sau bởi chữ cái không cùng ký tự có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê học A: Bông gòn B: Cầu giấy C: Môi trƣờng MS Hình 4-10: Hạt nhân tạo nẩy mầm trên các giá thể Kết luận sơ bộ: Qua thí nghiệm 4, chúng tôi nhận thấy giá thể bông gòn có hạt nhân tạo nẩy mầm với tỷ lệ cao (88,63) so với cầu giấy (68,64) và môi trƣờng MS đặc (53,65), có sự khác biệt về mặt thống kê. 45 4.2 Nội dung 2: Khảo sát sự hiện diện của mycorrhiza ở các giống lan Sau khi thu thập, nhuộm rễ quan sát dƣới kính hiển vi, chúng tôi quan sát mycorrhiza bắt màu xanh đậm, có các dạng sau: -Sợi nấm ăn màu xanh, phân nhiều nhánh ăn xuyên qua nhiều lớp tế bào -Sợi nấm cuộn tròn trong 1 tế bào -Sợi nấm là các cuộn tròn nằm ở các tế bào, nối với nhau bằng sợi nấm Bảng 4.9: Sự hiện diện của mycorrhiza trên các giống lan Giống Số cây lấy mẫu Số cây có mycorrhiza % cây có mycorrhiza DENDROBIUM RỪNG 15 13 87 DENDROBIUM LAI 15 10 67 CATTLEYA 1 LÁ 15 12 80 CATTLEYA 2 LÁ 15 12 80 NGỌC ĐIỂM 15 7 47 ONCIDIUM 50 32 64 VANDA 50 6 12 MOKARA 50 15 30 (Riêng giống Oncidium, Vanda, Mokara tham khảo số liệu của Ngô Huỳnh Thanh Vân, 2005.) 46 Biểu đồ 4.3: Sự hiện diện của mycorrhiza trên các giống lan Qua bảng số liệu và biểu đồ, chúng tôi nhận thấy hầu hết các giống lan đều có mycorrhiza cộng sinh, giúp cây lan phát triển tốt hơn. Tuy nhiên sự hiện diện ở các giống lan có sự khác biệt rõ rệt. Mycorrhiza hiện diện nhiều nhất ở Dendrobium (77%), ít nhất ở Vanda (12%). Ở những giống lan độc trụ nhƣ Mokara, Ngọc Điểm, Vanda thì sự có mặt của mycorrhiza kém hơn so với cây lan đa thân. Cây Dendrobium rừng (87%) có tỷ lệ mycorrhiza nhiều hơn so với cây Dendrobium lai (67%). Còn giữa loài Cattleya 1 lá và Cattleya 2 lá thì tỷ lệ hiện diện của mycorrhiza là ngang bằng nhau, không có sự khác biệt. Nguyên nhân: Do hình thức phát triển của rễ Do nguồn gốc cây lan trồng Do cách chăm sóc nhƣ phun thuốc trừ sâu làm giảm lƣợng nấm. 47 Hình 4-11: Vùng mô có mycorrhiza A, B: Sợi nấm đa bào, xuyên qua các tế bào C: Nấm có những u to tròn ở cuối sợi nấm D: Nấm cuộn tròn trong tế bào. Hình 4-12: Các dạng mycorrhiza C D Có mycorrhiza Không có mycorrhiza 48 A: Sợi nấm cuộn lại có 2 đầu đƣa ra bên ngoài B: Các cuộn nấm nối với nhau bằng các sợi nấm, sợi nấm có vách ngăn Hình 4-13: Dạng mycorrhiza cuộn tròn 49 CHƢƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận * Nghiên cứu kỹ thuật tạo hạt nhân tạo từ phôi cây lan Vanda Hạt nhân tạo từ phôi cây lan Vanda có hình dạng đẹp, tỷ lệ nẩy mầm cao khi nồng độ sodium alginate (30 g/l) và môi trƣờng dinh dƣỡng (1/2 MS) bổ sung vào vỏ hạt nhân tạo thích hợp cho phôi cây lan Vanda. Môi trƣờng bảo quản (MS) thích hợp cho việc lƣu trữ hạt nhân tạo, bảo đảm chất lƣợng và tỷ lệ nẩy mầm cao cho hạt nhân tạo. Hạt nhân tạo nẩy mầm cho tỷ lệ cao (bông gòn thấm 40 ml nƣớc cất), vì sợi gòn xốp tạo môi trƣờng thông thoáng, khô ráo, giữ độ ẩm lâu nên thích hợp cho hạt nhân tạo nẩy mầm * Khảo sát sự hiện diện của mycorrhiza trên một số giống lan Mycorrhiza xuất hiện ở giống lan đa thân cao hơn ( 64-87%) còn ở lan đơn thân thì tỷ lệ này thấp hơn ( 12-47%) vì vậy cây đa thân hút dinh dƣỡng tốt hơn, ít bị hiện tƣợng thiếu hụt khoáng hơn so với cây đơn thân. Mycorrhiza ở cây cấy mô (Dendrobium lai 67%) có tỷ lệ thấp hơn so với cây lan có nguồn gốc tự nhiên (Dendrobium rừng 87%) 5.2 Đề nghị * Nghiên cứu kỹ thuật tạo hạt nhân tạo từ phôi cây lan Vanda Tiếp tục khảo sát các điều kiện và môi trƣờng bảo quản hạt nhân tạo lâu hơn vẫn cho tỷ lệ nẩy mầm cao hơn khi gieo hạt nhân tạo ở điều kiện thích hợp. Tìm giá thể khác gieo hạt nhân tạo có giá rẻ nhƣng có tỷ lệ nẩy mầm cao. * Khảo sát sự hiện diện của mycorrhiza trên một số giống lan Tiếp tục nghiên cứu phân lập và định danh tên các dạng mycorrhiza trên cây lan. 50 Tiếp tục thu thập nhiều mẫu rễ lan và thực hiện trên nhiều loài lan để đƣa ra kết luận chính xác, chi tiết hơn. Nghiên cứu ảnh hƣởng của mycorrhiza trên sự sinh trƣởng của cây lan trong nuôi cấy in vitro. 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO * Tài liệu tiếng Việt 1. Bùi Bá Bổng, 1995. Nhân giống c ây bằng nuôi cấy mô. Nhà Xuất Bản Sở Khoa Học Công Nghệ Và Môi Trƣờng An Giang. 2. Lee S. Cooke, 1995. Sâu bệnh hại cây hoa lan. (Nguyễn Minh Trực dịch). Nhà Xuất Bản Nông Nghiệp. 3. Dƣơng Công Kiên, 2002. Nuôi cấy mô thực vật (tập 1). Nhà Xuất Bản Đại Học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh 4. Nguyễn Đức Lƣợng, Lê Thị Thuỷ Tiên, 2002. Công nghệ tế bào. Nhà Xuất Bản 5. Trần Văn Mão, 1999. Sử dụng vi sinh vật có ích (tập 2). Nhà Xuất Bản Nông Nghiệp 6. Nguyễn Công Nghiệp, 1999. Trồng hoa lan. Nhà Xuất Bản Trẻ 7. Liêu Hồng Phú, 2005. Khoá luận tốt nghiệp (Đại Học Nông Lâm) 8. Trịnh Pari, 2004. Luận văn thạc sĩ (Đại Học Nông Lâm 9. Nguyễn Thiện Tịch, Đoàn Thị Hoa, Trần Sĩ Dũng, Huỳnh Thị Ngọc Nhân, 1996. Kỹ thuật nuôi trồng hoa lan. Nhà Xuất Bản Nông Nghiệp. 10. Trần Ngọc Thuỷ Tiên, 2004. Khoá luận tốt nghiệp (Đại Học Khoa Học Tự Nhiên) 11. Ngô Huỳnh Thanh Vân, 2005. Khoá luận tốt nghiệp (Đại Học Nông Lâm) 12. Câu lạc bộ học viên hoa lan, 1999. Tìm hiểu hoa lan. Nhà Xuất Bản Nông Nghiệp *Tài liệu nƣớc ngoài: 1. Supriyanto, Jahja T. K., 1995. Biology and biotechnology of mycorrhiza. Southeast Asian Regional Centre for Tropical Biology Bogor, Indonesia 2. Mukerji K.G., Manoharachary C., Chamola B.P., 2001. Techniques in mycorrhiza studies. Kluwer Academic Publishers. 52 3. Sharp W.R., Sondah M.R., Caldas L.S and Maraffo S.B.,1980. The phisiology of in vitro asexual embryogenesis. Hortie 4. Fujimura T. and Komamine A., 1979. Synchronization of somatic embryogenesis in carrot cell suspension culture. Plant physiol 5. Redenbaugh K. et al., 1986. Somatic seed: encapsulation of asexual plant embryo. Biotechnology *Tài liêu từ internet ?config 53 PHỤ LỤC Thí nghiệm 1:Tỷ lệ sống sót của hạt nhân tạo sau 1 tuần One-Way Analysis of Variance -------------------------------------------------------------------------------- Data: tn1.ss Level codes: tn1.t Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance ------------------------------------------------------------------------------------------ Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level ------------------------------------------------------------------------------------------ Between groups 1672.8675 3 557.62249 3.230 .0442 Within groups 3452.8019 20 172.64009 ------------------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 5125.6693 23 0 missing value(s) have been excluded. Tests for Homogeneity of Variances ---------------------------------- ---------------------------------------------------------- Cochran's C test: 0.528615 P = 0.123637 Bartlett's test: B = 1.67499 P(9.52264) = 0.0230917 Hartley's test: 21.2296 Multiple range analysis for tn1.ss by tn1.t ------------------------------------------------------------------------------------------ Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups ------------------------------------------------------------------------------------------ 4 6 60.656667 X 3 6 62.676667 X 2 6 75.410000 X X 1 6 80.430000 X ----------------------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits 2 - 3 12.7333 15.8279 2 - 4 14.7533 15.8279 2 - 1 -5.02000 15.8279 3 - 4 2.02000 15.8279 3 - 1 -17.7533 15.8279 * 4 - 1 -19.7733 15.8279 * ----------------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. 54 Thí nghiệm 1:Tỷ lệ sống sót của hạt nhân tạo sau 2 tuần One-Way Analysis of Variance -------------------------------------------------------------------------------- Data: Tn1.ss Level codes: tn1.t Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance ----------------------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level ----------------------------------------------------------------------------------------------- Between groups 1649.8414 3 549.94713 2.312 .1069 Within groups 4756.3131 20 237.81565 ----------------------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 6406.1544 23 0 missing value(s) have been excluded. Tests for Homogeneity of Variances ---------------------------------------------------------------------------------------------- Cochran's C test: 0.566161 P = 0.0720209 Bartlett's test: B = 1.7141 P(9.94876) = 0.0190068 Hartley's test: 20.1912 Multiple range analysis for tn1.ss by tn1.t -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 3 6 58.020000 X 4 6 58.983333 X 2 6 70.250000 X X 1 6 78.016667 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits 2 - 3 12.2300 18.5768 2 - 4 11.2667 18.5768 2 - 1 -7.76667 18.5768 3 - 4 -0.96333 18.5768 3 - 1 -19.9967 18.5768 * 4 - 1 -19.0333 18.5768 * -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. 55 Thí nghiệm 1:Tỷ lệ sống sót của hạt nhân tạo sau 3 tuần One-Way Analysis of Variance ------------------------------------------------------------------------------------- Data: Tn1.ss Level codes: Tn1.t Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance ----------------------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level ---------------------------------------------------------------------------------------------- Between groups 1490.3449 3 496.78165 3.882 .0245 Within groups 2559.2726 20 127.96363 ---------------------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 4049.6176 23 0 missing value(s) have been excluded. Tests for Homogeneity of Variances ---------------------------------- Cochran's C test: 0.644031 P = 0.0191185 Bartlett's test: B = 1.47409 P(7.16388) = 0.0668539 Hartley's test: 8.17543 Multiple range analysis for tn1.ss by tn1.t ----------------------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups ----------------------------------------------------------------------------------------------- 3 6 55.280000 X 4 6 55.586667 X 2 6 70.725000 X 1 6 71.633333 X ----------------------------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits 2 - 3 15.4450 13.6268 * 2 - 4 15.1383 13.6268 * 2 - 1 -0.90833 13.6268 3 - 4 -0.30667 13.6268 3 - 1 -16.3533 13.6268 * 4 - 1 -16.0467 13.6268 * ----------------------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. 56 Thí nghiệm 1: Tỷ lệ nẩy mầm sau 3 tuần One-Way Analysis of Variance ---------------------------------------------------------------------------------------- Data: Tn1.nm Level codes: Tn1.t Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance ----------------------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level ----------------------------------------------------------------------------------------------- Between groups .2740917 3 .0913639 22.559 .0003 Within groups .0324000 8 .0040500 ----------------------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) .3064917 11 0 missing value(s) have been excluded. Tests for Homogeneity of Variances ---------------------------------- Cochran's C test: 0.598765 P = 0.258378 Bartlett's test: B = 1.52419 P(2.79038) = 0.425086 Hartley's test: 15.3158 Multiple range analysis for Tn1.nm by tn1.t ----------------------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups ---------------------------------------------------------------------------------------------- 4 3 .2633333 X 3 3 .3066667 X 2 3 .5566667 X 1 3 .6100000 X ----------------------------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits 2 - 3 0.25000 0.11986 * 2 - 4 0.29333 0.11986 * 2 - 1 -0.05333 0.11986 3 - 4 0.04333 0.11986 3 - 1 -0.30333 0.11986 * 4 - 1 -0.34667 0.11986 * ----------------------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. 57 Thí nghiệm 1: Tỷ lệ nẩy mầm sau 4 tuần One-Way Analysis of Variance -------------------------------------------------------------------------------- Data: TN12.nm Level codes: TN12.t Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- Between groups .2380639 3 .0793546 5.890 .0201 Within groups .1077792 8 .0134724 -------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) .3458431 11 0 missing value(s) have been excluded. Tests for Homogeneity of Variances ---------------------------------- Cochran's C test: 0.423889 P = 0.764855 Bartlett's test: B = 1.30398 P(1.75728) = 0.624276 Hartley's test: 7.37675 Multiple range analysis for TN12.nm by TN12.t -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 3 3 .3968254 X 4 3 .4262372 X 1 3 .6641026 X 2 3 .7160062 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits 1 - 2 -0.05190 0.21860 1 - 3 0.26728 0.21860 * 1 - 4 0.23787 0.21860 * 2 - 3 0.31918 0.21860 * 2 - 4 0.28977 0.21860 * 3 - 4 -0.02941 0.21860 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. 58 Thí nghiệm 2:Tỷ lệ sống sót của hạt nhân tạo sau 1 tuần One-Way Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------------------- Data: TN2.ss Level codes: tn2.t Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance ----------------------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level ----------------------------------------------------------------------------------------------- Between groups 144.6845 3 48.22816 .100 .9578 Within groups 3863.6698 8 482.95872 ---------------------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 4008.3543 11 0 missing value(s) have been excluded. Tests for Homogeneity of Variances ----------------------------------------------------------------------------------------------- Cochran's C test: 0.361364 P = 1 Bartlett's test: B = 1.03615 P(0.235114) = 0.971731 Hartley's test: 2.07152 Multiple range analysis for TN2.ss by tn2.t ---------------------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups ---------------------------------------------------------------------------------------------- 4 3 69.486667 X 2 3 75.213333 X 3 3 76.106667 X 1 3 79.070000 X ---------------------------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits 2 - 3 -0.89333 41.3896 2 - 4 5.72667 41.3896 2 - 1 -3.85667 41.3896 3 - 4 6.62000 41.3896 3 - 1 -2.96333 41.3896 4 - 1 -9.58333 41.3896 ---------------------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. 59 Thí nghiệm 2:Tỷ lệ sống sót của hạt nhân tạo sau 2 tuần One-Way Analysis of Variance -------------------------------------------------------------------------------------------- Data: tn2.ss Level codes: tn2.t Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance ---------------------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level ---------------------------------------------------------------------------------------------- Between groups 68.09663 3 22.698875 .317 .8131 Within groups 573.17567 8 71.646958 --------------------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 641.27229 11 0 missing value(s) have been excluded. Tests for Homogeneity of Variances ---------------------------------- Cochran's C test: 0.503208 P = 0.490437 Bartlett's test: B = 1.95629 P(4.44283) = 0.217447 Hartley's test: 14.7063 Multiple range analysis for tn2.ss by tn2.t -------------------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups --------------------------------------------------------------------------------------------- 4 3 57.703333 X 2 3 59.106667 X 1 3 59.696667 X 3 3 64.076667 X ------------------------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits 2 - 3 -4.97000 15.9417 2 - 4 1.40333 15.9417 2 – 1 -0.59000 15.9417 3 - 4 6.37333 15.9417 3 - 1 4.38000 15.9417 4 - 1 -1.99333 15.9417 ------------------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. 60 Thí nghiệm 2:Tỷ lệ sống sót của hạt nhân tạo sau 3 tuần One-Way Analysis of Variance --------------------------------------------------------------------------------------------- Data: tn2.ss Level codes: tn2.t Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance --------------------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level --------------------------------------------------------------------------------------------- Between groups 308.28820 3 102.76273 6.689 .0143 Within groups 122.90087 8 15.36261 ----------------------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 431.18907 11 0 missing value(s) have been excluded. Tests for Homogeneity of Variances ---------------------------------- ----------------------------------------------------------- Cochran's C test: 0.834815 P = 0.0180291 Bartlett's test: B = 3.97505 P(9.1368) = 0.0275263 Hartley's test: 108.678 Multiple range analysis for tn2.ss by tn2.t -------------------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups --------------------------------------------------------------------------------------------- 3 3 36.123333 X 4 3 37.266667 X 1 3 44.843333 X 2 3 48.193333 X ---------------------------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits 2 - 3 12.0700 7.38191 * 2 - 4 10.9267 7.38191 * 2 - 1 3.35000 7.38191 3 - 4 -1.14333 7.38191 3 - 1 -8.72000 7.38191 * 4 - 1 -7.57667 7.38191 * ----------------------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. 61 Thí nghiệm 2: Tỷ lệ nẩy mầm sau 3 tuần One-Way Analysis of Variance --------------------------------------------------------------------------------------------- Data: tn2.nm Level codes: tn2.t Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance ---------------------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level ---------------------------------------------------------------------------------------------- Between groups .2080917 3 .0693639 8.266 .0078 Within groups .0671333 8 .0083917 -------------------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) .2752250 11 0 missing value(s) have been excluded. Tests for Homogeneity of Variances -------------------------------------------------------------------------------------------- Cochran's C test: 0.480636 P = 0.560372 Bartlett's test: B = 1.3808 P(2.13625) = 0.544614 Hartley's test: 12.4103 Multiple range analysis for tn2.nm by tn2.t --------------------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups --------------------------------------------------------------------------------------------- 4 3 .3900000 X 3 3 .4000000 X 1 3 .5233333 X 2 3 .7166667 X ---------------------------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits 2 - 3 0.31667 0.17253 * 2 - 4 0.32667 0.17253 * 2 - 1 0.19333 0.17253 * 3 - 4 0.01000 0.17253 3 - 1 -0.12333 0.17253 4 - 1 -0.13333 0.17253 ----------------------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. 62 Thí nghiệm 2: Tỷ lệ nẩy mầm sau 4 tuần One-Way Analysis of Variance -------------------------------------------------------------------------------- Data: TN22.nm Level codes: TN22.t Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- Between groups .1024765 3 .0341588 5.100 .0291 Within groups .0535860 8 .0066982 -------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) .1560625 11 0 missing value(s) have been excluded. Tests for Homogeneity of Variances ---------------------------------- Cochran's C test: 0.335218 P = 1 Bartlett's test: B = 1.08099 P(0.515576) = 0.915456 Hartley's test: 2.8392 Multiple range analysis for TN22.nm by TN22.t -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 4 3 .4777778 X 3 3 .5039683 X 1 3 .5379915 X 2 3 .7142191 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits 1 - 2 -0.17623 0.15414 * 1 - 3 0.03402 0.15414 1 - 4 0.06021 0.15414 2 - 3 0.21025 0.15414 * 2 - 4 0.23644 0.15414 * 3 - 4 0.02619 0.15414 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. 63 Thí nghiệm 3: Tỷ lệ nẩy mầm của hạt nhân tạo sau khi bảo quản One-Way Analysis of Variance -------------------------------------------------------------------------------- Data: TN32.nm Level codes: TN32.t Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- Between groups .7630944 5 .1526189 22.154 .0000 Within groups .0826667 12 .0068889 -------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) .8457611 17 0 missing value(s) have been excluded. Tests for Homogeneity of Variances ---------------------------------- Cochran's C test: 0.51371 P = 0.163166 Bartlett's test: B = 260862 P(125.298) = 0 Hartley's test: 7.34998E31 Multiple range analysis for TN32.nm by TN32.t -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 4 3 .1000000 X 2 3 .1533333 X 1 3 .1866667 X 3 3 .2000000 X 5 3 .2466667 X 6 3 .7166667 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits 2 - 3 -0.04667 0.14769 2 - 4 0.05333 0.14769 2 - 5 -0.09333 0.14769 2 - 6 -0.56333 0.14769 * 2 - 1 -0.03333 0.14769 3 - 4 0.10000 0.14769 3 - 5 -0.04667 0.14769 * denotes a statistically significant difference. 64 Thí nghiệm 4: Tỷ lệ nẩy mầm của hạt nhân tạo trê n các giá thể One-Way Analysis of Variance ---------------------------------------------------------------------------------------------- Data: tn4.nm Level codes: tn4.t Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance ---------------------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level ---------------------------------------------------------------------------------------------- Between groups 1847.6009 2 923.80043 6.408 .0324 Within groups 865.0445 6 144.17409 ----------------------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 2712.6454 8 0 missing value(s) have been excluded. Tests for Homogeneity of Variances ----------------------------------------------------------------------------------------------- Cochran's C test: 0.895096 P = 0.0330148 Bartlett's test: B = 2.50508 P(4.50812) = 0.104972 Hartley's test: 21.5492 Multiple range analysis for tn4.nm by tn4.t ----------------------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups ---------------------------------------------------------------------------------------------- 1 3 53.653333 X 2 3 68.636667 XX 3 3 88.630000 X --------------------------------------------------------------------------------------------- contrast difference limits 2 - 3 -19.9933 23.9965 2 - 1 14.9833 23.9965 3 - 1 34.9767 23.9965 * --------------------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. 65 Bảng số liệu Thí nghiệm 1:Tỷ lệ hạt nhân tạo sống sót chưa biến đổi arcsin alginate 20 g/l 30g/l 40 g/l 50g/l 1 tuần 90 82 75 89 1 tuần 100 100 75 76 1 tuần 88 77 86 60 2 tuần 89 73 73 89 2 tuần 100 100 62 68 2 tuần 80 63 80 60 3 tuần 85 73 64 80 3 tuần 99 100 57 65 3 tuần 80 60 80 58 Thí nghiệm 1:Tỷ lệ nẩy mầm ở các nồng độ alginate sau 3 tuần 20 g/l 30 g/l 40 g/l 50 g/l lần 1 0,69 0,56 0,27 0,20 lần 2 0,64 0,58 0,36 0,27 lần 3 0,50 0,53 0,29 0,32 Thí nghiệm 1:Tỷ lệ nẩy mầm ở các nồng độ alginate sau 4 tuần 20 g/l 30 g/l 40 g/l 50 g/l Lần 1 0,70 0,77 0,33 0,33 Lần 2 0,69 0,83 0,50 0,59 Lần 3 0,60 0,55 0,36 0,36 66 Thí nghiệm 2: Tỷ lệ sống sót ở các môi trường dinh dưỡng chưa biến đổi arsin MS 1/2 MS 1/4 MS 1/8 MS 1 tuần 0,83 1,00 1,00 0,65 1 tuần 1,00 0,83 0,80 0,67 1 tuần 0,90 0,75 0,82 1,00 2 tuần 0,91 0,70 0,79 0,90 2 tuần 0,65 0,69 0,78 0,60 2 tuần 0,64 0,73 0,86 0,60 3 tuần 0,45 0,60 0,33 0,38 3 tuần 0,40 0,57 0,37 0,36 3 tuần 0,64 0,50 0,34 0,36 Thí nghiệm 2: Tỷ lệ hạt nhân tạo nẩy mầm sau 3 tuần MS 1/2 MS 1/4 MS 1/8 MS lần 1 0,45 0,8 0,33 0,4 lần 2 0,67 0,73 0,5 0,35 lần 3 0,45 0,62 0,37 0,42 Thí nghiệm 2: Tỷ lệ hạt nhân tạo nẩy mầm sau 4 tuần MS 1/2 MS 1/4 MS 1/8 MS Lần 1 0,48 0,73 0,43 0,45 Lần 2 0,54 0,80 0,58 0,58 Lần 3 0,59 0,62 0,50 0,40 67 Thí nghiệm 3: Tỷ lệ hạt nhân tạo nẩy mầm sau khi bảo quản Không dinh dưỡng Nước cất Nước đường Agar Agar đường MS Lần 1 0,24 0,18 0,3 0,1 0,11 0,7 Lần 2 0,22 0,08 0,2 0,1 0,4 0,73 Lần 3 0,1 0,2 0,1 0,1 0,23 0,72 Thí nghiệm 4: Tỷ lệ hạt nhân tạo nẩy mầm chưa biến đổi arcsin MS Cầu giấy Bông gòn 0,60 0,87 1,00 0,73 0,80 0,83 0,62 0,92 1,00