Khóa luận Nghiên cứu hiện trạng nhiễm bệnh TSWV (tomato spotted wilt virus) trên cây ớt bằng kỹ thuật elisa và bước đầu xây dựng phương pháp chẩn đoán bằng kỹ thuật RT - Pcr

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: NGHIÊN CỨU HIỆN TRẠNG NHIỄM BỆNH TSWV (Tomato spotted wilt virus) TRÊN CÂY ỚT BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ BƢỚC ĐẦU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN BẰNG KỸ THUẬT RT - PCR Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2001-2005 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN ĐÌNH TRƢỜNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2005 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ****** NGHIÊN CỨU HIỆN TRẠNG NHIỄM BỆNH TSWV (Tomato spotted wilt virus) TRÊN CÂY ỚT BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ BƢỚC ĐẦU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN BẰNG KỸ THUẬT RT - PCR Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS. TS. BÙI CÁCH TUYẾN NGUYỄN ĐÌNH TRƢỜNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2005 iii LỜI CẢM TẠ Chân thành cảm tạ Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ môn Công Nghệ Sinh Học cùng toàn thể Quý Thầy Cô trong Bộ môn đã tận tình dạy dỗ giúp đỡ em trong suốt thời gian học tập. PGS. TS. Bùi Cách Tuyến tận tình hướng dẫn tôi thực hiện đề tài này. TS. Bùi Minh Trí đã tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi thực hiện đề tài này. KS. Phạm Đức Toàn đã hết lòng giúp đỡ tôi thực hiện đề tài này. Các anh, chị đang công tác tại Trung tâm Phân tích Thí nghiệm trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp. Cô Lê Thị Thu Hà công tác tại trạm Bảo vệ Thực vật huyện Củ Chi đã giúp tôi trong quá trình tìm hiểu tình hình canh tác nông nghiệp trong huyện. Các cô, chú bác nông dân đã tận tình giúp đỡ trong quá trình điều tra thu thập mẫu. Cùng các bạn bè chung lớp đã giúp đỡ tôi. Thành kính ghi ơn Ông bà đã dạy bảo cho con thành người có ích. Cha mẹ đã sinh con, nuôi dạy cho con ăn học để con đạt được kết quả như ngày hôm nay. Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 15 tháng 09 năm 2005 Sinh viên thực hiện Nguyễn Đình Trường iv TÓM TẮT NGUYỄN ĐÌNH TRƢỜNG, Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. Tháng 9/2005. “NGHIÊN CỨU HIỆN TRẠNG NHIỄM BỆNH TSWV (Tomato spotted wilt virus) TRÊN CÂY ỚT BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ BƢỚC ĐẦU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN BẰNG RT – PCR”. Hội đồng hƣớng dẫn: PGS.TS. BÙI CÁCH TUYẾN Đề tài đƣợc tiến hành tại các xã trong huyện Củ Chi, Trảng Bàng, Châu Thành  Điều tra mức độ nhiễm bệnh TSWV trên cây ớt, tại các xã trong huyện  Tiến hành lấy mẫu bệnh TSWV tại vùng điều tra và chẩn đoán bằng kỹ thuật ELISA và RT – PCR tại Trung tâm phân tích Thí Nghiệm, Bộ môn Bảo vệ Thực vật Trƣờng Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. Nội dung thực hiện:  Điều tra, đánh giá tỷ lệ nhiễm bệnh TSWV ngoài đồng bằng sự đánh giá về hình thái.  Lấy mẫu, tiến hành chẩn đoán bằng phƣơng pháp ELISA và RT - PCR, từ đó rút ra kết luận về triệu chứng điển hình của TSWV trên cây ớt. Kết quả đạt đƣợc:  Tỷ lệ nhiễm TSWV theo địa bàn điều tra - Nhuận Đức: 12,1% - Phƣớc Thạnh: 12,5% - Lộc Hƣng: 0%  Tỷ lệ nhiễm TSWV theo triệu chứng - Lá khảm vàng xanh, cong, héo rũ: 37,5% - Lá chấm vàng xanh, nhăn nheo, co lại, dày, giòn: 57% - Lá khảm nặng có chấm đen, lủng lỗ:53% v - Khảm vàng nhạt trên lá và cả rìa lá: 25%  Tỷ lệ nhiễm trên trái - Trái nhiễm: 33% - Không nhiễm: 67% vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT TSWV: Tomato Spotted Wilt Virus dDAS-ELISA: direct Double Antibody Sandwich Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay RT-PCR: Reverse Transciptase-Polymerase Chain Reaction Genome L: Genome long Genome M: Genome medium Genome S: Genome short N: Nucleocapside cRNA: Complementary RNA vRNA: Virion RNA Tm: Melting temperature Ta: Annealing temperature GSP: Gen Special Primer cDNA: Complementary DNA p-NPP: p-Nitrophenyl phosphate RNAbc: RNA binding column PVP: Polyvinylpyrolydol vii MỤC LỤC Trang Trang tựa .......................................................................................................................... ii Cảm tạ ............................................................................................................................ iii Tóm tắt ............................................................................................................................ iv Danh sách các chữ viết tắt .............................................................................................. vi Mục lục .......................................................................................................................... vii Danh sách các bảng ........................................................................................................ xi Danh sách các đồ thị ....................................................................................................... xi Danh sách các hình ........................................................................................................ xii Danh sách các sơ đồ ...................................................................................................... xii Phần I. Mở Đầu .............................................................................................................. 1 1.1 Đặt vấn đề .................................................................................................................. 1 1.2 Mục Đích - Yêu cầu .................................................................................................. 1 1.2.1 Mục đích nghiên cứu ........................................................................................... 1 1.2.2 Yêu cầu ................................................................................................................ 1 Phần II. Tổng Quan Tài Liệu ....................................................................................... 2 2.1 Giới thiệu về cây ớt ................................................................................................... 2 2.1.1 Sơ lƣợc về cây ớt ................................................................................................. 2 2.1.2 Nguồn gốc cây ớt ................................................................................................. 2 2.1.3 Đặc điểm thực vật học của cây ớt ........................................................................ 2 2.1.3.1 Thân ............................................................................................................... 2 2.1.3.2 Rễ ................................................................................................................... 2 2.1.3.3 Lá ................................................................................................................... 2 2.1.3.4 Hoa ................................................................................................................. 3 2.1.3.5 Quả ................................................................................................................. 3 2.1.3.6 Hạt .................................................................................................................. 3 2.1.4 Giá trị dƣợc liệu của cây ớt .................................................................................. 3 2.1.5 Giá trị dinh dƣỡng của ớt ..................................................................................... 4 2.2 Một số bệnh trên cây ớt gây ra bởi các virút khác .................................................... 4 2.3 Yêu cầu điều kiện ngoại cảnh của cây ớt .................................................................. 9 viii 2.3.1 Nhiệt độ................................................................................................................ 9 2.3.2 Ánh sáng .............................................................................................................. 9 2.3.3 Ẩm độ .................................................................................................................. 9 2.3.4 Đất và dinh dƣỡng ............................................................................................... 9 2.4. Giới thiệu về Tomato spotted Wilt Virus (TSWV) ............................................... 10 2.4.1 Sơ lƣợc nguồn gốc TSWV ................................................................................. 10 2.4.2 Cấu trúc TSWV ................................................................................................. 10 2.5 Hình thức tấn công và gây bệnh .............................................................................. 13 2.6 Triệu chứng chung trên các loại cây trồng bị nhiễm TSWV ................................... 14 2.7 Triệu chứng cụ thể trên cây ớt ................................................................................. 14 2.8 Con đƣờng lây bệnh và dịch tễ học ......................................................................... 15 2.9 Điều kiện cho bệnh phát triển ................................................................................. 16 2.10 Khống chế bệnh TSWV ......................................................................................... 16 2.11 Chẩn đoán bệnh TSWV ......................................................................................... 18 2.11.1 Phƣơng pháp cây chỉ thị .................................................................................. 18 2.11.1.1 Cây nhiễm bộ phận .................................................................................... 18 2.11.1.2 Cây nhiễm hệ thống ................................................................................... 18 2.11.2 Phƣơng pháp chẩn đoán bằng kính hiển vi điện tử.......................................... 19 2.12 ELISA .................................................................................................................... 19 2.12.1 Khái niệm về ELISA ....................................................................................... 19 2.12.2 Phân loại ELISA .............................................................................................. 20 2.12.2.1 Direct ELISA (ELISA trực tiếp) ................................................................ 20 2.12.2.2 ELISA gián tiếp ......................................................................................... 21 2.12.2.3 Sandwich ELISA ....................................................................................... 21 2.12.2.4 Phản ứng ức chế /cạnh tranh ...................................................................... 22 2.12.3 Các yếu tố ảnh hƣởng đến độ nhạy của phản ứng ELISA ............................... 23 2.12.4 Các yếu tố ảnh hƣởng đến kết quả ELISA ...................................................... 23 2.13 Giới thiệu về kỹ thuật PCR .................................................................................... 23 2.13.1 Nguyên tắc của kỹ thuật PCR .......................................................................... 23 2.13.2.Tối ƣu hóa các điều kiện cho phản ứng PCR .................................................. 25 2.13.3 Ƣu, nhƣợc điểm của kỹ thuật PCR .................................................................. 30 2.13.4 Các vấn đề thƣờng gặp trong phản ứng PCR và hƣớng giải quyết ................. 31 ix 2.13.4.1 Có nhiều sản phẩm không chuyên biệt có kích thƣớc dài hơn .................. 31 2.13.4.2 Có nhiều sản phẩm không đặc hiệu với kích thƣớc ngắn hơn ................... 32 2.13.4.3 Không thu đƣợc bất kỳ sản phẩm nào........................................................ 32 2.13.4.4 Sản phẩm quá yếu ...................................................................................... 33 2.13.4.5 Hai primer có nhiệt độ Tm khác nhau ....................................................... 33 2.14 Phƣơng pháp RT-PCR ........................................................................................... 33 2.14.1 Phân loại RT – PCR ......................................................................................... 33 2.14.1.1 Phản ứng RT – PCR một bƣớc .................................................................. 33 2.14.1.2 Phản ứng RT – PCR hai bƣớc .................................................................... 34 2.14.2 Các phƣơng pháp đƣợc thực hiện trong phản ứng tổng hợp cDNA ................ 34 2.15 Những nghiên cứu trong nƣớc và trên thế giới về mức độ gây hại của TSWV .... 35 2.15.1 Những nghiên cứu tại Việt Nam ...................................................................... 35 2.15.2 Những nghiên cứu trên thế giới ....................................................................... 35 Phần III. Vật Liệu và Phƣơng Pháp Nghiên Cứu .................................................... 36 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ........................................................................... 36 3.2 Phƣơng pháp điều tra và lấy mẫu ............................................................................ 36 3.3 Phƣơng pháp lấy mẫu .............................................................................................. 36 3.4 Các phƣơng pháp chẩn đoán TSWV ....................................................................... 37 3.4.1 Chẩn đoán bằng dDAS – ELISA ....................................................................... 37 3.4.1.1 Dụng cụ và hoá chất cần thiết cho việc chẩn đoán bằng ELISA ................. 37 3.4.1.2 Các bƣớc thực hiện ...................................................................................... 37 3.4.2 Chẩn đoán TSWV bằng RT – PCR ................................................................... 39 3.4.2.1 Giai đoạn ly trích RNA theo Kit ly trích của Biorad ................................... 39 3.4.2.2 Kiểm tra sự hiện diện của RNA bằng điện di .............................................. 40 3.4.2.3 Lựa chọn cặp Primer chạy RT – PCR .......................................................... 40 3.4.2.4 Khuếch đại bằng RT – PCR ......................................................................... 41 3.4.2.5 Phƣớng pháp đổ gel agarose điện di ............................................................ 43 Phần IV. Kết quả Thảo luận ....................................................................................... 45 4.1 Mức độ nhiễm bệnh TSWV ở 3 xã đại diện cho 3 huyện qua chẩn đoán ELISA ... 45 4.1.1 Tỷ lệ nhiễm bệnh TSWV theo địa bàn điều tra ................................................. 45 4.1.2 Tỷ lệ nhiễm TSWV theo từng giống ớt ............................................................. 46 4.1.3 Tỷ lệ nhiễm virút TSWV theo triệu chứng ........................................................ 47 x 4.1.4 Tỷ lệ nhiễm bệnh TSWV theo độ tuổi ............................................................... 50 4.2 Kết quả tiến trình RT – PCR ................................................................................... 51 4.2.1 Kết quả kiểm tra RNA ....................................................................................... 51 4.2.2 Kết quả kiểm tra Primer ..................................................................................... 52 4.2.3 Kết quả tiến trình RT – PCR.............................................................................. 53 4.2.4 Kết quả tiến trình thiết kế primer cho Nested PCR ........................................... 54 Phần V. Kết luận và đề nghị ....................................................................................... 60 5.1 Kết luận.................................................................................................................... 60 5.2 Đề nghị .................................................................................................................... 60 Phần VI. TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................... 61 PHẦN VII. PHỤ LỤC ................................................................................................. 64 xi DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1: Thành phần các chất có trong ớt xanh ............................................................ 4 Bảng 2.2: Mô tả đặc tính của từng loại genome TSWV ............................................... 13 Bảng 3.1: Các địa bàn đƣợc lấy mẫu ớt ......................................................................... 36 Bảng 4.1: Tỷ lệ nhiễm bệnh TSWV tại các xã: Nhuận Đức, Phƣớc Thạnh, Lộc Hƣng .... 45 Bảng 4.2 Tỷ lệ nhiễm TSWV theo triệu chứng ............................................................. 49 DANH SÁCH CÁC ĐỒ THỊ Trang Đồ thị 4.1: Tỷ lệ nhiễm virút TSWV tại các xã: Nhuận Đức,Phƣớc Thạnh, Lộc Hƣng.45 Đồ thị 4.2: Tỷ lệ bệnh theo triệu chứng ......................................................................... 49 Đồ thị 4.3: Tỷ lệ nhiễm TSWV trên trái ớt ................................................................... 50 xii DANH SÁCH CÁC HÌNH Trang Hình 2.1: Cấu trúc virút TSWV .................................................................................... 11 Hình 2.2: Sơ đồ sao mã và dịch mã của virút TSWV ................................................... 12 Hình 2.3: Chu trình xâm nhiễm của virút TSWV ......................................................... 14 Hình 2.4: Ớt bị nhiễm TSWV ........................................................................................ 15 Hình 2.5: Các loài bọ trĩ ................................................................................................ 16 Hình 2.6: Nguyên tắc phản ứng PCR ............................................................................ 24 Hình 2.7: Tiến trình thực hiện RT – PCR một bƣớc ..................................................... 33 Hình 2.8: Tiến trình thực hiện phản ứng RT – PCR hai bƣớc ...................................... 34 Hình 3.1: Sơ đồ bố trí phản ứng ELISA ........................................................................ 39 Hình 4.1: Ớt Ba tri bị nhiễm TSWV.............................................................................. 46 Hình 4.2: Ớt hiểm Bungari bị nhiễm TSWV ................................................................. 46 Hình 4.3: Ớt có triệu chứng lá khảm vàng xanh, cong .................................................. 47 Hình 4.4: Ớt có triệu chứng lá chấm vàng xanh, nhăn nheo, co lại, dày, giòn ............. 47 Hình 4.5: Ớt có triệu chứng khảm nặng,chấm đen, lủng lỗ .......................................... 48 Hình 4.6: Ớt có triệu chứng khảm vàng nhạt trên rìa lá, lá nhỏ .................................... 48 Hình 4.7: Kết quả điện di RNA ..................................................................................... 51 Hình 4.8: Kết quả chạy đối chứng dƣơng ..................................................................... 53 DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ Trang Sơ đồ 2.1: Tiến trình thực hiện phản ứng ELISA trực tiếp ........................................... 20 Sơ đồ 2.2: Tiến trình thực hiện phản ứng ELISA gián tiếp ........................................... 21 Sơ đồ 2.3: Tiến trình thực hiện ELISA Sandwich trực tiếp .......................................... 21 Sơ đồ 2.4: Tiến trình thực hiện phản ứng ELISA Sandwich gián tiếp .......................... 22 Sơ đồ 2.5: Tổng hợp cDNA ........................................................................................... 34 1 Phần I Mở Đầu 1.1 Đặt vấn đề Cây ớt (Capsicum annum L.) là cây trồng quan trọng thứ hai (sau cây cà chua) trong các loại cây vừa nhƣ một loại rau, vừa nhƣ một loại gia vị. Ngoài ra trong quả ớt chứa nhiều vitamin nhƣ: A, B, C, D, Caroten và một số chất khoáng khác. Trồng ớt mang lại hiệu quả kinh tế cao gấp 3-4 lần so với cây lúa nên những năm gần đây, ở nƣớc ta cây ớt đƣợc trồng với diện tích và sản lƣợng ngày càng tăng, đáp ứng nhu cầu trong nƣớc và xuất khẩu. Ớt là mặt hàng xuất khẩu đứng vị trí số 1 trong các loại gia vị. (Trích dẫn luận văn tốt nghiệp Nguyễn Hữu Trúc) Ngoại thành TP.Hồ Chí Minh có điều kiện tự nhiên và xã hội thuận lợi cho việc phát triển nhiều chủng loại rau, trong đó cây ớt luôn đƣợc chú trọng và đƣợc trồng với diện tích ngày càng tăng. Tuy nhiên, việc phát triển ớt chuyên canh lại là điều kiện cho nhiều loại mầm bệnh gây hại phát triển mạnh, trong đó bệnh gây ra bởi virus mà gây hại mạnh nhất là virút gây bệnh đốm héo rũ trên cà chua (Tomato Spotted Wilt Virus- TSWV) gây khó khăn cho những vùng chuyên sản xuất ớt hiện nay, ảnh hƣởng đến kinh tế rất lớn. Chính vì lý do đó mà đề tài “Nghiên cứu hiện trạng nhiễm bệnh TSWV trên cây ớt bằng kỹ thuật ELISA và bước đầu xây dựng phương pháp chẩn đoán bằng kỹ thuật RT - PCR” đƣợc thực hiện nhằm xác định sớm mầm bệnh, từ đó có biện pháp ngăn chặn kịp thời và giảm bớt mức thiệt hại do mầm bệnh này gây ra. 1.2 Mục Đích - Yêu cầu 1.2.1 Mục đích nghiên cứu Thực tập, ứng dụng và bƣớc đầu xây dựng phƣơng pháp chẩn đoán bệnh TSWV trên đối tƣợng cây ớt ở mức độ phân tử, từ đó có thể đánh giá đƣợc hiện trạng nhiễm bệnh TSWV trên cây ớt tại các địa bàn điều tra. 1.2.2 Yêu cầu + Phải đi thực tế tại các địa bàn để điều tra, lấy mẫu ớt. + Nắm vững lý thuyết về hai phƣơng pháp dDAS-ELISA cũng nhƣ RT – PCR, rồi từ đó mới tiến hành các phƣơng pháp chẩn đoán. 2 Phần II Tổng Quan Tài Liệu 2.1 Giới thiệu về cây ớt 2.1.1 Sơ lƣợc về cây ớt Cây ớt thuộc họ cà (Solanaceae), có khoảng 30 loài nhƣng chỉ có 5 loài đƣợc trồng là: C.pendulum, C. pubescens, C. annum, C. frutescens, và C. chinensis, trong đó hai loài C. pendulum và C. pubescens đƣợc trồng hạn chế ở Trung và Nam Mỹ, loài C. chinensis đƣợc trồng ở khu vực Amazon và Châu Phi, hai loài C. annum và C. frutescens đƣợc trồng khắp nơi trên thế giới. 2.1.2 Nguồn gốc cây ớt Theo các nhà nghiên cứu phân loại thực vật học thì cây ớt có nguồn gốc từ Mehico và nguồn gốc thứ hai là ở Guatemala. Theo Vavilop, nguồn gốc thứ hai không phải ở Guatemala mà ở Evraz. Hiện nay ớt đƣợc trồng phổ biến ở các nƣớc nhiệt đới và á nhiệt đới. 2.1.3 Đặc điểm thực vật học của cây ớt 2.1.3.1 Thân Ớt là cây bụi, hai lá mầm, thân thƣờng mọc thẳng, đôi khi có thể gặp các dạng có thân bò, nhiều cành, chiều cao trung bình từ 0,5-1,5m, có thể là cây hàng năm hoặc lâu năm nhƣng thƣờng đƣợc gieo trồng nhƣ cây hàng năm. 2.1.3.2 Rễ Ớt có rễ cọc phát triển mạnh với nhiều rễ phụ. Tuy nhiên do việc cấy chuyển, rễ cọc thƣờng bị đứt và cho một hệ rễ chùm phát triển, vì vậy nhiều ngƣời lầm tƣởng ớt có hệ rễ chùm. 2.1.3.3 Lá Thƣờng ớt có lá đơn mọc xoắn trên thân chính. Lá có nhiều dạng khác nhau, nhƣng thƣờng gặp nhất là loại lá mác, mép lá ít răng cƣa. Lông trên lá tùy thuộc vào các loại khác nhau, một số có mùi thơm, lá thƣờng mỏng có kích thƣớc trung bình 1,5- 12cm×0,5-7,5cm. 3 2.1.3.4 Hoa Các hoa hoàn thiện và quả thƣờng đƣợc sinh đơn độc trên từng nách lá. Hoa có thể mọc thẳng đứng hoặc buông thòng. Trên cuống hoa thƣờng không có li tầng, hoa thƣờng có màu trắng, một số giống có màu sữa, xanh lam, màu tím. Hoa có 5-7 cánh hoa, cuống dài khoảng 1,5cm, đài ngắn có dạng chuông, nhụy có màu trắng hoặc tím, đầu nhụy có dạng hình đầu, hoa có 5-7 nhị đực với ống phấn màu xanh da trời hoặc tía. 2.1.3.5 Quả Thuộc loại quả mọng có nhiều hạt và chia làm nhiều ngăn. Các giống khác nhau có kích thƣớc quả, hình dạng, màu sắc, độ cay và độ mềm của thịt quả rất khác nhau. Quả chƣa chín có thể có màu xanh hoặc tím, quả chín có màu đỏ, da cam, vàng, màu kem hoặc hơi tím. 2.1.3.6 Hạt Hạt ớt nhỏ dẹp có dạng thận, màu vàng rơm, hạt có chiều dài khoảng 3-5mm, 1gram ớt cay khoảng 220 hạt. (Lƣơng Nguyễn Thu Tâm, 1996-2001) 2.1.4 Giá trị dƣợc liệu của cây ớt Ớt đƣợc trồng khắp nơi để làm gia vị và làm thuốc, ớt có loại ngọt và loại cay. Ở Việt Nam, phổ biến nhất là loại ớt cay. Quả ớt có vị cay, tính nóng, có tác dụng tiêu đờm, ổn trung, tán hàn, giải biểu, kiện vị, tiêu thực gây sung huyết, kích thích chung, thông kinh lạc, giảm đau, sát trùng. Rễ ớt có tác dụng làm hoạt huyết, tán thũng. Lá ớt có vị đắng, tính mát có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, lợi tiểu. Công dụng: ớt ngọt đƣợc dùng làm rau ăn, ớt cay làm gia vị và là vị thuốc. Quả ớt trị tỳ vị hƣ lạnh, tiêu chảy, hắc loạn, nôn mửa, dạ dày ruột đầy trƣớng, mất trƣơng lực, tích trệ, ăn không tiêu, đau nhức nửa đầu, đau lƣng, đau khớp, thống phong, đau dây thần kinh, viêm thanh quản, viêm họng. (Theo SK&ĐS, 2005) 4 2.1.5 Giá trị dinh dƣỡng của ớt Bảng 2.1: Thành phần các chất có trong ớt xanh (trong 100g phần ăn đƣợc) Thành phần chủ yếu của vỏ quả là chất cay, không màu, kết tinh, có tên gọi là Capsaicin (C18H27NO3), hàm lƣợng của nó phụ thuộc vào giống. Quả còn chứa một loại dầu có màu đỏ, không cay, năng suất chiết xuất 20-25% dịch chiết alkaloid. Quả ớt xanh chứa nhiều rutin là một chất đƣợc dùng rộng rãi trong chế biến thuốc- y học. (Nguyễn Hữu Trúc, 1995-2000) 2.2 Một số bệnh trên cây ớt gây ra bởi các virút khác Bệnh virus gây khảm cỏ linh lăng (Alfalfa) a. Mầm bệnh Bệnh do virus hình trụ gây ra, virus này đƣợc lan truyền bởi rệp b. Triệu chứng Trên tàn lá, bệnh thể hiện một dạng khảm đặc biệt có màu vàng trắng cho đến trắng, đôi khi mất màu ở vùng mô giữa các gân lá. Các triệu chứng này thƣờng đƣợc xem nhƣ là bệnh khảm calico. Các dạng sọc vàng và chết hoại gân cũng có thể xảy ra. Thành phần Hàm lƣợng Thành phần Hàm lƣợng Ẩm độ 85,7g P 80mg Protein 2,9g Fe 1,2mg Chất béo 0,6g Na 6,5mg Chất khoáng 1,0g K 2,7mg Cacbuahydrat 3,0g S 34mg Chất sơ 6,8g Cu 1,55mg Ca 30mg Thiamin 0,19mg Mn 24mg Vitamin A 292mg Riboflavia 0.39mg Vitamin C 111mg Acid oxalic 67mg 5 Thông thƣờng, lá không bị biến dạng. Cây nhiễm bệnh có thể hơi lùn và đôi khi trái bị biến dạng. Bệnh virus đốm gân lá ớt a. Mầm bệnh Bệnh do Potyvirus gây ra, virus này đƣợc lan truyền bởi rệp b. Triệu chứng Triệu chứng đặc trƣng nhất của bệnh là lốm đốm trên lá và gân lá có màu xanh lục đậm. Ở một số giống ớt lá bị nhỏ lại và méo mó, trên một vài giống khác có thể thấy các đốm vòng chết hoại. Sự nhiễm bệnh sớm làm cây lùn lại. Trái trên cây nhiễm bệnh nhỏ đi và đôi khi biểu hiện lốm đốm và hơi biến dạng. Bệnh virus gây khảm dƣa leo a. Mầm bệnh Bệnh do Cucumovirus gây ra, bệnh này đƣợc lan truyền bởi rệp. b. Triệu chứng Triệu chứng bệnh rất rõ ràng. Một trong số những biểu hiện phổ biến nhất là cây lùn hẳn lại, không phát triển và có tàn lá màu xanh nhạt, đục có vẻ giống nhƣ da nhƣng không có những dấu vết rõ rệt trên tàn lá. Đôi khi triệu chứng trên tàn lá rất rõ rệt và có thể bao gồm: lá thu hẹp lại, khảm, hóa vàng, có đốm vòng vàng nhạt hoặc chết hoại, biến dạng lá sồi. Trong một số trƣờng hợp, chồi ngọn bị chết hoại. Trên trái có thể xuất hiện những vòng vàng nhạt hoặc chết hoại. Bệnh virus đốm trên ớt a. Mầm bệnh Bệnh do Potyvirus gây ra, virus này đƣợc lan truyền bởi rệp. b. Triệu chứng Các giống mẫn cảm phát triển triệu chứng lốm đốm trầm trọng trên lá và thƣờng đi kèm theo triệu chứng gân xanh và biến dạng lá. Nhiều chủng virus gây biến dạng mạnh trên trái. Bệnh virus gây khảm nặng trên ớt a. Mầm bệnh Bệnh do Potyvirus gây ra, virus này đƣợc lan truyền bởi rệp 6 b. Triệu chứng Các vạch và đốm chết hoại hình thành trên thân, lá và trái sau đó lá rụng. Các lá mới mọc bị khảm rất nặng. Năng suất bị giảm nghiêm trọng. Bệnh virus đốm gân lá ớt a. Mầm bệnh Bệnh do Potyvirus gây ra, virus này đƣợc lan truyền bởi rệp b. Triệu chứng Lá biến vàng dọc theo các gân chính, sau đó phần giữa các gân cũng biến vàng, lá thƣờng bị nhỏ lại và bị biến dạng mạnh. Các lá này thƣờng rụng sớm làm cho cây bị trụi lá một phần. Cây bị bệnh cho ít trái và trái nhỏ hơn. Bệnh virus Y khoai tây a. Mầm bệnh Bệnh do Potyvirus gây ra, virus này đƣợc truyền bởi rệp. b. Triệu chứng Những triệu chứng điển hình nhất là khảm và gân xanh đậm. Cũng thƣờng thấy triệu chứng lá nhăn nheo, biến dạng và cây bị lùn. Lá cây ớt giống “Tabasco” hình thành những vạt màu vàng. Một số chủng gây chết hoại mô bào gân lá và đỉnh các nhánh gần ngọn. Trên cây bị bệnh có ít trái và trái nhỏ, đôi khi trái biểu hiện khảm và/hoặc bị biến dạng Bệnh virus gây vết hằn thuốc lá a. Mầm bệnh Bệnh do Potyvirus gây ra, virus này đƣợc lan truyền bởi rệp. b. Triệu chứng Lá thƣờng thể hiện triệu chứng khảm và những vệt xanh đậm rộng dọc theo gân lá. Lá biến dạng, trái biến dạng và cây bị lùn cũng là triệu chứng thƣờng gặp ở những cây bị nhiễm bệnh virus này. Ở hầu hết các giống, năng suất và chất lƣợng trái bị suy giảm nghiêm trọng. Trong một số thời vụ giống ớt này bị thất thu hoàn toàn. Bệnh virus gây cong ngọn củ cải a. Mầm bệnh Bệnh do Geminivirus gây ra, virus này đƣợc lan truyền bởi rầy lá. 7 b. Triệu chứng Triệu chứng điển hình gồm có sự cong mép các lá già lên trên và mép lá non hơn cong lên rất mạnh. Cuống lá cong nhiều về phía dƣới. Cây bị nhiễm bệnh vào những giai đoạn đầu bị vàng và lùn rõ rệt. Sau khi nhiễm bệnh cây cho rất ít trái, những trái có sẵn nhỏ lại, méo mó và chín ép. Cây bị nhiễm bệnh sớm trong vụ trồng thƣờng không sống đƣợc. Bệnh virus đốm lá ớt ngọt a. Mầm bệnh Bệnh do Tobamovirus gây ra và đƣợc lan truyền bằng con đƣờng cơ học b. Triệu chứng Triệu chứng trên lá gồm có: trong gân lá, khảm, lốm đốm và hoá vàng. Cây bị nhiễm bệnh trong thời kỳ đầu có thể bị lùn lại. Khó phân biệt đƣợc triệu chứng do virus này gây ra với triệu chứng do các tobamovirus. Bệnh virus gây đốm nhẹ trên cây ớt (Bệnh khảm ớt hay bệnh khảm ẩn thuốc lá Samsun) a. Mầm bệnh Bệnh do Tobamovirus gây ra và đƣợc lan truyền bằng con đƣờng cơ học b. Triệu chứng Triệu chứng khảm nhẹ phát triển khắp trên mặt lá và đôi khi lá bị nhăn nheo. Trái thƣờng bị thiệt hại nặng với các triệu chứng nhƣ vòng, vệt thẳng, đốm chết hoại và méo mó. Cây bị lùn khi bị nhiễm bệnh sớm vào thời kỳ đầu giai đoạn sinh trƣởng. Bệnh virus khảm thuốc lá - Bệnh virus khảm cà chua a. Mầm bệnh Các loại Tobamovirus và đƣợc lan truyền bằng con đƣờng cơ học. b. Triệu chứng Triệu chứng tƣơng tự đối với cả hai loại bệnh. Các triệu chứng thay đổi tùy theo giống nhƣng đều có biểu hiện lùn, khảm, toàn cây biến vàng và đôi khi có sự chết hoại toàn bộ kèm theo rụng lá. Bệnh virus gây héo đốm lá cà chua a. Mầm bệnh Do Tospovirus gây ra và đƣợc lan truyền bởi bọ trĩ. 8 b. Triệu chứng Triệu chứng rất thay đổi. Lá có thể bị khảm, lốm đốm vàng, đốm vòng vàng và chết hoại, biến dạng. Ở một số giống, xảy ra chết hoại chồi ngọn và lá rụng, sau đó các lá mới mọc bị khảm toàn bộ và biến dạng mạnh mẽ. Các triệu chứng trên trái bao gồm đốm vàng và chết hoại, khảm, các hình vòng và méo mó. Cây nhiễm bệnh ở thời kỳ đầu bị lùn hẳn và không thể hồi phục, mặc dù một số giống có khả năng phục hồi lại sự sinh trƣởng bình thƣờng. Bệnh virus cong lá ớt a. Mầm bệnh Do Geminivirus đƣợc lan truyền bởi bọ phấn. b. Triệu chứng Triệu chứng điển hình là cây bị lùn thấp và lá bị vàng, cong lên. Cây bị nhiễm bệnh có các lóng ngắn và lá bị nhỏ hẳn, mép lá cuốn cong lên tạo thành dáng chiếc xuồng. Bìa lá biến thành màu xanh nhạt hoặc vàng sáng lan vào đến các vùng thịt lá giữa các gân. Bệnh Tigre’ a. Mầm bệnh Phức hợp Geminivirus gây ra và đƣợc truyền bởi bọ phấn. b. Triệu chứng Đặc điểm của bệnh Tigre’ là lá bị cong và hoá vàng rõ rệt mép lá và vùng thịt lá giữa các gân. Lá bệnh nhỏ hẳn, nhăn nheo, mép lá cuốn ngƣợc lên trên. Cây nhiễm bệnh trong những thời kỳ đầu bị lùn hẳn lại. Bệnh virus gây khảm vàng Serrano a. Mầm bệnh Do Geminivirus, đƣợc lan truyền bởi bọ phấn b. Triệu chứng Sự xâm nhiễm của virus gây ra khảm vàng tàn lá ớt. Bệnh geminivirus trên ớt Texas a. Mầm bệnh Geminivirus, virus này đƣợc lan truyền bởi bọ phấn 9 b. Triệu chứng Cây bệnh biểu hiện triệu chứng cong lá và biến dạng. Mép lá có xu hƣớng cuốn lên trên và xuất hiện các đốm vàng sáng, đôi khi các viền vàng lan vào trong các vùng mô giữa gân lá. (Bùi Cách Tuyến) 2.3 Yêu cầu điều kiện ngoại cảnh của cây ớt 2.3.1 Nhiệt độ Nhiệt độ ảnh hƣởng đến sinh trƣởng, số hoa, tỷ lệ đậu quả. Nhiệt độ ngày/đêm khoảng 25/18 là thích hợp nhất cho sự sinh trƣởng, phát triển của ớt nói chung, tăng năng suất, tăng số quả thƣơng phẩm. Nhiệt độ ban đêm thấp (8-15oC) thƣờng làm giảm tỷ lệ đậu quả và sinh quả không hạt, nhiệt độ ban đêm thích hợp nhất là 20oC trong giai đoạn nở hoa. Ngoài ra nhiệt độ thấp còn làm giảm kích thƣớc dạng quả. Nói chung ớt thích hợp nhiệt độ cao hơn và dao động trong khoảng 20-30oC. 2.3.2 Ánh sáng Ớt là cây không mẫn cảm lắm với ánh sáng nhƣng là cây ƣa ánh sáng ngày ngắn. Nếu chiếu sáng 9-10 giờ sẽ kích thích sinh trƣởng, tăng sản phẩm khoảng 21-24% và tăng chất lƣợng quả. Trời âm u sẽ làm hạn chế khả năng đậu quả, làm giảm năng suất của cây ớt. 2.3.3 Ẩm độ Ớt rất thích với điều kiện đất ẩm, đất ẩm nhƣng trong điều kiện không khí khô hạn sẽ kích thích quá trình chín của quả. Ớt là cây chịu hạn, nếu ẩm độ đất khoảng 10% tỷ lệ rụng quả tăng đến trên 71%, trong khi ẩm độ từ 55-58% tỷ lệ rụng quả chỉ còn 20-30%. Nếu ẩm độ thấp hơn 70% trong giai đoạn ra hoa, hình thành quả thì quả sẽ bị sần sùi, giảm giá trị thƣơng phẩm. Tốt nhất duy trì độ ẩm đồng ruộng khoảng 70- 80%. Nếu ẩm độ quá cao rễ sinh trƣởng kém, cây còi cọc. 2.3.4 Đất và dinh dƣỡng Ớt là cây trồng tƣơng đối dễ tính. Đất phù hợp nhất là đất thịt nhẹ, giàu vôi, ớt có thể sinh trƣởng, cho năng suất trên đất cát nhƣng phải bảo đảm đƣợc chế độ nƣớc và dinh dƣỡng đầy đủ. Đất chua và kiềm đều không thích hợp cho ớt sinh trƣởng và phát triển. Ớt có thể sinh trƣởng ở đất chua và màu mỡ nhƣng tỷ lệ nảy mầm và tính chín sớm bị ảnh hƣởng. Ớt là cây chịu mặn, ngƣời ta đã nghiên cứu và thấy rằng ớt có thể nảy mầm ngay cả ở nồng độ muối 4000ppm và pH=7,6. 10 2.4. Giới thiệu về Tomato spotted Wilt Virus (TSWV) 2.4.1 Sơ lƣợc nguồn gốc TSWV TSWV có phổ ký chủ rất rộng ở cả vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới trên toàn thế giới. TSWV đƣợc báo cáo đầu tiên vào năm 1915 khi nó gây thiệt hại rất lớn trên cà chua ở Úc, sau đó đƣợc mô tả chính xác là bệnh gây ra bởi virus. Bên cạnh ớt, cà chua và các loại hoa màu chính yếu mà nhạy cảm với TSWV thì còn có họ cúc, khoai tây, đậu phụng, thuốc lá, rau diếp, và một số loại hoa màu khác. Tỉ lệ nhiễm khoảng 59- 90% điều này đƣa đến hậu quả là nó ảnh hƣởng lên các loại hoa màu có giá trị thƣơng mại, và trong thời gian gần đây nó là một trong những loại virus làm ảnh hƣởng đến các loại hoa màu nhiều nhất. (Lindsey Irons and Emily Sims) 2.4.2 Cấu trúc TSWV TSWV là thành viên của giống Tospovirus, thuộc họ Bunya viridae là một nhóm lớn virus chứa vật liệu di truyền là các sợi đơn RNA. TSWV là những tiểu phần nhỏ, đƣờng kính 80-120nm. Genome của TSWV gồm một sợi RNA âm tính và hai sợi RNA ambisense. Mỗi RNA của genome thì đƣợc bao bọc bởi nhiều bản copy của Nucleocapside (N) để hình thành nên ribonucleoprotein cũng đƣợc biết nhƣ là nucleocapside. Các nucleocapside đƣợc bao bọc bên trong lớp màng đôi đƣợc tạo ra từ ký chủ và đi kèm với protein L phụ thuộc vào chuỗi RNA. Chúng để lộ các glycoprotein ra ngoài bề mặt 5-10nm mà sau khi đã gắn vào lớp màng đôi lipid dày khoảng 5nm. Tính trên thành phần tổng số thì RNA chiếm 2%; protein chiếm 58%; lipid chiếm 33% và carbohydrate chiếm 7%. Chúng chỉ xuất hiện trong tế bào chất mà không ở bất kỳ tổ chức nào. Theo một nhà khoa học thì có ba thuyết chính giải thích về hình thể tròn của virus. Thứ nhất là nồng độ của khối khuếch tán bình thƣờng là rất cao và đôi khi vỏ nucleoprotein của virus lại xoắn lại. Thứ hai là sự bao bọc các nucleoprotein trần này bằng các màng để tạo nên virus trƣởng thành. Thuyết thứ ba là sự cách ly với các phần của virus trong các buồng bên trong các lỗ trong màng hoặc trong hệ thống lƣới nội chất là một phản ứng của cây ký chủ (cô lập chúng bằng cách bao chúng lại). Tất cả các virus thuộc họ này đều có ba đoạn genome RNA, đƣợc đặt tên là L (long), M (medium), và S (short). Có thể số lƣợng thì không tƣơng đồng trong mỗi loại virion bởi vì sự giống hay khác nhau về số lƣợng của các đoạn này là không có ý nghĩa. 11 Đoạn genome L tạo ra một loại protein, đây là một polymerase. Các đoạn M tạo ra các glycoprotein đƣợc đặt tên là G1 và G2. Đoạn genome S tạo ra các nucleoprotein. Tiến trình tái bản của genome L nền tảng cho TSWV (genome L tạo ra polymerase, đây là một enzyme cần thiết cho sự tái bản để nhân lên của virus trong cơ thể ký chủ). Chính các bản sao của RNA của virus thành cRNA, cRNA sau đó sẽ tạo ra nhiều vRNA, hai tiến trình này thƣờng xuyên tạo ra lẫn nhau. vRNA sau đó thực hiện sao mã và dịch mã thành chuỗi protein. Đây là cách để tái bản genome tốt nhất. Tiến trình này khác với cả các đoạn genome S và M. Đồng thời chính các sao của vRNA cũng chuyển thành cRNA. Tuy nhiên, cRNA sau đó cũng trải qua quá trình sao mã và dịch mã một cách trực tiếp mà không cần sự có mặt của vRNA, song song với cRNA thì vRNA cũng trải qua quá trình sao mã và dịch mã. Khả năng này xảy ra thì đƣợc gọi là “ambisense”. Điều này có nghĩa là các đoạn S và M có cả các chiến lƣợc tái bản mang ý nghĩa “positive” và “negative”. Kết quả là tạo ra protein phi cấu trúc đƣợc gọi là NSs hoặc NSm và nó phụ thuộc vào genome mà ta đang quan sát. Đoạn S cũng tạo ra protein N và đoạn M tạo ra cả hai loại G1 và G2 bằng việc phân cắt protein trong quá trình dịch mã. Cho đến nay thì chức năng của protein NS vẫn chƣa đƣợc biết rõ. Bên cạnh đó một điều đáng quan tâm là giữa các đoạn S, L, M có trình tự kết thúc nhƣ nhau khi ta quan sát trình tự nucleotide của chúng. Vùng đầu tiên của các sợi đều nhƣ nhau, còn vùng cuối cùng thì có sự phân biệt. Có lẽ chính điều này mà không thể tìm thấy sự tƣơng đồng trong các virion. (Lindsey Irons and Emily Sims) Hình 2.1: Cấu trúc virút TSWV 12 Hình 2.2: Sơ đồ sao mã và dịch mã của virút TSWV (Peter Schreier, Prof. Dr. Martin Hülskamp, 2002) 13 Bảng 2.2: Mô tả đặc tính của từng loại genome TSWV (Biowave vol.6 No.23, 2004) 2.5 Hình thức tấn công và gây bệnh Con đƣờng xâm nhập và tái bản virus đƣợc thể hiện nhƣ hình vẽ, các đoạn RNA tái bản từ đầu đến cuối. Đầu tiên là tấn công của hạt virion. Thứ hai là xâm nhập vào và cởi bỏ lớp áo virus bằng sự ẩm thực bào của hạt virus và sự hợp nhất giữa màng virus và màng nhân. Thứ ba là sự sao mã sơ cấp xảy ra. Thứ tƣ là sự dịch mã của các đoạn mRNA L và S bởi các ribosome tự do, trong khi đó sự dịch mã của các đoạn mRNA M bởi các ribosome gắn trên màng và xảy ra sự glycozyl hoá đầu tiên các protein vỏ mới đƣợc tạo ra. Giai đoạn thứ năm là giai đoạn tổng hợp và phủ (encapsidation) một đầu bằng đoạn nucleotide để thích hợp nhƣ là những khuôn mẫu đối với RNA genome hoặc trong một số trƣờng hợp là những mRNA. Tiếp đến là sự tái bản genome theo sau là sự sao mã thứ cấp, tức là tổng hợp các loại mRNA và xuất hiện sự sao mã ambisense. Sau đó là sự tạo hình, bao gồm cả protein G1 và G2 từ genome M trong tiểu thể golgi. Giai đoạn cuối cùng trong tiến trình xâm nhiễm là sự hợp nhất giữa khối tế bào chất với màng tế bào và giải phóng virion trƣởng thành. 14 Hình 2.3: Chu trình xâm nhiễm của virút TSWV (Lindsey Irons and Emily Sims) 2.6 Triệu chứng chung trên các loại cây trồng bị nhiễm TSWV Triệu chứng là xuất hiện các vòng tròn đồng tâm, héo tạo đốm trên cây, thay đổi màu của thân cành, cây cằn cỗi, đốm lấm chấm nhƣ màu rám nắng. Điều này làm cho cây bị biến đổi rất mạnh mẽ cả về hình thái và sức sống. Sự gây hại này phụ thuộc vào việc trồng trọt, cách ly với virus, giai đoạn phát triển của cây khi bị tấn công và điều kiện môi trƣờng. Nếu cây trồng bị nhiễm lúc giai đoạn đang phát triển thì nó sẽ gây hại nghiêm trọng và đôi khi không cho ra quả, nếu cây trồng bị nhiễm sau khi cây đã ra quả thì sẽ làm giảm khả năng quang hợp, xuất hiện các đốm hoại tử hoặc các vòng hoại tử trên cành, thân, lá. Hiện tƣợng rụng hoa và lá cũng xuất hiện trong một số trƣờng hợp. Sự tăng màu diệp lục tố, xuất hiện các đốm hoại tử, các vòng nhẫn hoặc thể khảm có thể tăng trên quả khi cây bị nhiễm. Những triệu chứng này làm mất giá trị cảm quan khi cây trƣởng thành.( Theo Ken Pernezny và ctv, 2003). 2.7 Triệu chứng cụ thể trên cây ớt Triệu chứng bệnh TSWV trên cây ớt rất thay đổi. Lá có thể bị khảm, lốm đốm vàng, đốm vòng vàng và chết hoại, biến dạng. ở một số giống, xảy ra chết hoại toàn bộ chồi ngọn và lá rụng, sau đó các lá mới mọc bị khảm toàn bộ và biến dạng mạnh mẽ. Các triệu chứng trên trái bao gồm đốm vàng và chết hoại, khảm, các hình vòng và méo 15 mó. Cây bị nhiễm ở thời kỳ đầu bị lùn hẳn và không thể hồi phục, mặc dù một số giống có khả năng phục hồi lại sự sinh trƣởng bình thƣờng. Hình 2.4: Ớt bị nhiễm TSWV (Ray Cerkauskas, 2004) 2.8 Con đƣờng lây bệnh và dịch tễ học Về mặt huyết thanh học thì TSWV thuộc Serogroup I, TSWV có thể đƣợc vận chuyển bằng cơ học vào phòng thí nghiệm, nhƣng trên đồng ruộng thì nó đƣợc truyền từ cây này sang cây khác thông qua nhiều loại bọ trĩ khác nhau (Thysanoptera, thuộc họ Thripidae). Các loài bọ trĩ trên hoa Western (Frankliniella occidentalis), bọ trĩ trên thuốc lá (F. fusca) là các vectơ chính truyền bệnh. Ngoài ra F. schultzei, F. intonsa, F. bispinosa, Thrips tabaci và Thrips setosus cũng có thể mang virus này. Thông thƣờng thì bọ trĩ ở giai đoạn ấu trùng thƣờng mang TSWV nhƣ một nhu cầu cần thiết, còn bọ trĩ ở giai đoạn trƣởng thành thì lại mang TSWV không thƣờng xuyên lắm. TSWV sinh sản trong bọ trĩ càng tốt hơn khi bọ trĩ ở trong ký chủ thực vật của nó. Virus và các 16 vectơ của nó thì càng lan rộng nhanh hơn khi lƣu chuyển cây cảnh và rau quả đi từ vùng này sang vùng khác, các cánh đồng thuốc lá, đậu phụng và cỏ dại là những nguồn thƣờng xuyên và phổ biến nhất cho các loại virus và vectơ truyền bệnh này. Hình 2.5: Các loài bọ trĩ (Lindsey Irons and Emily Sims) 2.9 Điều kiện cho bệnh phát triển Các loài bọ trĩ đƣợc xem là trung gian truyền virút TSWV chính trên cây ớt. Chúng thì nhỏ, sinh sản nhanh chóng, sống ký sinh trên một phổ rộng các loại thực vật và vào các cánh đồng một cách thƣờng xuyên. Các loài bọ trĩ chỉ ăn phần thịt của lá, thân, quả và các bộ phận của hoa. Khi chúng ăn các phần trên sẽ làm phá hủy về hình dạng. Bọ trĩ chƣa trƣởng thành, chƣa có cánh thì đòi hỏi phải có virus ký sinh và chúng di chuyển nhiều hơn các con trƣởng thành và từ đó truyền mầm bệnh giữa các cây với nhau, từ đó dẫn đến mức độ lây lan rất nhanh. Vòng đời của bọ trĩ thƣờng từ 7-10 ngày ở nhiệt độ dao động từ 20 – 37oC. Thông thƣờng có khoảng ba thế hệ trong suốt mùa phát triển. TSWV cứ nhiễm dai dẳng từ năm này sang năm khác trong các cây bị nhiễm từ những loài bọ trĩ ký sinh trong các mùa vụ kế cận nhau. (Ray Cerkauskas, 2004) 2.10 Khống chế bệnh TSWV TSWV ngày càng mở rộng mạnh mẽ phổ ký chủ và vectơ truyền bệnh, điều này làm cho việc khống chế chúng trở rất nên khó khăn. Thêm vào đó là sự khan hiếm các gen kháng ở cây ký chủ, đồng thời cỏ dại và cây cảnh là những kho dự trữ để lƣu lại virus và truyền bệnh cho vụ mùa sau. Do đó khi bệnh xuất hiện trong một mùa vụ, các cây trồng nên đƣợc loại và tiêu huỷ nhanh chóng cả những cây đang mang mầm bệnh tiềm ẩn và những cây có triệu chứng bệnh biểu hiện ở mức độ nghiêm trọng. Các bột 17 sáp bên ngoài những cây có triệu chứng bệnh thì không phải luôn luôn gây ảnh hƣởng, mà nó là các đối chứng cho việc nhiễm sau này vì TSWV thƣờng mở rộng mức độ lây lan trƣớc khi phát triển triệu chứng bệnh. Sau đây là một số biện pháp phòng bệnh TSWV:  Loại bỏ các loài cỏ dại và những cây mọc tự nhiên, duy trì các khoảng đệm cách ly không chứa cây cối khoảng 10 mét.  Giảm mật độ trồng để tránh sự di chuyển của các loài bọ trĩ từ những nguồn bị nhiễm bệnh.  Bỏ hoang các cánh đồng bị nhiễm sau khoảng 3-4 tuần, nhằm cho phép các loại bọ trĩ có thể nổi lên lại từ những phần của hoa màu và từ đó có thể loại bỏ chúng khỏi cánh đồng hoa màu. Nếu tiết kiệm, đất có thể đƣợc xông với methamsodium (Vapam) hoặc 1,3-dichloropropene (Telone) để loại trừ bọ trĩ đang tồn tại trong các phần của hoa màu trong đất.  Nên lựa chọn trồng những cây không dễ dàng mắc bệnh, vì tỉ lệ quần thể TSWV và bọ trĩ ở khắp mọi nơi là rất cao.  Loại bỏ tất cả những nguồn bọ trĩ vào cuối mỗi mùa vụ để tránh chứa chấp một quần thể nhỏ sẵn sàng tấn công vào vụ sau.  Sử dụng những cây trồng sạch bệnh virus.  Dùng các màn lƣới để ngăn chặng hoặc làm trì hoãn sự tấn công của bọ trĩ vào nhà kính.  Khi sử dụng thuốc trừ sâu thì nên dùng vào ngày thứ năm trong giai đoạn ngƣng nghỉ để giảm bớt tỉ lệ nhiễm một cách có ý nghĩa.  Việc sử dụng nhiều loại thuốc là cần thiết để tiêu diệt đƣợc càng nhiều loại bọ trĩ càng tốt.  Khi phun thuốc cũng nên lựa chọn những thiết bị tạo ra những tiểu phần thuốc nhỏ và hiệu quả nhất khi toàn bộ cánh đồng đều đƣợc phun.  Thay đổi liên tục các loại thuốc trừ sâu để trì hoãn sự kháng thuốc. Hứa hẹn trong tƣơng lai là sẽ phân lập các gen kháng để chuyển vào cây ớt cho phép tạo ra tính kháng với TSWV. (Ray Cerkauskas, 2004), (Ken Pernezny và ctv, 2003) 18 2.11 Chẩn đoán bệnh TSWV 2.11.1 Phƣơng pháp cây chỉ thị Cây chỉ thị thực chất cũng là cây ký chủ (có thể là cây trồng hay cây dại) nhƣng có triệu chứng bệnh rất điển hình và biểu hiện nhanh chóng. Chẩn đoán bằng cây chỉ thị là phƣơng pháp khá chính xác trong nghiên cứu virus thực vật. Cây chỉ thị đƣợc chia làm hai nhóm: các cây nhiễm bệnh cục bộ và các cây nhiễm bệnh hệ thống. Cây nhiễm bệnh cục bộ thƣờng tạo ra các vết chết trên lá, thân,…còn cây nhiễm hệ thống thƣờng tạo ra triệu chứng toàn thân nhƣ: khảm lá, biến vàng, lùn cây, và một số triệu chứng khác. Để thu đƣợc cây chỉ thị thì chúng ta phải thực hiện các yêu cầu sau:  Các điều kiện chuẩn bị để làm thí nghiệm lây bệnh trên cây chỉ thị: đất thí nghiệm, phân bón.  Phƣơng pháp trồng trọt cây chỉ thị  Phƣơng pháp tiến hành lây bệnh nhân tạo (Vũ Triệu Mân, 2003) 2.11.1.1 Cây nhiễm bộ phận Nhƣ cây cúc bách nhật (Gomphrena globosa) virus X gây vết chết hình nhẫn vòng viền đỏ. Cây rau muối (Chenopodium quinoa) virus S gây các đốm vàng trên lá. 2.11.1.2 Cây nhiễm hệ thống Cây thuốc lá: Nicotiana tabacum var xanthi virus Y gây khảm lá và gân sáng. Cây tầm bóp Mỹ: Physalis floridana gây hiện tƣợng vàng lùn cây sau khi truyền bằng rệp. Các cây chỉ thị đƣợc sử dụng trƣớc tiên với mục đích để chẩn đoán bệnh hại: ngƣời ta thƣờng dùng những cây có triệu chứng nhiễm bộ phận để thực hiện thí nghiệm này. Các cây nhiễm hệ thống thƣờng đƣợc dùng để giữ nguồn virus phục vụ các thí nghiệm trong phòng. Cây chỉ thị là cách chẩn đoán quan trọng trong các phòng thí nghiệm virus thực vật vì chúng là cơ sở ban đầu để chẩn đoán. Nhƣợc điểm cơ bản của phƣơng pháp này cần có thời gian lây bệnh và phải chờ cây phát bệnh sau một thời kỳ ủ bệnh. 19 Yêu cầu chung đối với mẫu Toàn bộ hoặc một phần của lá đều có thể đƣợc dùng làm mẫu phân tích. Nguyên liệu đòi hỏi phải còn tƣơi, lá lớn và còn non, không sử dụng lá già. Chọn những lá có biểu hiện bệnh để thực hiện thí nghiệm chẩn đoán bệnh TSWV. Trƣờng hợp cây có sự phân bố không đều mầm bệnh thì phải thu thập những phần mà có biểu hiện bệnh mạnh nhất. (Theo Lê Lƣơng Tề - Vũ Triệu Mân, 1999). 2.11.2 Phƣơng pháp chẩn đoán bằng kính hiển vi điện tử  Virus thực vật có những đặc điểm sinh vật sống, chúng tự nhân lên trong cây trồng và di truyền tính gây bệnh, chúng tự phân chia thành các phân tử nhỏ nhƣng cũng có thể tạo thành những tinh thể giống nhau chứa đựng những phân tử protein  Chúng ta không thể thấy virus dƣới kính hiển vi quang học, nhƣng chúng ta có thể quan sát đƣợc chúng trên kính hiển vi điện tử với độ phóng đại 500.000 lần.  Phƣơng pháp đơn giản là sử dụng dung dịch chứa virus chiết từ lá cây bệnh hay thông qua làm tinh khiết cố định bằng hoá chất trên lƣới đồng để quan sát trên kính hiển vi điện tử. Đây là phƣơng pháp trực tiếp và đơn giản nhất.  Có thể sử dụng kháng huyết thanh khi dùng phƣơng pháp xem trực tiếp để phân biệt trong trƣờng hợp nghi là mẫu bị lẫn virus khác. Phƣơng pháp này giúp ta xác định đƣợc hai virus khác nhau trong cùng một mẫu.  Ngƣời ta còn dùng lát cắt cực mỏng bằng Ultramicrotom và nhuộm mẫu đƣợc cắt, quan sát sự hiện diện của virus trong các tế bào thực vật bị nhiễm bệnh. (Phạm Đức Toàn, 1996 – 2001) (Nguyễn Văn Tuất, 2002) 2.12 ELISA 2.12.1 Khái niệm về ELISA  Nguyên tắc: dựa vào phản ứng ngƣng kết giữa kháng nguyên và kháng thể. Cụ thể ở virút TSWV thì kháng nguyên là cấu trúc vỏ protein Nucleocapsid (N); glycoprotein (GP) G1. 20 (Trích từ Chemicon International) 2.12.2 Phân loại ELISA 2.12.2.1 Direct ELISA (ELISA trực tiếp) Sơ đồ 2.1: Tiến trình thực hiện phản ứng ELISA trực tiếp Cho kháng nguyên vào đĩa ELISA Đem ủ các đĩa chứa kháng nguyên Rửa Thêm kháng thể có gắn enzyme Rửa Ủ ở 37oC Thêm cơ chất Ủ ở 37oC Đọc kết quả 21 2.12.2.2 ELISA gián tiếp Sơ đồ 2.2: Tiến trình thực hiện phản ứng ELISA gián tiếp 2.12.2.3 Sandwich ELISA Sandwich ELISA có thể đƣợc chia làm hai hệ thống:  Sandwich ELISA trực tiếp Sơ đồ 2.3: Tiến trình thực hiện ELISA Sandwich trực tiếp Cho kháng nguyên vào đĩa Đem ủ, rửa Thêm kháng thể Ủ, rửa Bổ sung kháng kháng thể có gắn enzyme Ủ, rửa Thêm cơ chất tạo màu Ủ, đọc kết quả Cho kháng thể vào mỗi đĩa ELISA Ủ, rửa Thêm kháng nguyên vào Ủ, rửa Bổ sung kháng thể có gắn enzyme Ủ, rửa Thêm cơ chất tạo màu Ủ, đọc kết quả 22  Sandwich ELISA gián tiếp Sơ đồ 2.4: Tiến trình thực hiện phản ứng ELISA Sandwich gián tiếp 2.12.2.4 Phản ứng ức chế /cạnh tranh C-ELISA (competition ELISA) (John R. Crowther, 2001). Cho kháng thể thứ I vào giếng ELISA Ủ, rửa Thêm kháng nguyên Ủ, rửa Thêm kháng thể thứ II Ủ, rửa Bổ sung kháng kháng thể thứ II có gắn enzyme vào Ủ, rửa Thêm cơ chất tạo màu Ủ, đọc kết quả Trƣờng hợp I Trƣờng hợp II Cho kháng nguyên vào Cho kháng nguyên vào Ủ, rửa Ủ, rửa Bổ sung kháng nguyên Không bổ sung kháng nguyên Thêm kháng thể có gắn enzyme Thêm kháng thể có gắn enzyme Ủ, rửa Ủ, rửa Bổ sung cơ chất tạo màu Bổ sung cơ chất tạo màu Ủ Ủ Đọc kết quả (không màu): 100% Đọc kết quả (màu): 0%  Tuỳ theo độ đậm nhạt của màu mà ta có phần trăm mức độ cạnh tranh từ đó kết luận mức độ nhiễm bệnh. cạnh tranh cạnh tranh 23 2.12.3 Các yếu tố ảnh hƣởng đến độ nhạy của phản ứng ELISA  Số lƣợng kháng thể thứ nhất đƣợc gắn vào đáy giếng  Ái lực của kháng thể thứ nhất đối với kháng nguyên  Ái lực của kháng thể thứ hai đối với kháng nguyên  Hoạt tính chuyên biệt của kháng thể thứ hai (Chemicon International) 2.12.4 Các yếu tố ảnh hƣởng đến kết quả ELISA  Nếu các đối chứng âm cho kết quả dƣơng tính thì có thể do sự nhiễm từ chất tạo màu hoặc từ kháng thể đƣợc đánh dấu hoặc chính các đối chứng bị nhiễm.  Nếu màu không xuất hiện đối với đối chứng dƣơng hoặc đối với mẫu thì phải kiểm tra lại tất cả hoá chất bao gồm: hạn sử dụng, nồng độ, điều kiện bảo quản  Nếu màu xuất hiện quá thấp đối với đối chứng dƣơng và cả mẫu kiểm tra thì phải kiểm tra lại kháng thể đƣợc gắn enzyme và nồng độ của chất tạo màu  Nếu có tạo màu đối với mẫu nhƣng không tạo màu với đối chứng dƣơng thì có thể kiểm tra lại nguồn gốc đối chứng, hạn sử dụng và điều kiện bảo quản.  Khi chạy lại một thử nghiệm trong điều kiện đang gặp sự cố thì chỉ nên thay đổi một yếu tố thí nghiệm. (Trích từ Chemicon International). 2.13 Giới thiệu về kỹ thuật PCR 2.13.1 Nguyên tắc của kỹ thuật PCR PCR đƣợc thực hiện trên cơ sở sinh tổng hợp DNA theo nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 trình tự nhƣ sau :  Bƣớc 1: Biến tính sợi đôi thành sợi đơn (denature) Giai đoạn này đƣợc thực hiện ở nhiệt độ cao (94-95o C) trong vòng 30 giây đến 1 phút, làm cho phân tử DNA mạch kép tách thành 2 mạch đơn. Chính 2 mạch đơn này đóng vai trò là mạch khuôn cho sự tổng hợp 2 mạch bổ sung mới.  Bƣớc 2: Phản ứng của primer gắn vào đầu dây chuỗi mã đối xứng với chuỗi mã trên dây template (gọi là tiến trình bắt cặp) để có phân tử DNA mới. Ở giai đoạn này nhiệt độ đƣợc hạ thấp cho phép các primer bắt cặp với DNA khuôn mẫu, nhiệt độ này dao động trong khoảng 30-70o C, kéo dài trong khoảng 30 giây đến 1 phút, tùy thuộc vào nhiệt độ nóng chảy Tm (melting temperature) của các primer sử dụng. Giai đoạn này gọi là giai đoạn bắt cặp.  Bƣớc 3: Kéo dài dây mới nhờ primer (extension) 24 Nhiệt độ đƣợc tăng lên 72oC giúp cho DNA polymerase hoạt động tốt nhất. Thời gian của giai đoạn này tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA khuếch đại, thƣờng kéo dài từ 30 giây đến vài phút. Kết quả cuối cùng là một đoạn mã hóa di truyền đặc biệt nào đó đƣợc khuếch đại lên rất nhiều lần. Sự khuếch đại này có thể đƣợc tính nhƣ sau: Tổng lƣợng DNA khuếch đại = m x 2n m : là số bản sao của chuỗi mã hóa. n : là số chu kỳ. Hình 2.6: Nguyên tắc phản ứng PCR Ba tiến trình này xảy ra theo chu kỳ rất nhanh để khuếch đại DNA. Trong chu kỳ thứ nhất và thứ hai của phản ứng khuếch đại, chỉ có sản phẩm chuỗi dài đƣợc hình thành, còn trong những chu kỳ tiếp theo khuếch đại cả những sản phẩm chuỗi dài và chuỗi ngắn. Sản phẩm chuỗi dài đƣợc tích tụ theo hƣớng tuyến tính, còn sản phẩm chuỗi ngắn tích tụ theo logarit.Ngƣời ta hy vọng có khoảng 105 lƣợng sản phẩm chuỗi ngắn sau khoảng 25-30 chu kỳ. Theo nguyên tắc PCR đƣợc áp dụng để khuếch đại các đoạn DNA có chiều dài 200-2000bp. Những phản ứng trên đƣợc thực hiện nhờ polymerase nhƣ Taq polymerase, và sự thay đổi chu kỳ nhiệt một cách hợp lý, đặc biệt là nhiệt độ cho sự biến tính và nhiệt độ cho bắt cặp. Một polymerase của DNA và bốn loại nucleotide (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) đƣợc dùng để khuếch đại một đoạn nào đó của DNA. Primer bên trái tác động trên dây DNA 3’-5’ còn đƣợc gọi là forward primer, kí hiệu là F. Primer bên phải tác động trên dây 5’-3’ còn đƣợc gọi là reverse primer, kí hiệu là R. Sự sắp xếp nhƣ vậy đảm bảo vùng bị can thiệp đƣợc tăng cƣờng hoạt động, theo 3 trình tự đã nói ở trên. Tóm lại khi các primer kết hợp với sợi DNA bổ sung của 25 nó trong điều kiện một khoảng cách đã đƣợc kích hoạt, các đoạn DNA này có thể sẽ đƣợc khuếch đại lên theo phản ứng dây chuyền với polymerase. 2.13.2.Tối ƣu hóa các điều kiện cho phản ứng PCR  DNA mẫu PCR là một công cụ rất mạnh để khuếch đại DNA, vì thế trong phản ứng PCR chỉ cần một lƣợng rất nhỏ là đủ. Nhƣng để giảm bớt lỗi gây ra bởi Taq DNA polymerase thì một nồng độ cao hơn có thể đƣợc sử dụng, tuy nhiên nếu nồng độ DNA khuôn mẫu quá cao thì sẽ làm gia tăng mức độ nhiễm đồng thời có thể làm giảm hiệu quả phản ứng. Phản ứng khuếch đại tối ƣu xảy ra trên DNA thật tinh sạch. Tuy nhiên, những kỹ thuật chẩn đoán bằng PCR vẫn cho kết quả tốt với DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào. Thông thƣờng, nhiễm protein trong mẫu DNA trong quá trình ly trích DNA sẽ không ảnh hƣởng xấu đến sự nhân DNA. Tuy nhiên nhiễm DNA lạ sẽ dẫn đến kết quả PCR bị sai lệch. Đối với những DNA có kích thƣớc quá lớn (>50kb), sự biến tính có thể không hữu hiệu và năng suất PCR thấp. Trong trƣờng hợp này, cần phải cắt DNA trƣớc bằng enzyme cắt hạn chế mà enzyme đó không cắt trong chuỗi đích; hoặc có thể tách DNA bằng cách dùng nhiệt độ tới 100oC trong 2-5 phút.  Enzyme DNA polymerase Ngƣời ta thƣờng sử dụng Taq polymerase, đây là enzyme chịu nhiệt ly trích từ vi khuẩn suối nƣớc nóng Thermus aquaticus (Bùi Trang Việt, 2002). Với enzyme này, PCR cho hiệu quả cao nhất, Taq có thể xúc tác kéo dài khoảng 35-100 nucleotide trong 4 giây ở nhiệt độ 70-80oC. Đây là giới hạn nhiệt độ thích hợp nhất cho enzyme này hoạt động (Newton và Graham, 1997). Nồng độ Taq polymerase đƣợc sử dụng thông thƣờng là 0.5-5 đơn vị/100μl dung dịch phản ứng. Nếu nồng độ Taq quá cao, những sản phẩm không chuyên tính có thể nhảy vào làm sai lệch kết quả. Nếu nồng độ Taq quá thấp, chúng ta sẽ không có đủ số lƣợng men để xúc tác tạo ra sản phẩm PCR theo ý muốn. Trong phản ứng PCR thì Taq polymerase có khuynh hƣớng thêm một nucleotide loại “A” vào đầu tận cùng 3’ của sản phẩm PCR, điều này rất quan trong trong việc tạo dòng (TA- cloning) và nó sẽ bị loại thải đi nếu sự gắn kết xảy ra ở đầu 26 tận cùng là đầu bằng (blunt end ligation). Ngoài ra có thể làm gia tăng hoạt tính của Taq polymerase bằng cách sử dụng kết hợp với một số enzyme khác: Tli hoặc Pfu. Use Tli, Pfu và một số enzyme polymerase khác.  Lựa chọn Enzyme polymerase cho phản ứng PCR DNA Polymerase Tự nhiên hoặc tái tổ hợp Nguồn gốc Taq Tự nhiên Thermus aquaticus Amplitaq® Tái tổ hợp T. aquaticus Amplitaq (Stoffel fragment)® Tái tổ hợp T. aquaticus Hot Tub™ Tự nhiên Thermus flavis Pyrostase™ Tự nhiên T. flavis Vent™ Tái tổ hợp Thermococcus litoralis Deep Vent™ Tái tổ hợp Pyrococcus GB-D Tth Tái tổ hợp Thermus thermophilus Pfu Tự nhiên Pyrococcus furiosus ULTma™ Tái tổ hợp Thermotoga maritima  Đặc tính của từng loại DNA polymerase đƣợc sử dụng trong PCR (Michael Blaber, 1998) Taq/Amplitaq® Stoffel fragment Vent™ Deep Vent™ Pfu Tth ULTma™ 95 °C half-life 40 phút 80 phút 400 phút 1380 phút >120 phút 20 phút >50 phút 5'3' exo + + 3'5' exo + + + + Tỉ lệ kéo dài (nucleotide/giây) 75 >50 >80 ? 60 >33 ? Hoạt tính Reverse transcription Yếu Yếu ? ? ? Tốt ? Tạo ra đầu tận cùng 3' A 3' A >95% đầu bằng >95% đầu bằng đầu bằng 3' A đầu bằng Sự đổi chỗ sợi + + Trọng lƣợng phân tử (kDa) 94 61 ? ? 92 94 70 27  Primer Một số chỉ tiêu cơ bản trong thiết kế- lựa chọn Primer:  Thông thƣờng các primer có chiều dài 20- 30 mer  Không nên thiết kế các primer có polybase (chuỗi base cùng loại) hay những trình tự lặp lại  Kiểm tra lại primer để tránh hiện tƣợng primer- dimer  Thêm một cặp GC vào đầu tận cùng 5’ nếu thấy có vị trí cắt giới hạn ở đó  Các trình tự bổ sung với các primer khác sử dụng trong PCR nên đƣợc tránh để ngăn chặn sự lai giữa các primer với nhau  Khoảng cách giữa các primer nên thấp hơn 10 kb  Thêm một hoặc hai G / C vào đầu tận cùng 3’ thì tốt nhƣng tránh thêm quá nhiều vì điều này có thể cho kết quả là sẽ tạo ra các sản phẩm PCR không đặc hiệu  Tm của mồi xuôi và mồi ngƣợc không cách biệt nhau quá xa. Thành phần nucleotide của các primer cân bằng, tránh các cặp G, C lặp lại nhiều lần.  Các primer đƣợc chọn phải đặc trƣng cho trình tự DNA cần khuếch đại, không trùng với các trình tự lặp lại trên genome.  Trình tự DNA nằm giữa hai mồi “xuôi” và “ngƣợc” không quá lớn. Phản ứng sẽ tối ƣu trên những trình tự DNA nhỏ hơn 1 kb. Tính toán nhiệt độ nóng chảy (Tm) của primer:  Cách 1: Cách này chỉ sử dụng khi chiều dài primer không quá 20 nucleotide Tm = [(A+T) x 2 °C] + [(G+C) x 4 °C]  Cách 2: Hiệu quả đối với primer có chiều dài từ 14 – 70 nucleotide Tms = 81.5 + 16.6(log10[J + ]) + 0.41(%G+C) - (600/l) + [J +] : nồng độ mol các cation hoá trị I + (%G+C) : % nucleotide loại G và C  Cách 3: Hiệu quả nhất đối với các primer có chiều dài từ 20 – 35 base Tmp = 22 + 1.46([2 x (G+C)] + (A+T)) 28  Nhiệt độ bắt cặp Kỹ thuật PCR rất mẫn cảm với nhiệt độ. Vì thế bất cứ sự thay đổi nhiệt độ nào của phản ứng cũng có thể ảnh hƣớng mạnh đến năng suất và độ chuyên biệt. Suggs và ctv.(1981) đã đề nghị một công thức để ƣớc đoán nhiệt độ Tm, mà ở nhiệt độ ấy, một nửa các primer sẽ lai với DNA mục tiêu. Công thức đƣợc sử dụng trong điều kiện primer có khoảng 20 oligonucleotide: Tm = 4 (G + C) + 2 (A + T) A, T, C, G là số lƣợng các base có trong oligonucleotide. Tuy nhiên, việc tính toán này chỉ có tính chất tạm thời, chúng ta phải điều chỉnh lại nhiệt độ này để có sự khuếch đại cao nhất và thu nhận tần suất đa hình cao nhất. Bằng kinh nghiệm và thực hiện xét nghiệm nhiều lần, chúng ta mới có thể có số liệu đúng về nhiệt độ lai. Số base càng ít nhiệt độ này càng thấp và ngƣợc lại. Nếu nhiệt độ bắt cặp quá thấp dẫn đến sản phẩm đƣợc nhân lên quá mức do sự bắt cặp các primer không chuyên biệt có thể xảy ra. Nếu nhiệt độ lai quá cao, năng suất của sản phẩm mong muốn sẽ giảm. Nếu primer bắt cặp một cách chính xác với đoạn DNA mẫu, nhiệt độ bắt cặp nên thấp hơn nhiệt độ lý thuyết Tm khoảng 5 oC. Thông thƣờng, với một oligonucleotide có 20 nucleotide có thể dùng nhiệt độ lai 50-55oC. Nếu chuỗi dài hơn (25 nucleotide hay nhiều hơn) hoặc có thể nhiều base G, C, nhiệt độ lai có thể đến 55- 65 oC. Trong vài phản ứng, oligonucleotide lớn (từ 30 bp trở lên), giai đoạn bắt cặp và kéo dài có thể đƣợc kết hợp và thực hiện ở 68-72oC. Khi dùng dƣ oligonucleotide với khả năng bắt cặp sai, nhiệt độ bắt cặp có thể giảm còn 37-45oC (Hồ Bích Liên,2003).  Tỉ lệ primer/DNA khuôn mẫu Một trong những yếu tố quan trọng nhất của PCR là tỉ lệ tối ƣu giữa primer và DNA mẫu. Nếu tỉ lệ này quá cao, hiện tƣợng primer-dimer sẽ xuất hiện, giống nhƣ trƣờng hợp DNA mẫu quá loãng. Nếu tỉ lệ này quá nhỏ, kết quả sản phẩm PCR sẽ không nhiều. Hầu hết các trƣờng hợp áp dụng PCR, đều dùng một nồng độ primer không quá 0.5μM (12.5 pmol/25 μl phản ứng), không tính đến nồng độ DNA mẫu, để tránh hiện tƣợng primer-dimer. 29  Các thành phần khác  Dung dịch đệm Một nồng độ cao của dung dịch đệm PCR đƣợc sử dụng để tăng cƣờng hiệu quả cho phản ứng PCR. Sau đây là dung dịch đệm PCR đƣợc xem là tốt hơn đối với các đệm đang có mặt trên thị trƣờng  16,6 mM ammoniumsulfate  67,7 mM TRIS-HCl, pH 8,89  10 mM beta-mercaptoethanol  170 microgams/ml BSA  1,5-3mMMgCl2  Nồng độ dNTP (các deoxynucleotide triphotphat) Nồng độ dNTP có thể sử dụng lên đến 1,5mM, dNTP gắn với Mg++, vì thế nồng độ Mg++ cũng phải đƣợc thay đổi cho phù hợp. Tuy nhiên dNTP quá dƣ thừa sẽ làm tăng tỉ lệ lỗi và có thể ức chế enzyme polymerase. Nồng độ dNTP thấp (10 - 50µM) có thể giảm bớt tỉ lệ lỗi, các sản phẩm PCR có kích thƣớc lớn thì cần nhiều dNTP. Nồng độ dNTP thƣờng đƣợc sử dụng là 20-200 μM. Nồng độ cao hơn dễ dẫn đến sự khuếch đại “ký sinh". Nồng độ dNTP thích hợp nhất cho một phản ứng PCR còn phụ thuộc vào nồng độ Mg2+, nồng độ primer, số lƣợng chu kỳ của phản ứng và chiều dài của sản phẩm đƣợc khuếch đại. Vì thế, nồng độ dNTP tối ƣu cho từng phản ứng phải đƣợc xác định qua thực nghiệm.  Nồng độ MgCl2 Nồng độ MgCl2 cũng là một nhân tố ảnh hƣởng mạnh đến phản ứng PCR. Mg 2+ rất cần cho quá trình liên kết các dNTP, xúc tác cho enzyme Taq polymerase, làm tăng Tm của DNA mạch kép. Nồng độ Mg2+ thấp sẽ làm hạn chế quá trình kéo dài. Ngƣợc lại nồng độ Mg2+ cao sẽ giúp ổn định dây đôi DNA và ngăn ngừa sự biến tính hoàn toàn (do sự mở dây đôi DNA) của sản phẩm trong mỗi chu kỳ,làm cho sản phẩm PCR ít đi; đồng thời, có thể làm cho hiện tƣợng bắt cặp giả xảy ra ổn định hơn và cho ra những sản phẩm mong muốn với số lƣợng quá lớn nhƣng mức độ chuyên biệt thấp. 30  Chất ổn định hoạt động enzyme Những hoạt chất ổn định hoạt động enzyme cũng đƣợc chú ý. Nhiều nhà sản xuất hóa chất đã xem xét gelatin hoặc Triston X-100 trong những buffer để tồn trữ enzyme. Có trƣờng hợp ngƣời ta sử dụng cả hai làm dung dịch đệm. Nhằm bảo quản và ổn định enzyme trong quá trình xử lý nhiệt của PCR, mỗi dung dịch đệm trong phản ứng đều có chứa gelatin ở nồng độ 0,01% và Triston X-100 ở nồng độ 0,1%.  Số lƣợng chu kỳ của phản ứng PCR Trong thực tế số chu kỳ cho một phản ứng PCR không nên vƣợt quá 40. Sở dĩ nhƣ vậy vì phản ứng PCR diễn tiến qua hai giai đoạn : Giai đoạn đầu: Số lƣợng bản sao tăng lên theo cấp số nhân, tỉ lệ với lƣợng mẫu ban đầu. Giai đoạn sau: Hiệu quả khuếch đại giảm hẳn do sự phân hủy và cạn kiệt các thành phần của phản ứng, sự xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng, hoặc các bản sao vừa đƣợc tổng hợp không kết hợp với mồi mà bắt cặp với nhau. Số chu kỳ cho một phản ứng PCR tùy thuộc số lƣợng mẫu DNA ban đầu. Nếu số lƣợng mẫu ban đầu là 105 thì cần 25-30 chu kỳ . Nếu số lƣợng mẫu ban đầu là 102- 10 3 thì số chu kỳ phải là 35-40 chu kỳ.  Thiết bị và dụng cụ trong phản ứng PCR Thực chất, một thiết bị dùng để tiến hành phản ứng PCR chỉ cần đáp ứng yêu cầu thay đổi nhiệt độ thật nhanh và chính xác. Các thiết bị hiện nay đã đƣợc cải tiến để tránh tối đa sự bốc hơi nƣớc trong trong quá trình phản ứng, hay cho phép tiến hành PCR ngay trên mô và tế bào. Tuy nhiên, mỗi thiết bị đều có đặc điểm khuếch đại riêng nên mọi thí nghiệm của một nghiên cứu cần đƣợc tiến hành trên cùng một loại thiết bị. Hơn nữa, ống nghiệm (eppendorf) dùng cho các phản ứng của cùng một nghiên cứu phải cùng kiểu vì tính đặc tính truyền nhiệt của các ống này cũng nhƣ nhiệt độ tiếp xúc giữa các ống và bộ phận tạo nhiệt của thiết bị khuếch đại có ảnh hƣớng lớn đến kết quả PCR. 2.13.3 Ƣu, nhƣợc điểm của kỹ thuật PCR Kỹ thuật PCR đƣợc sử dụng trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu quan trọng do các ƣu điểm sau: - Độ nhạy rất cao - Thao tác đơn giản. - Thời gian thực hiện nhanh. 31 - Độ tinh sạch của mẫu không cần cao. Tuy nhiên, phƣơng pháp này có nhiều mặt hạn chế và đòi hỏi sự thận trọng đặc biệt khi tiến hành thí nghiệm cũng nhƣ khi phân tích kết quả. Có thể có ba vấn đề lớn khi sử dụng kỹ thuật PCR:  Trong thực nghiệm, kích thƣớc của trình tự cần khuếch đại là giới hạn đầu tiên. Trừ vài trƣờng hợp rất cá biệt, phƣơng pháp PCR không hoạt động đƣợc với những đoạn DNA lớn hơn 3 kb. Việc sử dụng PCR với các độ dài dƣới 1,5 kb cho kết quả tốt. Với những độ dài lớn hơn, điều kiện tối ƣu cho phản ứng phải đƣợc xác định qua thực nghiệm.  Sự ngoại nhiễm là vấn đề lớn nhất đặt ra đối với PCR, gắn liền với khả năng khuếch đại bản sao của phƣơng pháp này. Nguồn ngoại nhiễm lớn nhất chính là các sản phẩm khuếch đại của những lần thao tác trƣớc. Khi mở nắp các ống nghiệm sau mỗi lần khuếch đại, các phân tử khuếch đại sẽ thoát ra khỏi ống nghiệm và lơ lửng trong không gian phòng thí nghiệm rồi nhiễm vào các phản ứng tiến hành sau đó. Có thể khắc phục vấn đề này bằng một số biện pháp sau: - Các công đoạn thao tác khác nhau phải tiến hành ở những địa điểm cách xa nhau. - Dùng tia tử ngoại để loại bỏ các phân tử còn lại từ các lần khuếch đại trƣớc. - Tất cả mọi thành phần phản ứng đều chia thành những lƣợng nhỏ đủ với 1,2 lần thao tác.  Các sai sót gây ra do Taq polymerase Sự sao chép bởi Taq polymerase cho tỉ lệ sai sót khá cao (10-4, nghĩa là cứ 10000 nucleotid thì enzyme gắn sai một nucleotid). Ta không thể loại bỏ hoàn toàn các sai sót này mà chỉ có thể gảm bớt. 2.13.4 Các vấn đề thƣờng gặp trong phản ứng PCR và hƣớng giải quyết 2.13.4.1 Có nhiều sản phẩm không chuyên biệt có kích thƣớc dài hơn  Giảm thời gian bắt cặp  Tăng nhiệt độ bắt cặp Giảm thời gian kéo dài 32  Giảm nhiệt độ kéo dài đến: 62 – 68oC  Tăng nồng độ KCl trong dung dịch đệm đến 1,2X – 2X nhƣng vẫn giữ nồng độ MgCl2 ở 1,5 – 2mM  Tăng nồng độ MgCl2 lên 3 – 4,5mM nhƣng vẫn giữ nồng độ dNTP không đổi  Giảm nồng độ primer  Giảm nồng độ DNA khuôn mẫu  Giảm nồng độ Taq polymerase xuống  Nếu không phải từng lý do trên thì phải kiểm tra lại trình tự primer bằng cách Blast để đối chiếu với giữ liệu trên ngân hàng gene  Nếu không đƣợc thì có thể kết hợp tất cả hoặc một vài yếu tố trên 2.13.4.2 Có nhiều sản phẩm không đặc hiệu với kích thƣớc ngắn hơn  Tăng nhiệt độ bắt cặp  Tăng thời gian bắt cặp  Tăng thời gian kéo dài  Tăng nhiệt độ kéo dài: 74- 78oC  Giảm nồng độ muối KCl xuống còn 0,7 – 0,8X nhƣng vẫn giữ nồng độ MgCl2 ở 1,5 – 2mM  Tăng nồng độ MgCl2 lên 3 – 4.5mM nhƣng vẫn giữ nồng độ dNTP không đổi  Giảm nồng độ DNA khuôn mẫu  Giảm nồng độ Taq polymerase xuống  Nếu không phải từng lý do trên thì phải kiểm tra lại trình tự primer bằng cách Blast để đối chiếu với giữ liệu trên ngân hàng gene  Nếu không đƣợc thì có thể kết hợp tất cả hoặc một vài yếu tố trên 2.13.4.3 Không thu đƣợc bất kỳ sản phẩm nào  Đảm bảo chắc chắn các thành phần PCR đã đƣợc cho vào  Thay đổi dung dịch dNTP  Nếu mới mua primer mới thì phải kiểm tra lại để đảm bảo độ tin cậy  Tăng nồng độ primer  Tăng lƣợng DNA khuôn mẫu  Giảm nhiệt độ bắt cặp xuống 6 – 10oC  Nếu làm nhƣ vậy mà thu đƣợc sản phẩm (kể cả không đặc hiệu) thì thực hiện nhƣ đã trình bày ở trên 33 2.13.4.4 Sản phẩm quá yếu  Giảm dần dần nhiệt độ bắt cặp xuống thấp nhất đến có thể  Tăng nồng độ primer  Tăng lƣợng DNA khuôn mẫu  Tăng nồng độ Taq polymerase  Thay đổi nồng độ KCl (cao hơn nếu sản phẩm thấp hơn 1000bp và thấp hơn nếu sản phẩm lớn hơn 1000bp)  Thêm chất bổ trợ. Tốt nhất là sử dụng BSA nồng độ cuối 0.1 – 0.8 µg/µL. Có thể thử với DMSO hoặc glycerol nồng độ cuối 5% (v/v)  Kiểm tra lại trình tự primer xem có lỗi không và/hoặc tăng chiều dài primer lên 5 nucleotide  Kết hợp tất cả hoặc một vài yếu tố trên 2.13.4.5 Hai primer có nhiệt độ Tm khác nhau  Một cách đơn giản là tăng chiều dài của primer có nhiệt độ Tm thấp. Nếu muốn giữ sản phẩm PCR không đổi thì có thể thêm vài nucleotide ở đầu tận cùng 3’, còn nếu không quan tâm kích thƣớc sản phẩm thì có thể thêm ở cả hai đầu 3’ và cả 5’. 2.14 Phƣơng pháp RT-PCR 2.14.1 Phân loại RT – PCR 2.14.1.1 Phản ứng RT – PCR một bƣớc (ONE STEP) Hình 2.7: Tiến trình thực hiện RT – PCR một bƣớc 34 2.14.1.2 Phản ứng RT – PCR hai bƣớc (TWO STEP) Hình 2.8: Tiến trình thực hiện phản ứng RT – PCR hai bƣớc (Trích từ: www.promega.com/guides/rna_guide/amplifyingrna.pdf) 2.14.2 Các phƣơng pháp đƣợc thực hiện trong phản ứng tổng hợp cDNA Gồm 2 trƣờng hợp:  Trƣờng hợp 1: Đối với các loại virút có đuôi poly(A) thì sự tổng hợp cDNA có thể đƣợc thực hiện dựa vào các loại primer: oligo(dT), primer chuyên biệt cho gen cần khuếch đại và cuối cùng là primer ngẫu nhiên – các đoạn gồm 6 nucleotide  Trƣờng hợp 2: Ngƣợc lại với các loại virút không có đuôi poly(A) thì sự tổng hợp cDNA chỉ dựa vào các loại primer: primer chuyên biệt cho gen cần khuếch đại và primer ngẫu nhiên là các đoạn gồm 6 nucleotide Sơ đồ 2.5: Tổng hợp cDNA (Sambrook và Russell, 2001). 35 2.15 Những nghiên cứu trong nƣớc và trên thế giới về mức độ gây hại của TSWV 2.15.1 Những nghiên cứu tại Việt Nam  Năm 2002, tại trung tâm phân tích thí nghiệm trƣờng Đại Học Nông Lâm TP.HCM đã có nghiên cứu về TSWV nhƣng trên đối tƣợng là cây thuốc lá thì cho kết quả dƣơng tính rất yếu. Vào năm 2003 chẩn đoán lại, lần này việc chẩn đoán cho kết quả dƣơng tính rất mạnh, trên 70% mẫu thuốc lá bị nhiễm virút TSWV (Nguyễn Ngọc Bích, 2004).  Hiện tại theo chúng tôi tìm hiểu thì chƣa thấy có tài liệu nào đề cập đến việc chẩn đoán TSWV trên cây ớt bằng kỹ thuật RT - PCR 2.15.2 Những nghiên cứu trên thế giới  TSWV có phổ ký chủ rất rộng ở cả vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới trên toàn thế giới. TSWV đƣợc báo cáo đầu tiên vào năm 1915 khi nó gây thiệt hại rất lớn trên cà chua ở Úc, sau đó đƣợc mô tả chính xác là bệnh gây ra bởi virus. Bên cạnh ớt, cà chua và các loại hoa màu chính yếu mà nhạy cảm với TSWV thì còn có họ cúc, khoai tây, đậu phụng, thuốc lá, rau diếp, và một số loại hoa màu khác. Tỉ lệ nhiễm khoảng 59- 90% điều này đƣa đến hậu quả là nó ảnh hƣởng lên các loại hoa màu có giá trị thƣơng mại, và trong thời gian gần đây nó là một trong những loại virus làm ảnh hƣởng đến các loại hoa màu nhiều nhất.  Ở Brazil, mức độ nhiễm bệnh TSWV lên tới 800 loài thực vật khác nhau.  TSWV xuất hiện trong những quốc gia trong vùng EPPO, châu Á, châu Phi, bắc Mỹ, Caribbean, nam Mỹ, Thái Bình Dƣơng, (EPPO, 1999), mức độ nhiễm hơn 900 loài thực vật khác nhau với các loài ký chủ ngày càng mở rộng (Peter, 1998). Xuất hiện các loài trung gian truyền bệnh khác ở vài nƣớc Châu Âu (Mumford et al., 1996, Chatzivassiliou et al., 2000).  Tính kháng siêu mẫn cảm với TSWV đƣợc xác định bởi một gen trội đơn (allele kháng: Tsw) trong vài kiểu gen của Capsicum chinense (B. Moury, S. Pflieger, A. Blattes, V. Lefebvre, and A. Palloix) 36 Phần III Vật Liệu và Phƣơng Pháp Nghiên Cứu 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu Thời gian nghiên cứu: từ tháng 03 năm 2005 đến giữa tháng 09 năm 2005. Địa điểm điều tra và lấy mẫu: Xã Nhuận Đức - Huyện Củ chi - Thành Phố Hồ Chí Minh; Ấp Lộc Thạnh – Xã Lộc Hƣng – Trảng Bàng – Tây Ninh; Ấp Phƣớc thuận – Xã Phƣớc Thạnh – Châu Thành - Tiền Giang. Việc chẩn đoán bệnh TSWV đƣợc tiến hành tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh. 3.2 Phƣơng pháp điều tra và lấy mẫu Công việc lấy mẫu ớt đƣợc tiến hành nhƣ hoạch định gồm các giai đoạn sau: Liên hệ trạm Bảo vệ Thực vật huyện điều tra tình hình về phân bố diện tích ớt trên địa bàn huyện, từ đó có định hƣớng rõ ràng trong việc xác định vùng sẽ lấy mẫu. Sau khi liên hệ trạm Bảo vệ Thực vật huyện thì đã xác định đƣợc xã vẫn còn trong mùa vụ trồng ớt là xã Nhuận Đức, xã Lộc Hƣng, xã Phƣớc Thạnh. 3.3 Phƣơng pháp lấy mẫu Khi đã chọn đƣợc vƣờn để lấy mẫu thì tiến hành lấy mẫu nhƣ sau: tuỳ theo diện tích vƣờn mà có thể lấy mẫu từ 5- 15 mẫu thƣờng thì lấy bốn gốc và ở giữa còn lại lấy ngẫu nhiên và có theo phán đoán cá nhân. Lấy lá không non cũng không già lắm, phiến lá lớn, cắt cho vào bọc nylon đã đƣợc ghi nhãn sẵn: chủ vƣờn, địa điểm, giống, tuổi cây, triệu chứng. (Phụ lục số 4) Mẫu đƣợc cho vào thùng đá bảo quản lạnh ngay rồi vận chuyển về phòng thí nghiệm trữ ở - 20oC để phân tích. Bảng 3.1 trình bày số liệu về số lƣợng mẫu đƣợc thu thập tại các địa bàn. Bảng 3.1: Các địa bàn đƣợc lấy mẫu ớt STT Xã Mẫu lá + Trái ớt 1 Nhuận Đức 100 2 L ộc H ƣng 20 3 Ph ƣ ớc Th ạnh 40 Tổng số mẫu 160 37 3.4 Các phƣơng pháp chẩn đoán TSWV 3.4.1 Chẩn đoán bằng dDAS – ELISA (direct Double Antibody Sandwich – Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) Đây là phƣơng pháp dễ thực hiện nhƣng lại cho hiệu quả rất đáng tin cậy, kháng thể đƣợc sử dụng ở đây là kháng thể đơn dòng đƣợc cung cấp bởi công ty Biorad dùng để chẩn đoán sự hiện diện của virus TSWV gây bệnh trên cây ớt. 3.4.1.1 Dụng cụ và hoá chất cần thiết cho việc chẩn đoán bằng ELISA Dụng cụ  Cối và chày sứ nghiền mẫu (Đức)  Kéo  Cân phân tích (Ohaus - Mỹ)  Bình tia  Đĩa ELISA (Micriplates) 96 giếng (do công ty BioRad cung cấp)  Hộp nhựa  Tips 100µ;1000 µl (Đức)  Micropipette P100; P1000 (Nichiryo- Nhật)  Băng keo trong  Tủ định ôn (Memmert - Đức)  Máy ly tâm (Hettich - Đức) Hoá chất (do công ty BioRad cung cấp)  Dung dịch đệm trích mẫu (Extraction buffer)  Dung dịch đệm rửa (PBS - T)  Dung dịch đệm kháng thể (Coating buffer)  Dung dịch đệm cơ chất (Substrate buffer)  Kháng thể đơn dòng: cung cấp bởi công ty Biorad  Kháng thể có gắn Enzyme  p-Nitrophenyl phosphate (p - NPP) 3.4.1.2 Các bƣớc thực hiện Giai đoạn ly trích mẫu: Mẫu khi lấy về trữ ở -20oC, chọn những lá vừa không non cũng không già, phiến lá lớn, cân 0,5g cho vào cối, thêm 2,5ml dịch trích mẫu. Nghiền thật nát vụn 38 chỉ thấy dạng dung dịch. Sau đó đổ vào eppendoff gần đầy và ghi ký hiệu thật cẩn thận. Đem ly tâm tốc độ 5000vòng/phút trong 3 phút ở nhiệt độ 4oC. Dùng Micropipette P1000 hút phần dịch nỗi sang một eppendoff 1.5ml mới và cũng ghi nhãn cẩn thận (loại bỏ cặn lắng). Trữ ở 4oC Chẩn đoán ELISA  Bƣớc 1: Chuẩn bị đĩa và sơ đồ bố trí. Mỗi đĩa đƣợc bố trí 2 đối chứng âm và 2 đối chứng dƣơng.  Bƣớc 2: Pha loãng kháng thể 1/250 trong dung dịch đệm (coating buffer). Trên mỗi đĩa sử dụng 60 giếng, mỗi giếng hút vào 100µl, chạy trên 5 đĩa, nhƣ vậy tổng cộng là 30ml, do đó phải pha dung dịch đệm là khoảng 35ml: pha loãng 140µl kháng thể vào trong 35ml dung dịch đệm kháng thể, trộn thật kỹ trƣớc khi dùng. Hút 100µl dung dịch vừa pha vào mỗi giếng, dùng băng keo dán kín lại và đặt vào tủ ủ ở 37oC trong 2 giờ  Bƣớc 3: rửa với dung dịch đệm PBS – T bằng máy rửa, rửa 3 lần mỗi lần 3 phút  Bƣớc 4: mỗi đối chứng âm và dƣơng đƣợc hoà tan với 1ml nƣớc cất, hút 100µl mỗi loại đối chứng vào các giếng đối chứng, tiếp theo hút 100µl mẫu vào các giếng đã đƣợc bố trí. Đem ủ ở 4oC qua đêm  Bƣớc 5: Rửa lại với PBS – T 3 lần mỗi lần 3 phút.  Bƣớc 6: pha kháng thể có gắn enzyme vào dung dịch đệm tƣơng tự nhƣ pha kháng thể ở bƣớc 2. Hút 100µl dung dịch kháng thể có gắn enzyme đã đƣợc pha vào mỗi giếng , dán băng keo lại, sau đó đem ủ ở 37oC trong 2 giờ.  Bƣớc 7: rửa lại với PBS – T 3 lần, mỗi lần 3 phút.  Bƣớc 8: hoà tan pNPP trong dung dịch đệm Subtrate để đạt nồng độ cuối là 1mg/ml của pNPP Cách pha: nghiền nát thành bột mịn 7 viên pNPP (mỗi viên 5mg), cho vào 35ml dung dịch đệm Subtrate (không màu), chờ 5 phút để pNPP tan hoàn toàn trong dung dịch đệm. Hút 100µl cho vào mỗi giếng, dán băng keo lại. Ủ ở 37oC trong 30 phút  Bƣớc 9: đọc kết quả bằng máy đọc OD sau 30 phút, 1 giờ, 2 giờ  Những giếng xuất hiện màu vàng: giếng chứa mẫu bị nhiễm bệnh.  Những giếng không màu: giếng chứa mẫu không bị nhiễm bệnh. 39 Những ô để trống Nƣớc cất Buffer Đối chứng dƣơng Đối chứng âm Mẫu ly trích Hình 3.1: Sơ đồ bố trí phản ứng ELISA 3.4.2 Chẩn đoán TSWV bằng RT – PCR 3.4.2.1 Giai đoạn ly trích RNA theo Kit ly trích của Biorad  Bƣớc 1: Cân khoảng 60 mg mẫu lá ớt đã qua chẩn đoán ELISA cho kết quả dƣơng tính. Cho mẫu vào cối (đã qua xử lý với NaOH, EDTA, rửa lại bằng nƣớc cất siêu sạch, bọc giấy bạc rồi đem hấp khử trùng ở 121oC trong 20 phút, sấy khô trong một ngày đêm) nghiền thành bột mịn với nitơ lỏng. Thêm nitơ lỏng thƣờng xuyên, không để cho mẫu bị nóng lên.  Bƣớc 2: Lấy muỗng cho vào hết trong tube ly tâm 2ml có nắp đậy (không có RNase). Hòa tan mẫu bằng dung dịch ly giải (lysis solution) có bổ sung PVP 2% (hỗn hợp này đã đƣợc trộn trƣớc: 14µl PVP 2% + 700µl dung dịch ly giải cho mỗi mẫu)  Bƣớc 3: Cho 700µl dung dịch đã đƣợc trộn ở bƣớc trên vào tube chứa mẫu, trộn thật kỹ bằng pipet khoảng 10 lần  Bƣớc 4: Ly tâm 13000 vòng trong 3 phút. Chuyển toàn bộ dịch nổi vào tube ly tâm 2ml mới.  Bƣớc 5: Thêm 700 µl ethanol 70%, hoà tan bằng pipet cho đến khi không còn sự phân lớp  Bƣớc 6: Ủ ấm dung dịch hoà tan (elution solution) trong bồn ủ ở 70oC (để chuẩn bị cho bƣớc 15). Đặt RNA binding column (RNAbc) vào tube 2ml không nắp. 40  Bƣớc 7: Cho 700µl dung dịch ở bƣớc 5 vào RNAbc, ly tâm 12000 vòng trong 60 giây, loại bỏ dịch lọc. Thực hiện tƣơng tự cho đến hết phần dịch còn lại.  Bƣớc 8: Dịch rửa low stringency từ 5X pha loãng bằng ethanol 95 – 100% xuống còn 1X  Bƣớc 9: Cho 700µl dung dịch low stringency vào RNAbc, ly tâm 12000 vòng trong 30 giây, loại bỏ dịch lọc  Bƣớc 10: Pha Dnase I với 250µl Tris 10mM pH 7.5. Hoà tan bằng pipet.  Bƣớc 11: Trộn 5µl Dnase I với 75µl dung dịch Dnase dilution trong tube 1.5ml, cho vào RNAbc. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút, ly tâm 30 giây. Loại bỏ dịch lọc.  Bƣớc 12: Cho 700µl high stringency vào RNAbc, ly tâm 12000 vòng trong 30 giây, loại bỏ dịch lọc.  Bƣớc 13: Thực hiện tƣơng tự nhƣ bƣớc 12 nhƣng với dung dịch low stringency.  Bƣớc 14: Ly tâm 12000 vòng trong 1 phút để loại bỏ hoàn toàn dịch rửa.  Bƣớc 15: Chuyển RNAbc vào tube 1.5ml có nắp đậy, cho vào 80µl dung dịch hoà tan ở bƣớc 6. Để 1 phút, ly tâm 12000 vòng trong 2 phút để thu RNA tổng số. Bảo quản ở 4oC. 3.4.2.2 Kiểm tra sự hiện diện của RNA bằng điện di  Bƣớc 1: Các mẫu sau khi ly trích xong, hút 2µl để chạy điện di, thấy xuất hiện các vệt băng.  Bƣớc 2: Xử lý với RNase: hút 1µl RNase cho vào tube chứa 2µl mẫu RNA tổng số vừa ly trích 3.4.2.3 Lựa chọn cặp Primer chạy RT – PCR  Primers (mồi): Dƣới đây là một số cặp primer đƣợc sử dụng trong PCR để khuếch đại một đoạn gen trong genome của virút TSWV L1 TSWV R 5’-AAT TGC CTT GCA ACC AAT TC-3’ L2 TSWV F 5’-ATC AGT CGA AAT GGT CGG CA-3’ (J.Morris) TSWV-CP–17F TSWV 5’ – CTCTTGATGATGCAAAGTCTGTGA– 3’ TSWV-CP–100RTSWV5’–TCTCAAAGCTATCAACTGAAGCAATAA-3’ 41 (J.Morris) TSWV723 CAC AAG GCA AAG ACC TTG AG 2698-2717b 620 TSWV722 GCT GGA GCT AAG TAT AGC 2098-2118c 5’ATGTCTAAGGTTAAGCTC-3 5 TTAAGCAAGTTCTGTGAG-3 )(protein vỏ)(800bp) (P. Sreerama Kumar, 2000)  Tiến trình PCR là một tiến trình rất nhạy, nếu các primer không đƣợc kiểm tra trƣớc về độ đặc hiệu (tức là ngoài sản phẩm chính theo mong đợi thì nó còn có thể khuếch đại với các loài khác gây ức chế phản ứng PCR), ngoài ra còn phải kiểm tra có bao nhiêu vị trí trên genome mà primer có thể bắt cặp đƣợc. Chính vì lý do này mà chúng ta phải kiểm tra để chọn ra cặp primer thích hợp cho việc khuếch đại bằng PCR. Công việc này đƣợc thực hiện bởi phần phần mềm Blast hiện có trên mạng Internet. Các bƣớc thực hiện nhƣ sau:  Bƣớc 1: Vào trang chủ NCBI  Bƣớc 2: Vào Folder Blast  Bƣớc 3: Nhập trình tự của cả hai primer vào  Chú ý: Nhập nhƣ sau: Primer1 nnnnnnnnnnnnn Primer2 (lấy bổ sung và đảo đầu đối với primer2 này vì genome của con virút TSWV là RNA sợi đơn) 3.4.2.4 Khuếch đại bằng RT – PCR RT – PCR hai bƣớc Bƣớc 1: Reverse transcription  Thành phần hoá chất  Thể tích RNA tổng số chạy thí nghiệm: 2µl; 4µl; 6µl; 8µl; 10µl  iScript Reaction Mix 4µ  iScript Reverse Transcriptase 1µ  Nuclease-free water 13µ  RNA khuôn mẫu 2µ Tổng thề tích 20µ 42  Chu trình nhiệt 5 phút ở 25oC 30 phút ở 42oC 5 phút ở 85oC Giữ ở 4oC Bƣớc 2: Khuếch đại bằng PCR  Thành phần hoá chất Nồng độ đầu Nồng độ cuối iTaq buffer 10X 5µl 1X MgCl2 50mM 1.5µl 1.5mM dNTP mix 10mM 1µl 200µM iTaq DNA polymerase 0,25µl 1,25units primer 1 2µl 0,1pmol primer 2 2µl 0,1pmol Nuclease-free-water 33,25µl DNA đã qua Reverse 2µl Tổng thể tích 50µl  Chu trình nhiệt cho phản ứng 1 chu kỳ 5 phút ở 94oC 30 chu kỳ 1 phút ở 94oC 1 phút ở 55oC 1 phút ở 72oC 1 chu kỳ 10 phút ở 72oC Giữ ở 4oC trong 15 phút  Chú thích: Trên đây là protocol chuẩn (J.Morris), nhƣng trong quá trình tiến hành chúng tôi thấy không cho kết quả nên đã có một số thay đổi mang tính chất thí nghiệm để tìm ra qui trình phù hợp, một số thay đổi nhƣ sau:  Hạ nhiệt độ bắt cặp từ 55oC xuống 50oC; 48oC; 46oC  Hạ nhiệt độ bắt cặp kết hợp với tăng chu kỳ từ 30 chu kỳ lên 35 chu kỳ; 45 chu kỳ 43  Hạ nhiệt độ bắt cặp, tăng chu kỳ kết hợp với tăng nồng độ primers từ 5pmol lên 50pmol (đã qua tham khảo thầy cô và bạn bè)  Tăng nồng độ MgCl2 từ 1,5µl lên 2µl; 2,5µl  Ly tâm nhẹ RNA tổng số để mong thu đƣợc nồng độ cao hơn  Tăng nồng độ Taq DNA polymerase từ 1,25U lên 2,5U RT – PCR hai bƣớc  Thành phần hoá chất Dung dịch đ ệm AMV/Tfl 5X 10µl 1X dNTP mix (10mM m ỗi lo ại dNTP) 1µl 0,2mM MgSO4 25mM 2µl 1mM Primer xuôi 50pmol 1µM Primer ngƣợc 50pmol 1µM AMV Reverse Transcriptase (5u/µ) 1µl 0,1u/µl Tfl DNA polymerase (5u/µl) 1µl 0,1u/µl RNA tổng số 5µl Nuclease-free Water 28µl Tổng thể tích 50µl  Chú thích: có chạy kèm đối chứng dƣơng của công ty Promega để kiểm tra thao tác và hoạt động của máy.  Chu trình nhiệt 1 chu kỳ 45oC trong 45 phút 1 chu kỳ 94oC trong 2 phút 45 chu kỳ 94oC trong 30 giây 50 o C trong 1 phút 72 o C trong 1 phút 1 chu kỳ ở 72oC trong 10 phút 1 chu kỳ ở 4oC trong 15 phút 3.4.2.5 Phƣớng pháp đổ gel agarose điện di  Bƣớc 1: Chuẩn bị gel agarose 1-2%  Bƣớc 2: Làm nguội agarose đã đƣợc nấu chín đến 50-60oC, sau đó đổ vào khuôn đã đƣợc đặt lƣợc vào trƣớc 44  Bƣớc 3: Lấy lƣợc ra, cho gel vào 1×TBE.  Bƣớc 4: Hút 2µl loading dye trộn với 4µl mẫu  Bƣớc 5: Bơm vào các giếng một cách cẩn thận 4µl mẫu + dung dịch đệm.  Bƣớc 6: Chạy điện di ở 100V/40mA, cho đến khi thuốc nhuộm cách đầu tận cùng của gel là 1cm.  Bƣớc 7: Lấy gel ra và ngâm vào dung dịch ethidium bromide (0,5Ug/ml) trong 20 phút.  Bƣớc 8: Rửa nhẹ gel với nƣớc đã qua chƣng cất.  Bƣớc 9: Đọc kết quả dƣới tia UV, thẩm định kết quả với marker.  Bƣớc 10: Chụp bản gel để lƣu lại kết quả 45 Phần IV Kết quả Thảo luận 4.1 Mức độ nhiễm bệnh TSWV ở 3 xã đại diện cho 3 huyện qua chẩn đoán ELISA 4.1.1 Tỷ lệ nhiễm bệnh TSWV theo địa bàn điều tra Bảng 4.1: Tỷ lệ nhiễm bệnh TSWV tại các xã: Nhuận Đức, Phƣớc Thạnh, Lộc Hƣng 12,1 12,5 0 0 2 4 6 8 10 12 14 Tæ leä (%) Xaõ Nhuaän Ñöùc Phöôùc Thaïnh Loäc Höng Đồ thị 4.1: Tỷ lệ nhiễm virút TSWV tại các xã: Nhuận Đức,Phƣớc Thạnh, Lộc Hƣng.  Qua kết quả trên chúng tôi thấy rằng tỉ lệ nhiễm TSWV trên các địa bàn xã tại hai huyện Củ Chi (12,1%) và Châu Thành (12,5%) còn ở mức thấp, trái lại trên địa bàn xã Lộc Hƣng huyện Trảng Bàng tỉnh Tây Ninh chƣa thấy mầm mống của virút TSWV (0%). Địa bàn Số mẫu điều tra Số mẫu nhiễm TSWV % mẫu nhiễm TSWV Nhuận Đức 91 11 12,1 Phƣớc Thạnh 32 4 12,5 Lộc Hƣng 12 0 0 46 4.1.2 Tỷ lệ nhiễm TSWV theo từng giống ớt  Hiện tại theo nghiên cứu này chúng tôi chƣa xác định đƣợc tỷ lệ bệnh nhiễm vào từng giống ớt là do yếu tố khách quan vì rất ít hộ nông dân nắm vững tên của giống ớt mà họ đang trồng. Đa số ngƣời dân chỉ biết là mua ớt tại công ty nào thôi, chứ ớt giống gì thì bà con hầu nhƣ chƣa quan tâm lắm. Dƣới đây là một số giống ớt theo chẩn đoán là đã bị nhiễm virút TSWV Hình 4.1: Ớt Ba tri (tên ngƣời dân thƣờng gọi) bị nhiễm TSWV Hình 4.2: Ớt hiểm Bungari (tên ngƣời dân thƣờng gọi) bị nhiễm TSWV 47 4.1.3 Tỷ lệ nhiễm virút TSWV theo triệu chứng Triệu chứng bệnh trên cây ớt là rất nhiều nhƣng qua quá trình tham khảo tài liệu cùng với phán đoán chủ quan thì chúng tôi ghi nhận lại các triệu chứng nhƣ sau:  Lá khảm vàng xanh, cong. Hình 4.3: Ớt có triệu chứng lá khảm vàng xanh, cong (hình chụp tại vƣờn của chủ hộ Nguyễn Văn Bảnh, ấp Bầu Tròn - Nhuận Đức - Củ Chi ngày 21 tháng 3 năm 2005)  Lá chấm vàng xanh, nhăn nheo,co lại, dày, giòn Hình 4.4: Ớt có triệu chứng lá chấm vàng xanh, nhăn nheo, co lại, dày, giòn (hình chụp tại vƣờn ông Cần, ấp Phƣớc Thuận - Phƣớc Thạnh – Châu Thành - Tiền Giang ngày 3 tháng 4 năm 2005) 48  Khảm nặng có chấm đen, lủng lỗ Hình 4.5: Ớt có triệu chứng khảm nặng,chấm đen, lủng lỗ (hình chụp tại vƣờn ông Huỳnh Ngọc Đạt, ấp Phƣớc Thuận – Phƣớc Thạnh – Châu Thành – Tiền Giang ngày 3 tháng 4 năm 2005)  Khảm vàng nhạt trên rìa lá, lá nhỏ Hình 4.6: Ớt có triệu chứng khảm vàng nhạt trên rìa lá, lá nhỏ (hình chụp tại vƣờn bà Nguyễn Thị Liễu, ấp Bầu Tròn - Nhuận Đức ngày 15 tháng 3 năm 2005) 49 Bảng 4.2 Tỷ lệ nhiễm TSWV theo triệu chứng  Nhận xét: theo kết quả trên thì các triệu chứng nghi ngờ đều có thể tin cậy đƣợc, bởi vì kết quả chẩn đoán bằng ELISA đều cho thấy tỉ lệ nhiễm TSWV cũng khá cao (57%). Bên cạnh đó còn một điều lƣu ý là hầu nhƣ những lá bị khảm vàng đều có thể đã bị nhiễm TSWV, nhƣng mức độ nặng hay nhẹ thì phải qua chẩn đoán mới có kết luận chính xác. Có những lá nhìn bề ngoài thì không thấy triệu chứng gì nhƣng khi kiểm tra vẫn phát hiện bệnh. Điều này có thể lý giải là bệnh chỉ ở giai đoạn đ ầu khi virút vừa xâm nhập, chƣa đủ thời gian để biểu hiện triệu chứng ra bên ngoài. 37,5 57 53 25 0 10 20 30 40 50 60 Tỷ lệ (%) Xaõ Khảm vàng xanh, lá cong Lá chấm vàng xanh, nhăn, dày Khảm nặng, chấm đen, lủng lỗ Khảm vàng nhạt trên rìa lá, lá n h ỏ Đồ thị 4.2: Tỷ lệ bệnh theo triệu chứng  Nhƣ vậy, chúng ta thấy trong tất cả các triệu chứng trên không xuất hiện triệu chứng là các đốm vòng tròn đồng tâm (đây lại là triệu chứng chính của virút TSWV), nhƣng kiểm tra vẫn phát hiện bệnh. Do đó không thể chỉ dựa vào một triệu chứng là các vòng tròn đồng tâm mà phải kết hợp với các triệu chứng nêu trên mới có thể chẩn đoán trên đồng ruộng một cách khá tốt rằng cây ớt có bị nhiễm bệnh TSWV Triệu chứng Số mẫu điều tra Số mẫu nhiễm % mẫu nhiễm Khảm vàng xanh, lá cong 8 3 37, Lá chấm vàng xanh, nhăn, dày,giòn 7 4 57 Khảm nặng, chấm đen, lủng lỗ 15 8 53 Khảm vàng nhạt trên rìa lá, lá nhỏ 8 2 25 50 hay không. Bên cạnh việc xác định bệnh trên lá, chúng tôi cũng tiến hành kiểm tra trên trái ớt, với kết quả nhƣ sau: 67% 33% Không nhiễm Trái nhiễm Đồ thị 4.3: Tỷ lệ nhiễm TSWV trên trái ớt  Từ những thực tế trên đồng ruộng cho thấy rằng: để phát hiện bệnh mà chỉ dựa vào triệu chứng là những đốm vòng tròn đồng tâm thì khó có thể phát hiện đƣợc. Bởi vì có những trái ớt có triệu chứng là những vòng tròn đồng tâm nhƣng rất giống với triệu chứng của bệnh thán thƣ, nên rất khó phân biệt. 4.1.4 Tỷ lệ nhiễm bệnh TSWV theo độ tuổi Việc đánh giá tỉ lệ bệnh theo độ tuổi là rất khó và không thực hiện đƣợc vì khi tiến hành lấy mẫu ớt thì các vƣờn ớt đều đã vào cuối vụ, đã cho trái đợt hai. Nhƣ chúng ta đã biết, bệnh virút là bệnh không điều trị đƣợc. Cây khi bị nhiễm virút thì bắt buộc phải loại bỏ, nhƣng nếu làm nhƣ vậy thì sẽ ảnh hƣởng rất lớn đến hiệu quả kinh tế của các nông hộ. Do đó tính cấp thiết của vấn đề là khi bệnh chƣa bùng phát thành dịch thì phải có biện pháp phòng ngừa kịp thời, có chiến lƣợc quản lý nguồn giống trƣớc khi đƣa vào canh tác để đem lại hiệu quả kinh tế cho bà con nông dân. 51 4.2 Kết quả tiến trình RT – PCR 4.2.1 Kết quả kiểm tra RNA Hình 4.7: Kết quả điện di RNA  Chú thích: + Giếng 1: mẫu cDNA 1 đã qua bƣớc reverse transcription + Giếng 2: mẫu cDNA 2 đã qua bƣớc reverse transcription + Giếng 3: mẫu RNA 1 tổng số vừa ly trích xong + Giếng 4: mẫu RNA 1 đã qua xử lý RNase, ủ ở 37oC trong 1 giờ + Giếng 5: mẫu RNA 2 tổng số vừa ly trích + Giếng 6: mẫu RNA 3 tổng số vừa ly trích  Nhận định chung: + Từ giếng số 3 và 4 cho thấy, cũng một mẫu RNA tổng số sau khi ly trích nhƣng khi đƣợc xử lý với RNase thì vệt băng mờ hẳn đi. Điều này có thể phần nào khẳng định rằng trong mẫu ly trích có chứa RNA tổng số nhƣng có thể chƣa khẳng định đƣợc là có tồn tại RNA của virút TSWV nhƣ mong muốn không. Ở đây sẽ có một điều khó hiểu là tại sao RNA sợi đơn lại có thể bắt đƣợc với các phân tử ethidium bromide để phát sáng dƣới tia UV, từ thắc mắt này chúng tôi đã tìm hiểu và biết rằng các phân tử ethidium bromide không có một cơ chế bắt cặp đặc hiệu với sợi đôi DNA, ethidium bromide có thể xen vào các khe hở giữa các phân tử, nó tồn tại ở đó và sẽ phát sáng dƣới tia UV (đòi hỏi hàm lƣợng các phân tử phải khá cao) 52 + Ở giếng 1 và giếng 2 chúng tôi tiến hành chạy sản phẩm cDNA, nhƣng không cho bất kỳ kết quả nào. Điều này có thể giải thích: bƣớc reverse transcription để chuyển RNA thành cDNA với tổng thể tích là 20µl nhƣng chỉ chứa 2µl RNA tổng số, rồi từ 20µl cDNA đó ta chỉ hút 4µl để chạy điện di. Nhƣ vậy có thể hàm lƣợng cDNA quá thấp chƣa tới ngƣỡng phát hiện, do đó không thể phát hiện khi nhuộm với ethidium bromide và chụp dƣới tia UV. + Ở giếng 5 và giếng 6 không thấy vệt băng xuất hiện. Điều này có thể kết luận là quá trình ly trích không thành công hoặc lƣợng RNA quá ít không thể phát hiện đƣợc. 4.2.2 Kết quả kiểm tra Primer Sau khi thực hiện Blast để kiểm tra primer thì có kết quả sau:  Chỉ có một vị trí gắn duy nhất trên gen đích và không hề có vị trí gắn nào khác trên sợi bổ sung  Ngoài cá thể cần khuếch đại thì cặp primer này chỉ có thể khuếch đại với một số cá thể sau: 1: AY070218 Tomato spotted wilt virus RNA-dependent RNA polymerase (L) gene, complete cds gi|27461077|gb|AY070218.1|[27461077] 2: AB190813 Tomato spotted wilt virus RNA segment L, complete sequence gi|52421192|dbj|AB190813.1|[52421192] 3: D10066 Tomato spotted wilt virus L RNA encoding RNA polymerase, complete cds gi|222680|dbj|D10066.1|TSWLRPOLM[222680] 4: Z66548 Puumala virus segment L, genomic RNA, strain Sotkamo gi|1292880|emb|Z66548.1|PVLSOTKMO[1292880] 5: AB198742 Tomato spotted wilt virus gene for L protein, complete cds gi|57635879|dbj|AB198742.1|[57635879] 53  Cặp primer đã chọn L1 TSWV R 5’-AAT TGC CTT GCA ACC AAT TC-3’ L2 TSWV F 5’-ATC AGT CGA AAT GGT CGG CA-3’ 4.2.3 Kết quả tiến trình RT – PCR Kết quả RT – PCR hai bƣớc Tiến trình chạy RT – PCR hai bƣớc không cho kết quả dƣơng tính đối với virút TSWV. Điều này theo chúng tôi có thể do những nguyên nhân sau:  Genome L (long) của virút TSWV không có đuôi polyA, nhƣ vậy sẽ rất khó khăn trong việc tổng hợp cDNA. Việc tổng hợp cDNA chủ yếu dựa vào các primer (mồi) ngẫu nhiên là các đoạn 6 nucleotide.  Việc tổng hợp cDNA bằng các primer nhẫu nhiên đôi khi không cho kết quả là những sản phẩm có chứa đoạn gen cần khuếch đại  Hàm lƣợng RNA quá thấp, nên lƣợng cDNA đƣợc tạo ra cũng rất thấp. Điều này có thể dẫn đến xác suất hút ra để chạy PCR đôi khi là rất thấp hoặc không có. Kết quả RT – PCR một bƣớc Hình 4.8: Kết quả chạy đối chứng dƣơng Sản phẩm đối chứng 323bp 54  Nhận định chung: Sau khi chạy RT – PCR một bƣớc có kèm đối chứng dƣơng thì chỉ có đối chứng cho sản phẩm chỉ một băng duy nhất còn mẫu bệnh ly trích thì không cho kết quả dƣơng tính. Tới đây chúng tôi mới đề xuất phƣơng án để khắc phục hiện tƣợng số lƣợng RNA khuôn mẫu quá ít là làm sao phải thiết kế đƣợc một cặp primer nữa, cặp primer này sẽ phủ bên ngoài cặp primer hiện đang dùng, mục đích là để chạy Nested PCR. 4.2.4 Kết quả tiến trình thiết kế primer cho Nested PCR  Sự cần thiết phải chọn giải pháp RT – PCR kết hợp Nested PCR Bƣớc chẩn đoán virút TSWV bằng phƣơng pháp ELISA cho kết quả dƣơng tính rất yếu, điều này có thể do lƣợng virút nhiễm (RNA khuôn mẫu) rất thấp, khó có thể phát hiện bằng PCR với một cặp Primer. Do đó phải dùng phƣơng pháp Nested PCR  Bƣớc thiết kế Primer dùng cho Nested PCR Để đảm bảo sản phẩm PCR sau cùng không thay đổi về kích thƣớc, chúng tôi tiến hành thiết kế một cặp primer mới (ứng dụng phần mềm PCGEN), cặp primer này sẽ phủ bên ngoài cặp primer cũ. Nhƣ vậy qua bƣớc PCR thứ nhất với cặp primer mới sẽ tạo ra sản phẩm có kích thƣớc lớn hơn sản phẩm mong đợi. Từ đây ta trích ra một thể tích để chạy tiếp PCR với cặp primer cũ và có thể thu đƣợc sản phẩm PCR với kích thƣớc mong đợi. Sau khi tiến hành thiết kế primer bằng phần mềm PCGEN cho việc chạy Nested PCR, chúng tôi đã thiết kế đƣợc rất nhiều primer đơn bắt vào sợi sense, primer đơn bắt vào sợi antisense, cặp primer bắt vào cả hai sợi với các thông số đòi hỏi đƣợc đƣa ra nhƣ sau:  Các thông số về primer  Chiều dài primer tối ƣu là 20bp  Chiều dài primer chấp nhận đƣợc là từ 15 – 25bp  Độ lặp lại của các base đơn tối đa là 3 lần  Số lƣợng base GC ở đầu 3’ là 2  % GC chấp nhận đƣợc: 40 – 60%  Các thông số gắn kết của primer  Số lƣợng tối đa các base đối với sự tự bắt cặp của 2 primer là 4 55  Vùng cuộn lại (stem – loop) có thể chấp nhận đƣợc tối đa là 4  % các base tối đa mà có thể bắt cặp bổ sung với các vùng trên các khuôn mẫu khác là 70%  Thông số về nhiệt độ nóng chảy (Tm)  Tm tối ƣu: 64oC  Dãy Tm chấp nhận đƣợc: 49 – 79 Các primer đơn đạt chuẩn về thành phần và vị trí gắn đối với sợi (+) |STT |Trình tự primer (5' --> 3') | bp | Tm | delG | %GC |Vùng bắt cặp | P1 | CATGTAGCGCAGAGTGATCCATCGG | 25 | 64 | -53 | 56 | 187-211 | | P2 | AGCGCAGAGTGATCCATCGGAAGC | 24 | 65 | -54 | 58 | 192-215 | | P3 | TAGCGCAGAGTGATCCATCGGAAGC | 25 | 65 | -55 | 56 | 191-215 | | P4 | TGTAGCGCAGAGTGATCCATCGG | 23 | 62 | -50 | 57 | 189-211 | | P5 | ATGTAGCGCAGAGTGATCCATCGG | 24 | 62 | -51 | 54 | 188-211 | | P6 | CGCAGAGTGATCCATCGGAAGC | 22 | 61 | -49 | 59 | 194-215 | | P7 | CATGTAGCGCAGAGTGATCCATCG | 24 | 61 | -50 | 54 | 187-210 | | P8 | GCAGAGTGATCCATCGGAAGCC | 22 | 60 | -49 | 59 | 195-216 | | P9 | AGCGCAGAGTGATCCATCGGAAGCC | 25 | 68 | -57 | 60 | 192-216 | | P10 | GTAGCGCAGAGTGATCCATCGG | 22 | 59 | -48 | 59 | 190-211 | | P11 | ATGTAGCGCAGAGTGATCCATCG | 23 | 59 | -48 | 52 | 188-210 | | P12 | TGCTTGAATTTGTCATGTCCAAGG | 24 | 59 | -49 | 42 | 26-49 | | P13 | ATGCTTGAATTTGTCATGTCCAAGG | 25 | 59 | -50 | 40 | 25-49 | | P14 | GCAGATGCTTGAATTTGTCATGTCC | 25 | 59 | -50 | 44 | 21-45 | | P15 | AGCGCAGAGTGATCCATCGG | 20 | 58 | -46 | 60 | 192-211 | | P16 | TAGCGCAGAGTGATCCATCGG | 21 | 58 | -47 | 57 | 191-211 | | P17 | TGTAGCGCAGAGTGATCCATCG | 22 | 58 | -47 | 55 | 189-210 | | P18 | CAGAGTGATCCATCGGAAGCC | 21 | 57 | -46 | 57 | 196-216 | | P19 | GCAGAGTGATCCATCGGAAGC | 21 | 57 | -46 | 57 | 195-215 | | P20 | ACGTTATCTTTGGACACAATCACG | 24 | 56 | -47 | 42 | 256-279 | | P21 | TACGTTATCTTTGGACACAATCACG | 25 | 56 | -48 | 40 | 255-279 | | P22 | CATCGGAAGCCATATCTATAAGTGG | 25 | 56 | -50 | 44 | 206-230 | | P23 | GTAGCGCAGAGTGATCCATCG | 21 | 56 | -45 | 57 | 190-210 | 56 | P24 | GCTTGAATTTGTCATGTCCAAGG | 23 | 56 | -47 | 43 | 27-49 | | P25 | CAGATGCTTGAATTTGTCATGTCC | 24 | 56 | -47 | 42 | 22-45 | | P26 | CGTTATCTTTGGACACAATCACG | 23 | 55 | -46 | 43 | 257-279 | | P27 | ATCGGAAGCCATATCTATAAGTGG | 24 | 54 | -48 | 42 | 207-230 | | P28 | AGAGTGATCCATCGGAAGCC | 20 | 54 | -44 | 55 | 197-216 | | P29 | AGCGCAGAGTGATCCATCG | 19 | 54 | -43 | 58 | 192-210 | | P30 | TAGCGCAGAGTGATCCATCG | 20 | 54 | -44 | 55 | 191-210 | | P31 | TCGGAAGCCATATCTATAAGTGG | 23 | 53 | -47 | 43 | 208-230 | | P32 | CAGAGTGATCCATCGGAAGC | 20 | 53 | -43 | 55 | 196-215 | | P33 | GAGTGATCCATCGGAAGCC | 19 | 52 | -42 | 58 | 198-216 | | P34 | CTTGAATTTGTCATGTCCAAGG | 22 | 52 | -44 | 41 | 28-49 | | P35 | GATGCTTGAATTTGTCATGTCC | 22 | 52 | -43 | 41 | 24-45 | | P36 | CATGTAGCGCAGAGTGATCC | 20 | 51 | -42 | 55 | 187-206 | | P37 | GTTATCTTTGGACACAATCACG | 22 | 50 | -42 | 41 | 258-279 | | P38 | AGTGATCCATCGGAAGCC | 18 | 50 | -41 | 56 | 199-216 | | P39 | AGAGTGATCCATCGGAAGC | 19 | 49 | -41 | 53 | 197-215 | | P40 | TGAATTTGTCATGTCCAAGG | 20 | 49 | -40 | 40 | 30-49 | | P41 | TGCTTGAATTTGTCATGTCC | 20 | 49 | -40 | 40 | 26-45 Các primer đạt chuẩn về thành phần và vị trí gắn đối với sợi (-) | STT |Trình tự primer (5' --> 3') | bp | Tm | delG | %GC |Vùng bắt cặp | M1 | GCCTGCAATAGAGAGGAATAATCGC | 25 | 59 | -53 | 48 | 923-947 | | M2 | TGCCTGCAATAGAGAGGAATAATCG | 25 | 59 | -51 | 44 | 924-948 | | M3 | TGCAATAGAGAGGAATAATCGCTCC | 25 | 58 | -51 | 44 | 920-944 | | M4 | CCTGCAATAGAGAGGAATAATCGC | 24 | 56 | -50 | 46 | 923-946 | | M5 | GCCTGCAATAGAGAGGAATAATCG | 24 | 56 | -50 | 46 | 924-947 | | M6 | GCAATAGAGAGGAATAATCGCTCC | 24 | 55 | -49 | 46 | 920-943 | | M7 | GATGTTGCATTATCATCAGAGTGC | 24 | 54 | -45 | 42 | 717-740 | | M8 | CTGCAATAGAGAGGAATAATCGC | 23 | 53 | -46 | 43 | 923-945 | | M9 | CCTGCAATAGAGAGGAATAATCG | 23 | 53 | -46 | 43 | 924-946 | | M10 | TTTATCAACCTCTCCACTGGC | 21 | 52 | -43 | 48 | 748-768 | 57 | M11 | CAATAGAGAGGAATAATCGCTCC | 23 | 52 | -46 | 43 | 920-942 | | M12 | TGCAATAGAGAGGAATAATCGC | 22 | 52 | -45 | 41 | 923-944 | | M13 | TGCACAATCCATCTAGTTTGG | 21 | 51 | -42 | 43 | 699-719 | | M14 | TGTTGCATTATCATCAGAGTGC | 22 | 51 | -42 | 41 | 717-738 | | M15 | GCTTCTAAACAACATTTCTGGC | 22 | 51 | -44 | 41 | 798-819 | | M16 | AATAGAGAGGAATAATCGCTCC | 22 | 49 | -44 | 41 | 920-941 | | M17 | GCAATAGAGAGGAATAATCGC | 21 | 49 | -43 | 43 | 923-943 | | M18 | CTGCAATAGAGAGGAATAATCG | 22 | 49 | -43 | 41 | 924-945 | | M19 | CAGTTTGCTAAATGCCTGC | 19 | 49 | -41 | 47 | 942-960 Các cặp primer đạt chuẩn về vị trí gắn và nhiệt độ Tm | STT Trình tự primer (5' --> 3') | Ta | Tm | delG | %GC |Vùng bắt cặp |---------------------------------------------------------------------------| |P18 |CAGAGTGATCCATCGGAAGCC | 54 | 57 | -46 | 57 | 196-216 | |M1 |GCCTGCAATAGAGAGGAATAATCGC | | 59 | -53 | 48 | 923-947 | | | | | | | | | |P8 |GCAGAGTGATCCATCGGAAGCC | 54 | 60 | -49 | 59 | 195-2