Khóa luận Khảo sát sự ra hoa trong ống nghiệm ở cây lan sõ (dischidia pectinoides pearson) và cây bắt ruồi (drosera burmannii vahl)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC  KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT SỰ RA HOA TRONG ỐNG NGHIỆM Ở CÂY LAN SÕ (Dischidia pectinoides Pearson) và CÂY BẮT RUỒI (Drosera burmannii Vahl) NGÀNH: CƠNG NGHỆ SINH HỌC NIÊN KHĨA: 2003 – 2007 SINH VIÊN THỰC HIỆN: NGUYỄN THỊ NGỌC TƯ Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 08/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC  KHẢO SÁT SỰ RA HOA TRONG ỐNG NGHIỆM Ở CÂY LAN SÕ (Dischidia pectinoides Pearson) và CÂY BẮT RUỒI (Drosera burmannii Vahl) GVHD: TS. TRẦN THỊ DUNG SVTH: NGUYỄN THỊ NGỌC TƯ Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 08/2007 ii LỜI CẢM TẠ Con thành kính ghi ơn ba mẹ cùng những ngƣời thân trong gia đình luơn tạo điều kiện và động viên con trong suốt quá trình học tập. Chúng tơi xin chân thành cảm ơn: - Ban Giám Hiệu trƣờng Đại học Nơng Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện cho tơi trong suốt thời gian học tập. - Các Thầy Cơ thuộc Bộ mơn Cơng nghệ Sinh học cùng các Thầy Cơ tại trƣờng đã luơn tận tình hƣớng dẫn, giảng dạy và giúp đỡ tơi. - TS. Trần Thị Dung đã trực tiếp hƣớng dẫn và giúp đỡ tơi trong suốt thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp. - KS. Trần Ngọc Hùng, KS. Nguyễn Thị Thu Hằng, KS. Lê Hồng Thủy Tiên thuộc Trung tâm Cơng nghệ sinh học Đại học Nơng Lâm Tp.HCM đã tạo mọi điều kiện và hƣớng dẫn tơi hồn thành tốt đề tài. - Tồn thể các bạn trong lớp CNSH29 đã hỗ trợ, giúp đỡ và động viên tơi trong suốt thời gian làm đề tài. Chân thành cảm ơn. Tháng 08 năm 2007 Nguyễn Thị Ngọc Tú iii TĨM TẮT NGUYỄN THỊ NGỌC TÚ, Đại học Nơng Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 08/2007 “KHẢO SÁT SỰ RA HOA TRONG ỐNG NGHIỆM Ở CÂY LAN SỊ (Dischidia pectinoides Pearson) và CÂY BẮT RUỒI (Drosera burmannii Vahl)” Hội đồng hƣớng dẫn: TS. Trần Thị Dung Đề tài đƣợc thực hiện từ tháng 03/2007 đến tháng 08/2007 tại Bộ mơn Cơng nghệ sinh học Trƣờng Đại học Nơng Lâm Tp.HCM. Cây lan sị và cây bắt ruồi in vitro đƣợc nuơi cấy trong mơi trƣờng cảm ứng ra hoa với các yếu tố cảm ứng đƣợc sử dụng là GA3, BA, cƣờng độ ánh sáng và sự gia tăng nồng độ KH2PO4, giảm nồng độ NH4NO3. Những kết quả thu đƣợc:  Đối với cây lan sị - Mơi trƣờng thích hợp nhất để cây lan sị ra hoa trong ống nghiệm (đạt tỉ lệ 44,4%) là mơi trƣờng MS cĩ bổ sung GA3 1,5mg/l. Cây ra nụ sau 78 ngày nuơi cấy và ra hoa sau 95,5 ngày, trung bình đạt 7 hoa/cây. - Mơi trƣờng cĩ bổ sung BA hoặc thay đổi cƣờng độ ánh sáng khơng cĩ ảnh hƣởng nhiều trên sự ra hoa của cây lan sị in vitro.  Đối với cây bắt ruồi - Việc thay đổi nồng độ KH2PO4 và NH4NO3 khơng cĩ ảnh hƣởng tốt trên sự ra hoa của cây bắt ruồi in vitro. Cây chỉ ra nụ nhƣng tỉ lệ khơng cao hơn so với đối chứng. Tất cả các nụ đều khơng nở thành hoa. iv ABSTRACT NGUYEN THI NGOC TU, Nong Lam University, HCM city, August, 2007. “The study of flowering in vitro in Dischidia pectinoides Pearson and Drosera burmannii Vahl.” Supervisor: Tran Thi Dung, Ph.D The subject was studied from 3/2007 to 8/2007 at the Department of Biotechnology at Nong Lam University. Dischidia pectinoides and Drosera burmannii in vitro were cultured in basic medium Murashige and Skoog (MS) and the supplement with different plant growth regulator such as: GA3, BA; the change of the intensity of light, KH2PO4, NH4NO3. Results:  In Dischidia pectinoides The best medium for flower induction is MS medium supplemented with 1.5mg/l GA3. The plants has formed flower buds after 78 days and bloomed after 95.5 days. There are 7 flowers in plant. The effect of MS medium supplemented with BA or changed the intensity of light isn’t clearly.  In Drosera burmannii The change of KH2PO4 and NH4NO3 concentrations didn’t effect in fowering in vitro in Drosera burmannii. The plants was formed flower buds, but ratio isn’t higher when compared with control treatment. All of flower buds didn’t bloom. v MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang tựa ......................................................................................................... i Lời cảm tạ ........................................................................................................ ii Tĩm tắt ............................................................................................................ iii Mục lục ............................................................................................................ v Danh sách các bảng ......................................................................................... viii Danh sách các hình .......................................................................................... x Chƣơng 1: MỞ ĐẦU ........................................................................................ 1 1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................. 1 1.2. Mục đích yêu cầu ...................................................................................... 2 1.2.1. Mục đích .............................................................................................. 2 1.2.2. Yêu cầu ................................................................................................ 2 Chƣơng 2:TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 3 2.1. Giới thiệu về đối tƣợng nghiên cứu .......................................................... 3 2.2.1. Giới thiệu khái quát về cây lan sị ....................................................... 3 2.1.2. Giới thiệu khái quát về cây bắt ruồi ................................................... 5 2.2. Các yếu tố ảnh hƣởng lên sự ra hoa ngồi tự nhiên .................................. 6 2.2.1. Độ tuổi cây ......................................................................................... 7 2.2.2. Mơi trƣờng ........................................................................................... 7 2.2.2.1. Tình trạng dinh dƣỡng ................................................................... 7 2.2.2.2. Nhiệt độ ......................................................................................... 8 2.2.2.3. Quang kỳ ........................................................................................ 8 2.2.2.4. Hiện tƣợng xuân hĩa (hay sự thọ hàn) ......................................... 13 2.3. Các yếu tố ảnh hƣởng lên sự ra hoa in vitro ............................................. 15 2.3.1. Độ tuổi cây ......................................................................................... 16 vi 2.3.2. Dinh dƣỡng .......................................................................................... 16 2.3.2.1. Nồng độ đƣờng .............................................................................. 16 2.3.2.2. Hàm lƣợng photpho và nitơ .......................................................... 17 2.3.3. Các chất điều hịa sinh trƣởng ............................................................. 18 2.3.3.1. Cytokinins ...................................................................................... 18 2.3.3.2. Auxins ........................................................................................... 19 2.3.3.3. Gibberellins ................................................................................... 19 2.3.4. Các yếu tố khác ................................................................................... 20 2.4. Sự phát triển hoa in vitro ........................................................................... 22 2.5. Các nghiên cứu ra hoa in vitro .................................................................. 23 2.5.1. Trên thế giới ........................................................................................ 23 2.5.2. Trong nƣớc .......................................................................................... 24 Chƣơng 3: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 26 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu .............................................................. 26 3.2 Nội dung .................................................................................................... 26 3.3 Bố trí thí nghiệm ........................................................................................ 26 3.3.1 Nội dung 1: Khảo sát sự ra hoa in vitro của cây lan sị ........................ 27 Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của cƣờng độ ánh sáng đến sự tạo sị và ra hoa in vitro của cây lan sị. ............................................................. 26 Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của nồng độ GA3 đến sự ra hoa in vitro của cây lan sị trên mơi trƣờng cĩ và khơng cĩ bổ sung nƣớc dừa ................. 27 Thí nghiệm 3: Ảnh hƣởng của nồng độ BA đến sự tạo sị và ra hoa in vitro của cây lan sị. .................................................................................................. 28 3.3.2 Nội dung 2: Khảo sát sự ra hoa in vitro của cây bắt ruồi ............ 28 Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của nồng độ KH2PO4 đến sự ra hoa in vitro của cây bắt ruồi. .............................................................................................. 28 Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của nồng độ NH4NO3 đến sự ra hoa in vitro của cây bắt ruồi ................................................................................................ 29 3.4. Chỉ tiêu theo dõi ........................................................................................ 29 vii 3.4.1 Theo dõi khả năng tạo chồi và sinh trƣởng ......................................... 29 3.4.2 Theo dõi sự ra hoa ................................................................................ 29 3.5 Phƣơng pháp tiến hành ............................................................................... 30 3.5.1 Mơi trƣờng nuơi cấy ............................................................................. 30 3.5.2 Chuẩn bị mẫu cấy ................................................................................. 30 3.5.3 Điều kiện nuơi cấy ................................................................................ 30 3.5.4 Xử lý số liệu ......................................................................................... 30 Chƣơng 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN .............................................................. 31 Chƣơng 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................ 51 5.1. Kết luận ..................................................................................................... 51 5.2. Đề nghị ...................................................................................................... 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................ 52 PHỤ LỤC 1 PHỤ LỤC 2 viii DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 3.1: Các nghiệm thức thí nghiệm ảnh hƣởng của cƣờng độ ánh sáng đến sự tạo sị và ra hoa trên cây lan sị trong ống nghiệm .................................... 26 Bảng 3.2: Các nghiệm thức thí nghiệm ảnh hƣởng của nồng độ GA3 đến sự ra hoa in vitro ở cây lan sị trên mơi trƣờng cĩ và khơng cĩ bổ sung nƣớc dừa ................................................................................................ 27 Bảng 3.3: Các nghiệm thức thí nghiệm ảnh hƣởng của nồng độ BA đến sự tạo sị và ra hoa in vitro trên cây lan sị .................................................... 28 Bảng 3.4: Các nghiệm thức thí nghiệm ảnh hƣởng của nồng độ KH2PO4 đến sự ra hoa in vitro trên cây bắt ruồi ................................................................. 28 Bảng 3.5: Các nghiệm thức thí nghiệm ảnh hƣởng của nồng độ NH4NO3 đến sự ra hoa in vitro trên cây bắt ruồi. ................................................................. 29 Bảng 4.1. Ảnh hƣởng của cƣờng độ ánh sáng đến sự gia tăng số chồi của cây lan sị in vitro ........................................................................................... 31 Bảng 4.2. Ảnh hƣởng của cƣờng độ ánh sáng đến sự gia tăng lá của cây lan sị in vitro .......................................................................................... 32 Bảng 4.3. Ảnh hƣởng của nồng độ GA3 đến số chồi của cây lan sị in vitro trên mơi trƣờng cĩ và khơng cĩ bổ sung nƣớc dừa. ............................................. 34 Bảng 4.4. Ảnh hƣởng của nồng độ GA3 đến sự sinh trƣởng lá của cây lan sị in vitro trên mơi trƣờng cĩ và khơng cĩ bổ sung nƣớc dừa . ....... 36 Bảng 4.5. Ảnh hƣởng của nồng độ GA3 đến sự ra hoa in vitro của cây lan sị trên mơi trƣờng cĩ và khơng cĩ bổ sung nƣớc dừa ...................... 37 Bảng 4.6. Ảnh hƣởng của nồng độ BA đến sự gia tăng số chồi của cây lan sị in vitro ........................................................................................... 42 Bảng 4.7. Ảnh hƣởng của nồng độ BA đến sự gia tăng số lá của cây lan sị in vitro ........................................................................................... 42 Bảng 4.8. Ảnh hƣởng của nồng độ KH2PO4 đến sự sinh trƣởng chiều cao ix của cây bắt ruồi in vitro ........................................................................................ 45 Bảng 4.9. Ảnh hƣởng của nồng độ KH2PO4 đến sự ra hoa in vitro của cây bắt ruồi .................................................................................................... 46 Bảng 4.10. Ảnh hƣởng của nồng độ NH4NO3 đến sự sinh trƣởng chiều cao của cây bắt ruồi in vitro ........................................................................................ 47 Bảng 4.11. Ảnh hƣởng của nồng độ NH4NO3 đến sự ra hoa của cây bắt ruồi in vitro ........................................................................................ 48 x DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 4.1: Các giai đoạn phát triển của hoa lan sị in vitro ................................... 39 Hình 4.2: Hoa lan sị in vitro ................................................................................ 40 Hình 4.3: Những biểu hiện bất thƣờng của hoa lan sị in vitro ............................ 41 Hình 4.4: Ảnh hƣởng của BA trên sự tạo chồi và gia tăng số lá của cây lan sị in vitro ........................................................................................... 44 Hình 4.5: Các giai đoạn phát triển của hoa bắt ruồi in vitro ................................ 49 Hình 4.6: Cấu tạo hoa và các cơ quan bên trong của nụ hoa bắt ruồi in vitro ..... 50 B2 1 Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ Vịng đời của một thực vật bắt đầu từ hạt. Hạt nẩy mầm hình thành chồi và rễ. Cây phát triển sinh dƣỡng đến một giai đoạn nhất định thì ra hoa, thụ phấn và tạo hạt. Giai đoạn tạo hạt cũng chính là giai đoạn kết thúc một vịng sinh trƣởng và phát triển của thực vật và khi hạt nẩy mầm sẽ mở ra một vịng đời mới. Thế giới thực vật vơ cùng phong phú và đa dạng, cĩ những cây hồn thành vịng đời trên chỉ trong ba tháng đến một năm nhƣng cũng cĩ những cây phải mất đến vài năm. Do vậy, cùng với sự phát triển của cơng nghệ sinh học hiện đại, con ngƣời đã dần dần chuyển sang nhân giống cây trong ống nghiệm để rút ngắn vịng đời của thực vật, từ đĩ cĩ thể kiểm sốt hầu hết cơ chế của các quá trình diễn ra trong cuộc sống của thực vật. Việc nghiên cứu điều khiển thực vật ra hoa trong ống nghiệm cũng là một phần của mục đích trên. Nếu con ngƣời hiểu rõ cơ chế và cĩ thể điều khiển thực vật ra hoa trong ống nghiệm dễ dàng thì đây sẽ là một cơng cụ rất hữu ích trong việc nghiên cứu sinh lý thực vật; rút ngắn giai đoạn sinh trƣởng sinh dƣỡng ở các thực vật cĩ giai đoạn sinh trƣởng dài, làm cây ra hoa sớm; và một đĩng gĩp to lớn cho nơng nghiệp đĩ là xây dựng một hệ thống cĩ ý nghĩa trong vi nhân giống, cải thiện giống cây trồng, phục hồi các tính trạng quý, tạo cây cĩ năng suất cao, chất lƣợng tốt,… Hơn nữa, trong cuộc sống hiện đại mà hoa kiểng là một phần khơng thể thiếu của con ngƣời thì việc thƣơng mại hĩa hoa trong ống nghiệm rất cĩ tiềm năng phát triển trong tƣơng lai do hoa trong ống nghiệm cĩ nhiều ƣu điểm vƣợt trội nhƣ là nhỏ, gọn, khơng tốn diện tích, khơng tốn cơng chăm sĩc,…rất thích hợp để trang trí trong những văn phịng làm việc hiện đại cũng nhƣ làm quà tặng. 2 Cùng mục đích trên và đƣợc sự đồng ý của Bộ mơn Cơng nghệ sinh học trƣờng Đại học Nơng Lâm, dƣới sự hƣớng dẫn của TS.TRẦN THỊ DUNG, chúng tơi tiến hành đề tài nghiên cứu: KHẢO SÁT SỰ RA HOA TRONG ỐNG NGHIỆM Ở CÂY LAN SÕ (Dischidia pectinoides Pearson) VÀ CÂY BẮT RUỒI (Drosera burmannii Vahl) 1.2 MỤC ĐÍCH YÊU CẦU 1.2.1 Mục đích Khảo sát ảnh hƣởng của các yếu tố mơi trƣờng và điều kiện nuơi cấy thích hợp để cây lan sị và cây bắt ruồi ra hoa trong ống nghiệm. 1.2.2. Yêu cầu Theo dõi sự sinh trƣởng và phát triển của cây lan sị và cây bắt ruồi in vitro: - Trong mơi trƣờng nuơi cấy cĩ sự thay đổi nồng độ chất dinh dƣỡng và nồng độ chất kích thích sinh trƣởng. - Trong các điều kiện ánh sáng khác nhau. 3 Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 GIỚI THIỆU VỀ ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 2.2.1 Giới thiệu khái quát về cây lan sị  Nguồn gốc phân loại [15] Giới : Thực vật Giới phụ : Tracheobionta Ngành : Spermatophyta Ngành phụ : Magnoliophyta Lớp : Magnoliopsida Lớp phụ : Asteridae Bộ : Gentianales Họ : Asclepiadaceae Giống : Dischidia Tên khoa học : Dischidia pectinoides Pearson / Tên tiếng Việt : Lan sị Lan sị cĩ nguồn gốc từ Philippines, là một loại hoa kiểng mới tại Việt Nam.  Đặc điểm hình thái và sinh học [25] Lan sị là một loại dây leo nhỏ, sống hàng năm, cĩ khả năng phát triển đến chiều dài khoảng 250 cm. Lá đơn, mọc đối hoặc xen kẽ. Cây phân nhánh từ gốc và nách lá. Một số lá của lan sị phồng to lên trơng giống nhƣ một con sị. Hoa nhỏ màu đỏ hồng xuất hiện ở nách lá vào mùa xuân. Lan sị đƣợc trồng từ cây con in vitro hoặc từ các nhánh con cĩ rễ. Lan sị phát triển tốt trên các loại giá thể là dƣơng xỉ, vỏ cây bần, xơ dừa hoặc những nhánh cây gỗ trơi dạt,…khơng phát triển hoặc phát triển chậm trên giá thể là đất. Lan sị là cây ƣa bĩng râm, dƣới ánh nắng trực tiếp cĩ thể dẫn tới hiện tƣợng cháy sém lá, phát 4 triển tốt trong điều kiện ít ánh nắng mặt trời tốt nhất là ánh nắng nhẹ lúc sớm mai và lúc cuối buổi trƣa. Ngồi ra đây cũng là một loại cây nhạy cảm với nhiệt độ lạnh. Nhu cầu nƣớc của cây khơng cao, chỉ cần tƣới phun sƣơng cho cây 1-2 lần trong một tuần. Nguồn thức ăn của cây đƣợc tổng hợp từ khơng khí do vậy chỉ cần bổ sung thêm cho cây một lƣợng ít phân bĩn mỗi tháng một lần.  Một số loại lan sị [18, 33] Dischidia ovata: cĩ nguồn gốc từ Úc, đƣợc phát triển nhƣ là một loại thực vật trồng trong nhà, là một loại dây leo cĩ rễ bám cĩ khả năng phát triển đến chiều dài 2m. Lá hình oval, mọng nƣớc, màu nâu đỏ khi phát triển dƣới ánh nắng mặt trời. Khi lớn, cây cĩ những cụm hoa nhỏ màu đỏ hồng. Đây là loại cây ƣa bĩng râm, phát triển trong điều kiện khí hậu ẩm ƣớt. Cây đƣợc nhân giống bằng hạt tƣơi hoặc giâm cành. Cây giâm cành ở giai đoạn vƣờn ƣơm cần độ ẩm rất cao. Dischidia platyphylla: xuất xứ từ vùng đảo Philippine, dài khoảng 2m. Lá mọc đối; một vài lá nhỏ, màu xanh xám; hình oval. Hoa màu vàng sẫm cĩ thể lớn đến khoảng 4mm đƣờng kính, phát triển từ nách lá cĩ hình dạng nhƣ là bình chứa nƣớc. Nhân giống bằng hạt hoặc cành. Điều kiện thích hợp cho loại thực vật này phát triển là nhà kính cĩ độ ẩm và nhiệt độ cao, khí hậu mát mẻ. Dischidia nummularia: dài khoảng 3m, dạng dây leo bện chặt vào thân cây chủ. Lá màu xám bạc. Hoa nhỏ màu trắng dạng ống mọc thành cụm trịn đồng tâm cĩ một vịng lơng thƣa phía trong. Nhân giống sử dụng hạt hoặc nhánh trƣởng thành trong điều kiện ẩm ƣớt và khí hậu ấm áp. Dischidia imbricata: cĩ nguồn gốc từ vùng rừng mƣa của Malaysia cũng là một dạng dây leo, bám và phát triển rễ từ các nách lá bất cứ nơi nào tiếp xúc với giá thể để củng cố độ bám và bao phủ hầu nhƣ tồn bộ giá thể. Hoa của loại cây này cĩ dạng nhƣ là một cái bình trà nhỏ. Đây cũng là loại cây ƣa bĩng râm, phát triển tốt trong nhà kính cĩ nhiệt độ ấm áp và cĩ độ ẩm thích hợp. 5 2.1.2 Giới thiệu khái quát về cây bắt ruồi  Nguồn gốc phân loại [10] Giới : Thực vật Ngành : Magnoliophyta Lớp : Magnoliopsida Lớp phụ : Rosidae Bộ : Caryophyllales Họ : Droseraceae Giống : Drosera Tên khoa học : Drosera burmanni Vahl (1794) Tên tiếng Việt : Cây bắt ruồi, Trƣờng lệ Burman, Bèo đất, Trĩi gà Trong tự nhiên, họ bắt ruồi Droseraceae gồm cĩ 4 chi và khoảng 200 lồi, phân bố khắp thế giới. Phổ biến nhất là ở Mỹ. Ở Việt Nam, cây bắt ruồi đƣợc tìm thấy ở khu bảo tồn Bình Châu- Phƣớc Bửu, Đà Lạt và một vài nơi ở Miền Trung. Chúng chủ yếu mọc hoang dại, dọc đƣờng đi, ít đƣợc con ngƣời quan tâm.[3]  Đặc điểm hình thái và sinh học [1, 16, 19] Cây bắt ruồi (Drosera burmanni) là dạng cây cỏ nhỏ, sống nhất niên, bị sát đất. Thân ngắn, rễ giả. Lá hình hoa thị, mọc chụm ở mặt đất, cĩ cuống bụng, dạng trứng ngƣợc (đầu nhỏ ở phía cuống lá) hoặc dạng nêm, cuống nhỏ dài 10-15 mm, cĩ nhiều lơng tuyến ở phía trên. Lá cĩ thể sập lại đƣợc để bắt sâu bọ đậu vào lá. Cây sinh sản bằng hai hình thức hữu tính và vơ tính. Sinh sản vơ tính bằng cách nẩy chồi con từ gốc thân hay từ đỉnh sinh trƣởng. Sinh sản hữu tính bằng hạt. Cây cĩ hoa quanh năm. Hoa nhỏ màu trắng, vàng hoặc tím nằm trên một cuống chung dài mọc thẳng từ giữa đám lá thấp mang hoa lƣỡng tính gọi là phát hoa. Phát hoa cao khoảng 10 cm cĩ từ 3-10 hoa; hoa mẫu 5; 5 nhị hoa, ngắn hơn đài hoa; bầu nhị đơn, 5 vịi nhụy. Quả mỡ, chứa nhiều hạt nhỏ. Hệ thống lơng tuyến trên lá tiết ra nhiều chất keo rất nhầy. Khi những con cơn trùng nhỏ nhƣ ruồi, muỗi đậu vào lá, chúng sẽ bị dính chặt vào, lá từ từ cuộn mép 6 lại, đƣa con mồi vào giữa lá, sau đĩ dịch tiêu hĩa sẽ đƣợc tiết ra và con mồi dần dần bị tiêu hĩa. Cây bắt ruồi đƣợc nhân giống bằng hạt, tách chồi hoặc bằng cây con nuơi cấy in vitro. Mơi trƣờng phát triển cây bắt ruồi ngồi vƣờn ƣơm thích hợp là: ¾ đất mùn + ¼ cát, cát sạch hoặc cát trộn với bột than gỗ, độ ẩm khoảng 50-70%, nhiệt độ 18-240C, là loại cây ƣa ánh sáng nên cần nhiều ánh sáng trực tiếp và cây phải đƣợc chiếu sáng tối thiểu từ 6-8 h ngày. Ở nơi cĩ cƣờng độ ánh sáng cao cây phát triển tốt và cĩ màu đỏ.  Các loại cây bắt ruồi Drosera indica L. (gọng vĩ): lá hẹp và dài, mọc toả ra nhƣ gọng vĩ, cũng cĩ nhiều lơng nhày. Phân bố những vùng đất lầy, ruộng nghèo. [1] Drosera spatulata: cịn gọi là bắt ruồi lá hình thìa, là một lồi cây thân thảo với các lá hình thìa đƣờng kính 12-25 mm. Rễ chùm, đƣờng kính mỗi sợi rễ tới 0,2 mm. Hoa mọc thành chùm khoảng 2-30 hoa nhỏ, cuống hoa dài khoảng 2-30 cm, phủ đầy lơng. Các cánh hoa màu tím hồng. Hạt hình elip- trụ hoặc elip- trứng, màu từ nâu sẫm đến đen, dài 0,4 mm, đƣờng kính 0,06- 0,12 mm. Lồi bắt ruồi này phân bố chủ yếu ở châu Á, từ miền bắc Nhật Bản, tới Australia và New Zealand. [11] 2.2 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG LÊN SỰ RA HOA NGỒI TỰ NHIÊN [8] Trong suốt cuộc đời mình, cơ thể thực vật chịu nhiều biến đổi chất lƣợng đặc trƣng phù hợp với từng giai đoạn khác nhau của vịng đời. Ở thực vật cĩ hoa, sự ra hoa là bƣớc chuyển quan trọng đánh dấu bƣớc phát triển mới của thực vật và cĩ ý nghĩa quyết định đối với sự tồn tại của thực vật. Hoa đƣợc thành lập từ chồi ngọn hay chồi nách qua ba giai đoạn chính: chuyển tiếp ra hoa; tƣợng hoa; tăng trƣởng và nở hoa. Sự chuyển tiếp ra hoa Sự chuyển tiếp ra hoa gây nên các biến đổi sâu sắc của mơ phân sinh ngọn, từ mơ phân sinh dinh dƣỡng thành mơ phân sinh tiền hoa. Các biểu hiện đầu tiên của sự chuyển tiếp ra hoa khơng thấy đƣợc bằng mắt thƣờng, chỉ biết đƣợc bởi các phân tích tế bào học hay sinh hĩa học, với sự tăng mạnh hoạt tính biến dƣỡng (tổng hợp RNA, ribosom, protein), đặc biệt trong vùng đỉnh. Sự chuyển tiếp ra hoa xảy ra 7 đồng thời với sự biến đổi rất rõ của bộ máy dinh dƣỡng, đặc biệt là sự kéo dài lĩng thân do hoạt động mạnh của vùng dƣới ngọn của mơ phân sinh tiền hoa. Sự tƣợng hoa Sự chuyển tiếp ra hoa cần khoảng 2-3 ngày để dẫn tới sự tƣợng hoa, tức sự sinh cơ quan hoa (quan sát đƣợc dƣới kính hiển vi). Sự phát triển của các sơ khởi hoa nĩi chung xảy ra nhanh chĩng, làm chồi phồng lên thành nụ hoa (dễ thấy dƣới kính lúp, qua lát cắt dọc). Sự tăng trƣởng và nở hoa Khi sự tƣợng hoa hồn thành, nụ hoa cĩ thể tiếp tục tăng trƣởng và nở (trƣờng hợp các cây nhất niên). Tuy nhiên nụ hoa cĩ thể vào trạng thái ngủ (ví dụ: nụ hoa Lilas đƣợc tạo vào cuối mùa hè, nhƣng hoa chỉ nở vào mùa xuân nhờ nhiệt độ lạnh mùa đơng gỡ trạng thái ngủ).[8] 2.2.1 Độ tuổi cây [8] Sự ra hoa (phát triển hoa) là bƣớc chuyển quan trọng trong đời sống thực vật. Để một chồi dinh dƣỡng trở thành sinh sản, thực vật cần phải đạt tới trạng thái phát triển tối thiểu hay trƣởng thành ra hoa. Trạng thái này cĩ thể rất sớm ở Arachis (phát thể hoa thành lập ở nách tử điệp), khoảng 13 lĩng ở cà chua, 5-7 năm ở các cây ăn trái, và khoảng 50 năm ở cây sồi. Hơn nữa, vài thực vật cần mùa đơng hay quang kỳ thích hợp mới đạt tới trạng thái này. Tùy theo các lồi thực vật khác nhau mà cĩ chu kỳ phát triển khác nhau, từ hột tới hột, trong vịng vài tháng tới vài năm, thậm chí ở một số cây chỉ khoảng 15 ngày nhƣ vài cây vùng sa mạc. 2.2.2 Mơi trƣờng 2.2.2.1 Tình trạng dinh dƣỡng [8] Mỗi thời kỳ sinh trƣởng và phát triển của thực vật cĩ nhu cầu dinh dƣỡng khác nhau. Trong thời kỳ ra hoa cây cần nhu cầu dinh dƣỡng khơng nhiều nhƣng phải cân đối. Lƣợng dinh dƣỡng phải đảm bảo nằm trong giới hạn cho phép: Giới hạn trên: là giới hạn mà ở đĩ sự phát triển dinh dƣỡng chiếm ƣu thế. Giới hạn dƣới: là giới hạn mà dƣới đĩ, dinh dƣỡng khơng đủ cho sự ra hoa. 8 Vì vậy, trong thực tế sự tỉa cành thích hợp sẽ kích thích mạnh sự phát triển hoa. Thơng thƣờng, sự dinh dƣỡng nhiều đạm kích thích sự phát triển dinh dƣỡng và ngƣợc lại, sự dinh dƣỡng giàu carbon kích thích sự ra hoa. Do đĩ, việc lựa chọn tỉ lệ C/N cao thích hợp sẽ kích thích sự ra hoa, nếu tỉ lệ này thấp sẽ làm cây phát triển sinh dƣỡng cao, nếu tỉ lệ này quá cao hoặc quá thấp sẽ ức chế sinh trƣởng của thực vật. Tĩm lại, cĩ nhiều yếu tố dinh dƣỡng ảnh hƣởng tới sự ra hoa, tuy nhiên quan trọng nhất là: sự cạnh tranh giữa phát triển dinh dƣỡng và phát triển sinh sản, sự thiếu dinh dƣỡng nhẹ (trên mức tối thiểu), và cân bằng C/N. 2.2.2.2 Nhiệt độ [1] Nhiệt độ mơi trƣờng cũng ảnh hƣởng đến sự ra hoa trong đĩ cĩ nhiệt độ thực tại và tổng tích ơn. Nhiệt độ thực tại: mỗi thực vật thƣờng cĩ một nhiệt độ thích hợp để ra hoa. Tổng tích hàn: một số thực vật khơng phụ thuộc vào nhiệt độ thực tại mà phụ thuộc vào tổng nhiệt độ tích luỹ đƣợc trong suốt giai đoạn sinh trƣởng. Khi đạt đƣợc một tổng nhiệt độ thích hợp thì trổ hoa. 2.2.2.3 Quang kỳ [8] Quang kỳ là sự xen kẽ giữa sáng và tối trong giai đoạn 24 giờ (trong thực nghiệm, giai đoạn này cĩ thể dài hoặc ngắn hơn), và quang kỳ tính (quang chu kỳ) là phản ứng của thực vật đối với quang kỳ tức là đối với sự biến thiên theo mùa của độ dài ngày. Độ dài ngày là một yếu tố quan trọng để điều khiển thời gian ra hoa. Đã cĩ nhiều thí nghiệm chứng minh rằng độ dài ngày cĩ ảnh hƣởng sâu sắc đối với sự ra hoa của thực vật. Thí nghiệm của Tournois (1912, Pháp) lần đầu tiên chứng minh cây gai dầu cĩ khả năng ra hoa, trong nhà kính, nếu giai đoạn chiếu sáng đƣợc rút ngắn. Năm 1913, Klebs trên ví dụ của cây cỏ trƣờng sinh (Sempervivum) đã chỉ ra rằng cĩ thể làm cây ra hoa vào mùa đơng bằng cách chiếu ánh sáng bổ sung. 9 Garner và Allard (1920, Mỹ) thực hiện một hệ thống các thí nghiệm trên loại thuốc lá ra hoa vào mùa thu: Maryland mammoth. Bằng cách thay đổi nhiệt độ và quang kỳ (thay đổi chiều dài ngày và đêm), họ kết luận, ở thứ thuốc lá này, khơng phải nhiệt độ mà chính là quang kỳ ảnh hƣởng tới sự ra hoa: cây chỉ ra hoa nếu chiều dài ngày dƣới 13-14 giờ. Đây là cây ngày ngắn (CNN), giống nhƣ cây gai dầu. Nhƣ vậy, khi đạt tới tuổi trƣởng thành, nhiều thực vật phải chờ một dấu hiệu nào đĩ để tƣợng hoa, mà quan trọng nhất là quang kỳ. Dựa theo những quan sát và phân tích cách đáp ứng của thực vật đối với quang kỳ, ngƣời ta phân biệt cây theo quang kỳ nhƣ sau:  Cây bất định (CBĐ): cĩ thể ra hoa bất chấp quang kỳ, miễn là giai đoạn sáng cho phép quang hợp đủ. Đặc trƣng cho các loại thực vật thuộc nhĩm này là: cà chua, đậu Hà lan, phần lớn các thứ thuốc lá, bắp, Lilas, anh đào,…  Cây ngày ngắn (CNN): chỉ cĩ thể ra hoa nếu giai đoạn sáng ngắn hơn một giai đoạn sáng tới hạn C và giai đoạn tối dài hơn giai đoạn tối tối thiểu; giai đoạn tối khơng đƣợc gián đoạn (sự chiếu sáng trong giai đoạn tối, dù chỉ vài phút, sẽ cản sự ra hoa). Các cây tiêu biểu cho nhĩm này là: gai dầu, đậu nành, tía tơ, thƣợc dƣợc,…  Cây ngày dài (CND): chỉ cĩ thể ra hoa nếu giai đoạn sáng dài hơn giai đoạn sáng tới hạn C. Ví dụ: rau bi na cĩ C = 13-14 giờ, thì là: 11-14 giờ. Trong nhĩm này cịn cĩ: hành, cà rốt, cải đƣờng, sà lách, thuốc phiện, lúa mạch… Ngồi các nhĩm cây nêu trên, cịn một số cây khơng lệ thuộc quá chặt chẽ vào quang kỳ: trong quang kỳ thích hợp, chúng ra hoa nhanh chĩng; trong quang kỳ khơng thích hợp, chúng vẫn ra hoa nhƣng chậm hơn. Đĩ là các cây thích ngày ngắn (vài thứ cúc, Cosmos, Euphorbia), hay các cây thích ngày dài (lúa mì, lúa mạch đen mùa xuân). Hiếm hơn, một vài lồi cĩ thể ra hoa trong đêm tối liên tục nhƣ huệ dạ hƣơng từ giị, khoai tây từ chồi trên củ. Một số cây cĩ đồng thời hai giá trị tới hạn: một trên và một dƣới. Đây là các cây ngày dài- ngày ngắn hay cây ngày ngắn- ngày dài. 10 Vậy quang kỳ tác động lên cây nhƣ thế nào? Theo quan điểm của Allard và Garnar (1920) thì cây đáp ứng với các chiều dài tƣơng đối của ngày và đêm. Hanner và Bonner (1938) đã chứng minh rằng ở một số cây ngày ngắn Xanthium (C=15,5 giờ): cây khơng đáp ứng với chiều dài ngày cũng nhƣ chiều dài tƣơng đối của ngày và đêm, mà đáp ứng với chiều dài của giai đoạn tối, chính giai đoạn tối mới quan trọng. Các nhà nghiên cứu trong những năm 40 của thế kỷ XX đã phát hiện rằng sự ra hoa và các phản ứng khác đối với quang kỳ thực chất là do độ dài đêm chứ khơng phải do độ dài ngày kiểm sốt. Thực nghiệm cho thấy thực vật đƣợc gọi là ngày ngắn cần cĩ đêm tối liên tục. Nếu giai đoạn tối bị ngắt quãng bởi những cƣờng độ chiếu sáng thấp chỉ khoảng 3-5 lux trong thời gian 3-5 phút ở 7-9 giờ sau khi bắt đầu giai đoạn tối cĩ thể đảo ngƣợc phản ứng ra hoa của cây. Ngƣợc lại, nếu giai đoạn sáng của cây ngày dài bị ngắt quãng bởi sự che tối thì điều này hồn tồn khơng gây ảnh hƣởng tới khả năng ra hoa của cây ngày dài [2,8] Năm 1936, B.S. Moskov và M.K. Tsailakhian chứng minh rằng cơ quan tiếp nhận cảm ứng quang kỳ là lá. Những cành khơng cĩ lá khơng ra hoa mặc dầu cĩ tác động của quang kỳ thích hợp. Sự tác động của quang kỳ dù chỉ trên một lá cũng đủ để hình thành mầm hoa. Các lá non đã nở ra hồn tồn mẫn cảm nhất. Tác nhân kích thích đƣợc hình thành trong lá dƣới ảnh hƣởng của quang kỳ thích hợp di chuyển vào điểm sinh trƣởng. Sau một số lƣợng chu kỳ cảm ứng nhất định cây mới ra hoa trong mọi chu kỳ quang. Tùy thuộc vào kiểu thực vật mà số lƣợng các chu kỳ cảm ứng khác nhau. Cĩ những lồi chỉ địi hỏi một chu kỳ quang, song cũng cĩ những lồi cần đến 25 chu kỳ quang (đậu tƣơng). [8] Vào năm 1865, Sachs phát hiện ra rằng những lá cây để ngồi sáng sản xuất ra những chất hình thành hoa, chúng hiện diện ở hàm lƣợng rất nhỏ nhƣng đĩng vai trị tiên phong trong sự ra hoa. Đến năm 1936, Chailakhyan đã nhận thấy ở cây Xanthium chỉ cần đặt một lá trong ngày ngắn (che tối), phần cây cịn lại trong ngày dài, cây cĩ thể ra hoa ở những vị trí khác nhau. Lá là nơi nhận cảm ứng và chồi là nơi phản ứng ra hoa, do đĩ phải cĩ sự vận chuyển kích thích từ lá tới chồi [7] . Kích thích ấy cĩ dấu hiệu hormon và đƣợc ơng gọi là florigen – hormon ra hoa. 11 Giả thuyết về florigen đã đƣợc làm sáng tỏ qua việc tiến hành các thí nghiệm ghép: cĩ sự truyền kích thích quang kỳ qua chỗ ghép, để kích thích sự ra hoa của cành khơng đƣợc cảm ứng. Hơn nữa, chất trích từ cây ngày ngắn Xanthium hay cây bất định hƣớng dƣơng, đang ra hoa, nếu đƣợc chích vào cây Xanthium chƣa đƣợc cảm ứng quang kỳ, cĩ thể kích thích cây Xanthium này ra hoa. Từ các kết quả nhƣ vậy, ngƣời ta cho rằng: florigen là hormon chuyên biệt cho sự ra hoa, cĩ tính phổ biến ở thực vật và khơng cĩ tính hữu cực. Nhƣ vậy, cây chỉ ra hoa khi nào tích lũy đủ lƣợng florigen cần thiết cho sự ra hoa dƣới tác dụng của quang kỳ.[8] Các thí nghiệm trên đã dẫn tới kết luận về sự tồn tại của hormon đặc hiệu chuyên biệt gây ra sự chuyển cây sang trạng thái ra hoa. Vì sự chuyển sang trạng thái ra hoa cĩ thể do sự ghép lá lấy từ cây đang ra hoa gây nên tùy thuộc vào phản ứng chu kỳ quang của nĩ, ngƣời ta giả định hormon đĩ giống nhau đối với tất cả các lồi cây. Tuy nhiên, quan điểm đĩ đã bị lung lay một ít vì đã cĩ thí nghiệm trong đĩ xử lí hormon GA làm cho thực vật ngày dài ra hoa ở điều kiện ngày ngắn và khơng gây ảnh hƣởng gì đối với cây ngày ngắn [8]. Chailakhyan (1936- 1977) đã đƣa ra giả thuyết chất tạo hoa cĩ chứa hai thành phần gồm: gibberellin và anthesin để hĩa giải mâu thuẫn này. Theo ơng tùy lồi thực vật mà một trong hai thành phần của florigen luơn luơn hiện diện đầy đủ trong mọi cơ quan thực vật, thành phần thứ hai chỉ đƣợc tạo ra trong điều kiện quang kỳ cảm ứng. Một thực vật trƣởng thành ra hoa khi hội đủ hai thành phần này. Quang kỳ và số chu kỳ cảm ứng thay đổi theo lồi là để điều chỉnh tỉ lệ giữa hai thành phần này (gibberellin/ anthesin) ở mức độ thích hợp từ đĩ kích thích cây ra hoa. [8] Những thí nghiệm trên đây đã khẳng định sự hiện diện của florigen nhƣng bản chất và cơ chế tác động thực sự của florigen đối với sự hình thành ra hoa của cây vẫn cịn là một bí ẩn lớn đối với các nhà khoa học. Gần đây, với tiến bộ về phƣơng pháp phân tích với độ nhạy cao cĩ thể phát hiện sự hiện diện của những hợp chất ở những nồng độ rất nhỏ đã mở ra hy vọng tìm ra florigen. Kết quả phân tích cho thấy, ngoại trừ đƣờng, trong libe cịn chứa những phân tử nhỏ, peptide, protein (Fisher và ctv, 1992; Sakuth và ctv, 1993; Marentes và Grusak, 1998; Xoconostle- 12 Cazares và ctv, 1999; Kehr và ctv, 1999), và acid nucleic (Kühn và ctv, 1997; Ruiz- Medrano và ctv, 1999). Vì vậy florigen cũng cĩ thể đƣợc dự đốn là một peptide, 1 protein, 1 nucleic acid, hay 1 phân tử nhỏ. Vì vậy chỉ cĩ những phân tích về thành phần của nhựa libe một cách tỉ mỉ hơn mới cĩ thể trả lời chính xác thành phần tự nhiên của florigen là gì và đây cũng là nhiệm vụ của cơng nghệ sinh học thực vật trong tƣơng lai. [14,24] Năm 1935, Flint và Mcalister thấy rằng sự nẩy mầm của hạt cải xà lách đƣợc kích thích bởi ánh sáng đỏ nhƣng bị cản bởi ánh sáng đỏ xa (Fr). Năm 1946, Borthwick và Hendricks chứng minh hiệu ứng đối nghịch của R (660nm) và Fr (730nm) trên sự ra hoa Xanthium pennsylvanicu. Năm 1952, Borthwick và Hendricks lặp lại thí nghiệm của Flint và Mcalister và nhận thấy rằng hiệu ứng ánh sáng cĩ những đặc tính giống nhau trên hai hiện tƣợng nẩy mầm và ra hoa và hai ơng nhận định rằng: do yêu cầu thấp về năng lƣợng nên khơng thể cĩ hai sắc tố mà đơn giản hơn chỉ cĩ hai dạng dễ biến đổi qua lại của cùng một sắc tố họ gọi là phytochrom gồm cĩ dạng Pfr (hoạt động) đƣợc sinh ra dƣới hiệu ứng của R qua con đƣờng quang hĩa cĩ tác dụng kích thích nẩy mầm hay cản ra hoa, và dạng Pr (khơng hoạt động) đƣợc sinh ra dƣới hiệu ứng của Fr. Từ đây xuất hiện hai thuyết về hoạt động của phytochrom đối với quá trình ra hoa của thực vật là thuyết “đồng hồ cát” và thuyết “đồng hồ sinh học”. Tuy nhiên, hai thuyết này chƣa thuyết phục bởi chƣa giải thích đƣợc một số trƣờng hợp đối với các lồi thực vật khác. Gần đây, ngƣời ta hƣớng sang xem xét đến nhiều yếu tố mơi trƣờng sung quanh. Các yếu tố mơi trƣờng cĩ thể tác động trực tiếp hoặc gián tiếp trên sự ra hoa: quang kỳ đƣợc nhận bởi lá trƣởng thành, nhiệt độ bởi cả thực vật (riêng sự thọ hàn đƣợc nhận chủ yếu bởi ngọn chồi), nƣớc bởi hệ thống rễ,…Các yếu tố này tƣơng tác mạnh trong sự ra hoa, và mỗi yếu tố cĩ thể làm thay đổi giá trị ngƣỡng của những yếu tố khác. Sự điều hịa chuyển tiếp ra hoa bằng tín hiệu mơi trƣờng cĩ ảnh hƣởng quan trọng đảm bảo cho sự ra hoa đồng loạt và giao phối cùng lồi của hầu hết các lồi thực vật, hồn tất sự sinh sản hữu tính dƣới các điều kiện bên ngồi thích hợp. 13 Cho đến nay cơ chế của sự ra hoa trên thực tế vẫn chƣa đƣợc hiểu rõ và vẫn cịn gây nhiều thắc mắc tranh cãi đối với những ngƣời làm nghiên cứu khoa học. Tuy nhiên, những thí nghiệm trên đây đã phần nào hé mở và đƣa ra những hƣớng đi mới để chúng ta cĩ thể đi sâu nghiên cứu một cách rõ ràng hơn nữa cơ chế và các yếu tố ảnh hƣởng trên sự ra hoa ở thực vật. 2.2.2.4 Hiện tƣợng xuân hĩa (hay sự thọ hàn) [8] Hiện tƣợng xuân hĩa ở thực vật là hiện tƣợng cảm ứng thực vật nẩy chồi hoặc ra hoa bằng xử lý nhiệt độ lạnh (cây chỉ ra hoa sau khi trải qua một giai đoạn nhiệt độ lạnh nhất định) đặc biệt là thực vật ơn đới. Điều này đã đƣợc chứng minh qua thí nghiệm của Lyssenko (1928) trên giống lúa mì Triticum sativum. Đây là giống lúa mì gồm hai thứ: thứ mùa đơng hạt gieo vào mùa thu, cây mầm trải qua mùa đơng và tăng trƣởng trong mùa xuân, sau đĩ cây ra hoa vào mùa hè năm sau; thứ mùa xuân hạt đƣợc gieo vào mùa xuân, cây tăng trƣởng và ra hoa trong mùa hè (cây mầm khơng chịu đƣợc mùa đơng). Nhƣ vậy, thứ mùa đơng phải trải qua nhiệt độ lạnh mùa đơng mới cĩ thể cho hoa, nếu gieo vào mùa xuân, cây vẫn ở trạng thái dinh dƣỡng và khơng cho hoa trong mùa hè. Trên cơ sở đĩ, Lyssenko đã tiến hành thí nghiệm nhƣ sau: ơng đã cho làm ẩm hạt thứ mùa đơng (tới 50% trọng lƣợng khơ), sau đĩ đặt hạt trong phịng lạnh (1-200C), trong một tháng, thì các hạt này cĩ thể gieo trong mùa xuân, và cây ra hoa nhƣ thứ mùa xuân với năng suất cao. Với kỹ thuật này, cây khơng cần qua mùa đơng và ngƣời nơng dân khơng phải làm việc vất vả. Đĩ là kỹ thuật thọ hàn hay xuân hĩa do Lyssenko đề ra và đặt tên, và đã đƣợc áp dụng trên hàng triệu hecta, từ năm 1935, ở Liên Xơ. Nhƣ vậy, dựa vào yêu cầu của sự thọ hàn cĩ thể phân thực vật ra làm 3 loại: Cây cần thọ hàn tuyệt đối (thƣờng cĩ dạng hoa hồng): phải trải qua một thời gian nhiệt độ lạnh mới ra hoa thƣờng là cây hai năm ( cải đƣờng, cà rốt,…); cây nhiều năm (Lolium, Dactylis glomerata,…);… Cây cần thọ hàn khơng bắt buộc (ra hoa sớm hơn nếu đƣợc thọ hàn): lúa mạch đen Petkus ra hoa khi cĩ 7 lá nếu hạt đƣợc thọ hàn, nhƣng cần 16-25 lá nếu khơng đƣợc thọ hàn. 14 Cây khơng cần thọ hàn: cây một năm khơng qua mùa đơng, cây đa niên tƣợng hoa trƣớc mùa đơng. Cơ quan để cây tiếp nhận kích thích của nhiệt độ thấp là phơi hay chồi. Nhiệt độ thấp là yếu tố khởi động hoạt tính phân sinh của phơi hay chồi và làm cho tất cả các chồi xuất phát từ đĩ cũng đƣợc xuân hĩa. Ngồi ra cũng cĩ một số thí nghiệm cho thấy rằng đỉnh sinh trƣởng cũng là nơi tiếp nhận xử lý lạnh. Nếu ghép đỉnh sinh trƣởng của cây đã xuân hĩa vào cây chƣa xuân hĩa thì sẽ xảy ra phản ứng ra hoa y nhƣ chúng đã đƣợc xuân hĩa. Tuy nhiên cho đến lúc này thì cơ chế của quá trình xuân hĩa vẫn chƣa đƣợc hiểu đầy đủ. [2] Tùy theo loại cây mà độ tuổi mẫn cảm với xuân hĩa của thực vật cĩ khác nhau. Ở ngũ cốc giai đoạn hiệu quả nhất là lúc nẩy mầm, thậm chí ở giai đoạn bảo quản hạt giống. Ở các thực vật khác thì giai đoạn mẫn cảm nhiệt độ sảy ra ở một thời kỳ sinh trƣởng của cây: giai đoạn cây con, giai đoạn trải lá bàng (bắp cải). Chính vì vậy mà những cây hai năm thì cần một mùa đơng cây sinh trƣởng trong điều kiện nhiệt độ thấp. Năm 1948, Melchers và Lang đã tiến hành thí nghiệm ghép giữa cây hai năm khơng thọ hàn và cây hai năm đã thọ hàn, cho thấy kích thích ra hoa. Từ đây đã xuất hiện quan niệm về hormon xuân hĩa đặc hiệu gọi là “vernalin” đƣợc truyền qua chỗ ghép và khơng đặc hiệu cho lồi. Vậy bản chất của “vernalin” là gì? Sự thọ hàn thƣờng đi cặp với sự gia tăng gibberellin, nhĩm chất làm dễ sự ra hoa ở vài lồi hoa hồng. Các chất cản sinh tổng hợp gibberellin đàn áp hiệu ứng thọ hàn. Tuy nhiên, giả thuyết vernalin là gibberellin là khĩ chấp nhận vì gibberellin chỉ giúp sự kéo dài lĩng ở các thực vật mà các lĩng ngắn là sự cản trở duy nhất của sự ra hoa và gibberellin vẫn kích thích ra hoa ở một số cây hai năm khi khơng trải qua xử lý lạnh. Vậy cũng giống florigen, gibberellin khơng thể là vernalin - hormon xuân hĩa mà chỉ cĩ thể là hormon hoạt tính của vernalin. Trong cây tồn tại chất mà biến đổi thành tiền chất của vernalin trong điều kiện lạnh, sau đĩ tiền chất này biến đổi thành vernalin và ở nhiệt độ ấm áp, nĩ quay trở lại chất ban đầu. Do đĩ trong một số 15 trƣờng hợp điều kiện mơi trƣờng khơng thuận lợi đặc biệt là nhiệt độ cao sẽ xảy ra hiện tƣợng phản xuân hĩa. [2,8] Việc hiểu biết ảnh hƣởng của nhiệt độ thấp hay hiện tƣợng xuân hĩa đến sự phát triển của cây cĩ ý nghĩa trong sản xuất. Bằng biện pháp xử lý nhiệt độ thấp thích hợp, ngƣời ta cĩ thể biến lúa mì đơng thành lúa mì xuân, biến cây hai năm thành cây một năm. Hơn nữa, với hầu hết các loại cây trồng, việc xử lý nhiệt độ thấp hoặc bảo quản nhiệt độ thấp cho hạt giống, củ hoặc căn hành sẽ làm tăng khả năng rút ngắn thời gian sinh trƣởng, xúc tiến sự ra hoa nhanh và làm tăng năng suất, phẩm chất thu hoạch. [2] 2.3 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG LÊN SỰ RA HOA IN VITRO Ngay từ khi ra đời ngành cơng nghệ sinh học nhất là cơng nghệ sinh học thực vật đã cĩ những đĩng gĩp to lớn trong lĩnh vực nơng nghiệp, gĩp phần cải thiện đáng kể sản lƣợng lƣơng thực, thực phẩm đồng thời bảo tồn và gĩp phần làm phong phú thêm hệ thực vật trên trái đất. Cơng nghệ nuơi cấy mơ tế bào thực vật cĩ vai trị đáng kể trong những thành quả đã đạt đƣợc ở trên thơng qua việc nghiên cứu sinh lý các quá trình sinh trƣởng và sinh sản của thực vật. Hiện nay, việc nghiên cứu sinh lý thực vật đƣợc tập trung ở thời kỳ cuối trong vịng đời của thực vật đĩ là giai đoạn ra hoa. Khả năng hình thành hoa in vitro của mẫu cấy phụ thuộc vào nhiều yếu tố bên trong và bên ngồi, hố học và vật lý nhƣng thật sự thì các yếu tố trên đều cĩ ảnh hƣởng qua những con đƣờng rất phức tạp và khơng thể xác định đƣợc (Trần Thanh Vân ,1973; Trần Thanh Vân và ctv, 1974; Scorza và Janick, 1980; Croes và ctv, 1985; Lang, 1987; Compton và Vielleux, 1992). Sự ra hoa đƣợc xem là một quá trình điều hồ phức tạp bởi sự phối hợp của các yếu tố mơi trƣờng và di truyền (Tisserat và Galletta, 1995). Những yếu tố đặc biệt quan trọng là độ tuổi, dinh dƣỡng, chất điều hồ sinh trƣởng, ánh sáng và pH của mơi trƣờng nuơi cấy (Heylen và Vendrig, 1988). [38] 16 2.3.1 Độ tuổi cây Trong điều kiện in vitro, cây cĩ thể ở trạng thái phát triển sinh dƣỡng mãi mãi mà khơng cần hồn thành vịng đời nhƣ trong điều kiện in vivo. Tuy nhiên, đối với giai đoạn ra hoa, cả cây in vitro lẫn cây in vivo đều phải hội đủ các yếu tố cần thiết mới hình thành hoa hay nĩi cách khác thực vật phải trải qua giai đoạn sinh trƣởng sinh dƣỡng, đạt đến một giai đoạn trƣởng thành nhất định thì mới ra hoa. Thực vật cịn non khơng ra hoa vì chúng chƣa cĩ khả năng ra hoa hoặc đỉnh sinh trƣởng khơng đáp ứng với nhân tố tạo hoa (Lang, 1965; Hackett, 1985). Ở đây, độ tuổi của mẫu cấy ban đầu cĩ thể cĩ hoặc khơng ảnh hƣởng nhƣ là một yếu tố cần thiết cho sự ra hoa của cây in vitro. Demeulemeester và Deproft (1999) báo cáo rằng độ tuổi của cây mẹ cĩ khả năng ảnh hƣởng lên sự ra hoa in vitro ở cây rau diếp xoăn. Tƣơng tự, ở cây hoa hồng, G. Y. Wang+ và cộng sự cũng nhận thấy cây mẹ hoa hồng cịn trẻ và khỏe mạnh sẽ làm tăng sức sống và sự đồng đều của mẫu cấy trƣớc khi đƣa vào mơi trƣờng cảm ứng tạo hoa. Hơn nữa, thời gian của giai đoạn tiền nuơi cấy cũng ảnh hƣởng mạnh tới khả năng tạo hoa của cây hoa hồng sau khi đƣợc đƣa vào mơi trƣờng cảm ứng. Ví dụ: nếu mẫu cấy hoa hồng đƣợc nuơi cấy 45 ngày trƣớc khi đƣa vào mơi trƣờng cảm ứng thì tỉ lệ hình thành hoa rất cao (49,2%), trong khi mẫu đƣợc nuơi cấy khoảng 25 hoặc 60 ngày trƣớc khi cảm ứng cho tỉ lệ hoa thấp hơn nhiều (5,9% và 9,2%). Đối với cây đậu xanh (Pisum sativum), tỉ lệ hoa tăng sau khi cấy chuyền lần hai, tỉ lệ hoa giảm và mất khả năng ra hoa sau lần cấy chuyền thứ ba trở đi. Trái lại, đối với cây cẩm chƣớng, các mẫu cấy dù đã trải qua trên bốn lần cấy chuyền mẫu cấy vẫn cho tỉ lệ hình thành hoa cao (Daksha et al, 1994). Cho đến nay vẫn chƣa cĩ báo cáo rõ ràng nào về sự ảnh hƣởng của độ tuổi mẫu cấy đối với sự ra hoa của cây trong điều kiện in vitro. [21,22] 2.3.2 Dinh dƣỡng 2.3.2.1 Nồng độ đƣờng Đƣờng cần thiết cung cấp nguồn cacbon trong mơi trƣờng nuơi cấy để cảm ứng sự ra hoa và phát triển hoa (Steinberg 1950; Takimoto 1960; Kimura 1963; Loo 1964b; Paulet 1965; Margara và Touraud 1968; Nitsch 1972; Dien và Tran Thanh 17 Van 1974; Handro 1977). Các loại đƣờng sucrose, glucose, maltose, lactose và raffinose đã đƣợc sử dụng thành cơng (Margara và Rancillac 1966; Nitsch và Nitsch 1967) trong đĩ sucrose là loại đƣờng thƣờng đƣợc sử dụng trong nuơi cấy in vitro nhất. Nồng độ đƣờng tối ƣu cho sự ra hoa khác nhau giữa các lồi. Hiệu quả tác động của đƣờng hịa tan thể hiện thơng qua việc tăng cƣờng hoạt động của con đƣờng trao đổi chất pentose phosphate (Nitsch và Nitsch 1967). Ngồi ra, hiệu quả của việc sử dụng đƣờng cũng chịu ảnh hƣởng của ánh sáng và sự xuân hĩa trong tác động riêng biệt của chúng (Liverman và Bonner 1953; Baldev 1959; Pierik 1967b). [9] 2.3.2.2 Hàm lƣợng photpho và nitơ [1,22] Nhƣ chúng ta đã biết, nitơ là thành phần cơ bản của chất nguyên sinh trong tế bào, quyết định sự sinh trƣởng của cây. Ngồi ra, nitơ cịn là thành phần cấu tạo của enzyme và diệp lục tố. Sự dinh dƣỡng giàu nitơ giúp cây phát triển sinh dƣỡng mạnh, cây cao lớn, lá xanh tốt; thiếu nitơ, lá nhỏ, vàng úa, cây cằn cỗi, phát triển chậm và ra hoa sớm. Trong nuơi cấy mơ, nitơ đƣợc cung cấp thống qua các các muối nitrat (NO3 - )và muối amon (NH4 + ). Ngồi nitơ, phospho cũng là yếu tố khơng thể thiếu cho cây, cĩ vai trị quan trọng trong tổng hợp nucleoprotein của nhân tế bào, vận chuyển năng lƣợng, tham gia vào cấu trúc màng, thúc đẩy sự phát triển rễ và làm cây phát dục nhanh. Do vậy, trong nghiên cứu ra hoa in vitro, mơi trƣờng thƣờng đƣợc sử dụng là mơi trƣờng ½ MS hoặc kết hợp giảm lƣợng nitơ và tăng lƣợng phospho. Điều này đã đem lại những kết quả đáng kể trong các nghiên cứu ra hoa in vitro. Ví dụ: ở cây Torenia, nếu loại bỏ NH4NO3 trong mơi trƣờng sẽ làm tăng cƣờng sự biệt hĩa nụ hoa của mẫu cấy trên mơi trƣờng MS (Tanimoto và Harada, 1981); ở cây đậu xanh, khi giảm nồng độ NH4NO3 trong mơi trƣờng MS cịn 8,25g/ml thì tỉ lệ ra hoa cao nhất là 4,2 hoa/ chồi; ở Cymbidium và Ornithogalum nồng độ phospho cao kích thích sự ra hoa của cây; sự gia tăng lƣợng phospho gấp 2 lần trong mơi trƣờng ½ MS (giảm N) làm cải thiện đáng kể tỉ lệ ra hoa của cây Brassica [30] 18 2.3.3 Các chất điều hịa sinh trƣởng Khi thực vật đạt đƣợc độ tuổi nở hoa, các yếu tố mơi trƣờng nhƣ nhiệt độ, ánh sáng và chất dinh dƣỡng cĩ ảnh hƣởng đáng kể đến sự hình thành và biệt hĩa chồi hoa (Lang, 1952; Salisbury, 1961; Evans, 1971). Những ảnh hƣởng này đƣợc thực vật cảm nhận gián tiếp thơng qua các chất cĩ tác dụng kích thích hay ức chế sự nở hoa tồn tại trong cơ thể chúng. Qua nhiều nghiên cứu cho thấy sự nở hoa dƣờng nhƣ là kết quả của sự tƣơng tác giữa các chất điều hịa sinh trƣởng thực vật nhƣ cytokinin, auxin, gibberellin, ethylene, acid abscisic (ABA) và những chất khác đã biết hoặc chƣa biết (Raghavan và Jacobs, 1961; Bernier và ctv, 1977; Wellensiek, 1977). Điều này càng thể hiện rõ hơn trong các nghiên cứu ra hoa trong ống nghiệm và các chất điều hịa sinh trƣởng thể hiện rõ vai trị quan trọng của mình. [9] 2.3.3.1 Cytokinins Cytokinin là một trong các chất điều hịa sinh trƣởng bắt buộc đƣợc sử dụng trong điều khiển ra hoa in vitro do cĩ vai trị kích thích sự phân chia tế bào và hình thành cơ quan, tạo chồi và tăng trƣởng nụ nách thơng qua tác dụng của quá trình sinh tổng hợp các yếu tố tăng trƣởng [2,20]. Ngồi ra, cytokinin cịn thúc đẩy một số thực vật bậc cao chuyển sang giai đoạn sinh sản trong điều kiện in vitro (Dickens và Staden, 1988; Paek và ctv, 1989; Wang và ctv, 1993, 1997; Jumin và Nito, 1996; Jumin và Ahmad 1999). Cytokinin cần thiết cho sự sinh trƣởng và phát triển của nụ hoa đƣợc báo cáo ở cả cây một lá mầm (Mohanram và Batra, 1970; Zhong và ctv, 1992) và hai lá mầm (Rastogi và Sawhney, 1987; Narasimhulu và Reddy, 1984). Cytokinin cĩ thể cảm ứng tạo hoa khi sử dụng đơn lẻ (Duan và Yazawa, 1995; Jumin và Nito, 1996; Nadgauda và ctv, 1997; Jumin và Ahmad, 1999). Ở một số thực vật, để hoa đƣợc hình thành thì cần kết hợp cytokinin với auxin (Peeter và ctv, 1994), hay gibberellin (Rastogi và Sawhney, 1987) hoặc kết hợp cùng kinetin, GA3 và IAA (Luo và ctv (2000); Tepfer và ctv, 1966) [30]. Tuy cytokinin cĩ vai trị quan trọng trong việc hình thành hoa in vitro nhƣng nĩ vẫn khơng thể cảm ứng sự nở hoa ở các mơ thực vật cịn non. Điều này cho thấy rằng ngồi cytokinin cịn cĩ yếu tố 19 khác liên quan đến hƣớng biệt hĩa hoa của thực vật (Wardell và Skoog, 1969b; Scorza và Janick, 1980) [9] Trong các loại cytokinin thì 6_Benzyladenine (BA) và thidiazuron (TDZ) thƣờng đƣợc sử dụng nhất. TDZ là một chất điều hồ sinh trƣởng tổng hợp, khơng là dẫn xuất của cytokinin nhƣng cĩ tác dụng nhƣ 1 cytokinin. Các sinh trắc nghiệm đƣợc thực hiện nhận thấy rằng TDZ cĩ tác dụng gấp 4 lần hơn cytokinin. Ở nồng độ thấp, TDZ cảm ứng tái sinh chồi trực tiếp từ mơ. Ở nồng độ cao, TDZ cảm ứng hình thành sẹo và những cấu trúc bất thƣờng. Ở nồng độ quá cao, TDZ cảm ứng hình thành sẹo và phơi sinh dƣỡng từ sẹo. Vì TDZ bền, cĩ hoạt tính cao nên thƣờng đƣợc sử dụng trong nuơi cấy mơ [5]. Đối với tác dụng kích thích sự ra hoa in vitro, đã cĩ nhiều nghiên cứu thành cơng khi bổ sung BA hoặc TDZ vào mơi trƣờng nuơi cấy nhƣ Bambusa edulis (Chuoun-Sea Lin và ctv, 2002), hoa hồng (Wang G.Y và ctv, 2002), Cymbidium (Chang và Chang, 2003), Murya paniculata (Jumin và Admad, 1999) [4,9,21,31] 2.3.3.2 Auxins Auxin cảm ứng ra hoa ở một số lồi khi sử dụng đơn lẻ nhƣ ở cây Torenia (Tanimoto và Harada, 1981), Vigna radiata (Avenido và Haulea, 1990) và Vigna mungo (Ignacimuthu và ctv, 1997) hay auxin kết hợp với GA3 ở cây canation (Sankhla và ctv, 1994) và Pisum sativum (G. Franklin và ctv, 2000). Tuy nhiên, ở một vài lồi thì auxin khơng cĩ tác dụng (Bergoef và Bruinsma, 1979; Rastogi và Sawhney, 1987) hay thậm chí là ức chế (Blake, 1969; Deaton và ctv, 1984) [12]. Anton và cộng sự (1991) nghiên cứu sự tạo hoa của cây Nicotiana tabacum cv Samsun bằng cách áp dụng những loại hormone khác nhau trong những thời gian khác nhau cho thấy rằng auxin tuy khơng cĩ vai trị trong sự tƣợng hoa nhƣng nĩ quan trọng trong sự biệt hố của chồi hoa sau đĩ. [30] 2.3.3.3 Gibberellins [9] Trong điều kiện in vivo, gibberellins là kích thích tố sinh trƣởng vừa cĩ tác dụng điều khiển nở hoa trên một số lồi vừa cĩ tác dụng ức chế ra hoa trên một số lồi khác (Evans 1971). Gibberellins cĩ thể cảm ứng làm thay đổi trạng thái của cây 20 từ giai đoạn trẻ sang giai đoạn ra hoa trên một vài loại cây lá kim (Phares et al. 1976). Trong điều kiện in vitro, gibberellin thƣờng đƣợc sử dụng trong các nghiên cứu điều khiển ra hoa trong ống nghiệm. Cĩ nhiều báo cáo chứng minh rằng GA3 cĩ tác dụng tăng cƣờng sự nở hoa của mẫu cấy trên nhiều lồi khác nhau nhƣ Araceae (Paulet và Nitsch 1964b; Pierik 1967b; Tizio 1979; Chang và Hsing 1980; Corr và Widme 1987, Tjia 1989; Funnell 1993; Henny 1995; Henny et al 1999; Kuehny 2000). Lang (1965) cho rằng gibberellins cĩ tác dụng đối với sự phát triển của hoa hơn là cảm ứng tạo hoa. 2.3.4 Các yếu tố khác Ngồi các chất cơ bản cĩ trong mơi trƣờng nuơi cấy nhƣ: các chất vơ cơ và hữu cơ, chất điều hồ sinh trƣởng thì cịn cĩ một số chất khác cũng đĩng vai trị là tác nhân kích thích hoặc ức chế sự ra hoa trong ống nghiệm. Các chất kích thích sự ra hoa in vitro thƣờng là các hợp chất phenol nhƣ p-coumaric acid và coumarin (Paulet và Nitsch, 1964), EDTA (Maheshwari và Chauhan, 1963), nƣớc dừa, dịch chiết từ cây L. annua đang nở hoa hoặc chƣa nở hoa (Pierik, 1967), orotic acid, thymine, adenine, abscisic acid (Nitsch và Nitsch, 1967), glucosamine, diethylstillbesterol, uridylic acid (Margara và Touraud, 1967), amino acid, amino sugars và meso-inositol (Margara và Touraud, 1967). Ngƣợc lại, các RNA nucleosides, Flavin-adenine-dinucleotide (Chailakhyan và ctv, 1961) và dịch chiết từ cây Kalanchoe blossfediana chƣa cảm ứng đƣợc sự ra hoa (Blake, 1972) cĩ vai trị nhƣ chất ức chế sự hình thành hoa. [9]  pH và trạng thái vật lý của mơi trƣờng Sự phát triển của mơ cĩ thể thay đổi hồn tồn nếu chúng đƣợc nuơi cấy trên một mơi trƣờng đặc hoặc trong một mơi trƣờng lỏng. Các rễ của cây endive (một loại rau cải thƣờng đƣợc sử dụng ở Châu Âu) đƣợc nuơi trong mơi trƣờng lỏng cĩ cầu giấy chỉ cĩ thể sinh ra các chồi dinh dƣỡng, trong lúc ấy nếu nuơi trên mơi trƣờng cĩ agar thì cĩ thể tạo nên các chồi hoa. Tƣơng tự, mẫu cấy rễ C. intybus trong mơi trƣờng cĩ agar cho tỷ lệ mẫu nở hoa nhiều hơn trong mơi trƣờng lỏng sử dụng cầu giấy lọc làm giá thể (Margara và Bouniols, 1967; Bouniols và Margara, 21 1968; Bouniols, 1971) [3]. Ngƣợc lại, G. R. Rout và P. Das (1994) khi nghiên cứu tạo phơi soma và ra hoa trong ống nghiệm ở 3 lồi tre là Bambusa vulgaris, Dendrocalamus gigateus và Dendrocalamus strictus thì mơi trƣờng lỏng cảm ứng ra hoa tốt hơn mơi trƣờng thạch. [22] pH mơi trƣờng ảnh hƣởng đến khả năng hịa tan của các ion trong mơi trƣờng khống, khả năng đơng tụ agar và sự tăng trƣởng của tế bào. Vì vậy, việc xác định chính xác độ pH của mơi trƣờng cĩ ý nghĩa quan trọng trong nuơi cấy mơ [3]. Đối với điều khiển ra hoa in vitro, pH thích hợp cho sự ra hoa thƣờng ở mức thấp hơn so với pH của mơi trƣờng thơng thƣờng (5,2- 5,8). Ví dụ ở cây Brassica napus pH tối ƣu cho sự ra hoa in vitro là 3,9 là mức pH khá thấp so với pH của mơi trƣờng thƣờng. Ở mức pH thấp nhƣ vậy cây cĩ thể hấp thu đƣợc một số hợp chất chỉ hịa tan đƣợc ở mức pH thấp nhƣ Fe từ hợp chất sắt ferric phosphate (Dalton, Iqbal và Turner 1983; Vyskot và Bezdek 1984; Wolfe, Chen và Eck 1986),…. [30]. Tác động của pH đƣợc xác định thơng qua khả năng tăng cƣờng sự hấp thu các chất dinh dƣỡng nhƣ ion NO3 - (pH thấp), NH4 +; các chất điều hịa sinh trƣởng nhất là auxin; khả vận chuyển H+ qua màng tế bào thực vật (Edwards và Goldsmith 1980; Zsoldos và Haunold 1982)  Quang kỳ Ở điều kiện tự nhiên, quang kỳ đĩng vai trị rất quan trọng cho sự ra hoa và qua nhiều nghiên cứu quang kỳ cũng cần thiết cho sự ra hoa in vitro đặc biệt là ở các lồi nhạy cảm với chiều dài ngày. Các nghiên cứu cho thấy sự cảm ứng quang kỳ của thực vật in vitro cĩ thể là do tồn cơ thể thực vật (Hillman, 1959), đỉnh sinh trƣởng (Raghavan, 1961; Harada, 1967; Jacobs và Suthers, 1971), đốt thân (Harada, 1966; C. Nitsh, 1967), đoạn cắt của trục dƣới lá mầm (Nitsch, 1972), mẫu mơ lá (Rossini và Nitsch, 1966) và đốt rễ (Paulet và Nitsch, 1964; Bouriquet, 1966; Margana và Touraud, 1967, 1968). Các xử lý quang kỳ nhìn chung thƣờng ứng dụng cho các mẫu cấy cịn non, qua các thí nghiệm cho thấy rằng sự cảm nhận kích thích của ánh sáng ở thực vật phụ thuộc vào sự hiện diện của lá, đỉnh sinh trƣởng hoặc cả cây hồn chỉnh. Sự phản ứng của thực vật đáp ứng với quang kỳ cịn phụ 22 thuộc vào nồng độ tối thiểu của đƣờng cĩ trong mơi trƣờng nuơi cấy (Margana và Touraud, 1968; C. Nitsch, 1967, 1972). Trong một vài trƣờng hợp ngƣời ta thấy rằng sucrose cĩ thể thay thế hồn tồn sự kích thích ngày dài ở các cây in vitro (Lona, 1948; Baldev, 1959, 1962; Deltour, 1967). Zeatin cĩ thể thay thế kích thích ngày ngắn cho sự nở hoa của cây Wolffia microscopica (Margara và ctv, 1965). [9] 2.4 SỰ PHÁT TRIỂN HOA IN VITRO Sự khởi đầu ra hoa ở cây xảy ra thƣờng theo sau sự cảm ứng của các tín hiệu mơi trƣờng. Trong điều kiện in vivo và in vitro, giai đoạn này thƣờng đƣợc nhận biết bởi sự tích lũy và lƣu giữ tinh bột, sự phân bố lại phức tạp hơn của mạng lƣới nội chất trong tồn bộ tế bào chất, sự tăng tổng hợp DNA, tăng cƣờng hoạt động của ty thể, của các enzyme thủy giải, tăng mật độ ribosome, tăng hoạt động của các quá trình nguyên phân và hệ số hơ hấp ở đỉnh sinh trƣởng hoa (Ebrahim Zadeh và Nicolas – Prat, 1969; Salisbury, 1971; Yeung và Peterson, 1972; Wardell vavf Skoog, 1973; Trần Thanh Vân và Chlyah, 1976; Bernier và ctv, 1977). [9] Thơng thƣờng các hoa tạo ra trong ống nghiệm cĩ kích thƣớc nhỏ hơn hoặc cĩ hình dạng khác thƣờng so với hoa ngồi tự nhiên (Buteko, 1964; Ganapathy, 1969; Mehra và Mehra, 1972; Trần Thanh Vân, 1973a; Scorza và Janick, 1980) [9]. Chẳng hạn ở cây nhân sâm, hoa tạo ra trong điều kiện in vitro cĩ kích thƣớc nhỏ hơn so với hoa trong điều kiện tự nhiên mặc dù hoa vẫn cĩ đầy đủ các cơ quan hoa)[23]; ở cây hoa hồng, đơi lúc hoa bị đột biến, cánh hoa khơng đều, đài hoa chƣa chuẩn hoặc cĩ khi chƣa ra đƣợc màu giống với hoa trồng trong mơi trƣờng thiên nhiên... [26]; ở cây Gentiana triflora Pall. var. axillarflora, tuy màu sắc hoa cĩ sáng hơn, số bao phấn ít hơn nhƣng hoa vẫn cĩ hình chuơng nguyên thủy (Zhang và Leung, 2000). Ngồi ra, việc điều khiển ra hoa trong ống nghiệm cịn một hạn chế đĩ là tỉ lệ nở hoa khơng đạt đƣợc 100% nhƣ mong đợi. [23,36] 23 2.5 CÁC NGHIÊN CỨU RA HOA IN VITRO 2.5.1 Trên thế giới Chang và Hsing (1980) tạo phơi từ các mơ sẹo rễ của cây nhân sâm (Panax ginseng) và các phơi này ra hoa khi nuơi cấy trên mơi trƣờng 1/2 MS cĩ bổ sung 1 mg/l BA và 1 mg/l GA3. [23] Haeng Soon Lee, Kwang _ Wong Lee, Seung Gyun Yang và Jang Ryol Liu (1991): từ tế bào hợp tử (zygotic embryos) nghiên cứu điều khiển ra hoa trong ống nghiệm trên cây nhân sâm (Panax ginseng). Thí nghiệm đƣợc tiến hành trên mơi trƣờng muối vơ cơ MS (1962) cĩ nồng độ nitrogen giảm đi một nửa, 100mg/l myo_inositol, 0,4mg/l thiamin HCl, 30mg/l sucrose và kích thích sinh trƣởng BA, GA3, ABA. Sau 10 tuần nuơi cấy, cây nhân sâm ra hoa với tỉ lệ cao nhất trên mơi trƣờng chứa 5µm BA và 5µm GA3. Ngồi ra, trên các mơi trƣờng chỉ chứa BA; tổ hợp BA+GA3+ABA, hoặc BA + ABA cây cũng cho ra hoa với tỉ lệ tƣơng đối cao. G. R. Rout và P. Das (1994) nghiên cứu tạo phơi soma và ra hoa trong ống nghiệm ở 3 lồi tre là Bambusa vulgaris, Dendrocalamus gigateus và Dendrocalamus strictus. Đốt thân của cây con tái sinh từ phơi soma đƣợc nuơi cấy trên mơi trƣờng cảm ứng ra hoa: 1/2 MS bổ sung 0,5 mg/l adenin sulphate; 0,25 mg/l IBA; 0,5 mg/l GA3 và 3% sucrose. Sau 12 tuần nuơi cấy thì cho hoa, mơi trƣờng lỏng cảm ứng ra hoa tốt hơn mơi trƣờng cĩ agar (60-70% so với 25-30%). [36] Rajani S. Nadgauda và ctv (1997) báo cáo rằng khi nuơi cấy cây con in vitro của giống tre Babusa arundinacea trong mơi trƣờng MS lỏng chứa 2% sucrose, 5% nƣớc dừa và 2,2 µM BA, sau 3 - 6 tháng cĩ 70 % mẫu cấy ra hoa. [37] Nadgauda et al (2000): Cảm ứng tạo hoa in vitro ở cây Dendrocalamus strictus. Cây đƣợc nuơi cấy trong mơi trƣờng ½ MS cĩ bổ sung các nồng độ khác nhau của TDZ (0; 0,01; 0,05; 0,1; 0,5; và 1mg/l); 2% sucrose và để trong điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày ở 25 ± 20C. Sau 21 ngày nuơi cấy tất cả mẫu đƣợc chuyển sang mơi trƣờng ½ MS khơng chứa TDZ. Kết quả thí nghiệm cho tỷ lệ ra hoa cao 24 nhất sau 2 tuần nuơi cấy trên những mẫu cấy đƣợc cấy chuyền từ mơi trƣờng ½ MS cĩ chứa 0,5mg/l TDZ sang mơi trƣờng ½ MS. Kachonpadungkitti Yong sak Romchatngoen Supot Hasegewa Koji và Hisajima Shigeru (2001): cảm ứng tạo hoa in vitro từ mẫu chồi cây lúa kiều mạch nuơi cấy in vitro. Trên mơi trƣờng ½ MS, với nitrat là nguồn nitro duy nhất, 5% sucrose, 0,1µm kinetin trong điều kiện nuơi cấy 27± 20C ở quang kỳ là 8 giờ chiếu sáng và 16 giờ trong tối, mẫu cấy đƣợc cảm ứng tạo hoa trên 100% số lƣợng với 16 hoa trên mẫu và số hoa nở trên mẫu là 9 sau 8 tuần nuơi cấy. [29] S. Sudhakaran và V.Sivasankari (2002): chồi của cây húng (Ocimum basilicum L.) đƣợc cấy trên mơi trƣờng 1/2 MS cĩ bổ sung BAP (3- 5- 7 mg/l) và IAA (1-3-5 mg/l). Sau 20 ngày nuơi cấy cây cho ra hoa in vitro ở mơi trƣờng cĩ nồng độ BAP là 7 mg/l và IAA là 5 mg/l. [35] G. Y. Wang, M.F.Yuan và Y.Hồng (2002) đã nghiên cứu ra hoa trong ống nghiệm ở 6 loại hoa hồng. Cây con tái sinh từ chồi sau 45 ngày thì chuyển sang mơi trƣờng MS chứa 400 mg/l myo–inositol, 30 g/l sucrose bổ sung các chất điều hồ sinh trƣởng zeatin, TDZ, NAA, BA, IAA, GA3 ở các nồng độ khác nhau. Sau 156- 561 ngày kể từ khi bắt đầu nuơi cấy cây cho ra hoa in vitro với mật độ hoa cao nhất ở mơi trƣờng chứa 0,5 mg/l TDZ hoặc 0,5 mg/l zeatin kết hợp với 0,1 mg/l NAA (49,2%, 44,2%). [21] Chen Chang và Wei - Chin Chang (2003) đã thành cơng khi callus cĩ đƣợc từ thân rễ của Cymbidium ensifolium var. misericors ra hoa in vitro trên mơi trƣờng 1/2 MS chứa 1,5 µM NAA kết hợp với TDZ (nồng độ từ 3,3–10 µM) hay 2iP (nồng độ 10–33 µM) sau 100 ngày nuơi cấy. [31] 2.5.2 Trong nƣớc Nguyễn Hồng Vũ và ctv (2003) lần đầu tiên điều khiển thành cơng ra hoa trong ống nghiệm ở cây hoa hồng. Đặc biệt, tác giả đã phát hiện 2 yếu tố quan trọng mang tính chất quyết định đối với sự nở hoa của thực vật là cytokinin và đƣờng, trong đĩ, đƣờng là yếu tố tác động chính lên sự hình thành hoa in vitro, cịn cytokinin giúp làm tăng tỉ lệ hình thành hoa và giúp biệt hố các cấu trúc hoa ở giai đoạn sau khi 25 tƣợng hoa, làm chất kích thích sự hình thành hoa. Tuy nhiên đề tài vẫn cịn một số điểm chƣa hồn thiện lắm: đơi lúc hoa bị đột biến, cánh hoa khơng đều, đài hoa chƣa chuẩn hoặc cĩ khi chƣa ra đƣợc màu giống với hoa trồng trong mơi trƣờng thiên nhiên...do vậy cần tiếp tục nghiên cứu, hồn thiện quy trình ra hoa của cây hoa hồng trong ống nghiệm. [26,27] Phạm Thị Minh Thu và ctv (2005) đã cho lồi hoa Torenia màu tím (Torenia Fournieri) trổ hoa thành cơng trong ống nghiệm từ mẫu chồi đƣợc tái sinh từ lá cây Torenia mọc lên từ hạt. Tiếp theo Nguyễn Ngọc Thi và ctv đã tiếp tục tiến hành thí nghiệm làm thay đổi màu sắc hoa torenia trong ống nghiệm từ màu tím sang trắng bằng cách bổ sung yếu tố vi lƣợng vào mơi trƣờng sống của cây.[12,34] Vũ Quốc Luận, Dƣơng Tấn Nhựt (2006) đã điều khiển làm cho những đĩa hoa lan đầu tiên nở trong ống nghiệm ở lồi lan Dendrobium Mild Yumi. [17] Lê Hồng Thủy Tiên và ctv (2006) điều khiển ra hoa thành cơng cây dừa cạn (Catharanthus roseus) trong điều kiện in vitro. Theo thí nghiệm này, mơi trƣờng thích hợp nhất cho sự ra hoa của cây dừa cạn trong ống nghiệm là mơi trƣờng MS bổ sung 0,05 mg/l TDZ và 0,1 mg/l NAA. Tỉ lệ ra hoa là 100%. Cây ra nụ sau 58 ngày nuơi cấy và 68 ngày thì hoa nở, trung bình cĩ 4 hoa/cây. [4] Nguyễn Thị Mỹ Duyên và ctv (2007) đã tiến hành thí nghiệm nở hoa trong ống nghiệm trên hai giống lan Dendrobium mini và Giả Hạc và đã đạt đƣợc thành cơng đáng kể khi hai loại hoa lan này đã lần lƣợt ra hoa trong ống nghiệm. [13] 26 Chƣơng 3 NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU Đề tài đƣợc thực hiện từ tháng 3/2007 đến tháng 8/2007 tại Bộ mơn Cơng Nghệ Sinh Học trƣờng Đại Học Nơng Lâm Tp.HCM. 3.2 NỘI DUNG Đề tài thực hiện gồm 2 nội dung: Nội dung 1: Khảo sát sự ra hoa in vitro ở cây lan sị (Dischidia pectinoides Pearson) Nội dung 2: Khảo sát sự ra hoa in vitro ở cây bắt ruồi (Drosera burmannii Vahl) 3.3 BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM Các thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hồn tồn ngẫu nhiên (Completely Randomized Design, CRD), một yếu tố, 3 lần lặp lại, mỗi nghiệm thức cấy 3 bình, mỗi bình 1 mẫu. 3.3.1 Nội dung 1: Khảo sát sự ra hoa in vitro của cây lan sị Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của cƣờng độ ánh sáng đến sự tạo sị và ra hoa in vitro của cây lan sị. Bảng 3.1: Các nghiệm thức thí nghiệm ảnh hƣởng của cƣờng độ ánh sáng đến sự tạo sị và ra hoa in vitro trên cây lan sị. Nghiệm thức Mơi trƣờng Cƣờng độ ánh sáng (lux) 1 (ĐC) MS 900 2 MS 1800 3 MS 2700 4 MS 3600 Ghi chú: 900 lux ≈ 1 bĩng đèn neon Số nghiệm thức: 4 27 Tổng số bình: 36 Tổng số mẫu: Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của nồng độ GA3 đến sự ra hoa in vitro của cây lan sị trên mơi trƣờng cĩ và khơng cĩ bổ sung nƣớc dừa Bảng 3.2. Các nghiệm thức thí nghiệm ảnh hƣởng của nồng độ GA3 đến sự ra hoa in vitro ở cây lan sị trên mơi trƣờng cĩ và khơng cĩ bổ sung nƣớc dừa Nghiệm thức Mơi trƣờng GA3 (mg/l) Nồng độ nƣớc dừa (%) 1 (ĐC) MS 0 0 2 MS 0,5 0 3 MS 1,0 0 4 MS 1,5 0 5 MS 2,0 0 6 MS 2,5 0 7 MS 3,0 0 8 MS 0 15 9 MS 0,5 15 10 MS 1,0 15 11 MS 1,5 15 12 MS 2,0 15 13 MS 2,5 15 14 MS 3,0 15 Số nghiệm thức: 14 Tổng số bình: 126 Tổng số mẫu: 126 28 Thí nghiệm 3: Ảnh hƣởng của nồng độ BA đến sự tạo sị và ra hoa in vitro của cây lan sị. Bảng 3.3. Các nghiệm thức thí nghiệm ảnh hƣởng của nồng độ BA đến sự tạo sị và ra hoa in vitro trên cây lan sị Nghiệm thức Mơi trƣờng BA (mg/l) 1 (ĐC) MS 0 2 MS 1 3 MS 3 4 MS 5 Số nghiệm thức: 4 Tổng số bình: 36 Tổng số mẫu: 36 3.3.2 Nội dung 2: Khảo sát sự ra hoa in vitro của cây bắt ruồi Thí nghiệm đƣợc tiến hành trên mơi trƣờng cơ bản MS với sự thay đổi nồng độ của thành phần hĩa chất thực hiện thí nghiệm. Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của nồng độ KH2PO4 đến sự ra hoa in vitro của cây bắt ruồi. Bảng 3.4: Các nghiệm thức thí nghiệm ảnh hƣởng của nồng độ KH2PO4 đến sự ra hoa in vitro trên cây bắt ruồi Nghiệm thức Mơi trƣờng KH2PO4 (mg/l) 1 (ĐC) MS 170 (theo MS) 2 MS 340 (x 2) 3 MS 510 (x 3) 4 MS 680 (x 4) 5 MS 850 (x 5) Số nghiệm thức: 5 29 Tổng số bình: 45 Tổng số mẫu: 45 Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của nồng độ NH4NO3 đến sự ra hoa in vitro của cây bắt ruồi. Bảng 3.5: Các nghiệm thức thí nghiệm ảnh hƣởng của nồng độ NH4NO3 đến sự ra hoa in vitro trên cây bắt ruồi. Nghiệm thức Mơi trƣờng NH4NO3 (mg/l) 1 (ĐC) MS 1650 (theo MS) 2 MS 825 (1/2) 3 MS 412,5 (1/4) 4 MS 275 (1/6) 5 MS 206,25 (1/8) Số nghiệm thức: 5 Tổng số bình: 45 Tổng số mẫu: 45 3.4 CHỈ TIÊU THEO DÕI 3.4.1 Theo dõi khả năng tạo chồi và sinh trƣởng của cây - Chiều cao cây (cm): tính từ gốc đến đỉnh sinh trƣởng. - Số lá (lá/cây): đếm số lá trên cây, tính lá đã nở ra hồn tồn và thấy rõ cuống lá. - Số chồi hình thành: số chồi hình thành sau khi cấy 3.4.2 Theo dõi sự ra hoa - Tỉ lệ cây ra nụ (%): là tỉ lệ giữa tổng số cây ra nụ trên tổng số mẫu cấy. - Thời gian ra nụ (ngày): tính từ lúc cấy đến khi cĩ 30% cây ra nụ. - Thời gian ra hoa (ngày): tính từ lúc cấy đến khi 30% nụ nở thành hoa đầu tiên. - Tỉ lệ hoa nở (%): là tỉ lệ giữa tổng số hoa và tổng số nụ. - Số hoa (hoa/cây): là tổng số hoa trên 1 cây. 30 3.5 PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 3.5.1 Mơi trƣờng nuơi cấy Mơi trƣờng nuơi cấy cơ bản là mơi trƣờng MS. Tùy theo mục đích thí nghiệm mà bổ sung thêm chất điều hịa sinh trƣởng GA3 (gibberellin), BA (6_Benzyladenine); nƣớc dừa; tăng hay giảm nồng độ KH2PO4, NH4NO3. Mơi trƣờng sau đĩ đƣợc chỉnh về pH 5,8 (bằng NaOH hoặc HCl) trƣớc khi thêm agar. Sử dụng bình nuơi cấy thể tích 500ml, phân phối vào mỗi bình khoảng 80ml mơi trƣờng, hấp tiệt trùng bằng autoclave ở 1210C, áp suất 1,2 atm trong thời gian là 25 phút (riêng mơi trƣờng cĩ bổ sung GA3 thì đƣợc hấp thanh trùng trƣớc sau đĩ mới bổ sung GA3 đã đƣợc lọc vơ trùng, mơi trƣờng cĩ nƣớc dừa chỉ hấp thanh trùng trong thời gian 20 phút). 3.5.2 Chuẩn bị mẫu cấy Đề tài thực hiện trên cây lan sị và cây bắt ruồi in vitro đƣợc cung cấp bởi phịng nuơi cấy mơ thuộc Bộ mơn Cơng Nghệ Sinh Học trƣờng Đại học Nơng Lâm Tp.HCM. Cây lan sị in vitro đƣợc nhân giống sau 30 ngày tạo cây con hồn chỉnh, cĩ từ hai đến ba chồi trên một cây. Đây chính là nguồn mẫu sử dụng cảm ứng tạo hoa in vitro. Đối với cây bắt ruồi, sau 14 ngày nhân giống sẽ tạo cây con hồn chỉnh cĩ 1 chồi trên một cây. 3.5.3 Điều kiện nuơi cấy Cây lan sị in vitro đƣợc nuơi trong phịng tăng trƣởng ở nhiệt độ 240C (± 20C), ẩm độ 55 – 60%, thời gian chiếu sáng là 16 giờ/ngày với cƣờng độ ánh sáng khoảng 1000 – 2000 lux. 3.5.4 Xử lý số liệu Số liệu thu thập đƣợc xử lý trên máy vi tính bằng chƣơng trình thống kê Statgraphics 7.0 31 Chƣơng 4 KẾT QUẢ THẢO LUẬN 4.1. NỘI DUNG 1: CÂY LAN SÕ IN VITRO Do lan sị là một loại thực vật thân bị nên đối với sự sinh trƣởng của cây chúng tơi chỉ theo dõi chỉ tiêu về sự gia tăng số lá của cây. 4.1.1. Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của cƣờng độ ánh sáng trên sự ra hoa của cây lan sị in vitro Lan sị là một loại cây chịu ánh sáng kém, chỉ thích hợp với ánh sáng nhẹ lúc sáng sớm và lúc cuối buổi chiều. Nếu để trong điều kiện ánh sáng quá mạnh cây sẽ kém phát triển cĩ thể dẫn đến cháy lá. Trong thí nghiệm này chúng tơi khảo sát sự ảnh hƣởng của ánh sáng đối với sự sinh trƣởng sinh dƣỡng và sự ra hoa của cây lan sị in vitro.  Sự gia tăng số chồi Bảng 4.1. Ảnh hƣởng của cƣờng độ ánh sáng đến sự gia tăng số chồi của cây lan sị in vitro Nghiệm thức Cƣờng độ ánh sáng (lux) Số chồi trên cây 30 ngày 60 ngày 1 (Đ/C) 900 7,67a 8,56a 2 1800 7,11 a 8,33 a 3 2700 7,00 a 5,67 b 4 3600 5,56 b 3,33 c CV (%) 18,5 18,56 Ghi chú: - Trong cùng một cột, các giá trị trung bình cĩ kí tự theo sau giống nhau khơng cĩ sự khác biệt về mặt thống kê (P > 0,05). 32 Trong điều kiện ánh sáng yếu 900 lux, cây cĩ số chồi hình thành cao nhất 8 chồi. Khi cƣờng độ ánh sáng tăng trên 2700 lux, cây khơng những khơng hình thành chồi mới mà số chồi đang hiện diện cũng giảm đi. Điều này cho thấy cƣờng độ ánh sáng cĩ ảnh hƣởng rất lớn đối với sự gia tăng số chồi của cây.  Sự gia tăng số lá trên cây Bảng 4.2. Ảnh hƣởng của cƣờng độ ánh sáng đến sự gia tăng số lá của cây lan sị in vitro Nghiệm thức Cƣờng độ ánh sáng (lux) Số lá (lá/cây) 30 ngày 60 ngày 1 (Đ/C) 900 49,56a 60,22a 2 1800 38,89 b 46,89 b 3 2700 34,33 bc 33,33 c 4 3600 28,89 c 23,44 d CV (%) 17,4 19,8 Ghi chú: - Trong cùng một cột, các giá trị trung bình cĩ kí tự theo sau giống nhau khơng cĩ sự khác biệt về mặt thống kê (P > 0,05). Cũng nhƣ khả năng tạo chồi, ở các cƣờng độ ánh sáng càng cao, sự gia tăng số lá trên cây càng thấp. Sự gia tăng số lá nhiều nhất là ở nghiệm thức 1 (60 lá) và thấp nhất ở nghiệm thức 4 (23 lá). Những kết quả thu đƣợc về ảnh hƣởng của cƣờng độ ánh sáng đối với sự gia tăng số chồi và số lá khẳng định rằng cƣờng độ ánh sáng yếu mới là điều kiện thích hợp cho sự sinh trƣởng và phát triển của cây lan sị in vitro. Tuy nhiên, sau 60 ngày nuơi cấy dƣới ảnh hƣởng của cƣờng độ ánh sáng, cây lan sị chƣa tạo sị và ra hoa in vitro, điều này cĩ thể là do sự tác động của cƣờng độ ánh sáng chƣa thích hợp để đƣa cây đến giai đoạn trƣởng thành nhất định cần thiết cho sự tạo sị và ra hoa in vitro. 33 4.1.2. Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của nồng độ GA3 đến sự ra hoa in vitro của cây lan sị trên mơi trƣờng cĩ và khơng cĩ bổ sung nƣớc dừa. GA3 là chất kích thích sinh trƣởng đƣợc sử dụng nhiều nhất trong các nghiên cứu ra hoa in vitro trên nhiều lồi khác nhau. Tác dụng của GA3 thể hiện trong khả năng kích thích sự phân chia và kéo dài tế bào, tăng trƣởng lĩng thân và lá, tăng cƣờng sự nở hoa trên nhiều lồi khác nhau. Ngồi ra, GA3 cịn cĩ tác dụng kích thích sự tạo hoa trên các cây ngày dài cũng nhƣ các cây cần cĩ sự kéo dài lĩng thân để ra hoa [7]. Do vậy, GA3 cĩ thể cảm ứng sự ra hoa in vitro trên cây lan sị. Nƣớc dừa, theo nhiều nghiên cứu đã chứng minh đƣợc trong thành phần cĩ chứa nhiều chất dinh dƣỡng khác nhau nhƣ myo- inositol, các loại acid amin thiết yếu, zeatin …. Zeatin - một loại cytokinin cĩ tác dụng kích thích sự phân chia của các tế bào thân đã phân hĩa. Đây chính là yếu tố giúp cho sự sinh trƣởng và phát triển của cây, đƣa cây đến giai đoạn trƣởng thành ra hoa đặc biệt ở những cây cần cĩ sự kéo dài lĩng thân mới ra hoa.[2] 34  Sự gia tăng số chồi trên cây Bảng 4.3. Ảnh hƣởng của nồng độ GA3 đến số chồi của cây lan sị in vitro trên mơi trƣờng cĩ và khơng cĩ bổ sung nƣớc dừa. Nghiệm thức Nồng độ GA3 (mg/l) Nồng độ nƣớc dừa (%) Số chồi trên cây 30 ngày 60 ngày 1 (Đ/C) 0 0 4,56a 9,89a 2 0,5 0 4,67 a 6,22 e 3 1,0 0 7,33 de 10,33 af 4 1,5 0 8,11 ef 9,67 ab 5 2,0 0 6,00 bc 9,44 ab 6 2,5 0 9,00 f 12,22 g 7 3,0 0 6,89 cd 11,44 fg 8 0 15 4,33 a 6,67 de 9 0,5 15 6,00 bc 9,11 abc 10 1,0 15 7,00 cde 9,44 ab 11 1,5 15 6,78 cd 7,89 cd 12 2,0 15 5,11 ab 6,67 de 13 2,5 15 5,00 ab 5,78 e 14 3,0 15 6,78 cd 8,33 bc CV(%) 19,3 18,67 Ghi chú: - Trong cùng một cột, các giá trị trung bình cĩ kí tự theo sau giống nhau khơng cĩ sự khác biệt về mặt thống kê (P > 0,05).  Trên mơi trƣờng khơng bổ sung nƣớc dừa Trong mơi trƣờng cĩ nồng độ GA3 2,5 mg/l, cây hình thành chồi nhiều nhất, trung bình 12 chồi/cây. Ở các nồng độ GA3 thấp hơn, số chồi hình thành ít hơn. Tuy nhiên, khi nồng độ GA3 cao hơn mức 2,5 mg/l sự gia tăng số chồi của cây cĩ dấu hiệu giảm lại (xem bảng 4.2). Ở đây, chúng tơi thấy sự gia tăng số chồi ở các nghiệm thức bổ sung GA3 ít hơn so với sự gia tăng số chồi của nghiệm thức đối 35 chứng (khơng sử dụng GA3). Điều này cĩ thể do gibberellin là một chất cĩ hoạt tính cản sự khởi tạo đỉnh sinh trƣởng, do đĩ ức chế sự hình thành chồi mới, chỉ kích thích sự phát triển của chồi một khi đỉnh sinh trƣởng đã đƣợc hình thành (Jarret và Hasegawa, 1981) [3].  Trên mơi trƣờng cĩ bổ sung nƣớc dừa Sau 30 ngày nuơi cấy, nghiệm thức 10 cĩ nồng độ GA3 1 mg/l cĩ số chồi hình thành cao nhất (9,44 chồi). Sau 60 ngày nuơi cấy, số chồi hình thành cao nhất vẫn là ở nghiệm thức 10 và khi nồng độ GA3 càng cao, sự gia tăng số chồi giảm dần. Nồng độ GA3 thích hợp nhất cho sự hình thành chồi của cây lan sị in vitro là 1mg/l. Khi nuơi cấy cây lan sị trên mơi trƣờng cĩ và khơng cĩ nƣớc dừa với sự thay đổi nồng độ GA3 từ 0-3 mg/l, kết quả thu đƣợc cho thấy: trên mơi trƣờng khơng chứa nƣớc dừa, số chồi hình thành nhiều nhất ở nghiệm thức 6 với nồng độ GA3 là 2,5 mg/l và số lá hình thành nhiều nhất ở nghiệm thức 3 với nồng độ GA3 là 1,0mg/l; trên mơi trƣờng cĩ nƣớc dừa, mơi trƣờng thích hợp nhất cho sự hình thành chồi và tăng trƣởng lá cho cây lan sị in vitro là mơi trƣờng bổ sung GA3 1,0 mg/l. Những kết quả trên đây cĩ thể là do trên mơi trƣờng khơng cĩ nƣớc dừa, sự tác động của GA3 chỉ là ở nồng độ GA3 sử dụng trong các nghiệm thức. Việc sử dụng nồng độ GA3 cĩ hiệu quả trên sự gia tăng số lá của cây, cây tăng nhanh về số lá và chiều dài lĩng thân làm cây sum xuê hơn so với mẫu cấy lúc đầu. Trên mơi trƣờng chứa nƣớc dừa, nƣớc dừa là một hợp chất chứa rất nhiều thành phần dinh dƣỡng khác nhau nhƣ vitamine, acid amine thiết yếu, zeatin,…. Cịn gibberellin lại đƣợc xem là cĩ thể thay thế cho auxin trong quá trình cảm ứng tạo chồi (Sekioka và Tanaka, 1981) [3]. Chính vì vậy, việc phối hợp sử dụng gibberellin và nƣớc dừa trong mơi trƣờng nuơi cấy cũng cĩ thể đƣợc coi nhƣ là sự phối hợp giữa auxin và cytokinine, và khi sự phối hợp này đạt đƣợc một tỷ lệ thích hợp cần thiết cho sự tạo chồi (auxin/cytokinine nhỏ hơn 1) sẽ kích thích mạnh sự phát triển chồi của cây. Ở đây, sự hình thành chồi đƣợc quan sát thấy cao nhất trong mơi trƣờng chứa 15% nƣớc dừa và GA3 1,0 mg/l, đây cĩ thể đƣợc xem là mơi trƣờng cĩ sự kết hợp giữa gibberellin và nƣớc dừa phù hợp cho sự tạo chồi cây lan sị in vitro. 36  Số lá trên cây Bảng 4.4. Ảnh hƣởng của nồng độ GA3 đến sự sinh trƣởng lá của cây lan sị in vitro trên mơi trƣờng cĩ và khơng cĩ bổ sung nƣớc dừa. Nghiệm thức Nồng độ GA3 (mg/l) Nồng độ nƣớc dừa (%) Số lá (lá/cây) 30 ngày 60 ngày 1 (Đ/C) 0 0 29,22ab 48,33abc 2 0,5 0 20,67 c 48,56 abc 3 1,0 0 38,33 de 72,00 f 4 1,5 0 24,33 ac 54,00 bcd 5 2,0 0 20,67 c 45,56 ab 6 2,5 0 23,33 ac 56,56 cd 7 3,0 0 27,00 ac 60,67 def 8 0 15 28,33 ab 42,44 a 9 0,5 15 37,78 de 68,00 def 10 1,0 15 53,44 f 72,33 f 11 1,5 15 50,22 f 67,22 def 12 2,0 15 35,89 de 57,67 cde 13 2,5 15 34,22 bd 49,33 abc 14 3,0 15 42,33 e 69,78 ef CV(%) 19,8 19,24 Ghi chú: - Trong cùng một cột, các giá trị trung bình cĩ kí tự theo sau giống nhau khơng cĩ sự khác biệt về mặt thống kê (P > 0,05). Trên cả hai mơi trƣờng cĩ và khơng cĩ nƣớc dừa, sự gia tăng số lá đều đƣợc nhận thấy cao nhất ở mơi trƣờng bổ sung GA3 1,0 mg/l sau 30 và 60 ngày nuơi cấy (72 lá). Ở nồng độ GA3 cao hơn hoặc thấp hơn, sự gia tăng số lá trên cây ít hơn. Tuy nhiên, trên mơi trƣờng cĩ nƣớc dừa, số lá hình thành trên cây cao hơn so với trên mơi trƣờng khơng cĩ nƣớc dừa (Bảng 4.4). Nhƣ vậy, sự gia tăng số lá của cây lan sị tốt nhất là trên mơi trƣờng bổ sung GA3 1,0 mg/l và 15% nƣớc dừa. 37  Sự ra hoa Bảng 4.5. Ảnh hƣởng của nồng độ GA3 đến sự ra hoa in vitro của cây lan sị trên mơi trƣờng cĩ và khơng cĩ bổ sung nƣớc dừa Nghiệm thức Nồng độ GA3 (mg/l) Nồng độ nƣớc dừa (%) Tỉ lệ cây ra nụ (%) Thời gian ra nụ (ngày) Thời gian ra hoa (ngày) Tỉ lệ hoa nở (%) Số hoa/cây (hoa) 1 0 0 0 a 0 a 0 a 0 a 0 a 2 0,5 0 33,3 b 90,0 bc 107,0 b 100 b 2,0 b 3 1,0 0 55,5 e 89,8 c 100,7 b 100 b 2,3 b 4 1,5 0 44,4 d 78,0 b 95,5 b 100 b 7,0 d 5 2,0 0 33,3 d 77.7 b 95,5 b 100 b 4.3 c 6 2,5 0 33,3 d 76,0 b 95,5 b 100 b 4,0 c 7 3,0 0 22,2 c 79,0 b 90,0 b 100 b 3,5 bc 8,9,10,11 12,13,14 15 - - - - CV (%) 15,9 7,0 5,9 0 15,9 Ghi chú: - Trong cùng một cột, các giá trị trung bình cĩ kí tự theo sau giống nhau khơng cĩ sự khác biệt về mặt thống kê (P > 0,05). Trên mơi trƣờng khơng cĩ nƣớc dừa, tất cả các nghiệm thức đều ra hoa và khác biệt cĩ ý nghĩa so với đối chứng. - Theo bảng 4.5, tỉ lệ cây ra nụ tƣơng đối thấp ở các nghiệm thức và dao động trong khoảng 22,2 – 44,4%, chỉ cĩ nghiệm thức 3 cĩ tỉ lệ ra nụ cao nhất 55,6%. - Về thời gian ra nụ, nghiệm thức 6 với nồng độ GA3 2,5 mg/l cĩ thời gian ra nụ ngắn nhất 76 ngày trong khi các nghiệm thức khác thời gian ra nụ dài hơn hẳn. - Thời gian ra hoa của cây từ 90 - 110 ngày kể từ lúc cấy. Thời gian ra hoa ngắn nhất là 90 ngày ở nghiệm thức 7 nhƣng lại khơng cĩ sự khác biệt cĩ ý nghĩa so với các nghiệm thức cịn lại. Thời gian để nụ phát triển thành hoa ở các nghiệm thức rất khác nhau. Ví dụ: nghiệm thức 6 cĩ thời gian ra nụ ngắn nhất nhƣng thời gian để 38 nụ phát triển thành hoa lại cao nhất, nghiệm thức 3 và nghiệm thức 7 là cĩ thời gian phát triển từ nụ thành hoa ngắn nhất (11 ngày). Theo sự quan sát của chúng tơi, những hoa cĩ thời gian phát triển từ nụ thành hoa càng dài thì thời gian tồn tại của hoa sau đĩ càng lâu, và ngƣợc lại những hoa cĩ thời gian phát triển từ nụ thành hoa càng ngắn thì độ bền của hoa cũng giảm xuống. Cụ thể là hoa bị rụng sớm khi chƣa phát triển đến giai đoạn hồn chỉnh nhất. Nguyên nhân của hiện tƣợng này cĩ thể do lƣợng chất dinh dƣỡng trong mơi trƣờng đã giảm bớt trong thời gian nuơi cấy nên khi cây đến giai đoạn trổ hoa thì lƣợng dinh dƣỡng khơng đủ để cây cung cấp cho hoa, do vậy hoa hồn thành vịng phát triển nhanh và rụng sớm. Hơn nữa cũng cĩ thể do nụ phát triển thành hoa quá nhanh dẫn đến khơng đảm bảo tổng hợp đủ các yếu tố cần thiết để phát triển thành hoa hồn chỉnh và tồn tại lâu dài. - Số hoa hình thành trên cây cao nhất ở nghiệm thức 4 cĩ nồng độ GA3 1,5mg/l với số hoa trung bình là 7 hoa/cây, khác biệt rất cĩ ý nghĩa về mặt thống kê so với các nghiệm thức cịn lại. Trên mơi trƣờng bổ sung nƣớc dừa, tất cả các cây đều chƣa cĩ dấu hiệu của sự ra hoa. Qua thí nghiệm này, mơi trƣờng thích hợp nhất để điều khiển cây lan sị ra hoa in vitro là mơi trƣờng bổ sung GA3 1,5 mg/l và khơng cĩ nƣớc dừa. Cây ra nụ sau 78 ngày nuơi cấy và phát triển thành hoa sau 95 ngày, trung bình cĩ 7 hoa trên cây. Mơi trƣờng cĩ GA3 1,0 mg/l dù tỉ lệ ra nụ cao nhất nhƣng thời gian ra nụ dài, đa số hoa bị rụng sớm và cĩ dấu hiệu bất thƣờng khơng phải là mơi trƣờng tốt để phát triển hoa in vitro. Hoa lan sị in vitro tƣơng đối giống với hoa in vivo. Tuy nhiên, hoa hình thành trong điều kiện in vitro cĩ một số nhƣợc điểm nhƣ: phát triển khơng bình thƣờng, rụng sớm; cấu trúc hoa khơng hồn chỉnh, màu sắc hoa đậm hơn hoặc nhạt hơn hoa in vivo. 39 Hình 4.1 Các giai đoạn phát triển của hoa lan sị in vitro. (B1): Cây lan sị 30 ngày sau cấy; (B2): Nụ hoa 3 ngày tuổi; (B3): Nụ hoa 10 ngày tuổi; (B4): Nụ hoa 15 ngày tuổi; (B5), (B6): Hoa lan sị in vitro chƣa hồn chỉnh và hồn chỉnh. B2 B1 B6 B3 B5 B2 B4 40 Hình 4.2 Hoa lan sị in vitro. (C1): lan sị ra hoa in vitro; (C2), (B3): hoa chƣa trƣởng thành và trƣởng thành. C1 C2 C3 41 Hình 4.3 Những biểu hiện khơng bình thƣờng của hoa lan sị in vitro. (D1): Hoa lan sị in vivo; (D2): Hoa lan sị in vitro; (D4), (D3): Hoa biến dạng; (D5): Hoa cĩ màu sắc đậm; (D6), (D7): Hoa cĩ dấu hiệu rụng sớm; (D8): Hoa khơng hồn chỉnh (phần dƣới hoa bị hở). D 42 4.1.3. Thí nghiệm 3: Ảnh hƣởng của nồng độ BA đến sự tạo sị và ra hoa in vitro trên cây lan sị  Sự gia tăng số chồi của cây Bảng 4.6. Ảnh hƣởng của nồng độ BA đến sự gia tăng số chồi của cây lan sị in vitro Nghiệm thức Nồng độ BA (mg/l) Số chồi trên cây 60 ngày 90 ngày 1 (Đ/C) 0 7,67a 9,56a 2 1 7,78 a 11,45 b 3 3 10,11 b 15,22 c 4 5 13,56 c 25,00 d CV (%) 16,03 10,71 Ghi chú: - Trong cùng một cột, các giá trị trung bình cĩ kí tự theo sau giống nhau khơng cĩ sự khác biệt về mặt thống kê (P > 0,05). Sau 60 và 90 ngày nuơi cấy, số chồi/cây hình thành nhiều nhất ở nghiệm thức 3 với nồng độ BA 3mg/l và nghiệm thức 4 cĩ nồng độ BA là 5mg/l, ở nghiệm thức 1 cĩ nồng độ BA 1mg/l sự khác biệt về số chồi/cây so với đối chứng là khơng đáng kể.  Số lá trên cây Bảng 4.7. Ảnh hƣởng của nồng độ BA đến sự gia tăng số lá trên cây lan sị in vitro Nghiệm thức Nồng độ BA (mg/l) Số lá (lá/cây) 60 ngày 90 ngày 1 (Đ/C) 0 33,22a 45,78a 2 1 34,78 a 47,00 a 3 3 45,67 b 52,78 b 4 5 33,89 a 35,67 c CV (%) 14,89 11,92 43 Ghi chú: - Trong cùng một cột, các giá trị trung bình cĩ kí tự theo sau giống nhau khơng cĩ sự khác biệt về mặt thống kê (P > 0,05). Sau 60 và 90 ngày nuơi cấy số lƣợng lá/cây đƣợc quan sát thấy nhiều nhất ở nghiệm thức 3 cĩ nồng độ BA là 3mg/l, và thấp nhất ở nghiệm thức 4 do nồng độ BA quá cao làm lá bị cuộn lại và khơng cĩ hình lá hồn chỉnh, khơng cĩ sự khác biệt cĩ ý nghĩa về phƣơng diện thống kê giữa nghiệm thức 2 so với đối chứng. Những kết quả về hệ số nhân chồi và sự gia tăng số lá trên cây là do BA - một loại cytokinine - là chất cĩ tác dụng trên hoạt động sinh lý của cây qua con đƣờng trao đổi chất, kích thích sự phân chia mạnh tế bào thực vật. Do vậy, việc dùng BA nồng độ cao cĩ thể làm ức chế và tác động sâu sắc đến sự trao đổi chất của cây, làm rối loạn các quá trình sinh lý, sinh hĩa của cây, tạo ra số lƣợng lớn chồi nhƣng đồng thời cũng gây đột biến mạnh cho cây. Ở thí nghiệm này chúng tơi nhận thấy ở nồng độ BA 1mg/l, cây phát triển gần nhƣ bình thƣờng. Ở nồng độ BA 3 mg/l, các chồi cây hình thành cĩ sự tăng nhẹ về số lƣợng và đồng thời một số chồi cĩ dấu hiệu bị đột biến nhẹ. Qua nghiệm thức 4 với nồng độ BA 5mg/l, tỉ lệ chồi hình thành rất cao nhƣng khoảng 95% chồi thể hiện sự bất thƣờng nhƣ chồi ngắn, vƣơn thẳng, yếu ớt; số lá trên chồi ít, lá bị thay đổi hình dạng, một số lá nở ra nhƣng bị cong lại, một số lá khơng thể nở ra hồn tồn. 44 Hình 4.4 Ảnh hƣởng của BA trên sự tạo chồi và gia tăng số lá của cây lan sị in vitro  Sự tạo sị và ra hoa Trong thí nghiệm này, sự thay đổi nồng độ BA chƣa cảm ứng đƣợc sự tạo sị và ra hoa trên cây lan sị in vitro. Cây tạo chồi và tăng trƣởng số lá nhiều nhƣng chƣa tạo sị và ra hoa trong ống nghiệm. Nhƣ vậy, đối với cây lan sị in vitro, mơi trƣờng MS cĩ bổ sung GA3 là mơi trƣờng thích hợp cho sự ra hoa. Tuy nhiên cần nghiên cứu thêm để khắc phục những mặt cịn hạn chế của hoa lan sị in vitro, gĩp phần điều khiển cây lan sị ra hoa với số lƣợng lớn, hoa hồn chỉnh và thời gian tồn tại của hoa trên cây dài. Mơi trƣờng bổ sung BA hoặc xử lý ánh sáng chƣa thích hợp cho sự ra hoa in vitro của cây lan sị cĩ thể là do chƣa đủ thời gian hoặc do mơi trƣờng chƣa thật sự thích hợp cho sự ra hoa của cây. Cần nghiên cứu thêm để bổ sung thêm vào mơi trƣờng những chất cĩ khả năng cảm ứng sự hoa của cây lan sị in vitro. 45 4.2. NỘI DUNG 2: CÂY BẮT RUỒI IN VITRO Do cây bắt ruồi cĩ thời gian ra hoa ngắn nên đối với sự sinh trƣởng sinh dƣỡng của cây chúng tơi chỉ theo dõi chỉ tiêu về chiều cao chồi trong 15 ngày nuơi cấy. 4.2.1. Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của nồng độ KH2PO4 đến sự ra hoa in vitro trên cây bắt ruồi. Lân (P) cĩ tác dụng kích thích, thúc đẩy quá trình hình thành hoa, giữ hoa ít rụng. Kali (K) làm cây cứng cáp, thúc đẩy ra chồi mới, giữ hoa lâu tàn, màu sắc đẹp. Chính vì vậy, trong thí nghiệm này chúng tơi đã gia tăng nồng độ KH2PO4 để kích thích cây bắt ruồi ra hoa in vitro.  Sự sinh trƣởng chiều cao của cây Bảng 4.8. Ảnh hƣởng của nồng độ KH2PO4 đến sự sinh trƣởng chiều cao của cây bắt ruồi in vitro Nghiệm thức Nồng độ KH2PO4 (mg/l) Chiều cao chồi (cm) 7 ngày 15 ngày 1 (Đ/C) 170 (theo MS) 1,41a 1,88a 2 340 (x 2) 1,80 c 2,02 c 3 510 (x 3) 1,63 b 1,79 a 4 680 (x 4) 1,60 b 1,90 ac 5 850 (x5) 1,32 a 1,48 b Ghi chú: - Trong cùng một cột, các giá trị trung bình cĩ kí tự theo sau giống nhau khơng cĩ sự khác biệt về mặt thống kê (P > 0,05). Sự thay đổi nồng độ KH2PO4 khơng ảnh hƣởng nhiều tới sự sinh trƣởng chiều cao của cây bắt ruồi in vitro. Cụ thể sự tăng trƣởng chiều cao của cây sau 15 ngày nuơi cấy khơng cĩ sự khác biệt lớn so với nghiệm thức đối chứng. Tuy nhiên ở nghiệm thức 2 với nồng độ KH2PO4 tăng gấp đơi lại cĩ sự khác biệt cĩ ý nghĩa so với các nghiệm thức cịn lại (Bảng 4.8). 46  Sự ra hoa Bảng 4.9. Ảnh hƣởng của nồng độ KH2PO4 đến sự ra hoa in vitro của cây bắt ruồi Nghiệm thức Nồng độ KH2PO4 (mg/l) Tỉ lệ cây ra nụ (%) Thời gian ra nụ (ngày) 1 170 (theo MS) 100 a 10,00 a 2 340 (x 2) 22,22 b 12,00 ab 3 510 (x 3) 33,33 b 13,00 ab 4 680 (x 4) 100 a 11,40 ab 5 850 (x 5) 100 a 12,74 b CV (%) 13,5 8,5 Ghi chú: - Trong cùng một cột, các giá trị trung bình cĩ kí tự theo sau giống nhau khơng cĩ sự khác biệt về mặt thống kê (P > 0,05). Ở nồng độ KH2PO4 tăng gấp 4 và 5 lần trong nghiệm thức 4 và 5 của thí nghiệm, cây cĩ tỉ lệ ra nụ cao nhất (100%) và khơng cĩ sự khác biệt cĩ ý nghĩa so với nghiệm thức đối chứng. Hơn nữa, thời gian ra nụ ở hai nghiệm thức này dài hơn hẳn so với đối chứng. Ở nghiệm thức 2 và 3, tỉ lệ cây bắt ruồi in vitro ra nụ rất thấp và thời gian ra hoa dài so với đối chứng là mơi trƣờng khơng thích hợp để điều khiển ra hoa in vitro trên cây bắt ruồi. Cây bắt ruồi là một lồi cây ăn thịt, sinh lý ra hoa của cây cĩ thể khác với cây thơng thƣờng. Sự ra hoa của cây khơng chỉ phục vụ cho sinh sản mà hoa cịn đƣợc dùng thu hút cơn trùng làm thức ăn, tạo nguồn dinh dƣỡng cho cây. Do vậy, nếu chỉ dựa trên việc gia tăng các yếu tố kích thích sự tạo hoa mà ở đây là KH2PO4 cĩ thể chƣa tạo đúng điều kiện cần thiết cho cây ra hoa. 4.2.2. Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của nồng độ NH4NO3 đến sự ra hoa in vitro trên cây bắt ruồi Nhƣ chúng ta đã biết, sự dinh dƣỡng giàu nitơ giúp cây phát triển sinh dƣỡng mạnh, cây cao lớn, lá xanh tốt; thiếu nitơ, lá nhỏ, vàng úa, cây cằn cỗi, phát triển chậm và ra hoa sớm. Hơn nữa, cây bắt ruồi là cây ăn thịt. Khi thiếu dinh dƣỡng, cây 47 sẽ hình thành hoa để thu hút cơn trùng. Trong thí nghiệm này chúng tơi giảm nồng độ NH4NO3, tạo điều kiện mơi trƣờng nghèo dinh dƣỡng để bắt cây bắt ruồi ra hoa in vitro.  Sự sinh trƣởng của cây Bảng 4.10. Ảnh hƣởng của nồng độ NH4NO3 đến sự sinh trƣởng chiều cao của cây bắt ruồi in vitro Nghiệm thức Nồng độ NH4NO3 (mg/l) Chiều cao chồi (cm) 7 ngày 15 ngày 1 (Đ/C) 1650 (theo MS) 1,41a 1,88a 2 825 (1/2) 1,70 b 2,16 b 3 412,5 (1/4) 1,60 b 1,90 a 4 275 (1/6) 1,35 a 2,15 b 5 206,25 (1/8) 1,38 a 1,98 ab Ghi chú: - Trong cùng một cột, các giá trị trung bình cĩ kí tự theo sau giống nhau khơng cĩ sự khác biệt về mặt thống kê (P > 0,05). Theo bảng số liệu, việc giảm nồng độ NH4NO3 trong mơi trƣờng nuơi cấy khơng ảnh hƣởng đáng kể tới sự tạo chồi cây in vitro. Chiều cao chồi sau 7 ngày nuơi cấy quan sát đƣợc ở nghiệm thức 3, 4 và 5 khơng cĩ sự khác biệt cĩ ý nghĩa so với đối chứng, sự gia tăng chiều cao nhiều nhất ở nghiệm thức 2 với nồng độ NH4NO3 giảm đi một nửa so với đối chứng. (Bảng 4.10) 48  Sự ra hoa Bảng 4.11: Ảnh hƣởng của nồng độ NH4NO3 đến sự ra hoa của cây bắt ruồi in vitro Nghiệm thức Nồng độ NH4NO3 (mg/l) Tỉ lệ cây ra nụ (%) Thời gian ra nụ (ngày) 1 1650 (theo MS) 100 a 13 a 2 825 (1/2) 100 a 12,5 a 3 412,5 (1/4) 100 a 12,25 a 4 275 (1/6) 100 a 10 ab 5 206,25 (1/8) 100 a 11 ab CV(%) 0 11,06 Ghi chú: - Trong cùng một cột, các giá trị trung bình cĩ kí tự theo sau giống nhau khơng cĩ sự khác biệt về mặt thống kê (P > 0,05). Theo bảng số liệu, tất cả các nghiệm thức đều đạt tỉ lệ ra nụ cao nhất 100%. Thời gian ra nụ ngắn nhất là ở nghiệm thức 4 (10 ngày). Ở các nồng độ cao hơn hoặc thấp hơn, thời gian ra nụ của cây dài hơn. Nhƣ vậy, mơi trƣờng cĩ nồng độ NH4NO3 giảm sáu lần so với đối chứng (1650 mg/l) là mơi trƣờng thích hợp để kích thích sự ra nụ của cây bắt ruồi. Tuy nhiên, dù tỉ lệ ra nụ trên cây rất cao (100%), nhƣng tất cả các nụ đều hồn tồn khơng nở thành hoa. Qua việc nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ của KH2PO4 và NH4NO3 đối với sự ra hoa in vitro của cây bắt ruồi, chúng tơi nhận thấy rằng sự thay đổi nồng độ của hai thành phần này trong mơi trƣờng nuơi cấy chỉ kích thích đƣợc cây ra nụ mà khơng ra hoa. Những nụ hoa bắt ruồi hình thành trong ống nghiệm chỉ phát triển đƣợc đến giai đoạn nụ trƣởng thành, khơng thể phát triển đến khi nụ nở thành hoa hồn chỉnh ngay cả trong mơi trƣờng cĩ nồng độ KH2PO4 cao là yếu tố quan trọng để kích thích hoa nở nhiều, màu sắc đẹp và giữ hoa lâu tàn. 49 Ở đây, chúng tơi đã tiến hành việc giải phẫu hoa để xem xét sự hiện diện của các cơ quan bên trong nụ hoa. Qua quá trình giải phẫu chúng tơi quan sát đƣợc cấu tạo của các nụ hoa đƣợc thể hiện trong hình 4.6. Theo hình 4.6, cây cĩ gần nhƣ đầy đủ các bộ phận cơ bản của một hoa nhƣ là nhụy, bầu nỗn, chỉ nhị, túi phấn,…nhƣng lại thiếu cánh hoa. Thậm chí cĩ trƣờng hợp nụ hoa hồn tồn khơng cĩ bất cứ một cơ quan hoa nào bên trong mà chỉ cĩ đài hoa rỗng hoặc chỉ cĩ duy nhất chỉ nhị và túi phấn nhƣ hình B7 và B8. Qua đĩ, chúng tơi dự đốn việc nụ hoa khơng thể nở thành hoa hồn chỉnh là do thiếu sự hiện diện của một số cơ quan hoa bên trong trong quá trình tƣợng hoa và tăng trƣởng nở hoa. Nguyên nhân của sự thiếu cơ quan cĩ thể do việc thiếu hụt một số chất cần thiết cho cây trong giai đoạn hình thành cơ quan; mơi trƣờng nuơi cấy khơng thích hợp dẫn tới trƣờng hợp cây khơng thể hồn thiện đƣợc giai đoạn tƣợng hoa và đƣa nụ hoa vào giai đoạn tăng trƣởng nở hoa. Hình 4.5 Các giai đoạn phát triển của hoa bắt ruồi in vitro. (A1): nụ hoa 5 ngày tuổi; (A2): nụ hoa 10 ngày tuổi; (A3): nụ hoa trƣởng thành A1 A3 A2 50 B1: nụ đầy đủ B2, B3: cấu tạo bên trong của nụ trƣởng thành B4: bầu nỗn B5, B6: túi phấn B7, B8: hoa bắt ruồi in vitro Hình 4.6: Cấu tạo hoa và các cơ quan bên trong của nụ hoa bắt ruồi in vitro 51 Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. KẾT LUẬN Trên cơ sở những kết quả thu đƣợc, chúng tơi đƣa ra một số kết luận nhƣ sau:  Đối với cây lan sị in vitro - Mơi trƣờng thích hợp nhất để cây lan sị ra hoa trong ống nghiệm là mơi trƣờng MS cĩ bổ sung 1,5 mg/l GA3. Cây ra nụ sau 78 ngày nuơi cấy và ra hoa sau 95ngày, trung bình đạt 7 hoa/cây. - Mơi trƣờng bổ sung 2,0 và 2,5 mg/l GA3 cũng cĩ thể đƣợc dùng để tạo hoa trong ống nghiệm nhƣng cần nghiên cứu thêm để tăng tỉ lệ ra nụ và số hoa trên cây. Việc sử dụng BA hoặc thay đổi cƣờng độ ánh sáng chƣa cho thấy tác dụng cảm ứng đối với sự hình thành hoa lan sị in vitro.  Đối với cây bắt ruồi in vitro - Việc thay đổi nồng độ KH2PO4 và NH4NO3 khơng cĩ ảnh hƣởng tốt trên sự ra hoa của cây bắt ruồi in vitro. Cây chỉ ra nụ nhƣng tỉ lệ khơng cao hơn so với đối chứng, tất cả các nụ đều khơng nở thành hoa. 5.2. ĐỀ NGHỊ Với kết quả trên chúng tơi đƣa ra một số đề nghị để tiếp tục phát triển hiệu quả của đề tài: - Nghiên cứu tác dụng của sị đối với cây về mặt sinh lý, cơ chế để cây hình thành sị. - Khảo sát các yếu tố giúp hoa lan sị phát triển bình thƣờng và tăng độ bền của hoa lan sị trong ống nghiệm. - Nghiên cứu các yếu tố ảnh hƣởng lên sự ra hoa của cây bắt ruồi in vitro. Khảo sát các yếu tố giúp duy trì nụ hoa và kích thích hoa nở hồn chỉnh. 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1. Lê Đại Hải,2005. Nuơi cấy mơ cây bắt ruồi Drosera Burmannii Vahl và khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của chất chiết thơ Plumbagin. Khĩa luận tốt nghiệp Kỹ sƣ Cơng nghệ Sinh học, Đại học Nơng Lâm, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 2. Nguyễn Nhƣ Khanh. Sinh học phát triển thực vật. Nhà xuất bản Giáo dục. 3. Nguyễn Đức Lƣợng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002. Cơng nghệ tế bào. Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia, Tp. HCM 4. Lê Hồng Thủy Tiên, 2005. Khảo sát sự ra hoa trong ống nghiệm ở cây Dừa cạn (Catharanthus) và Dã yên thảo (Pentunia hybrida). Khĩa luận tốt nghiệp Kỹ sƣ Cơng nghệ Sinh học, Đại học Nơng Lâm, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 5. Mai Trần Ngọc Tiếng, 2001. Thực vật bậc cao. Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia, Tp. HMC, trang 109 - 113 6. Bùi Minh Trí, 2003. Bài giảng Sinh lý thực vật 7. Nguyễn Ngọc Trì, 2005. Bài giảng Sinh lý thực vật, phần II: sinh trưởng và phát triển. 8. Bùi Trang Việt, 2000. Sinh lý thực vật đại cương, phần II: Phát triển. Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia, Tp. HCM, trang 122 – 168, 298 – 308. TIẾNG ANH 9. Ralph Scorza, 1982. In vitro flowering, Horticultural reviews (Ralph Scorza), p. 106-119 TÀI LIỆU INTERNET 10. 11. ắt ruồi lá hình thìa 12. 13. 53 14. 15. 16. 17. 06_1 18. 19. 20. %2C+in+vitro%2C+zantedeschia+spp Scorza, 1982. Hormonal control of inflorescece development in plantets of calla lily (Zantedeschia spp) grown in vitro 21. rt00024 Wang G.Y.; Yuan M.F.; Hong Y, 2002. In vitrro flowering induction in rose. In vitro Cellular and Development Biology - Plant, Volume 38, Number 5, pp. 513-518(6) 22. 00260561;jsessionid=nlnbbm89o5gs.alice Franklin G; Pius P.K.; Ignacimuthu S., 2000. Factors affecting in vitro flowering and fruiting of green pea (Pisum sativum L.). Euphytica, Volume 115, Number 1, 2000, pp. 65-74(10) 23. nid=29434F64139F0A02B4ED08BC3D74F30E Wei - Chin Chang and Yue – Ie Hsing, 1980.In vitro flowering of embryoids derived from mature root callus of ginseng (Panax ginseng). Nature 284, 341 – 342. 24. 25. 26. 54 27. &sid=371 28. bution.asp?referrer=parent&backto=issue,1,17;journal,74,250;linkingpublicat ionresults,1:100383,1 Kostenyuk , B. J. Oh , I. S. So, 1999. Induction of early flowering in Cymbidium niveo-marginatum Mak in vitro. Plant Cell Reports, Vol. 19, No. 1, pp. 1-5. 29. ribution.asp?referrer=parent&backto=issue,5,14;journal,42,145;linkingpublic ationresults,1:100329,1 Yongsak Kachonpadungkitti, Supot Romchatngoen, Koji Hasegawa and Shigeru Hisajima, 2001. Efficient flower induction from cultured buckwheat (Fagopyrum esculentum L.) node segments in vitro. Plant Growth Regulation 35 (1), p. 37 – 45. 30. ribution.asp?referrer=parent&backto=issue,8,17;journal,67,254;linkingpublic ationresults,1:100383,1 W. L. Koh and C. S. Loh, 2000.Direct somatic embryogenesis, plant regeneration and in vitro flowering in rapid-cycling Brassica napus. Plant Cell Reports,Vol. 19, No. 12Pages: 1177 – 1183. 31. ution.asp?referrer=parent&backto=issue,3,10;journal,26,143;linkingpublicati onresults,1:100329,1 Chen Chang and Wei-Chin Chang, 2003. Cytokinins promotion of flowering in Cymbidium ensifolium var. misericors in vitro. Plant Growth Regulation, pp: 217 – 221 32. ibution.asp?referrer=parent&backto=issue,10,16;journal,37,238;linkingpubli 55 cationresults,1:100327,1 Chung-Chih Lin, Chuoun-Sea Lin and Wei-Chin Chang, 2002. In vitro flowering of Bambusa edulis and subsequent plantlet survival. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 72: 71- 78. 33. 34. 35. www.jplantbiotech.com/journal_dir/ pdf_files/vol4_4/vol4_4pp179.pdf S. Sudhakaran, V. Sivasankari, 2002. In vitro flowering Response of Ocimum basilicum L. Plant Biotechnology, Vol. 4 (4), pp. 181-183. 36. www.low-cost-medication.com/ 110/somatic-embryogenesis-of- bamboo.html G. R. Rout and P. Das, 1994. Somatic embryogenesis and in vitro flowering of 3 species of bamboo. Plant Cell Reports 13: 683-686. 37. www.springerlink.com/index/H2072P5256J53412.pdf Rajani S. Nadgauda, C. K. John, V. A. Parasharami, M. S. Joshi & A. F. Mascarenhas, 1997. A comparidon of in vitro with flowering in bamboo: Bambusa arundinace. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 48: 181-188. 38. www.springerlink.com/index/T3TQPEN8CGKDRE3J.pdf H. B. Jumin, M. Ahmad, 1999. High-frequency in vitro flowering of Murraya paniculata (L). Jack. Plant Cell Reports, Vol. 18, No. 9, pp. 764- 768. 56 PHỤ LỤC 1 Thành phần mơi trƣờng MS ( Murashige và Skoog, 1962)  Agar 8,5 g/l  pH mơi trƣờng (trƣớc khi hấp) 5,8 Nguyên tố Nồng độ (mg/l) Nguyên tố đa lƣợng CaCl2 332,02 KNO3 1900,00 KH2PO4 170,00 NH4NO3 1650,00 MgSO4.7H2O 180,54 Nguyên tố vi lƣợng CoCl2.6H2O 0,025 CuSO4.5H2O 0,025 H3BO3 6,20 KI 0,83 MnSO4.H2O 16,90 Na2MoO4.H2O 0,25 ZnSO4.H2O 8,60 Vitamine & aminoacid Glycine 2,00 Myo-Inositol 100 Nicotinic acid 0,50 Pyridoxine HCl 0,50 Thiamine-HCl 0,10 Sắt EDTA FeNaEDTA 36,70 57 PHỤ LỤC 2 1. Nội dung 1 1.1. Thí nghiệm 1  Số chồi trên cây One-Way Analysis of Variance ------------------------------------------------------------------------------- - Data: TN1LSGA3.Sochoi60N Level codes: TN1LSGA3.Treat Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance ------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level ------------------------------------------------------------------------------- - Between groups 195.77778 6 32.629630 10.126 .0000 Within groups 180.44444 56 3.222222 ------------------------------------------------------------------------------- - Total (corrected) 376.22222 62 0 missing value(s) have been excluded. Table of means for TN1LSGA3.Sochoi60N by TN1LSGA3.Treat ------------------------------------------------------------------------------- - Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean ------------------------------------------------------------------------------- - 1 9 9.888889 .6758625 .5983516 9.041128 10.736650 2 9 6.222222 .4339028 .5983516 5.374461 7.069983 3 9 10.333333 .7453560 .5983516 9.485572 11.181094 4 9 9.666667 .4409586 .5983