Khóa luận Khảo sát hiệu quả một số thuốc bảo vệ thực vật dùng phõng trị bệnh rụng lá corynespora (corynespora cassiicola (berk. & curt.) wei.) trên cây cao su

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT HIỆU QUẢ MỘT SỐ THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT DÙNG PHÕNG TRỊ BỆNH RỤNG LÁ CORYNESPORA (Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei.) TRÊN CÂY CAO SU Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 - 2007 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN VĂN PHƢƠNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT HIỆU QUẢ MỘT SỐ THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT DÙNG PHÕNG TRỊ BỆNH RỤNG LÁ CORYNESPORA (Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei.) TRÊN CÂY CAO SU Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: ThS. PHAN THÀNH DŨNG NGUYỄN VĂN PHƢƠNG TS. TRẦN VĂN CẢNH TS. PHAN PHƢỚC HIỀN Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 iii LỜI CẢM TẠ Tôi xin chân thành cảm tạ: Ban Giám Hiệu trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, Ban Chủ Nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý Thầy - Cô đã truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong suốt thời gian học tại trƣờng. TS. Phan Phƣớc Hiền, ThS. Phan Thành Dũng và TS. Trần Văn Cảnh đã tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận. Ban giám đốc Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực tập và hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp. KS. Vũ Thị Quỳnh Chi cùng các cô chú, anh chị cán bộ công nhân viên Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật - Viện Nghiên Cứu Cao Su đã nhiệt tình giúp đỡ và hƣớng dẫn tôi trong suốt thời gian thực tập tại Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam. Bạn Phạm Ngọc Chinh và bạn Nguyễn Ngọc Thanh Trang đã chia sẻ khó khăn và giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập. Các bạn bè thân yêu lớp Công Nghệ Sinh Học 29 đã giúp đỡ và chia sẻ cùng tôi những vui buồn trong suốt những năm học cũng nhƣ thời gian thực tập tốt nghiệp. Sinh viên thực hiện: Nguyễn Văn Phƣơng iv TÓM TẮT NGUYỄN VĂN PHƢƠNG, Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 9/2007. “Khảo sát hiệu quả một số thuốc bảo vệ thực vật dùng phòng trị bệnh rụng lá Corynespora (Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei.) trên cây cao su”. Bệnh rụng lá Corynespora gây ra bởi nấm C. cassiicola đang đƣợc xem là bệnh lá nguy hiểm nhất cho các vùng trồng cao su trên thế giới. Ở Việt Nam, bệnh xuất hiện lần đầu vào tháng 8 năm 1999. Hiện nay, bệnh đang trong giai đoạn tích lũy và có thể bùng phát trong tƣơng lai. Do đó, công tác phòng trừ bệnh đang rất đƣợc quan tâm. Đề tài này thực hiện khảo sát 9 loại thuốc bảo vệ thực vật dùng phòng trị nấm C. cassiicola. Kết quả đạt đƣợc trong các thí nghiệm nhƣ sau: Thí nghiệm in vitro: có 6 loại thuốc cho hiệu quả ức chế nấm cao là: Cyproconazole, Flusilazole, Hexaconazole, Triadimenol, Tebuconazole, Propiconazole. Thuốc Difenoconazole cho hiệu quả ức chế cao ngay từ nồng độ thấp, nhƣng khi tăng nồng độ lên cao thì hiệu quả lại tăng rất ít. Không có loại thuốc nào ức chế khả năng hình thành bào tử trên môi trƣờng nhân tạo. Ngƣợc lại, một số thuốc Hexaconazole, Flusilazole, Cyproconazole, Propiconazole, Triadimenol, Tebuconazole, Triadimefon còn làm tăng mật độ bào tử ở các nồng độ ức chế cao. Các loại thuốc cũng không ảnh hƣởng tới hình thái và tỉ lệ nảy mầm của bào tử. Thí nghiệm trên lá cắt rời: cả 6 loại thuốc thí nghiệm Cyproconazole, Difenoconazole, Flusilazole, Hexaconazole, Tebuconazole, Propiconazole đều có hiệu quả giảm mức độ bệnh so với đối chứng. Nhƣng thuốc Difenoconazole có thời gian bảo hộ ngắn hơn. Thí nghiệm ngoài đồng: cả 5 loại thuốc Cyproconazole, Flusilazole, Hexaconazole, Tebuconazole, Propiconazole đều có hiệu quả phòng trị nấm cao. Tỉ lệ khỏi bệnh hoàn toàn tới 65 đến 79%, mức độ bệnh giảm tử 79 đến 87%. Trong đó thuốc Hexaconazole và Flusilazole luôn thể hiện hiệu quả cao nhất ở tất cả các thử nghiệm. v SUMMARY NGUYEN VAN PHUONG, Nong Lam University, Ho Chi Minh City. Sectember, 2007. “Investigation effect of some pesticides use control of Corynespora leaf disease (Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei.) of Hevea brasiliensis” Corynespora leaf fall disease caused by C. cassiicola was considered as one of the most serious leaf diseases on rubber tree. In Vietnam, the disease was first detected in August, 1999. At present, the disease is spreading and developing into epidemics in future. Because of that, the control of disease has being very considered. Nine pesticides are tested on C. cassiicola, the result is mentioned below: In vitro tests: Six pesticides included Cyproconazole, Flusilazole, Hexaconazole, Triadimenol, Tebuconazole, and Propiconazole are highly to inhibit the growth of fungal colonies. Difenoconazole is the most effective at the low dose, but its effect doesn’t increase when its degree of concentration increase. All tested fungicides are not able to reduce a number of fungal spores on artificial medium. Conversely, some pesticide as Hexaconazole, Flusilazole, Cyproconazole, Propiconazole, Triadimenol, Tebuconazole, Triadimefon even make to increase density spores at the high dose. These pesticides don’t also affect to spore form and percentage of spore germination. Detected leaves tests: Cyproconazole, Difenoconazole, Flusilazole, Hexaconazole, Tebuconazole and Propiconazole are highly effective to inhibit on disease development compared to the control. Among them, Difenoconazole is less remain the effectiveness after each application. Field tests: Five fungicides included Cyproconazole, Flusilazole, Hexaconazole, Tebuconazole and Propiconazole are found very effect to control the disease development. Hexaconazole and Flusilazole are showed the most effective to reduce the disease infection. vi MỤC LỤC ĐỀ MỤC TRANG Trang tựa Lời cảm tạ .................................................................................................................. iii Tóm tắt ....................................................................................................................... iv Summary ..................................................................................................................... v Mục lục ....................................................................................................................... vi Danh sách các chữ viết tắt .......................................................................................... ix Danh sách các hình ...................................................................................................... x Danh sách các bảng .................................................................................................. xi Chƣơng 1 MỞ ĐẦU ................................................................................................. 1 1.1. Đặt vấn đề .......................................................................................................... 1 1.2. Mục đích và yêu cầu .......................................................................................... 2 1.2.1. Mục đích ..................................................................................................................... 2 1.2.2. Yêu cầu ........................................................................................................................ 2 1.3. Giới hạn đề tài .................................................................................................... 3 Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................... 4 2.1. Giới thiệu về cây cao su Hevea brasiliensis Muell. Arg ................................... 4 2.2. Đặc tính sinh học của nấm C. cassiicola trên cây cao su. ................................. 7 2.2.1. Phân loại học .............................................................................................................. 7 2.2.2. Hình thái khuẩn ty, khuẩn lạc, bào tử và điều kiện nuôi cấy ................................... 7 2.2.3. Phổ kí chủ, sự xâm nhiễm của nấm C. cassiicola .................................................... 9 2.3. Bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su H. brasiliensis Muell. Arg. ............ 9 2.3.1. Nguyên nhân và triệu chứng ..................................................................................... 9 2.3.2. Điều kiện phát sinh bệnh .......................................................................................... 11 2.3.3. Tác hại của bệnh và cách phòng trị ......................................................................... 11 2.4. Phòng trị bệnh bằng thuốc bảo vệ thực vật ...................................................... 12 vii 2.4.1. Lịch sử và phân loại thuốc bảo vệ thực vật ............................................................ 12 2.4.2. Triazole - Nhóm thuốc trừ nấm ............................................................................... 13 2.4.3. Tình hình sử dụng hóa chất trong kiểm soát bệnh rụng lá Corynespora .............. 14 Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP .......................................................... 16 3.1. Thời gian và địa điểm tiến hành ...................................................................... 16 3.2. Đối tƣợng nghiên cứu ...................................................................................... 16 3.3. Phƣơng pháp cơ bản ......................................................................................... 16 3.3.1. Phƣơng pháp lấy mẫu .............................................................................................. 16 3.3.2. Phân lập ..................................................................................................................... 17 3.3.3. Phƣơng pháp nhân số lƣợng bào tử ......................................................................... 18 3.4. Khảo sát hiệu quả sử dụng hóa chất................................................................. 19 3.4.1. Hoá chất ................................................................................................................... 19 3.4.2. Khảo sát hiệu quả thuốc trên đĩa petri ..................................................................... 20 3.4.3. Khảo sát hiệu quả thuốc trên lá bệnh cắt rời ........................................................... 21 3.4.4. Khảo sát hiệu quả thuốc trên vƣờn gỗ ghép ........................................................... 23 3.5. Xử lý số liệu ..................................................................................................... 24 Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................ 25 4.1. Kết quả phân lập mẫu nấm .............................................................................. 25 4.2. Khảo sát ảnh hƣởng các loại thuốc trên môi trƣờng in vitro ........................... 26 4.2.1. Hiệu quả ức chế đƣờng kính khuẩn lạc của các loại thuốc ................................... 26 4.2.2. Ảnh hƣởng của thuốc đến mật độ, kích thƣớc và tỉ lệ nảy mầm của bào tử ......... 38 4.2.2.1. Sự ảnh hƣởng của thuốc đến mật độ bào tử hình thành trên môi trƣờng bị đầu độc ............................................................................................. 39 4.2.2.2. Sự ảnh hƣởng của thuốc đến hình thái bào tử hình thành trên môi trƣờng bị đầu độc ............................................................................................. 41 4.2.2.3. Sự ảnh hƣởng của thuốc đến khả năng nảy mầm của bào tử hình thành trên môi trƣờng bị đầu độc ...................................................................................... 42 4.3. Kết quả thí nghiệm trên lá cắt rời .................................................................... 44 4.4. Kết quả thí nghiệm ngoài đồng ........................................................................ 48 viii 4.4.1. Ảnh hƣởng của các loại thuốc đến tỉ lệ nhiễm bệnh. ............................................. 49 4.4.2. Ảnh hƣởng của các loại thuốc đến mức độ nhiễm bệnh. ....................................... 51 Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................... 53 5.1. Kết luận ............................................................................................................ 53 5.2. Đề nghị ............................................................................................................. 53 Chƣơng 6 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................... 55 PHỤ LỤC .................................................................................................................. 58 ix DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT BVTV: Bảo vệ thực vật. CSB: Chỉ số bệnh. Ctv: Cộng tác viên. Dvt: Dòng vô tính. LD50: Liều lƣợng làm chết 50% cá thể (Lethal Dose). LD90: Liều lƣợng làm chết 90% cá thể. LLL: Lần lặp lại. PDA: Potato Dextrose Agar. PSA: Potato Saccharose Agar. TLB: Tỉ lệ bệnh. VNCCSVN: Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam. x DANH SÁCH CÁC HÌNH TRANG Hình 2.1. Triệu chứng của bệnh rụng lá Corynespora trên lá trƣởng thành ............. 10 Hình 2.2. Triệu chứng của bệnh rụng lá Corynespora trên lá non và cành............... 10 Hình 4.1. Khuẩn lạc và bào tử nấm C. cassiicola sau khi phân lập .......................... 26 Hình 4.2. Bào tử nấm C. cassiicola trên lá cao su .................................................... 26 Hình 4.3. Khuẩn lạc nấm C. cassiicola trên môi trƣờng bị đầu độc thuốc Cyproconazole sau 7 ngày cấy nấm ......................................................... 33 Hình 4.4. Khuẩn lạc nấm C. cassiicola trên môi trƣờng bị đầu độc thuốc Difenoconazole sau 7 ngày cấy nấm ....................................................... 34 Hình 4.5. Khuẩn lạc nấm C. cassiicola trên môi trƣờng bị đầu độc thuốc Flusilazole sau 7 ngày cấy nấm ................................................................ 34 Hình 4.6. Khuẩn lạc nấm C. cassiicola trên môi trƣờng bị đầu độc thuốc Hexaconazole sau 7 ngày cấy nấm ........................................................... 35 Hình 4.7. Khuẩn lạc nấm C. cassiicola trên môi trƣờng bị đầu độc thuốc Triadimenol sau 7 ngày cấy nấm .............................................................. 35 Hình 4.8. Khuẩn lạc nấm C. cassiicola trên môi trƣờng bị đầu độc thuốc Tebuconazole sau 7 ngày cấy nấm ........................................................... 36 Hình 4.9. Khuẩn lạc nấm C. cassiicola trên môi trƣờng bị đầu độc thuốc Triacyclazole sau 7 ngày cấy nấm ............................................................ 36 Hình 4.10. Khuẩn lạc nấm C. cassiicola trên môi trƣờng bị đầu độc thuốc Propiconazole sau 7 ngày cấy nấm .......................................................... 37 Hình 4.11. Khuẩn lạc nấm C. cassiicola trên môi trƣờng bị đầu độc thuốc Triadimefon sau 7 ngày cấy nấm .............................................................. 37 Hình 4.12. Bào tử và ống mầm nấm C. cassiicola .................................................... 43 xi DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ BIỂU ĐỒ TRANG Bảng 3.1 Thành phần môi trƣờng PSA, PDA ........................................................... 17 Bảng 3.2. Các loại thuốc sử dụng trong thí nghiệm .................................................. 19 Bảng 3.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ngoài đồng .......................................................... 24 Bảng 4.1: Ảnh hƣởng của thuốc trừ nấm đến đƣờng kính khuẩn lạc C. cassiicola ...... 28 Bảng 4.2: Ảnh hƣởng của thuốc trừ nấm đến tốc độ phát triển đƣờng kính khuẩn lạc ............................................................................... 31 Bảng 4.3: Phƣơng trình tƣơng quan tuyến tính và chỉ số LD50 của các loại thuốc sau 7 ngày nuôi cấy. ................................................... 32 Bảng 4.4.Sự ảnh hƣởng của các loại thuốc lên mật độ, kích thƣớc và tỉ lệ nảy mầm của bào tử ...................................................................... 40 Bảng 4.5. Chỉ số bệnh trung bình sau 1, 3, 5, 7 ngày lây bệnh trên lá cắt rời .......... 45 Bảng 4.6. Tỉ lệ bệnh trung bình sau 1, 3, 5, 7 ngày lây bệnh trên lá cắt rời ............. 48 Bảng 4.7. Nồng độ các thuốc sử dụng trong thí nghiệm ngoài đồng ........................ 49 Bảng 4.8. Tỉ lệ bệnh trung bình trƣớc và sau các lần xử lý thuốc ngoài đồng ......... 49 Bảng 4.9. Chỉ số bệnh trung bình trƣớc và sau các lần xử lý thuốc ngoài đồng....... 51 Biểu đồ 4.1. Chỉ số bệnh trung bình sau 7 ngày lây bệnh trên lá cắt rời .................. 47 1 Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Bệnh rụng lá Corynespora do nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei. gây ra, là loại bệnh mới và có tác hại lớn chƣa từng có từ trƣớc tới nay ở các nƣớc trồng cao su tại Đông và Nam Á. Bệnh xuất hiện lần đầu trên cây cao su thực sinh tại Châu Phi năm 1949, tiếp theo nghi nhận tại Ấn Độ năm 1958, Malaysia năm 1961, Thái Lan, Sri Lanka và Indonesia năm 1985, Brazil và Bangladesh năm 1988 (Phan Thành Dũng, 2004), và gần đây nhất tại Trung Quốc năm 2007 (Jinji và ctv, 2007). Bệnh gây thiệt hại nặng nhất tại Sri Lanka, nơi phải nhổ bỏ và trồng lại trên 5.000 ha. Tại Malaysia, Thái Lan và Indonesia nhiều ngàn ha cao su bị hại nặng làm ảnh hƣởng lớn đến sản lƣợng và sinh trƣởng đôi khi gây chết toàn bộ cây. Tại Ấn Độ, dòng vô tính RRII 108 đƣợc trồng chiếm 80% tổng diện tích cao su cả nƣớc bị nhiễm loại bệnh này, hàng năm phải sử dụng hoá chất để phòng trị hàng chục ngàn ha. Nhiều dòng vô tính (dvt) sinh trƣởng nhanh và sản lƣợng cao ngày càng dễ nhiễm. Hơn nữa, tính kháng bệnh của dvt biến thiên nhiều theo từng vùng khí hậu khác nhau. Trên cây cao su, bệnh gây hại ở tất cả các bộ phận trên mặt đất nhƣ: lá, cuống và chồi (Phan Thành Dũng, 2004). Ở Việt Nam, bệnh đƣợc ghi nhận lần đầu vào tháng 8 năm 1999, gây hại nặng cho dvt RRIC 103, RRIC 104 và LH 88/372. Hiện nay, số lƣợng dvt bị nhiễm bệnh tăng lên nhiều và cũng đã xuất hiện tại một số công ty cao su tại Đông Nam Bộ (Phan Thành Dũng, 2004). Hiện nay, bệnh đang trong giai đoạn tích lũy và có thể bùng phát trong tƣơng lai (Phan Thành Dũng, 2006). Nguy cơ có thể cao hơn nữa, do sự phá vỡ tính kháng của chủng nấm đối với các dvt ngày càng nhanh, sự thay đổi khí hậu thất thƣờng cũng nhƣ sự trao đổi thƣơng mại các sản phẩm nông nghiệp 2 đang trên đà tăng nhanh. Do đó, việc nghiên cứu về các đặc điểm cũng nhƣ các biện pháp phòng trừ hiệu quả bệnh rụng lá Corynespora đang rất đƣợc quan tâm hiện nay. Trên cơ sở đó, chúng tôi thực hiện đề tài “Khảo sát hiệu quả một số thuốc bảo vệ thực vật dùng phòng trị bệnh rụng lá Corynespora (Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei.) trên cây cao su”. 1.2. Mục đích và yêu cầu 1.2.1. Mục đích Mục đích của đề tài là tìm ra những hóa chất bảo vệ thực vật thích hợp cho việc phòng và trị bệnh rụng lá Corynespora. Từ mục đích trên, nghiên cứu đƣợc hiện với mục tiêu cụ thể sau: Phân lập và nuôi cấy nấm C. cassiicola trên môi trƣờng in vitro. Khảo sát hiệu quả hóa chất trên môi trƣờng in vitro, nghiên cứu ảnh hƣởng hoá chất đến khả năng hình thành bào tử, hình thái và khả năng nảy mầm của bào tử. Khảo sát hiệu quả hóa chất trên lá cao su cắt rời đƣợc lây bệnh bằng bào tử. Khảo sát hiệu quả hóa chất trên vƣờn gỗ ghép đã nhiễm bệnh. 1.2.2. Yêu cầu Hiểu biết căn bản về bệnh cây cao su, bệnh rụng lá Corynespora nhận diện đƣợc triệu chứng đặc trƣng của bệnh. Nắm vững quy trình phân lập, nuôi cấy và thử nghiệm thuốc trong phòng. Hiểu biết về thuốc bảo vệ thực vật và các kỹ thuật liên quan . Nắm vững các thao tác trong phòng thí nghiệm và trên vƣờn thực nghiệm. Vận hành các máy móc thiết bị hiện có, củng cố nắm vững kiến thức đã học. 3 1.3. Giới hạn đề tài Thời gian thực tập hạn chế (từ tháng 03/03/2007 – 30/07/2007). Khối lƣợng mẫu thí nghiệm lớn nên độ lặp lại của một số thí nghiệm có phần hạn chế. Khi xử lý ngoài đồng thì vào thời điểm mƣa nhiều nên ảnh hƣởng đến kết quả phun thuốc thí nghiệm. Do kinh nghiệm bản thân về bảo vệ thực vật còn hạn chế nên việc đánh giá kết quả chƣa hoàn hảo. 4 Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Giới thiệu về cây cao su Hevea brasiliensis Muell. Arg. Những cây có nhựa mủ có thể sản xuất ra cao su trên thế giới thuộc vào năm họ thực vật sau: Euphorbiaceae, Moraceae, Apocynaceae, Aslepiadaceae, Compositae. Nhƣng cây cao su thuộc loại H. brasiliensis (giống Hevea, họ Euphorbiaceae) là cây duy nhất đƣợc chọn để canh tác đại qui mô (Nguyễn Hữu Trí, 2004). Cây cao su có nguồn gốc tự nhiên ở vùng rừng lƣu vực Amazone, Nam Mỹ, trải rộng từ vĩ tuyến 15 Nam đến vĩ tuyến 16 Bắc và kinh tuyến 46 – 77 Tây, bao gồm các nƣớc Brazil, Bolivia, Colombia, Peru, Ecuador, Venezuela, French Guiana, Surinam và Guyana. Dân địa phƣơng đã dùng mủ cao su để làm các vật dụng chống thấm và có tính đàn hồi nhƣ quả bóng đồ chơi thể thao, tấm lợp nhà, túi đựng nƣớc, các hình tƣợng trong lễ hội tôn giáo… Cây cao su đƣợc ngƣời châu Âu biết lần đầu sau chuyến thám hiểm của ông Christopher Columbus đến châu Mỹ năm 1492. Sau đó, một số nhà khoa học châu Âu đã khám phá các đặc tính của mủ cao su: đàn hồi, dẻo, không thấm nƣớc. Cao su đƣợc sử dụng làm nguyên liệu chế tạo vỏ ruột xe đạp từ 1888 và vỏ ruột xe hơi từ 1895. Những phát minh lƣu hoá cao su và hoà trộn mủ cao su với các nguyên liệu khác (bột than, thép, kaolin, đất đỏ…) đã làm các sản phẩm từ mủ cao su ngày càng phong phú, đa dạng, từ đó nhu cầu cao su tăng nhanh. Cho đến cuối thế kỷ 19, cao su thiên nhiên là do Brazil độc quyền cung cấp từ các cây rừng. Để giải quyết nhu cầu về cao su ngày càng tăng, nƣớc Anh đã tìm cách trồng cây cao su ở các nƣớc châu Á. Năm 1876, Henry Wickham, nhà thực vật 5 Anh, đã chuyển 70.000 hạt cao su từ Brazil về Anh, sau đó những cây con từ nguồn hạt này đƣợc mang sang trồng ở Sri Lanka, Singapore, Malaysia và Indonesia. Từ 1883, cây cao su ở Sri Lanka và Malaysia có hạt và làm nguồn giống cung cấp cho nhiều nƣớc châu Á và châu Phi. Sau năm 1889, các vƣờn cao su châu Á bắt đầu sản xuất mủ, nhanh chóng vƣợt Brazil và đến nay vẫn giữ vị trí chủ đạo, đứng đầu là Thái Lan, Indonesia và Malaysia (Đặng Văn Vinh, 1997). Năm 1897 đánh dấu sự hiện diện của cây cao su ở Việt Nam. Công ty cao su đầu tiên đƣợc thành lập là Suzannah (Dầu Giây, Long Khánh, Đồng Nai) năm 1907. Tiếp theo sau hàng loạt đồn điền và công ty ra đời, chủ yếu là của ngƣời Pháp và tập trung ở Đông Nam Bộ: SIPH, SPTR, CEXO, Michelin,… Một số đồn điền cao su tƣ nhân Việt Nam cũng đƣợc thành lập. Đến năm 1920, miền Đông Nam Bộ có khoảng 7.000 ha và sản lƣợng 3.000 tấn. Cây cao su đƣợc đƣa vào trồng ở Tây Nguyên từ năm 1923 và phát triển mạnh trong giai đoạn 1960 – 1962, trên những vùng đất có cao trình 400 – 600 m, sau đó ngƣng vì chiến tranh. Trong thời kỳ trƣớc 1975, để có nguồn nguyên liệu cho ngành công nghiệp miền Bắc, cây cao su đã đƣợc trồng vƣợt trên vĩ tuyến 17º Bắc (Quảng Trị, Quảng Bình, Nghệ An, Thanh Hoá, Phú Thọ) trong giai đoạn 1958 – 1963 từ nguồn giống từ Trung Quốc, diện tích đã lên tới khoảng 6.000 ha. Đến năm 1976, Việt Nam còn gần 76.000 ha, tập trung ở Đông Nam Bộ khoảng 69.500 ha, 3.482 ha ở Tây Nguyên và 3.636 ha ở các tỉnh duyên hải miền Trung và khu Bốn cũ. Sau năm 1975, cây cao su đƣợc tiếp tục phát triển chủ yếu ở Đông Nam Bộ tại các tỉnh Đồng Nai, Bình Dƣơng, Bình Phƣớc, Tây Ninh và Bà Rịa. Từ năm 1977, Tây Nguyên bắt đầu lại chƣơng trình trồng mới cao su, đầu tiên do các nông trƣờng quân đội, sau năm 1985 do các công ty quốc doanh và tƣ nhân đã tham gia trồng cao su từ năm 1992 đến nay. Ở miền Trung, sau năm 1984, cây cao su đƣợc phát triển ở Quảng Trị, Quảng Bình trong các công ty quốc doanh. (Trần Thị Thuý Hoa, 2006). 6 Cây cao su là loại cây công nghiệp dài ngày, cung cấp mủ và gỗ cho rất nhiều ngành công nghiệp. Đây cũng là loại cây có giá trị kinh tế cao trong các lĩnh vực nông – lâm – công nghiệp. Trong những năm gần đây, sản lƣợng mủ không ngừng đƣợc nâng cao nhờ những cải tiến về giống, kỹ thuật nông nghiệp, quy trình khai thác. v.v. Tính đến cuối năm 2006, diện tích cao su cả nƣớc đã đạt gần 511.900 ha với sản lƣợng 546.900 tấn, năng suất bình quân đạt 1.370 kg/ha/năm. Riêng các diện tích do Tập đoàn Cao su Việt Nam quản lý đạt năng suất bình quân là 1,86 tấn/ha/năm, đứng đầu trên thế giới. Năm 2006, toàn Ngành cao su xuất khẩu 707.895 tấn đạt kim ngạch xuất khẩu gần 1,3 tỷ USD, là nông sản đứng thứ 2 về kim ngạch xuất khẩu sau lúa (Tập đoàn Cao su Việt Nam, 2007). Trong tƣơng lai khi nghị định thƣ Kyoto đƣợc thông qua thì việc bán hạn ngạch về khí thải sẽ mang lại cho ngƣời trồng cao su thêm một khoản thu nhập đáng kể (Trần Văn Cảnh, 2006). Cùng với sự phát triển mạnh cây cao su thì những thiệt hại do bệnh gây ra cũng gia tăng đáng kể. Một phần do việc chọn lọc theo hƣớng sản lƣợng cao, sinh trƣởng nhanh đã làm thất thoát gen kháng bệnh. Mặt khác, do tình hình thời tiết – khí hậu có nhiều thay đổi và diễn biến phức tạp. Thêm vào đó, việc phát triển và chuyên canh cây trồng trên diện rộng trong vùng khí hậu nóng ẩm, mƣa nhiều đã dẫn đến sự phát sinh – phát triển mạnh về cả chủng loại cũng nhƣ mức độ bệnh, gây ảnh hƣởng không nhỏ đến vấn đề canh tác và hiệu quả kinh tế của nó, thiệt hại đến sản lƣợng và gia tăng chi phí sản xuất. Hiện nay, cao su đƣợc phát triển mạnh dƣới dạng tiểu điền, nên thiệt hại do bệnh gây ra đã ảnh hƣởng trực tiếp đến đời sống của những ngƣời trồng cao su. Theo Chee (1976), cây cao su bị trên 550 loài sinh vật tấn công, trong đó có 24 loài có tầm quan trọng về kinh tế. Đến năm 2003, Phan Thành Dũng và cộng tác viên (ctv) cho biết có 8 loại bệnh cao su chính gây ảnh hƣởng trực tiếp đến sinh trƣởng và sản lƣợng cây cao su trong nƣớc, trong đó có 4 loại bệnh lá, 2 bệnh thân cành, 1 bệnh mặt cạo và 1 bệnh rễ. Đáng kể trong các loại trên, bệnh rụng lá 7 Corynespora là bệnh mới xuất hiện năm 1999 và đang có chiều hƣớng mở rộng phạm vi gây hại cho các dvt cao su mới (Phan Thành Dũng, 2004). 2.2. Đặc tính sinh học của nấm C. cassiicola trên cây cao su. 2.2.1. Phân loại học Bệnh rụng lá Corynespora đƣợc ghi nhận xuất hiện lần đầu tiên trên cây cao su thực sinh tại Sierra Leone (châu Phi) năm 1949. Năm 1954, Wei. tổng hợp và đặt tên nấm gây bệnh là Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei.. Theo nghiên cứu phân loại gần đây nhất (Kirk và Paul, 2004 – trích dẫn bởi Lê Văn Huy, 2006) thì nấm C. cassiicola đƣợc phân loại nhƣ sau: Giới nấm (Fungi). Ngành (Phylum): Ascomycota. Lớp (Class): Ascomycetes. Bộ (Order): Pleosporales. Họ (Family): Corynesporascaceae. Giống (Genus): Corynespora. (Nguồn: 2.2.2. Hình thái khuẩn ty, khuẩn lạc, bào tử và điều kiện nuôi cấy Khuẩn ty của nấm có màu xám đến nâu. Khuẩn lạc biến thiên rất lớn về tốc độ sinh trƣởng, hình thái, độ dày, độ mịn và màu sắc khuẩn lạc cho dù đƣợc phân lập từ một bào tử duy nhất (Dung, 1995). Trên môi trƣờng PDA (Potato Dextrose Agar), PSA (Potato Sucrose Agar) khuẩn lạc có màu xám đến nâu (Liyanage & Jayasinghe, 1988). Về hình thái và hình dạng bào tử trên vết bệnh cũng nhƣ trong môi trƣờng nhân tạo có sự biến thiên rất lớn. Bào tử trên lá có màu nâu nhạt với dạng hình lƣỡi liềm hay thẳng chứa nhiều vách ngăn. Chiều dài biến thiên lớn (22 – 300 m), đôi 8 khi đạt 700 m. Chiều rộng biến thiên từ 5 – 10 m. Bào tử dạng đơn, đôi khi dạng chuỗi dính với nhau ở hai đầu gọi là hilum. Bào tử phát tán nhờ gió và hạt mƣa, phóng thích vào ban ngày, và tại Việt Nam cao điểm từ 8 – 11 giờ sáng. Sau thời gian mƣa nhiều và tiếp theo nắng ráo, số lƣợng bào tử phóng thích nhiều nhất do nấm cần ẩm độ cao để hình thành bào tử (Phan Thành Dũng, 2004; Ellis và Holiday, 1971). Trên vết bệnh, số lƣợng bào tử có khi lên đến 1.200 bào tử/cm2. Nấm C. cassiicola rất ít hình bào tử trên môi trƣờng nhân tạo, số lƣợng bào tử cũng thay đổi tùy dvt. Có dvt sản xuất trên 100.000 bào tử trên 1 đĩa petri trong khi chủng khác lại không tạo bào tử (Liyanage và Jayasinghe, 1986). Nếu dùng các biện pháp kích thích nhƣ: để tối liên tục 3 ngày, sau đó chiếu sáng liên tục 3 ngày bằng ánh sáng huỳnh quang hay chiếu sáng bằng tia cực tím trong thời gian ngắn.v.v... sẽ làm tăng số lƣợng bào tử (Chee, 1988). Dƣới điều kiện tối ƣu: phạm vi nhiệt độ từ 25 – 30oC, ẩm độ 100% bào tử nảy mầm trong 3 giờ (Liyanage và Jayasinghe, 1988) và phát triển ống mầm ở vị trí nằm giữa hai vách, nhƣng phổ biến nhất ở hai đầu của bào tử. Nhiệt độ từ 15 – 20oC, bào tử nảy mầm sau 12 giờ và khi nhiệt độ trên 35 – 40oC bào tử không nảy mầm đƣợc. Ẩm độ trên 96% và nếu không có nƣớc tự do hiện diện thì bào tử vẫn có thể nảy mầm đƣợc nhƣng thời gian ủ bệnh kéo dài hơn 24 giờ. Bào tử có khả năng tồn tại trên các vết bệnh cũng nhƣ trong đất với thời gian kéo dài, trên lá cao su khô nấm vẫn tồn tại và giữ nguyên khả năng gây bệnh đến 3 tháng (Phan Thành Dũng, 2004). Điều kiện nuôi cấy: Nấm có thể nuôi cấy trên nhiều môi trƣờng khác nhau, với pH thay đổi tùy môi trƣờng: PDA (pH: 6,8 – 7), PSA (pH: 6,8 – 7,0): Rose Ben Agar (pH: 5,5); Czapek Dox Agar (pH: 6,8 – 7,2); Corn Meal Agar (pH: 6,8 – 7,0). Richard’s medium (pH: 5,4). Tuy nhiên môi trƣờng PDA là môi trƣờng tối ƣu cho sự phát triển của nấm, 9 môi trƣờng PSA hay dịch chiết cao su + dextrose + agar là hai môi trƣờng thích hợp nhất cho sự hình thành bào tử (Liyanage và cộng sự, 1986). 2.2.3. Phổ kí chủ, sự xâm nhiễm của nấm C. cassiicola Nấm C. cassiicola có phổ kí chủ rộng, gồm khoảng 150 loài ký chủ thuộc các nhóm cây ăn quả, cây công nghiệp, cây lâm nghiệp, cây ngũ cốc, cây rau màu và nhiều loại cây cảnh khác. Chúng phân bố trên 80 nƣớc, ở nhiều vùng khí hậu từ nhiệt đới đến ôn đới và gây hại trên tất cả bộ phận của cây từ lá tới rễ. Tuy nhiên, nấm C. cassiicola trên cây cao su là ký sinh chuyên biệt (Phan Thành Dũng, 2004). Nấm xâm nhập chủ yếu ở mặt dƣới lá qua biểu bì và khí khổng, ngoài ra nấm còn tiết ra men cellulozase giúp phân hủy màng tế bào. Sau khi bào tử nảy mầm, chúng mọc sâu vào vị trí vách ngăn của các tế bào dậu, sau đó khuẩn ty phân nhánh xâm nhiễm vào tế bào và hình thành bào tử 96 giờ sau đó. Trong quá trình sinh trƣởng nấm tiết ra độc tố cassiicolin (CC. toxin) chứa các amino acid, hợp chất này rất độc cho cao su cho nên chỉ với một vết bệnh nhỏ trên gân lá chính cũng đủ gây rụng lá (Phan Thành Dũng, 2004). Đây là loại độc tính chuyên biệt, có tác động đến hiện tƣợng chết mô lá, vỏ và kích thích lá hình thành tầng rời, hậu quả là gây rụng lá. 2.3. Bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su H. brasiliensis Muell. Arg. 2.3.1. Nguyên nhân và triệu chứng Bệnh do nấm C. cassiicola gây nên, nấm có khả năng gây hại cho cả lá già và lá non cũng nhƣ cuống lá và chồi với các triệu chứng biểu hiện rất khác nhau (Phan Thành Dũng, 2004). Trên lá: Vết bệnh màu đen với hình dạng xƣơng cá dọc theo gân lá, vết bệnh lan rộng nếu điều kiện thuận lợi, gây chết từng phần lá do sự phá hủy của lục lạp, sau đó lá đổi màu vàng cam và rụng từng lá một. Trên lá non vết bệnh hình tròn màu xám đến nâu với quầng màu vàng xung quanh, có khi hình thành lỗ thủng. Lá quăn và biến dạng, sau đó rụng toàn bộ. 10 Hình 2.1. Triệu chứng của bệnh rụng lá Corynespora trên lá trƣởng thành Nguồn: Bộ môn BVTV/VNCCSVN. Hình 2.2. Triệu chứng của bệnh rụng lá Corynespora trên lá non và cành Nguồn: Bộ môn BVTV/VNCCSVN. Trên chồi và cuống lá: Các chồi xanh dễ nhiễm bệnh, đôi khi nấm bệnh cũng gây hại chồi đã hóa nâu. Dấu hiệu đầu tiên với vết nứt dọc theo cuống và chồi có dạng hình thoi, có mủ rỉ ra sau đó hóa đen, vết bệnh có thể phát triển dài đến 20 cm gây chết chồi, đôi khi chết cả cây. Nếu dùng dao cắt bỏ lớp vỏ ngoài sẽ xuất hiện những sọc đen ăn sâu trên gỗ, chạy dọc theo vết bệnh. Trên cuống lá với vết nứt màu đen có chiều dài 0,5 – 3,0 mm. Nếu cuống lá bị hại, toàn bộ lá chét bị rụng khi còn xanh mặc dù không có một triệu chứng nào xuất hiện trên phiến lá. 11 2.3.2. Điều kiện phát sinh bệnh Có ba yếu tố dẫn đến sƣ phát sinh bệnh trên cây cao su gồm: a. Dòng vô tính cao su mẫn cảm : tính mẫn của của các dvt cao su thì tùy thuộc vào điều kiện từng nƣớc cũng nhƣ giai đoạn phát triển. Nhƣ dvt RRIC 103 trƣớc đây đƣợc xem là kháng bệnh ở Indonesia nhƣng đột nhiên trở nên nhiễm nặng. Trong khi dvt PB 260 là dvt có triển vọng về sản lƣợng và kháng bệnh tại Malaysia, Indonesia, nhƣng bị hại rất nặng tại Cameroon và Châu Phi. Dòng vô tính RRIM 725 mẫn cảm ở giai đoạn cây con nhƣng kháng khi trƣởng thành (Darussamin và Pawirosoemardjo, 1996). b. Nấm hình thành nòi mới: nấm dễ thích nghi với điều kiện môi trƣờng để hình thành nòi mới, vƣợt qua tính kháng của một số dvt, cũng nhƣ đáp ứng khác nhau với thuốc trị bệnh. Nòi mới hình thành gồm ba yếu tố sau: đáp ứng với điều kiện địa lí, đáp ứng với cây ký chủ khác, đáp ứng với dvt cao su, trong đó yếu tố đầu và cuối có vai trò quan trọng đến mức độ gây hại của nấm với cao su từng vùng. c. Môi trƣờng thuận lợi cho nấm bệnh cao su phát triển: cũng nhƣ nhiều loại bệnh khác, sự phát dịch, lây lan và tác hại của C. cassiicola có liên quan đến các yếu tố môi trƣờng nhƣ độ ẩm, nhiệt độ, lƣợng mƣa, độ cao và độ màu mỡ của đất (CFC/INRO A Proposal, 1999). RRIM 600 nhiễm bệnh nặng tại Johore (Malaysia), nhƣng không bị bệnh ở vùng có mùa khô kéo dài nhƣ Kedah và Pelis (Darussamin và Pawirosoemardjo, 1996). Một số ghi nhận cho rằng, ở độ cao trên 300 m thì cao su ít bị bệnh hơn (Jaysinghe, 2000). 2.3.3. Tác hại của bệnh và cách phòng trị Tác hại Mức nguy hại của bệnh tùy thuộc vào mức độ kháng của dvt và giai đoạn tuổi. Tùy theo sự tƣơng thích giữa ký sinh, ký chủ và môi trƣờng. Bệnh gây hại quanh năm vào mọi giai đoạn sinh trƣởng của cây cao su. 12 Ở cây con trong giai đoạn kiến thiết cơ bản, bệnh xuất hiện quanh năm gây rụng lá, làm chậm sự phát triển, cuối cùng gây chết cây. Ở cây cao su trƣởng thành mẫn cảm với bệnh có thể gây giảm 20 – 25% sản lƣợng. Do bệnh có khả năng gây hại cho mọi lứa tuổi cây và xuất hiện quanh năm nên việc sử dụng dvt kháng bệnh là biện pháp khả thi nhất. Cách phòng trị: (Phan Thành Dũng, 2004) Không trồng các dvt mẫn cảm với bệnh nhƣ RRIC 103, 104, KRS 21, RRIM 725, RRIM 600, Fx 25, IAN 873, PPN 2058, 2444, 2447. Ghép tán bằng dvt kháng bệnh. Tạo tuyển các dòng cao su kháng bệnh. Cần sự hỗ trợ của công nghệ sinh học nhằm tạo tuyển nhanh, chính xác và kinh tế các dvt kháng bệnh. Trị bệnh bằng thuốc trừ nấm nhƣ: Bordeaux 0,75%, Zineb 80WP 0,75%, Benlate 50WP 0,5%, Score, Anvil 5SC, Propineb 50WP 0,5% chu kỳ 10-14 ngày/lần. Chú ý phun mặt dƣới lá nơi nấm thƣờng xâm nhiễm. Tuy nhiên, biện pháp sử dụng hóa chất hiện nay chỉ áp dụng cho pham vi qui mô nhỏ, vƣờn ƣơm, vƣờn nhân, cây cao su trong giai đoạn kiến thiết cơ bản vì lý do kinh tế và hiệu quả. 2.4. Phòng trị bệnh bằng thuốc bảo vệ thực vật 2.4.1. Lịch sử và phân loại thuốc bảo vệ thực vật Thuốc bảo vệ thực vật đƣợc biết vào thời cổ đại, khi ngƣời La Mã biết dùng hơi lƣu huỳnh để trừ côn trùng và muối để trừ cỏ. Vào thế kỷ thứ 9, ngƣời Trung Hoa sử dụng arsenic hòa trong nƣớc diệt trừ côn trùng. Đầu thế kỷ 19, pyrethrin và rotenone chiết xuất từ cây cúc dại và cây thuốc cá cũng đƣợc dùng trừ nhiều loại côn trùng. Hỗn hợp Paris xanh gồm CuSO4 và arsenic dùng trừ bọ cánh cứng Colorado khoai tây năm 1865. Ngày nay, với sự phát triển nhanh chóng của ngành hoá học, đã có rất nhiều loại hóa chất ra đời để đáp ứng nhu cầu bảo vệ thực vật của con ngƣời (Phan Thành Dũng, 2004). 13 Có nhiều cách phân loại thuốc bảo vệ thực vật, nhƣng thƣờng phân loại theo đối tƣợng phòng trừ nhƣ: Thuốc trừ sâu, trừ bệnh, trừ cỏ, trừ chuột, trừ nhện, trừ ốc sên, thuốc điều tiết sinh trƣởng cây trồng,... Trong mỗi nhóm trên, thƣờng phân ra các nhóm nhỏ hơn theo gốc hóa học. Nhƣ thuốc trừ bệnh gồm có 2 nhóm lớn là nhóm vô cơ và nhóm hữu cơ. Nhóm vô cơ nhƣ nhóm đồng, nhóm lƣu huỳnh, nhóm thủy ngân. Nhóm hữu cơ nhƣ nhóm lân hữu cơ, nhóm Carbamate, nhóm Dithiocarbamate, nhóm Triazole. Ngoài ra còn có nhóm Dicarboximit, nhóm thuốc sinh học (Phạm Văn Biên và ctv, 2006). 2.4.2. Triazole - Nhóm thuốc trừ nấm Nhóm thuốc Triazole là những thuốc trừ nấm thế hệ mới nhất, có tính chọn lọc cao, nội hấp, hiệu lực mạnh, đang đƣợc phát triển và sử dụng nhiều. Nó là nhóm thuốc có tác dụng kìm hãm sinh tổng hợp ergosterol, liều sử dụng thấp, ít độc với ngƣời và gia súc. Nó thuộc nhóm chất lƣu dẫn, đƣợc cây hấp thu qua rễ, thân, lá và dịch chuyển đến các bộ phận khác qua hệ thống bó mạch. Thuốc lƣu dẫn theo hƣớng lên và hiếm khi từ trên xuống. Các loại thuốc này hiệu quả trong phòng cũng nhƣ trị bệnh (Phan Thành Dũng, 2004; Phạm Văn Biên và ctv, 2006). Cơ chế tác động của thuốc nhóm Triazole là kìm hãm quá trình sinh tổng hợp ergosterol (thông thƣờng sự phá hoại của vật gây bệnh tăng khi có hàm lƣợng ergosterol tăng), ngăn cản sự hình thành rễ bám hay giác mút, sự sinh trƣởng của tản nấm và sự hình thành bào tử. Các thuốc này xâm nhập và dịch chuyển trong cây rất nhanh (Nguyễn Trần Oánh, 1997). Công thức cấu tạo của gốc Triazole nhƣ sau: Các thuốc nhóm Triazole có tính nội hấp, thuốc nhanh chóng thấm qua bề mặt và phân bố đều trong lá, lƣu dẫn mạnh trực tiếp đến các vết bệnh nơi nấm xâm 14 nhập. Hiệu quả của thuốc kéo dài nhờ vào đặc tính phòng bệnh (ngăn chặn sự xâm nhập của nấm bệnh), trị bệnh (chặn đứng sự tiến triển của nấm bệnh) và diệt triệt để (nấm đã xâm nhập và các bào tử mới). Thuốc đạt hiệu quả phòng trị cao, giảm chi phí công lao động và số lần phun. Ví dụ thuốc Opus 75EC là thuốc trừ nấm thế hệ mới với hoạt chất Epoxiconazole, sản phẩm của Công ty BASF (Cộng hòa Liên bang Đức). Opus 75EC còn kích thích cơ chế tự kháng bệnh của cây, giúp dƣỡng cây xanh lá. Thuốc Sumi-Eight 12 là thuốc trừ nấm phổ rộng với hoạt chất Diniconazole còn có tác dụng dƣỡng cây, cây khỏe, bộ lá xanh hơn, tăng khả năng chống chịu sâu bệnh. ( 2.4.3. Tình hình sử dụng hóa chất trong kiểm soát bệnh rụng lá Corynespora Sử dụng hóa chất là chiến lƣợc quản lý bệnh có hiệu quả nhanh nhất, nó đƣợc áp dụng trong hầu hết các lĩnh vực trồng trọt, đƣợc nông dân áp dụng phổ biến và có khả năng đem lại kết quả tốt. Mặc dù đã có những báo cáo liên quan đến giá trị và ảnh hƣởng xấu của hóa chất bảo vệ thực vật tới môi trƣờng, nông dân vẫn tiếp nhận nó. Các phƣơng pháp sinh học trong kiểm soát bệnh, bao gồm cả thao tác di truyền, đã đƣợc ủng hộ trong vài thập kỷ qua, nhƣng thuốc hóa học vẫn chƣa bị loại bỏ trong chƣơng trình quản lý bệnh thực vật. Phƣơng pháp kết hợp cả sinh học lẫn hóa học trong quản lý bệnh đang đƣợc áp dụng rộng rãi. Để kiểm soát bệnh cho những cây trồng giá trị cao, cung cấp cho các ngành công nghiệp vật liệu nhƣ cao su thì hóa chất bảo vệ thực vật vẫn có thể còn đƣợc sử dụng trong thời kỳ lâu dài, bởi vì các hóa chất hầu nhƣ không nhiễm vào sản phẩm của cây cao su, do đó không ảnh hƣởng trực tiếp đến ngƣời tiêu dùng. Trong các vùng trồng cao su nhƣ Ấn Độ, việc sử dụng hóa chất để kiểm soát bệnh đã đƣợc thực hiện gần một thế kỷ. Bệnh nấm hồng gây bởi Corticium salmonicolor và bệnh rụng lá mùa mƣa gây bởi Phytophthora spp đƣợc kiểm soát bởi thuốc trừ nấm đã đƣợc đề ra và áp dụng rộng rãi ngay từ năm 1910 ở Ấn Độ và Sri Lanka. 15 Kiểm soát bằng thuốc hóa học với bệnh rụng lá Corynespora đã đƣợc giới thiệu khi bệnh xuất hiện lần đầu tiên trên vƣờn ƣơm ở Ấn Độ khoảng năm 1958. Việc phun hỗn hợp Bordeaux (1%) hay Zineb (0,24%) với lƣợng phun 2 lần trong 3 tuần, trong suốt khoảng thời gian của mùa bệnh đã đƣợc đề ra để kiểm soát bệnh. Cả 2 loại thuốc trừ nấm tiếp xúc và lƣu dẫn đều đƣợc thử nghiệm rộng rãi trong phòng thí nghiệm và ngoài vƣờn ƣơm. Trong các thử nghiệm in vitro chỉ ra rằng Carbendazim ức chế mầm bệnh phát triển hoàn toàn ở nồng độ 25 ppm a.i.. Trong thí nghiệm trên vƣờn ƣơm Mancozeb (0,2%), Carbendazim (0,5%) và tổ hợp Metalaxyl + Mancozeb (0,2%) đều có hiệu quả phòng trị bệnh. (Manju, 2006) Các loại thuốc đã đƣợc báo cáo có hiệu quả phòng trị nấm C. cassiicola là: Nhóm thuốc tiếp xúc nhƣ: Bordeaux, Mancozeb, Captafol, Chlorothalonil. Nhóm thuốc lƣu dẫn nhƣ: Carbendazim, Tridemorph, Hexaconazole. Các thuốc hỗn hợp nhƣ: Metalaxyl + Mancozeb (0,2%), Benomyl và Thiram, Copperoxychloride (21%) + Mancozeb (20%), Propineb (56%) + Oxadixyl (10%), Mancozeb (63%) + Carbendazim (12%), Hexaconazole + Captan, Difenoconazole cũng đƣợc báo cáo có hiệu quả phòng trị bệnh. (Srinivas và Idicula, 2006) 16 Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 3.1. Thời gian và địa điểm tiến hành Thí nghiệm đƣợc thực hiện từ tháng 03/2007 đến tháng 08/2007 Địa điểm tiến hành tại Bộ môn Bảo vệ Thực vật (BVTV), Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam (VNCCSVN). 3.2. Đối tƣợng nghiên cứu Mẫu nấm C. cassiicola đƣợc phân lập từ lá cao su thuộc dvt RRIV 4 có biểu hiện các triệu chứng đặc trƣng của bệnh rụng lá Corynespora. 3.3. Phƣơng pháp cơ bản 3.3.1. Phƣơng pháp lấy mẫu Mẫu nấm đƣợc lấy trên dvt RRIV 4 có vết bệnh đặc trƣng. Mẫu đƣợc lấy vào buổi sáng sớm khi độ ẩm không khí còn cao, bào tử còn nằm trên lá và chƣa phát tán vào không khí. Mẫu đƣợc ghi rõ tên dvt lấy mẫu, địa điểm lấy mẫu, lá non hay lá già, vết bệnh đặc trƣng hay không đặc trƣng. Mẫu lá bệnh đƣợc đặt vào hộp có đặt giấy thấm nƣớc để giữ ẩm. 17 3.3.2. Phân lập Hóa chất và dụng cụ Dụng cụ: bình tam giác, ống nghiệm, đĩa petri (9 cm đƣờng kính), que cấy, đèn cồn, pence, lame, lamelle, giá đỡ ống nghiệm, becher, kính hiển vi quang học, nồi hấp Tommy, tủ sấy, hộp đựng mẫu, giấy thấm nƣớc, bút lông. Hóa chất: Bảng 3.1 Thành phần môi trƣờng PSA, PDA Thành phần Môi trƣờng PSA (g/l) Môi trƣờng PDA(g/l) Khoai Tây 100 200 Đƣờng 10 (sucrose) 20 (dextrose) Agar 15 15 Nƣớc cất Nƣớc cất vừa đủ 1lít Nƣớc cất vừa đủ 1lít Cách chuẩn bị môi trƣờng PSA: Khoai tây gọt vỏ rửa sạch, cân đủ 100 g, thái nhỏ hạt lựu, thêm 500 ml nƣớc cất 2 lần, đun sôi trong 30 phút. Lọc lấy nƣớc trong. Thêm 15 g agar, 10 g đƣờng sucrose và nƣớc cất vừa đủ 1 lít vào dung dịch đã lọc. Đun sôi trong 3 phút, khuấy đều trong lúc nấu. Sau đó môi trƣờng đƣợc phân vào các bình tam giác đem hấp khử trùng ở 121 C/15 phút. Môi trƣờng PDA đƣợc thực hiện tƣơng tự nhƣ môi trƣờng PSA. 18 Phƣơng pháp phân lập Lá có triệu chứng bệnh đặc trƣng đƣợc đƣa về phòng thí nghiệm, rửa bằng nƣớc cất vô trùng 3 lần, dùng que cấy nấm đã khử trùng ƣớt và khô, sau đó đốt trên ngọn lửa đèn cồn, để nguội, lấy trực tiếp bào tử ngay trên vết bệnh cấy vào đĩa môi trƣờng (5 điểm/đĩa). Sau hai ngày những khuẩn lạc nghi ngờ là nấm C. cassiicola đƣợc cấy sang đĩa môi trƣờng mới (môi trƣờng PDA) và đặt dƣới ánh sáng đèn huỳnh quang 12 giờ/ngày ở điều kiện nhiệt độ phòng (26 - 30ºC). Khi nấm phát triển, tiến hành kiểm tra và cấy chuyền sang môi trƣờng mới cho đến khi thu đƣợc nguồn nấm thuần chủng. Với phƣơng pháp phân lập nhƣ trên, sau khi phân lập các mẫu nấm cần phải đƣợc kiểm tra lại bằng cách quan sát hình thái sợi nấm và bào tử của nấm C. cassiicola dƣới kính hiển vi. 3.3.3. Phƣơng pháp nhân số lƣợng bào tử Nấm C. cassiicola rất khó tạo bào tử trên môi trƣờng nhân tạo, để tạo đƣợc nhiều bào tử có thể áp dụng theo phƣơng pháp sau: (Chee, 1988) Nuôi cấy nấm trên môi trƣờng PSA trong điều kiện tối liên tục 24/24 giờ ở điều kiện nhiệt độ phòng trong 5 ngày. Sau đó sử dụng một tấm lame vô trùng cạo nhẹ trên bề mặt khuẩn lạc để kích thích sợi nấm tạo bào tử. Tiếp tục nuôi cấy ở điều kiện chiếu sáng hoàn toàn 24/24 giờ ở nhiệt độ phòng trong 3 ngày. Sau thời gian trên tiến hành kiểm tra lại nguồn nấm bằng cách soi bào tử dƣới kính hiển vi (đặt bào tử trong giọt nƣớc cất hoặc giọt dung dịch methylene blue). Hình dạng bào tử đƣợc so sánh với những mô tả của Ellis và Holiday (1971). Các nguồn nấm đƣợc xác định chính xác là nấm C. cassiicola sẽ đƣợc sử dụng vào những phân tích tiếp theo. 19 Các đĩa nấm có bào tử đƣợc cho thêm 20 ml nƣớc cất vô trùng, lắc đều để hoà tan bào tử vào nƣớc. Sau đó đổ dịch bào tử vào bình tam giác qua lƣới lọc, lắc đều sẽ đƣợc dịch bào tử sử dụng cho các thí nghiệm sau (Vũ Thị Quỳnh Chi, 2005). 3.4. Khảo sát hiệu quả sử dụng hóa chất 3.4.1. Hoá chất Các thí nghiệm khảo sát đƣợc thực hiện với 9 hóa chất bảo vệ thực vật thuộc nhóm Triazole nhƣ sau: Bảng 3.2. Các loại thuốc sử dụng trong thí nghiệm Ký hiệu chữ Tên hoạt chất Tên thƣơng mại Cy Cyproconazole Bonanza 100SL Di Difenoconazole Score 250EC Fl Flusilazole Nustar 40EC He Hexaconazole Anvil 5SC Ta Triadimenol Bayfidan 250EC Te Tebuconazole Forlicur 250EW Ty Triacyclazole Flash 75WP Pr Propiconazole TilUSA super 250EC Tf Triadimefon Encoleton 25WP DC Đối chứng không xử lý thuốc Cách qui đổi từ nồng độ hoạt chất cần dùng ra nồng độ thƣơng phẩm: Nồng độ hoạt chất cần dùng (% a.i) * 100 % hoạt chất trong thuốc thƣơng phẩm Nồng độ thƣơng phẩm = 20 3.4.2. Khảo sát hiệu quả thuốc trên đĩa petri Bố trí thí nghiệm: Kiểu thí nghiệm: Khối đầy đủ ngẫu nhiên 2 yếu tố (Two Factor Randomized Complete Block Design). Số nghiệm thức: 9 hoá chất với 5 nồng độ là: 0,1; 0,5; 2,5; 12,5; 25. Cộng với 1 đối chứng có tổng số 46 nghiệm thức. Số đĩa thực hiện: Mỗi nghiệm thức thực hiện trên 4 đĩa, tổng số 184 đĩa/1 lần lặp lại Số lần lặp lại: 3 lần Thời gian thực hiện: từ ngày 22/05/07 đến ngày 22/06/07 Cách thực hiện: Sử dụng phƣơng pháp đầu độc môi trƣờng nhƣ sau: Môi trƣờng PDA đƣợc chuẩn bị và khử trùng bằng phƣơng pháp nhiệt ƣớt (autoclave) ở nhiệt độ 121ºC trong 15 phút. Lƣợng thuốc đƣợc thêm vào môi trƣờng ở nhiệt độ 40 – 50ºC để có nồng độ tƣơng ứng (đổ 9 ml môi trƣờng sau đó thêm 1 ml thuốc). Lắc đều và để nguội. Cấy mẫu nấm có đƣờng kính 0,8 cm lấy từ khuẩn lạc đang phát triển (5 ngày tuổi) vào giữa đĩa. Đánh giá kết quả: Chỉ tiêu theo dõi: Đo đƣờng kính khuẩn lạc với khoảng cách 1 ngày 1 lần kể từ ngày cấy nấm. Cách đo đƣờng kính khuẩn lạc: d = (d1+d2)/2 Trong đó: d1, d2 là độ dài 2 đƣờng chéo phần khuẩn lạc phân bố. 21 Đánh giá hiệu lực của thuốc theo phƣơng pháp Finney (1968): Dựa vào chỉ số LD50 (Lethal Dose) là liều lƣợng làm chết 50% cá thể trong quần thể. Từ các nồng độ thí nghiệm và phần trăm ức chế đƣờng kính khuẩn lạc (% giảm so với đối chứng) lập phƣơng trình tƣơng quan tuyến tính từ đó suy ra chỉ số LD50 của mỗi loại thuốc để đánh giá. LD50 < 10 mg a.i/l : Rất có hiệu lực. LD50 = 10 – 50 mg a.i/l : Hiệu lực trung bình LD50 = 51 – 125 mg a.i/l : Hiệu lực rất ít LD50 > 125 mg a.i/l : Không có hiệu lực Khảo sát ảnh hƣởng của hóa chất đến mật độ bào tử, kích thƣớc bào tử và sự nảy mầm của bào tử: Tính diện tích khuẩn lạc, tiếp theo cho nƣớc cất vào đĩa Petri theo tỷ lệ 1 ml/1cm2 dùng muỗng sắt cào đều trên bề mặt khuẩn lạc để tách bào tử, sau đó lấy 3 giọt dung dịch (mỗi giọt 10 µl) trên 1 đĩa, nhỏ lên lame và đếm số lƣợng bào tử. Từ đó tính ra mật độ bào tử trên cm2 diện tích khuẩn lạc. Dùng dung dịch trên đo kích thƣớc (dài, rộng) số vách ngăn của bào tử. Đo ngẫu nhiên 10 bào tử trên 1 đĩa Petri (40 bào tử/nghiệm thức/lần lặp lại). Dùng 0,1 ml dung dịch bào tử nhỏ trên lame, ủ 12 giờ sau đó cho thêm 1 giọt methylene blue (có bổ sung formon để ức chế sự nảy mầm tiếp tục của nấm nhằm thuận tiện trong việc theo dõi), đếm tỷ lệ bào tử nảy mầm và đo chiều dài của ống mầm (germtube) của 20 bào tử trên 1 nghiệm thức. 3.4.3. Khảo sát hiệu quả thuốc trên lá bệnh cắt rời Bố trí thí nghiệm: Kiểu thí nghiệm: Hoàn toàn ngẫu nhiên 2 yếu tố (Two Factor Completety Randomized Design). 22 Số nghiệm thức: chọn 6 thuốc có hiệu quả tốt nhất trong thí nghiệm trên đĩa, mỗi thuốc chọn 3 nồng độ dựa vào chỉ số LD50*100 và LD99. Cộng với 1 đối chứng có tổng số 19 nghiệm thức. Số hộp thực hiện: Mỗi nghiệm thức thực hiện trên 1 hộp plastic có nắp đậy trong suốt (mỗi hộp có 6 lá cao su cắt rời), suy ra tổng số 19 hộp/1lần Số lần lặp lại: 2 lần trong cùng 1 đợt. Thời gian thực hiện: từ ngày 23/06/07 đến ngày 08/07/07 Cách thực hiện: Thu hái lá ở giai đoạn mới ổn định (lá mới chuyển từ màu nâu đỏ sang màu xanh lá mạ) của cùng 1 dvt, không có các triệu chứng nhiễm bệnh, giữ ẩm và đem về phòng thí nghiệm ngay. Rửa sạch lá bằng nƣớc cất, để ráo rồi đặt úp trên lƣới sắt trong hộp plastic, dƣới có lót sẵn giấy thấm ƣớt để giữ ẩm. Phun ƣớt đều dung dịch thuốc tƣơng ứng lên các lá. Để lá ráo nƣớc khoảng 1 giờ. Dùng bình phun nhỏ phun ƣớt đều dịch bào tử (đã đƣợc kiểm tra số lƣợng bào tử/ml dung dịch) lên các lá. Đậy nắp hộp và đặt dƣới ánh sáng đèn huỳnh quang trong 12 giờ/ngày, nhiệt độ phòng 28 ± 2ºC. Ghi nhận cấp bệnh vào ngày thứ 1, 3, 5, 7 ngày sau khi lây bệnh dựa theo bảng phân cấp bệnh của Bộ môn BVTV/VNCCSVN nhƣ sau: Cấp 0: Không bệnh. Cấp 1: Một vài vết bệnh hoặc đốm nhỏ nhìn kỹ mới thấy. Cấp 2: Các vết bệnh chiếm 1/8 diện tích mẫu lá. Cấp 3: Các vết bệnh chiếm 1/4 diện tích mẫu lá. 23 Cấp 4: Các vết bệnh chiếm 1/2 diện tích mẫu lá. Cấp 5: Các vết bệnh chiếm trên 3/4 diện tích mẫu lá. Đánh giá kết quả: Từ cấp bệnh tính ra tỉ lệ bệnh (TLB) và chỉ số bệnh (CSB) theo công thức. CSB (%) = (a x b) x 100/(n x 5) Với a: Số cây bị bệnh của mỗi cấp bệnh b: Cấp bệnh tƣơng ứng 5: Cấp bệnh cao nhất trong bảng phân cấp n: Tổng số cây điều tra TLB (%) = m x 100/n Với m: Số cây bị bệnh n: Tổng số cây điều tra 3.4.4. Khảo sát hiệu quả thuốc trên vƣờn gỗ ghép Bố trí thí nghiệm: Kiểu thí nghiệm: Hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD: Completety Randomized Design). Số nghiệm thức: Từ kết quả 2 thí nghiệm trên chọn ra 5 loại thuốc 1 nồng độ thích hợp. Cộng với 1 đối chứng có tổng số 6 nghiệm thức. Bố thí thí nghiệm: Thí nghiệm đƣợc bố trí 3 lần lặp lại (LLL) trên cùng 1 khu thí nghiệm là Vƣờn Nhân giống RRIV 4 (VNCCSVN) có cùng độ tuổi và mức độ nhiễm bệnh khá tƣơng đồng. Mỗi nghiệm thức bố trí ngẫu nhiên trong 1 hàng. Trong 1 hàng chọn 10 cây, mỗi cây chọn 4 cành ở 4 hƣớng khác nhau, mỗi cành chọn 5 lá để theo dõi cố định. Mỗi nghiệm thức đƣợc bố trí cách ly nhau 1 hàng (Srinivas và Idicula, 2006). 24 Bảng 3.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ngoài đồng LLL 1 LLL 2 LLL 3 DC Te Fl Cy He Pr He Fl Pr Cy DC Te Cy Pr He Te DC Fl Thời gian thực hiện: từ ngày 09/07/07 đến ngày 02/08/07 Cách thực hiện: Ghi nhận cấp bệnh 1 ngày trƣớc khi phun đợt đầu (Đợt 1- kiểm trắng) Thực hiện phun thuốc tƣơng ứng với từng lô quy định. Tiến hành phun làm 3 đợt, mỗi đợt cách nhau 7 ngày. Sau 6 ngày trong mỗi đợt phun thì tiến hành ghi nhận cấp bệnh trên các lá đã đánh dấu sẵn. Đánh giá kết quả: Dựa vào tỷ lệ bệnh (TLB) và chỉ số bệnh (CSB) của các nghiệm thức so với đối chứng để đi đến kết luận về hiệu quả thuốc. 3.5. Xử lý số liệu Sử dụng phần mềm Statgraphics Ver. 7.0, MSTATC để so sánh hiệu quả sử dụng hóa chất thí nghiệm ở mức α = 0,05 hay LSD (95%) (Least Significant Difference). Số liệu đƣợc xử lý thống kê và vẽ biểu đồ bằng phần mềm Excel 25 Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả phân lập mẫu nấm Một trong những kỹ thuật cơ bản trong công tác nghiên cứu bảo vệ thực vật, đặc biệt đối với những loại nấm ký sinh, là phân lập và thuần chủng trong môi trƣờng nhân tạo. Đối với nấm C. cassiicola đƣợc phân lập từ các vị trí nhiễm bệnh, trong đó vết bệnh trên lá thƣờng đƣợc sử dụng là nguồn chính để phân lập. Mục đích của việc phân lập này là định danh đƣợc nấm gây bệnh và tạo nguồn nấm cho những nghiên cứu khác, nhƣ đánh giá hiệu lực của các loại thuốc trừ nấm sẽ đề cập trong những phần tiếp theo. Sau khi tiến hành cấy mẫu nấm vào đĩa 1 ngày thì khuẩn ty bắt đầu phát triển từ vết cấy, khuẩn lạc sẽ hình thành rõ rệt ở ngày thứ 3. Tiếp theo, khuẩn lạc đƣợc quan sát và định danh theo cán bộ nghiện cứu của bộ môn BVTV, rồi đƣợc cấy chuyền sang đĩa petri mới. Những khuẩn lạc này đƣợc kích thích để hình thành bào tử và quan sát chúng dƣới kính hiển vi dựa trên tài liệu nghiên cứu của các tác giả đã công bố (bào tử màu nâu nhạt với dạng hình lƣỡi liềm hay thẳng chứa nhiều vách ngăn. Chiều dài biến thiên lớn (22 – 300 m). Chiều rộng biến thiên từ 5 – 10 m (Ellis và Holiday, 1971)) nhằm xác định độ chính xác của nấm C. cassiicola (hình 4.1 và hình 4.2). Sau cùng, nấm đƣợc cấy qua ống nghiệm có chứa môi trƣờng PDA để bảo quản và dùng làm nguồn nấm cho các thí nghiệm tiếp theo. 26 Hình 4.1. Khuẩn lạc và bào tử nấm C. cassiicola sau khi phân lập (vật kính X40) Hình 4.2. Bào tử nấm C. cassiicola trên lá cao su Nguồn: Bộ môn BVTV/VNCCSVN. 4.2. Khảo sát ảnh hƣởng các loại thuốc trên môi trƣờng in vitro 4.2.1. Hiệu quả ức chế đƣờng kính khuẩn lạc của các loại thuốc Một trong những tác động của thuốc trừ nấm lên một loại nấm ký sinh là khả năng ức chế sự phát triển của khuẩn lạc. Việc thực hiện thử nghiệm in vitro bằng phƣơng pháp đầu độc môi trƣờng (poisioned food technique) đã chuẩn hoá và đƣợc các nhà nghiên cứu BVTV áp dụng rộng rãi. Phƣơng pháp này không những cho phép đánh giá nhanh hiệu quả của thuốc trừ nấm trên một loại nấm ký sinh, mà còn 27 có chi phí thấp. Qua thử thuốc bằng phƣơng pháp in vitro xác định đƣợc chỉ số LD50 (liều làm chết 50% cá thể), từ đó xác định đƣợc nồng độ của thuốc khi áp dụng ngoài đồng. Chẳng hạn, nhƣ đối với Validacin 5L nồng độ thuốc có hiệu lực ngoài đồng bằng LD50*100. Phƣơng pháp đầu độc môi trƣờng đã đƣợc áp dụng trên C. samonicolor, Phytophthora spp gây bệnh nấm hồng và loét sọc mặt cạo (Huỳnh Hữu Tấn, 1996), trên C. gloeosporioides gây bệnh héo đen đầu lá (Radziah & Omar, 1985 - trích dẫn bởi Nguyễn Đôn Hiệu, 2004). Đề tài bƣớc đầu sử dụng phƣơng pháp này để đánh giá hiệu lực của một số thuốc trừ nấm gốc Triazole trên C. cassiicola. Tiếp theo, những loại thuốc và nồng độ thích hợp sẽ đƣợc khảo sát trên lá cao su cắt rời trong phòng thí nghiệm (phƣơng pháp in vivo) và từ kết quả này làm cơ sở để chọn đƣợc loại thuốc và nồng độ thích hợp nhất áp dụng ra ngoài đồng ruộng. Thí nghiệm in vitro đƣợc tiến hành đánh giá tốc độ phát triển của nấm C. cassiicola bằng phƣơng pháp đầu độc môi trƣờng với các loại thuốc trừ nấm. Những loại thuốc nào có hiệu quả trị nấm tốt thì khuẩn ty sẽ kém phát triển hoặc bị ức chế hoàn toàn so với nghiệm thức đối chứng không xử lý thuốc. Đƣờng kính khuẩn lạc đƣợc theo dõi hàng ngày trong suốt thời gian thí nghiệm, kết quả đƣợc trình bày ở bảng 4.1. Theo dõi trên bảng 4.1, ở ngày đầu tiên, thuốc Hexaconazole ức chế hoàn toàn sự phát triển của nấm ở ngay nồng độ thấp là 2,5 ppm. Điều này chứng tỏ Hexaconazole cho hiệu quả ức chế cao nhất ngay từ những ngày đầu tiên. Các ngày tiếp theo, thuốc Hexaconazole cũng ức chế hoàn toàn sự phát triển khuẩn ty ở các nồng độ 12,5 và 25 ppm. 28 Bảng 4.1: Ảnh hƣởng của thuốc trừ nấm đến đƣờng kính khuẩn lạc C. cassiicola Thuốc Nồng độ (ppm-ai) Đƣờng kính khuẩn lạc trung bình (cm) % Ức chế đƣờng kính khuẩn lạc 1 ngày 3 ngày 5 ngày 7 ngày 1 ngày 3 ngày 5 ngày 7 ngày Cyproco- nazole 0,1 1,2 2,5 4,1 5,5 27,1 36,6 38,4 36,9 0,5 0,9 1,8 3,0 3,8 44,7 55,6 55,5 55,6 2,5 0,5 1,0 1,6 2,2 65,6 74,8 76,7 74,8 12,5 0,0 0,0 0,3 0,3 100,0 100,0 96,3 96,5 25 0,0 0,0 0,0 0,0 100,0 100,0 100,0 100,0 Difenoco- nazole 0,1 1,0 2,1 3,2 4,3 34,9 49,0 52,1 50,5 0,5 0,9 1,5 2,3 3,1 42,8 64,0 66,4 64,4 2,5 1,0 1,7 2,3 3,0 34,8 58,4 65,1 65,8 12,5 0,9 1,6 2,2 2,6 43,4 60,9 67,4 69,9 25 0,3 1,4 2,0 2,4 83,7 64,7 69,4 72,0 Flusila- zole 0,1 0,9 1,9 3,1 4,2 42,3 52,8 52,3 51,3 0,5 0,8 1,4 2,3 3,1 48,8 65,7 64,3 64,0 2,5 0,5 1,0 1,6 2,1 65,6 75,8 76,1 75,1 12,5 0,0 0,0 0,8 1,1 100,0 100,0 87,3 87,9 25 0,0 0,0 0,0 0,0 100,0 100,0 100,0 100,0 Hexaco- nazole 0,1 0,9 1,9 3,0 4,1 43,2 54,1 54,8 53,0 0,5 0,8 1,3 2,1 2,9 48,8 68,5 68,0 66,3 2,5 0,0 0,9 1,3 1,7 100,0 78,4 80,7 79,9 12,5 0,0 0,0 0,0 0,0 100,0 100,0 100,0 100,0 25 0,0 0,0 0,0 0,0 100,0 100,0 100,0 100,0 Triadime- nol 0,1 1,2 3,0 4,8 6,5 21,4 25,0 27,0 24,9 0,5 1,0 2,2 3,6 4,8 36,7 44,4 45,5 44,1 2,5 0,8 1,7 2,8 3,7 48,5 58,2 57,5 57,0 12,5 0,0 1,0 1,9 2,6 100,0 75,0 71,5 69,5 25 0,0 0,8 1,2 1,8 100,0 79,2 81,5 79,8 Tebuco- nazole 0,1 1,2 2,9 4,8 6,6 22,0 28,9 27,9 23,8 0,5 0,9 2,2 3,8 5,1 41,2 44,5 42,7 41,2 2,5 0,8 1,4 2,5 3,4 48,8 64,0 62,5 60,7 12,5 0,3 1,1 1,7 2,1 83,1 73,7 74,6 75,8 25 0,0 0,9 1,4 1,6 100,0 78,3 79,5 81,0 Triacy- clazol 0,1 1,5 3,4 5,7 7,4 6,8 14,6 15,8 14,5 0,5 1,3 2,9 4,8 6,5 19,8 27,3 27,9 25,2 2,5 1,3 3,0 5,0 6,9 15,1 25,2 25,4 21,1 12,5 1,5 3,5 5,9 8,0 3,2 12,2 11,8 8,1 25 1,4 3,1 5,0 6,9 13,6 23,5 25,3 20,2 Propico- nazole 0,1 1,1 2,6 4,3 5,9 32,6 36,3 35,6 32,1 0,5 0,9 2,0 3,4 4,5 42,6 49,9 49,6 47,5 2,5 0,8 1,2 2,2 3,0 49,3 69,1 67,3 65,0 12,5 0,0 0,9 1,4 1,8 100,0 78,3 79,0 79,2 25 0,0 0,9 1,2 1,5 100,0 78,3 82,0 82,6 Triadime- fon 0,1 1,3 3,3 5,4 7,4 18,0 17,2 18,6 14,4 0,5 1,2 2,9 4,8 6,7 26,7 28,3 26,9 22,9 2,5 1,1 2,5 4,1 5,6 30,6 38,3 37,9 35,1 12,5 1,0 2,1 3,5 4,7 37,8 49,0 47,8 45,2 25 0,6 1,8 2,7 3,7 63,4 56,4 59,3 57,8 Đối chứng 0 1,6 4,0 6,7 8,7 0,0 0,0 0,0 0,0 29 Thuốc Cyproconazole và Flusilazole nồng độ 25 ppm cũng có hiệu quả ức chế 100% ở tất cả các ngày theo dõi, nhƣng ở nồng độ 12,5 ppm thì các thuốc này chỉ cho hiệu quả ức chế 100% ở những ngày đầu, đến ngày thứ 5 thì khuẩn ty đã mọc lan xuống môi trƣờng mới. Có lẽ ở nồng độ đó chƣa đủ sức diệt hoàn toàn khuẩn ty nên chúng đã bắt đầu thích nghi đƣợc với môi trƣờng bị đầu độc. Các thuốc Propiconazole và Triadimenol nồng độ 12,5 và 25 ppm; thuốc Tebuconazole nồng độ 25 ppm thì chỉ cho hiệu quả ức chế 100% ở ngày đầu tiên, ở các ngày tiếp theo khuẩn ty đã có thể phát triển xuống môi trƣờng. Thuốc Difenoconazole, Triadimefon và Triacyclazole đều không cho thấy hiệu quả ức chế 100% kể cả ở nồng độ cao nhất là 25 ppm. Hiệu quả ức chế đƣờng kính khuẩn lạc so với đối chứng (không xử lý thuốc) của các loại thuốc đƣợc xử lý thống kê theo kiểu khối đầy đủ ngẫu nhiên 2 yếu tố là thuốc và nồng độ, kết quả đƣợc nêu trong phụ lục 1.1. Bảng Anova ở các phụ bảng 1.1.1, phụ bảng 1.1.2, phụ bảng 1.1.3 và phụ bảng 1.1.4 đều cho thấy có sự khác biệt rất nhiều giữa các loại thuốc cũng nhƣ giữa các nồng độ với nhau, đồng thời sự tƣơng tác giữa thuốc và nồng độ là rất có ý nghĩa (P = 0,0000 < 0.001). Khi so sánh phân hạng các loại thuốc, cho thấy thuốc Hexaconazole và Flusilazole luôn có hiệu quả ức chế cao nhất ở tất cả các ngày theo dõi. Thuốc Cyproconazole có hiệu quả tƣơng đƣơng Flusilazole, nhƣng kém hơn Hexaconazole và cao hơn các thuốc khác. Thuốc Difenoconazole có hiệu quả ức chế kém ở những ngày đầu (kém hơn thuốc Propiconazole, Triadimenol, Tebuconazole; phụ bảng 1.1.1), nhƣng hiệu quả tăng dần cho đến ngày thứ 5 và thứ 7 thì hiệu quả ức chế cao hơn thuốc Triadimenol và Tebuconazole. Thuốc Propiconazole hầu nhƣ không thể hiện sự khác biệt so với các thuốc Difenoconazole, Tebuconazole, Triadimenol. Chỉ đến ngày thứ 7 thuốc Propiconazole mới cho thấy hiệu quả cao hơn Triadimenol. Còn thuốc Triadimenol và Tebuconazole không cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa. 30 Thuốc Triacyclazole luôn cho hiệu quả ức chế kém nhất, thuốc Triadimefon cũng cho hiệu quả kém hơn các thuốc khác ở tất cả các ngày theo dõi (phụ lục 1.1). Bảng 4.1 còn cho thấy hầu hết các loại thuốc khi nồng độ tăng dần thì hiệu quả ức chế cũng tăng dần, chỉ trừ thuốc Difenoconazole và Triacyclazole. Trong thuốc Difenoconazole, khi nồng độ tăng từ 0,5 đến 25 ppm thì hiệu quả ức chế hầu nhƣ không có sự khác biệt (phụ bảng 1.1.5). Trong thuốc Triacyclazole khi nồng độ tăng từ 0,1 đến 0,5 thì hiệu quả ức chế tăng lên cao nhất, rồi lại giảm dần đến thấp nhất ở nồng độ 12,5; sau đó mới tăng lên khi nồng độ tăng lên 25 ppm. Khi xử lý thống kê thì cho thấy các nồng độ của thuốc Triacyclazole không có sự khác biệt về hiệu quả ức chế (phụ bảng 1.1.6). Điều này cũng đƣợc thể hiện rõ trong bảng 4.2, thuốc Difenoconazole từ nồng độ 0,5 đến 25 thì tốc độ phát triển đƣờng kính khuẩn lạc hầu nhƣ không thay đổi, còn Triacyclazole thì tốc độ cao nhất ở nồng độ 12,5. Điều này có lẽ do hiệu quả ức chế ngƣợc của thuốc Triacyclazole khi nồng độ tăng ở mức nhất định thì kích thích sự phát triển của nấm, còn nồng độ thấp hơn hoặc cao hơn thì lại ức chế mạnh hơn. Các loại thuốc khác là Cyproconazole, Flusilazole, Hexaconazole, Triadimenol, Tebuconazole, Propiconazole và Triadimefon đều có tốc độ phát triển đƣờng kính khuẩn lạc giảm khi nồng độ thuốc tăng (bảng 4.2). Nhìn chung, tất cả các nghiệm thức đều có tốc độ phát triển đƣờng kính tăng dần từ ngày thứ 1 đến ngày thứ 5, sau đó lại giảm dần đến ngày thứ 7 (bảng 4.2). Điều này hợp với quy luật phát triển của vi sinh vật nói chung và vi nấm nói riêng, vì trong thời gian 1 – 2 ngày đầu nấm mới cấy vào cần thời gian thích nghi với môi trƣờng mới, sau đó chúng mới phát triển nhanh và khi có mật độ lớn thì tốc độ phát triển giảm dần vì lý do dinh dƣỡng và diện tích giới hạn. 31 Bảng 4.2: Ảnh hƣởng của thuốc trừ nấm đến tốc độ phát triển đƣờng kính khuẩn lạc Thuốc Nồng độ (ppm-ai) Tốc độ phát triển đƣờng kính khuẩn lạc (cm/ngày) 1 - 3 ngày 3 - 5 ngày 5 - 7 ngày Trung bình Cyproconazole 0,1 0,70 0,77 0,68 0,72 0,5 0,45 0,59 0,45 0,50 2,5 0,24 0,27 0,31 0,28 12,5 0,00 0,14 0,02 0,05 25 0,00 0,00 0,00 0,00 Difenoconazole 0,1 0,52 0,58 0,54 0,55 0,5 0,27 0,40 0,42 0,37 2,5 0,32 0,32 0,33 0,32 12,5 0,34 0,30 0,22 0,28 25 0,58 0,31 0,19 0,36 Flusilazole 0,1 0,48 0,63 0,53 0,55 0,5 0,28 0,49 0,38 0,38 2,5 0,21 0,30 0,29 0,27 12,5 0,00 0,42 0,10 0,18 25 0,00 0,00 0,00 0,00 Hexaconazole 0,1 0,48 0,59 0,52 0,53 0,5 0,23 0,44 0,39 0,35 2,5 0,43 0,21 0,23 0,29 12,5 0,00 0,00 0,00 0,00 25 0,00 0,00 0,00 0,00 Triadimenol 0,1 0,88 0,91 0,83 0,87 0,5 0,61 0,68 0,61 0,64 2,5 0,43 0,57 0,45 0,48 12,5 0,50 0,45 0,37 0,44 25 0,42 0,20 0,26 0,29 Tebuconazole 0,1 0,81 0,97 0,90 0,89 0,5 0,65 0,79 0,64 0,69 2,5 0,32 0,52 0,46 0,43 12,5 0,39 0,31 0,21 0,30 25 0,43 0,24 0,14 0,27 Triacyclazol 0,1 0,99 1,11 0,88 0,99 0,5 0,83 0,95 0,82 0,87 2,5 0,84 0,99 0,92 0,92 12,5 1,01 1,19 1,03 1,08 25 0,86 0,97 0,95 0,93 Propiconazole 0,1 0,74 0,86 0,80 0,80 0,5 0,55 0,67 0,59 0,60 2,5 0,22 0,46 0,43 0,37 12,5 0,44 0,26 0,20 0,30 25 0,44 0,17 0,15 0,25 Triadimefon 0,1 1,01 1,05 0,99 1,02 0,5 0,85 0,99 0,90 0,92 2,5 0,68 0,81 0,75 0,75 12,5 0,53 0,71 0,63 0,62 25 0,59 0,48 0,47 0,51 Đối chứng 0 1,22 1,33 0,99 1,18 32 Tóm lại, qua sự phát triển của nấm trong từng giai đoạn có thể rút ra kết luận rằng thuốc Hexaconazole và Flusilazole có hiệu quả ức chế cao nhất, thuốc Cyproconazole có hiệu quả ức chế cao thứ 3. Thuốc Difenoconazole cũng có hiệu quả ức chế cao ngay từ nồng độ thấp nhƣng khi tăng nồng độ lên cao 25 ppm thì hiệu quả ức chế tăng rất ít chỉ đạt 72%. Điều này chứng tỏ để đạt hiệu quả ức chế 100% thì thuốc Difenoconazole cần nồng độ rất cao (điều này sẽ đƣợc thấy rõ hơn trong khi xử lý tƣơng quan hồi quy - bảng 4.3). Bảng 4.3: Phƣơng trình tƣơng quan tuyến tính và chỉ số LD50 của các loại thuốc sau 7 ngày nuôi cấy. Thuốc Phƣơng trình tƣơng quan tuyến tính (Y = bX + a) Hệ số tƣơng quan (R) Giá trị xác xuất (P) LD50 LD99 Cyproconazole Y = 27,0053X + 10,3137 0,998052 0,0001 0,2948 19,232 Difenoconazole Y = 7,91923X + 46,3682 0,931434 0,02133 0,0287 44267 Flusilazole Y = 19,112X + 31,5271 0,991204 0,00099 0,0926 33,915 Hexaconazole Y = 20,9658X + 31,1211 0,992965 0,00071 0,0795 17,282 Triadimenol Y = 21,5622X + 5,37855 0,995469 0,00037 1,1734 219,75 Tebuconazole Y = 24,3444X - 0,219241 0,998072 0,0001 1,1558 119,03 Triacyclazol Y = -1,33733X + 20,4185 -0,195895 0,75218* Propiconazole Y = 21,7469X + 10,6099 0,997317 0,00017 0,6476 116,01 Triadimefon Y = 17,374X - 5,53363 0,985076 0,00218 15,717 10391 (Ghi chú: * giá trị xác xuất (P) > 0,05 suy ra bác bỏ phƣơng trình tƣơng quan tuyến tính) Trong đó: X = Lg(C*100) C: nồng độ thuốc (ppm a.i.) Y: % ức chế đƣờng kính khuẩn lạc Bảng 4.3 cho thấy mối tƣơng quan giữa sự ức chế đƣờng kính khuẩn lạc và nồng độ của các thuốc Cyproconazole, Flusilazole, Hexaconazole, Triadimenol, Tebuconazole, Propiconazole, Triadimefon là rất chặt chẽ và đáng tin cậy (hệ số tƣơng quan biến động từ 0,9851 đến 0,9981; giá trị P < 0,01). Còn đối với thuốc 33 Difenoconazole thì mối tƣơng quan cũng khá cao (R = 0,9314) nhƣng có độ tin cậy trung bình (0,01 < P < 0,05). Hơn nữa phƣơng trình tuyến tính của thuốc Difenoconazole lại có hệ số góc (Slope, b = 7,91923) nhỏ hơn các loại thuốc khác. Điều này có nghĩa là yếu tố nồng độ của thuốc Difenoconazole ít ảnh hƣởng đối với hiệu quả ức chế nấm. Chính vì vậy mà khi tính chỉ số LD99 (liều lƣợng làm chết 99% cá thể) của thuốc Difenoconazole thì cho giá trị rất cao (44267 ppm), tuy nhiên chỉ số LD50 của Difenoconazole lại thấp nhất (0,0287 ppm). Theo phƣơng pháp đánh giá của Finney (1968) thì các loại thuốc Cyproconazole, Difenoconazole, Flusilazole, Hexaconazole, Triadimenol, Tebuconazole, Propiconazole đều có hiệu lực trị nấm rất cao (LD50 < 10 ppm a.i.), thuốc Triadimefon có hiệu quả trung bình, còn thuốc Triacyclazole là không có hiệu lực (thuốc Triacyclazole có P > 0,05 nên không có mối tƣơng quan rõ ràng giữa nồng độ thuốc và hiệu quả ức chế nấm). Hình 4.3. Khuẩn lạc nấm C. cassiicola trên môi trƣờng bị đầu độc thuốc Cyproconazole sau 7 ngày cấy nấm 34 Hình 4.4. Khuẩn lạc nấm C. cassiicola trên môi trƣờng bị đầu độc thuốc Difenoconazole sau 7 ngày cấy nấm Hình 4.5. Khuẩn lạc nấm C. cassiicola trên môi trƣờng bị đầu độc thuốc Flusilazole sau 7 ngày cấy nấm 35 Hình 4.6. Khuẩn lạc nấm C. cassiicola trên môi trƣờng bị đầu độc thuốc Hexaconazole sau 7 ngày cấy nấm Hình 4.7. Khuẩn lạc nấm C. cassiicola trên môi trƣờng bị đầu độc thuốc Triadimenol sau 7 ngày cấy nấm 36 Hình 4.8. Khuẩn lạc nấm C. cassiicola trên môi trƣờng bị đầu độc thuốc Tebuconazole sau 7 ngày cấy nấm Hình 4.9. Khuẩn lạc nấm C. cassiicola trên môi trƣờng bị đầu độc thuốc Triacyclazole sau 7 ngày cấy nấm 37 Hình 4.10. Khuẩn lạc nấm C. cassiicola trên môi trƣờng bị đầu độc thuốc Propiconazole sau 7 ngày cấy nấm Hình 4.11. Khuẩn lạc nấm C. cassiicola trên môi trƣờng bị đầu độc thuốc Triadimefon sau 7 ngày cấy nấm 38 Trong quá trình thí nghiệm, theo dõi mật độ khuẩn ty thì thấy ở các đĩa đối chứng và các đĩa bổ sung thuốc Triacyclazole đều có khuẩn ty mọc thƣa hơn tất cả các thuốc khác. Điều này chứng tỏ rằng, khi không có sự ức chế trên môi trƣờng thì khuẩn ty dễ mọc lan rộng ra và do đó chúng mọc thƣa hơn. Còn ở những nghiệm thức có sự ức chế cao thì khuẩn ty không mọc lan rộng ra đƣợc và chúng phải mọc dày lại. Nhƣ vậy, có thể đi đến kết luận rằng thuốc Triacyclazole là cho hiệu quả ức chế nấm trên môi trƣờng in vitro không cao, thuốc Triadimefon cho hiệu quả ức chế trung bình, Difenoconazole cho hiệu quả ức chế cao ngay từ nồng độ thấp nhƣng khi tăng nồng độ lên cao thì hiệu quả lại tăng rất ít. Còn các thuốc Cyproconazole, Flusilazole, Hexaconazole, Triadimenol, Tebuconazole, Propiconazole đều cho hiệu quả ức chế cao, trong đó cao nhất là Hexaconazole, Flusilazole kế đến là Cyproconazole, Propiconazole, Tebuconazole và Triadimenol. 4.2.2. Ảnh hƣởng của thuốc đến mật độ, kích thƣớc và tỉ lệ nảy mầm của bào tử Ngoài việc ức chế về sự phát triển và hình thái của khuẩn lạc, thuốc trừ nấm còn có tác động đến bào tử do nấm tạo ra về số lƣợng và kích thƣớc. Những bào tử này cũng bị ảnh hƣởng đến sức sống qua sự nảy mầm và phát triển của ống mầm (germtube). Điều này là rất có ý nghĩa, bởi vì mật độ bào tử và sự nảy mầm của bào tử nấm thƣờng liên quan tới khả năng gây bệnh của chúng, nếu mật độ và tỉ lệ nảy mầm cao thì cũng đồng nghĩa là khả năng lây lan và xâm nhiễm cao hơn. Nhƣ vậy, không những hạn chế sự bùng phát trở lại của mầm bệnh mà còn giảm thiểu nguy cơ xuất hiện những chủng nấm kháng thuốc, gây khó khăn cho việc quản lý bệnh sau này. Các thuốc đƣợc sử dụng trong thí nghiệm này đều thuộc nhóm Triazole, thế hệ thuốc trừ nấm lƣu dẫn mới. Ngoài khả năng lƣu dẫn trong cây, chúng cũng có tính năng hấp thu và dịch chuyển trong tế bào của nấm. Chúng có tác dụng kìm hãm quá trình sinh tổng hợp và chuyển hoá lanosterol thành ergosterol (một tiền chất vitamin D của tế bào nấm), dẫn tới sự ảnh hƣởng đến quá trình hình thành vách tế bào, làm 39 nấm không hấp thu đƣợc nƣớc và chết, đồng thời sự giảm hàm lƣợng ergosterol còn tác động tới chu trình vận chuyển năng lƣợng của tế bào, ngăn cản sự hình thành giác hút và sự hình thành bào tử. (Nguyễn Trần Oánh, 1997) Trong các thí nghiệm này, tiến hành khảo sát những ảnh hƣởng của 9 loại thuốc đến khả năng hình thành bào tử nấm trên môi trƣờng bị đầu độc, kích thƣớc bào tử đƣợc hình thành và tỉ lệ nảy mầm của chúng. 4.2.2.1. Sự ảnh hƣởng của thuốc đến mật độ bào tử hình thành trên môi trƣờng bị đầu độc Tất cả các đĩa thí nghiệm, sau khi kết thúc khảo sát đƣờng kính khuẩn lạc, đƣợc đem ra tách bào tử và đếm số lƣợng bào tử trên kính hiển vi (ngoại trừ những nghiệm thức không có đƣờng kính khuẩn lạc phát triển nhƣ Cyproconazole, Flusilazole nồng độ 25 ppm; Hexaconazole nồng độ 12,5 và 25 ppm; hoặc có khuẩn lạc mà khuẩn ty mới chỉ bắt đầu lan xuống môi trƣờng nhƣ Cyproconazole, Flusilazole nồng độ 12,5 ppm). Từ đó tính ra mật độ bào tử trên 1 cm2 diện tích khuẩn lạc. Kết quả đƣợc ghi nhận ở cả 3 đợt và số liệu trung bình đƣợc nêu trong bảng 4.4. Tuy nhiên, do mật độ bào tử biến thiên rất nhiều giữa các đợt, cũng nhƣ giữa các nghiệm thức (không có sự tƣơng đồng về biến lƣợng các nghiệm thức), nên cần thực hiện chuyển đổi số liệu sang dạng Lg (mật độ + 1), sau đó kiểm tra lại biến lƣợng thì thấy có sự tƣơng đồng rồi mới tiến hành xử lý trắc nghiệm phân hạng. Kết quả xử lý nêu trong phụ bảng 1.2.1. 40 Bảng 4.4. Sự ảnh hƣởng của các loại thuốc lên mật độ, kích thƣớc và tỉ lệ nảy mầm của bào tử Thuốc Nồng độ (ppm-ai) Mật độ bào tử (bt/cm2) Kích thƣớc bào tử (µm) Tỉ lệ nảy mầm (%) Chiều dài ống mầm Chiều dài Chiều rộng Số vách Cyproconazole 0,1 109,75 62,51 10,26 4,61 25,0 22,75 0,5 107,43 54,90 10,15 4,14 0,0 2,5 393,13 63,52 10,27 5,53 5,0 23,83 12,5 25 Difenoconazole 0,1 190,90 56,29 9,90 4,60 3,3 38,00 0,5 97,56 53,17 10,03 4,41 30,0 61,44 2,5 108,42 59,84 9,85 4,91 0,0 12,5 48,35 63,01 10,31 5,38 0,0 25 80,92 59,71 10,28 4,98 8,3 12,00 Flusilazole 0,1 343,22 63,79 10,46 4,68 20,0 39,04 0,5 169,80 55,99 10,56 4,70 32,5 60,69 2,5 1874,23 52,91 10,88 4,48 41,7 44,54 12,5 25 Hexaconazole 0,1 258,67 63,47 10,19 4,58 0,0 0,5 384,11 61,28 10,14 4,85 0,0 2,5 955,67 48,21 10,53 4,03 10,0 11,56 12,5 25 Triadimenol 0,1 80,86 61,84 10,18 4,49 0,0 0,5 242,04 60,66 10,03 4,91 3,3 3,50 2,5 79,90 63,24 10,53 5,60 0,0 12,5 440,75 62,94 10,38 5,43 35,0 43,60 25 1420,64 50,40 10,52 4,16 8,3 26,75 Tebuconazole 0,1 106,32 59,16 10,34 4,38 0,0 0,5 62,36 61,31 10,26 4,71 7,5 47,50 2,5 112,19 63,83 10,33 5,10 26,7 34,23 12,5 365,78 66,52 10,65 5,53 0,0 25 660,81 58,13 10,69 5,24 6,7 6,17 Triacyclazol 0,1 290,91 65,18 10,45 5,00 0,0 0,5 72,19 62,15 10,27 4,92 26,7 59,94 2,5 186,90 63,26 10,21 4,74 0,0 12,5 51,98 61,25 10,41 4,92 0,0 25 42,11 56,16 10,05 4,01 18,3 11,63 Propiconazole 0,1 222,99 61,02 10,31 4,61 12,5 4,80 0,5 374,72 64,21 10,38 4,64 10,0 11,33 2,5 171,66 59,66 10,27 4,93 3,3 6,25 12,5 472,05 62,37 10,03 5,62 1,7 97,50 25 2112,57 62,83 10,43 5,56 0,0 Triadimefon 0,1 156,87 68,35 10,55 4,93 5,0 12,50 0,5 48,65 63,88 10,36 4,98 2,5 65,00 2,5 89,37 59,20 10,01 4,58 1,7 6,00 12,5 167,37 57,53 10,46 5,11 1,7 3,00 25 510,47 54,44 10,28 4,59 0,0 Đối chứng 0 48,54 68,35 10,40 5,32 3,3 3,75 41 Kết quả ở phụ bảng 1.2.1 cho thấy có sự khác biệt có ý nghĩa giữa các nghiệm thức thí nghiệm (P = 0,0182 < 0,05). Trong bảng phân hạng, nhận thấy hầu hết các nghiệm thức có mật độ bào tử cao đều là những nghiệm thức có hiệu quả ức chế khuẩn ty cao nhƣ Hexaconazole (nồng độ 0,1; 0,5 và 2,5 ppm); Cyproconazole, Flusilazole (nồng độ 2,5 ppm); Propiconazole, Triadimenol, Tebuconazole (nồng độ 12,5 và 25 ppm) và Triadimefon nồng độ 25 ppm. Có lẽ đây là cơ chế tự vệ của nấm khi môi trƣờng sống không thuận lợi thì chúng sẽ tạo ra nhiều bào tử để duy trì sự tồn tại dạng tiềm sinh. Trên bảng 4.4 cho thấy hầu nhƣ các loại thuốc đều có mật độ bào tử tăng khi nồng độ thuốc tăng, chỉ trừ thuốc Difenoconazole và Triacyclazole thì ngƣợc lại, có mật độ bào tử giảm khi nồng độ tăng. Có lẽ do khi tăng nồng độ của 2 loại thuốc này không ảnh hƣởng đến sự phát triển khuẩn ty nên cũng ít ảnh hƣởng tới mật độ bào tử. Bên cạnh đó, khi so sánh phân hạng với nghiệm thức đối chứng (phụ bảng 1.2.1), thì thấy hầu hết các nghiệm thức đều không có sự khác biệt so với đối chứng. Điều này chứng tỏ các loại thuốc thí nghiệm không có tác dụng kìm hãm sự hình thành bào tử của nấm C. cassiicola trên môi trƣờng in vitro. Ngƣợc lại, một số thuốc Hexaconazole, Flusilazole, Cyproconazole, Propiconazole, Triadimenol, Tebuconazole, Triadimefon còn kích thích tạo bào tử ở các nồng độ ức chế cao. 4.2.2.2. Sự ảnh hƣởng của thuốc đến hình thái bào tử hình thành trên môi trƣờng bị đầu độc Sau khi đếm số lƣợng bào tử xong, các lame đƣợc chuyển sang đo kích thƣớc bào tử cả về chiều dài lẫn chiều rộng, đồng thời đếm số vách ngăn của mỗi bào tử. Mỗi nghiệm thức đƣợc đo ngẫu nhiên 40 bào tử/lần lặp lại. Kết quả số liệu trung bình đƣợc nêu trong bảng 4.4, và đƣợc xử lý thống kê trong phụ lục 1.2. 42 a) Sự ảnh hƣởng của thuốc đến chiều dài bào tử Qua phụ bảng 1.2.2 cho thấy có sự khác biệt có ý nghĩa giữa các nghiệm thức về chiều dài bào tử (P = 0.0245). Cụ thể là các thuốc Hexaconazole, Flusilazole nồng độ 2,5 ppm, Triadimenol nồng độ 25 ppm, Difenoconazole nồng độ 0,5 ppm có chiều dài bào tử ngắn nhất và khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng. Tuy nhiên, ở những nồng độ khác thì các thuốc trên lại không cho thấy khác biệt so với đối chứng. Theo dõi trên bảng 4.4 cũng nhận thấy hầu hết các thuốc có sự biến thiên chiều dài bào tử không theo quy luật khi nồng độ tăng lên. Chiều dài bào tử biến thiên từ 48,21 µm đến 68,35 µm. Điều đó cho thấy chiều dài bào tử ít biến động so với mô tả của các tác giả (theo Ellis và Holiday (1971) chiều dài biến thiên từ 22 – 300 m). Nhƣ vậy chứng tỏ các loại thuốc không có ảnh hƣởng rõ ràng tới chiều dài bào tử. b) Sự ảnh hƣởng của thuốc đến chiều rộng của bào tử Qua phụ bảng 1.1.3 cho thấy không có sự khác biệt có ý nghĩa giữa các nghiệm thức về chiều rộng bào tử (P = 0,096 > 0.05). Trong bảng 4.4 cũng cho thấy chiều rộng bào tử biến thiên rất ít từ 9,85 đến 10,88 µm. c) Sự ảnh hƣởng của thuốc đến số vách ngăn của bào tử Theo dõi trên bảng 4.4 và phụ bảng 1.2.4 thì thấy hầu nhƣ không có sự khác biệt lớn giữa các nghiệm thức về số vách ngăn trên 1 bào tử (P = 0,0523 > 0,05), số vách ngăn biến thiên từ 4,01 đến 5,62. Nhƣ vậy có thể kết luận các loại thuốc cũng không ảnh hƣởng tới số vách ngăn trên 1 bào tử. 4.2.2.3. Sự ảnh hƣởng của thuốc đến khả năng nảy mầm của bào tử hình thành trên môi trƣờng bị đầu độc Tỉ lệ nảy mầm của bào tử cả 3 đợt đƣợc ghi nhận và xử lý thống kê nêu trong phụ bảng 1.2.5, số liệu trung bình đƣợc nêu trên bảng 4.4. Từ kết quả cho thấy không có sự khác biệt ý nghĩa giữa các nghiệm thức về hiệu quả ức chế sự nảy mầm 43 của bào tử (P = 0,1638). Tỉ lệ bào tử nảy mầm trung bình của tất cả các nghiệm thức là 9%. Đây là tỉ lệ rất thấp, ngay cả nghiệm thức đối chứng không xử lý thuốc cũng có tỉ lệ bào tử nảy mầm rất thấp (3%). Điều này có thể do chủng nấm phân lập đƣợc, qua nhiều lần cấy chuyền trên môi trƣờng nhân tạo, chúng đã bị thoái hóa về khả năng nảy mầm bào tử. Nhƣ vậy, tỉ lệ bào tử nảy mầm trong thí nghiệm là rất thấp và các loại thuốc không ảnh hƣởng tới khả năng nảy mầm của chúng. Những bào tử có nảy mầm thì đƣợc đo chiều dài của ống mầm (hình 4.12), số liệu trung bình đƣợc nêu trên bảng 4.4. Do tỉ lệ nảy mầm thấp nên số liệu về chiều dài ống mầm bị khuyết nhiều, do vậy ở đây chƣa thể đƣa ra kết quả đánh giá. Hình 4.12. Bào tử và ống mầm nấm C. cassiicola Chú thích: A – hình ảnh chụp ở vật kính X10 (1 vạch trên thƣớc tƣơng ứng 10 µm). B – hình ảnh chụp ở vật kính X40 (1 vạch trên thƣớc tƣơng ứng 2,43µm). a – vách ngăn của bào tử. b – ống mầm của bào tử. b a a b A B 44 4.3. Kết quả thí nghiệm trên lá cắt rời Dựa vào phƣơng pháp tuyển non dòng vô tính bằng cách gây bệnh nhân tạo trên lá cao su cắt rời (Chee, 1988), chúng tôi bƣớc đầu phát triển thành phƣơng pháp thử nghiệm hiệu quả của các thuốc trị nấm trên lá cao su cắt rời. Phƣơng pháp này cơ bản vẫn giống phƣơng pháp tuyển non, nhƣng thay vì sử dụng lá cao su của nhiều dòng vô tính thì ở đây chỉ dùng lá cao su của 1 dòng vô tính mẫm cảm với bệnh để khảo sát. Đồng thời, trƣớc khi lây bệnh bằng bào tử thì các lá cao su đã đƣợc phun thuốc trừ nấm trƣớc 60 phút. Dựa vào cấp độ nhiễm bệnh của từng lá, tính chỉ số bệnh (CSB) và tỉ lệ bệnh (TLB) của từng nghiệm thức để so sánh hiệu quả phòng trừ của các loại thuốc, đồng thời giới hạn bớt nồng độ để thử nghiệm ngoài đồng. Do điều kiện phòng thí nghiệm và thời gian thực tập đề tài có hạn nên ở đây chỉ chọn ra 6 loại thuốc có hiệu quả trị nấm tốt nhất trong thí nghiệm in vitro, dựa vào chỉ số LD50*100 và LD99 (bảng 4.3) để đƣa ra 3 nồng độ khác nhau cho mỗi loại thuốc và áp dụng cho thí nghiệm trên lá cao su cắt rời. Các loại thuốc và nồng độ tƣơng ứng là: Cyproconazole nồng độ 10; 30; 50 ppm. Difenoconazole nồng độ 5; 62,5; 125 ppm. Flusilazole nồng độ 10; 20; 40 ppm. Hexaconazole nồng độ 4; 8; 20 ppm. Tebuconazole nồng độ 50; 100; 150 ppm. Propiconazole nồng độ 40; 62,5; 125 ppm. Lá cao su sử dụng trong thí nghiệm này đƣợc lấy trên dòng vô tính mẫm cảm RRIV 4 từ vƣờn Dự Án Giống Cao Su Quốc Gia/VNCCSVN. Các lá đƣợc chọn là những lá không bị bệnh, 3 đến 4 ngày tuổi (lá mới có màu xanh non) và đƣợc hái từ sớm để hạn chế bào tử nấm bệnh bám trên lá. Trƣớc khi đƣa vào thí nghiệm các lá đƣợc rửa nhẹ nhàng bằng nƣớc cất để loại bụi bẩn và các vi sinh vật khác. Sau đó 45 phun thuốc thí nghiệm lên lá, chờ khô (60 phút), rồi mới tiến hành lây bệnh nhân tạo. Dung dịch bào tử đã đƣợc chuẩn bị sẵn và đem đi kiểm tra nồng độ bào tử trên kính hiển vi cho thấy có 1000 bào tử/ml dung dịch. Theo dõi cấp độ nhiễm bệnh ở các ngày 1, 3, 5, 7 sau khi lây bệnh. Kết quả tổng hợp đƣợc nêu trong bảng 4.5, bảng 4.6 và phụ lục 2. Kết quả cho thấy các nghiệm thức đều có TLB và CSB khá cao, mức độ ngày càng tăng theo thời gian. Có lẽ ở đây do lá cao su bị cắt rời khỏi cây nên tác dụng lƣu dẫn của thuốc không phát huy hết hiệu quả. Tuy nhiên, khi so sánh với nghiệm thức đối chứng thì vẫn thấy có hiệu quả khác biệt. Bảng 4.5. Chỉ số bệnh trung bình sau 1, 3, 5, 7 ngày lây bệnh trên lá cắt rời Thuốc Nồng Độ hoạt chất (ppm.ai) CSB (%) 1 ngày 3 ngày 5 ngày 7 ngày Cyproconazole 10 26,7 33,3 53,3 73,3 30 21,7 26,7 38,3 58,3 50 23,3 25,0 36,7 55,0 Difenoconazole 5 20,0 26,7 38,3 83,3 62,5 15,0 25,0 28,3 66,7 125 11,7 15,0 21,7 58,3 Flusilazole 10 21,7 36,7 53,3 76,7 20 25,0 33,3 45,0 73,3 40 23,3 26,7 33,3 53,3 Hexaconazole 4 28,3 30,0 55,0 91,7 8 21,7 25,0 33,3 73,3 20 18,3 21,7 23,3 55,0 Tebuconazole 50 28,3 36,7 58,3 83,3 100 11,7 16,7 30,0 70,0 150 16,7 16,7 26,7 43,3 Propiconazole 40 21,7 33,3 50,0 70,0 62,5 23,3 26,7 41,7 61,7 125 8,3 11,7 23,3 45,0 Đối chứng 0 35,0 45,0 73,3 100,0 46 Theo bảng 4.5 nhận thấy nghiệm thức đối chứng luôn có CSB cao nhất ở tất cả các ngày theo dõi. Các loại thuốc đều có CSB giảm dần khi nồng độ tăng lên. Điều này chứng tỏ các loại thuốc đã ảnh hƣởng tới mức độ nhiễm bệnh của nấm C. cassiicola trên lá cao su cắt rời. Bảng Anova ở các phụ bảng 2.1.1, phụ bảng 2.1.3, phụ bảng 2.1.4 đều cho thấy có sự khác biệt có ý nghĩa giữa các nghiệm thức về CSB. Các nghiệm thức có nồng độ cao nhƣ Propiconazole nồng độ 125 ppm, Tebuconazole nồng độ 100 và 150 ppm, Hexaconazole nồng độ 20 ppm đều cho CSB thấp ở tất cả các ngày theo dõi và thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa so với nghiệm thức đối chứng (bảng phân hạng ở các phụ lục 2.1). Các thuốc Flusilazole nồng độ 40 ppm, Cyproconazole nồng độ 50 ppm ở những ngày đầu thì không khác biệt so với đối chứng, nhƣng đến ngày thứ 5 thì có hiệu quả khác biệt và đến ngày thứ 7 thì hiệu quả là rất cao (tƣơng đƣơng Tebuconazole nồng độ 150 ppm và Propiconazole nồng độ 125 ppm). Thuốc Difenoconazole nồng độ 125 ppm ở những ngày đầu có CSB thấp, nhƣng đến ngày thứ 7 thì CSB lại tăng nhanh (bảng 4.5) và cao hơn các thuốc khác. Điều này chứng tỏ thuốc Difenoconazole có thời gian bảo hộ ngắn. Theo dõi trên biểu đồ 4.2 thấy khi nồng độ thuốc tăng lên thì Hexaconazole có CSB giảm nhanh nhất, kế đến là Flusilazole và Cyproconazole, thuốc Difenoconazole có CSB giảm ít nhất. Điều này cũng phù hợp với kết quả của thí nghiệm in vitro ở trên cho thấy thuốc Difenoconazole có hiệu quả ức chế nấm không cao khi nồng độ tăng lên cao. 47 0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0 80,0 90,0 100,0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Nồng độ Ch ỉ s ố bệ nh Cyproconazole Difenoconazole Flusilazole Hexaconazole Tebuconazole Propiconazole Biểu đồ 4.1. Chỉ số bệnh trung bình sau 7 ngày lây bệnh trên lá cắt rời Khi đánh giá tỉ lệ nhiễm bệnh thì thấy TLB của các nghiệm thức là rất cao, đặc biệt nghiệm thức đối chứng cho TLB 100% ngay từ ngày đầu tiên sau khi lây bệnh (bảng 4.6). Điều này chứng tỏ phƣơng pháp lây bệnh bằng bào tử đƣợc thực hiện là có hiệu quả cao. TLB của ngày đầu tiên sau khi lây bệnh là có sự khác biệt ý nghĩa giữa các nghiệm thức (P = 0,0351), còn ở các ngày tiếp theo thì không có sự khác biệt (phụ lục 2.2). Ở ngày đầu tiên các thuốc Propiconazole nồng độ 125 ppm, Tebuconazole nồng độ 100 ppm, Difenoconazole nồng độ 125 ppm có TLB thấp nhất và khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng. Đến ngày thứ 5 và thứ 7 thì hầu hết các nghiệm thức đều cho TLB 100% (bảng 4.6). 48 Bảng 4.6. Tỉ lệ bệnh trung bình sau 1, 3, 5, 7 ngày lây bệnh trên lá cắt rời Thuốc Nồng Độ hoạt chất (ppm.ai) TLB (%) 1 ngày 3 ngày 5 ngày 7 ngày Cyproconazole 10 100,0 100,0 100,0 100,0 30 91,7 100,0 100,0 100,0 50 91,7 91,7 100,0 100,0 Difenoconazole 5 75,0 83,3 100,0 100,0 62,5 75,0 100,0 100,0 100,0 125 58,3 66,7 83,3 100,0 Flusilazole 10 91,7 100,0 100,0 100,0 20 83,3 91,7 100,0 100,0 40 91,7 100,0 100,0 100,0 Hexaconazole 4 100,0 100,0 100,0 100,0 8 100,0 100,0 100,0 100,0 20 91,7 100,0 100,0 100,0 Tebuconazole 50 100,0 100,0 100,0 100,0 100 50,0 66,7 100,0 100,0 150 75,0 75,0 100,0 100,0 Propiconazole 40 100,0 100,0 100,0 100,0 62,5 100,0 100,0 100,0 100,0 125 41,7 58,3 100,0 100,0 Đối chứng 0 100,0 100,0 100,0 100,0 Nhƣ vậy, có thể đi đến kết luận cả 6 loại thuốc đều có hiệu quả giảm mức độ nhiễm bệnh ở những nồng độ cao nhất trong thí nghiệm. Tuy nhiên, để đảm bảo hiệu quả phòng trị nấm triệt để thì nên tăng nồng độ của các thuốc khi áp dụng cho thí nghiệm ngoài đồng. 4.4. Kết quả thí nghiệm ngoài đồng Các thí nghiệm trong phòng chỉ là bƣớc đầu gạn lọc những thuốc không có hiệu quả và giới hạn nồng độ thuốc thí nghiệm. Để có thể khẳng định chính xác về hiệu quả phòng trị nấm của một thuốc thì cần phải tiến hành khảo sát ngoài đồng. Bởi vì, điều kiện thí nghiệm ngoài đồng gần giống với điều kiện thực tế áp dụng thuốc, các 49 thuốc cũng nhƣ mầm bệnh đều bị ảnh hƣởng bởi các điều kiện môi trƣờng nhƣ nhiệt độ, ẩm độ, ánh sáng... và đặc biệt là yếu tố ký chủ. Qua thí nghiệm in vitro và thí nghiệm trên lá cắt rời ở trên, chọn ra 5 loại thuốc và các nồng độ tƣơng ứng nhƣ sau: Bảng 4.7. Nồng độ các thuốc sử dụng trong thí nghiệm ngoài đồng Nghiệm thức Nồng độ hoạt chất (ppm a.i.) Nồng độ thuốc thƣơng phẩm (%) Cyproconazole 62,5 0,0625 Flusilazole 50 0,0125 Hexaconazole 25 0,05 Tebuconazole 156 0,0625 Propiconazole 125 0,05 Thuốc Difenoconazole bị loại bỏ do có biểu hiện không khả quan nhƣ có chỉ số LD99 (liều tiêu diệt 99% mầm bệnh) rất cao, thời gian bảo hộ ngắn, hơn nữa thuốc nó lại có giá thành cao (667.000 đồng/lít), không phổ biến trên thị trƣờng. 4.4.1. Ảnh hƣởng của các loại thuốc đến tỉ lệ nhiễm bệnh. Bảng 4.8. Tỉ lệ bệnh trung bình trƣớc và sau các lần xử lý thuốc ngoài đồng Nghiệm thức Đợt I (trƣớc xử lý) Đợt II (sau xử lý lần 1) Đợt III (sau xử lý lần 2) Đợt IV (sau xử lý lần 3) TLB * TLB * TLB * Cyproconazole 100,00 74,00 26,00 67,00 33,00 34,33 65,67 Flusilazole 99,50 68,67 30,99 56,83 42,88 26,83 73,03 Hexaconazole 100,00 71,17 28,83 55,33 44,67 21,00 79,00 Tebuconazole 100,00 72,33 27,67 63,33 36,67 28,17 71,83 Propiconazole 100,00 75,50 24,50 65,83 34,17 27,17 72,83 Đối chứng 97,17 97,50 -0,34 99,50 -2,40 99,50 -2,40 (Ghi chú: * là % bệnh giảm so với trƣớc xử lý) 50 Qua bảng 4.8 cho thấy: – Trƣớc xử lý thuốc, tỉ lệ nhiễm bệnh ở các lô bố trí là khá tƣơng đồng (P = 0,2441; phụ bảng 3.1.1), TLB rất cao và biến động ít từ 97,17 đến 100%. – Sau xử lý thuốc lần 1, giữa các nghiệm thức thuốc không có sự khác biệt về mặt thống kê, nhƣng đều khác biệt so với đối chứng (phụ bảng 3.1.2). TLB của các nghiệm thức thuốc đều giảm đi rất nhiều so với trƣớc xử lý (từ 24,5 đến 30,99%). – Sau xử lý thuốc lần 2, tất cả các thuốc đều có TLB thấp hơn nhiều so với đối chứng. Trong đó thuốc Hexaconazole có TLB giảm nhanh nhất, gần đạt 50% (44,67%) và thể hiện khác biệt so với Tebuconazole, Propiconazole, Cyproconazole. Kế đến là thuốc Flusilazole cũng cho thấy hiệu quả giảm bệnh nhanh, không khác biệt so với Hexaconazole và Tebuconazole. Còn các thuốc Tebuconazole, Propiconazole, Cyproconazole không thể hiện khác biệt về mặt thống kê (phụ bảng 3.1.3). – Sau xử lý thuốc lần 3, hầu hết các thuốc đều có mức độ giảm bệnh tƣơng đƣơng nhau và khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng. Trong đó thuốc Hexaconazole vẫn cho hiệu quả giảm bệnh tốt nhất và thể hiện khác biệt so với thuốc Cyproconazole. Nhƣ vậy, sau 3 lần xử lý các thuốc đều có hiệu quả giảm tỉ lệ nhiễm bệnh tốt, từ 65,67 đến 79%. Trong đó thuốc Hexaconazole và Flusilazole cho hiệu quả cao ngay từ những lần xử lý đầu tiên. Trên bảng 4.8 cũng cho thấy TLB của các nghiệm thức xử lý thuốc giảm đi nhanh chóng sau lần xử lý đầu tiên và lần xử lý sau cùng. Ở lần xử lý thứ 2 TLB cũng giảm đi nhƣng không nhanh bằng lần 1 và lần 3. Điều này có lẽ do lần xử lý đầu tiên thuốc có hiệu quả ngay đối với những vết bệnh mới chớm và những vết bệnh đã lâu ngày không còn khả năng lan rộng. Còn đối với những vết bệnh đã xâm nhập sâu vào trong mô lá thì thuốc chƣa đủ thời gian, liều lƣợng để thâm nhập tiêu diệt chúng (ngay cả lần xử lý thứ 2). Nhƣng đến lần thứ 3 thì các thuốc đã có đủ khả năng tiêu diệt chúng, do đó mà TLB giảm đi nhanh chóng. Nhƣ vậy, thí nghiệm bố trí phun thuốc 3 đợt, mỗi đợt cách nhau 7 ngày là rất hợp lý trong việc phòng trị bệnh. 51 4.4.2. Ảnh hƣởng của các loại thuốc đến mức độ nhiễm bệnh. Bảng 4.9. Chỉ số bệnh trung bình trƣớc và sau các lần xử lý thuốc ngoài đồng Nghiệm thức Đợt I (trƣớc xử lý) Đợt II (sau xử lý lần 1) Đợt III (sau xử lý lần 2) Đợt IV (sau xử lý lần 3) CSB * CSB * CSB * Cyproconazole 33,93 17,60 48,13 14,10 58,45 6,93 79,57 Flusilazole 30,77 15,57 49,40 11,70 61,97 5,40 82,45 Hexaconazole 33,70 16,53 50,94 11,23 66,67 4,30 87,24 Tebuconazole 31,27 17,40 44,35 13,07 58,21 5,67 81,88 Propiconazole 33,93 18,37 45,87 14,07 58,55 5,43 83,99 Đối chứng 27,07 29,23 -8,00 32,00 -18,23 31,37 -15,89 (Ghi chú: * là % bệnh giảm so với trƣớc xử lý) Qua bảng 4.9 cho thấy: – Trƣớc xử lý thuốc, CSB của các lô xử lý thuốc không có sự khác biệt. Lô đối chứng có CSB nhỏ hơn các lô bố trí thuốc Tebuconazole, Hexaconazole, Propiconazole, Cyproconazole (phụ bảng 3.2.1). – Sau xử lý thuốc lần 1, CSB của các nghiệm thức xử lý thuốc đều giảm nhanh từ 44,35 đến 50,94%. Ngƣợc lại, CSB của nghiệm thức đối chứng lại tăng lên 8%. Chính vì vậy, khi xử lý thống kê cho thấy có sự khác biệt giữa đối chứng và các nghiệm thức xử lý thuốc. Giữa các nghiệm thức thuốc không cho thấy khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê (phụ bảng 3.2.2). – Sau xử lý thuốc lần 2, hiệu quả giảm CSB của các loại thuốc đều tăng lên so với lần xử lý 1 (CSB giảm từ 58,21 đến 66,67% so với trƣớc xử lý). Mức độ giảm CSB giữa các loại thuốc không có sự khác biệt về mặt thống kê, nhƣng đều khác biệt so với đối chứng. – Sau xử lý thuốc lần 3, hiệu quả giảm CSB của các loại thuốc đạt mức cao, từ 79,57 đến 87,24%. Điều này chứng tỏ các loại thuốc thí nghiệm đều có hiệu quả trị 52 bệnh tốt. Trong đó thuốc Hexaconazole luôn cho hiệu quả tốt nhất, kế đến là thuốc Flusilazole. Thuốc Cyproconazole ở lần xử lý thứ 3 thể hiện hiệu quả kém hơn thuốc Hexaconazole, còn các loại thuốc khác không thể hiện sự khác biệt. Nghiệm thức đối chứng vẫn có CSB tăng lên. Bảng 4.9 cũng cho thấy tất cả các thuốc đều có hiệu quả trị nấm tốt ngay từ lần xử lý đầu tiên. CSB ở lần xử lý đầu tiên giảm đi nhanh chóng, còn các lần xử lý tiếp theo mức độ giảm bệnh vẫn cao song không bằng lần đầu. Nhƣ vậy, có thể đi đến kết luận rằng cả 5 loại thuốc thí nghiệm đều có hiệu quả phòng trị nấm C. cassiicola tốt. Tỉ lệ khỏi bệnh khá cao từ 65 đến 79%, mức độ bệnh cũng giảm từ 79 đến 87%. Tác dụng của các thuốc ổn định sau 21 ngày theo dõi. Đặc biệt, trong thời gian thí nghiệm, thời tiết có mƣa nhiều là yếu tố thuận lợi cho nấm lây lan và gây bệnh (chính vì vậy mà nghiệm thức đối chứng luôn có TLB và CSB tăng lên qua các đợt theo dõi), đồng thời cũng ảnh hƣởng không nhỏ tới tác dụng của thuốc. Tuy nhiên, với kết quả nhƣ trên đã khẳng định đƣợc tác dụng lƣu dẫn của các loại thuốc là rất tốt ít bị ảnh hƣởng bởi môi trƣờng. Trong các loại thuốc thì Hexaconazole và Flusilazole mặc dù có nồng độ thấp (25 và 40 ppm) song vẫn cho hiệu quả trị nấm cao nhất. Các thuốc Propiconazole và Tebuconazole cũng có hiệu quả cao song nồng độ sử dụng ở đây là cao hơn (125 và 150 ppm). Còn thuốc Cyproconazole có lẽ cần tăng nồng độ lên (nồng độ sử dụng ở đây là 50 ppm) để tăng hiệu quả trị nấm. Hơn nữa, thuốc Hexaconazole thuộc nhóm độc III, ít gây độc đối với ngƣời sử dụng cũng nhƣ môi trƣờng, đồng thời nó lại dễ tìm và rẻ tiền (thuốc thƣơng mại là Anvil 5 SC có bán phổ biến ở hầu hết các đại lý thuốc BVTV lớn và nhỏ, giá khoảng 340.000 đồng/lít). Do đó nên khuyến cáo ngƣời trồng cao su sử dụng thuốc Hexaconazole để phòng trị nấm C. cassiicola và có thể sử dụng các thuốc khác nhƣ: Flusilazole, Propiconazole, Tebuconazole, Cyproconazole để xử lý luân phiên, tránh hiện tƣợng kháng thuốc có thể xảy ra. Nên phun làm 3 đợt, mỗi đợt cách nhau 7 ngày để có hiệu quả trị bệnh cao nhất. 53 Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận – Trong thí nghiệm in vitro: có 6 thuốc cho hiệu quả trị nấm cao là: Hexaconazole, Flusilazole, Cyproconazole, Propiconazole, Tebuconazole và Triadimenol. Thuốc Difenoconazole có hiệu quả ức chế cao ngay từ nồng độ thấp nhƣng khi tăng nồng độ lên cao thì hiệu quả lại tăng rất ít. Thuốc Triacyclazole không có hiệu quả ức chế, thuốc Triadimefon có hiệu quả ức chế trung bình. Các loại thuốc trên không ảnh hƣởng tới bào tử đƣợc hình thành trên môi trƣờng bị đầu độc. – Trong thí nghiệm trên lá cắt rời: cả 6 loại thuốc Hexaconazole, Flusilazole, Cyproconazole, Propiconazole, Tebuconazole, Difenoconazole đều có hiệu quả giảm CSB nhƣng không làm giảm TLB. – Trong thí nghiệm ngoài đồng: 5 loại thuốc là Hexaconazole nồng độ 25 ppm, Flusilazole nồng độ 50 ppm, Cyproconazole nồng độ 62,5 ppm, Propiconazole nồng độ 125 ppm và Tebuconazole nồng độ 156 ppm đều có hiệu lực trị nấm cao. Tỉ lệ khỏi bệnh hoàn toàn từ 65 đến 79%, mức độ bệnh giảm từ 79 đến 87%. Trong đó thuốc Hexaconazole luôn thể hiện hiệu quả cao nhất ở tất cả các thử nghiệm. 5.2. Đề nghị – Sử dụng thuốc Hexaconazole với nồng độ 25 ppm a.i. (nồng độ thuốc thƣơng phẩm là 0,05%) để phun phòng trị bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su. Có thể luân phiên sử dụng các thuốc khác để thay thế là: Cyproconazole, Flusilazole, Tebuconazole, Propiconazole. Nên xử lý làm 3 đợt, mỗi đợt cách nhau 7 ngày. 54 – Sử dụng chủng nấm C. cassiicola phân lập từ dvt khác (có khả năng tạo nhiều bào tử trên môi trƣờng nhân tạo) và áp dụng các biện pháp kích thích tạo bào tử để nghiên cứu kỹ hơn ảnh hƣởng của các loại thuốc đối với khả năng phát sinh bào tử, hình thái và tỉ lệ nảy mầm của bào tử. – Tiếp tục khảo sát phƣơng pháp thử thuốc trên lá cắt rời với các loại nấm và loại thuốc khác, để xây dựng phƣơng pháp chung nhằm áp dụng rộng rãi trong công tác nghiên cứu BVTV. 55 Chƣơng 6 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt 1. Phạm Văn Biên, Bùi Cách Tuyến và Nguyễn Mạnh Chinh, 2006. Cẩm nang thuốc bảo vệ thực vật. Nhà xuất bản Nông Nghiệp. 2. Trần Văn Cảnh, 2006. Công tác bảo vệ ngành cao su việt nam 3. Vũ Thị Quỳnh Chi, 2005. Phân tích đa dạng di truyền một số mẫu nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei gây bệnh trên cây cao su (Hevea brasliensis Muell. Arg) bằng phương pháp RFLP – PCR.. Khóa Luận tốt nghiệp kỹ sƣ công nghệ sinh học, Đại học Nông lâm Tp. HCM. 4. Phan Thành Dũng, 2004. Kỹ thuật bảo vệ thực vật cây cao su. Nhà xuất bản Nông Nghiệp. 5. Phan Thành Dũng, 2006. Công tác bảo vệ ngành cao su việt nam. Hiên trang và thác thức mới(VNCCSVN). 6. Nguyễn Đôn Hiệu, 2004. Điều tra và đánh giá hiệu quả trị bệnh nấm hồng trên cây cao su của một số thuốc trừ nấm. Luận văn tốt nghiệp, Trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. HCM. 7. Trần Thị Thuý Hoa, 2006. Hiện trạng, phương hướng phát triển ngành cao su Việt Nam và cao su tiểu điền đến năm 2020. Diễn đàn Khuyến nông & Công nghệ lần thứ 6. Bộ NN & PTNT. 8. Lê Văn Huy, 2006. Nghiên cứu đa dạng di truyền của quần thể nấm C.cassiicola(Burt &Curt) Wei gây bệnh cho cây cao su tại trại thực nghiệm cao su Lai Khê, Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam bằng kỹ thuật RAPD.. Khóa Luận tốt nghiệp kỹ sƣ công nghệ sinh học, Đại học Nông lâm Tp. HCM. 9. Nguyễn Trần Oánh, 1997. Hóa học bảo vệ thực vật. Nhà xuất bản Nông nghiệp Hà Nội. Trang 123. 56 10. Huỳnh Hữu Tấn, 1996. So sánh biện pháp phòng trừ bệnh nấm hồng và bước đầu thăm dò kỹ thuật trong phòng thí nghiệm. Luận văn tốt nghiệp, Đại học Nông lâm Tp. HCM. 11. Nguyễn Hữu Trí, 2004.Công nghệ cao su thiên nhiên. Trang 17 – 20 12. Tập đoàn Cao su Việt Nam, 2007. Báo cáo tổng kết năm 2006 13. Đặng Văn Vinh, 1997. Cao su thiên nhiên trên thế giới. Nhà xuất bản Nông Nghiệp Tài liệu tiếng nƣớc ngoài 14. Chee K.H., 1987. Corynespora leaf spot. Rubber Research Institute of Malaysia. Planters’ Bulletin, No 194: 3 – 7. 15. Chee K.H., 1988. Studies on sporulation pathorenicity and epidemiology of Corynespora. Journal of Natural Rubber research 3(1). 16. Darussamin A., Pawirosoemardjo S., 1996. Proceedings of the Workshop on Corynespora Leaf Fall Disease of Hevea Rubber. Indonesian Rubber Research Institute, Medan, Indonesia. 17. Dung P.T., 1995. Studies on C. cassiicola (Berk. & Curt.) Wei on rubber. Masters’ thesis. University Pertanian Malaysia. 18. Ellis M.B. and Holiday, 1971. Corynespora cassiicola. C.M.I Description of Pathogenic Fungi and Bacteria. No. 303. 1-2. 19. Liyanage A.de., Jayasinghe C.K., Liyanage N.S.I and Jayaratne R., 1986. Corynespora leaf spot disease of (Hevea brasiliensis): a new record. Journal of rubber research institute of Sri Lanka. 65. 47 – 50 20. Liyanage A.de., Jayasighe, C. cassiicola k. and liyanage, N.I.S. (1988).Biology, epidemiology and pathogenicity of Corynespora cassiicola leaf fall disease workshop held at Bogor Research Instute, Indonesia, 12 th to 13 th february, 1988 21. International Natural Rubber Organization (INRO), 1999. A proposal to the common fund for commodities (CFC). International Natural Rubber Organization 5/1999. 57 22. Jayashinge C.K., 2000. Current status of Corynespora leaf fall in Sri Lanka. Presented at workshop on Corynespora leaf fall disease of Hevea brassiliensis, Kuala Lumpur, Malaysia and Medan, Indonesia, 6 – 15, June, 2000. 23. Jinji P., Yangxian Q., Yixian X., Huiqiang Z. and Z. He., 2007. First record of Corynespora leaf fall disease of Hevea rubber tree in China. Australian Plant Disease Notes 2(1): 35 – 36 24. Manju M.J, 2006. Chemical control of Corynespora leaf fall disease. Corynespora leaf disease of Hevea brasiliensis Strategies for management (C. Kuruvilla Jacob, P. Srinivas, C. Bindu Roy). Rubber Research Institute of India, Kottayam, Kerala, India. p. 102 – 108. 25. Srinivas P. and Idicula S.P., 2006. Fungicides in Corynespora leaf fall disease management. A Laboratory Manual for International Training on Strategies for Management of Corynespora Leaf Fall Disease of Hevea Brasiliensis (C.K. Jacob, P. Srinivas, C. Bindu Roy). Rubber Research Institute of India, Kottayam, India. p. 40 – 49. Tài liệu internet 26. n=456 58 PHỤ LỤC Phụ lục 1. Kết quả thí nghiệm in vitro Phụ lục 1.1. Sự ức chế của các loại thuốc lên đƣờng kính khuẩn lạc Phụ bảng 1.1.1. Tỉ lệ (%) đƣờng kính khuẩn lạc giảm so với đối chứng sau 1 ngày cấy nấm Analysis of Variance for DK1NG.ucche - Type III Sums of Squares -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- MAIN EFFECTS A:DK1NG.Dot 223.254 2 111.627 .736 .4821 B:DK1NG.Thuoc 52317.217 8 6539.652 43.103 .0000 C:DK1NG.Nongdo 60926.935 4 15231.734 100.393 .0000 INTERACTIONS BC 21519.858 32 672.49556 4.432 .0000 RESIDUAL 13351.451 88 151.72103 -------------------------------------------------------------------------------- TOTAL (CORRECTED) 148338.72 134 -------------------------------------------------------------------------------- 0 missing values have been excluded. All F-ratios are based on the residual mean square error. Multiple range analysis for DK1NG.ucche by DK1NG.Thuoc -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- Ty 15 11.226604 X Tf 15 35.034654 X Di 15 48.202713 X Te 15 58.811887 X Ta 15 61.541968 X Pr 15 64.719496 XX Cy 15 67.695931 XX Fl 15 71.512119 XX He 15 78.274587 X -------------------------------------------------------------------------------- Multiple range analysis for DK1NG.ucche by DK1NG.Nongdo -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 0.1 27 27.562885 X 0.5 27 39.077604 X 2.5 27 50.905197 X 12.5 27 74.097838 X 25 27 84.478674 X ---------------------------