Khảo sát mối quan hệ giữa hoạt tính Enzyme Nitroreductase với khả năng khử độc cho nguồn nước bị nhiễm thuốc nổ TNT của cây thủy trúc- Đỗ Ngọc Khuê

Nghiên cứu khoa học công nghệ Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số 34, 12 - 2014 147 KH¶O S¸T MèI QUAN HÖ GI÷A HO¹T TÝNH ENZYME NITROREDUCTASE Víi KH¶ N¨NG KHö ®éc CHO Nguån N­íc BÞ NHIÔM THUèC Næ TNT CñA C©Y THñY TRóC ĐỖ NGỌC KHUÊ*PHẠM KIÊN CƯỜNG*, NGUYỄN VĂN HOÀNG*, VŨ QUANG BÁCH**, ĐỖ BÌNH MINH* Tãm t¾t: Bµi b¸o giíi thiÖu kÕt qu¶ kh¶o s¸t vÒ ho¹t tÝnh enzyme nitroreductase trong mét sè lo¹i thùc vËt thñy sinh (chñ yÕu lµ c©y thñy tróc) vµ mèi quan hÖ cña ho¹t tÝnh enzyme nµy víi kh¶ n¨ng khö ®éc cho nguån n­íc nhiÔm thuèc næ TNT. KÕt qu¶ thö nghiÖm cho thÊy c©y thñy tróc cã ho¹t tÝnh enzyme nitroreductase cao vµ ®©y cã thÓ lµ nguyªn nh©n chÝnh ®· t¹o ra kh¶ n¨ng hÊp thu vµ chuyÓn hãa TNT cña thñy tróc cao h¬n ®¸ng kÓ so víi c¸c lo¹i thùc vËt kh¸c nh­ c¸c lo¹i bÌo. Tõ kho¸: Ho¹t tÝnh enzyme nitroreductase, Thñy tróc, Khử độc TNT. 1. MỞ ĐẦU Khö ®éc cho ®Êt vµ n­íc bÞ nhiÔm thuèc næ ®ang lµ vÊn ®Ò m«i tr­êng ®­îc c¸c nhµ khoa häc ë nhiÒu n­íc trªn thÕ giíi quan t©m nghiªn cøu. Tuy nhiªn, nh­ ta ®· biÕt, c¸c c«ng nghÖ truyÒn thèng ®Ó xö lý ®Êt, n­íc bÞ nhiÔm thuèc næ, vÒ b¶n chÊt, lµ c«ng nghÖ ex-situ, chóng th­êng tiªu tèn nhiÒu n¨ng l­îng vµ ®ßi hái chi phÝ cao [1]. Trong khi ®ã thùc tiÔn ®· cho thÊy phytoremediation lµ c«ng nghÖ xö lý « nhiÔm thuèc næ gi¸ thµnh thÊp (low-cost), in situ vµ th©n thiÖn víi m«i tr­êng [1-3]. Trong gi¶i ph¸p c«ng nghÖ nµy ®Ó ph©n hñy vµ chuyÓn hãa thuèc næ thµnh c¸c chÊt Ýt ®éc h¬n víi m«i tr­êng cã thÓ sö dông rÊt nhiÒu lo¹i thùc vËt, c©y trång trªn c¹n vµ thñy sinh kh¸c nhau [1-14], trong ®ã cã c¸c lo¹i c©y cã thÓ t¹o ra c¸c enzym cã kh¶ n¨ng ph©n hñy c¸c hîp ch©t xenobiotics, c¸c lo¹i c©y biÕn ®æi gen (transgenic plants) [2-7]. C¸c kÕt qu¶ nghiªn cøu gÇn ®©y của chóng t«i [ 8,9] còng ®· cho thÊy mét sè loµi thùc vËt ­a n­íc phổ biến ở Việt Nam nh­ mét sè lo¹i cá th­êng mäc ë vïng ®Çm lÇy (cá l¸c, cá l¨n) vµ ®Æc biÖt lµ c¸c c©y hä cãi (Cyperraceae) trong ®ã cã c©y cãi vµ ®Æc biÖt lµ c©y thuû tróc Cyperus alternifolius Linn cã kh¶ n¨ng khö ®éc rÊt tèt cho nguån n­íc bÞ nhiÔm c¸c lo¹i hãa chÊt cã tÝnh næ trong ®ã cã TNT. Tuy nhiªn trong c¸c c«ng tr×nh ®· c«ng bè [8,9] cßn ch­a ®Ò cËp ®Õn mèi quan hÖ gi÷a ho¹t tÝnh enzyme nitroreductasse cña c¸c lo¹i c©y ®· kh¶o s¸t víi kh¶ n¨ng hÊp thu vµ chuyÓn hãa c¸c thuèc næ cu¶ chóng. Trong bµi b¸o nµy chóng t«i sÏ giíi thiÖu kÕt qu¶ kh¶o s¸t b­íc ®Çu vÒ ho¹t tÝnh enzyme nitroreductase trong mét sè lo¹i thùc vËt thñy sinh vµ sù biÕn ®æi cña enzym nµy trong c©y thuû tróc Cyperus alternifolius Linn trong quá trình khö ®éc cho n­íc bÞ nhiÕm TNT. Môc ®Ých cña viÖc thö nghiÖm nµy kh«ng nh÷ng lµ lµm s¸ng tá h¬n b¶n chÊt kh¶ n¨ng khö ®éc thuèc næ cña c©y thuû tróc, mµ cßn gãp phÇn x©y dùng ph­¬ng ph¸p míi dïng ®Ó ph©n lo¹i, lùa chän vµ dù b¸o c¸c lo¹i thùc vËt thÝch hîp cho môc ®Ých khö ®éc cho m«i tr­êng n­íc bÞ nhiÔm c¸c lo¹i thuèc næ dùa trªn c¬ së mét sè chØ tiªu hãa sinh (thÝ dô, c¸c lo¹i enzyme thùc vËt trong ®ã cã enzyme nitroreductase). 2. PhÇn thùc nghiÖm 2.1. ThiÕt bÞ nghiªn cøu §Ó nghiªn cøu ®· sö dông thiÕt bÞ s¾c ký láng hiÖu n¨ng cao Model HP 1100 (Mü) víi detector chuçi (DAD); thiÕt bÞ GC/MS model 9860N cña h·ng Agilent (Mü), m¸y quang Hoá học & Kỹ thuật môi trường Đỗ Ngọc Khuê,,Đỗ Bình Minh, “Khảo sát mối quan hệcây thuỷ trúc.” 148 phæ tö ngo¹i kh¶ kiÕn UV-Vis Agilent 8453 (Mü), thiÕt bÞ nghiÒn mÉu thùc vËt chuyªn dông cña h·ng Philip; c©n ph©n tÝch cã ®é chÝnh x¸c  0,4 mg cña h·ng Tolido (Thuþ SÜ) vµ m¸y ®o pH cña h·ng Hanna (Singapo). 2.2. Ho¸ chÊt §Ó chiÕt t¸ch chÊt « nhiÔm tõ n­íc, thùc vËt vµ ®Ó ph©n tÝch HPLC, ®· sö dông mét sè lo¹i dung m«i cã ®é s¹ch s¾c ký nh­ hexan, axetonitryl, etanol, methanol cïng c¸c hãa chÊt kh¸c ®Òu ®¹t tiªu chuÈn ®é s¹ch ding cho ph©n tÝch. 2.3. §èi t­îng nghiªn cøu §èi t­îng nghiªn cøu lµ mét sè lo¹i thùc vËt thñy sinh nh­: bÌo c¸i Pistia stratiotes, bÌo lôc b×nh Eichhoznia crassipes, bÌo hoa d©u Azolla cazoliana, c©y cãi vµ c©y thuû tróc cã møc ph¸t triÓn trung b×nh, ch­a ra hoa. Nguån cung cÊp c¸c lo¹i thùc vËt trªn ®· ®­îc nªu trong tµi liÖu [8,13]. MÉu n­íc th¶i nhiÔm TNT ®­îc lÊy trùc tiÕp tõ 1 c¬ së s¶n xuÊt vËt liÖu næ thuéc Tæng côc c«ng nghiÖp Quèc phßng. 2.4. Ph­¬ng ph¸p nghiªn cøu 2.4.1. Ph­¬ng ph¸p chuÈn bÞ mÉu thÝ nghiÖm - C¸c mÉu bÌo c¸i Pistia stratiotes, bÌo lôc b×nh Eichhoznia crassipes, bÌo hoa d©u Azolla cazolian vµ c©y cãi ®­îc lÊy trùc tiÕp ở thùc ®Þa từ m«i tr­êng n­íc kh«ng bÞ nhiÔm TNT råi ®­a ®i xö lý vµ ph©n tÝch ho¹t tÝnh enzyme nitroreductase theo quy tr×nh ®· dÉn trong môc 2.4.3. - MÉu c©y thñy tróc ®­îc chuÈn bÞ theo c¸ch t­¬ng tù nh­ ®· tr×nh bµy trong tµi liÖu [8]. Cã 3 bÓ thÝ nghiÖm ®­îc chuÈn bÞ: 1. BÓ cã trång thuû tróc víi l­îng sinh khèi trung b×nh (P) 400-450g (tÝnh c¶ phÇn rÔ, gèc, th©n, l¸)(bÓ 1) ®­îc bæ sung 2 lÝt n­íc kh«ng nhiÔm TNT (gäi lµ bÓ trång thñy tróc ®èi chøng). 2. BÓ cã trång thuû tróc víi l­îng sinh khèi trung b×nh (P) 400-450g (tÝnh c¶ phÇn rÔ, gèc, th©n, l¸) (bÓ 2) ®­îc bæ sung 2 lÝt n­íc th¶i cã nång ®é TNT ban ®Çu lµ 42,5 mg/l TNT. 3. BÓ chØ chøa 2lÝt dung dÞch n­íc th¶i nhiÔm TNT víi nång ®é ban ®Çu lµ 42,5mg/l TNT. §Ó x¸c ®Þnh sù biÕn ®æi hµm l­îng TNT trong qu¸ tr×nh xö lý sÏ ®Þnh kú lÊy mÉu n­íc trong bÓ 2 ®Ó x¸c ®Þnh hµm l­îng TNT b»ng ph­¬ng ph¸p HPLC. §Ô ph©n tÝch ho¹t tÝnh enzyme nitroreductase (EN) cña c©y thñy tróc ®Þnh kú t¸ch lÊy c¸c nh¸nh c©y thñy tróc (bao gåm c¶ phÇn cñ vµ th©n) trång trong bÓ 1 vµ 2 sau ®ã sÏ t¸ch riªng phÇn cñ vµ th©n ®Ó xÐt nghiÖm ho¹t tÝnh EN trong tõng phÇn ®ã. 2.4.2. Ph­¬ng ph¸p x¸c ®Þnh TNT Hµm l­îng TNT trong mÉu n­íc bÓ 2 ®­îc x¸c ®Þnh b»ng ph­¬ng ph¸p HPLC theo quy tr×nh ®· nªu trong tµi liÖu [8. C¸c s¶n phÈm chuyÓn ho¸ cña TNT trong mÉu thùc vËt ®­îc x¸c ®Þnh b»ng ph­¬ng ph¸p GC/MS theo quy tr×nh sau: nhæ c¶ khãm thñy tróc cßn l¹i trong bÓ 2 sau khi ®· lÊy mÉu ®Ó x¸c ®Þnh ho¹t tÝnh EN (tøc lµ khãm thñy tróc ®· sö dông ®Ó xö lý n­íc th¶i nhiÔm TNT ) vµ khãm thñy tróc ®èi chøng cßn l¹i (trång trong bÓ 1); röa s¹ch toµn bé c¸c phÇn cña c©y, ph¬i kh« tù nhiªn råi t¸ch riªng phÇn: rÔ, cñ, th©n, l¸ b¨m nhá c¸c phÇn nµy råi ®em sÊy kh« ë 60oC trong 24 giê. Sö dông m¸y nghiÒn chuyªn dông nghiÒn nhá mÉu. §Ó ph©n tÝch cÇn lÊy l­îng mÉu kho¶ng 10g sau ®ã chiÕt sochlet víi dung m«i lµ axetonitryl trong thêi gian 1 giê. Dung m«i chiÕt ®­îc ®Þnh møc tíi 50ml b»ng axetonitryl råi ®­a ®i ph©n tÝch GC/MS. §iÒu kiÖn ph©n tÝch GC/MS ®· nªu trong tµi liÖu 8. 2.4.3. Ph­¬ng ph¸p x¸c®Þnh hoạt tÝnh của enzym nitroreductase TNT ®­îc chuyÓn hãa rÊt m¹nh nhê nitroreductase vµ rÊt nhiÒu thµnh phÇn kh¸c, bao gåm hydorxylamino-dinitrotoluenes, amino-dinitrotoluenes vµ diamino-dinitrotoluenes [11]. V× vËy theo Adamia [12] hiện ch­a thÓ cã c¸c sè liÖu ®Þnh l­îng vÒ ho¹t ®é enzyme nitroreductase, mµ chØ cã thÓ x¸c ®Þnh ®­îc ho¹t tÝnh cña nã. Ho¹t tÝnh cña nitroreductase, Nghiên cứu khoa học công nghệ Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số 34, 12 - 2014 149 theo [11] cã thÓ ®­îc x¸c ®Þnh dùa trªn kÕt qu¶ ®o tèc ®é ph©n hñy cña TNT khi cã mÆt enzyme nµy trong dung dÞch thö nghiÖm (ñ)[11]. Qu¸ tr×nh nµy ®­îc tiÕn hµnh nhê viÖc x¸c ®Þnh TNT kh«ng bÞ biÕn ®æi trong dung dÞch ñ. Trong ®iÒu kiÖn kiÒm m¹nh, TNT cã b­íc sãng hÊp phô quang häc lµ 447nm, trong khi ®ã nh÷ng chÊt tæng hîp chÝnh cña nã nh­ 2-amino-4,6-dinitrotoluene, 4-amino-2,6-dinitrotololuene, vµ 2,6-diamino-4- nitrotoluene l¹i kh«ng phæ biÕn ë b­íc sãng nµy [14]. Hçn hîp ñ bao gåm TNT, t¸c nh©n khö (NADH hoÆc NADPH), ®Öm photphat pH 7.4 vµ dÞch ®ång hãa tÕ bµo cña mét m« c¬ quan cña thùc vËt. Sau 30 phót, ph¶n øng ®­îc dõng l¹i b»ng c¸ch bæ sung KOH 1M. pH cña hçn hîp ®­îc x¸c ®Þnh ph¶i > 12.2 do bæ sung KOH. Sau 4 phót, hçn hîp ®­îc ph©n tÝch b»ng c¸ch ®ã sù hÊp phô ë b­íc sãng 447 nm. MÉu chØ gåm TNT vµ KOH ®­îc dïng lµm thÝ nghiÖm ®èi chøng. C¸c b­íc tiÕn hµnh cô thÓ nh­ sau: + ChuÈn bÞ nguyªn liÖu vµ hãa chÊt - §Öm phosphate 50mM, pH 7.4 cã chøa NaCl 25mM dùng để chiết. - §Öm phosphate 100mM, pH 7.4 dùng cho mục đích phân tích hoạt tính; - Dung dÞch TNT (10X): 200 µM; Dung dÞch β NADH: 1.5 mM; - DÞch chiÕt tõ thùc vËt ®­îc chuÈn bÞ nh­ sau: 1gam mÉu thùc vËt ®­îc nghiÒn víi 5ml ë nhiÖt ®é 4oC, dÞch nghiÒn ®ång thÓ sau ®ã ®­îc ly t©m 14.000rpm, 4oC trong 20 phót thu dÞch trong ®Ó x¸c ®Þnh ho¹t tÝnh enzym nitroreductase. + TiÕn hµnh x¸c ®Þnh ho¹t tÝnh: Chuẩn bị 2 ống nghiệm trong đó 1 ống dùng để thí nghiệm xác định hoạt tính (gọi tắt là ống thí nghiệm) và 1 ống dùng để đối chứng (gọi tắt là ống kiểm tra) , thành phần dung dịch trong 2 ống được dẫn trong bảng 1. Bảng1. Thành phần dung dịch trong các ống thí nghiệm và kiểm tra. èng thÝ nghiÖm (TN) èng kiÓm tra (KT) - 1 ml ®Öm ph©n tÝch ho¹t tÝnh - 0.2 ml dung dÞch β NADH 1.5 mM - 0.4 ml H20 - 0.2 ml dÞch thùc vËt chiÕt chøa enzym nitroreductase - 0.2 ml dd TNT(10X) - 1 ml ®Öm ph©n tÝch ho¹t tÝnh - 0.2 ml dung dÞch β NADH 1.5 mM - 0.4 ml H20 - 0.2 ml ®Öm chiÕt thùc vËt chiÕt chøa enzym nitroreductase ®· xö lý nhiÖt 100oC trong 5 phót - 0.2 ml dd TNT (10X) Việc xác định hoạt tính enzyme trong ống thí nghiệm được tiến hành như sau: Trén ®Òu hỗn hợp trong ống dùng để phân tích hoạt tính, ñ tiếp hçn hîp ph¶n øng ë nhiÖt ®é phßng trong 30 phót, sau ®ã bæ sung KOH 1M, ®Ó ®¹t pH > 12.2. Ly t©m thu dÞch trong, sau đó ®o mËt ®é quang øng víi b­íc sãng 447nm (OD447TN). + Hoạt tính enzyme trong ống kiểm tra được tiến hành như sau:Thay 0.2 ml dÞch chiÕt tõ thùc vËt b»ng ®Öm chiÕt , sau ®ã còng ®o mËt ®é quang øng víi b­íc sãng 447 nm (OD447KT). Ho¹t tÝnh enzyme nitroreductase ®­îc x¸c ®Þnh trªn c¬ së tÝnh hiÖu sè gi÷a OD447TN) vµ OD447KT: ∆OD447 = OD447 KT - OD447 TN ë ®©y ∆OD447 thÓ hiÖn ho¹t tÝnh cña enzym nitroreductase. 3. KÕt qu¶ vµ th¶o luËn 3.1. Kh¶o s¸t ho¹t tÝnh enzym nitroreductase cña mét sè lo¹i thùc vËt thñy sinh Sö dông ph­¬ng ph¸p nªu trong môc 2.4.3 ®· tiÕn hµnh kh¶o s¸t ho¹t tÝnh enzyme nitroreductase ë mét sè lo¹i thùc vËt thñy sinh nh­ bÌo hoa d©u, bÌo c¸i, bÌo lôc b×nh, c©y thñy tróc vµ c©y cãi, kÕt qu¶ ®­îc thÓ hiÖn trªn h×nh 1. Tõ kÕt qu¶ dÉn trªn h×nh 1 cho thÊy ho¹t tÝnh enzyme nitroreductase lµ rÊt thÊp ë c¸c lo¹i thùc vËt thñy sinh ®· ®­îc chøng minh lµ Ýt cã kh¶ n¨ng tån t¹i vµ ph¸t triÓn trong m«i tr­êng bÞ nhiÔm thuèc næ nh­ bÌo hoa d©u, bÌo c¸i vµ bÌo lôc b×nh [8,10]. Trong khi ®ã ho¹t tÝnh enzyme nitroreductase ë c¸c c©y hä cãi Cyperus (c©y cãi vµ thñy tróc) lµ nh÷ng Hoá học & Kỹ thuật môi trường Đỗ Ngọc Khuê,,Đỗ Bình Minh, “Khảo sát mối quan hệcây thuỷ trúc.” 150 c©y cã kh¶ n¨ng khö ®éc cho m«i tr­êng bÞ nhiÔm thuèc næ [8,10] cao h¬n tõ 3 ®Õn 4 lÇn so víi c¸c lo¹i bÌo, trong ®ã ho¹t tÝnh enzyme nitroreductase ë c©y thñy tróc lµ cao nhÊt. KÕt qu¶ kh¶o s¸t cßn cho thÊy ho¹t tÝnh enzyme nitroreductase ë c¸c bé phËn kh¸c nhau cña c©y thñy tróc còng kh¸c nhau trong ®ã ho¹t tÝnh cña enzyme nµy ë phÇn cñ cña c©y lµ cao nhÊt (h×nh 2). Nh­ vËy kh¶ n¨ng chuyÓn hãa m¹nh c¸c thuèc næ sau khi ®­îc hÊp thu sÏ x¶y ra m¹nh nhÊt ë vïng cñ cña c©y thñy tróc. H×nh 1. Ho¹t tÝnh enzyme nitroreductase ë mét sè lo¹i thùc vËt thñy sinh H×nh 2. Ho¹t tÝnh enzyme nitroreductase ë c¸c bé phËn kh¸c nhau cña c©y thñy tróc 3.2. Kh¶o s¸t sù biÕn ®æi ho¹t tÝnh enzym nitroreductase cña c©y thñy tróc trong qu¸ tr×nh xö lý nguån n­íc nhiÔm TNT Nh»m x¸c ®Þnh mèi quan hÖ gi÷a ho¹t tÝnh enzyme nitroreductase víi kh¶ n¨ng khö ®éc cho n­íc bÞ nhiÔm TNT cña c©y thñy tróc, chóng t«i tiÕn hµnh kh¶o s¸t ®ång thêi sù biÕn ®æi nång ®é TNT trong dung dÞch cã trång thñy tróc (bÓ 2) vµ kh¶o s¸t sù biÕn ®æi ho¹t tÝch cña enzyme nµy trong qu¸ tr×nh sö dông ®Ó khö ®éc cho nguån n­íc bÞ nhiÕm TNT. H×nh 3. Sù biÕn ®æi theo thêi gian hµm l­îng TNT trong bÓ 3 kh«ng trång thñy tróc (1) vµ bÓ 2 cã trång thñy tróc (2) KÕt qu¶ ®o sù biÕn ®æi hµm l­îng TNT trong dung dÞch bÓ 2 vµ bÓ 3 theo thêi gian ®­îc dÉn trªn h×nh 3. Trên hình này đ­êng 1 øng víi sù biÕn ®æi TNT trong bÓ 3 (bÓ chøa n­íc th¶i nhiÔm TNT nh­ng kh«ng trång thñy tróc); đ­êng 2 øng víi sù biÕn ®æi TNT trong bÓ 2 (bÓ chøa n­íc th¶i nhiÔm TNT vµ cã trång thñy tróc). Tõ h×nh 3 ta nhËn thÊy trong ®iÒu kiÖn kh«ng cã thuû tróc (®­êng 1) hµm l­îng TNT trong n­íc th¶i hÇu nh­ kh«ng thay ®æi sau thêi gian thö nghiÖm lµ 20 ngµy. Sù suy gi¶m ®¸ng kÓ hµm l­îng TNT theo thêi gian chØ nhËn thÊy ®èi víi n­íc th¶i cña bÓ cã trång thñy tróc (®­êng 2). Sau 12 ngµy thö nghiÖm hµm l­îng TNT trong bÓ 2 gi¶m gÇn hÕt (chØ cßn 0,25 mg/l so víi hµm l­îng ban ®Çu lµ 42,5 mg/l). Cïng víi sù biÕn ®æi nång ®é TNT trong dung dÞch bÓ 2 (h×nh 3) th× ho¹t tÝnh enzyme nitroreductase trong c¸c bé phËn cñ vµ th©n cña c©y thñy tróc trång trong bÓ nµy còng thay ®æi (h×nh 4,5). Kh¸c víi quy luËt biÕn ®æi nång ®é TNT trong bÓ cã trång thñy tróc (bÓ 2) ho¹t tÝnh enzyme nitroreductase trong mÉu cñ (h×nh 4) vµ th©n thñy tróc (h×nh 5) lÊy trùc tiÕp tõ bÓ nµy t¨ng dÇn trong kho¶ng thêi gian ®Çu cña qu¸ tr×nh xö lý vµ ®¹t gi¸ trÞ cùc ®¹i ë thêi ®iÓm sau 10 ngµy xö lý (tøc lµ khi nång ®é TNT trong dung dÞch ®· gi¶m m¹nh) vµ Nghiên cứu khoa học công nghệ Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số 34, 12 - 2014 151 sau ®ã lµ gi¶m dÇn khi tiÕp tôc t¨ng thêi gian. ViÖc ph¸t hiÖn ®­îc ho¹t tÝnh enzyme nitroreductase cho thÊy kh¶ n¨ng khö ®éc cho n­íc nhiÔm TNT liªn quan chñ yÕu ®Õn enzyme nitroreductase t¸c ®éng lªn nhãm nito cña TNT. §iÒu nµy ®· chØ ra r»ng con ®­êng biÕn ®æi chÝnh cña TNT trong tÕ bµo thùc vËt lµ sù lo¹i bá nhãm nitro cña hîp chÊt nµy. Nh­ vËy ho¹t tÝnh nitroreductase cña thùc vËt cã thÓ ®­îc xem lµ mét chÊt chØ thÞ hãa sinh lý t­ëng cho thùc vËt vµ cã thÓ sö dông khi lùa chän c¸c lo¹i thùc vËt cã kh¶ n¨ng sö dông ®Ó xö lý n­íc vµ ®Êt nhiÔm TNT. 0,014 0,22 0,27 0,26 0,23 0,17 0,155 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0 5 10 15 20 25 30 35 t, ngày H×nh 4. Sù biÕn ®æi ho¹t tÝnh enzyme nitroreductase trong cñ cña c©y thñy tróc trong trong qu¸ tr×nh khö ®éc cho n­íc nhiÔm TNT - TT1: c©y thñy tróc trong bÓ kh«ng cã TNT (bÓ 1) - TT2 c©y thñy tróc trong bÓ cã TNT nång ®é ban ®Çu lµ 45,2 mg/l(bÓ 2) 0,04 0,08 0,13 0,11 0,1 0,08 0,065 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0 5 10 15 20 25 30 35 t, ngày H×nh 5. Sù biÕn ®æi ho¹t tÝnh enzyme nitroreductase trong th©n cña c©y thñy tróc trong trong qu¸ tr×nh khö ®éc cho n­íc nhiÔm TNT - TT1: c©y thñy tróc trong bÓ kh«ng cã TNT - TT2 c©y thñy tróc trong bÓ cã TNT nång ®é ban ®Çu lµ 45,2 mg/l Ngoµi viÖc kh¶o s¸t sù biÕn ®æi ho¹t tÝnh enzyme nitroreductase cña c©y thñy tróc trong qu¸ tr×nh xö lý n­íc nhiÔm TNT chóng t«i ®· kh¶o s¸t c¶ sù thay ®æi thµnh phÇn hãa häc cña c©y thñy tróc (träng t©m lµ bé phËn cñ) lÊy tõ bÓ ®èi chøng (bÓ 1) vµ tõ bÓ ®· sö dông ®Ó xö lý nguån n­íc nhiÔm TNT (bÓ 2). KÕt qu¶ ph©n tÝch thµnh phÇn ho¸ häc cña cñ c©y thuû tróc ®· sö dông ®Ó lo¹i bá TNT trong n­íc th¶i vµ c©y thuû tróc ®èi chøng b»ng ph­¬ng ph¸p GC/MS mét lÇn n÷a ®· cho thÊy ®· cã mét sè sù biÕn ®æi râ rµng vÒ thµnh phÇn ho¸ häc cña cñ c©y thuû tróc sau khi sö dông ®Ó khö TNT. Trong thµnh phÇn cña mÉu cñ thuû tróc ®èi chøng (lÊy tõ bÓ 1)chØ ph¸t hiÖn ®­îc c¸c hîp chÊt chÝnh lµ: Cyclotrisiloxan, hexamethyl; Isopropyl linoleate; Bis (2- ethylhexyl) phthalate; Squalene. Trong khi ®ã, trong thµnh phÇn mÉu cñ cña c©y thuû tróc ®· sö dông ®Ó xö lý TNT (lÊy tõ bÓ 2) ngoµi c¸c chÊt trªn ®· ph¸t hiÖn thªm mét sè chÊt míi nh­: vitamin E, Cyclotetradecane; Campesterol; Stigmasterol; Gamma- sitosterol. KÕt qu¶ nµy phï hîp víi kÕt qu¶ thö nghiÖm ®· ®­îc dÉn trong tµi liÖu [9]. Nguyªn nh©n sù xuÊt hiÖn thªm nhiÒu chÊt míi trong thµnh phÇn c©y thuû tróc ®· sö dông ®Ó xö lý TNT cã thÓ liªn hÖ víi kÕt qu¶ cña qu¸ tr×nh hÊp thu vµ chuyÓn ho¸ TNT b»ng c©y thuû tróc d­íi t¸c dông cña c¸c qu¸ tr×nh hãa sinh víi sù tham gia cña c¸c enzyme thùc vËt. C¬ chÕ h×nh thµnh c¸c chÊt míi nµy lµ vÊn ®Ò rÊt phøc t¹p nªn ®Ó lµm râ nã ®ßi hái ph¶i cã c¸c nghiªn cøu bæ sung. Tuy nhiªn tõ kÕt qu¶ kh¶o s¸t vÒ mèi liªn hÖ gi÷a ho¹t tÝnh nitroreductase cña thñy tróc vµ sù biÕn ®æi nång ®é TNT trong dung dÞch cã trång thñy tróc ®· cho thÊy ho¹t tÝnh nitroreductase cña c©y cµng cao th× qu¸ tr×nh hÊp thu vµ chuyÓn hãa TNT cña nã ra cµng x¶y ra nhanh h¬n (H×nh 3-5). B»ng kÕt qu¶ ph©n tÝch GC/MS cho thÊy kh«ng x¶y ra hiÖn t­îng tÝch luü c¸c chÊt ®éc h¹i nh­ TNT hoÆc c¸c dÉn xuÊt nitro cña nã trong c©y (®iÒu th­êng x¶y ra víi ®èi t­îng chÊt « nhiÔm lµ kim lo¹i TT2 TT1 TT2 TT1 Hoá học & Kỹ thuật môi trường Đỗ Ngọc Khuê,,Đỗ Bình Minh, “Khảo sát mối quan hệcây thuỷ trúc.” 152 nÆng) mÆc dï ®· sö dông dµi ngµy ®Ó xö lý n­íc nhiÔm TNT. KÕt qu¶ kh¶o s¸t nµy cho phÐp rót ra kÕt luËn lµ ho¹t tÝnh nitroreductase cña thùc vËt cã thÓ ®­îc coi lµ mét trong c¸c th«ng sè hãa sinh c¬ b¶n cã thÓ dùa vµo ®ã ®Ó lùa chän vµ dù b¸o vÒ c¸c loµi thùc vËt tiÒm n¨ng cã thÓ sö dông hiÖu qu¶ ®Ó xö lý nguån n­íc nhiÔm TNT b»ng c«ng nghÖ phytoremediation. 4. KÕt luËn Tõ kÕt qu¶ nghiªn cøu ®· tr×nh bµy ë trªn cã thÓ rót ra 1 sè kÕt luËn sau: 1. Ho¹t tÝnh enzym nitroreductase cã trong c¸c lo¹i thùc vËt cã ¶nh h­ëng lín tíi kh¶ n¨ng khö ®éc TNT nhiÔm trong m«i tr­êng n­íc cña chóng. Ho¹t tÝnh enzyme nµy cµng cao th× c©y cµng cã kh¶ n¨ng tån t¹i vµ ph¸t triÓn l©u dµi trong m«i tr­êng nhiÔm TNT, còng nh­ cµng cã kh¶ n¨ng hÊp thu vµ chuyÓn hãa m¹nh TNT. Ho¹t tÝnh enzyme nitroreductase trong cÊy cãi, c©y Thuû tróc lµ cao h¬n so víi mét sè lo¹i bÌo nh­ bÌo hoa d©u, bÌo c¸i, bÌo lôc b×nh,chÝnh v× vËy thñy tróc vµ cãi cã kh¶ n¨ng tån t¹i vµ ph¸t triÓn trong m«i tr­êng n­íc nhiÔm TNT, còng nh­ hÊp thu vµ chuyÓn hãa TNT m¹nh h¬n so víi c¸c lo¹i bÌo kÓ trªn. 2. Ho¹t tÝnh enzyme nitroreductase cña thñy tróc biÕn ®æi theo quy luËt t¨ng dÇn trong giai ®o¹n ®Çu cña qu¸ tr×nh khö ®éc cho n­íc nhiÔm TNT vµ ®¹t gi¸ trÞ cùc ®¹i sau khi chÊt « nhiÔm trong dung dÞch ®· bÞ hÊp thu vµ chuyÓn hãa hÕt. 3. KÕt qu¶ nghiªn cøu b­íc ®Çu vÒ mèi quan hÖ gi÷a ho¹t tÝnh enzyme nitroreductase víi kh¶ n¨ng khö ®éc cña c©y thñy tróc cho phÐp hy väng vÒ kh¶ n¨ng cã thÓ sö dông nitroreductase còng nh­ mét sè enzyme thùc vËt kh¸c lµm chØ tiªu hãa sinh ®Ó lùa chän, ph©n lo¹i vµ dù b¸o c¸c lo¹i thùc vËt vµ c©y trång míi cã kh¶ n¨ng sö dông hiÖu qu¶ cho môc ®Ých khö ®éc cho m«i tr­êng bÞ nhiÔm c¸c hãa chÊt xenobiotic, trong ®ã cã thuèc næ. C¸c t¸c gi¶ tr©n träng c¸m ¬n sù hç trî cña Quü NAFOSTED vµ ®Ò tµi M· sè 104.07-2011.15 5. TµI LIÖU THAM KH¶O [1]. Konstantinos C. Makris, Kabindra M. Shakya, Rupali Datta, Dibyendu Sarkar, Devanand Pachanoor, “ Chemically catalyzed uptake of 2,4,6-trinitrotoluene by Vetiveria zizanioides,” Environmental Pollution, 148, (2007)101-106. [2]. Elizabeth L Rylott, Astrid Lorenz, Neil C Bruce, “Biodegradation and biotransformation of explosives,” Current opinion in Biotechnology, 22, (2010). 1-7. [3]. Mc Cutcheon ,S.C.,Mediana, V.F., Larson,S.L, “Proof of phytoremediation for explosivesin water and soil. In: Mc Cutcheon, S.C.,Schnoor, J.L (Eds), Phytoremediation: Transformation and Control of contaminants,” Wiley - Interscience, Hoboken, NJ (2003) pp.429-480. [4]. Karen E. Gerhardt, Xiao-Dong Huang, Bernard R. Glick, Bruce M. Greenberg, “Phytoremediation and rhizoremediation of organic soil contaminants: Potential and challenges,” Plant Science 176, (2009), 20–30. [5]. Sridhar Susarla, Victor F. Medina, Steven C. McCutcheon, “Phytoremediation: An ecological solution to organic chemical contamination,” Ecological Engineering, 18, (2002), 647–658. [6]. P.C. Abhilash, Sarah Jamil, Nandita Singh, “Transgenic plants for enhanced biodegradation and phytoremediation of organic xenobiotics,” Biotechnology Advances 27, (2009), 474–488. [7]. Christopher, D. Gwenin, Maher Kalaji, Peter A. Williams, Catherine M. Kay, “A kinetic analysis of three modified novel nitroreductases,” Biodegradation DOI 10.1007/s10532-010-9418-0(2010). Nghiên cứu khoa học công nghệ Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số 34, 12 - 2014 153 [8]. Đỗ Ngọc Khuê, Phạm Kiên Cường, Đỗ Bình Minh, Tô Văn Thiệp (2007), “Nghiên cứu khả năng khử độc cho nước thải bị nhiễm thuốc nổ TNT bằng cây thủy trúc Cyperus alternifolius Linn,” Tạp chí Khoa học và Công nghệ. T.45, 3, (2007)81-87. [9]. Đỗ Ngọc Khuê và cộng sự, “Quy trình và hệ thống xử lý nước thải bị ô nhiễm các chất nổ,”Bằng độc quyền giải pháp hữu ích số 725. Cục Sở hữu trí tuệ Bộ KH-CN. QĐ số 16555/QĐ-SHTT ngày 19/8/2008. [10]. Sridhar Susarla, Victor F. Medina, Steven C. McCutcheon, “Phytoremediation: An ecological solution to organic chemical contamination,”Ecological Engineering 18 , (2002),647–658. [11]. G. Adamia, M. Ghoghoberidze, D. Graves, G. Khatisashvili, G. Kvesitadze, E. Lomidze, D. Ugrekhelidze, G. Zaalishvili, “Absorption, distribution, and transformation of TNT in higher plants,” Ecotoxicology and Environmental Safety 64 (2006), 136–145. [12]. M. Vila, S. Lorber-Pascal, F. Laurent, “Phytotoxicity to and uptake of TNT by rice,” Environ Geochem Health, 30: (2008), 199–203. [13]. El-Hawari, A.M., Hodgson, J.R., Winston, J.M., Sawyer, M.D., Hainje, M., Lee, C.C., 1981, “Species Differences in the Disposition and Metabolism of 2,4,6- Trinitrotoluene as a Function of Route of Administration,” Final Report. Project No. 4274-B, Midwest Research Institute, Kansas City, MO. DAMD17-76-C-6066. ADA114-025. (Cited in EPA 1989, 1990). [14]. Oh, B., Sarath, G., Drijber, R.A., Comfort, S.D., 2000, “Rapid spectrophotometric determination of 2,4,6-trinitrotoluene in a Pseudomonas enzyme assay,” Microbiol. Methods 42 (2), (2000),149–158. ABSTRACT SURVEYING THE RELATIONSHIP BETWEEN THE ACTIVITY OF NITROREDUCTASE ENZYME AND THE DETOXIFYING ABILITY OF CYPERUS ALTERNIFOLIUS LINN IN THE TNT CONTAMINATED WATER This article presents the results in the survey the activity of nitroreductase enzyme in some aquatic plants (Most of them are Cyperus Alternifolius linn) and the relationship between the activity of this enzyme and the detoxifying ability in the TNT contaminated water. The test results showed that these plants have high nitroreductase enzyme activity; This can be a major cause creating absorpting and metabolizing ability of Cyperus Alternifolius that remarkably higher than other aquatic plants like duckweeds. Keywords: Nitroreductase enzyme activity, Cyperus Alternifolius Linn, Detoxify TNT. Nhận bài ngày 23 tháng 6 năm 2014 Hoàn thiện ngày 11 tháng 8 năm 2014 Chấp nhận đăng ngày 05 tháng 12 năm 2014 Địa chỉ: * Viện Công nghệ mới, Viện KH-CNQS, Bộ Quốc phòng ** Viện Công nghệ, Tổng cục CNQP, Bộ Quốc phòng ĐT: 0913560346