Khảo sát độc tính cấp đường uống và tác dụng kháng viêm cấp của cao chiết cồn lá dâm bụt (hibiscus rosa-Sinensis l.) trên chuột nhắt

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 78 KHẢO SÁT ĐỘC TÍNH CẤP ĐƯỜNG UỐNG VÀ TÁC DỤNG KHÁNG VIÊM CẤP CỦA CAO CHIẾT CỒN LÁ DÂM BỤT (HIBISCUS ROSA-SINENSIS L.) TRÊN CHUỘT NHẮT Đỗ Thị Hồng Tươi*, Nguyễn Đặng Kim Quyên*, Hà Thị Hồng Phúc*, Trần Thị Vân Anh* TÓM TẮT Mục tiêu: Khảo sát độc tính cấp đường uống, tác dụng dự phòng và điều trị viêm trên chuột nhắt của cao cồn 96% từ lá Dâm bụt (Hibiscus rosa-sinensis L.). Phương pháp: Thử nghiệm độc tính cấp đường uống của cao chiết lá Dâm bụt trên chuột nhắt Swiss albino, đực và cái, 6-7 tuần tuổi, trọng lượng khoảng 25 g, theo dõi tỉ lệ chết và biểu hiện độc tính trong vòng 72 giờ. Khảo sát tác dụng dự phòng và điều trị viêm của cao với liều uống 100 mg/kg và 200 mg/kg trên chuột nhắt được gây phù bàn chân bằng carrageenan 1%. Kết quả: Cao cồn 96% từ lá Dâm bụt không thể hiện độc tính cấp đường uống trên chuột với liều tối đa có thể cho uống qua kim Dmax là 32 g/kg (tương ứng 94,8 g bột lá Dâm bụt khô/kg). Cao chiết thể hiện tác động dự phòng viêm cấp trên chuột khi cho uống liều 100 mg/kg và 200 mg/kg giúp giảm độ phù bàn chân chuột so với lô chứng bệnh tại các thời điểm khảo sát, liều 200 mg/kg có tác động tốt hơn. Cả hai liều 100 mg/kg và 200 mg/kg thể hiện tác dụng điều trị viêm cấp chậm và yếu hơn thuốc đối chứng diclofenac. Kết luận: Cao chiết Dâm bụt không thể hiện độc tính cấp đường uống trên chuột với liều tối đa Dmax là 32 g/kg (tương ứng 94,8 g bột Dâm bụt khô/kg). Cao chiết thể hiện tác dụng phòng và điều trị viêm cấp trên chuột nhắt với liều 100 mg/kg và 200 mg/kg. Từ khóa: Dâm bụt Hibiscus-rosa sinensis L., độc tính cấp, tác dụng kháng viêm. ABSTRACT STUDY ON ORAL ACUTE TOXICITY AND ANTI-INFLAMMATORY EFFECT OF ETHANOL EXTRACT FROM HIBISCUS ROSA-SINENSIS L. LEAVES IN MICE Do Thi Hong Tuoi, Nguyen Đang Kim Quyen, Ha Thi Hong Phuc, Tran Thi Van Anh * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Vol. 22 - No 5- 2018: 78 – 82 Objectives: This study evaluated the oral acute toxicity and anti-inflammatory effects of ethanol extract from of Hibiscus rosa-sinensis L. leaves. Methods: Oral acute toxicity of H. rosa-sinensis extract was investigated in male and female Swiss albino mice by monitoring mortality and toxicity within 72 hours. Anti-inflammatory effect was determined in 1% carrageenan-induced paw edema mouse model. Results: H. rosa-sinensis L. extracts did not show any acute oral toxicity in mice at maximum dose (Dmax) of 32 g/kg corresponding to 94.8 g plant dry powder/kg. The extract exhibited protective effect against acute inflammation at the oral doses of 100 mg/kg and 200 mg/kg by decreasing hind paw edema in mice compared to pathological control at all tested times. This effect of the dose of 200 mg/kg was better than that of 100 mg/kg one. Both two doses of 100 mg/kg and 200 mg/kg showed a treatment effect against acute inflammation; which was later and weaker than that of reference drug diclofenac. Conclusions: The extract of Hisbicus rosa-sinensis L. did not show oral acute toxicity in mice at the  Khoa Dược - Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: PGS.TS. Đỗ Thị Hồng Tươi ĐT: 0908683080 Email: hongtuoi@ump.edu.vn Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 Nghiên cứu Y học 79 maximum oral dose (Dmax) of 32 g/kg (corresponding to 94.8 g dry plant/kg). This extract exhibited protective and curative effects on inflammation at the oral doses of 100 mg/kg and 200 mg/kg in mice. Keywords: Hibiscus rosa-sinensis L., oral acute toxicity, anti-inflammatory effect. ĐẶT VẤN ĐỀ Dâm bụt (Hibiscus rosa–sinensis L.) là một loài dược liệu được sử dụng phổ biến ở Việt Nam và các nước trên thế giới để hỗ trợ điều trị nhiều bệnh khác nhau như viêm dạ dày, mụn nhọt, lở ngứa, sưng tấy, đái tháo đường(3). Nhiều công trình nghiên cứu về tác dụng dược lý của Dâm bụt cho thấy dịch chiết lá có tiềm năng điều trị các bệnh liên quan đến hội chứng chuyển hóa(6), viêm đại tràng(4) đái tháo đường(9), Với mục đích cung cấp cơ sở khoa học, chứng minh sự an toàn và những công dụng trị liệu của lá Dâm bụt, đề tài tiến hành khảo sát độc tính cấp đường uống, tác dụng dự phòng và điều trị viêm của cao chiết ethanol 96% từ lá Dâm bụt (Hibiscus rosa–sinensis L.) trên mô hình chuột nhắt. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Mẫu thử Cao lá Dâm bụt được chiết bằng phương pháp ngấm kiệt với ethanol 96% (tỷ lệ dược liệu: dung môi là 1 g: 12 ml). Dâm bụt thu hái lá bánh tẻ vào tháng 10/2017 tại Trảng Bom, Đồng Nai. Hiệu suất chiết là 17,6%. Cao thử có độ ẩm là 5,2%. Động vật thử nghiệm Chuột nhắt Swiss albino đực và cái, 6-7 tuần tuổi, khoảng 25 g, cung cấp bởi Viện Vaccin và Sinh phẩm Y tế Nha Trang. Chuột được sử dụng khỏe mạnh, không có biểu hiện bất thường, nuôi ổn định trong môi trường thí nghiệm 5 ngày. Chuột được nuôi trong lồng kích thước 25 x 35 x 15 cm, cung cấp thức ăn và nước uống đầy đủ. Hóa chất Carrageenan 1% (Sigma Aldrich, Mỹ) pha trong dung dịch nước muối sinh lý, dung dịch chống thấm Ornano imbidente (Ugo Basile, Ý) pha 1 ml với 250 mg NaCl trong 500 ml nước cất, thuốc đối chứng diclofenac (viên nén Voltaren, Novartis, Ý). Phương pháp nghiên cứu Thiết kế thực nghiệm, đo lường độc lập. Khảo sát độc tính cấp đường uống trên chuột nhắt trắng(2) Cho chuột (3 đực, 3 cái) nhịn đói ít nhất 12 giờ trước khi tiến hành thử nghiệm. Cao được phân tán trong hỗn dịch tween 80 pha trong nước cất với nồng độ là 10% (tt/tt). Liều tối đa qua kim cho uống khảo sát được là 32 g cao/kg tương ứng với 94,8 g dược liệu khô/kg (nồng độ tối đa qua kim là 1,6 g cao/ml, cho uống với thể tích 20 ml/kg chuột). Tiến hành song song với chuột đối chứng cho uống hỗn dịch tween 80 10% (tt/tt). Theo dõi và ghi nhận cử động tổng quát, biểu hiện về hành vi, trạng thái lông, ăn uống, tiêu tiểu và số lượng chết của chuột trong 72 giờ. Sau 72 giờ, chuột không có dấu hiệu bất thường hoặc chết, tiếp tục theo dõi trong 7 ngày. Chuột chết trong 7 ngày và những chuột sống sót sau 7 ngày được mổ để quan sát đại thể các cơ quan. Chuột chết hay không trong 72 giờ quyết định bước tiếp theo: tiến hành với liều thấp hơn để xác định LD50 hoặc không cần tiếp tục tiến hành thử nghiệm. Khảo sát tác dụng dự phòng viêm(7) Chuột đực được chia vào 6 lô (n = 10) sao cho thể tích bàn chân ban đầu (Vo - đo bằng thiết bị plethysmometer Model 7140, Ugo Basile, Ý) khác biệt không có ý nghĩa (p > 0,05): Lô sinh lý và lô chứng bệnh: uống nước cất; Lô dung môi: uống tween 80 pha trong nước cất nồng độ 1% (tt/tt); Lô đối chứng: uống diclofenac 5 mg/kg; Lô thử 1 và 2: uống cao Dâm bụt 100 và 200 mg/kg. Chuột được cho uống nước cất, dung môi, diclofenac hoặc cao thử mỗi ngày 1 lần vào buổi sáng (thể tích 0,1 ml/10 g) trong 7 ngày. Vào ngày 7, sau khi cho chuột uống 1 giờ, chuột ở các lô (trừ lô sinh lý) được gây viêm bằng cách tiêm dưới da vào gan bàn chân phải sau 0,025 ml carrageenan 1%. Đo thể tích bàn chân sau khi Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 80 cho uống 1, 3, 5, 24, 48, 72, 96 và 120 giờ (Vt). Sau khi đo thể tích bàn chân ở thời điểm 24, 48, 72 và 96 giờ, chuột được tiếp tục cho uống nước cất, dung môi, diclofenac hoặc cao thử (1 lần/ngày). Độ phù X (%) ở các thời điểm được tính theo công thức: X (%) = [(Vt – Vo)/ Vo] x 100, trong đó: Vo và Vt: thể tích chân chuột tại thời điểm trước và sau khi gây viêm (ml). Khảo sát tác dụng điều trị viêm cấp(7) Chuột đực được gây viêm bằng cách tiêm dưới da vào gan bàn chân phải sau 0,025 ml hỗn dịch carrageenan 1%. Đo thể tích chân chuột trước và 3 giờ sau gây viêm bằng thiết bị plethysmometer Model 7140, Ugo Basile, Ý. Các chuột có độ phù từ 50% trở lên được chia vào các lô (n = 10) sao cho không có sự khác biệt có ý nghĩa (p > 0,05) về độ phù giữa các lô: lô chứng bệnh uống nước cất; lô dung môi: uống tween 80 1% (tt/tt); lô đối chứng uống diclofenac 10 mg/kg; lô thử 1 và lô thử 2 lần lượt uống cao Dâm bụt liều 100 và 200 mg/kg. Chuột được cho uống nước cất, dung môi, diclofenac hoặc cao thử 1 lần (sau khi phân lô) với thể tích 10 ml/kg. Đo thể tích chân chuột sau khi cho uống 1, 3 và 5 giờ (Vt), tính mức độ phù bàn chân chuột X (%) ở các thời điểm. Xử lý kết quả và phân tích thống kê Kết quả được trình bày ở dạng giá trị trung bình ± SEM (standard error of mean - sai số chuẩn của số trung bình). Sự khác biệt giữa các lô được phân tích bằng phép kiểm Kruskal-Wallis và Mann-Whitney với phần mềm SPSS 22.0. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05. KẾT QUẢ Độc tính cấp đường uống của cao lá Dâm bụt Sau khi cho chuột uống cao ethanol 96% từ lá Dâm bụt với liều tối đa qua kim là 32 g cao/kg, tất cả chuột đều khỏe mạnh, ăn cám viên, uống nước, tiêu tiểu, cử động bình thường và không có chuột nào chết trong thời gian 72 giờ quan sát tương tự như lô đối chứng cho uống dung môi tween 80 10% (tt/tt). Tiếp tục theo dõi trong 7 ngày, kết quả cho thấy không có chuột chết, chuột không có dấu hiệu bất thường về hành vi, trạng thái lông, ăn uống, tình trạng tiêu tiểu. Như vậy, cao chiết Dâm bụt không thể hiện độc tính cấp đường uống với liều tối đa có thể cho uống qua kim (Dmax) là 32 g cao/kg (tương ứng với 94,8 g bột Dâm bụt khô/kg). Tác động phòng viêm cấp Đề tài chọn liều thử tác động phòng và điều trị viêm của cao chiết lá Dâm bụt là 100 và 200 mg/kg tương ứng 1/320 và 1/160 Dmax. Sự thay đổi độ phù chân chuột theo thời gian giữa các lô chuột được trình bày ở Bảng 1. Bảng 1. Sự thay đổi độ phù chân chuột theo thời gian giữa các lô Lô (n = 10) Độ phù trung bình ± SEM (%) V1h V3h V5h V24h V48h V72h V96h V120h Sinh lý 1,74 ± 1,16 2,65 ± 1,35 4,55 ± 1,52 2,65 ± 1,35 2,65 ± 1,35 2,65 ± 1,35 2,65 ± 1,35 2,65 ± 1,35 Chứng bệnh 81,46 ± 5,85 *** 78,64 ± 5,02 *** 73,43 ± 5,94 *** 68,32 ± 7,25 *** 55,80 ± 6,45 *** 46,00 ± 6,84 *** 31,96 ± 4,93 *** 27,40 ± 4,31 *** Dung môi 96,55 ± 6,55 *** 88,74 ± 4,70 *** 86,82 ± 4,49 *** 78,30 ± 8,80 *** 78,24 ± 10,20 *** 62,95 ± 7,76 *** 47,14 ± 6,09 *** 38,48 ± 5,61 *** Diclofenac 5 mg/kg 59,85 ± 7,82 ***# 42,82 ± 5,58 ***## 40,09 ± 4,38 ***## 40,09 ± 5,50 ***# 29,45 ± 3,83 ***## 23,32 ± 3,61 ***## 15,42 ± 3,47 ***# 9,12 ± 3,05 ***## Cao Dâm bụt 100 mg/kg 73,80 ± 7,42 *** 64,65 ± 6,14 ***#$ 60,50 ± 5,91 ***##$ 58,23 ± 8,13 ***$ 47,32 ± 8,94 *** 38,76 ± 8,62 ***# 29,05 ± 6,24 *** 21,09 ± 5,34 ***# Cao Dâm bụt 200 mg/kg 60,98 ± 6,69 ***## 53,26 ± 6,50 ***## 46,59 ± 6,28 ***## 48,03 ± 4,05 ***## 36,59 ± 6,14 ***## 26,97 ± 4,48 ***## 12,95 ± 2,28 ***@### 10,53 ± 1,78 ***### ***p < 0,001: so với lô sinh lý ở cùng thời điểm; #p < 0,01, ##p < 0,01 và ###p < 0,001: so với lô chứng bệnh (diclofenac) hoặc dung môi (cao thử) ở cùng thời điểm $p < 0,05: so với lô diclofenac ở cùng thời điểm; @p < 0,05: so với lô cao liều 100 mg/kg ở cùng thời điểm Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 Nghiên cứu Y học 81 Chuột được cho uống tween 80 tỷ lệ 1% (tt/tt) trong nước cất có độ phù cao hơn lô chứng bệnh nhưng sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở tất cả các thời điểm khảo sát (p > 0,05). Như vậy, tween 80 1% (tt/tt) sử dụng để pha cao thử không ảnh hưởng đến độ phù và kết quả của lô dung môi được dùng so sánh, đánh giá tác động kháng viêm của cao thử. Lô đối chứng diclofenac liều 5 mg/kg làm giảm độ phù bàn chân chuột so với lô chứng bệnh. Sự khác biệt ý nghĩa thống kê (p < 0,05) bắt đầu từ 1 giờ sau khi gây viêm. Lô cao Dâm bụt liều 100 mg/kg và 200 mg/kg có tác động giảm độ phù bàn chân chuột so với lô chứng bệnh tại các thời điểm khảo sát (p < 0,05), trừ thời điểm sau 1 và 96 giờ cho uống cao liều 100 mg/kg (Bảng 1). Liều 200 mg/kg có tác dụng tốt hơn liều 100 mg/kg măc dù sự khác biệt về độ phù tại các thời điểm giữa 2 lô không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). So với lô đối chứng diclofenac 5 mg/kg, chuột được cho uống cao Dâm bụt liều 200 mg/kg có độ phù khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở các thời điểm khảo sát (p > 0,05). Lô uống liều 100 mg/kg có độ phù cao hơn lô diclofenac có ý nghĩa sau 3, 5 và 24 giờ (p < 0,05); tại các thời điểm còn lại, sự khác biệt giữa 2 lô không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). Tác dụng điều trị viêm cấp Sự thay đổi độ phù chân chuột theo thời gian giữa các lô chuột được trình bày ở Bảng 2. Lô đối chứng diclofenac 10 mg/kg làm giảm độ phù bàn chân chuột rõ rệt so với lô chứng bệnh ở cả 3 thời điểm khảo sát (p < 0,001). Bảng 2. Sự thay đổi độ phù chân chuột theo thời gian của các lô Lô (n = 10) Độ phù trung bình ± SEM (%) V0h V1h V3h V5h Chứng bệnh 65,85 ± 6,19 72,97 ± 5,16 69,95 ± 2,87 58,20 ± 3,56 Dung môi 65,11 ± 3,91 61,89 ± 6,78 64,00 ± 5,48 49,78 ± 4,36 Diclofenac 10 mg/kg 64,92 ± 3,35 39,52 ± 3,37 *** 30,68 ± 2,95 *** 26,86 ± 3,31 *** Cao Dâm bụt 100 mg/kg 64,64 ± 2,91 49,55 ± 3,15 40,49 ± 3,15 **# 30,34 ± 3,27 ** Cao Dâm bụt 200 mg/kg 63,60 ± 2,73 51,19 ± 3,33 # 45,18 ± 4,18 *# 37,16 ± 5,11 **p < 0,01 và ***p < 0,001: so với lô chứng bệnh (diclofenac) hoặc lô dung môi (cao thử) ở cùng thời điểm #p < 0,05: so với lô diclofenac ở cùng thời điểm. Lô cao Dâm bụt liều 100 mg/kg và 200 mg/kg thể hiện tác động điều trị viêm cấp trên mô hình chuột nhắt trắng thông qua làm giảm độ phù ở lô liều 100 mg/kg có ý nghĩa thông kê sau 3 và 5 giờ (p < 0,05) và lô liều 200 mg/kg sau 3 giờ (p < 0,05). Ở các thời điểm còn lại, độ phù của các lô uống cao giảm từ khoảng 12,5% đến 25% nhưng sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). So với diclofenac liều 10 mg/kg, chuột được cho uống cao thử có độ phù cao hơn lô có ý nghĩa thống kê sau 1, 3 giờ (p < 0,05) và không có ý nghĩa sau 5 giờ (p > 0,05). So sánh giữa liều 100 mg/kg và liều 200 mg/kg, cao lá Dâm bụt thể hiện tác động kháng viêm tương đương nhau ở cả 3 thời điểm khảo sát (p < 0,05). Như vậy, cao ethanol 96% từ lá Dâm bụt thể hiện tác động điều trị viêm ở liều 100 mg/kg và 200 mg/kg sau 3 giờ. Tác động này chậm và yếu hơn so với thuốc đối chứng diclofenac 10 mg/kg. BÀN LUẬN Dâm bụt được sử dụng trong dân gian với nhiều công dụng như trị viêm niêm mạc dạ dày, mụn nhọt, lở ngứa, sưng tấy. Lá tươi có thể giã nhỏ trộn với một ít muối đắp lên vết thương mưng mủ sẽ chóng lành(3). Nhằm góp phần giải thích những công dụng dân gian của Dâm bụt trên cơ sở khoa học, nhóm nghiên cứu khảo sát độc tính cấp đường uống và tác dụng kháng viêm của cao chiết lá Dâm bụt (Hibiscus rosa- sinensis L.) trên chuột nhắt. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 82 Cao chiết lá Dâm bụt không thể hiện độc tính cấp với Dmax là 32 g cao/kg tương đương 94,8 g bột dược liệu khô/kg. Kết quả này phù hợp với những nghiên cứu về tính an toàn của cao chiết Dâm bụt trên động vật thí nghiệm(4,5). Tác động kháng viêm của cao ethanol 96% từ lá Dâm bụt cũng phù hợp với báo cáo trước đây của Zubia và cộng sự (2015)(1). Tác dụng này có thể liên quan đến thành phần flavonoid có trong lá Dâm bụt. Theo các báo cáo phân tích về hóa học của Dâm bụt, trong lá chứa nhiều thành phần flavonoid và các nhóm chất khác như tannin, terpenoid, saponin, acid hữu cơ(4,8). Kết quả của đề tài làm tiền đề cho những nghiên cứu về hóa học với định hướng tìm các chất có tác dụng kháng viêm trong lá Dâm bụt. KẾT LUẬN Cao ethanol 96% từ lá Dâm bụt không thể hiện độc tính cấp đường uống với liều tối đa Dmax là 32 g/kg (tương ứng với 94,8 g bột Dâm bụt khô/kg). Cao chiết liều 100 mg/kg và 200 mg/kg thể hiện tác dụng điều trị viêm và dự phòng viêm cấp trên chuột nhắt. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Begum Z, Younus I, Ali SM (2015). “Anti-inflammatory, analgesic and anti-pyretic activities of Hibiscus rosa sinensis Linn and phytochemicals”. World Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences; 4(12): 116 – 123. 2. Bộ Y tế (2015). Hướng dẫn thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng thuốc đông y, thuốc từ dược liệu. Ban hành theo quyết định số 141/QĐ-K2ĐT ngày 27/10/2015, tr. 13-17. 3. Đỗ Huy Bích và các cộng sự (2006). Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam - tập 1. NXB Khoa học và kỹ thuật, tr. 603- 604. 4. Kandhare AD et al. (2012). “Effect of hydroalcoholic extract of Hibiscus rosa sinensis Linn. leaves in experimental colitis rats”. Asian Pac J Trop Biomed; 2(5): 337 – 344. 5. Nath P, Yadav AK (2015). “Acute and sub-acute oral toxicity assessment of the methanolic extract from leaves of Hibiscus rosa- sinensis L. in mice”. Journal of Intercultural Ethnopharmacology; 4(1): pp 70 – 73. 6. Nwibo DD et al (2016). “Effects of Hibiscus rosa-sinensis leaf products on haematological indices, lipid profile and hepatic parameters of hyperlipidemic rat”. African Journal of Pharmacy and Pharmacology; 10(12): 223 – 229. 7. Patel M, Murugananthan G, Gowda KPS (2012). “In vivo animal models in preclinical evaluation of anti-inflammatory activity-A review”. Int. J. Pharm. Res. Allied Sci; 1(2): 1-5. 8. Rauan SZ et al (2013). “Anti-inflammatory effects of Hibiscus rosa sinensis L. and Hibiscus rosa sinensis Var. Alba ethanol extracts”. International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences; 5(4): 754 – 762. 9. Sachdewa A, Nigam R, Khemani LD (2003). “Effect of Hibiscus rosa sinensis Linn. ethanol flower extract on blood glucose and lipid profile in streptozotocin induced diabetes in rats”. Journal of Ethnopharmacology; 89(1): 61 – 66. Ngày nhận bài báo: 25/04/2018 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 20/06/2018 Ngày bài báo được đăng: 20/09/2018