Khảo sát độc tính cấp đường uống và tác động hạ đường huyết trên chuột nhắt của viên nang cứng Insutrix

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 Nghiên cứu Y học 115 KHẢO SÁT ĐỘC TÍNH CẤP ĐƯỜNG UỐNG VÀ TÁC ĐỘNG HẠ ĐƯỜNG HUYẾT TRÊN CHUỘT NHẮT CỦA VIÊN NANG CỨNG INSUTRIX Đỗ Thị Hồng Tươi*, Lộ Nữ Hoàng Thư*, Dương Thị Mộng Ngọc** TÓM TẮT Mục tiêu: Đề tài khảo sát độc tính cấp đường uống và tác động hạ đường huyết trên chuột nhắt của viên nang cứng Insutrix chứa cao mềm chiết từ hỗn hợp các dược liệu lá Mã đề, thân rễ Nghệ và hoa Hòe. Phương pháp: Khảo sát hoạt tính ức chế enzym α-amylase và α-glucosidase in vitro của bột thuốc viên nang cứng Insutrix bằng phương pháp so màu. Các thử nghiệm in vivo trên chuột nhắt Swiss albino, 6-7 tuần tuổi, trọng lượng trung bình khoảng 25 g. Khảo sát độc tính cấp đường uống của cao trên chuột đực và cái, theo dõi tỷ lệ chết và biểu hiện độc tính trong 72 giờ. Tác dụng hạ đường huyết của viên Insutrix được đánh giá trên chuột đực bình thường và chuột gây đái tháo đường bằng cách tiêm tĩnh mạch streptozotocin liều 170 mg/kg được cho uống viên Insutrix liều 250, 500 và 1000 mg/kg mỗi ngày trong 14 ngày; đo nồng độ glucose mỗi 5 ngày trong 15 ngày. Glibenclamid 5 mg/kg sử dụng làm thuốc đối chứng. Kết quả: Bột thuốc viên Insutrix ức chế enzym α-amylase và α-glucosidase in vitro với giá trị IC50 lần lượt là 652,09 µg/ml và 927,8 µg/ml so với 13,66 µg/ml và 429,24 µg/ml của đối chứng dương acarbose. Viên Insutrix không thể hiện độc tính cấp đường uống trên chuột với liều tối đa Dmax 10 g/kg. Trên chuột khỏe mạnh, viên Insutrix không làm hạ đường huyết. Trên mô hình tăng đường huyết, sau 2 tuần điều trị, viên Insutrix cho chuột uống với liều 250, 500 và 1000 mg/kg giảm đường huyết lần lượt 54%, 24% và 51% so với 47% của nhóm glibenclamid. Tác dụng hạ đường huyết thể hiện sớm theo thứ tự liều 250 mg/kg > 500 mg/kg > 1000 mg/kg; trong đó liều 250 mg/kg thể hiện tác dụng tương đương với glibenclamid 5 mg/kg. Kết luận: Viên nang cứng Insutrix không thể hiện độc tính cấp đường uống liều tối đa Dmax 10 g/kg. Chế phẩm thể hiện tác động hạ đường huyết liều cho uống 250, 500 và 1000 mg/kg theo thứ tự sớm như sau: liều 250 mg/kg > 500 mg/kg > 1000 mg/kg. Khả năng ức chế enzym α-amylase và ức chế α-glucosidase có thể là một trong những cơ chế tác động của viên Insutrix. Từ khóa: viên nang cứng Insutrix, α-amylase, α-glucosidase, độc tính cấp, tác dụng hạ đường huyết. ABSTRACT STUDY ON ORAL ACUTE TOXICITY AND HYPOGLYCEMIC EFFECT OF INSUTRIX CAPSULE IN MICE Do Thi Hong Tuoi, Lo Nu Hoang Thu, Duong Thi Mong Ngoc * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Vol. 22 - No 5- 2018: 115 – 122 Objectives: This study aim to evaluate oral acute toxicity and hypoglycemic effect of Insutrix capsule from extract of mixture of Plantago asiatica L., Curcuma longa L. and Sophora japonica L. Methods: For in vitro study, inhibitory activity on α-amylase and α-glucosidase was performed by spectrophotometrical methods. In vivo experiments were carried out in Swiss albino mice, 6-7 week aged; weighing 25 g. The oral acute toxicity in male and female mice was studied on the death rate within 72 hours after being dosed. Hypoglycemic effect of Insutrix capsule was evaluated in normal mice and hyperglycemic mice induced by iv streptozotocine at 170 mg/kg. Mice were orally given Insutrix capsule every day at the doses of 250,  Khoa Dược - Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh ** Trung tâm Sâm và Dược liệu TP. Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: PGS.TS. Đỗ Thị Hồng Tươi ĐT: 0908683080 Email: [email protected] Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 116 500 and 1000 mg/kg for 14 days. Blood glucose was determined every 5 days for 15 days. Glibenclamide 5 mg/kg was used as a drug reference Results: Insutrix capsule could inhibit in vitro activity of α-amylase and α-glucosidase with IC50 values of 652.09 µg/ml và 927.8 µg/ml compared to those of 13.66 µg/ml and 429.24 µg/ml of acarbose postitive control. This product had no oral acute toxicity in Swiss albino mice at the maximum dose of 10 g/kg body weight. Insutrix capsule did not exhibe hypoglycemic effect in normal mice. In streptozotocin-induced hyperglycemic model, after 2 weeks treatment, glucose levels of mice treated with Insutrix capsule at 250 mg/kg, 500 mg/kg and 1000 mg/kg were decreased 54%, 24% and 51%, respectively, compared to 47% of 5 mg/kg glibenclamide group. The hypoglycemic effect early expressed in the order: 250 mg/kg > 500 mg/kg > 1000 mg/kg; in which that of the dose at 250 mg/kg was similar to that of 5 mg/kg glibenclamide. Conclusions: Insutrix capsule did not show oral acute toxicity in mice at the maximum oral dose (Dmax) of 10 g/kg. This product exhibed hypoglycemic effect at the oral doses of 250, 500 and 1000 mg/kg in the early order: 250 mg/kg > 500 mg/kg > 1000 mg/kg. Its inhibitory activity on α-amylase and α-glucosidase could be one of mechanisms of hypoglycemic effect. Keywords: Insutrix capsule, α-amylase, α-glucosidase, acute toxicity, hypoglycemic effect. ĐẶT VẤN ĐỀ Đái tháo đường là một trong những rối loạn chuyển hóa có thể gây biến chứng nghiêm trọng và tỷ lệ bệnh nhân ngày càng tăng(15). Hiện nay, bên cạnh thuốc tổng hợp, xu hướng điều trị đái tháo đường là sử dụng các thuốc từ dược liệu giúp kiểm soát đường huyết, hạn chế tác dụng phụ khi dùng trong thời gian dài. Ở Việt Nam, một số dược liệu được báo cáo tác dụng hạ đường huyết như Mướp đắng, Cam thảo, Giảo cổ lam, Chè đắng, Hoàng kỳ... Mã đề (Plantago asiatica L.) thường dùng trị bí đái, đái ra máu, ho lâu ngày, viêm khí quản, đau mắt đỏ(13). Ở Giava, toàn cây Mã đề được dùng sắc uống trị đái tháo đường(4). Nghệ (Curcuma longa L.) đã được dân gian sử dụng điều trị bệnh đái tháo đường, trong đó hoạt chất curcumin đã được báo cáo về tác dụng làm giảm đường huyết, bảo vệ tế bào tụy và tăng độ nhạy cảm với insulin(2,11). Ngoài ra, flavonoid có nhiều trong thân rễ Nghệ và Hòe hoa (Sophora japonica L.) thể hiện tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ các cơ quan khỏi tổn thương do tình trạng đường huyết cao gây ra. Từ những cơ sở trên, ThS. Dương Thị Mộng Ngọc đã nghiên cứu bào chế viên nang cứng Insutrix chứa cao mềm được chiết từ hỗn hợp các dược liệu lá Mã đề, thân rễ Nghệ và hoa Hòe với định hướng ứng dụng trong điều trị bệnh đái tháo đường. Vì vậy, đề tài thực hiện khảo sát độc tính cấp đường uống và tác động hạ đường huyết trên chuột nhắt của viên nang cứng Insutrix nhằm cung cấp cơ sở khoa học về tính an toàn và tác động hạ đường huyết của chế phẩm này. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Mẫu thử Viên nang cứng Insutrix sản xuất ngày 02/8/2017 đạt tiêu chuẩn cơ sở. Viên chứa 25% khối lượng cao mềm chiết từ hỗn hợp dược liệu lá Mã đề, thân rễ Nghệ và hoa Hòe, đóng gói trong chai nhựa nút kín do ThS. Dương Thị Mộng Ngọc cung cấp. Viên chứa bột thuốc màu nâu đen, mùi thơm đặc trưng. Động vật thử nghiệm Chuột nhắt Swiss albino đực, 5 - 6 tuần tuổi, trung bình khoảng 25 g do Viện Vaccin và Sinh phẩm Y tế Nha Trang cung cấp. Chuột khoẻ mạnh, không có biểu hiện bất thường, được nuôi ổn định 5 ngày, nuôi trong lồng nhựa 25 x 35 x 15 cm (6 chuột/lồng) và cung cấp thức ăn, nước uống đầy đủ trong thời gian thử nghiệm. Hóa chất Streptozotocin, α-amylase, α-glucosidase, p-nitrophenyl-α-D-glucopyranosid (pNPG) (Sigma-Aldrich, Hoa Kỳ); acarbose (CKD Bio, Hàn Quốc), ethylen diamin tetra-acetic Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 Nghiên cứu Y học 117 (EDTA) (Merck, Đức), kit định lượng glucose (Clinitech, Pháp), glibenclamid (Stada, Việt Nam), tinh bột, Na2CO3, cồn 96%, ether ethylic (Guangdong Guanghua, Trung Quốc), NaCl 0,9% (OPV, Việt Nam). Phương pháp nghiên cứu Thiết kế thực nghiệm, đo lường độc lập. Khảo sát hoạt tính ức chế enzym α-amylase in vitro Amylase xúc tác phản ứng thủy giải tinh bột thành đường đơn, đường đôi hay dextrin phân tử lớn. Lượng maltose được giải phóng ra được xác định bằng phương pháp tạo màu với hỗn hợp thuốc thử. Hoạt tính ức chế α-amylase được khảo sát dựa vào phương pháp đo màu(6). Hỗn hợp phản ứng gồm 1 ml tinh bột 1% (kl/tt), 1 ml α-amylase (1,5 đơn vị/ml) pha trong đệm acetat 0,1 M (pH 7,2), 1 ml dung dịch mẫu thử (bột thuốc viên nang cứng Insutrix/đối chứng acarbose), 2 ml đệm acetat. Ủ hỗn hợp 25 phút ở 37°C. Thêm 1 ml HCl 1N, trộn đều để kết thúc phản ứng. Thêm 0,1 ml iod 1%. Đo OD ở 565 nm. Mẫu chuẩn (có α-amylase, không có mẫu thử) được tiến hành song song. Lặp lại thí nghiệm 3 lần, lấy giá trị trung bình và xác định hoạt tính ức chế enzym α-amylase: % ức chế = (ODmẫu thử - ODmẫu chuẩn)/ ODmẫu chuẩn x 100. Xác định IC50 (nồng độ ức chế 50% hoạt tính α-amylase) dựa vào phương trình hồi quy giữa % ức chế và nồng độ mẫu thử. Khảo sát tác dụng ức chế enzym α-glucosidase in vitro(12) Hỗn hợp phản ứng gồm 40 µl α-glucosidase (0,2 đơn vị/ml), 50 µl mẫu thử hoặc acarbose hoặc đệm phosphat pH 6,8 (so màu mẫu thử). Ủ 20 phút ở nhiệt độ phòng, thêm 40 µl pNPG 1 mM trong đệm phosphat pH 6,8. Trộn đều, ủ 20 phút ở nhiệt độ phòng. Kết thúc phản ứng bằng cách thêm 130 µl Na2CO3 0,2 M (pH 9,7), trộn đều. Đo OD ở 405 nm. Mẫu chuẩn (không có mẫu thử) được tiến hành song song. Hoạt tính ức chế α-glucosidase tính theo công thức: % ức chế = [(ODmẫu chuẩn-ODso màu mẫu chuẩn) - (ODmẫu thử- ODso màu mẫu thử)] / (ODmẫu chuẩn-ODso màu mẫu chuẩn) x 100. Xác định giá trị IC50 (nồng độ của mẫu thử ức chế 50% hoạt tính α-glucosidase) dựa vào phương trình hồi quy giữa % ức chế và nồng độ mẫu thử. Khảo sát độc tính cấp đường uống 6 chuột (50% đực, 50% cái) nhịn đói ít nhất 12 giờ, được cho uống viên nang Insutrix liều duy nhất tối đa có thể qua kim (thể tích 0,2 ml/10g) theo “Hướng dẫn thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng thuốc đông y, thuốc từ dược liệu” của Bộ Y tế (3). Theo dõi và ghi nhận cử động tổng quát, biểu hiện về hành vi, trạng thái lông, ăn uống, tiêu tiểu và số lượng chết của chuột trong 72 giờ. Nếu sau 72 giờ, chuột không có dấu hiệu bất thường hoặc chết, tiếp tục theo dõi trong vòng 7 ngày. Nếu có chuột chết, giảm liều, tìm liều tối thiểu gây chết 100% chuột (LD100), liều tối đa không gây chết chuột nào (LD0) và liều gây chết 50% chuột (LD50). Khảo sát tác động lên trọng lượng và đường huyết trên chuột nhắt trắng bình thường Chuột bình thường khỏe mạnh được chia ngẫu nhiên thành 4 lô: lô sinh lý: cho chuột uống nước cất, 3 lô thử cho uống viên nang Insutrix với liều 250 mg/kg, 500 mg/kg hoặc 1000 mg/kg, 1 lần/ngày vào buổi sáng trong 14 ngày. Đường huyết của chuột được đo mỗi 5 ngày. Lấy máu tĩnh mạch đuôi chuột vào buổi sáng sau khi cho chuột nhịn đói qua đêm. Khảo sát tác động lên trọng lượng và đường huyết trên chuột nhắt trắng gây đái tháo đường bằng streptozotocin(8) Chuột cho nhịn đói ít nhất 12 giờ, gây tăng đường huyết bằng cách tiêm tĩnh mạch streptozotocin (pha trong NaCl 0,9%) liều 170 mg/kg. Sau 5 ngày tiêm streptozotocin, định lượng glucose máu (cho chuột nhịn đói ít nhất 12 giờ). Những chuột có đường huyết đói ≥ 200 mg/dl được xem là chuột đái tháo đường, điều trị bằng glibenclamid 5 mg/kg (đối chứng dương) hoặc viên Insutrix liều 250 mg/kg, 500 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 118 mg/kg và 1000 mg/kg, cho uống 1 lần/ngày vào buổi sáng (8 - 10 giờ) trong 14 ngày. Theo dõi đường huyết của chuột thử nghiệm mỗi 5 ngày theo nguyên tắc enzym màu bằng kit định lượng glucose (Clinitech, Pháp). Nồng độ glucose được tính theo công thức: Nồng độ glucose (mg/dl) = [(Athử - Atrắng)/(Achuẩn - Atrắng)] x Cchuẩn x độ pha loãng. Xử lý kết quả và phân tích thống kê Kết quả trình bày dạng trung bình ± sai số chuẩn của giá trị trung bình (Mean ± SEM). Số liệu phân tích thống kê bằng phép kiểm Kruskal-Wallis và Mann-Whitney với phần mềm SPSS 22.0. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05. KẾT QUẢ Hoạt tính ức chế enzym α-amylase in vitro Khảo sát sơ bộ cho thấy hoạt tính ức chế α- amylase in vitro của bột thuốc viên nang Insutrix ở 1000 µg/ml khoảng 55%. Kết quả thấy bột thuốc viên Insutrix thể hiện hoạt tính ức chế enzym α-amylase với giá trị IC50 là 652,09 µg/ml cao hơn 49,6 lần so với IC50 của mẫu đối chứng acarbose là 13,15 µg/ml (Bảng 1) tương tự như giá trị IC50 của acarbose là 12,48 µg/ml trong báo cáo trước đây của nhóm nghiên cứu(7). Hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase in vitro Từ kết quả thu được, xác định giá trị IC50 của bột thuốc viên nang Insutrix và đối chứng dương acarbose lần lượt là 927,8 µg/ml và 434,0 µg/ml (Bảng 2). Bảng 1. Hoạt tính ức chế enzym α-amylase in vitro theo nồng độ Chất đối chiếu acarbose Bột thuốc viên nang cứng Insutrix Nồng độ (µg/ml) % ức chế (Mean ± SD) Nồng độ (µg/ml) % ức chế (Mean ± SD) 2,5 22,84 ± 4,02 125 14,76 ± 9,81 5 29,71 ± 3,72 250 30,96 ± 7,24 10 41,06 ± 1,60 500 50,27 ± 4,88 15 56,65 ± 0,26 1000 54,81 ± 7,94 20 62,36 ± 1,63 1500 64,75 ± 1,96 25 78,32 ± 1,98 2000 77,15 ± 4,01 30 83,59 ± 2,92 3000 80,79 ± 0,50 Phương trình: y = 0,0013x 2 + 0,2945x - 4,8268 R 2 = 0,9905 IC50 = 13,15 µg/ml Phương trình: y = 0,8011x 2 - 38,248x + 561,74 R 2 = 0,9553 IC50 = 652,09 µg/ml Bảng 2. Hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase in vitro của mẫu thử và đối chứng acarbose Acarbose Bột thuốc viên nang cứng Insutrix Nồng độ (µg/ml) Hoạt tính ức chế (%) Nồng độ (µg/ml) Hoạt tính ức chế (%) 1000 75,87 ± 2,18 2000 76,75 ± 4,22 500 55,34 ± 2,49 1500 60,93 ± 2,66 250 36,93 ± 4,22 1000 50,95 ± 2,92 125 23,62 ± 2,15 500 41,42 ± 1,68 62,5 20,10 ± 2,98 250 24,57 ± 1,99 31,25 7,68 ± 2,70 125 12,97 ± 4,97 31,25 7,82 ± 5,62 Phương trình: y = 0,1792x 2 + 0,7993x + 25,964 R 2 = 0,9986 IC50 = 434,0 µg/ml Phương trình: y = 0,3137x 2 + 3,0199x - 7,4405 R 2 = 0,983 IC50 = 927,8 µg/ml Độc tính cấp đường uống của viên nang Insutrix Khảo sát trên 6 chuột với liều tối đa có thể bơm được qua kim là 10 g/kg. Sau khi cho chuột uống, tất cả chuột khỏe mạnh, ăn cám viên, uống nước, tiêu tiểu, cử động bình thường, không có dấu hiệu bất thường nào và không có chuột nào chết trong 72 giờ cũng như trong 7 ngày quan sát. Như vậy, viên nang Insutrix không xác định được giá trị LD50, không thể hiện độc tính cấp đường uống với liều tối đa có thể cho uống (Dmax) là 10 g/kg trọng lượng chuột. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 Nghiên cứu Y học 119 Tác động lên trọng lượng và đường huyết của chuột bình thường Kết quả cho thấy sự thay đổi đường huyết trên chuột bình thường cho uống viên Insutrix liều 250 mg/kg, 500 mg/kg hoặc 1000 mg/kg so với lô sinh lý không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). Như vậy, việc uống viên Insutrix không ảnh hưởng đường huyết của chuột bình thường (Bảng 3 và Bảng 4). Tác động lên trọng lượng và đường huyết của chuột bị đái tháo đường Các lô tiêm streptozotocin có khối lượng cơ thể giảm khoảng 5,5 g - 16 g so với chuột sinh lý tại thời điểm N0 và các thời điểm khảo sát trong 14 ngày tiếp theo (p < 0,05). Kết quả chứng tỏ streptozotocin gây độc tế bào tụy dẫn đến tình trạng tăng đường huyết và giảm trọng lượng cơ thể chuột vào ngày N0 và tiếp tục tiến triển trong thời gian thử nghiệm. Lô chứng bệnh trọng lượng giảm dần theo thời gian (khoảng 3,5 - 4 g vào 5 ngày cuối so với thời điểm N0), trong khi ở 4 lô điều trị (3 lô cho uống viên Insutrix và lô glibenclamid) cho thấy trọng lượng cơ thể ổn định và tăng nhẹ. Tuy nhiên, so với lô chứng bệnh, trọng lượng không khác biệt ở các thời điểm khảo sát (p > 0,05), trừ lô uống Insutrix liều 500 g/kg vào các ngày 10, 11, 13 và Insutrix liều 250 g/kg ngày 10 có trọng lượng cơ thể cao hơn lô chứng bệnh (p < 0,05; Bảng 5). Điều đó chứng tỏ việc uống viên Insutrix có thể giúp duy trì thể trạng của chuột. Tại thời điểm ban đầu, chuột được tiêm streptozotocin có đường huyết tăng cao hơn, gấp 2,7 lần so với chuột sinh lý (p < 0,01). Những chuột có đường huyết lớn hơn 200 mg/dL được phân chia vào 5 lô (chứng bệnh, glibenclamid và 3 lô uống Insutrix) sao cho đường huyết trung bình giữa 5 lô này khác nhau không có ý nghĩa (p > 0,05, Bảng 6). Sau 5 ngày điều trị, kết quả cho thấy chỉ có lô đối chứng glibenclamid 5 mg/kg và lô cho uống viên nang Insutrix liều 250 mg/kg làm giảm đường huyết lần lượt khoảng 24% và 38% so với thời điểm trước khi điều trị và thấp hơn có ý nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh ở cùng thời điểm (p < 0,05). Đối với 2 lô uống viên nang Insutrix liều 1000 mg/kg và 500 mg/kg, đường huyết của chuột đều giảm khoảng 30 mg/dL so với thời điểm trước điều trị nhưng không khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh ở cùng thời điểm khảo sát (p > 0,05). Vào ngày 10, đường huyết của chuột ở lô điều trị bằng glibenclamid 5 mg/kg, viên nang Insutrix liều 500 mg/kg và 250 mg/kg giảm lần lượt khoảng 31%, 29% và 40% so với thời điểm trước điều trị và thấp có ý nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh (p < 0,05), trong khi lô cho uống viên Insutrix liều 1000 mg/kg có đường huyết tương đương với thời điểm trước điều trị và tương đương với lô chứng bệnh khảo sát tại cùng thời điểm (p > 0,05). Sau 15 ngày điều trị, các lô điều trị bằng glibenclamid 5 mg/kg, Insutrix liều 1000 mg/kg, 500 mg/kg và 250 mg/kg giảm lần lượt 47%, 51%, 24% và 54% so với thời điểm trước điều trị và thấp có ý nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh tại cùng thời điểm (p < 0,05). So sánh giữa 3 lô cho uống viên nang Insutrix liều 1000 mg/kg, 500 mg/kg và 250 mg/kg, đường huyết ở lô uống liều 1000 mg/kg cao hơn có hơn có nghĩa thống kê so với 2 liều còn sau 5 ngày và 10 ngày (p > 0,05); khác biệt không có ý nghĩa so với 2 liều còn lại sau 15 ngày điều trị (p > 0,05). Giữa 2 liều 500 mg/kg và 250 mg/kg, đường huyết của chuột thử nghiệm khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở cả 3 thời điểm khảo sát sau khi điều trị (p > 0,05). So với glibenclamid 5 mg/kg, tác động hạ đường huyết ở lô Insutrix 250 mg/kg khác biệt không có ý nghĩa sau 5, 10 và 15 ngày điều trị (p < 0,05). Lô Insutrix 500 mg/kg có đường huyết không khác biệt sau 5 và 10 ngày điều trị (p > 0,05), đường huyết cao hơn có ý nghĩa sau 15 ngày điều trị (p < 0,05). Insutrix liều 1000 mg/kg thể hiện tác động hạ đường huyết tương đương glibenclamid sau 15 ngày (p > 0,05) nhưng kém Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 120 hơn sau 5 và 10 ngày (p < 0,05). Như vậy, viên Insutrix ở ba liều khảo sát thể hiện tác động hạ đường huyết chậm hơn đối chứng glibenclamid 5 mg/kg. Tác động này xuất hiện sớm theo thứ tự: 250 mg/kg > 500 mg/kg > 1000 mg/kg; trong đó liều 250 mg/kg thể hiện tác động tương đương glibenclamid 5 mg/kg. Bảng 3. Trọng lượng trung bình của các lô chuột bình thường trong 15 ngày (N: ngày) Lô (n=8) N0 N1 N2 N3 N4 N5 N6 N7 N8 N9 N10 N11 N12 N13 N14 Sinh lý 26,0 ± 0,7 28,4 ± 0,8 29,7 ± 1,1 27,5 ± 1,2 29,9 ± 1,4 29,5 ± 1,5 29,0± 1,4 30,7 ± 1,3 31,1 ± 1,6 30,4 ± 1,3 30,1 ± 1,4 30,7 ± 1,3 31,3 ± 1,3 32,1 ± 1,2 32,8± 1,3 Insutrix 1000 mg/kg 24,4 ± 0,5 27,4 ± 0,6 28,5 ± 0,7 29,3 ± 0,7 28,1 ± 0,7 29,0 ± 0,8 29,4± 0,8 30,1 ± 0,8 30,2 ± 0,7 30,1 ± 0,9 28,6 ± 0,9 30,2 ± 0,8 30,5 ± 0,9 31,0 ± 0,9 32,0± 0,8 Insutrix 500 mg/kg 26,1 ± 0,7 28,7 ± 1,0 30,8 ± 1,0 31,3 ± 1,0 30,7 ± 1,0 30,8 ± 1,1 30,8 ± 1,2 31,3 ± 1,1 31,7 ± 1,1 31,2 ± 1,1 29,2 ± 1,0 31,3 ± 1,3 31,4 ± 1,3 32,4 ± 1,5 30,3± 1,5 Insutrix 250 mg/kg 27,0 ± 0,6 29,6 ± 0,7 31,3 ± 0,8 31,6 ± 0,8 30,4 ± 0,9 30,9 ± 1,2 31,3± 1,2 32,2 ± 1,1 31,9 ± 1,3 32,1 ± 1,6 30,8 ± 1,7 32,1 ± 1,9 31,9 ± 2,0 32,5 ± 2,1 31,7± 1,9 Bảng 4. Nồng độ glucose huyết của chuột bình thường ở các lô Lô (n = 8) Đường huyết trung bình ± SEM (mg/dL) Ngày 0 Ngày 5 Ngày 10 Ngày 15 Sinh lý 78,18 ± 4,29 84,75 ± 4,22 83,40 ± 5,05 84,52 ± 5,15 Insutrix 1000 mg/kg 69,65 ± 7,56 85,22 ± 5,49 85,62 ± 5,76 80,93 ± 3,49 Insutrix 500 mg/kg 80,95 ± 6,64 81,36 ± 5,85 84,78 ± 4,76 99,22 ± 6,74 Insutrix 250 mg/kg 73,38 ± 4,63 68,84 ± 4,40 83,94 ± 7,21 81,28 ± 3,92 Bảng 5. Trọng lượng trung bình của các lô chuột đái tháo đường trong 15 ngày (N: ngày) Lô (n=6) N0 N1 N2 N3 N4 N5 N6 N7 N8 N9 N10 N11 N12 N13 N14 Sinh lý 38,3 ± 1,0 39,2 ± 1,0 39,4 ± 0,8 41,3 ± 0,9 40,6 ± 0,7 41,5 ± 0,9 41,9 ± 1,0 42,4 ± 1,0 41,9 ± 0,6 42,6 ± 0,9 43,1 ± 1,2 42,1 ± 0,9 44,4 ± 1,4 44,5 ± 1,6 43,3± 1,4 Chứng bệnh 32,7 ± 1,4* 32,7± 1,7* 32,3 ± 2,0* 32,7 ± 2,1* 32,5 ± 2,1* 31,3 ± 2,2* 30,7 ± 1,8* 30,5 ± 1,6* 30,3 ± 1,3* 29,5 ± 1,2* 29,1 ± 1,1* 28,7 ± 1,3* 29,5 ± 1,2* 28,7 ± 1,3* 29,0 ± 1,5* Glibenclami d 5mg/kg 29,9± 1,9* 29,6± 1,8* 28,9 ± 2,0* 29,6 ± 1,8* 29,6 ± 1,7* 28,3 ± 1,5* 28,9 ± 1,7* 28,9 ± 1,7* 29,3 ± 1,8* 29,3 ± 1,9* 28,3 ± 1,8* 28,1 ± 2,0* 28,8 ± 2,1* 29,0 ± 2,1* 28,9± 2,1* Insutrix 1000 mg/kg 32,3± 1,3* 31,9 ± 1,3* 31,0 ± 1,1* 31,0 ± 1,1* 30,2 ± 1,1* 29,1 ± 1,2* 29,4 ± 1,1* 29,5 ± 1,2* 30,1 ± 1,1* 28,9 ± 0,8* 29,7 ± 1,5* 29,2 ± 1,2* 29,8 ± 1,3* 29,1 ± 1,1* 29,4± 1,4* Insutrix 500 mg/kg 32,6± 1,8* 32,9 ± 1,6* 34,1 ± 1,6* 34,9 ± 1,6* 32,9 ± 1,7* 33,2 ± 1,7* 34,5 ± 1,7* 35,1 ± 1,7* 33,4 ± 1,6* 33,1 ± 1,8* 34,3 ± 1,7* # 33,6 ± 1,5* # 31,5 ± 1,2* 33,8± 1,6* # 33,2± 2,0* Insutrix 250 mg/kg 31,6± 0,9* 31,5 ± 0,9* 32,8 ± 0,9* 33,5 ± 0,9* 31,4 ± 1,2* 30,7 ± 0,9* 33,3 ± 1,0* 33,2 ± 0,9* 30,5 ± 1,6* 31,5 ± 0,9* 32,2± 1,0* # 31,1 ± 1,2* 33,0 ± 0,8* 31,8 ± 1,0* 31,9± 1,0* * p < 0,05 so với lô sinh lý và # p < 0,05 so với lô chứng bệnh ở cùng thời điểm khảo sát. Bảng 6. Đường huyết của chuột bị đái tháo đường ở các lô vào ngày 0, 5, 10, 15 Lô (n = 6) Đường huyết trung bình ± SEM (ml/dL) Ngày 0 Ngày 5 Ngày 10 Ngày 15 Sinh lý 102,28 ± 5,11 67,07 ± 2,35 62,56 ± 5,76 77,28 ± 2,23 Chứng bệnh 276,27 ± 10,30 ** 271,03 ± 17,23 ** 316,87 ± 27,81 ** 295,77 ± 30,27 ** Glibenclamid 5 mg/kg 264,15 ± 13,52 ** 201,33 ± 13,71 **# 181,38 ± 18,11 **## 139,28 ± 8,73 **## Insutrix 1000 mg/kg 282,37 ± 22,70 ** 254,27 ± 12,17 **$ 287,59 ± 29,87 **$ 138,28 ± 15,34 # Insutrix 500 mg/kg 254,65 ± 20,48 ** 219,91 ± 21,82 ** 181,08 ± 22,84 **# 193,56 ± 16,43 **#$ Insutrix 250 mg/kg 270,16 ± 16,46 ** 166,60 ± 18,80 **## 160,94 ± 20,15 **## 125,33 ± 30,04 # ** p < 0,01: so với lô sinh lý; # p < 0,05; ## p < 0,01: so với lô chứng bệnh và $ p < 0,05: so với lô glibenclamid ở cùng thời điểm khảo sát Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 Nghiên cứu Y học 121 BÀN LUẬN Bên cạnh việc sử dụng từng dược liệu riêng lẻ trong điều trị bệnh đái tháo đường, một số chế phẩm ở Trung Quốc, Ấn Độ và Việt Nam thường kết hợp nhiều dược liệu để tăng hiệu quả kiểm soát bệnh này. Viên nang cứng được bào chế từ cao mềm chiết từ hỗn hợp lá Mã đề, thân rễ Nghệ và hoa Hòe phù hợp với định hướng chung của Việt Nam và thế giới. Một trong những cơ chế điều trị đái tháo đường là làm giảm tiêu hóa và hấp thu carbohydrat ở ruột non qua cơ chế ức chế α-amyase và α- glucosidase, hai enzym tham gia phân giải và thủy phân các phân tử carbohydrat thành đường đơn hấp thu vào máu. Kết quả về tác dụng ức chế α-amyase và α-glucosidase của bột thuốc viên Insutrix thu được trong đề tài phù hợp với các báo cáo trước đây về tác dụng ức chế hai enzym này của rutin, quercetin có trong hoa Hòe và curcumin, demethoxycurcumin, bisdemethoxycurcumin phân lập từ củ Nghệ(5,10). Với kết quả viên Insutrix không thể hiện độc tính cấp ở Dmax là 10 g/kg, đề tài chọn liều 250, 500 và 1000 mg/kg để khảo sát tác động hạ đường huyết in vivo. Các liều này tương ứng với 1/40, 1/20 và 1/10 Dmax, phù hợp với khuyến cáo về liều thử tác dụng dược lý của Bộ Y tế(3). Ở ba liều khảo sát, viên Insutrix không ảnh hưởng lên thể trọng và đường huyết của chuột bình thường; bước đầu chứng tỏ tính an toàn của chế phẩm. Trên mô hình chuột đái tháo đường gây bởi streptozotocin, viên Insutrix thể hiện tác động hạ đường huyết sớm theo thứ tự: 250 mg/kg > 500 mg/kg > 1000 mg/kg; trong đó liều 250 mg/kg thể hiện tác động tương đương thuốc đối chứng glibenclamid 5 mg/kg. Tác động này của viên Insutrix phù hợp với báo cáo về khả năng hạ đường huyết của cao cồn từ lá Mã đề liều 1000 mg/kg trên chuột cống bị đái tháo đường được báo cáo bởi nhóm nghiên cứu Malaysia(1). Tác động hạ đường huyết của viên Insutrix có thể giải thích nhờ kết hợp cơ chế bảo vệ tế bào tụy và tăng độ nhạy cảm với insulin của củ Nghệ(2,11) với cơ chế ức chế các cytokin viêm (IL-6, TNF-α), giảm tình trạng stress oxy hóa, rối loạn lipid huyết cũng như bảo vệ tế bào beta tụy, làm tăng giải phóng insulin của hoa Hòe(9). Flavonoid trong hoa Hòe cũng được báo cáo tác dụng bảo vệ tế bào beta tụy, tế bào thận tránh khỏi những tổn thương gây ra bởi streptozotocin của hoa Hòe(14). Liều 250 mg/kg thể hiện tác động hạ đường huyết có ý nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh ở cùng thời điểm khảo sát sớm hơn liều 500 mg/kg và 1000 mg/kg có thể giải thích khi tăng liều, thành phần không thể hiện tác động hạ đường huyết lớn sẽ ảnh hưởng nhiều hơn đến tác động mong muốn. Từ đó gợi ý việc chọn liều phù hợp để tính toán liều dự kiến ở người. Kết quả của đề tài cung cấp cơ sở khoa học về tính an toàn và tác động hạ đường huyết của viên nang cứng Insutrix, là tiền đề để ứng dụng chế phẩm này trong phòng và/hoặc điều trị đái tháo đường trên lâm sàng. KẾT LUẬN Viên nang cứng Insutrix thể hiện tác động ức chế α-amylase và α-glucosidase in vitro với IC50 lần lượt là 652,09 µg/ml và 927,8 µg/ml so với IC50 của acarbose lần lượt là 13,66 µg/ml và 429,24 µg/ml. Viên Insutrix không thể hiện độc tính cấp đường uống với liều Dmax là 10 g/kg. Chế phẩm thể hiện tác động hạ đường huyết ở liều 250 mg/kg, 500 mg/kg và 1000 mg/kg sau 2 tuần điều trị; tác động này nhanh theo thứ tự 250 mg/kg > 500 mg/kg > 1000 mg/kg; trong đó liều 250 mg/kg thể hiện tác động hạ đường huyết tương đương glibenclamid 5 mg/kg. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Abdulghani MA et al (2014). “Potential antidiabetic activity of Plantago major leaves extract in Streptozocin-induced diabetic rats”. Research Journal of Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences; 5(2): 896-902. 2. Arun N, Nalini N (2002). “Efficacy of turmeric on blood sugar and polyol pathway in diabetic albino rats”. Plant Foods Hum. Nutr.; 57(1): 41-52. 3. Bộ Y tế (2015). Hướng dẫn thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng thuốc đông y, thuốc từ dược liệu. Ban hành theo quyết định số 141/QĐ-K2ĐT ngày 27 tháng 10 năm 2015 của Bộ trưởng Bộ Y tế. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 122 4. Choi SY, Jung SH, Lee HS, Park KW, Yun BS, Lee KW (2008). “Glycation inhibitory activity and the identification of an active compound in P. asiatica extract”. Phytother. Res.; 22: 323–329. 5. Dua Z et al. (2006). “α-glucosidase inhibition of natural curcuminoids and curcumin analogs”. European journal of medicinal chemistry; 41(2): 213-218. 6. Gupta D, Chandrashekar, Richard L, Yogendra, Gupta N (2012). “In vitro antidiabetic activity of stem bark of Bauhinia purpurea Linn.”. Der Pharmacia Lettre; 4(2): 614-619. 7. Mai Thị Cúc, Đỗ Thị Hồng Tươi (2015). “Phân tích sơ bộ thành phần hóa học, khảo sát hoạt tính ức chế α-amylase, α- glucosidase in vitro và độc tính cấp đường uống của trà thảo mộc Karantina”. Tạp chí Y học Thành phố Hồ Chí Minh; 19(3): 32- 37. 8. Ngô Thị Nga, Mai Thị Cúc, Đỗ Thị Hồng Tươi (2017). “Khảo sát tác dụng hạ lipid huyết và hạ đường huyết của cao cồn 50% từ trà thảo mộc Panas Karantina trên chuột nhắt”. Tạp chí Y học Thành phố Hồ Chí Minh; 21(2): 7-15. 9. Niture NT, Ansari AA, Naik SR (2014). “Anti-hyperglycemic activity of rutin in streptozotocin-induced diabetic rats: an effect mediated through cytokines, antioxidants and lipid biomarkers”. Indian J Exp Biol.; 52(7): 720-727. 10. Oboh G et al. (2015). “Comparative effect of quercetin and rutin on α-amylase, α-glucosidase, and some pro-oxidant-induced lipid peroxidation in rat pancreas”. Comparative Clinical Pathology; 24(5): 1103-1110. 11. Onozato ML, Tojo A, Goto A et al. (2002). “Oxidative stress and nitric oxide synthase in rat diabetic nephropathy, effect of A-CEI and ARB”. Kidney Int.; 61(1): p. 186 12. Phạm Thị Diệu Hạnh, Phùng Văn Trung, Nguyễn Ngọc Hạnh, Nguyễn Đông Trúc (2007). “Khảo sát hoạt tính ức chế men alpha glucosidase của các cao chiết hạt mướp đắng”. Tạp chí Khoa học Trường đại học Cần Thơ; 7: 130-137. 13. Viện dược liệu (2004). Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam – tập I. NXB khoa học và kỹ thuật, tr. 172-173. 14. Wang T, Miao M, Bai M, Li Y, Li M, Li C, Xu Y (2017). “Effect of Sophora japonica total flavonoids on pancreas, kidney tissue morphology of streptozotocin-induced diabetic mice model”. Saudi J Biol Sci; 24(3): 741-747. 15. World Health Organization (2018). truy cập ngày 6/6/2018. Ngày nhận bài báo: 25/04/2017 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 20/06/2018 Ngày bài báo được đăng: 20/09/2018