Khảo sát độc tính bán trường diễn của cao chiết từ nấm thượng hoàng (phellinus sp.) hoang dại trên chuột nhắt trắng

50 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 1(86)/2018 I. ĐẶT VẤN ĐỀ Nấm Thượng hoàng Phellinus sp. là một loài nấm dược liệu quý hiếm có khả năng ngăn chặn sự tăng trưởng của tế bào ung thư, có hoạt tính chống khối u ở các tế bào ung thư vú, trực tràng, phổi và tuyến tiền liệt (Li et al., 2004). Nấm Thượng hoàng thiên nhiên thường xuất hiện ở các vùng rừng núi hiểm trở hoang vắng chỉ hiện diện ở một vài quốc gia như Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản và Việt Nam. Nấm rất khó nuôi trồng và thời gian hình thành thể quả ngoài thiên nhiên có thể lên đến 20 năm. Đây cũng là loài nấm đầu tiên được sử dụng làm thuốc chống ung thư tại Nhật (Shibata et al., 2004). Loại nấm này đã được nhóm tác giả tìm thấy ở An Giang. Việc nghiên cứu về loài nấm này rất có ý nghĩa cho xã hội vì đây là loài nấm quý hiếm có thể chữa trị ung thư lại hiện diện ngay tại địa phương thì vấn đề nuôi trồng được sẽ dễ dàng. Dù Thượng hoàng là loài nấm quý nhưng là loài nấm hoang dại nên vấn đề an toàn phải được đặt lên hàng đầu. Vì thế, hướng nghiên cứu khảo sát tính an toàn của nấm thượng hoàng trong thời gian dài trên chuột được thực hiện để làm tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo. Mục đích của nghiên cứu này là khảo sát tính an toàn của cao chiết từ nấm Thượng hoàng trong một thời gian dài sau khi uống, nếu có độc tính thì không được sử dụng lâu dài. II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu - Mẫu nghiên cứu: Cao chiết nấm Thượng hoàng Phellinus sp. - Động vật nghiên cứu: Chuột nhắt trắng đực và cái chủng Swiss albino trưởng thành (4 - 5 tuần tuổi), được cung cấp bởi Viện Vắc xin và Sinh phẩm Y tế Nha Trang. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Tiến hành thí nghiệm Chọn chuột có trọng lượng 25 ± 2 g, chia ngẫu nhiên thành lô chứng cho chuột uống nước cất, lô thử cho chuột uống cao chiết từ nấm Thượng hoàng liều 0,4 g/kg trọng lượng chuột. Chuột được cho uống liên tục trong vòng 1 tháng, sau đó lấy máu tĩnh mạch ở đuôi chuột làm các xét nghiệm. Các chỉ tiêu đánh giá: Trọng lượng cơ thể, thông số huyết học (hồng cầu, hemoglobin, bạch cầu, công thức bạch cầu, tiểu cầu, các chỉ số liên quan đến hồng cầu như MCV, MCH, MCHC, RDW), thông số đánh giá chức năng gan (GOT, GPT, protein toàn phần, triglycerid), thông số đánh giá chức năng thận (creatinin, urea), khảo sát vi thể gan và thận. 1 Đại học An Giang, 2 Đại học Cần Thơ KHẢO SÁT ĐỘC TÍNH BÁN TRƯỜNG DIỄN CỦA CAO CHIẾT TỪ NẤM THƯỢNG HOÀNG (Phellinus sp.) HOANG DẠI TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG Hồ Thị Thu Ba1, Trần Nhân Dũng2, Trương Trần Thuận2 TÓM TẮT Khảo sát tính an toàn của mẫu cao chiết từ nấm Thượng hoàng Phellinus sp. hoang dại liều 0,4 g/kg trọng lượng chuột trong một thời gian dài bằng các bộ kit định lượng protein toàn phần, triglyceride, urea, creatinin, GOT, GPT được cung cấp bởi hãng Human và Đức. Kết quả cho thấy các chỉ tiêu đánh giá như: trọng lượng cơ thể; thông số huyết học (hồng cầu, hemoglobin, bạch cầu, công thức bạch cầu, tiểu cầu, các chỉ số liên quan đến hồng cầu như MCV, MCH, MCHC, RDW); thông số thuộc chức năng gan (GOT, GPT, protein toàn phần, triglycerid), thông số thuộc chức năng thận (creatinin, urea); vi thể gan và thận của chuột, sau thời gian một tháng, đều ghi nhận nằm trong giới hạn bình thường. Từ khóa: Nấm thượng hoàng, cao chiết, khảo sát, độc tính bán trường, chuột nhắt trắng Hình 1. Nấm thượng hoàng Phellinus sp., chuột giải phẩu; tiêu bản gan và thận chuột 51 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 1(86)/2018 2.2.2. Các thông số khảo sát Theo dõi thể trọng cơ thể chuột: Ghi nhận trọng lượng cơ thể trước thử nghiệm và sau 1 tháng để theo dõi tình trạng sức khỏe, khả năng hấp thu dinh dưỡng của chuột. Các thông số huyết học gồm hồng cầu, hemoglobin, hematocrit, tiểu cầu, bạch cầu. Thông số đánh giá chức năng gan gồm có enzyme gan GOT (Glutamat Oxaloacetat Transaminase) và GPT (Glutamat Pyruvat Transaminase); protein toàn phần và Triglycerid. Thông số đánh giá chức năng thận gồm Creatinin và Urea. 2.2.3. Các kỹ thuật thao tác nghiên cứu Các bộ kit định lượng protein toàn phần, triglyceride, urea, creatinin, GOT, GPT được cung cấp bởi hãng Human, Đức. - Kỹ thuật buồng đếm số lượng hồng cầu, số lượng bạch cầu, hematocrit theo Phelan và Lawler (1997). - Kỹ thuật định lượng GOT và GPT trong huyết tương theo phương pháp Kinetic (Bộ Y tế, 2009). - Kỹ thuật định lượng protein toàn phần trong huyết tương theo phương pháp Biuret (Gornall et al., 1949). - Kỹ thuật định lượng creatinin trong huyết tương theo phương pháp Laffé (McEvoy-Bowe, 1966). - Kỹ thuật định lượng urea toàn trong huyết tương theo phương pháp Berthelot (Fawcett & Scott, 1960). 2.2.4. Đánh giá kết quả Các số liệu được biểu thị bằng trị số trung bình M ± SEM (Standard Error of Mean - sai số chuẩn của giá trị trung bình) và xử lý thống kê bằng phần mềm Sigma Stat-3.5 dựa vào phép kiểm Student t-test với độ tin cậy > 95% (P < 0,05). 2.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 8/2016 đến tháng 4/2017 tại Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học, Đại học An Giang. III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Trọng lượng cơ thể chuột Chuột được thử nghiệm là chuột đực và cái 6 tuần tuổi, đang trong giai đoạn tăng trưởng và phát triển nên thể trọng chuột của lô chứng và lô thử sau 1 tháng thử nghiệm tăng so với trước thử nghiệm. Vậy cao nấm Thượng hoàng không ảnh hưởng đến sự phát triển của chuột trong thời gian cho uống. Bảng 1. Trọng lượng cơ thể chuột trước và sau một tháng thử nghiệm 3.2. Các thông số huyết học Số lượng và chất lượng các tế bào máu phản ánh tình trạng của cơ quan tạo máu. Nếu thuốc tác động đến cơ quan tạo máu sẽ làm thay đổi số lượng và chất lượng các tế bào máu. Các chỉ số được ghi nhận sau 1 tháng như sau: - Hồng cầu: Để đánh giá sự ảnh hưởng của cao thuốc đến hồng cầu, tiến hành đếm số lượng hồng cầu trong một thể tích nhất định, đo thể tích hồng cầu thu đuợc kết quả là số lượng hồng cầu ở lô thử không khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng. Như vậy cao nấm Thượng hoàng không ảnh hưởng đến số lượng hồng cầu. - Hemoglobin: Hemoglobin có vai trò quan trọng trong vận chuyển O2 từ phổi đến các mô nên định lượng hemoglobin để biết được khả năng vận chuyển oxy của hồng cầu. Qua thí nghiệm nhận thấy hemoglobin ở lô thử không khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng. Như vậy cao nấm Thượng hoàng không ảnh hưởng đến hàm lượng hemoglobin. - Hematocrit: Tỷ lệ thể tích huyết cầu trong máu cũng phản ánh được một phần tình trạng của hồng cầu. Hematocrit được biểu thị bằng %, tức tỷ lệ % thể tích huyết cầu so với thể tích máu. Qua thí nghiệm nhận thấy hàm lượng hematocrit ở lô thử không khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng. Như vậy cao nấm Thượng hoàng không ảnh hưởng đến hàm lượng hematocrit. - Tiểu cầu: Nhiệm vụ chính của tiểu cầu là tham gia cơ chế đông máu. Thuốc làm tăng hoặc giảm số lượng tiểu cầu có ảnh hưởng đến quá trình đông máu. Qua thí nghiệm nhận thấy số lượng tiểu cầu ở lô thử nghiệm không khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng. Vậy cao nấm Thượng hoàng không ảnh hưởng đến số lượng tiểu cầu. - Thể tích trung bình hồng cầu: Thể tích trung bình của hồng cầu ở lô thử giảm đạt ý nghĩa thống kê nhưng vẫn nằm trong giới hạn bình thường (48 - 56 fl). Vậy, cao nấm Thượng hoàng không ảnh hưởng lên chỉ số thể tích trung bình của hồng cầu. Các chỉ số khảo sát (n = 8) Lô chứng uống nước cất Lô thử uống cao thượng hoàng Trước thử Sau thử Trước thử Sau thử Trọng lượng chuột 24,13g 36,63g 26,75g 37,13g 52 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 1(86)/2018 - Huyết sắc tố trung bình hồng cầu: Chỉ số huyết sắc tố trung bình hồng cầu ở lô thử có sự giảm đạt ý nghĩa thống kê nhưng vẫn nằm trong giới hạn bình thường (11 - 19 pg). Vậy, cao nấm không ảnh hưởng lên chỉ số huyết sắc tố trung bình hồng cầu. - Nồng độ huyết sắc tố trung bình hồng cầu: Nồng độ huyết sắc tố trung bình hồng cầu ở lô chứng và lô thử không có sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê. Vậy, cao nấm Thượng hoàng không ảnh hưởng lên nồng độ huyết sắc tố trung bình hồng cầu. - Tỷ lệ phân bố hồng cầu: Tỷ lệ phân bố hồng cầu ở lô chứng và lô thử không có sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê. Vậy, cao nấm Thượng hoàng không ảnh hưởng lên tỷ lệ phân bố hồng cầu. - Số lượng bạch cầu: Chức năng chính của bạch cầu là thực bào và sản xuất gamma - globulin. Thuốc hoặc bệnh có thể ảnh hưởng đến số lượng và chất lượng của bạch cầu. Qua thi nghiệm nhận thấy số lượng bạch cầu ở lô thử không khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng ở các thời điểm xét nghiệm. Vậy cao nấm không ảnh hưởng đến số lượng bạch cầu. - Số lượng bạch cầu hạt trung tính Số lượng bạch cầu hạt trung tính ở lô chứng và lô thử không có sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê. Như vậy, cao nấm Thượng hoàng không ảnh hưởng lên số lượng bạch cầu hạt trung tính. - Số lượng bạch cầu lympho Số lượng bạch cầu lympho ở lô chứng và lô thử không có sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê. Vậy, cao nấm không ảnh hưởng lên số lượng bạch cầu lympho. - Số lượng bạch cầu đơn nhân Số lượng bạch cầu đơn nhân ở lô chứng và lô thử không có sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê. Vậy, cao nấm không ảnh hưởng lên số lượng bạch cầu đơn nhân. 3.3. Các thông số sinh hóa 3.3.1. Thông số đánh giá chức năng gan Gan là cơ quan đảm nhận nhiều chức năng rất quan trọng. Khi đưa thuốc vào cơ thể, thuốc có thể gây độc với gan, ảnh hưởng đến chức năng gan. Enzyme gan GOT và GPT: Khi tế bào gan bị tổn thương thì GOT (Glutamat Oxaloacetat Transaminase) hoặc Aspartat aminotransferase (AST), GPT (Glutamat Pyruvat Transaminase) hoặc Alanin aminotransferase (ALT) trong huyết thanh hoặc huyết tương là tiêu chuẩn để đánh giá. Hàm lượng GOT: Hàm lượng GOT ở lô uống thử không khác biệt so với lô chứng vẫn nằm trong giới hạn sinh lý bình thường (69-191 IU/l). Như vậy cao nấm Thượng hoàng không ảnh hưởng lên hàm lượng GOT trong huyết tương chuột. Hàm lượng GPT: Hàm lượng GPT trong huyết tương ở lô chứng và lô thử không có sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê.Vậy, cao nấm Thượng hoàng không ảnh hưởng lên hàm lượng GPT trong huyết tương. Bảng 2. Thông số huyết học của chuột trước và sau một tháng thử nghiệm Các chỉ số khảo sát (đơn vị tính) (n = 8) Lô uống nước cất Lô uống cao thượng hoàng Trước thử Sau thử Trước thử Sau thử Hồng cầu (M/UL) 9,85±0,13 10,48±0,18 9,53±0,08 10,19±0,11 Hemoglobin (g/dl) 15,88±0,13 16,64±0,18 15,79±0,10 15,90±0,24 Hematocrit (%) 53,19±0,60 53,06±1,13 53,34±0,70 51,96±0,93 Tiểu cầu (103 tế bào/µl) 1014,88± 74,94 880,14± 90,77 1189,88± 70,87 979,63± 62,21 Thể tích trung bình hồng cầu (fl) 52,95±0,73 51,30±1,07 53,09±0,35 50,19±0,94 Huyết sắc tố trung bình hồng cầu (pg) 16,20±0,23 15,87±0,27 16,48±0,11 15,63±0,22 Nồng độ sắc tố trung bình hồng cầu (g/dL) 30,63±0,26 30,97±0,31 31,07±0,19 31,160,27 Tỷ lệ phân bố hồng cầu (%) 14,48±0,43 13,29±0,23 14,35±0,21 14,91±0,99 Số lượng bạch cầu (tế bào/µl) 4,26±0,32 8,42±0,57 4,41±0,33 8,95±0,91 Số lượng bạch cầu hạt trung tính (%) 21,59±2,54 20,89±2,66 23,94±1,76 20,06±2,07 Số lượng bạch cầu lympho (%) 68,76±2,97 70,47±2,60 64,01±2,97 67,21±2,04 Số lượng bạch cầu đơn nhân (%) 3,68±0,35 3,71±0,33 3,45±0,28 3,34±0,16 53 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 1(86)/2018 Bảng 3. Thông số đánh giá chức năng gan trước và sau một tháng thử nghiệm Bảng 4. Hàm lượng Protein toàn phần và triglycerid trong huyết tương Bảng 5. Thông số đánh giá chức năng thận sau một tháng thử nghiệm - Hàm lượng protein toàn phần: Định lượng protein toàn phần để đánh giá chức năng tổng hợp của gan. Hàm lượng protein toàn phần trong huyết tương ở lô chứng và lô thử không có sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê. Vậy, cao nấm Thượng hoàng không ảnh hưởng lên hàm lượng protein toàn phần trong huyết tương chuột. - Hàm lượng triglycerid: Nếu triglycerid tăng trong huyết tương sẽ có nguy cơ tăng lipid máu và gây ra nhiều bệnh lý sau này. Hàm lượng triglycerid của lô chứng và lô thử có sự tăng khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với trước thử nhưng vẫn ở trong giới hạn bình thường (71 - 164 mg/dl). Vậy, cao nấm không làm ảnh hưởng đến hàm lượng triglycerid. Các chỉ số khảo sát (đơn vị tính) (n = 8) Lô uống nước cất Lô uống cao thượng hoàng Trước thử Sau thử Trước thử Sau thử GOT (IU/l) 40,0±1,76 36,50±2,95 46,88±3,25 35,5±1,28 GPT (IU/l) 49,75±2,0 49,50±2,97 46,38±1,64 45,0±1,85 Các chỉ số khảo sát (đơn vị tính) (n = 8) Lô uống nước cất Lô uống cao thượng hoàng Trước thử Sau thử Trước thử Sau thử Protein (g/dL) 4,23±0,03 5,88±0,19 4,43±0,09 5,6±0,07 Triglycerid (mg/dL) 83,5±8,23 115,13±6,37 81,5±8,33 114,63±7,98 3.3.2. Thông số đánh giá chức năng thận - Creatinin: Để đánh giá ảnh hưởng của thuốc trên chức năng thận, thường dùng xét nghiệm định lượng creatinin huyết vì creatinin là thành phần ổn định nhất trong máu. Hàm lượng creatinin trong huyết tương ở lô thử không khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng. Vậy cao nấm không làm ảnh hưởng đến hàm lượng creatinin. - Urea: Khi urea huyết tăng là biểu hiện gián tiếp của sự tăng các độc chất trong cơ thể. Hàm lượng urea trong huyết tương ở lô chứng và lô thử không có sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê. Vậy, cao nấm không ảnh hưởng lên hàm lượng urea. Các chỉ số khảo sát (đơn vị tính) (n = 8) Lô uống nước cất Lô uống cao thượng hoàng Trước thử Sau thử Trước thử Sau thử Creatinin (mg/dL) 0,64±0,03 1,2±0,06 0,71±0,04 1,25±0,04 Urea (mg/dL) 52,16±4,92 60,10±2,86 53,09±3,15 53,0±1,75 3.4. Giải phẫu vi thể Khảo sát vi thể gan ở lô chứng và thử cho thấy có tình trạng viêm gan mạn ở cả 2 lô. Điều này có thể do ảnh hưởng của kỹ thuật tách mẫu và xử lý tiêu bản gan chuột. Khảo sát vi thể thận ở lô chứng và lô thử không cho thấy có sự bất thường. Giải phẩu vi thể chuột nhận thấy cao nấm Thượng hoàng không ảnh hưởng lên gan và thận, loài nấm này có thể sử dụng thời gian dài mà không ảnh hưởng đến cơ thể vì đây là hai cơ quan chịu tác động của độc tính. IV. KẾT LUẬN Cao nấm Thượng hoàng liều 0,4 g/kg sau 1 tháng cho uống không có biểu hiện bất thường về độc tính bán trường diễn trên chuột nhắt trắng. Các thông số về huyết học, chỉ số sinh hóa thuộc về chức năng gan - thận nằm trong giới hạn bình thường. TÀI LIỆU THAM KHẢO Bộ Y tế, 2009. Dược điển Việt Nam tái bản lần 4. Nhà xuất bản Y học. Hà Nội. Fawcett, J. K., & Scott, J., 1960. A rapid and precise method for the determination of urea.  Journal of clinical pathology, 13 (2): 156-159. Gornall, A. G., Bardawill, C. J., & David, M. M. 1949. Determination of serum proteins by means of the biuret reaction.  Journal of biological chemistry,  177 (2): 751-766. Li G, Kim DH, Kim TD, Park BJ, Park HD, Park JI, Na MK, Kim HC, Hong ND, Lim K, Hwang BD, Yoon WH., 2004. Protein-bound polysaccharide