Đồ án Tổng quan tài liệu về kỹ thuật Dense Phase CO 2 – Nguyên lý ứng dụng trong công nghệ thực phẩm

Ñoà aùn Coâng ngheä Thöïc phaåm 1 LÔØI NOÙI ÑAÀU Xaõ hoäi ngaøy moät phaùt trieån, nhu caàu cuûa con ngöôøi ngaøy moät naâng cao ñoøi hoûi kyõ thuaät cuõng phaûi coù nhöõng böôùc phaùt trieån phuø hôïp. Coâng ngheä thöïc phaåm cuõng khoâng ngoaïi leä. Vieäc tìm ra nhöõng phöông phaùp xöû lyù môùi, nhöõng saûn phaåm môùi cuõng nhö nhöõng nguoàn nguyeân lieäu môùi ñaõ trôû thaønh nhöõng vaán ñeà mang tính chieán löôïc hieän nay. CO2 sieâu tôùi haïn laø moät trong nhöõng ñeà taøi ñöôïc tìm hieåu nhieàu trong suoát thôøi gian gaàn ñaây vaø nhôø nhöõng öu ñieåm cuûa mình maø CO2 sieâu tôùi haïn ñaõ ñöôïc öùng duïng trong raát nhieàu lónh vöïc nghieân cöùu vaø thöïc teá nhö trích ly, tinh saïch, laøm moâi tröôøng phaûn öùng. Ñaëc bieät, vieäc söû duïng CO2 sieâu tôùi haïn ñeå thanh truøng, tieät truøng thöïc phaåm ñaõ ñöôïc nhieàu nhaø khoa hoïc nghieân cöùu vaø ñöa ra nhöõng keát luaän veà öu ñieåm cuûa kyõ thuaät môùi naøy so vôùi caùc kyõ thuaät truyeàn thoáng. Nhieäm vuï cuûa ñoà aùn “Toång quan taøi lieäu veà kyõ thuaät Dense Phase CO2 – Nguyeân lyù öùng duïng trong coâng ngheä thöïc phaåm” laø tìm hieåu veà kyõ thuaät thanh truøng, tieät truøng duøng CO2 sieâu tôùi haïn, goïi laø kyõ thuaät Dense Phase Carbon Dioxide (DPCD), phaân tích caùc aûnh höôûng cuûa kyõ thuaät naøy leân chaát löôïng thöïc phaåm cuõng nhö nguyeân lyù öùng duïng kyõ thuaät DPCD vaøo coâng ngheä thöïc phaåm. Ñoà aùn Coâng ngheä Thöïc phaåm 2 Chöông 1 GIÔÙI THIEÄU Caùc kyõ thuaät khoâng duøng nhieät (chieáu xaï, duøng aùp löïc cao (UHP), duøng xung ñoäng ñieän, kyõ thuaät dense phase CO2 (DPCD), xung ñoäng töø tröôøng) nhaèm tieâu dieät vi sinh vaät vaø voâ hoaït caùc enzyme trong thöïc phaåm ñang thu huùt söï quan taâm vaø ngaøy caøng ñöôïc chaáp nhaän nhö laø moät phöông phaùp xöû lyù thöïc phaåm giaøu tieàm naêng khaû dó coù theå thay theá hay ít ra laø hoã trôï cho caùc kyõ thuaät xöû lyù truyeàn thoáng nhö thanh truøng, tieät truøng hoaëc söû duïng caùc phuï gia. So vôùi caùc kyõ thuaät truyeàn thoáng thì nhöõng kyõ thuaät môùi naøy giuùp laøm giaûm söï thay ñoåi muøi vò moät caùch khoâng mong muoán trong quaù trình xöû lyù, söï bieán tính caùc thaønh phaàn dinh döôõng, taïo ra caùc ñoäc toá cuõng nhö söï thay ñoåi veà caùc tính chaát vaät lyù, hoaù lyù cuûa saûn phaåm. Trong nhöõng kyõ thuaät khoâng duøng nhieät noùi treân thì kyõ thuaät Dense phase CO2 ñöôïc xem laø kyõ thuaät coù nhieàu öu ñieåm nhaát. Dense phase CO2 (DPCD) laø moät kyõ thuaät söû duïng CO2 ôû traïng thaùi dense phase (traïng thaùi sieâu tôùi haïn) ñeå voâ hoaït vi sinh vaät vaø enzyme coù trong nguyeân lieäu ôû nhieät ñoä thaáp do ñoù maø giaûm ñöôïc nhöõng aûnh höôûng baát lôïi cuûa nhieät ñeán chaát löôïng thöïc phaåm. Kyõ thuaät naøy ñaõ ñöôïc nghieân cöùu trong hôn 50 naêm qua, ñaëc bieät laø trong 2 thaäp kyû vöøa qua, vaø aûnh höôûng cuûa noù leân caùc teá baøo sinh döôõng, caùc baøo töû vi sinh vaät, bao goàm caû caùc maàm beänh, vi sinh vaät gaây thoái, naám men, naám moác, vaø nhieàu loaïi enzyme khaùc nhau ñaõ ñöôïc chöùng minh. Nhieàu thöïc phaåm loûng ñaït ñöôïc giaù trò caûm quan toát, giöõ ñöôïc höông vò töï nhieân, giaù trò dinh döôõng cuõng nhö caùc tính chaát hoaù lyù sau khi ñöôïc xöû lyù baèng DPCP. Maët khaùc, CO2 laø loaïi nguyeân lieäu khoâng ñoäc, khoâng gaây chaùy noå, giaù thaønh thaáp, beân caïnh ñoù noù cuõng laø thaønh phaàn trong nhieàu loaïi thöïc phaåm chaúng haïn nhö caùc loaïi thöùc uoáng coù gas. Ñoà aùn Coâng ngheä Thöïc phaåm 3 Nghieân cöùu ñaàu tieân ñöôïc cho laø môû ñaàu cho khaû naêng öùng duïng kyõ thuaät DPCD laø nghieân cöùu cuûa Fraser (1951). Nghieân cöùu ñaõ keát luaän raèng söï giaûi phoùng ñoät ngoät khí CO2 ôû aùp suaát cao khoaûng 34 atm veà aùp suaát thöôøng coù theå phaù vôõ teá baøo vi khuaån. Quaù trình tieán haønh trong nghieân cöùu treân coù moät böôùc neùn CO2 ôû aùp suaát cao ñeå taêng khaû naêng thaåm thaáu qua maøng teá baøo roài giaûi phoùng aùp suaát khieán CO2 giaõn nôû vaø phaù vôõ teá baøo. Giaû thuyeát aáy ngaøy nay ñaõ ñöôïc chöùng minh vaø coâng trình cuûa Fraser vaø coäng söï ñöôïc xem laø baèng chöùng ñaàu tieân veà öùng duïng cuûa kyõ thuaät DPCD nhö moät phöông phaùp thanh trung, tieät truøng khoâng duøng nhieät. Naêm 1969, nhaø saûn xuaát Swift & Co. nhaän ñöôïc baèng saùng cheá cuûa Hoa Kyø cho phaùt minh heä thoáng tieät truøng thöïc phaåm söû duïng CO2. Hoï ñaõ keát luaän raèng thöïc phaåm tieät truøng coù theå giöõ ñöôïc muøi vò töï nhieân khi tieät truøng baèng CO2 ôû aùp suaát cao. Keå töø ñoù, nhieàu nghieân cöùu ñaõ ñöôïc tieán haønh nhaèm tìm hieåu cô cheá, ñoäng hoïc vaø caùc yeáu toá aûnh höôûng ñeán quaù trình xöû lyù thöïc phaåm duøng kyõ thuaät DPCD ñeå toái öu hoaù quaù trình xöû lyù. Beân caïnh ñoù, caùc nhaø khoa hoïc cuõng tìm hieåu nhöõng aûnh höôûng cuûa kyõ thuaät naøy leân thöïc phaåm vaø tieán haønh so saùnh noù vôùi caùc kyõ thuaät thanh truøng, tieät truøng khaùc. Ngaøy nay, kyõ thuaät DPCD ñaõ cho thaáy nhöõng öu ñieåm vaø taàm öùng duïng roäng raõi trong caùc coâng ngheä caàn xöû lyù vi sinh vaät vaø enzymes. Nhieàu nghieân cöùu vaãn coøn ñöôïc tieán haønh vôùi quy moâ lôùn nhoû khaùc nhau ñeå tìm hieåu saâu hôn veà kyõ thuaät öu vieät naøy. Ñoà aùn Coâng ngheä Thöïc phaåm 4 Chöông 2 KHAÙI NIEÄM, TÍNH CHAÁT DENSE PHASE CO2 2.1. Giôùi thieäu veà CO2 2.1.1. Lòch söû Carbon dioxide laø moät trong nhöõng loaïi khí ñaàu tieân ñöôïc xaùc ñònh laø toàn taïi töï do trong khoâng khí. Vaøo theá kyû 17, Jan Baptist Helmont, moät nhaø hoaù hoïc ngöôøi Bæ, laø ngöôøi ñaàu tieân phaùt hieän ra söï toàn taïi cuûa moät loaïi khí khoâng maøu sau moät thí nghieäm ñoát than cuûi vaø goïi noù laø moät loaïi “gas”. Trong thaäp nieân 50 cuûa theá kyû 17, Joseph Black, nhaø vaät lyù hoïc ngöôøi Scotland, cuõng ñaõ tìm hieåu veà tính chaát cuûa CO2 vaø keát luaän raèng loaïi khí naøy naëng hôn khoâng khí, khoâng duy trì söï chaùy vaø söï soáng cuûa sinh vaät, coù theå ñöôïc taïo ra baèng caùch nung noùng hay cho ñaù voâi taùc duïng vôùi acid. OÂng cuõng nhaän thaáy laø dung dòch nöôùc voâi trong sau khi ñöôïc suïc khí CO2 thì seõ hoaù ñuïc do taïo thaønh calcium carbonate, vaø ñaõ duøng hieän töôïng naøy giaûi thích cho vieäc taïo thaønh CO2 töø hoaït ñoäng trao ñoåi chaát cuûa con ngöôøi, ñoäng vaät vaø töø quaù trình leân men cuûa vi sinh vaät. Sau ñoù, nhaø hoaù hoïc ngöôøi Phaùp, oâng Antoine Lavoisier ñaõ chöùng minh ñöôïc chaát khí taïo thaønh töø phaûn öùng ñoát chaùy than cuûi cuûa Jan Baptist Helmont coù tính chaát nhö Black moâ taû laø moät oxide cuûa carbon. Naêm 1775, Joseph Priestley ñaõ söû duïng CO2 taïo thaønh töø phaûn öùng giöõa acid sulfuric vaø ñaù voâi ñeå saûn xuaát soda, moät loaïi thöùc uoáng coù CO2 ñaàu tieân. Naêm 1823, Humphrey Davy vaø Micheal Faraday laàn ñaàu tieân hoaù loûng ñöôïc CO2.. Naêm 1834, Charles Thilorier trong moät tai naïn tình côø ñaõ phaùt hieän ra caùch taïo carbon dioxide daïng raén (thöôøng goïi laø baêng khoâ) sau khi môû moät bình cao aùp chöùa CO2. Ñoà aùn Coâng ngheä Thöïc phaåm 5 Ngaøy nay, CO2 ñaõ ñöôïc tìm hieåu kyõ löôõng vaø ñöôïc öùng duïng trong raát nhieàu lónh vöïc khaùc nhau. 2.1.2. Tính chaát vaät lyù vaø hoaù hoïc cuûa CO2 Carbon dioxide laø moät hôïp chaát hoaù hoïc khoâng phaân cöïc, hình thaønh töø moät nguyeân töû carbon noái ñoâi vôùi hai nguyeân töû oxy, coù coâng thöùc hoaù hoïc laø CO2. Hình 2.1: Caáu truùc phaân töû cuûa CO2 CO2 toàn taïi ôû traïng thaùi khí trong ñieàu kieän thöôøng, khoâng maøu, khoâng muøi, khoâng duy trì söï chaùy, toàn taïi trong khoâng khí vôùi noàng ñoä xaáp xæ 0,03%, ít ñoäc vôùi con ngöôøi vaø ñoäng vaät. Baûng 2.1: Moät soá thoâng soá hoaù lyù cuûa CO2 Khoái löôïng rieâng (ñkc) 1,98 kg/m3 Ñoä tan trong nöôùc (to phoøng) 1,45 kg/m3 Ñieåm ñoâng ñaëc -57oC (neùn) Ñieåm soâi -78oC (thaêng hoa) pKa1 6,35 pKa2 10,33 Ñoä nhôùt (-78oC) 0,07 cP Nhieät ñoä tôùi haïn 31,1oC Aùp suaát tôùi haïn 7,37 MPa Khaû naêng hoaø tan trong nöôùc cuûa CO2 laø moät tính chaát quan troïng. Taïi ñieàu kieän thöôøng (14,7 psi, 15oC), moät theå tích CO2 coù theå hoaø tan hoaøn toaøn trong moät theå tích nöôùc. Tuy nhieân, ñeå duy trì söï hoaø tan naøy ta caàn phaûi duy trì aùp suaát, neáu khoâng CO2 seõ giaûi phoùng khoûi nöôùc döôùi daïng caùc boït nhoû. Khaû naêng hoaø tan cuûa CO2 phuï thuoäc vaøo aùp suaát, nhieät ñoä vaø pH dung dòch, cuï theå laø haøm löôïng CO2 hoaø Ñoà aùn Coâng ngheä Thöïc phaåm 6 tan trong nöôùc seõ taêng khi taêng aùp suaát, gi aûm nhieät ñoä vaø taêng pH. Trong ñoù, aùp suaát aûnh höôûng raát lôùn ñeán khaû naêng hoaø tan cuûa CO2: aùp suaát caøng cao thì löôïng CO2 hoaø tan caøng nhieàu. Khaû naêng hoøa tan cuûa CO2 vaøo nöôùc Aùp suaát (psi) Hình 2.2: Ñoà thò bieåu dieãn khaû naêng hoaø tan cuûa CO2 trong nöôùc ôû nhöõng nhieät ñoä khaùc nhau theo aùp suaát Quaù trình hoaø tan CO2 vaøo nöôùc ñöôïc moâ taû nhö sau:
Ban ñaàu, CO2 traïng thaùi khí seõ hoaø tan vaøo nöôùc
Sau ñoù, CO2 seõ töông taùc vôùi nöôùc ñeå taïo thaønh acid carbonic. Chæ khoaûng 1% CO2 hoaø tan toàn taïi döôùi daïng H2CO3
Acid carbonic laø moät acid yeáu, phaân ly qua hai giai ñoaïn H2CO3 ↔ H+ + HCO3- pKa = 6,57 HCO3- ↔ H+ + CO32- pKa = 10,62
Acid carbonic coù theå bò phaân huyû taïo thaønh CO2 vaø nöôùc Ñoà aùn Coâng ngheä Thöïc phaåm 7 Ngoaøi ra, CO2 laø moät hôïp chaát khoâng phaân cöïc, do ñoù maø noù deã daøng tan vaøo caùc dung moâi khoâng phaân cöïc nhö chaát beùo. Ñaây laø moät trong nhöõng ñaëc tính quan troïng cuûa CO2 khi öùng duïng traïng thaùi dense phase cuûa noù ñeå thanh truøng hay tieät truøng thöïc phaåm vì CO2 seõ hoaø tan vaøo phaàn kî nöôùc ôû giöõa maøng lipid keùp cuûa teá baøo vi sinh vaät vaø gaây bieán tính maøng. 2.1.3. Giaûn ñoà pha cuûa CO2 Hình 2.3: Giaûn ñoà pha cuûa CO2 CO2 coù theå toàn taïi ôû nhieàu traïng thaùi khaùc nhau: raén, loûng, khí tuyø thuoäc vaøo ñieàu kieän aùp suaát vaø nhieät ñoä. Taïi ñieåm tôùi haïn (critical point), khi taêng aùp suaát vaø nhieät ñoä, CO2 seõ tieán vaøo vuøng traïng thaùi sieâu tôùi haïn (supercritical), khi ñoù noù seõ coù tính chaát naèm giöõa traïng thaùi loûng vaø khí. Taïi moät nhieät ñoä coá ñònh treân nhieät ñoä tôùi haïn Tc, khi ta taêng aùp suaát, CO2 khoâng ngöng tuï chuyeån veà traïng thaùi loûng ñöôïc, khoái khí CO2 bò neùn laïi, do ñoù maø maät ñoä chuùng taêng leân, taïo neân moät traïng thaùi daøy ñaëc maø ta goïi laø traïng thaùi dense phase. Vì vaäy, traïng thaùi dense phase cuõng ñöôïc xem laø traïng thaùi sieâu tôùi haïn. Ñoà aùn Coâng ngheä Thöïc phaåm 8 2.2. Toång quan veà dense phase CO2 (Coustantina Tzia vaø George Liadakis, 2003) 2.2.1. Ñònh nghóa veà dense phase hay traïng thaùi sieâu tôùi haïn Traïng thaùi sieâu tôùi haïn laø traïng thaùi cuûa moät chaát, hôïp chaát hay hoãn hôïp maø nhieät ñoä vaø aùp suaát toàn taïi cuûa noù treân nhieät ñoä tôùi haïn (Tc), aùp suaát tôùi haïn (Pc) vaø döôùi aùp suaát chuyeån sang theå raén cuûa chaát ñoù 2.2.2. Nguyeân lyù taïo thaønh CO2 sieâu tôùi haïn Traïng thaùi cuûa moät chaát bieán ñoåi khi thay ñoåi caùc thoâng soá traïng thaùi cuûa chaát ñoù. Nguyeân taéc taïo traïng thaùi sieâu tôùi haïn cuûa moät chaát l aø hieäu chæ nh nhieät ñoä vaø aùp suaát cuûa chaát ñoù phaûi lôùn hôn nhieät ñoä tôùi haïn vaø aùp suaát tôùi haïn cuûa chính noù. Baûng 2.2: Nhieät ñoä tôùi haïn vaø aùp suaát tôùi haïn cuûa moät soá chaát thoâng duïng. Nhö vaäy, ñoái vôùi CO2, ta duy trì aùp suaát treân 7,37 Mpa vaø nhieät ñoä treân 31,1oC thì coù theå taïo ra CO2 ôû traïng thaùi sieâu tôùi haïn. 2.2.3. Tính chaát cuûa löu chaát sieâu tôùi haïn 2.2.3.1. Haèng soá tôùi haïn Ñieåm tôùi haïn cuûa moät chaát ñöôïc xaùc ñònh bôûi nhieät ñoä vaø aùp suaát, taïi ñoù traïng thaùi pha loûng vaø pha khí khoâng theå phaân bieät. Ñoà aùn Coâng ngheä Thöïc phaåm 9 Khi moät chaát bò neùn vaø gia nhieät ñeán moät aùp suaát vaø nhieät ñoä cao hôn ñieåm tôùi haïn thì chaát ñoù chuyeån sang moät traïng khaùc ñöôïc goïi laø traïng thaùi sieâu tôùi haïn. Nhieät ñoä, aùp suaát vaø theå tích mol cuûa moät chaát ôû ñieåm tôùi haïn ñöôïc goïi laø nhieät ñoä tôùi haïn (Tc), aùp suaát tôùi haïn (Pc) vaø theå tích mol tôùi haïn (Vc) töông öùng. Caùc tham soá treân ñöôïc goïi laø haèng soá tôùi haïn. Moãi chaát coù moät haèng soá tôùi haïn nhaát ñònh (baûng 2.2). 2.2.3.2. Tyû troïng Tyû troïng cuûa löu chaát sieâu tôùi haïn seõ thay ñoåi khi nhieät ñoä vaø aùp suaát töông öùng cuûa moâi tröôøng thay ñoåi. Trong moïi tröôøng hôïp, söï gia taêng nhieät ñoä daãn ñeán söï giaûm tyû troïng. Tyû troïng cuûa löu chaát bieán ñoåi nhanh ôû vuøng nhieät ñoä vaø aùp suaát gaàn ñieåm tôùi haïn. Tyû troïng ruùt goïn (ρr = ρ/ρc) cuûa hôïp chaát tinh khieát ôû aùp suaát ruùt goïn (Pr = P/Pc) laø 1,0 coù theå thay ñoåi töø giaù trò khoaûng 0,1 (tyû troïng gioáng chaát khí) ñeán khoaûng 2,0 (tyû troïng gioáng chaát loûng) khi ta tieán haønh hieäu chænh nhieät ñoä ruùt goïn (Tr = T/Tc) trong daõy töø 0,9 – 1,2 (hình 2.4, baûng 2.3). Hình 2.4: Söï bieán thieân tyû troïng ruùt goïn cuûa moät chaát trong vuøng laân caän tôùi haïn. Ñoà aùn Coâng ngheä Thöïc phaåm 10 Baûng 2.3: So saùnh ñaëc tính vaät lyù cuûa chaát loûng, chaát khí vaø chaát loûng sieâu tôùi haïn. Khi tyû troïng cuûa löu chaát sieâu tôùi haïn coù gi aù trò töông ñöông vôùi tyû troïng cuûa chaát ñoù ôû traïng thaùi loûng thì chaát loûng sieâu tôùi haïn hoaït ñoäng nhö dung moâi loûng. Tuy nhieân, khi nhieät ñoä ruùt goïn taêng ñeán giaù trò khoaûng 1,6, chaát loûng sieâu tôùi haïn trôû neân gioáng chaát khí do söï giaõn nôû taêng cuøng vôùi söï taêng nhieät ñoä. 2.2.3.3. Haèng soá ñieän moâi. Taïi aùp suaát cao, chaát khí khoâng coøn toàn taïi ôû traïng thaùi khí lyù töôûng do söï taêng cöôøng lieân keát vaät lyù giöõa caùc ion, caùc löôõng cöïc, caùc löôõng cöïc taïm thôøi vaø nhieàu cöïc aûnh höôûng tôùi caùc töông taùc phaân töû trong heä. Naêng löôïng töông taùc (Eq) giöõa caùc ñieän tích q1, q2 ñöôïc xaùc ñònh bôûi moät haøm cuûa haèng soá ñieän moâi (ε) vaø khoaûng caùch giöõa caùc ñieän tích (r). r qq Eq ..4 . 21 εpi = Haèng soá ñieän moâi tónh laø moät thoâng soá hieäu quaû ñeå ñaùnh giaù ñaëc tính dung moâi cuûa chaát loûng coù cöïc nhö ethanol, methanol vaø nöôùc. Haèng soá ñieän moâi cuõng laø thoâng soá phuï thuoäc vaøo tyû troïng vaø coù theå thay ñoåi baèng caùch hieäu chænh nhieät ñoä vaø aùp suaát cuûa heä. Haèng soá ñieän moâi cuûa chaát loûng sieâu tôùi haïn laø moät thoâng soá quan troïng ñeå öôùc löôïng söï taêng cöôøng lieân keát noäi phaân töû thoâng qua töông taùc löôõng cöïc – löôõng cöïc. Ví duï: ôû nhieät ñoä 40oC, giaù trò haèng soá ñieän moâi cuûa CO2 taêng khi aùp suaát taêng töø 70 – 200.105Pa vaø ñaït traïng thaùi gioáng chaát loûng khi aùp suaát cuûa heä dao ñoäng quanh giaù trò 200.105Pa. Nhö vaäy, aùp suaát caøng cao thì lieân keát noäi phaân töû caøng ñöôïc cuûng coá, tính chaát khoâng phaân cöïc cuûa CO2 caøng ñöôïc taêng cöôøng. Ñieàu Ñoà aùn Coâng ngheä Thöïc phaåm 11 naøy giaûi thích nguyeân nhaân ôû aùp suaát caøng cao thì khaû naêng tan cuûa caùc chaát khoâng phaân cöïc vaø caùc hôïp chaát khoù bay hôi trong dung moâi CO2 caøng taêng. Hình 2.5: Tyû troïng vaø haèng soá ñieän moâi cuûa CO2 theo aùp suaát ôû 50oC. 2.2.3.3. Ñaëc tính chuyeån ñoäng
Ñoä nhôùt Ñoä nhôùt laø moät thoâng soá quan troïng duøng ñeå ñaùnh giaù söï chuyeån ñoäng cuûa chaát loûng trong heä thoáng. Ñoä nhôùt cuûa chaát khí taêng khi nhieät ñoä taêng trong moät khoaûng aùp suaát nhaát ñònh. Tuy nhieân, ñoä nhôùt cuûa chaát loûng sieâu tôùi haïn laïi giaûm khi taêng nhieät ñoä trong 1 khoaûng aùp suaát nhaát ñònh. Ñoái vôùi löu chaát ôû traïng thaùi sieâu tôùi haïn, khi aùp suaát cuûa heä caøng taêng thì tyû troïng cuûa noù cuõng taêng vaø ñaït giaù trò baèng vôùi tyû troïng cuûa chaát ñoù ôû traïng thaùi loûng. Trong khi ñoù, ñoä nhôùt cuûa löu chaát sieâu tôùi haïn laïi taêng chaäm hôn vaø vaãn chöa ñaït ñeán ñoä nhôùt cuûa chaát ñoù ôû traïng thaùi loûng. Ñoà aùn Coâng ngheä Thöïc phaåm 12 Hình 2.6: Ñoä nhôùt cuûa CO2 ôû caùc nhieät ñoä khaùc nhau trong vuøng sieâu tôùi haïn.
Khaû naêng khueách taùn Khaû naêng khueách taùn cuõng laø moät thoâng soá quan troïng ñaùnh giaù hieäu quaû trích ly cuûa löu chaát sieâu tôùi haïn. Khaû naêng khueách taùn cuûa moät chaát ôû traïng thaùi sieâu tôùi haïn cao hôn so vôùi chaát ñoù ôû traïng thaùi loûng, vì vaäy maø khaû naêng truyeàn khoái cuûa löu chaát sieâu tôùi haïn cuõng cao hôn. Khaû naêng khueách taùn cuûa löu chaát sieâu tôùi haïn taêng khi nhieät ñoä taêng vaø giaûm khi aùp suaát taêng. 2.2.3.4. Nhieät dung rieâng vaø söï daãn nhieät Caùc thoâng soá veà nhieät dung rieâng vaø söï daãn nhieät ñöôïc duøng ñeå moâ taû caùch truyeàn nhieät trong heä. Trong vuøng tôùi haïn, nhieät dung ñaúng aùp raát lôùn vaø ñaït ñeán giaù trò cöïc ñaïi roài giaûm daàn veà giaù trò oån ñònh (hình 1.5). Tuy nhieân, nhieät dung ñaúng tích chæ thay ñoåi raát ít trong vuøng tôùi haïn. Ñoà aùn Coâng ngheä Thöïc phaåm 13 Hình 2.7:Nhieät dung rieâng cuûa CO2 ôû 320oK. Söï daãn nhieät cuûa chaát loûng sieâu tôùi haïn ñöôïc xem laø moät tính chaát truyeàn nhieät quan troïng. Heä soá daãn nhieät (λ) laø heä soá tyû leä giöõa doøng nhieät Q vaø gradient nhieät ñoä cuûa chaát loûng. Q = λ.∇T Haàu heát heä soá daãn nhieät cuûa chaát loûng sieâu t ôùi haïn taêng vôùi söï taêng nhieät ñoä vaø tyû troïng cuûa heä. Baûng 1.3 theå hieän soá lieäu veà heä soá daãn nhieät cuûa nöôùc vaø CO2 nhö moät haøm cuûa nhieät ñoä ôû vaøi aùp suaát. Baûng 2.4: Heä soá daãn nhieät cuûa nöôùc vaø CO2.  Toùm laïi, traïng thaùi dense phase hay traïng thaùi sieâu tôùi haïn ñöôïc moâ taû laø moät traïng thaùi trung gian giöõa traïng thaùi khí laø loûng, coù khaû naêng khueách taùn cao Ñoà aùn Coâng ngheä Thöïc phaåm 14 gaàn vôùi chaát khí vaø khaû naêng hoaø tan caùc chaát tan gaàn nhö moät dung moâi loûng. Moät chaát toàn taïi ôû traïng thaùi dense phase seõ coù nhöõng tính chaát gioáng traïng thaùi khí do ñoäng naêng cuûa caùc phaân töû lôùn hôn löïc huùt giöõa caùc phaân töû vôùi nhau, vì vaäy maø noù coù khaû naêng khueách taùn gioáng chaát khí. Maët khaùc, chaát naøy cuõng seõ coù nhöõng tính chaát gioáng traïng thaùi loûng do maät ñoä phaân töû lôùn, coù caùc tính chaát veà ñoä nhôùt, tính chaát doøng chaûy gaàn gioáng chaát loûng (N.L. Rozzi and R.K. Singh , 2002; Yoshaki Fukushima, 1999). Nhôø tính chaát khueách taùn vaø hoaø tan caùc chaát khaùc maø CO2 ôû traïng thaùi dense phase coù theå tieâu dieät vi sinh vaät vaø ñöôïc aùp duïng vaøo kyõ thuaät thanh truøng, tieät truøng môùi khoâng duøng nhieät ñoä cao. 2.3. ÖÙng duïng cuûa CO2 sieâu tôùi haïn CO2 sieâu tôùi haïn ñöôïc öùng duïng nhieàu laøm dung moâi trích ly caùc hôïp chaát öa beùo beân trong caùc nguyeân lieäu nhö haït, caùc loaïi quaû, taûo… Beân caïnh ñoù noù coøn ñöôïc söû duïng ñeå tinh saïch caùc saûn phaåm daàu moû, caùc hôïp chaát nhö lecithine… CO2 sieâu tôùi haïn coøn ñöôïc duøng laøm moâi tröôøng phaûn öùng trong moät soá thieát bò phaûn öùng. Moät trong nhöõng öùng duïng cuûa CO2 sieâu t ôùi haïn ñöôïc nghieân cöùu nhieàu nhaát hieän nay laø söû duïng CO2 sieâu tôùi haïn ñeå thanh truøng, tieät truøng caùc loaïi nguyeân lieäu khaùc nhau trong saûn xuaát thöïc phaåm, döôïc phaåm… Töông lai ñaây seõ laø moät kyõ thuaät nhieàu trieån voïng thay theá caùc kyõ thuaät thanh truøng, tieät truøng truyeàn thoáng nhö duøng nhieät ñoä cao vaø hoùa chaát. 2.4. Ñònh nghóa veà kyõ thuaät DPCD Kyõ thuaät DPCD ñöôïc ñònh nghóa laø kyõ thuaät söû duïng CO2 ôû traïng thaùi dense phase ñeå xöû lyù thöïc phaåm nhaèm öùc cheá vaø tieâu dieät caùc vi sinh vaät coù haïi, voâ hoaït caùc enzyme vaø keùo daøi thôøi gian baûo quaûn saûn phaåm. Tuy nhieân, hieän nay, ñònh nghóa kyõ thuaät DPCD khoâng chæ döøng laïi ôû phaïm vi söû duïng CO2 ôû traïng thaùi dense phase maø coøn môû roäng ra caùc kyõ thuaät duøng CO2 ôû aùp suaát cao ñeå xöû lyù thöïc phaåm. Vì vaäy, teân goïi DPCD söû duïng trong ñoà aùn naøy bao goàm caû kyõ thuaät DPCD chính xaùc theo ñònh nghóa vaø caùc kyõ thuaät duøng CO2 aùp suaát cao. Ñoà aùn Coâng ngheä Thöïc phaåm 15 2.5. Öu nhöôïc ñieåm cuûa kyõ thuaät DPCD 2.5.1. Öu ñieåm Haàu heát caùc nghieân cöùu veà kyõ thuaät DPCD ñeàu thoáng nhaát vôùi nhau veà caùc öu ñieåm noåi baät cuûa kyõ thuaät naøy trong vieäc thanh truøng, tieät truøng thöïc phaåm. Moät soá öu ñieåm coù theå keå ñeán nhö sau:
Ñieåm ñaàu tieân ñaùng chuù yù ñeán cuûa kyõ thuaät DPCD laø hieäu quaû tieâu dieät vi sinh vaät raát lôùn. So vôùi caùc kyõ thuaät thanh truøng, tieät truøng khaùc thì saûn phaåm sau khi xöû lyù baèng kyõ thuaät DPCD cho thaáy löôïng vi sinh vaät toång soá treân maãu nguyeân lieäu thaáp hôn nhieàu. Nguyeân nhaân cuûa aûnh höôûng treân laø do taùc duïng cuûa nhieàu yeáu toá cuøng moät luùc, ñaëc bieät laø khaû naêng bieán tính maøng teá baøo vaø trích ly teá baøo chaát cuûa CO2 ôû traïng thaùi dense phase. Neáu chæ söû duïng aùp suaát cao thì hieäu quaû öùc cheá vi sinh vaät khoâng toát baèng do teá baøo chæ chòu taùc ñoäng duy nhaát bôûi aùp suaát (coù theå keå theâm nhieät ñoä) vaø cuõng caàn moät aùp suaát raát cao ñeå ñaït ñöôïc hieäu quaû mong muoán. Maët khaùc, trong caùc loaïi khí ôû traïng thaùi dense phase thì CO2 laø loaïi khí cho hieäu quaû tieâu dieät vi sinh vaät cao hôn haún caùc khí khaùc chuùng khoù di chuyeån qua maøng teá baøo vi sinh vaät cuõng nhö khoâng coù taùc duïng giaûm pH moâi tröôøng vaø pH noäi baøo nhö CO2. Vieäc laøm giaûm pH baèng caùc loaïi axit nhö axit phosphoric, axit HCl cuõng nhö vieäc boå sung caùc loaïi phuï gia choáng vi sinh vaät nhö SO2, acid benzoic, acid sorbic vaø muoái cuûa chuùng... khoâng theå coù taùc duïng voâ hoaït cao nhö CO2 do nhöõng chaát keå treân khoâng theå thaám qua maøng teá baøo deã daøng nhö CO2 (Damar vaø Balaban, 2006).
Hieäu quaû öùc cheá enzyme cuûa kyõ thuaät DPCD cuõng cao hôn caùc kyõ thuaät truyeàn thoáng khaùc. Nghieân cöùu voâ hoaït enzyme polyphenol oxidase ôû toâm huøm cuûa Chen vaø coäng söï (1992) cho thaáy hoaït tính enzyme trong maãu chænh pH coøn 35% sau 30 phuùt, trong khi ñoù hoaït tính trong maãu xöû lyù baèng DPCD maát gaàn nhö hoaøn toaøn chæ sau 1 phuùt. Nhieàu nghieân cöùu khaùc cuõng cho thaáy, neáu chæ duøng nhieät ñoä hoaëc aùp suaát cao thì hieäu quaû öùc cheá enzyme khoâng toát nhö xöû lyù baèng kyõ thuaät DPCD Ñoà aùn Coâng ngheä Thöïc phaåm 16
Chaát löôïng caûm quan cuûa saûn phaåm veà maøu saéc, muøi vò, caáu truùc sau khi xöû lyù baèng DPCD toát hôn so vôùi caùc kyõ thuaät truyeàn thoáng khaùc. Do nhieät ñoä tieán haønh kyõ thuaät DPCD khoâng cao neân haïn cheá ñöôïc nhöõng bieán ñoåi baát lôïi do nhieät gaây ra nhö söï bieán maøu, taïo muøi vò khoâng mong muoán. Maët khaùc, aùp suaát cuûa kyõ thuaät DPCD cuõng khoâng cao neáu nhö so saùnh vôùi kyõ thuaät aùp suaát thuyû tónh cao (High Hydrostatic Pressure – HHP), do ñoù maø caáu truùc cuûa saûn phaåm cuõng khoâng bò bieán ñoåi ñaùng keå.
Thaønh phaàn dinh döôõng cuûa saûn phaåm ít bò bieán ñoåi, ít thaát thoaùt caùc caáu töû maãn caûm vôùi nhieät ñoä, caùc chæ tieâu hoaù lyù khaùc nhö haøm löôïng chaát khoâ, pH, haøm löôïng acid toång haàu nhö khoâng thay ñoåi. Chaát löôïng veà caûm quan vaø dinh döôõng toát sau khi xöû lyù laø öu ñieåm noåi baät khi aùp duïng kyõ thuaät DPCD.
Khí CO2 söû duïng trong kyõ thuaät DPCD khoâng gaây ñoäc, gaây chaùy noå, reû tieàn vaø coù theå taùi söû duïng laïi trong quaù trình xöû lyù baèng DPCD. Ngoaøi ra, CO2 ôû traïng thaùi dense phase coøn coù nhöõng tính chaát hoaù lyù phuø hôïp taïo ñöôïc hieäu quaû thanh truøng, tieät truøng cao hôn so vôùi caùc loaïi khí khaùc cuøng traïng thaùi.
Khaû naêng côù giôùi hoaù, töï ñoäng hoaù cao. Nhôø caùc öu ñieåm treân maø kyõ thuaät DPCD ñöôïc coi laø coù trieån voïng trong töông lai, thay theá caùc kyõ thuaät truyeàn thoáng khaùc. 2.5.2. Nhöôïc ñieåm Ngoaøi caùc öu ñieåm keå treân, kyõ thuaät DPCD cuõng toàn taïi moät soá nhöôïc ñieåm:
Chi phí ñaàu tö trang thieát bò cao.
Do taùc duïng cuûa aùp suaát cao neân tuoåi thoï thieát bò chòu aûnh höôûng nhieàu, yeâu caàu ñoä beàn cuûa thieát bò cuõng taêng leân ñaùng keå.
Phaïm vi öùng duïng chöa roäng raõi do quaù trình xöû lyù caùc maãu daïng raén gaëp khoù khaên.
Vieäc vaän haønh heä thoáng töông ñoái phöùc taïp. Trong soá caùc nhöôïc ñieåm keå treân thì vaán ñeà chi phí thieát bò cao ñang laø nhöôïc ñieåm lôùn cuûa kyõ thuaät DPCD. Vieäc öùng duïng kyõ thuaät naøy trong saûn xuaát ñoøi hoûi phaûi coù söï tính toaùn caân ñoái giöõa chi phí caàn thieát ñeå caûi thieän caùc chæ tieâu quan Ñoà aùn Coâng ngheä Thöïc phaåm 17 troïng veà caûm quan nhö maøu saéc, muøi vò vaø keùo daøi thôøi gian baûo quaûn nhôø kyõ thuaät DPCD vaø giaù caû saûn phaåm treân thò tröôøng. Ñoà aùn Coâng ngheä Thöïc phaåm 18 Chöông 3 CAÙC BIEÁN ÑOÅI CUÛA THÖÏC PHAÅM KHI XÖÛ LYÙ BAÈNG KYÕ THUAÄT DPCD 3.1. Bieán ñoåi sinh hoïc Kyõ thuaät DPCD ñaõ ñöôïc chöùng minh laø coù khaû naêng tieâu dieät vi sinh vaät coù maët trong nguyeân lieäu daïng loûng vaø daïng raén. DPCD coù theå voâ hoaït vi sinh vaät ôû daïng teá baøo sinh döôõng, daïng baøo töû, caùc loaïi vi khuaån chòu nhieät vaø caùc loaïi naám men, naám moác. Kyõ thuaät naøy coù theå seõ daàn daàn thay theá kyõ thuaät duøng nhieät ñoä cao trong moät soá saûn phaåm caàn giöõ ñöôïc caùc tính chaát hoaù lyù veà caáu truùc cuõng nhö caùc tính chaát caûm quan nhö maøu saéc, muøi vò… Coù nhieàu cô cheá lieân quan ñeán khaû naêng voâ hoaït vi sinh vaät cuûa kyõ thuaät DPCD, tuy nhieân ñeán naøy vaãn chöa roõ cô cheá naøo laø chuû yeáu. Moät soá cô cheá ñaõ ñöôïc chöùng minh nhö sau: 3.1.1. Cô cheá voâ hoaït teá baøo sinh döôõng 3.1.1.1. Taùc duïng giaûm pH CO2 coù theå laøm giaûm pH khi hoaø tan vaøo nöôùc coù trong thöïc phaåm vaø hình thaønh acid carbonic. Khi phaân ly, acid naøy taïo ra caùc ion bicarbonate, carbonate vaø H+ laøm giaûm pH moâi tröôøng. CO2 + H2O ↔ H2CO3 H2CO3 ↔ H+ + HCO3- pKa = 6,57 HCO3- ↔ H+ + CO32- pKa = 10,62 Ñoà aùn Coâng ngheä Thöïc phaåm 19 pH ño pH döï ñoaùn pH quaù trình Hình 3.1: pH cuûa nöôùc xöû lyù vôùi CO2 aùp suaát cao pH noäi baøo cuûa vi sinh vaät coù aûnh höôûng lôùn ñeán khaû naêng sinh tröôûng vaø phaùt trieån cuûa chuùng. Khi moâi tröôøng ngoaøi dö H2CO3 thì chuùng seõ thaám qua maøng teá baøo döôùi daïng khoâng phaân ly. Vaøo beân trong teá baøo, H2CO3 seõ phaân ly taïo ra H+ laøm giaûm pH noäi baøo. Teá baøo seõ töï chænh pH noäi baøo veà vôùi giaù trò phuø hôïp baèng caùch bôm ion H+ ra ngoaøi moâi tröôøng. Ñaây laø cô cheá vaän chuyeån chuû ñoäng ñeå ñaåy H+ ra khoûi teá baøo nhôø xuùc taùc cuûa enzyme vaän chuyeån H+-ATPase vaø naêng löôïng do ATP cung caáp. Khi coù quaù nhieàu H2CO3 traøn vaøo, cô cheá bôm H+ seõ khoâng coøn hieäu quaû do phaûi tieâu hao nhieàu naêng löôïng ñeå ñaït pH caân baèng. Keát quaû laø pH noäi baøo seõ giaûm maø khoâng theå phuïc hoài ñöôïc nöõa (Damar vaø Balaban, 2006; Hong vaø Pyun, 1999). Taùc duïng giaûm pH noäi baøo coù theå laøm voâ hoaït teá baøo thoâng qua vieäc laøm roái loaïn heä thoáng trao ñoåi chaát cuûa teá baøo do öùc cheá hoaït ñoäng cuûa moät soá enzyme. Caùc enzyme cuûa heä thoáng trao ñoåi chaát seõ bò aûnh höôûng vôùi möùc ñoä khaùc nhau tuøy vaøo loaïi enzyme vaø gioáng vi sinh vaät. Ñoái vôùi vi khuaån Escherichia coli, caùc enzyme coù ñieåm ñaúng ñieän trong vuøng acid nhö alkaline phosphatase vaø β-galactosidase bò voâ hoaït hoaøn toaøn, trong khi ñoù caùc enzyme coù ñieåm ñaúng ñieän trong vuøng base nhö acid phosphatase chæ bò aûnh höôûng raát ít (Ballestra vaø coäng söï, 1996). Nghieân cöùu cuûa Hong vaø Pyun (2001) ñaõ chöùng minh khoaûng 13 enzyme khaùc nhau cuûa vi Ñoà aùn Coâng ngheä Thöïc phaåm 20 khuaån Lactobacillus plantarum döôùi ñieàu kieän xöû lyù baèng DPCD taïi nhieät ñoä 30oC vaø aùp suaát 7 MPa, trong ñoù coù cystein arylamidase, α-galactosidase, α- vaø β- glucosidase, N-acetyl-β-glucosaminidase maát hoaït tính ñaùng keå coøn caùc enzyme lipase, leucine arylamidase, acid vaø alkaline phosphatase vaø Naphthol-AS-BI- phosphohydrolase ít bò aûnh höôûng. Khaû naêng soáng soùt cuûa L. plantarum giaûm hôn 90%. Baûng 3.1: Söï thay ñoåi hoaït tính moät soá enzyme cuûa vi khuaån Lactobacillus plantarum sau khi xöû lyù baèng kyõ thuaät DPCD Tuy nhieân, cho ñeán naøy, haàu nhö chöa coù nghieân cöùu naøo ñöa ñeán keát luaän söï voâ hoaït cuûa enzyme naøo seõ aûnh höôûng chuû yeáu ñeán söï soáng cuûa vi sinh vaät. Vì vaäy nhöõng nghieân cöùu tìm hieåu vai troø cuûa caùc enzyme ñoái vôùi söï soáng cuûa teá baøo vaãn tieáp tuïc ñöôïc thöïc hieän. Vieäc phaùt hieän enzyme naøo ñoùng vai troø quyeát ñònh ñoái vôùi söï soáng cuûa teá baøo laø raát quan troïng vì töø ñoù ta coù theå tieâu dieät vi sinh vaät thoâng qua vieäc taäp trung tieâu dieät caùc enzyme naøy (Damar vaø Balaban, 2006; Spilimbergo vaø Bertucco, 2003; Hong vaø Pyun,2001). Taùc duïng laøm giaûm pH cuûa CO2 ban ñaàu ñöôïc cho laø cô cheá voâ hoaït vi sinh vaät chính. Hieän nay, nhöõng cô cheá khaùc ñaõ ñöôïc chöùng minh laø coù aûnh höôûng lôùn ñeán hieäu quaû voâ hoaït vi sinh vaät hôn laø aûnh höôûng cuûa pH. Tuy nhieân coù moät ñieàu maø haàu heát caùc nhaø khoa hoïc ñeàu ñoàng yù laø taùc duïng giaûm pH chæ coù ñöôïc chæ khi CO2 hoaø tan vaøo nöôùc ñeå hình thaønh axit carbonic vôùi moät noàng ñoä ñaùng keå (Spilimbergo vaø Bertucco, 2003). Ñoà aùn Coâng ngheä Thöïc phaåm 21 3.1.1.2. Taùc duïng cuûa phaân töû CO2 vaø ion bicarbonate Moät soá enzyme thieát yeáu trong boä maùy trao ñoåi chaát cuûa vi sinh vaät coù theå bò voâ hoaït bôûi taùc duïng cuûa phaân töû CO2. Taïi pH thaáp, caùc nhoùm amino cuûa caùc enzyme naøy taùc duïng vôùi CO2 taïo thaønh caùc muoái bicarbonate vaø caùc hôïp chaát carbamate vaø laøm maát hoaït tính cuûa enzyme. Moät ví duï ñieån hình laø enzyme decarboxylase bò voâ hoaït do taùc duïng naøy vaø vì theá maø chuoãi phaûn öùng trong heä thoáng trao ñoåi chaát bò giaùn ñoaïn, khoâng theå thöïc hieän ñöôïc (Spilimbergo vaø Bertucco, 2003). Nghieân cöùu cuûa Ishikawa vaø coäng söï (1995) cho thaáy hoaït tính cuûa caùc enzyme nhö glucoamylase vaø acid protease chæ coøn laïi raát thaáp khi ñöôïc xöû lyù baèng kyõ thuaät DPCD. Caùc nhaø khoa hoïc naøy keát luaän raèng söï voâ hoaït nhöõng enzyme treân xaûy ra laø do söï haáp thu CO2 vaøo beân trong phaân töû enzyme. Ngoaøi ra, söï keát tuûa cuûa caùc muoái carbonate cuûa Ca vaø Mg beân trong teá baøo cuõng coù theå laøm voâ hoaït vi sinh vaät. Caùc protein chöùa nhöõng caàu noái Ca laø moät trong nhöõng loaïi protein quan troïng nhaát ñoái vôùi teá baøo. Do taùc duïng cuûa CO2, caùc protein chöùa caàu noái Ca, Mg seõ bò keát tuûa. Ñieàu naøy phuï thuoäc vaøo ñaëc ñieåm cuûa lieân keát ion vaø caáu truùc protein. Khi söï keát tuûa xaûy ra, hoaït ñoäng soáng cuûa teá baøo bò roái loaïn (Damar vaø Balaban, 2006). 3.1.1.3. Taùc duïng phaù vôõ teá baøo Cô cheá voâ hoaït vi sinh vaät ñöôïc keát luaän ñaàu tieân bôûi kyõ thuaät DPCD laø söï phaù vôõ caáu truùc teá baøo. Nguyeân nhaân teá baøo bò vôõ laø do söï giaûi phoùng aùp suaát moät caùch ñoät ngoät vaø söï giaõn nôû cuûa CO2 beân trong teá baøo (Fraser, 1951). Nakamura vaø coäng söï (1994) ñaõ duøng kyõ thuaät DPCD xöû lyù naám men ôû 40oC döôùi aùp suaát 4 MPa trong thôøi gian 5 giôø vaø keát luaän raèng sau khi xöû lyù, moät soá teá baøo bò vôõ hoaøn toaøn, trong khi ñoù moät soá khaùc chæ bò nhöõng veát söôùt nhoû hoaëc xuaát hieän nhöõng loã hoång treân beà maët teá baøo. Nghieân cöùu cuûa Ballestra (1996) vaø coäng söï veà taùc ñoäng cuûa kyõ thuaät DPCD leân vi khuaån E.coli trong ñieàu kieän aùp suaát 5 MPa vaø nhieät ñoä 35oC cho keát quaû l aø hôn 25% teá baøo khoâng bò taùc ñoäng cuûa DPCD l aøm thöông toån nhöng khaû naêng soáng chæ coøn khoaûng 1%. Tuy nhieân, nghieân cöùu cuûa Hong vaø caùc coäng söï (2001) laïi ñöa ra keát luaän laø khoâng theå taêng hieäu quaû voâ hoaït vi sinh vaät baèng caùch gia taêng cöôøng ñoä giaûi phoùng CO2 hay giaûi phoùng nhanh aùp suaát. Hong vaø Puyn (1999) cho thaáy raèng vi khuaån L. plantarum xöû lyù baèng CO2 (6,8 MPa, 30oC trong Ñoà aùn Coâng ngheä Thöïc phaåm 22 voøng 60 phuùt) bò voâ hoaït hoaøn toaøn nhöng kính hieån vi ñieän töû queùt laïi khoâng cho thaáy baát kyø söï toån thöông naøo veà caáu truùc. Ngöôøi ta coù theå ñaùnh giaù möùc ñoä voâ hoaït gaây ra bôûi caùc thöông t oån treân beà maët teá baøo do kyõ thuaät DPCD baèng caùch ñeám tröïc tieáp caùc teá baøo vôõ treân kính hieån vi. Caùch naøy chæ cho keát quaû toång soá teá baøo vôõ maø khoâng cho bieát soá teá baøo thöïc söï bò aûnh höôûng cuõng nhö tyû leä soáng soùt. Lin vaø coäng söï (1991) ñaõ duøng haøm löôïng protein toång giaûi thoaùt khoûi teá baøo xöû lyù baèng DPCD ñeå ñaùnh giaù möùc ñoä thöông toån. Söï giaûi phoùng protein noäi baøo vaøo moâi tröôøng phuï thuoäc vaøo kích thöôùc loã hoång treân maøng teá baøo. Ñeå quan saùt hình thaùi caùc teá baøo sau khi xöû lyù nhôø kyõ thuaät DPCD, ngöôøi ta söû duïng kính hieån vi queùt eletron (SEM). Maãu khoâng xöû lyù baèng DPCD Maãu xöû lyù baèng DPCD Hình 3.2: Aûnh chuïp caùc teá baøo Saccharomyces cerevisiae trong caùc maãu khoâng xöû lyù vaø coù xöû lyù DPCD (27,5 MPa, 21oC, 5 phuùt vôùi tyû leä CO2/ bia l aø 0,1) nhôø kyõ thuaät chuïp aûnh queùt electron (SEM micrograph) Hình 3.2 cho thaáy, sau khi xöû lyù baèng DPCD, moät soá teá baøo vò vôõ vaø xuaát hieän caùc loã hoång treân beà maët. Moät soá teá baøo bò nhöõng loã hoång khaù lôùn, trong khi soá khaùc chæ xuaát hieän nhöõng loã hoång nhoû. Thoâng qua caùc loã hoång naøy maø caùc chaát noäi baøo thoaùt ra ngoaøi vaø löôïng chaát noäi baøo thoaùt ra moâi tröôøng cuõng khaùc nhau tuøy vaøo kích thöôùc loã hoång treân maøng teá baøo. Tuy nhieân cô cheá treân cho thaáy nhöõng thieáu soùt trong vieäc giaûi thích nguyeân nhaân teá baøo bò öùc cheá döôùi taùc duïng cuûa kyõ thuaät DPCD: moät löôïng lôùn teá baøo Ñoà aùn Coâng ngheä Thöïc phaåm 23 khoâng coù baát kyø daáu hieäu toån thöông caáu truùc naøo nhö bò vôõ, thuûng beà maët... nhöng vaãn bò voâ hoaït. Hieän nay, giaû thuyeát haàu heát teá baøo vi sinh vaät bò voâ hoaït trong giai ñoaïn giaûi phoùng aùp suaát vaãn coøn toàn taïi nhieàu tranh caõi. Moät soá nghieân cöùu cho thaáy coù söï phaù vôõ caáu truùc teá baøo ôû möùc ñoä cao laøm voâ hoaït vi sinh vaät, trong khi ñoù, moät soá nghieân cöùu khaùc laïi keát luaän ñieàu ngöôïc laïi: söï giaûi phoùng aùp suaát ñoä ngoät khoâng ñoùng vai troø chính trong söï voâ hoaït vi sinh vaät maø phaûi coù moät cô cheá khaùc. 3.1.1.4. Taùc duïng bieán tính maøng teá baøo vaø trích ly teá baøo chaát CO2 khi toàn taïi ôû traïng thaùi dense phase seõ coù tính chaát nhö moät dung moâi, vì vaäy maø chuùng coù khaû naêng trích ly caùc teá baøo chaát vaø laøm bieán tính maøng teá baøo (Damar vaø Balaban, 2006; Spilimbergo vaø Bertucco, 2003; Hong vaø Pyun,2001). Nhö chuùng ta ñaõ bieát, maøng teá baøo laø moät maøng keùp, phaàn öa beùo cuûa caùc phospholipid höôùng vaøo nhau vaø phaàn öa nöôùc höôùng ra ngoaøi. Nhö vaäy, phaàn ngoaøi maøng vaø trong maøng laø phaàn öa nöôùc. Caùc phaân töû CO2 trong traïng thaùi dense phase coù khaû naêng khueách taùn, tính linh ñoäng cao neân coù theå deã daøng thaám qua maøng teá baøo vaø töông taùc vôùi thaønh phaàn öa beùo naèm giöõa maøng, laøm bieán tính maøng teá baøo vaø giaûm tính nhaïy caûm cuûa maøng (caùc nhaø khoa hoïc goïi hieän töôïng naøy laø “hieäu öùng gaây teâ”). Do hieäu öùng naøy maø maøng teá baøo trôû neân loûng leûo, tính thaám taêng, cô cheá vaän chuyeån proton chuû ñoäng cuûa teá baøo bò phaù vôõ vaø löôïng CO2 tích luõy beân trong teá baøo seõ taêng leân. Moät khi CO2 ñaõ thaám qua maøng teá baøo, noù coù theå trích ly caùc thaønh phaàn noäi baøo vaø vaän chuyeån chuùng ra ngoaøi, ñaëc bieät laø trong giai ñoaïn giaûi phoùng aùp suaát thì löôïng chaát trích ly ra moâi tröôøng taêng leân ñaùng keå. Söï trích ly caùc thaønh phaàn soáng vaø caùc lipid noäi baøo vaø maøng laøm voâ hoaït teá baøo vi sinh vaät. Theâm vaøo ñoù, do taùc duïng laøm cho maøng trôû neân loûng leûo vaø deã thaám neân hieäu quaû trích ly seõ caøng taêng. Keát quaû nghieân cöùu cuûa Hong vaø Pyun (1999) tieán haønh treân vi khuaån L. plantarum keát luaän raèng cô cheá voâ hoaït vi sinh vaät khoâng lieân quan ñeán söï phaù huûy caáu truùc teá baøo trong quaù trình giaûi phoùng aùp suaát chính laø cô cheá bieán tính maøng teá baøo vaø trích ly teá baøo chaát. AÛnh SEM cho thaáy teá baøo khoâng coù söï thay ñoåi naøo lôùn sau khi xöû lyù baèng DPCD vaø hình daùng beân ngoaøi cuûa teá baøo khoâng coù daáu hieäu bieán tính. Tuy nhieân, phim chuïp baèng kyõ thuaät chuïp aûnh chuyeån electron (TEM) laïi Ñoà aùn Coâng ngheä Thöïc phaåm 24 cho thaáy coù söï bieán tính maøng teá baøo cuøng vôùi söï thaát thoaùt cuûa teá baøo chaát, cuï theå laø khoaûng khoâng bao boïc giöõa thaønh teá baøo vaø maøng teá baøo chaát trôû neân lôùn hôn vaø coù nhöõng choã troáng beân trong teá baøo chaát (hình 3.3). Keát quaû laø teá baøo sau khi xöû lyù DPCD seõ chòu nhöõng aûnh höôûng baát lôïi khoâng theå phuïc hoài nhö maát khaû naêng chòu muoái, thaát thoaùt caùc hôïp chaát haáp thuï tia UV, thaát thoaùt caùc ion noäi baøo, suy yeáu khaû naêng thaám proton... Hình 3.3: AÛnh chuïp teá baøo Lactobacillus plantarum tröôùc vaø sau khi xöû lyù baèng kyõ thuaät DPCD nhôø kyõ thuaät chuïp aûnh chuyeån electron (TEM) a) Maãu khoâng xöû lyù baèng DPCD b) vaø c) Teá baøo Lactobacillus plantarum xöû lyù baèng DPCD (7 MPa, 30oC, 1 giôø) Nghieân cöùu sau naøy cuûa hai nhaø khoa hoïc treân cuõng vôùi ñoái töôïng vi khuaån L. plantarum xöû lyù baèng DPCD (7 Mpa, 30oC) vaøo naêm 2001 cuõng ñaõ cuûng coá giaû thuyeát veà t aùc duïng bieán tính maøng teá baøo, trích ly caùc chaát noäi baøo ra moâi tröôøng cuûa kyõ thuaät DPCD, do ñoù maø coù theå tìm thaáy söï coù maët cuûa amino acid, peptide, caùc lipid treân maøng vaø caùc ion trong moâi tröôøng ngoaïi baøo. Trong nghieân cöùu naøy, Hong vaø Pyun ñaõ tieán haønh phaân tích caùc hôïp chaát coù khaû naêng haáp thuï tia UV vaø caùc ion nhö K+ vaø Mg2+ trong moâi tröôøng ngoaïi baøo trong suoát quaù trình xöû lyù. Keát quaû ñöôïc theå hieän treân 2 ñoà thò sau: Ñoà aùn Coâng ngheä Thöïc phaåm 25 Thôøi gian xöû lyù (phuùt) Ñoä haáp thu (OD 260, 280) Hình 3.4: Haøm löôïng caùc chaát haáp thu tia UV trích ly ra moâi tröôøng trong quaù trình xöû lyù L. plantarum baèng DPCD Thôøi gian xöû lyù (phuùt) Haøm löôïng K+ Mg2+ (% so vôùi haøm löôïng toång) Hình 3.5: Haøm löôïng caùc ion noäi baøo trích ly ra moâi tröôøng trong quaù trình xöû lyù L. plantarum baèng DPCD. Keát quaû cho thaáy, noàng ñoä caùc chaát haáp thu tia UV cuõng nhö noàng ñoä caùc ion K+ vaø Mg2+ trong moâi tröôøng ngoaïi baøo taêng daàn theo thôøi gian vaø gaàn nhö oån ñònh sau 20 phuùt. Nhö vaäy, keát quaû phaân tích cho thaáy coù söï giaûi phoùng caùc chaát noäi baøo ra moâi tröôøng. Tuy nhieân, söï giaûi phoùng naøy khoâng phaûi do caáu truùc teá baøo bò phaù vôõ maø laø do taùc duïng bieán tính maøng teá baøo vaø trích ly teá baøo chaát cuûa DPCD. Ñoà aùn Coâng ngheä Thöïc phaåm 26 Nhieàu nghieân cöùu khaùc cuõng ñaõ ñöôïc tieán haønh vaø ñöa ra moät soá giaû thuyeát vaø keát luaän veà cô cheá voâ hoaït vi sinh vaät cuûa kyõ thuaät DPCD maø noäi dung cuûa chuùng cuõng taäp trung vaøo caùc cô cheá noùi treân. Nghieân cöùu cuûa Dagan vaø Balaban duøng kyõ thuaät DPCD ñeå thanh truøng bia (2006) döôùi ñieàu kieän aùp suaát 27,6 MPa t aïi nhieät ñoä 21oC trong voøng 5 phuùt ñöa ra keát luaän laø haàu heát caùc teá baøo naám men ñeàu coù hieän töôïng co ngoùt. Nguyeân nhaân cuûa hieän töôïng naøy ñöôïc hai nhaø khoa hoïc lyù giaûi laø do CO2 trong ñieàu kieän dense phase ñaõ trích ly moät phaàn teá baøo chaát cuûa naám men ra moâi tröôøng ngoaøi. Beân caïnh ñoù, nghieân cöùu naøy cuõng cho thaáy coù söï toån thöông veà maët caáu truùc cuûa teá baøo naám men: moät soá teá baøo bò vôõ, soá khaùc thì coù caùc veát thöông treân maøng. Shimoda vaø coäng söï nghieân cöùu aûnh höôûng cuûa DPCD leân khaû naêng soáng cuûa teá baøo vi sinh vaät (1998) cuõng ñöa ra caùc keát luaän veà taùc duïng laøm giaûm pH noäi baøo, bieán tính maøng teá baøo vaø trích ly teá baøo chaát cuûa kyõ thuaät naøy. Ngoaøi ra, nghieân cöùu coøn khaúng ñònh caùc teá baøo naám men S. cerevisiae sau khi xöû lyù baèng DPCD (6 MPa, 35oC) bò vôõ do söï giaõn nôû cuûa CO2 beân trong teá baøo trong quaù trình giaûi phoùng aùp suaát. Keát quaû laø caùc chaát noäi baøo thoaùt ra moâi tröôøng ngoaøi vaø laøm cho haøm löôïng caùc chaát coù khaû naêng haáp thu tia UV cuûa moâi tröôøng xöû lyù taêng leân ñaùng keå. Ngoaøi maãu thöïc phaåm loûng, kyõ thuaät DPCD coøn ñöôïc duøng ñeå xöû lyù maãu daïng raén. Nghieân cöùu cuûa Hong vaø coäng söï duøng DPCD ñeå öùc cheá vi khuaån Lactobacillus sp. treân saûn phaåm kimchi (1997) döôùi caùc ñieàu kieän xöû lyù khaùc nhau cuõng ñöa ra nhöõng giaûi thích töông töï veà nguyeân nhaân gaây voâ hoaït vi sinh vaät. Theo keát luaän cuûa nghieân cöùu naøy thì cuõng coù nhieàu cô cheá öùc cheá vaø tieâu dieät vi sinh vaät nhôø kyõ thuaät DPCD, trong ñoù bao goàm vieäc giaûm pH noäi baøo do acid carbonic vaän chuyeån qua maøng vaøo teá baøo roài phaân ly sinh ra H+, cô cheá bieán tính maøng lipid keùp cuûa teá baøo daãn ñeán “hieäu öùng gaây teâ” vaø trích ly caùc chaát noäi baøo cuûa vi sinh vaät ra moâi tröôøng ngoaøi. Nghieân cöùu cuõng ñi ñeán keát luaän laø kyõ thuaät DPCD coù theå ñöôïc söû duïng nhö laø moät kyõ thuaät thanh truøng khoâng duøng nhieät ñeå baûo quaûn kimchi. Maëc duø ñöa ra nhöõng cô cheá voâ hoaït vi sinh vaät nhö treân, tuy vaäy vaãn chöa theå keát luaän cô cheá naøo laø cô cheá chuû yeáu. Caùc nhaø khoa hoïc ñeàu cho raèng taùc duïng voâ hoaït vi sinh vaät chuû yeáu laø do taùc duïng cuûa CO2. Vieäc laøm giaûm pH baèng caùc loaïi axit nhö axit phosphoric, axit HCl khoâng theå coù taùc duïng voâ hoaït cao nhö CO2 Ñoà aùn Coâng ngheä Thöïc phaåm 27 (Damar vaø Balaban, 2006). Nhöõng axit naøy khoâng theå thaám qua maøng teá baøo deã daøng nhö CO2. Khaû naêng thaám qua maøng teá baøo ñöôïc cho laø taùc duïng chính trong vieäc giaûm pH noäi baøo. CO2 laøm voâ hoaït haàu nhö hoaøn toaøn caùc vi sinh vaät, trong khi ñoù HCl thì khoâng theå. Tính thaám cuõng nhö khaû naêng taùc duïng nhö moät dung moâi hoøa tan cuûa CO2 trong ñieàu kieän dense phase laøm bieán tính maøng teá baøo daãn ñeán “hieäu öùng gaây teâ” ñöôïc cho laø ñoùng vai troø chính trong vieäc voâ hoaït vi sinh vaät. Ñoà aùn Coâng ngheä Thöïc phaåm 28 Baûng 3.2: Moät soá keát quaû nghieân cöùu khaû naêng voâ hoaït caùc chuûng vi sinh vaät khaùc nhau baèng kyõ thuaät DPCD Ñoà aùn Coâng ngheä Thöïc phaåm 29 Baûng 3.2 (tt) Ñoà aùn Coâng ngheä Thöïc phaåm 30 3.1.2. Cô cheá voâ hoaït baøo töû Moät soá vi khuaån coù khaû naêng saûn sinh moät theå nghæ ñöôïc goïi laø baøo töû döôùi taùc duïng cuûa ñieàu kieän baát lôïi. Baøo töû coù tính khaùng nhieät, khaùng böùc xaï, khaùng hoùa chaát vaø khaùng aùp suaát thaåm thaáu cao hôn so vôùi caùc teá baøo sinh döôõng. Chaúng haïn nhö baøo töû cuûa vi khuaån Clostridium botulinum phaûi xöû lyù ôû 121oC trong voøng 10 phuùt môùi cheát, teá baøo sinh döôõng cuûa vi khuaån Clostridium thermosaccharolytium ôû 50oC cheát raát nhanh nhöng baøo töû cuûa noù thì ngay caû ôû nhieät ñoä 130oC cuõng chæ dieät ñöôïc 90%. Baøo töû coù tính beàn vöõng nhö vaäy laø do maøng cuûa chuùng laø moät caáu truùc phöùc taïp vaø vöõng chaéc bao goàm maøng ngoaøi, lôùp aùo baøo töû vaø lôùp voû baøo töû. Trong khi maøng teá baøo sinh döôõng coù tính linh ñoäng thì maøng baøo töû khaù trô, tính linh ñoäng keùm, tính ñeà khaùng cao vôùi lizozyme vaø caùc enzyme thuûy phaân nhö proteinase, trô vôùi caùc chaát hoùa hoïc nhö chaát hoaït ñoäng beà maët, vaø coù tính thaåm thaáu keùm ñoái vôùi caùc cation. Muoán tieâu dieät baøo töû, moät ñieàu caàn thieát phaûi laøm laø phaûi hoaït hoùa chuùng, töùc laø taïo ñieàu kieän thuaän lôïi cho chuùng naûy maàm trôû thaønh daïng teá baøo sinh döôõng thì sau ñoù môùi tieâu dieät ñöôïc. Kyõ thuaät DPCD ñaõ ñöôïc nghieân cöùu vaø keát luaän laø coù khaû naêng tieâu dieät baøo töû trong moät phaïm vi naøo ñoù. Quaù trình voâ hoaït baøo töû traûi qua hai giai ñoaïn:
Giai ñoaïn hoaït hoùa, naûy maàm: söû duïng caùc taùc nhaân nhö nhieät ñoä cao (ví duï nhö xöû lyù ôû 80oC trong voøng 10 phuùt), aùp suaát cao ñeå kích thích baøo töû naûy maàm. Döôùi taùc duïng cuûa caùc taùc nhaân treân, lôùp maøng cöùng cuûa baøo töû bò phaù vôõ, nöôùc thaám vaøo loõi baøo töû vaø hoaït hoùa caùc enzyme, toång hôïp caùc cô quan noäi baøo, ADN, ARN vaø protein môùi. Nhieàu nghieân cöùu cho raèng trong giai ñoaïn naøy nhôø söï hoã trôï cuûa nhieät ñoä vaø aùp suaát cao maø caùc phaân töû CO2 seõ deã daøng thaám qua maøng baøo töû, goùp phaàn phaù vôõ lôùp maøng daãn ñeán ñaåy nhanh toác ñoä hoaït hoùa vaø naûy maàm cuûa baøo töû.
Giai ñoaïn tieâu dieät: baøo töû sau khi ñöôïc hoaït hoùa vaø naûy maàm seõ trôû neân maãn caûm döôùi taùc duïng cuûa DPCD vaø seõ deã daøng bò tieâu dieät. Ñoà aùn Coâng ngheä Thöïc phaåm 31 Baûng 3.3: Moät soá keát quaû nghieân cöùu veà khaû naêng voâ hoaït baøo töû cuûa caùc chuûng vi sinh vaät khaùc nhau baèng kyõ thuaät DPCD Cô cheá voâ hoaït baøo töû hieän vaãn chöa roõ raøng. Giaû thuyeát cho raèng nhieät ñoä seõ laøm taêng khaû naêng thaåm thaáu cuûa CO2 vaøo beân trong baøo töû, beân caïnh ñoù ñieàu kieän xöû lyù baèng DPCD cuõng kích thích quaù trình naûy maàm cuûa baøo töû cuøng vôùi nhieät ñoä vaø caû hai yeáu toá naøy cuøng laøm taêng tính maãn caûm cuûa baøo töû, hoã trôï nhau trong vieäc tieâu dieät baøo töû. Neáu chæ duøng nhieät ñoä thì hieäu quaû tieâu dieät baøo töû khoâng cao baèng so vôùi khi söû duïng kyõ thuaät DPCD. CO2 trong ñieàu kieän dense phase vöøa coù taùc duïng gia taêng toác ñoä hoaït hoùa, naûy maàm cuûa baøo töû, vöøa ñaåy nhanh toác ñoä voâ hoaït chuùng (Damar vaø Balaban, 2006; Spilimbergo vaø Bertucco, 2003; Ballestra vaø Cuq; 1998). Do caùc baøo töû coù khaû naêng ñeà khaùng cao vôùi nhöõng taùc ñoäng baát lôïi töø moâi tröôøng neân raát khoù tieâu dieät chuùng hoaøn t oaøn. Caøng muoán naâng cao hieäu quaû voâ hoaït baøo töû thì ñieàu kieän xöû lyù phaûi caøng khaéc nghieät, haäu quaû laø chaát löôïng thöïc phaåm seõ bò aûnh höôûng moät caùch nghieâm troïng hôn. Vì vaäy, hieäu quaû cuûa kyõ thuaät DPCD trong vieäc voâ hoaït baøo töû chæ ñaït ñöôïc trong moät phaïm vi giôùi haïn. Ñoà aùn Coâng ngheä Thöïc phaåm 32 3.1.3. Caùc yeáu toá aûnh höôûng ñeán khaû naêng voâ hoaït vi sinh vaät baèng kyõ thuaät DPCD Coù nhieàu yeáu toá aûnh höôûng ñeán hieäu quaû voâ hoaït vi sinh vaät cuûa kyõ thuaät DPCD, bao goàm caùc yeáu toá veà kyõ thuaät nhö aùp suaát, nhieät ñoä, ñoä aåm...cuõng nhö caùc yeáu toá veà thieát bò vaø caùc yeáu toá veà vi sinh vaät... Nhieàu nghieân cöùu ñaõ ñöôïc tieán haønh nhaèm khaûo saùt möùc ñoä aûnh höôûng cuûa töøng yeáu toá ñeán hieäu quaû voâ hoaït chung nhaèm toái öu hoùa quaù trình vaø giaûm ñeán möùc thaáp nhaát caùc aûnh höôûng khoâng coù lôïi ñeán chaát löôïng thöïc phaåm. 3.1.3.1. Aûnh höôûng cuûa aùp suaát AÙp suaát laø moät trong nhöõng yeáu toá coâng ngheä quan troïng nhaát trong kyõ thuaät DPCD. AÙp suaát quyeát ñònh ñeán tính chaát hoùa lyù, khaû naêng khueách taùn cuõng nhö tính hoøa tan cuûa CO2. Keát quaû nghieân cöùu cuûa nhieàu taùc giaû khaùc nhau khi khaûo saùt veà aûnh höôûng cuûa aùp suaát ñeán hieäu quaû voâ hoaït vi sinh vaät cho thaáy khaû naêng voâ hoaït vi sinh vaät taêng tyû leä thuaän vôùi söï taêng aùp suaát trong moät giôùi haïn nhaát ñònh (Damar vaø Balaban, 2006; Werner and Hotchkiss, 2006; Gunes vaø coäng söï, 2005; Spilimbergo vaø Bertucco, 2003; Shimoda vaø coäng söï, 1998, 2001; Hong vaø coäng söï, 1997, 1999; Hong vaø Pyun, 1999; Louka vaø coäng söï, 1999) . Nguyeân nhaân laøm taêng hieäu quaû voâ hoaït vi sinh vaät döôùi aûnh höôûng cuûa aùp suaát laø do:
AÙp suaát cao laøm taêng khaû naêng hoøa tan cuûa CO2, daãn ñeán taêng khaû naêng thaåm thaáu cuûa CO2 vaøo teá baøo. Do löôïng CO2 thaåm thaáu taêng laøm bieán tính maøng teá baøo vaø giaûm pH noäi baøo nhanh hôn vôùi möùc ñoä cao hôn. Haàu heát moïi nghieân cöùu ñeàu thoáng nhaát veà keát luaän naøy.
AÙp suaát cao taïi nhieät ñoä tôùi haïn coøn laøm taêng khaû naêng trích ly cuûa CO2, khieán cho caùc chaát noäi baøo deã daøng ñöôïc trích ra khoûi teá baøo vaø teá baøo seõ deã bò voâ hoaït hôn (Gunes vaø coäng söï, 2005; Hong vaø coäng söï, 1997, 1999)
AÙp suaát cao seõ laøm baøo töû hoaït hoùa vaø naûy maàm nhanh hôn, töø ñoù deã daøng voâ hoaït chuùng hôn (Damar vaø Balaban, 2006; Spilimbergo vaø Bertucco, 2003; Shimoda vaø coäng söï, 2002; Ballestra vaø Cuq, 1997).
Quaù trình gi aûi phoùng aùp suaát cuõng aûnh höôûng ñeán hieäu quaû voâ hoaït vi sinh vaät: aùp suaát cao ñöôïc giaûi phoùng moät caùch ñoät ngoät veà aùp suaát thöôøng, thaäm chí veà vuøng chaân khoâng seõ laøm vôõ caáu truùc vaø tieâu dieät teá baøo. Ñoà aùn Coâng ngheä Thöïc phaåm 33 Beân caïnh ñoù, aùp suaát caøng cao thì thôøi gian xöû lyù coù theå ngaén laïi nhöng hieäu quaû voâ hoaït ñaït ñöôïc vaãn cao. Nhieàu nghieân cöùu cuõng chöùng minh raèng khi aùp suaát CO2 naèm trong vuøng dense phase (>7 MPa) thì hieäu quaû tieâu dieät vi sinh vaät seõ cao hôn nhieàu so vôùi aùp suaát ôû vuøng gaàn tôùi haïn (subcritical condition) (Damar vaø Balaban, 2006; Werner vaø Hotchkiss, 2006; Gunes vaø coäng söï, 2005; Louka vaø coäng söï, 1999). Theo Damar vaø Balaban (2006) thì aùp suaát thöôøng söû duïng trong kyõ thuaät DPCD naèm trong khoaûng döôùi 50 MPa. AÙp suaát quaù cao thì hieäu quaû voâ hoaït vi sinh vaät taêng khoâng ñaùng keå. AÙp suaát laø moät trong nhöõng thoâng soá kyõ thuaät quan troïng nhaát aûnh höôûng tröïc tieáp ñeán hieäu quaû voâ hoaït vi sinh vaät cuûa kyõ thuaät DPCD. Tuy nhieân, cuõng coù nghieân cöùu keát luaän raèng aûnh höôûng cuûa aùp suaát chæ trong moät phaïm vi giôùi haïn. AÙp suaát aûnh höôûng ñeán khaû naêng hoøa tan vaø khueách taùn cuûa CO2, nhöng khi moâi tröôøng ñaõ baõo hoøa CO2 thì vieäc taêng aùp suaát trôû neân voâ nghóa vì khi ñoù, hieäu quaû voâ hoaït vi sinh vaät cuûa kyõ thuaät DPCD taêng raát ít, khoâng ñaùng keå (Damar vaø Balaban, 2006). Nghieân cöùu cuûa Werner vaø Hotchkiss treân ñoái töôïng söõa nguyeân lieäu naêm 2006 ñaõ öùng duïng kyõ thuaät DPCD nhö moät kyõ thuaät thanh truøng môùi cho söõa thoâ nguyeân lieäu. Baèng vieäc söû duïng phöông phaùp doøng chaûy lieân tuïc (continuous flow method), nghieân cöùu ñaõ keát luaän raèng CO2 taïi aùp suaát vaø nhieät ñoä ôû vuøng dense phase seõ cho hieäu quaû tieâu dieät vi sinh vaät toát hôn so vôùi vuøng gaàn tôùi haïn (subcritical). Baûng 3.4: Toång soá khuaån laïc (ñôn vò log10, laáy giaù trò trung bình vaø ñoä leäch chuaån) treân söõa nguyeân lieäu taïi caùc nhieät ñoä, aùp suaát vaø tyû leä CO2 söû duïng. – : khoâng khaûo saùt Shimoda vaø coäng söï nghieân cöùu aûnh höôûng cuûa kyõ thuaät DPCD leân naám men S. cerevisiae (2001) cuõng khaûo saùt moät soá yeáu toá aûnh höôûng ñeán hieäu quaû voâ hoaït vi Ñoà aùn Coâng ngheä Thöïc phaåm 34 sinh vaät vaø ñöa ra keát luaän laø hieäu quaû tieâu dieät vi sinh vaät taêng cuøng vôùi vieäc taêng aùp suaát xöû lyù. Hình 3.6: Aûnh höôûng cuûa aùp suaát ñeán hieäu quaû voâ hoaït Saccharomyces cerevisiae baèng DPCD Karaman vaø Erkmen nghieân cöùu ñoäng hoïc quaù trình voâ hoaït vi khuaån E. coli treân nöôùc luoäc thòt duøng kyõ thuaät DPCD (2001) keát luaän raèng toác ñoä voâ hoaït E. coli khi aùp suaát xöû lyù caøng taêng vaø cho raèng taïi aùp suaát thaáp thì thôøi gian caàn thieát ñeå ñaït ñöôïc hieäu quaû voâ hoaït ñaùng keå caøng keùo daøi. Ñoà aùn Coâng ngheä Thöïc phaåm 35 Hình 3.7: Aûnh höôûng cuûa aùp suaát leân toác ñoä voâ hoaït vi khuaån E. coli baèng kyõ thuaät DPCD Nghieân cöùu cuûa Hong vaø Pyun veà ñoäng hoïc quaù trình voâ hoaït L. plantarum baèng kyõ thuaät DPCD naêm 1999 cuõng ñeà caäp ñeán caùc yeáu toá aûnh höôûng ñeán hieäu quaû voâ hoaït vi sinh vaät vaø ñaõ ñöa ra nhöõng keát luaän laø toác ñoä voâ hoaït vi khuaån L. plantarum taêng khi aùp suaát taêng trong ñieàu kieän nhieät ñoä 30oC. Ñoà aùn Coâng ngheä Thöïc phaåm 36 Thôøi gian xöû lyù (phuùt) Tyû leä soáng soùt N/N0 Hình 3.8: Aûnh höôûng cuûa aùp suaát ñeán toác ñoä voâ hoaït L. plantarum baèng kyõ thuaät DPCD Keát quaû treân hình 3.8 cuõng cho thaáy aùp suaát caøng cao thì thôøi gian caàn thieát ñeå ñaït ñöôïc toác ñoä voâ hoaït nhö mong muoán seõ caøng giaûm. Naêm 1997, Hong vaø caùc coäng söï khi nghieân cöùu veà voâ hoaït khuaån Lactobacillus sp. treân saûn phaåm kimchi ñaõ chöùng minh giaû thuyeát khi aùp suaát taêng thì thôøi gian xöû lyù coù theå ruùt ngaén laïi nhöng vaãn ñaûm baûo hieäu quaû tieâu dieät vi sinh vaät. Taïi nhieät ñoä 30oC, ñeå giaûm soá löôïng teá baøo toång coäng ñi 3 log thì vôùi aùp suaát CO2 laø 30 kg/m2 phaûi maát tôùi 240 phuùt, trong khi ñoù vôùi aùp suaát 70 kg/m2 thì chæ caàn khoâng ñeán 140 phuùt. Ñoà aùn Coâng ngheä Thöïc phaåm 37 Tyû leä teá baøo soáng soùt N/N0 Thôøi gian xöû lyù (phuùt) Hình 3.9: Aûnh höôûng cuùa aùp suaát ñeán hieäu quaû voâ hoaït Lactobacillus sp. treân saûn phaåm kimchi baèng kyõ thuaät DPCD Keát quaû treân hình 3.9 cuõng cho thaáy, ban ñaàu toác ñoä voâ hoaït dieãn ra khaù chaäm, sau ñoù taêng nhanh ñaùng keå. Ñieàu naøy coù theå ñöôïc giaûi thích nhö sau: ban ñaàu, caàn phaûi coù moät khoaûng thôøi gian ñeå CO2 khueách taùn vaøo beân trong teá baøo. Khi haøm löôïng CO2 beân trong teá baøo ñaõ t aêng ñeán möùc tôùi haïn (critical level) thì toác ñoä voâ hoaït seõ t aêng nhanh do noàng ñoä CO2 ñuû ñeå bieán tính maïnh meõ maøng teá baøo, gaây roái loaïn boä maùy trao ñoåi chaát thoâng qua vieäc voâ hoaït caùc enzyme vaø trích ly caùc thaønh phaàn trong teá baøo chaát. 3.1.3.2. Aûnh höôûng cuûa nhieät ñoä Cuøng vôùi aùp suaát thì nhieät ñoä cuõng laø moät thoâng soá voâ cuøng quan troïng trong kyõ thuaät DPCD. Nhieät ñoä coù nhöõng aûnh höôûng phöùc taïp ñeán hieäu quaû cuûa kyõ thuaät DPCD Nhö chuùng ta ñaõ bieát, ñoä tan cuûa khí CO2 seõ taêng khi nhieät ñoä giaûm. Nhieät ñoä taêng thì khaû naêng hoøa tan cuûa CO2 giaûm. Tuy nhieân, ñieàu naøy laïi khoâng heà laøm suy giaûm khaû naêng voâ hoaït vi sinh vaät cuûa kyõ thuaät DPCD vì nhieät ñoä taêng seõ laøm taêng khaû naêng khueách taùn vaø thaåm thaáu cuûa CO2 qua maøng teá baøo, do ñoù maø haøm löôïng Ñoà aùn Coâng ngheä Thöïc phaåm 38 CO2 hoøa tan tuy coù giaûm nhöng löôïng CO2 ñi qua maøng teá baøo laïi taêng leân. Beân caïnh ñoù, nhieät ñoä cao cuõng laøm maøng teá baøo trôû neân linh ñoäng, deã thaám khieán CO2 caøng deã daøng di chuyeån qua maøng hôn, chính vì vaäy laïi laøm taêng khaû naêng tieâu dieät vi sinh vaät (Damar vaø Balaban, 2006; Spilimbergo vaø coäng söï, 2005; Hong vaø Pyun, 1999). Theâm vaøo ñoù, nhieät ñoä taêng cuõng laøm thay ñoåi traïng thaùi cuûa CO2. Taïi aùp suaát cao treân 7 MPa vaø nhieät ñoä treân 31oC thì CO2 seõ chuyeån sang traïng thaùi dense phase, neáu nhieät ñoä vaø aùp suaát tieáp tuïc taêng cao thì CO2 seõ ñi vaøo vuøng sieâu tôùi haïn, khi ñoù thì tính thaám cuûa CO2 seõ raát cao vaø deã daøng phaùt huy taùc duïng tieâu dieät vi sinh vaät. Tuy nhieân, trong vuøng sieâu tôùi haïn thì tính thaám vaø khaû naêng hoøa tan cuõng nhö khaû naêng khueách taùn cuûa CO2 chæ taêng trong khu vöïc giôùi haïn gaàn ñieåm tôùi haïn, neáu nhieät ñoä vaø aùp suaát quaù cao so vôùi ñieåm tôùi haïn thì khaû naêng hoøa tan cuûa CO2 giaûm ñi ñaùng keå (Damar vaø Balaban, 2006; Hong vaø Pyun, 1999). Haàu heát caùc nghieân cöùu ñeàu keát luaän laø khi nhieät ñoä taêng trong moät phaïm vi giôùi haïn thì hieäu quaû voâ hoaït vi sinh vaät cuûa kyõ thuaät DPCD cuõng taêng vôùi nguyeân nhaân ñaõ trình baøy nhö treân. Nhieät ñoä taêng thì toác ñoä voâ hoaït vi sinh vaät taêng leân, thôøi gian xöû lyù coù theå ruùt ngaén (Damar vaø Balaban, 2006; Werner vaø Hotchkiss, 2006; Spilimbergo vaø Bertucco, 2003; Shimoda vaø coäng söï, 2001; Hong vaø Pyun, 1999; Hong vaø coäng söï, 1997, 1999). Ngoaøi ra, nhieät ñoä coøn goùp phaàn laøm cho baøo töû hoaït hoùa vaø naûy maàm nhanh hôn, töø ñoù cuøng vôùi aùp suaát seõ tieâu dieät chuùng deã daøng hôn (Damar vaø Balaban, 2006; Ballestra vaø Cuq, 1997). Thoâng thöôøng, nhieät ñoä aùp duïng kyõ thuaät DPCD dao ñoäng trong khoaûng töø 5oC ñeán 60 oC, hay duøng nhaát laø khoaûng nhieät ñoä töø 25-35oC (Damar vaø Murat O. Balaban, 2006). Ñoái vôùi vieäc voâ hoaït baøo töû thì nhieät ñoä caàn thieát cho quaù trình hoaït hoùa vaø naûy maàm baøo töû laø töø 80-90oC (Damar vaø Balaban, 2006; Ballestra vaø Cuq, 1997). Tuy nhieân, moät haäu quaû khoâng theå traùnh khoûi laø neáu söû duïng nhieät ñoä quaù cao thì chaát löôïng cuûa thöïc phaåm seõ bò aûnh höôûng ñaùng keå, ñaëc bieät laø caùc chæ tieâu caûm quan. Nghieân cöùu cuûa Shimoda vaø coäng söï (2001) keát luaän laø hieäu quaû tieâu dieät vi sinh vaät taêng cuøng vôùi vieäc taêng thôøi gian xöû lyù. Ñoà aùn Coâng ngheä Thöïc phaåm 39 Hình 3.10: Aûnh höôûng cuûa nhieät ñoä ñeán hieäu quaû voâ hoaït S. cerevisiae baèng DPCD. (○) 8 MPa; (●) 10 MPa Keát quaû nghieân cöùu cuûa Hong vaø Pyun veà ñoäng hoïc quaù trình voâ hoaït L. plantarum baèng kyõ thuaät DPCD (1999) cho thaáy nhieät ñoä caøng taêng thì toác ñoä voâ hoaït vi sinh vaät caøng taêng theo thôøi gian xöû lyù taïi aùp suaát 70 kg/cm2. Hình 3.11: Aûnh höôûng cuûa nhieät ñoä ñeán toác ñoä voâ hoaït L. plantarum baèng kyõ thuaät DPCD Ñoà aùn Coâng ngheä Thöïc phaåm 40 Tröôùc ñoù, naêm 1997, Hong vaø caùc coäng söï khi nghieân cöùu veà voâ hoaït khuaån Lactobacillus sp. treân saûn phaåm kimchi cuõng ñaõ keát luaän laø hieäu quaû tieâu dieät vi sinh vaät taêng cuøng vôùi söï taêng nhieät ñoä xöû lyù. Hình 3.12: Aûnh höôûng cuûa nhieät ñoä ñeán toác ñoä tieâu dieät Lactobacillus sp. treân saûn phaåm kimchi baèng kyõ thuaät DPCD (50 kg/cm2, tyû leä CO2 50%) 3.1.3.3. Thôøi gian xöû lyù Thôøi gian xöû lyù cuõng laø moät thoâng soá kyõ thuaät quan troïng trong quaù trình tieán haønh kyõ thuaät DPCD. Haàu heát moïi nghieân cöùu ñeàu keát luaän raèng thôøi gian xöû lyù caøng keùo daøi thì hieäu quaû voâ hoaït vi sinh vaät caøng cao. Cuøng vôùi aùp suaát vaø nhieät ñoä, thôøi gian xöû lyù laø moät thoâng soá ñöôïc duøng ñeå naâng cao aûnh höôûng öùc cheá, tieâu dieät vi sinh vaät cuûa kyõ thuaät DPCD. Thôøi gian keùo daøi thì nhöõng aûnh höôûng cuûa DPCD leân söï toàn taïi vaø phaùt trieån cuûa vi sinh vaät seõ dieãn ra saâu saéc hôn, daãn ñeán löôïng vi sinh vaät bò tieâu dieät nhieàu hôn. Ñieàu khieån vaø kieåm soaùt caùc thoâng soá veà thôøi gian laø voâ cuøng quan troïng trong kyõ thuaät DPCD. Neáu thôøi gian xöû lyù ñuû daøi thì xaùc suaát vi sinh vaät coøn soáng soùt sau khi xöû lyù baèng DPCD raát thaáp. Cuõng töông töï nhö quaù trình thanh, tieät truøng duøng nhieät, vaán ñeà voâ truøng tuyeät ñoái trong maãu laø khoù coù theå ñaït ñöôïc cho duø coù keùo daøi thôøi gian xöû lyù leân nhieàu laàn. Vì vaäy, caàn phaûi choïn thôøi gian toái öu t hích hôïp cho quaù trình xöû lyù baèng DPCD Ñoà aùn Coâng ngheä Thöïc phaåm 41 phuø hôïp vôùi tính chaát heä vi sinh vaät trong moãi loaïi thöïc phaåm cuõng nhö quy moâ saûn xuaát vaø ñaûm baûo hieäu quaû kinh teá cho nhaø saûn xuaát. Thöôøng heä vi sinh vaät nhieãm vaøo thöïc phaåm raát phöùc taïp, bao goàm nhieàu loaøi vi sinh vaät khaùc nhau, do ñoù maø caàn choïn ra nhöõng vi sinh vaät ñieån hình coù giaù trò D (thôøi gian tieâu dieät thaäp phaân) cao nhaát thöôøng nhieãm trong maãu laøm ñaïi dieän ñeå choïn thôøi gian xöû lyù vaø ñaùnh giaù hieäu quaû cuûa quaù trình xöû lyù vôùi DPCD. Vieäc löïa choïn thôøi gian xöû lyù naèm trong moái quan heä chaët cheõ vôùi caùc thoâng soá kyõ thuaät khaùc maø ñaëc bieät laø aùp suaát vaø nhieät ñoä. Beân caïnh ñoù, tính chaát heä vi sinh vaät treân nguyeân lieäu cuõng laø moät yeáu toá aûnh höôûng khoâng nhoû: löôïng vi sinh vaät ban ñaàu N0, khaû naêng chòu ñöïng cuûa caùc loaøi vi sinh vaät trong heä laø nhöõng thoâng soá quan troïng ñeå löïa choïn thôøi gian xöû lyù. Do vaäy, thôøi gian xöû lyù laø moät haøm soá phuï thuoäc vaøo caùc bieán soá chính laø aùp suaát, nhieät ñoä vaø tính chaát heä vi sinh vaät. Nghieân cöùu cuûa Shimoda vaø coäng söï (2001) cuõng keát luaän laø hieäu quaû tieâu dieät vi sinh vaät taêng cuøng vôùi vieäc taêng thôøi gian xöû lyù. Hình 3.13: Aûnh höôûng cuûa thôøi gian xöû lyù ñeán hieäu quaû voâ hoaït S. cerevisiae baèng DPCD (●: 10 MPa, 36oC; ○: 8 MPa, 38oC) 3.1.3.4. Aûnh höôûng cuûa ñoä aåm Hoaït ñoä cuûa nöôùc cuûa moâi tröôøng xöû lyù vaø beân trong teá baøo vi sinh vaät aûnh höôûng raát lôùn ñeán khaû naêng voâ hoaït vi sinh vaät cuûa kyõ thuaät DPCD. Ñoái vôùi moâi tröôøng vaø caùc teá baøo vi sinh vaät coù haøm löôïng nöôùc thaáp thì hieäu quaû cuûa kyõ thuaät Ñoà aùn Coâng ngheä Thöïc phaåm 42 DPCD khoâng cao. Haøm löôïng nöôùc trong moâi tröôøng xöû lyù vaø trong teá baøo taêng thì hieäu quaû öùc cheá vaø tieâu dieät vi sinh vaät cuûa kyõ thuaät DPCD seõ taêng (Damar vaø Balaban, 2006; Spilimbergo vaø Bertucco, 2003; Hong vaø Pyun, 1999; Louka vaø coäng söï, 1999). Nöôùc ñoùng moät vai troø quan troïng trong quaù trình xöû lyù thöïc phaåm baèng kyõ thuaät DPCD laø do nöôùc laø moâi tröôøng hoøa tan CO2, neáu löôïng nöôùc taêng thì löôïng CO2 hoøa tan caøng lôùn, khi ñoù hieäu quaû voâ hoaït vi sinh vaät caøng taêng. Neáu moâi tröôøng coù haøm löôïng nöôùc quaù thaáp, khoâng taïo ñuû ñieàu kieän ñeå CO2 hoøa tan toát thì söï tieáp xuùc giöõa CO2 vaø teá baøo khoâng toát, vaø do ñoù hieäu quaû tieâu dieät vi sinh vaät cuõng giaûm. Beân caïnh ñoù, haøm löôïng nöôùc trong teá baøo vaø moâi tröôøng cao seõ laøm cho maøng teá baøo linh ñoäng hôn, tính thaám taêng leân, CO2 seõ deã daøng thaåm thaáu vaøo trong teá baøo hôn. Maët khaùc, nöôùc giuùp cho CO2 hoøa tan taïo thaønh acid carbonic goùp phaàn laøm giaûm pH moâi tröôøng vaø pH noäi baøo cuûa vi sinh vaät, laøm gia taêng hieäu quaû voâ hoaït chuùng (Damar vaø Balaban, 2006; Hong vaø Pyun, 1999). Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa haøm löôïng nöôùc ñeán hieåu quaû voâ hoaït vi sinh vaät cuûa kyõ thuaät DPCD treân vi khuaån E.coli vaø naám men S. cerevisiae, Debs-Louka E vaø coäng söï (1999) ñaõ duøng 2 giaáy loïc caáy E. Coli vaø 2 giaáy loïc caáy S. cerevisiae, haøm löôïng nöôùc ñöôïc ñieàu chænh baèng caùch boå sung nöôùc caát voâ khuaån vaøo moät trong 2 giaáy loïc, giaáy loïc coøn laïi ñem saáy ôû nhieät ñoä 30oC trong 7 giôø. Sau khi xöû lyù caùc giaáy loïc baèng kyõ thuaät DPCD vôùi ñieàu kieän 5 MPa trong voøng 300 phuùt, keát quaû thu ñöôïc nhö sau: Baûng 3.5: Keát quaû sau khi xöû lyù giaáy loïc caáy E. Coli vaø S. cerevisiae baèng kyõ thuaät DPCD Keát quaû töø baûng 3.5 cho thaáy, maëc duø pH cuoái ôû caû hai loaïi giaáy loïc laø nhö nhau nhöng giaáy loïc khoâ cho thaáy haøm löôïng vi sinh vaät giaûm sau khi xöû lyù khoâng nhieàu, coøn ñoái vôùi giaáy loïc coù haøm aåm cao hôn thì löôïng vi sinh vaät giaûm nhieàu hôn haún sau khi xöû lyù. Ñieàu naøy chöùng toû khaû naêng voâ hoaït vi sinh vaät cuûa kyõ thuaät DPCD Ñoà aùn Coâng ngheä Thöïc phaåm 43 phuï thuoäc nhieàu vaøo haøm löôïng nöôùc trong moâi tröôøng xöû lyù. Louka vaø coäng söï keát luaän hieäu quaû voâ hoaït vi sinh vaät taêng cuøng vôùi söï taêng haøm aåm vaø hieäu quaû naøy caøng keùm neáu moâi tröôøng vaø teá baøo chöùa haøm löôïng nöôùc quaù thaáp. 3.1.3.5. Aûnh höôûng cuûa pH cuûa moâi tröôøng xöû lyù pH ban ñaàu cuûa moâi tröôøng xöû lyù coù aûnh höôûng quan troïng ñeán khaû naêng tieâu dieät vi sinh vaät cuûa kyõ thuaät DPCD. pH thaáp cuûa moâi tröôøng taïo ñieàu kieän thuaän lôïi cho söï vaän chuyeån cuûa acid carbonic qua maøng teá baøo, töông töï nhö nhöõng acid carboxylic khaùc, do ñoù maø hieäu quaû voâ hoaït seõ taêng leân (Damar vaø Bal aban, 2006). pH cuûa moâi tröôøng xöû lyù caøng giaûm thì toác ñoä voâ hoaït vi sinh vaät caøng taêng. Nguyeân nhaân laø do baûn thaân pH thaáp ñaõ laø moät trong nhöõng yeáu toá öùc cheá khaû naêng soáng vaø phaùt trieån cuûa vi sinh vaät, khi keát hôïp vôùi kyõ thuaät DPCD, pH thaáp cuûa moâi tröôøng coù t aùc duïng hoã trôï laøm taêng hieäu quaû cuûa kyõ thuaät naøy: pH thaáp laøm giaûm khaû naêng chòu ñöïng cuûa vi sinh vaät, laøm taêng khaû naêng di chuyeån cuûa acid carbonic qua maøng teá baøo, khi ñoù toác ñoä tieâu dieät vi sinh vaät seõ taêng leân (Damar vaø Balaban, 2006; Spilimbergo vaø coäng söï, 2005; Hong vaø Pyun, 1999). Nghieân cöùu cuûa Hong vaø Pyun (1999) treân khuaån Lactobacillus plantarum ñaõ ñöa ra keát quaû veà khaû naêng voâ hoaït vi sinh vaät cuûa kyõ thuaät DPCD treân nhöõng moâi tröôøng coù pH khaùc nhau vaø keát luaän raèng vôùi pH moâi tröôøng caøng thaáp thì khaû naêng voâ hoaït vi sinh vaät cuûa kyõ thuaät DPCD caøng cao. Ñoà aùn Coâng ngheä Thöïc phaåm 44 Thôøi gian xöû lyù (phuùt) Tyû leä soáng soùt N/N0 ñeäm acetate Nöôùc caát ñeäm phosphate vaø Hình 3.14: Aûnh höôûng cuûa pH moâi tröôøng xöû lyù ñeán hieäu quaû voâ hoaït L. plantarum baèng kyõ thuaât DPCD Theo keát quaû theå hieän treân ñoà thò 3.14 thì toác ñoä voâ hoaït vi sinh vaät cuûa moâi tröôøng ñeäm acetate pH 4,5 trong ñieàu kieän xöû lyù DPCD ôû aùp suaát 70kg/cm2, 30oC laø cao nhaát. Ñaây cuõng laø möùc pH thaáp nhaát trong soá caùc moâi tröôøng ñöôïc söû duïng trong nghieân cöùu treân. Ñoái vôùi moâi tröôøng dòch chieát xuaát töø thòt MRS, maëc duø pH cuõng laø 4,5 nhöng do moâi tröôøng chöùa nhieàu chaát beùo neân laøm haïn cheá hieäu quaû cuûa kyõ thuaät DPCD. Trong khi ñoù, moâi tröôøng boå sung Na bicarbonate laïi cho thaáy hieäu quaû thaáp nhaát do khoâng taïo ñöôïc pH thaáp maø laïi taïo ra ñeäm base (pH 8,0), do ñoù maø hieäu quaû voâ hoaït vi sinh vaät cuûa DPCD trong moâi tröôøng naøy trôû neân raát thaáp. Döïa vaøo keát quaû nhö treân, Hong vaø Pyun keát luaän moâi tröôøng coù pH thaáp seõ laøm taêng hieäu quaû xöû lyù cuûa kyõ thuaät DPCD. Ñoà aùn Coâng ngheä Thöïc phaåm 45 3.1.3.6. Aûnh höôûng cuûa noàng ñoä CO2 söû duïng (tæ leä CO2: nguyeân lieäu xöû lyù) Noàng ñoä CO2 cuõng laø yeáu toá quan troïng aûnh höôûng ñeán khaû naêng voâ hoaït vi sinh vaät cuûa kyõ thuaät DPCD. Noàng ñoä naøy ñöôïc tính baèng ñôn vò khoái löôïng (hoaëc theå tích) CO2 treân moät ñôn vò khoái löôïng (hoaëc theå tích) nguyeân lieäu xöû lyù. Quaù trình xöû lyù vôùi cuøng moät nhieät ñoä vaø aùp suaát nhöng vôùi noàng ñoä CO2 thaáp thì hieäu quaû voâ hoaït cuõng khoâng cao. Noàng ñoä CO2 caøng taêng thì hieäu quaû voâ hoaït vi sinh vaät cuûa kyõ thuaät DPCD seõ taêng theo. Ñieàu naøy coù theå giaûi thích laø do haøm löôïng CO2 söû duïng cao thì löôïng CO2 hoøa tan vaøo moâi tröôøng xöû lyù taêng, noàng ñoä CO2 thaám qua maøng teá baøo cuõng taêng do ñoù laøm taêng khaû naêng voâ hoaït vi sinh vaät (Werner vaø Hotchkiss, 2006; Gunes vaø coäng söï, 2005; Spilimbergo vaø Bertucco, 2003). Tuy nhieân, hieäu quaû voâ hoaït vi sinh vaät cuûa kyõ thuaät DPCD chæ taêng trong moät khoaûng taêng noàng ñoä CO2 giôùi haïn, nguyeân nhaân laø do söï baõo hoøa CO2 trong moâi tröôøng xöû lyù. 3.1.3.7. Aûnh höôûng cuûa phöông phaùp tieán haønh Phöông phaùp tieán haønh kyõ thuaät DPCD coù t heå aûnh höôûng ñeán toác ñoä voâ hoaït vi sinh vaät. Phöông phaùp naøo cho pheùp CO2 tieáp xuùc vôùi moâi tröôøng xöû lyù toát hôn thì coù hieäu quaû hôn trong vieäc tieâu dieät vi sinh vaät. Nguyeân nhaân laø do khi söï tieáp xuùc giöõa CO2 vaø moâi tröôøng xöû lyù taêng thì toác ñoä hoaø tan cuûa CO2 vaøo moâi tröôøng taêng, vì vaäy maø noàng ñoä CO2 ñaït ñeán baõo hoaø nhanh hôn, toác ñoä tieâu dieät vi sinh vaät luùc ñoù seõ taêng. Thoâng thöôøng thì phöông phaùp tieán haønh giaùn ñoaïn theo töøng meû caàn thôøi gian daøi hôn ñeå coù theå ñaït ñöôïc hieäu quaû voâ hoaït vi sinh vaät töông ñöông vôùi caùc phöông phaùp baùn lieân tuïc vaø lieân tuïc, töùc laø toác ñoä voâ hoaït vi sinh vaät trong phöông phaùp giaùn ñoaïn thaáp hôn caùc phöông phaùp coøn laïi. Phöông phaùp tieán haønh aûnh höôûng ñeán toác ñoä hoaø tan cuûa CO2 cuõng nhö ñeán noàng ñoä CO2 ñaït ñöôïc trong dung dòch xöû lyù, töø ñoù maø taïo ra nhöõng aûnh höôûng quan troïng ñeán caùc thoâng soá kyõ thuaät khaùc cuûa kyõ thuaät DPCD nhö aùp suaát, nhieät ñoä, thôøi gian xöû lyù vaø tyû leä CO2: nguyeân lieäu (Damar vaø Balaban, 2006; Gunes vaø coäng söï, 2005; Shimoda vaø coäng söï, 2001, 1998) Nghieân cöùu cuûa Shimoda vaø coäng söï veà taùc duïng tieäu dieät vi sinh vaät cuûa kyõ thuaät DPCD (1998) nhaän thaáy toác ñoä tieâu dieät vi khuaån Lactobacillus brevis baèng Ñoà aùn Coâng ngheä Thöïc phaåm 46 phöông phaùp doøng chaûy lieân tuïc cao hôn so vôùi phöông phaùp giaùn ñoaïn khi so saùnh treân taïi cuøng moät maät ñoä CO2 ôû 35oC. Maät ñoä CO2 (g/m 3) Löôïng teá baøo soáng soùt (CFU) Hình 3.15: Hieäu quaû tieâu dieät vi sinh vaät baèng phöông phaùp doøng chaûy lieân tuïc vaø phöông phaùp giaùn ñoaïn theo maät ñoä CO2 : Phöông phaùp doøng chaûy lieân tuïc : Phöông phaùp giaùn ñoaïn Theo keát quaû treân hình 3.15 thì Lactobacillus brevis gaàn nhö bò tieâu dieät hoaøn toaøn baèng phöông phaùp doøng chaûy lieân tuïc khi maät ñoä CO2 khoaûng 0,18 g/m3, trong khi ñoù, phöông phaùp giaùn ñoaïn chæ tieâu dieät hoaøn toaøn vi khuaån naøy khi maät ñoä CO2 ñaït 0,9 g/m3. Do ñoù maø caùc t aùc giaû naøy ñaõ keát luaän raèng phöông phaùp lieân tuïc cho hieäu quaû tieâu dieät vi sinh vaät cao hôn so vôùi phöông phaùp giaùn ñoaïn. 3.1.3.8. Aûnh höôûng cuûa tính chaát heä vi sinh vaät treân nguyeân lieäu caàn xöû lyù  Aûnh höôûng cuûa löôïng vi sinh vaät trong nguyeân lieäu xöû lyù Löôïng vi sinh vaät ban ñaàu trong maãu ñem xöû lyù (N0) aûnh höôûng lôùn ñeán thôøi gian tieán haønh kyõ thuaät DPCD taïi moät ñieàu kieän kyõ thuaät nhaát ñònh veà aùp suaát, nhieät ñoä vaø caùc thoâng soá khaùc. Vôùi moät löôïng vi sinh vaät ban ñaàu quaù lôùn thì cho duø saûn phaåm coù qua quaù trình xöû lyù vaãn khoâng ñaûm baûo vaán ñeà an toaøn vi sinh cho thöïc phaåm. Trong thöïc teá saûn xuaát, ñeå ruùt ngaén thôøi gian xöû lyù nhöng vaãn ñaûm baûo möùc ñoä an toaøn vi sinh cho thöïc phaåm, caùc nhaø coâng ngheä caàn ñaët ra caùc chæ tieâu vi sinh Ñoà aùn Coâng ngheä Thöïc phaåm 47 nghieâm ngaët cho nguyeân lieäu ñaàu vaøo, ñaëc bieät phaûi ñaûm baûo ñieàu kieän veä sinh thieát bò, nhaø xöôûng, coâng nhaân tham gia saûn xuaát... trong suoát quy trình coâng ngheä ñeå khoáng cheá giaù trò N0 cuûa caùc maãu thöïc phaåm tröôùc khi xöû lyù luoân ôû möùc thaáp nhaát.  Loaøi vi sinh vaät Caùc loaøi vi sinh vaät khaùc nhau coù caùc tính chaát veà caáu truùc vaø heä enzyme khaùc nhau, do ñoù maø chòu nhöõng aûnh höôûng khaùc nhau bôûi kyõ thuaät DPCD. Tính chaát cuûa maøng teá baøo vi sinh vaät coù aûnh höôûng quan troïng ñeán hieäu quaû cuûa kyõ thuaät DPCD. Vi khuaån G(-) vôùi maøng teá baøo moûng, nhaïy caûm do ñoù deã bò phaù vôõ vaø toån thöông trong giai ñoaïn giaûi phoùng aùp suaát, ñoàng thôøi tính thaám cuûa maøng cao hôn, taïo ñieàu kieän deã daøng cho CO2 thaám qua vaø trích ly caùc teá baøo chaát. Ngoaøi ra, maøng vi khuaån G(-) coøn ñöôïc cho l aø deã bieán tính hôn vi khuaån G(+). Vì caùc nguyeân nhaân treân vaø ngöôøi ta ñi ñeán keát luaän, vi khuaån G(-) bò tieâu dieät deã daøng hôn so vôùi vi khuaån G(+). Tuy nhieân, moät khi maøng teá baøo ñaõ bò bieán tính trong quaù trình xöû lyù baèng kyõ thuaät DPCD thì hieäu quaû voâ hoaït caùc loaøi vi sinh vaät khaùc nhau l aø nhö nhau. Tính chaát veà heä enzyme trong boä maùy trao ñoåi chaát cuûa caùc loaøi vi sinh vaät cuõng aûnh höôûng ñeán hieäu quaû cuûa kyõ thuaät DPCD. Tuøy vaøo loaøi vi sinh vaät khaùc nhau maø heä enzyme naøy cuõng khaùc nhau vaø chòu nhöõng aûnh höôûng vôùi caùc möùc ñoä khaùc nhau. Nhö ñaõ noùi ôû treân, chöa coù nghieân cöùu keát luaän söï voâ hoaït cuûa enzyme naøo seõ aûnh höôûng chuû yeáu ñeán söï soáng cuûa vi sinh vaät, vì vaäy caàn tìm hieåu theâm enzyme naøo quan troïng cho söï soáng cuûa teá baøo, töø ñoù taäp trung voâ hoaït nhöõng enzyme ñoù (phaàn 3.1.1.1) (Damar vaø Balaban, 2006; Spilimbergo vaø Bertucco, 2003). Ngoaøi ra, caùc loaøi vi sinh vaät khaùc nhau coù khaû naêng chòu ñöïng khaùc nhau ñoái vôùi ñieàu kieän xöû lyù baèng kyõ thuaät DPCD, ví duï nhö caùc vi khuaån lactic, acetic... coù theå chòu ñöôïc moâi tröôøng coù pH thaáp, moät soá loaøi vi sinh vaät khaùc laïi coù theå sinh toång hôïp nhöõng protein môùi coù taùc duïng baûo veä teá baøo choáng laïi caùc ñieáu kieän khaéc nghieät nhö aùp suaát vaø nhieät ñoä cao, noàng ñoä muoái cao... Nhöõng nguyeân nhaân treân cuõng goùp phaàn laøm giaûm hieäu quaû cuûa kyõ thuaät DPCD. Loaøi vi sinh vaät khaùc nhau aûnh höôûng ñeán caùc thoâng soá kyõ thuaät cuûa quaù trình xöû lyù baèng kyõ thuaät DPCD. Töông töï nhö caùc kyõ thuaät thanh, tieät truøng baèng nhieät, moãi Ñoà aùn Coâng ngheä Thöïc phaåm 48 loaøi vi sinh vaät coù moät giaù trò thôøi gian tieâu dieät thaäp phaân D khaùc nhau, vì vaäy ngöôøi ta seõ choïn ra loaøi vi sinh vaät coù giaù trò D cao nhaát, töùc laø coù khaû naêng chòu ñöïng cao nhaát, laøm ñaïi dieän ñeå thieát laäp cheá ñoä xöû lyù vaø ñaùnh giaù hieäu quaû quaù trình. Caùc so saùnh veà hieäu quaû cuûa quaù trình xöû lyù baèng kyõ thuaät DPCD treân caùc ñoái töôïng vi sinh vaät khaùc nhau caàn phaûi ñöôïc xem xeùt kyõ löôõng vaø phaûi coù söï ñoàng nhaát veà caùc ñieàu kieän xöû lyù. Aûnh höôûng cuûa kyõ thuaät DPCD leân caùc loaøi vi sinh vaät khaùc nhau ñeán nay vaãn chöa coù nhöõng keát luaän cuï theå, caùc nghieân cöùu caàn phaûi ñöôïc tieán haønh theâm ñeå tìm hieåu roõ veà vaán ñeà naøy. Louka vaø coäng söï nghieân cöùu aûnh höôûng cuûa kyõ thuaät DPCD ñeán söï soáng cuûa vi sinh vaät (1999) cho thaáy toác ñoä tieâu dieät seõ khaùc nhau ñoái vôùi caùc loaøi vi sinh vaät khaùc nhau vôùi cuøng moät cheá ñoä xöû lyù nhö nhau veà thôøi gian vaø aùp suaát Hình 3.16: Aûnh höôûng cuûa thôøi gian xöû lyù ñeán hieäu quaû voâ hoaït caùc loaøi vi sinh vaät khaùc nhau cuûa kyõ thuaät DPCD. Ñoà aùn Coâng ngheä Thöïc phaåm 49 Aùp suaát (MPa) Hình 3.17: Aûnh höôûng cuûa aùp suaát ñeán söï soáng cuûa caùc loaøi vi sinh vaät khaùc nhau (thôøi gian xöû lyù 30 phuùt)  Aûnh höôûng cuûa giai ñoaïn phaùt trieån cuûa vi sinh vaät. Giai ñoaïn phaùt trieån cuûa vi sinh vaät cuõng aûnh höôûng ñeán hieäu quaû voâ hoaït vi sinh vaät cuûa kyõ thuaät DPCD. Trong cuøng moät loaøi vi sinh vaät, caùc teá baøo treû nhaïy caûm hôn caùc teá baøo tröôûng thaønh, do ñoù maø deã bò tieâu dieät hôn. Teá baøo ôû pha thích nghi ñöôïc cho laø coù söùc ñeà khaùng yeáu nhaát do chuùng chöa sinh toång hôïp ñöôïc caùc enzyme vaø caùc caáu truùc thích hôïp vôùi ñieàu kieän moâi tröôøng, vì vaäy maø chuùng deã daøng bò tieâu dieät baèng kyõ thuaät DPCD. Ngöôïc laïi, ôû pha oån ñònh, vi sinh vaät coù khaû naêng chòu ñöïng cao nhaát neân khoù bò voâ hoaït nhaát. Nguyeân nhaân laø do trong giai ñoaïn naøy, caùc vi sinh vaät ñaõ sinh toång hôïp neân nhöõng protein môùi coù khaû naêng baûo veä teá baøo choáng laïi nhöõng aûnh höôõng baát lôïi töø moâi tröôøng nhö aùp suaát vaø nhieät ñoä cao, söï coù maët cuûa caùc chaát oxy hoaù khöû, noàng ñoä muoái cao... Trong caùc giai ñoaïn phaùt trieån thì baøo töû coù khaû naêng chòu ñöïng cao nhaát. Do caáu truùc lôùp voû vöõng chaéc, beàn vôùi caùc taùc ñoäng cuûa moâi tröôøng neân aûnh höôûng cuûa kyõ thuaät DPCD leân baøo töû cuõng laø thaáp nhaát so vôùi caùc gi ai ñoaïn phaùt trieån khaùc cuûa vi sinh vaät (Damar vaø Balaban, 2006; Spilimbergo vaø Bertucco, 2003; Hong vaø Pyun, 1999). Ñoà aùn Coâng ngheä Thöïc phaåm 50 Nghieân cöùu cuûa Hong vaø Pyun veà ñoäng hoïc quaù trình voâ hoaït L. plantarum baèng kyõ thuaät DPCD (1999) keát luaän vi sinh vaät ôû pha log coù tính maãn caûm cao, khaû naêng chòu ñöïng keùm vì vaäy maø deã bò tieâu dieät hôn. Nghieân cöùu naøy cuõng cho thaáy toác ñoä voâ hoaït L. plantarum ôû giai ñoaïn pha log (nuoâi caáy trong voøng 12 giôø t aïi 37oC) cao hôn so vôùi toác ñoä voâ hoaït ôû pha oån ñònh (nuoâi caáy trong voøng 24 giôø taïi 37oC). Thôøi gian xöû lyù (phuùt) Pha log Pha oån ñònh Tyû leä soáng soùt N/N0 Hình 3.18: Toác ñoä voâ hoaït L. plantarum ôû caùc giai ñoaïn phaùt trieån khaùc nhau baèng kyõ thuaät DPCD  Söï keát tuï cuûa caùc teá baøo vi sinh vaät vaø baøo töû Trong quaù trình phaùt trieån, moät soá loaøi vi sinh vaät coù xu höôùng keát tuï vôùi nhau thaønh töøng ñaùm lôùn. Söï keát tuï naøy giuùp cho chuùng taêng khaû naêng choáng chòu vôùi caùc ñieàu kieän baát lôïi cuûa moâi tröôøng. Trong suoát thôøi gian xöû lyù DPCD, caùc teá baøo cuõng nhö caùc baøo töû caøng coù xu höôùng keát tuï nhieàu hôn nhaèm choáng laïi caùc ñieàu kieän baát lôïi cuûa moâi tröôøng. Nghieân cöùu cuûa Furukawa vaø coäng söï (2006) veà hieän töôïng keát tuï cuûa caùc baøo töû trong quaù trình xöû lyù baéng kyõ thuaät DPCD cho thaáy, thôøi gian xöû lyù caøng keùo daøi thì soá löôïng baøo töû keát tuï caøng taêng. Ñoà aùn Coâng ngheä Thöïc phaåm 51 Baûng 3.6: Kích thöôùc caùc ñaùm keát tuï baøo töû theo thôøi gian Nguyeân nhaân cuûa söï keát tuï laø do ôû ñieàu kieän aùp suaát vaø nhieät ñoä xöû lyù kyõ thuaät DPCD, caùc protein treân maøng teá baøo bò bieán tính, tính kî nöôùc taêng, do ñoù chuùng coù xu höôùng keát tuï laïi vôùi nhau nhaèm laøm giaûm naêng löôïng dö beà maët. Nhö vaäy, vieäc laøm giaûm söï keát tuï hoaëc ngaên chaën söï hình thaønh caùc ñaùm keát tuï caùc teá baøo vaø baøo töû vi sinh vaät seõ laøm caûi thieän hieäu quaû tieâu dieät vi sinh vaät cuûa kyõ thuaät DPCD. Trong nghieân cöùu treân, Furukawa vaø coäng söï ñaõ duøng caùc chaát hoaït ñoäng beà maët ñeå haïn cheá hieän töôïng keát tuï vaø keát quaû sau khi xöû lyù cho thaáy löôïng vi sinh vaät bò tieâu dieät taêng leân nhieàu so vôùi maãu khoâng söû duïng chaát hoaït ñoäng beà maët. Hình 3.19: Aûnh höôûng cuûa caùc chaát hoaït ñoäng beà maët leân hieäu quaû xöû cuûa quaù trình xöû lyù baúng DPCD treân baøo töû Bacillus coagulans (A) vaø Bacillus licheniformis (B) 3.1.3.9. Aûnh höôûng cuûa caùc yeáu toá khaùc Haøm löôïng chaát beùo trong moâi tröôøng xöû lyù cuõng aûnh höôûng ñeán hieäu quaû tieâu dieät vi sinh vaät cuûa kyõ thuaät DPCD. Khi haøm löôïng chaát beùo trong moâi tröôøng xöû lyù cao thì toác ñoä voâ hoaït vi sinh vaät giaûm. Nguyeân nhaân laø do caùc chaát beùo laøm giaûm Ñoà aùn Coâng ngheä Thöïc phaåm 52 khaû naêng thaåm thaáu cuûa CO2 qua maøng teá baøo baèng caùch thay ñoåi caùc tính chaát beà maët cuûa maøng (Spilimbergo vaø Bertucco, 2003; Hong vaø Pyun, 1999). Söï coù maët cuûa caùc chaát hoã trôï trong moâi tröôøng xöû lyù laøm taêng hieäu quaû voâ hoaït vi sinh vaät cuûa kyõ thuaät DPCD. Chaúng haïn nhö khi boå sung moät löôïng SO2 (khoaûng 30ppm) vaøo CO2 thì toác ñoä tieâu dieät naám men Saccharomyces cerevisiae taêng leân ((Spilimbergo vaø Bertucco, 2003). Ñaõ coù nhieàu nghieân cöùu khaùc nhau treân raát nhieàu ñoái töôïng nhö bia, nöôùc quaû, caùc loaïi röôïu, söõa, moät soá caùc thöïc phaåm daïng raén nhö kimchi, thòt boø... ñöôïc tieán haønh nhaèm khaûo saùt caùc yeáu toá aûnh höôûng ñeán hieäu quaû voâ hoaït vi sinh vaät cuûa kyõ thuaät DPCD. Caùc nghieân cöùu naøy phaàn naøo ñaõ ñöa ra ñöôïc vai troø cuûa caùc thoâng soá kyõ thuaät chính cuõng nhö ñaõ thoáng nhaát ñöôïc moät soá cô cheá chuû yeáu voâ hoaït vi sinh vaät cuûa kyõ thuaät DPCD. Ñoà aùn Coâng ngheä Thöïc phaåm 53 3.2. Bieán ñoåi hoùa sinh Khaû naêng voâ hoaït caùc enzyme aûnh höôûng ñeán chaát löôïng thöïc phaåm cuûa kyõ thuaät DPCD ñaõ ñöôïc nhieàu nghieân cöùu chöùng minh. Kyõ thuaät DPCD coù theå voâ hoaït caùc enzyme taïi nhöõng nhieät ñoä maø phöông phaùp truyeàn thoáng söû duïng nhieät ñoä toû ra khoâng hieäu quaû. Haøng loaït caùc enzyme chòu aûnh höôûng bôûi DPCD coù theå keå ñeán nhö: enzyme pectinesterase (PE) laøm maát maøu ñuïc cuûa caùc loaïi nöôùc quaû ñuïc, enzyme polyphenoloxidase (PPO) laøm hoùa naâu caùc loaïi quaû, rau, nöôùc traùi caây vaø moät soá saûn phaåm haûi saûn, enzyme lypoxygenase (LOX) phaù huûy chlorophyll vaø laøm taêng muøi vò khoù chòu cho rau quaû laïnh ñoâng, vaø enzyme peroxidase (POD), moät enzyme chuû yeáu laøm bieán maøu thöïc phaåm vaø ñöôïc duøng nhö moät chæ soá ñaùnh giaù hieäu quaû voâ hoaït enzyme duøng nhieät ñoä trong quaù trình cheá bieán caùc saûn phaåm rau quaû. Maëc duø khoâng nhieàu veà maët soá löôïng nhöng nhöõng nghieân cöùu veà khaû naêng voâ hoaït enzyme nhôø kyõ thuaät DPCD ñaõ cho nhöõng keát quaû khaû quan, ñaëc bieät laø trong caùc saûn phaåm töø rau quaû (Damar vaø Balaban, 2006). 3.2.1. Cô cheá voâ hoaït enzyme Cuõng nhö ñoái vôùi vi sinh vaät, ñaõ coù nhieàu giaû thuyeát ñöa ra caùc cô cheá voâ hoaït enzyme nhöng vaãn chöa theå khaúng ñònh ñaâu laø cô cheá chuû yeáu. Moät soá caùc cô cheá ñöôïc ñeà caäp ñeán nhö sau: 3.2.1.1. Taùc duïng laøm giaûm pH Nhö ñaõ trình baøy ôû treân, kyõ thuaät xöû lyù vôùi DPCD coù theå laøm giaûm pH moâi tröôøng, vaø do ñoù laøm giaûm hoaït tính cuûa moät soá enzyme (Damar vaø Balaban, 2006; Gui vaø coäng söï, 2006; Tanimoto vaø coäng söï, 2005; Tisi, 2004; Park vaø coäng söï, 2002; Yoshimura vaø coäng söï, 2002, 2001; Chen vaø coäng söï, 1993). Moãi loaïi enzyme coù moät pH toái thích rieâng, neáu pH moâi tröôøng ra khoûi pH naøy thì hoaït tính enzyme seõ giaûm. Beân caïnh ñoù, vôùi moät soá enzyme coù pH ñaúng ñieän trong vuøng acid thì pH moâi tröôøng giaûm coù theå daãn ñeán vieäc ñoâng tuï caùc enzyme naøy. Ñoà aùn Coâng ngheä Thöïc phaåm 54 Baûng 3.7: pH toái thích cuûa moät soá enzyme laáy töø caùc nguoàn khaùc nhau (Yada, Proteins in food processing, CRC Press, 2004) Vieäc laøm giaûm pH cuûa nguyeân lieäu nhôø kyõ thuaät DPCD coù theå goùp phaàn laøm giaûm hoaït tính cuûa enzyme nhöng ñaây khoâng phaûi laø cô cheá chính voâ hoaït enzyme. Nguyeân nhaân ôû ñaây l aø do moät soá enzyme coù pH toái thích trong vuøng acid, khi ñoù taùc duïng laøm giaûm pH cuûa moâi tröôøng xöû lyù khoâng theå voâ hoaït caùc enzyme naøy ñöôïc maø ngöôïc laïi coøn goùp phaàn laøm taêng hoaït tính cuûa chuùng. Tuy nhieân, khi aùp duïng kyõ thuaät DPCD, maëc duø pH moâi tröôøng coù giaûm tôùi pH toái thích cuûa caùc enzyme thì caùc enzyme naøy vaãn bò voâ hoaït. Nghieân cöùu cuûa Balaban vaø coäng söï (1991) veà söï voâ hoaït enzyme PE treân nöôùc cam cho thaáy pH cuûa dung dòch phaûi thaáp hôn 2,4 thì môùi coù hieäu quaû voâ hoaït PE roõ raøng, trong khi ñoù, xöû lyù baèng DPCD chæ cho pH vaøo khoaûng 3,1 nhöng vaãn coù taùc duïng voâ hoaït PE. Vì theá, neáu chæ moät mình taùc duïng giaûm pH thì khoâng ñuû ñeå giaûi thích cô cheá voâ hoaït enzyme cuûa kyõ thuaät DPCD. Moät nghieân cöùu khaùc cuûa Chen (1992) cho keát quaû maãu toâm huøm xöû lyù baèng acid sao cho pH ñieàu chænh vaøo khoaûng 5,3 (baèng vôùi pH cuûa maãu ñaït ñöôïc khi xöû lyù baèng DPCD) coù hoaït tính enzyme PPO coøn laïi khoaûng 30% taïi nhieät ñoä 35oC sau 30 phuùt, Ñoà aùn Coâng ngheä Thöïc phaåm 55 trong khi ñoù maãu xöû lyù baèng DPCD cho thaáy hoaït tính cuûa enzyme PPO bò maát ñi hoaøn toaøn cuõng taïi nhieät ñoä treân chæ sau 1 phuùt (Damar vaø Balaban, 2006). Töø caùc keát quaû nghieân cöùu treân cuøng vôùi moät soá nghieân cöùu khaùc, ta thaáy taùc duïng laøm giaûm pH cuûa DPCD khoâng phaûi laø cô cheá voâ hoaït enzyme chuû yeáu. 3.2.1.2. Taùc duïng thay ñoåi caáu hình khoâng gian cuûa enzyme vaø cô chaát Nhö ta ñaõ bieát, phaàn lôùn caùc enzyme trong teá baøo sinh vaät laø nhöõng protein coù caáu truùc baäc 4 laø caáu truùc bao goàm caùc tieåu phaàn baäc ba theo khoâng gian ba chieàu. Trong ñoù, moät soá vò trí caùc chuoãi polypeptide coù caáu truùc daïng xoaén α, daïng gaáp neáp β, daïng caáu truùc maët cong β vaø daïng cuoän ngaãu nhieân. Hình 3.20: Caáu truùc cuûa moät loaïi enzyme peroxidase vôùi caùc vò trí coù caáu truùc baäc 2 vaø baäc 3. Döôùi aùp suaát cao cuûa kyõ thuaät DPCD, caùc enzyme coù theå bò bieán tính do thay ñoåi caáu hình khoâng gian. Cuï theå laø caùc vò trí coù caáu truùc baäc hai (α, β, cuoän ngaãu nhieân) vaø baäc ba seõ bò bieán tính laøm duoãi maïch, thaùo xoaén, thay ñoåi goùc cuûa neáp gaáp…. Söï thay ñoåi caáu hình naøy goùp phaàn laøm giaûm hoaït tính cuûa caùc enzyme. Möùc ñoä bieán tính enzyme phuï thuoäc vaøo aùp suaát trong khi tieán haønh xöû lyù: ñeå bieán tính hoaøn toaøn caùc enzyme phaûi caàn moät aùp suaát raát cao, chaúng haïn nhö theo nghieân cöùu cuûa Hendrickx vaø coäng söï veà aûnh höôûng cuûa kyõ thuaät DPCD leân protein (1998) cho thaáy phaûi naâng aùp suaát leân ñeán 310 MPa thì protein môùi bò bieán tính hoaøn toaøn, khoâng theå phuïc hoài. Do ñoù, söï bieán tính cuûa enzyme do taùc duïng cuûa kyõ thuaät DPCD laø bieán tính thuaän nghòch: caùc enzyme trong maãu sau khi xöû lyù coù theå phuïc hoài laïi moät Ñoà aùn Coâng ngheä Thöïc phaåm 56 phaàn hoaït tính trong thôøi gian baûo quaûn. Nguyeân nhaân cuûa vaán ñeà naøy laø do aùp suaát aùp duïng khi tieán haønh kyõ thuaät DPCD thaáp hôn nhieàu so vôùi aùp suaát caàn thieát ñeå bieán tính khoâng thuaän nghòch protein. Tuy nhieân, ñaây cuõng laø moät trong nhöõng cô cheá chuû yeáu goùp phaàn voâ hoaït enzyme ñaõ ñöôïc nhieàu nhaø khoa hoïc nghieân cöùu vaø coâng nhaän (Damar vaø Balaban, 2006; Gui vaø coäng söï, 2006; Tanimoto vaø coäng söï, 2005; Tisi, 2004; Chen vaø coäng söï, 1993). Khi töông taùc vôùi caùc enzyme, cô chaát phaûi coù moät caáu truùc thích hôïp ñeå coù theå taïo thaønh phöùc hôïp cuûa enzyme vaø cô chaát. Luùc ñoù, enzyme môùi coù theå phaùt huy taùc duïng xuùc taùc cuûa mình. Hình 3.21: Cô cheá xuùc taùc cuûa enzyme Aùp suaát cao trong kyõ thuaät DPCD coù theå laøm bieán ñoåi caáu hình khoâng gian cuûa cô chaát, töø ñoù laøm giaûm khaû naêng tieáp xuùc t aïo phöùc chaát giöõa enzyme vaø cô chaát, vaø do ñoù laøm giaûm toác ñoä cuûa phaûn öùng do enzyme xuùc t aùc. Cô cheá laøm thay ñoåi caáu hình enzyme vaø cô chaát cuûa kyõ thuaät DPCD ñeán nay maëc duø ñaõ ñöôïc nhieàu nhaø khoa hoïc ñoàng yù nhöng cuõng caàn ñöôïc nghieân cöùu theâm. Beân caïnh taùc duïng bieán tính caáu truùc enzyme vaø cô chaát döôùi taùc duïng cuûa aùp suaát cao thì cuõng phaûi keå ñeán taùc duïng cuûa phaân töû CO2 ñeán enzyme vaø cô chaát. CO2 coù theå phaûn öùng vôùi caùc nhoùm amino treân beà maët protein. Keát quaû cuûa phaûn öùng naøy laø söï taïo thaønh caùc hôïp chaát carbamate. Ñoà aùn Coâng ngheä Thöïc phaåm 57 Söï taùc duïng cuûa CO2 ñaõ laøm thay ñoåi tính chaát, töø ñoù laøm gi aûm hoaït tính cuûa caùc enzyme. Ngoaøi ra, neáu cô chaát laø protein thì phaûn öùng treân cuõng aûnh höôûng ñeán tính chaát cuûa cô chaát, goùp phaàn laøm giaûm toác ñoä cuûa phaûn öùng enzyme (Shota Tanimoto vaø coäng söï, 2005; Yoshimura vaø coäng söï, 2001; Habulin vaø Knez, 2001). Ngoaøi nhöõng nghieân cöùu nhö ñaõ trình baøy ôû treân, coøn coù nhieàu nghieân cöùu khaùc cuõng ñaõ ñöa ra nhöõng cô cheá taùc duïng leân enzyme cuûa kyõ thuaät DPCD. Tuy ñoái töôïng nghieân cöùu, phöông phaùp nghieân cöùu coù khaùc nhau, nhöng haáu heát ñeàu ñoàng yù vôùi nhöõng cô cheá neâu treân. Nghieân cöùu cuûa Gui vaø coäng söï söû duïng kyõ thuaät DPCD xöû lyù nöôùc taùo ñuïc (2006) nhaèm voâ hoaït enzyme polyphenol oxidase ñaõ ñoàng yù vôùi cô cheá thay ñoåi caáu hình khoâng gian cuûa enzyme do DPCD vaø ñöa ra keát luaän laø söï bieán tính naøy coù thuaän nghòch vì trong thôøi gian baûo quaûn, hoaït tính cuûa enzyme polyphenol oxidase coù taêng leân nhöng khoâng ñaùng keå so vôùi maãu khoâng xöû lyù baèng DPCD. Tröôùc ñoù khoâng laâu (2006), Gui cuøng coäng söï cuûa mình nghieân cöùu khaû naêng voâ hoaït enzyme horseradish peroxidase cuûa kyõ thuaät DPCD cuõng ñaõ ñi ñeán nhöõng keát luaän töông töï. Naêm 2005, Tanimoto cuøng caùc coäng söï nghieân cöùu aûnh höôûng cuûa kyõ thuaät DPCD ñeán khaû naêng voâ hoaït caùc enzyme trong saûn phaåm röôïu Sake vaø nhaän thaáy raèng haøng loaït caùc enzyme nhö α-glucosidase, α-amyl ase, glucoamylase, acid carboxypeptidase trong maãu coù hoaït tính giaûm so vôùi khi khoâng xöû lyù baèng DPCD. Caùc nhaø khoa hoïc naøy ñaõ ñöa ra cô cheá laøm thay ñoåi caáu hình khoâng gi an cuûa caùc enzyme, laøm giaûm pH cuûa moâi tröôøng xöû lyù cuõng nhö taùc duïng taïo hôïp chaát carbamate cuûa CO2 ñeå giaûi thích cho khaû naêng voâ hoaït enzyme cuûa kyõ thuaät DPCD. Nghieân cöùu cuûa Yoshimura veà aûnh höôûng cuûa kyõ thuaät DPCD leân hoaït tính enzyme protease vaø α-amylase (2002) keát luaän raèng hoaït tính cuûa caùc enzyme naøy giaûm sau khi xöû lyù vaø cuõng ñöa ra cô cheá nhö treân: ñoù laø taùc duïng laøm thay ñoåi caáu hình cuûa enzyme vaø cô chaát, taùc duïng cuûa phaân töû CO2 vaø taùc duïng laøm giaûm pH Ñoà aùn Coâng ngheä Thöïc phaåm 58 moâi tröôøng xöû lyù. Vaøo naêm 2001, cuõng caùc taùc giaû naøy khi nghieân cöùu cô cheá voâ hoaït enzyme protease (ñieàu kieän xöû lyù 50oC, 30 MPa) vaø α-amylase (ñieàu kieän xöû lyù 35oC, 30 MPa) vaø ñaõ ñöa ra keát luaän töông töï. Nghieân cöùu cuûa Park vaø coäng söï veà aûnh höôûng keát hôïp giöõa kyõ thuaät CO2 aùp suaát cao vaø kyõ thuaät aùp suaát thuyû tónh cao (High Hydrostatic Pressure – HHP) leân chaát löôïng cuûa nöôùc carrot (2002) cuõng nhaän thaáy hoaït tính cuûa enzyme pectinmethylesterase – PME, enzyme chuû yeáu laøm maát ñi tính chaát ñuïc cuûa nöôùc carrot, giaûm do taùc duïng laøm giaûm pH cuûa kyõ thuaät DPCD vì enzyme naøy coù pH toái thích trong vuøng gaàn trung tính, khoaûng 7,5. Naêm 2001, Habulin vaø Knez nghieân cöùu veà hoaït tính vaø ñoä beàn cuûa enzyme lipase töø nhöõng nguoàn thu nhaän khaùc nhau trong CO2 sieâu tôùi haïn vaø propane caän tôùi haïn nhaän thaáy raèng trong ñieàu kieän CO2 sieâu tôùi haïn, hoaït tính cuûa lipase giaûm vaø giaûi thích cô cheá laø do söï taùc duïng giöõa CO2 vaø enzyme, taïo ra hôïp chaát carbamate laøm thay ñoåi tính chaát enzyme. Nghieân cöùu cuûa Chen vaø coäng söï naêm 1993 veà öùng duïng kyõ thuaät DPCD voâ hoaït enzyme polyphenol oxidase trong caùc loaøi giaùp xaùc cho thaáy hoaït tính cuûa enzyme naøy giaûm sau khi xöû lyù ôû ñieàu kieän 43oC, 58 atm vaø ñaõ ñöa ra cô cheá l aø do söï bieán tính caáu truùc cuûa enzyme döôùi taùc duïng cuûa aùp suaát cao ñoàng thôøi vôùi taùc duïng laøm giaûm pH cuûa kyõ thuaät DPCD. Sau khi xöû lyù enzyme polyphenol oxidase baèng DPCD, caùc nhaø khoa hoïc naøy ñaõ nhaän thaáy coù söï ñoâng tuï protein noåi treân beà maët moâi tröôøng cuõng nhö taïo thaønh nhöõng ñaùm keát tuï trong loøng moâi tröôøng. Töø ñoù hoï ñaõ ñöa ra keát luaän l aø kyõ thuaät DPCD coù theå laøm bieán tính enzyme vaø laøm giaûm hoaït tính cuûa chuùng. Khaû naêng laøm giaûm hoaït tính cuûa caùc enzyme nhôø kyõ thuaät DPCD ñaõ ñöôïc xaùc nhaän. Tuy nhieân, cô cheá cuûa taùc duïng naøy ñeán nay vaãn chöa thaät söï roõ raøng vaø coøn caàn phaûi ñöôïc nghieân cöùu theâm. 3.2.2. Caùc yeáu toá aûnh höôûng ñeán hieäu quaû voâ hoaït enzyme baèng kyõ thuaät DPCD 3.2.2.1. Aûnh höôûng cuûa caùc yeáu toá veà enzyme  Loaïi enzyme Ñoà aùn Coâng ngheä Thöïc phaåm 59 Moãi loaïi enzyme khaùc nhau coù caùc tính chaát veà caáu taïo, caáu truùc, veà pH toái thích cuõng nhö khaû naêng chòu ñöïng khaùc nhau. Vì vaäy maø taùc duïng cuûa kyõ thuaät DPCD leân caùc enzyme khaùc nhau thì khoâng gioáng nhau. Ñaây laø keát luaän cuûa haàu heát caùc nghieân cöùu veà aûnh höôûng cuûa kyõ thuaät DPCD leân hoaït tính enzyme. Beân caïnh ñoù, caàn löu yù caùc ñaëc ñieåm khaùc nhau cuûa caùc enzyme maø aùp duïng kyõ thuaät xöû lyù thích hôïp, ví duï nhö duøng pH, nhieät ñoä cuõng nhö aùp suaát khaùc nhau ñeå taùc duïng leân hoaït tính cuûa enzyme. Vôùi nhöõng enzyme coù theå hoaït ñoäng toát trong vuøng pH thaáp, chaúng haïn nhö caùc enzyme protease, thì cô cheá giaûm pH cuûa kyõ thuaät DPCD toû ra khoâng höõu hieäu, khi ñoù caàn coù taùc duïng theâm cuûa nhieät ñoä vaø pH ñeå ñaït ñöôïc hieäu quaû öùc cheá enzyme nhö mong muoán. Nghieân cöùu cuûa Shota Tanimoto vaø coäng söï veå khaû naêng voâ hoaït caùc enzyme α- glucosidase (AGA), α-amylase (AA), glucoamylase (GA) vaø acid carboxypeptidase (ACP) coù trong röôïu Sake duøng phöông phaùp doøng chaûy lieân tuïc cuûa kyõ thuaät DPCD cho thaáy ôû cuøng moät ñieàu kieän xöû lyù, enzyme α-glucosidase beàn nhaát, trong khi ñoù enzyme α-amylase laïi laø enzyme bò aûnh höôûng nhieàu nhaát vaø hoaït tính coøn laïi thaáp nhaát sau khi xöû lyù. Caùc nhaø khoa hoïc naøy ñaõ giaûi thích nguyeân nhaân laø do α- amylase trong röôïu Sake coù khaû naêng chòu moâi tröôøng acid keùm, vì vaäy maø khi pH giaûm do kyõ thuaät DPCD thì enzyme naøy bò aûnh höôûng nhieàu nhaát. Coøn caùc enzyme coøn laïi trong röôïu Sake thì coù tính beàn vôùi acid cao hôn, do ñoù maø hoaït tính maát ñi cuõng ít hôn so vôùi α-amylase.  Nguoàn goác enzyme Cuøng moät loaïi enzyme nhöng laáy töø caùc nguoàn khaùc nhau coù nhöõng tính chaát veà caáu truùc, pH toái thích cuõng nhö ñoä beàn vaø khaû naêng chòu ñöïng khaùc nhau. Do ñoù maø aûnh höôûng cuûa kyõ thuaät DPCD leân enzyme töø caùc nguoàn khaùc nhau cuõng khaùc nhau (Sibel Damar vaø Murat O. Balaban, 2006; Chen vaø coäng söï, 1993). Nghieân cöùu cuûa Chen vaø coäng söï veà khaû naêng voâ hoaït enzyme polyphenol oxidase töø gi aùp xaùc (1993) nhaän thaáy vôùi ñieàu kieän xöû lyù laø 58 atm ôû 43oC, hoaït tính cuûa enzyme polyphenol oxidase töø toâm huøm vaø toâm naâu gaàn nhö maát hoaøn toaøn sau hôn 1 phuùt. Tuy nhieân, nghieân cöùu cuõng cho thaáy laø enzyme töø toâm naâu coù khaû naêng chòu ñöïng cao hôn töø toâm huøm moät ít. Ñoà aùn Coâng ngheä Thöïc phaåm 60 Chen vaø coäng söï cuõng keát luaän laø enzyme polyphenol oxidase töø khoai taây coù tính beàn cao hôn so vôùi enzyme töø toâm huøm vaø toâm naâu. Xaùc ñònh ñöôïc loaïi enzyme cuõng nhö nguoàn goác enzyme trong maãu cho pheùp caùc nhaø coâng ngheä ñeà ra ñöôïc phöông phaùp xöû lyù baèng kyõ thuaät DPCD. Cuõng töông töï nhö kyõ thuaät thanh truøng hay tieät truøng duøng nhieät, trong kyõ thuaät DPCD xöû lyù enzyme, ngöôøi ta cuõng ñöa ra khaùi nieäm thôøi gian tieâu dieät thaäp phaân D vaø haèng soá chòu aùp suaát zp (aùp suaát caàn taêng ñeå D giaûm 10 laàn) cuøng nhöõng ñaïi löôïng töông töï khaùc cho caùc enzyme. Trong moät maãu coù nhieàu loaïi enzyme, thöôøng phaûi xaùc ñònh nhöõng enzyme chính maø hoaït tính cuûa chuùng aûnh höôûng khoâng toát ñeán chaát löôïng saûn phaåm, vaø töø ñoù maø ñeà ra caùch thöùc xöû lyù vôùi kyõ thuaät DPCD cho hieäu quaû. 3.2.2.2. Aûnh höôûng cuûa caùc yeáu toá veà kyõ thuaät  Aùp suaát Aùp suaát laø moät trong nhöõng thoâng soá kyõ thuaät chính aûnh höôûng ñeán hieäu quaû öùc cheá enzyme cuûa kyõ thuaät DPCD. Aùp suaát caøng cao thì taùc duïng leân caáu truùc enzyme vaø cô chaát caøng lôùn, daãn ñeán nhöõng bieán ñoåi saâu saéc vaø laøm voâ hoaït enzyme hieäu quaû hôn. Beân caïnh ñoù, aùp suaát caøng taêng thì noàng ñoä CO2 hoaø t an trong moâi tröôøng caøng nhieàu vaø hieäu quaû laøm giaûm pH cuûa kyõ thuaät DPCD seõ taêng. Maët khaùc, aùp suaát caøng cao thì seõ taïo ra söï bieán tính saâu saéc veà caáu hình khoâng gian cuûa caùc enzyme, vaø do ñoù maø chuùng khoù khoâi phuïc hoaït tính trong thôøi gian baûo quaûn. (Damar vaø Balaban, 2006; Kincal vaø coäng söï, 2006; Bertoloni vaø coäng söï, 2006; Gui vaø coäng söï, 2006; Tanimoto vaø coäng söï, 2005; Tisi, 2004; Park vaø coäng söï, 2002; Tedjo vaø coäng söï, 2000; Chen vaø coäng söï, 1993). Nghieân cöùu cuûa Gui vaø coäng söï treân nöôùc taùo ñuïc cho thaáy hoaït tính enzyme polyphenol oxidase sau khi xöû lyù baèng DPCD coøn laïi töø 57,30 – 38,50% khi aùp suaát taêng töø 8 MPa ñeán 30 MPa. Beân caïnh ñoù, nghieân cöùu coøn cho thaáy hoaït tính cuûa enzyme naøy t aêng trong quaù trình baûo quaûn ôû 4oC vaø maãu coù aùp suaát xöû lyù caøng cao thì hoaït tính cuûa enzyme polyphenol oxidase taêng caøng ít, khoâng ñaùng keå trong thôøi gian baûo quaûn. Ñoà aùn Coâng ngheä Thöïc phaåm 61 Hình 3.22: Söï thay ñoåi hoaït tính enzyme polyphenol oxidase trong quaù trình baûo quaûn ôû 4oC vôùi cuûa caùc maãu nöôùc taùo ñuïc ñöôïc xöû lyù ôû caùc aùp suaát khaùc nhau baèng kyõ thuaät DPCD. Nghieân cöùu cuûa Park vaø coäng söï veà aûnh höôûng keát hôïp giöõa kyõ thuaät aùp suaát thuyû tónh cao (High Hydrostatic Pressure – HHP) vaø CO2 aùp suaát cao leân chaát löôïng nöôùc carrot nhaän thaáy hoaït tính cuûa caùc enzyme polyphenol oxidase, lipoxygenase vaø pectinmethylesterase giaûm caøng nhieàu khi aùp suaát söû duïng caøng taêng. Hình 3.23: Aûnh höôûng cuûa aùp suaát leân hoaït tính cuûa caùc enzyme.  Nhieät ñoä Beân caïnh aùp suaát, nhieät ñoä cuõng laø moät thoâng soá kyõ thuaät quan troïng aûnh höôûng ñeán hieäu quaû voâ hoaït enzyme cuûa kyõ thuaät DPCD. Nguyeân nhaân laø do moãi enzyme coù moät khoaûng nhieät ñoä thích hôïp ñeå hoaït ñoäng cuõng nhö khaû naêng chòu ñöïng vôùi Ñoà aùn Coâng ngheä Thöïc phaåm 62 nhöõng nhieät ñoä khaùc nhau. Beân caïnh ñoù, nhieät ñoä caøng taêng thì möùc ñoä bieán tính cuûa caùc enzyme cuõng taêng theo. Vì vaäy, nhieät ñoä taêng hay giaûm cuõng goùp phaàn aûnh höôûng khoâng nhoû ñeán hoaït tính cuûa caùc enzyme. Nhieät ñoä cuõng laøm taêng khaû naêng taùc duïng cuûa CO2 vôùi enzyme vaø cô chaát. Thoâng thöôøng, nhieät ñoä xöû lyù trong kyõ thuaät DPCD taêng thì hieäu quaû öùc cheá enzyme cuõng taêng theo (Damar vaø Balaban, 2006; Gui vaø coäng söï, 2006; Tanimoto vaø coäng söï, 2005; Yoshimura vaø coäng söï, 2002, 2001; Tedjo vaø coäng söï, 2000).  Thôøi gian Ngoaøi yeáu toá aùp suaát vaø nhieät ñoä thì thôøi gian xöû lyù cuõng laø moät thoâng soá kyõ thuaät ñieàu khieån quaù t rình xöû lyù thöïc phaåm baèng kyõ thuaät DPCD. Haàu heát caùc nghieân cöùu ñeàu cho raèng thôøi gian taêng thì hieäu quaû voâ hoaït enzyme seõ taêng, töông töï nhö caùc phöông phaùp thanh truøng hay tieät truøng duøng nhieät hoaëc chieáu xaï. Thôøi gian taêng seõ laøm cho aûnh höôûng cuûa aùp suaát leân caáu truùc caùc enzyme vaø cô chaát trôû neân saâu saéc hôn, caùc enzyme seõ khoù khoâi phuïc laïi hoaït tính hôn. Theâm vaøo ñoù, caùc taùc duïng cuûa CO2 ñoái vôùi enzyme vaø cô chaát, taùc duïng giaûm pH cuûa kyõ thuaät DPCD cuõng seõ taêng khi t