Đề tài Vông nem (Erythrina orientalis L. Murr., Fabaceae)

LỜI MỞ ĐẦU Vốn là một đất nước được thiên nhiên ưu đãi, nằm trong vùng nhiệt đới gió mùa, Việt Nam có một thảm thực vật vô cùng phong phú và đa dạng với hơn 12.000 loài thực vật bậc cao khác nhau. Từ nhiều thế kỷ nay, thực vật không chỉ là nguồn cung cấp dinh dưỡng cho con người mà còn là những phương thuốc chữa bệnh hết sức quý giá. Cho đến nay, việc nghiên cứu và phát triển các dược phẩm mới từ các nguồn nguyên liệu tự nhiên vẫn đang đóng góp mạnh mẽ vào các lĩnh vực điều trị bao gồm chống ung thư, chống nhiễm khuẩn, chống viêm, điều chỉnh miễn dịch và các bệnh về thần kinh. Giữa những năm 2000 – 2005, hơn 20 thuốc mới là sản phẩm thiên nhiên hoặc dẫn xuất từ thiên nhiên đã được đưa vào sản xuất. Với việc đưa vào các phương pháp sàng lọc hoạt tính sinh học nhanh thách thức đặt ra cho các nhà hóa học là việc nghiên cứu các quy trình phân tách hiệu quả các hợp chất thiên nhiên từ các nguồn thực vật, vi nấm, sinh vật biển… và thực hiện các chuyển hóa hóa học, ví dụ như bằng các con đường biomimetic, để tạo ra các dẫn xuất mới. Cây Vông nem (Erythrina orientalis L. Murr., Fabaceae) là một trong những vị thuốc kinh nghiệm trong dân gian Việt Nam và nhiều nước khác trên thế giới có tác dụng an thần, hạ huyết áp, kháng khuẩn và chống loãng xương. Cây Vông nem của Việt Nam còn chưa được nghiên cứu nhiều về hóa học. Trong chương trình nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các cây thuốc cổ truyền của Việt Nam, chúng tôi đã lựa chọn cây Vông nem (Erythrina orientalis L. Murr., Fabaceae) làm đối tượng nghiên cứu của luận văn này. Chương 1: TỔNG QUAN GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CHI ERYTHRINA [1, 32, 33, 34] Họ Đậu (Fabaceae) là họ lớn thứ hai của thực vật có hoa với 650 chi và trên 18.000 loài. Các tên gọi thông thường chủ yếu của các loài trong họ này là Đỗ hay Đậu và họ này chứa một số loài cây quan trọng bậc nhất trong cung cấp thực phẩm cho con người. Tất cả các thành viên trong họ này đều có hoa chứa 5 cánh hoa, trong dó bầu nhụy lớn khi phát triển được sẽ tạo ra quả thuộc loại quả đậu, hai vỏ của nó có thể tách đôi, bên trong chứa nhiều hạt trong các khoang riêng rẽ. Các loài trong họ này theo truyền thống được phân loại trong ba phân họ: Phân họ Vang (Caesalpinioideae), hay họ Vang (Caesalpiniaceae) Phân họ Trinh nữ (Mimosoideae), hay họ Trinh nữ (Mimosaceae) Phân họ Đậu (Faboideae hay Papilionoideae) (họ Fabaceae nghĩa hẹp hay họ Papilionaceae). Erythrina [2] là một chi của loại cây có hoa trong phân họ Đậu (Fabaceae nghĩa hẹp hay họ Papilionaceae) thuộc họ Đậu (Fabaceae). Các loài cây trong chi này phổ biến khắp các vùng nhiệt đới và cận nhiệt trên thế giới. Có khoảng 130 loài trong chi Erythrina với một số loài thường gặp như sau: Erythrina abyssinica DC. Erythrina americana Mill. (Mexico) Erythrina ankaranensis Du Puy & Labat (Madagascar) Erythrina atitlanensis Krukoff & Barneby Erythrina berteroana Urb. Erythrina burana Chiov. (Ethiopia) Erythrina caffra Thunb. (Southeastern Africa) Erythrina corallodendron L. (Hispaniola, Jamaica) Erythrina coralloides D.C. (Arizona in the United States, Mexico) Erythrina crista-galli L. (Argentina, Uruguay, Brazil, Paraguay) Erythrina decora Harms Erythrina edulis Micheli – Basul Erythrina eggersii Krukoff & Moldenke (United States Virgin Islands, Puerto Rico) Erythrina elenae Howard & Briggs (Cuba) Erythrina euodiphylla Hassk. ex Backh. (Indonesia) Erythrina falcata Benth. (Brazil) Erythrina flabelliformis Kearney Erythrina fusca Lour. (Pantropical) Erythrina haerdii Verdc. (Tanzania) Erythrina hazomboay Du Puy & Labat (Madagascar) Erythrina herbacea L. (Southeastern United States, Northeastern Mexico) Erythrina humeana Spreng. (South Africa) Erythrina lanceolata Standl. Erythrina latissima E.Mey. Erythrina lysistemon Hutch. (South Africa) Erythrina madagascariensis Du Puy & Labat (Madagascar) Erythrina megistophylla (Ecuador) Erythrina mulungu Diels Mart. (Brazil) Erythrina perrieri R.Viguier (Madagascar) Erythrina poeppigiana (Walp.) O.F.Cook Erythrina polychaeta Harms (Ecuador) Erythrina rubrinervia Kunth Erythrina sacleuxii Hua (Kenya, Tanzania) Erythrina sandwicensis O.Deg. (Hawaii) Erythrina schimpffii Diels (Ecuador) Erythrina schliebenii Harms (extinct: 1938) Erythrina senegalensis DC. Erythrina speciosa Andrews (Brazil) Erythrina stricta Roxb. (Southeast Asia) Erythrina suberosa Roxb. Erythrina tahitensis Nadeaud (Tahiti) Erythrina tuxtlana Krukoff & Barneby (Mexico) Erythrina variegata L. (Cambodia, Okinawa, Fiji, Bangladesh, Tibet, Thailand, Vietnam) Erythrina velutina Willd. (Caribbean, South America, Galápagos Islands) Erythrina vespertilio Benth. (Australia) Erythrina zeyheri Harv. Các cây lai (hybrid): Erythrina × bidwillii Lindl. Erythrina × sykesii Barneby & Krukoff. CÂY VÔNG NEM (Erythrina orientalis (L.) Murr.) Thực vật học [1, 2] Cây Vông nem còn được gọi bằng nhiều tên gọi khác là cây lá Vông, Hải đồng bì, Thích đồng bì, tên khoa học là Erythrina orientalis L. Murr. [1], ngoài ra còn có các tên đồng nghĩa khác như Erythrina indica Lam., Erythrina variegata L. var orientalis (L.) Merr., Erythrina variegata L. Cây cao khoảng từ 10 – 20 m, thân có gai ngắn. Lá gồm 3 lá, chét giữa rộng hơn là dài, dài 10 – 15 cm, hai lá chét hai bên dài hơn là rộng. Hoa màu đỏ tươi tụ họp từ 1 – 3 thành chum dầy. Quả giáp dài 15 – 30cm, đen, hơi hẹp lại giữa các hạt. Trong mỗi quả có 5 – 6 hạt hình thận màu đỏ hoặc nâu, tễ rộng, hình trứng đen có vành trắng. Loài phân bố rộng từ Ðông Á châu tới Phi châu nhiệt đới. Ở châu Á, loài này phổ biến ở Ấn Độ, Trung Quốc, Thái Lan, Campuchia, Lào, Việt Nam, Malaixia, Inđônêxia và Philippin. Thường gặp trong các bụi dọc bờ biển, lân cận với các rừng ngập mặn và trong rừng thưa, nhiều nơi ở nước ta. Cũng thường được trồng làm cây bóng mát dọc đường ở các khu dân cư. Người ta thu hái lá vào mùa xuân, chọn lá bánh tẻ, dùng tươi hay phơi khô, thu hái vỏ cây quanh năm. Dưới đây là ảnh của cây, hoa và vỏ thân cây Vông nem. Hình 1: Cây Vông nem (Erythrina orientalis L., Fabaceae) Hình 2: Hoa Vông nem (Erythrina orientalis L., Fabaceae) Hình 3: Vỏ thân Vông nem (Erythrina orientalis L., Fabaceae) Tác dụng dược lý của E. orientalis [1, 2] Bộ phận dùng của cây Vông nem là vỏ và lá (Cortex et Folium Erythrinae variegatae). Theo [1, 2] tác dụng dược lý của lá Vông nem như sau. Lá Vông có tác dụng ức chế thần kinh trung ương, làm yên tĩnh, gây ngủ, hạ nhiệt độ, hạ huyết áp, co bóp các cơ; lá vông ít độc. Nước sắc 10% lá vông, 9% NaCl có tác dụng làm co cứng cơ chân ếch và cơ thắt trực tràng, co thắt cơ van, cơ hậu môn. Ở Trung Quốc vỏ cây vông được dùng làm thuốc chữa sốt, sát trùng, thông tiểu, an thần và gây ngủ; dùng trong bệnh thổ tả, lỵ, amip và trực trùng, nhuận tràng. Ngoài ra còn dùng làm thuốc xoa bóp, thuốc mỡ. Các nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của E. orientalis Các nghiên cứu được thực hiện trên E. orientalis được thu thập ở Trung Quốc, Nhật Bản, Ấn Độ, Pakistan, Indonesia, Samoa với các bộ phận lá, vỏ thân, rễ và gỗ nhằm mục đích xác định các hợp chất thành phần, đặc biệt là các hoạt chất quyết định cho các hoạt tính kháng khuẩn và kháng viêm. Các hợp chất được phân lập có các cấu trúc đa dạng của các alkaloid (erythrinan và tetrahydroprotoberberin), flavonoid (isoflavanon, isoflavon, pterocarpan, stilben và benzofuran) và diphenylpropandiol. Sự prenyl hóa là một đặc trưng cấu trúc lý thú có thể đóng vai trò nhất định trong các hoạt tính của các hợp chất flavonoid từ E. orientalis. Các alkaloid Từ những năm 1970, S. Ghosal và cộng sự (Đại học Banaras Hindu, Ấn Độ) đã tiến hành định lượng alkaloid trong các bộ phận của E. orientalis [4]. Vỏ thân chứa 0,11% alkaloid với các alkaloid chính là erysotrin (1), erysodin (2), erysovin (3), erysonin (4), hypaphorin (5) và muối picrat của metyl ete (6). Lá chứa 0,035 % alkaloid với các alkaloid chính là erysotrin (7), erysodin (8), erythralin hiđroclorua (9) và hypaphorin. Hạt chứa 0,082 % alkaloid trong đó hypaphorin là thành phần chính, erysopin (10) và erysotin (11). Năm 1999, K. Ito (Đại học Meijo, Nhật Bản) đã tổng kết các alkaloid có trong E. orientalis [8]. Ngoài các alkaloid trên, erybidin (12) và reticulin (13), báo cáo còn nêu ra alkaloid dãy tetrahydroprotoberberin, scoulerin (14) và coreximin (15). 1 3 5 10 14 15 Các flavonoid Năm 1977, Deshpande V. H. và cộng sự đã phân lập từ vỏ ngoài E. orientalis các isoflavon, erytrinin A (16), B (17) và C (18); osajin (19), alpinum isoflavon (20), styrene oxyresveratrol (21) và dihydrostilben dihydrooxyresveratrol (22) [3]. Nănm 1990, Telikepalli H. và cộng sự (Đại học Kansas, Mỹ) đã phân lập được từ rễ E. variegata L. var orientalis (syn. E. indica) 4 pterocarpan, erycristagallin (23), erythrabyssin-II (24), phaseollin (25) và phaseollidin (26); 2 isoflavon, warangalon (scandenon) (27) và 5,7,4’-trihydroxy-6,8-diprenylisoflavon (28) cùng với một flavanon, isobavachin (29), và một cinnamylphenol mới, eryvariestyren (30) [26]. 23 24 30 Năm 1996, H. Tanaka và cộng sự (Đại học Meijo, Nhật Bản) đã phân lập được một pterocarpan mới từ gỗ E. orientalis, hydroxycristacarpon (11b-hydroxydienon) (31). 11b-Hydroxydienon đã được biết đến như là dẫn xuất của các pterocarpan phytoalexin được tạo thành bằng sự loại độc oxi hóa sự biến hóa của vi khuẩn. Đây là công bố đầu tiên về 11b-hydroxydienon từ chi Erythrina, và hydroxycristacarpon là một pterocarpan hiếm có cả nhóm prenyl và p-quinol trong cấu trúc. Các hợp chất khác được phân lập là pterocapan, crystacarpin (32) và 2 isoflavon, osajin (33) và wighteon (34) [19]. 31 33 Một pterocarpan mới, orientanol A (35), đã được H. Tanaka và cộng sự (Đại học Meijo, Nhật Bản) phân lập năm 1997 từ gỗ E. orientalis cùng với một isoflavon, daidzein (36) [20]. Năm 1997, V. R. Hegde và cộng sự (Viện nghiên cứu Schering-Plough, Mỹ) đã phân lập từ vỏ cây E. variegata 2 flavonoid, abyssinon V (4’-hydroxy-3’,5’-diprenylisoflavonon) (37) và erycrystagallin (3,9-dihydroxy-2,10-diprenylpterocarp-6a-en) (23) cùng với một isoflavonon mới, 4’-hydroxy-6,3’,5’-triprenylisoflavonon (38). Abyssinon V và erycrystagallin đã được công bố là các tác nhân kháng sinh vật từ loài Erythrina. Ba flavonoid này là các chất ức chế enzym photpholipase (PLA2) với các giá trị IC50 tương ứng là 6, 3, 10 μm [7]. 35 37 38 Năm 1998, H. Tanaka và cộng sự (Đại học Meijo, Nhật Bản) đã phân lập từ rễ E. orientalis 2 pterocarpan mới là orientanol B (39) và orientanol C (40) cùng với 2 pretocarpan đã biết, folitenol (41) và erythrabyssin II (24), một pterocarpen, erycristagallin (23), và isoflavon prenyl, bidwillol A (42) [21]. 39 40 41 Năm 1998, các isoflavanon mới orientanol D, E và F (43, 44 và 45) đã được H. Tanaka và cộng sự (Đại học Meijo, Nhật Bản) phân lập từ rễ E. orientalis cùng với 2 isoflavon, bidwillol A và bidwillol B (46) [22]. 43 44 45 46 Năm 2002, M. Sato và cộng sự (Đại học Asahi, Nhật Bản) đã công bố nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn của 7 isoflavonoid, orientanol B (39) (9-hydroxy-3-methoxy-2-γ,γ-dimethylallylpterocarpan), erystagallin A (47) (3,6a-dihydroxy-9-methoxy-2,10-di(γ,γ-dimethylallyl)pterocarpan), cristacarpin (48) (3,6a-dihydroxy-9-methoxy-10-γ,γ-dimethylallylpterocarpan), sigmoidin K (49) (3,9-dihydroxy-2,10-di(γ,γ-dimethylallyl)coumestan), erycristagallin (23) (3,9-dihydroxy-2,10-di(γ,γ-dimethylallyl)-6a,11a-dehydropterocarpan), 2-(γ,γ-dimethylallyl)-6a-hydroxyphaseollidin (50) (3,6a,9-trihydroxy 2,10-di(γ,γ-dimethylallyl)pterocarpan), eryvarin A (51) (6a-hydroxy-3-methoxy(3′,4′-dihydro-3′-hydroxy)-2′,2′-dimethylpyrano[5′,6′:9,10]pterocarpan) được phân lập từ E. variegata đối với các vi khuẩn gây sâu răng. 3,9-Dihydroxy-2,10-di(γ,γ-dimethylallyl)-6a,11a-dehydropterocarpan (erycristagallin) có hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất đối với các streptococci đường miệng, các chủng Actinomyces và Lactobacillus với nồng độ MIC là 1,56–6,25 μg/ml tiếp đó là 3,6a-dihydroxy-9-methoxy-2,10-di(γ,γ-dimethylallyl) pterocarpan (erystagallin A) và 9-hydroxy-3-methoxy-2-γ,γ-dimethylallylpterocarpan (orientanol B) (MIC 3,13–12,5 μg/ml). Tác dụng kháng khuẩn của erycristagallin đối với các mutan streptococci được dựa trên một tác dụng diệt khuẩn. Erycristagallin (MIC 6,25 μg/ml) đã ức chế hoàn toàn sự hợp nhất của thymidin được đánh dấu đồng vị vào các tế bào Streptococus mutans. Sự hợp nhất của glucozơ được đánh dấu đồng vị vào các tế bào vi khuẩn cũng được ức chế mạnh ở MIC, và ½ MIC của hợp chất giảm sự hợp nhất xuống khoảng một nửa. Các phát hiện đã cho thấy erycristagallin là tác nhân hóa học mạnh trong ngăn chặn sâu răng bằng cách ức chế sự phát triển của các vi khuẩn gây sâu răng và bằng cách tác động vào sự hợp nhất của glucozơ quyết định cho sự sản sinh các axit hữu cơ [12]. 47 48 49 50 Cũng năm 2002, một nghiên cứu khác của H. Tanaka và cộng sự (Đại học Meijo, Nhật Bản) đã sàng lọc hoạt tính kháng khuẩn đối với Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA) của 16 isoflavonoid được phân lập từ E. variegata. Mười bốn trong số 16 hợp chất được nghiên cứu bao gồm cristacarpin (48) (3,6a-dihydroxy-9-methoxy-10-c,c-dimethylallylpterocarpan), erycristagallin (23) (3,9-dihydroxy-2,10-di(c,c-dimethylallyl)-6a,11a-dehydropterocarpan), erystagallin A (47) (6a-hydroxy-3-methoxy(3’,4’-dihydro-3’-hydroxy)-2’,2’-dimethylpyrano[5’,6’:9,10]pterocarpan), erysubin F (52) (7,4’-dihydro-8,3’-di(c,c-dimethylallyl)isoflavone), eryvarin A (51) (6a-hydroxy-3-methoxy(3’,4’-dihydro-3’-hydroxy)-2’,2’-dimethylpyrano[5’,6’:9,10]pterocarpan), eryvarin C (53) (2’,4’-dihydroxy-2’’,2’’-dimethylpyrano[5’’,6’’:6,7]isoflavan, eryvarin D (54) (3-hydroxy-9-methoxy-10-c,c-dimethylallyl-6a,11a-dehydropterocarpan), eryvarin E (55) (3-hydroxy-9-methoxy-2,10-di(c,c-dimethylallyl)-6a,11a-dehydropterocarpan), folitenol (41) (3-hydroxy-2-c,c-dimethylallyl-2’’,2’’-dimethylpyrano[5’’,6’’:9,10]pterocarpan), orientanol B (39) (9-hydroxy-3-methoxy-2-c,c-dimethylallylpterocarpan), orientanol C (40) (9-hydroxy-10-c,c-dimethylallyl-2’,2’-dimethylpyrano[5’,6’:2,3]pterocarpan), orientanol F (45) (2’,4’-dihydroxy-6-c,c-dimethylallyl-2’’,2’’-dimethylpyrano[5’’,6’’:7,8]isoflavanon), phaseollidin (56) (3,9-dihydroxy-10-c,c-dimethylallylpterocarpan), phaseollin (57) (3-hydroxy-2’,2’-dimethylpyrano[5’,6’:9,10]pterocarpan), sigmoidin K (49) (3,9-dihydroxy-2,10-di(c,c-dimethylallyl)coumestan) và 2-(c,c-dimethylallyl)-6a-hydroxyphaseollidin (57) (3,6a,9-trihydroxy-2,10-di(c,c-dimethylallyl)pterocarpan) cho hoạt tính kháng khuẩn ở nồng độ rất khác nhau. Hai hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất là erycristagallin và orientanol B với các giá trị MIC 3,13–6,25 μg/ml [16]. Năm 2002, H. Tanaka và cộng sự (Đại học Meijo, Nhật Bản) đã phân lập được từ rễ của E. variegata 2 diphenylpropan-1,2-diol mới, eryvarinol A (58) và eryvarinol B (59). Cấu trúc của các hợp chất này đã được xác định là 1-(4-hydroxy-2-methoxyphenyl)-2-(4-hydroxy-3,5-dimethoxybenzoyloxy)-3-(4-hydroxyphenyl)propan-1-ol và dẫn xuất 3’’-prenyl của nó. Cả hai hợp chất này đều là diphenylpropan-1,2-diol khác thường với một nhóm syringyl [17]. 58 59 Năm 2003, H. Tanaka và cộng sự (Đại học Meijo, Nhật Bản) đã phân lập từ rễ E. variegata các 3-phenoxychromon mới, eryvarin F (60) và G (61). Eryvarin F và G là 2 dẫn xuất 3-phenoxychromon khác thường với 2 nhóm isoprenoid. Cấu trúc của các hợp chất này đã được xác định là 3-(2,4-dihydroxyphenoxy)-7-hydroxy-6,8-di(3,3-dimethylallyl)chromen-4-on và 3-(2,4-dihydroxyphenoxy)-8-(3,3-dimethylallyl)-2,2-dimethylpyrano[5,6:6,7]chromen-4-on [18]. 60 61 Năm 2003, H. Tanaka và cộng sự (Đại học Meijo, Nhật Bản) tiếp tục công bố một arylbenzofuran, erypoegin F (62) và 4 isoflavonoid, erypoegin G–J (63-65) cùng với 6 isoflavonoid đã biết, erypoegin A–E (67-71). Erypoegin F là một 2- arylbenzofuran hiếm có một nhóm fomyl và erypoegin là isoflavonoid thiên nhiên đầu tiên có nhóm 2-oxo-3-metylbutyl [28]. 62 63 64 65 66 Năm 2004, M. Sato (Đại học Asahi, Nhật Bản) nghiên cứu về khả năng kháng khuẩn của bidwillon B (46) được phân lập từ E. variegata. Bidwillon B ức chế sự phát triển của 12 chủng MRSA ở nồng độ MIC 3,13–6,25 μg/ml, trong khi các MIC của mupirocin là 0,20–3,13 mg/l. Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) của bidwillon B và mupirocin tương ứng là 6,25–25 mg/l (MBC90: 1,25 mg/l) và 3,13-25 mg/l (MBC90: 25 mg/l). Khi bidwillon B và mupirocin được kết hợp, các tác dụng hợp đồng đã được xác định cho 11 chủng MRSA (chỉ số nồng độ ức chế các phân đoạn, 0,5–0,75). Các giá trị MBC của mupirocin khi có bidwillon B (3,13 g/ml) đã được giảm xuống 0,05–1,56 g/ml. Bidwillon B ở các giá trị MIC ức chế mạnh sự hợp nhất của thymidin, uridin, glucozơ và isoleucin được đánh dấu phóng xạ vào các tế bào MRSA. Mupirocin có tác dụng ức chế thấp hơn bidwillon B đối với sự hợp nhất của thymidin, uridin và glucozơ, nhưng sự hợp nhất isoleucin đã được ngăn chặn hoàn toàn bởi kháng sinh này. Các kết quả này đã cho thấy bidwillon B có hoạt tính kháng MRSA đủ mạnh để ức chế sự phát triển và hồi phục và hợp chất này đã tác dụng hợp đồng với mupirocin. Các kết quả cũng cho thấy cả 2 hợp chất đã tác dụng lên MRSA qua các cơ chế khác nhau. Bidwillon B có thể được chứng tỏ là một tác nhân điều trị hóa thực vật mạnh và tác nhân kết hợp với mupirocin trong sự điều trị và dự phòng các bệnh nhiễm khuẩn MRSA [10]. Năm 2004, H. Tanaka và cộng sự (Đại học Meijo, Nhật Bản) công bố phân lập được 3 isoflavonoid mới, eryvarin M (72), eryvarin N (73) và eryvarin O (74); 2 2-arylbenzofuran mới, các eryvarins P (75) và Q (76), một 3-aryl-2,3-dihydrobenzofuran mới, eryvarin R (77) cùng với ba hợp chất đã biết khác từ rễ E. variergata. Eryvarin R được xác định là một dẫn xuất 3-aryl-2,3-dihydrobenzofuran khác thường với một nhóm fomyl. Eryvarin Q cho thấy hoạt tính kháng khuẩn đối với vi khuẩn Staphylococcus aureus kháng methicillin [30]. 72 73 74 75 76 77 Năm 2006, L. Xiaoli và cộng sự (Đại học Dược Shen Yang, Trung Quốc) đã phân lập từ vỏ E. varirgata 3 isoflavon mới, 5,4’-dihydroxy-8-(3,3-dimethylallyl)-2’-methoxyisopropylfurano[4,5:6,7]isoflavon (78), 5,7,4’-trihydroxy-6-(3,3-dimethylallyloxiranylmethyl)isoflavon (79) và 5,4’-dihydroxy-8-(3,3-dimethylallyl)-2’-hydroxymethyl-2’-methylpyrano[5,6:6,7]isoflavon (80), một isoflavanon mới, 5,4’-dihydroxy-2’-methoxy-8-(3,3-dimethylallyl)-2’,2’dimethylpyrano[5,6:6,7]isoflavanon (81) cùng với 7 hợp chất đã biết, euchrenon b10 (82), isoerysenegalensein E (83), wighteon (34), laburnetin (84), lupiwighteon (85), erythrodiol (86) và axit oleanolic (87). Ảnh hưởng của các hợp chất này lên sự tăng sinh ung thư cốt xương chuột (UMR 106) đã được nghiên cứu [23]. 78 79 80 81 Năm 2007, Y. Zhang và cộng sự (Đại học Dược Shen Yang, Trung Quốc) công bố nghiên cứu về hoạt tính chống loãng xương của phần chiết vỏ thân E. variegata (EV) được thử nghiệm trên chuột được cắt bỏ buồng trứng. Sự tiếp nhận phần chiết EV ở lượng 300 và 600 mg/kg mỗi ngày bằng đường uống trong 14 tuần đã ngăn chặn sự tăng các mức ALP, OCN huyết thanh và DPD nước tiểu gây bởi OVX. Sự phân tích hình thái mô đầu gần xương chày cho thấy phần chiết EV ngăn chặn sự giảm độ dày thớ và diện tích thớ gây bởi sự thiếu hụt estrogen cũng như khôi phục sự tăng phân tách thớ trong một sự phụ thuộc vào nồng độ. Hơn thế nữa, phần chiết EV làm tăng sự hấp thụ năng lượng và sự cứng chắc của thân xương giữa xương đùi chuột. Nghiên cứu này đã cho thấy rõ EV có thể kìm hãm tốc độ luân chuyển xương cao gây bởi sự thiếu hụt estrogen, kìm hãm sự mất xương và tăng các tính chất cơ sinh của xương trên chuột OVX [24]. Năm 2008, Y. Zhang và cộng sự (Đại học Chicago, Mỹ) đã phân lập được các dẫn xuất của genistein chủ yếu ở dạng prenylgenistein từ phần chiết EV, bao gồm 6-prenylgenistein (88), 8-prenylgenistein (89), và 6,8-diprenylgenistein (90). Nghiên cứu đã được thực hiện để xác định mối liên quan giữa cấu trúc-chức năng của các hợp chất này trong sự tăng sinh của tế bào xương, sự biệt hóa và khoáng hóa trong các tế bào UMR 106. Kết quả đã cho thấy genistein không kích thích phát triển tế bào trong khi 8-prenylgenistein thúc đẩy sự phát triển của tế bào khoảng 10-23%. Ngược lại, xử lý bằng 6-prenylgenistein trong 48 h làm giảm sự tăng sinh của tế bào UMR 106 khi được so sánh với tế bào đã được xử lý bằng genistein. Sự tăng sinh của các tế bào được xử lý bằng  6,8-diprenylgenistein mạnh hơn so với các tế bào được xử lý bằng 6-prenylgenistein trong tất cả các nồng độ thử nghiệm. Đối với hoạt tính ALP, sự tăng mạnh đã được phát hiện trong các tế bào được xử lý bằng 8-prenylgenistein hoặc 6,8-diprenylgenistein trong 48h ở nồng độ 10-10 M. Trong nghiên cứu khoáng hóa, hàm lượng Ca và P trong chất ngoại bào đã được tăng mạnh trong các tế bào được xử lý bằng 8-prenylgenistein. Các kết quả cho thấy các dẫn xuất genistein cho các tác dụng kích thích mạnh lên sự loãng xương trong các tế bào UMR 106. Dựa trên các nghiên cứu mối quan hệ hoạt tính – cấu trúc sự prenyl hóa ở C-8  chứ không phải ở C-6 có thể làm tăng tác dụng bảo vệ xương của genistein [31]. 88 89 90 Chương 2: NHIỆM VỤ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU CỦA LUẬN VĂN 1- Xây dựng một quy trình chiết thích hợp để điều chế các phần chiết chứa các hợp chất hữu cơ thiên nhiên từ lá, vỏ thân và gỗ cây Vông nem. 2- Nghiên cứu quy trình phân tích và phân tách các phần chiết nhận được từ từ lá, vỏ thân và gỗ cây Vông nem. 3- Phân lập các hợp chất chính trong các phần chiết nhận được từ từ lá, vỏ thân và gỗ cây Vông nem. 4- Xác định cấu trúc của các hợp chất được phân lập. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Phương pháp chiết và phân tách các hợp chất trong mẫu thực vật Ngâm chiết mẫu thực vật đã phơi khô, nghiền nhỏ bằng MeOH. Để tăng hiệu suất chiết tiến hành ngâm chiết nhiều lần, mỗi lần ngâm trong 3 ngày. Phần chiết MeOH này sau đó được phân bố giữa H2O và các dung môi hữu cơ khác nhau nhằm làm giàu các lớp chất theo độ phân cực tăng dần. Các phương pháp phân tích, phân tách và phân lập sắc ký Sắc ký lớp mỏng Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) là một phương pháp hiện đang được sử dụng rất rộng rãi trong các ngành khoa học hoá học, sinh học, hoá dược với nhiều mục đích khác nhau do các đặc tính ưu việt của nó: độ nhạy cao, lượng mẫu phân tích nhỏ (thường từ 1 đến 100x10-6 g), tốc độ phân tích nhanh, kỹ thuật phân tích dễ thực hiện. Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) có thể được dùng để phân tích định tính hay định lượng hoặc kiểm tra độ tinh khiết của các hợp chất cũng như hỗ trợ cho các phương pháp sắc ký cột để xác định và kiểm soát điều kiện phân tách. Sắc ký cột Sắc ký cột thường (CC) được thực hiện dưới trọng lực của dung môi trên silica gel theo cơ chế sắc ký hấp phụ và được sử dụng để phân tách các phần chiết, phân lập và tinh chế các hợp chất. Sắc ký cột nhanh (FC) được thực hiện dưới áp lực không khí nén để dung môi rửa giải đi qua cột nhanh hơn. Sắc ký cột tinh chế (Mini–C) được thực hiện để tinh chế lượng nhỏ các mẫu chất (<15 mg). Phương pháp kết tinh lại Phương pháp này được sử dụng để tách và làm sạch chất rắn. Việc làm sạch chất rắn bằng kết tinh là dựa trên sự khác nhau về độ tan của hợp chất mục tiêu và của tạp chất trong dung môi hoặc một hệ dung môi đã chọn. Các phương pháp nghiên cứu cấu trúc (các phương pháp phổ) Các phương pháp phổ hiện nay là các phương pháp hiện đại và hữu hiệu nhất để xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ bao gồm: Phổ hồng ngoại (IR); Phổ khối lượng phun bụi điện tử (ESI-MS); Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13 (13C-NMR) với chương trình DEPT; và Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều (2D NMR), HSQC và HMBC.Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu của luận văn là lá, vỏ thân và gỗ cây vông nem (Erythrina orientalis (L). Murr., Fabaceae) được thu thập tại Hà Nội vào tháng 10 năm 2008 (lá) và tháng 4 năm 2009 (vỏ thân và gỗ). Mẫu được hong trong bóng dâm, sấy ở nhiệt độ 50oC sau đó được xay thành bột mịn. ĐIỀU CHẾ CÁC PHẦN CHIẾT TỪ CÂY VÔNG NEM Phương pháp chiết có một ảnh hưởng quan trọng đến việc phân lập các hợp chất thuộc các lớp chất hữu cơ mong muốn. Nhằm đạt được một sự làm giàu sơ bộ mỗi loại chất trong các phần chiết riêng biệt, các bộ phận từ cây Vông nem (lá, vỏ thân và gỗ) đã được chiết chọn lọc với các dung môi có độ phân cực tăng dần. Ba mẫu trên được ngâm chiết theo cùng một quy trình như sau: Mẫu đã xay mịn được ngâm chiết với MeOH ở nhiệt độ phòng trong 3 lần, mỗi lần 3 ngày. Dịch MeOH thu được sau khi đã lọc bỏ bã được cất loại dung môi dưới áp suất giảm cho phần chiết MeOH. Chiết 2 pha lỏng (H2O - dung môi hữu cơ) các lớp chất trong phần chiết MeOH bằng các dung môi với độ phân cực tăng dần: Mẫu lá (EL): Chiết lần lượt với các dung môi là n-hexan, điclometan và etyl axetat. Các dịch chiết được làm khan bằng Na2SO4 , cất loại dung môi dưới áp suất giảm và thu được các phần chiết tương ứng EL1 (hiệu suất 2% so với lượng nguyên liệu khô), EL2 (hiệu suất 0,57% so với lượng nguyên liệu khô) và EL3 (hiệu suất 0,25% so với lượng nguyên liệu khô). Mẫu vỏ thân (EB): Chiết lần lượt bằng 2 dung môi là n-hexan và etyl axetat. Các dịch chiết được làm khan bằng Na2SO4, cất loại dung môi dưới áp suất giảm và thu được các phần chiết tương ứng EB1 (hiệu suất 1,3% so với lượng nguyên liệu khô) và EB2 (hiệu suất 2% so với lượng nguyên liệu khô) Mẫu gỗ (EW): Chiết bằng dung môi etyl axetat. Dịch chiết được làm khan bằng Na2SO4, cất loại dung môi dưới áp suất giảm và thu được phần chiết tương ứng EOC (hiệu suất 1,3% so với lượng nguyên liệu khô). Hiệu suất thu nhận các phần chiết từ 3 mẫu lá (EL), vỏ thân (EB) và gỗ (EW) được nêu trong Bảng 10, Mục 4.3, Chương 4. Quy trình chiết được tóm tắt ở Sơ đồ 1. Dịch nước Chiết với n-hexan Chiết với điclometan Chiết với etyl axetat Dịch chiết điclometan Dịch chiết Etyl axetat Dịch chiết n-hexan Phần chiết điclometan Phần chiết etyl axetat Phần chiết n-hexan 1. Làm khô bằng Na2SO4 2. Cất loại kiệt dung môi Phần chiết MeOH – trong nước Hòa nước cất 1. Ngâm chiết với MeOH (3 lần, 3 ngày/lần) 2. Lọc bỏ bã 3. Cất loại kiệt MeOH Nguyên liệu Phần chiết MeOH Sơ đồ 1: Quy trình chiết các hợp chất từ cây Vông nem PHÂN TÍCH CÁC PHẦN CHIẾT BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG (TLC) Phân tích TLC các phần chiết được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck). Quá trình phân tích sắc ký được thực hiện với các hệ dung môi với độ phân cực khác nhau nhằm mục đích tìm hệ cho sự phân giải tốt nhất. Sau khi triển khai sắc ký, bản mỏng được sấy khô, hiện màu với thuốc hiện 1% vanilin/ H2SO4 đặc , hơ nóng ở 120oC và đánh dấu các vệt chất màu xuất hiện trên bản mỏng. Phân tích phần chiết n-hexan lá cây Vông nem (EL1) Sau khi sử dụng một số hệ dung môi như n-hexan-axeton và n-hexan-EtOAc với các tỷ lệ khác nhau chúng tôi nhận thấy các hệ n-hexan-axeton 10:1, 6:1 và 3:1 (v/v) cho sự phân giải tốt đối với phần chiết n-hexan. Kết quả phân tích TLC được trình bày trong Bảng 1. Bảng 1: Phân tích TLC phần chiết n-hexan (EL1) Hệ dung môi n-hexan-axeton Rf Dạng vệt Hiện màu 10 : 1 0,97 tròn hồng 0,92 tròn tím 0,39 tròn nâu 0,37 tròn tím 0,26 tròn nâu 0,17 tròn hồng 0,13 tròn nâu 0,1 tròn nâu 6 : 1 0,92 tròn hồng 0,82 tròn tím 0,5 tròn nâu 0,42 tròn tím 0,36 tròn nâu 0,26 tròn hồng 0,21 tròn nâu 0,16 tròn nâu 3 : 1 0,95 tròn hồng 0,6 tròn tím 0,54 tròn nâu 0,5 tròn tím 0,42 tròn nâu 0,37 tròn hồng 0,3 tròn nâu Kết luận: Như vậy, phần chiết n-hexan có nhiều chất với độ phân cực khác nhau, thể hiện ở Rf phân tán. Các tỷ lệ dung môi n-hexan-axeton (10:1, 6:1, 3:1) có thể được sử dụng để triển khai sắc ký cột bởi sự phân giải tốt. Phân tích phần chiết điclometan lá cây Vông nem (EL2) Sau khi sử dụng một số hệ dung môi như điclometan-EtOAc, điclometan-axeton, n-hexan-axeton và n-hexan-EtOAc với các tỷ lệ khác nhau chúng tôi nhận thấy các hệ n-hexan-axeton với 20:1, 10:1 và 6:1 (v/v) cho khả năng tách tốt đối với phần chiết điclometan. Kết quả phân tích TLC được trình bày trong Bảng 2. Bảng 2: Phân tích TLC phần chiết điclometan (EL2) Hệ dung môi n-hexan-axeton Rf Dạng vệt Hiện màu 20 : 1 0,66 Tròn hồng 0,17 Tròn nâu 0,13 Tròn hồng 0,11 Tròn nâu 10 : 1 0,71 Tròn hồng 0,26 Tròn nâu 0,17 Tròn hồng 0,13 Tròn nâu 6 : 1 0,76 Tròn hồng 0,36 Tròn nâu 0,26 Tròn hồng 0,21 Tròn nâu Kết luận: Như vậy, phần chiết điclometan có nhiều chất với độ phân cực liền nhau, thể hiện ở Rf rất phân tán. Tuy vậy, tỷ lệ dung môi n-hexan-axeton với tỷ lệ 6:1 có thể được sử dụng để triển khai sắc ký cột bởi sự phân giải khá tốt. Phân tích phần chiết etyl axetat lá cây Vông nem (EL3) Sau khi sử dụng một số hệ dung môi với các tỷ lệ khác nhau chúng tôi nhận thấy hệ 3 dung môi n-hexan-etyl axetat-axit fomic với tỷ lệ 20:20:1 (v/v/v) cho khả năng phân giải tốt đối với phần chiết etyl axetat. Kết quả cụ thể được trình bày trong Bảng 3. Bảng 3: Phân tích TLC phần chiết etyl axetat (EL3) STT Rf Dạng vệt Hiện màu 1 0,86 tròn Xanh 2 0,56 tròn Tím 3 0,45 tròn Xanh Kết luận: Như vậy, trong phần chiết etyl axetat có chứa ít chất với độ phân cực khác nhau, thể hiện ở Rf rất phân tán. Hệ dung môi n-hexan-etyl axetat-axit formic với tỷ lệ 20:20:1 có thể được sử dụng để triển khai sắc ký cột bởi sự phân giải khá tốt. Phân tích TLC phần chiết n-hexan vỏ thân cây Vông nem (EB1) Sau khi sử dụng một số hệ dung môi với các tỷ lệ khác nhau chúng tôi nhận thấy hệ điclometan-etyl axetat 49:1, 19:1 và 10:1 (v/v) cho khả năng phân giải tốt nhất đối với phần chiết n-hexan. Kết quả cụ thể được trình bày trong Bảng 4. Bảng 4: Phân tích TLC phần chiết n-hexan (EB1) Hệ dung môi điclometan-etyl axetat Rf Dạng vệt Hiện màu 49 : 1 0,94 tròn Hồng 0,90 tròn Tím 0,84 tròn Nâu 0,78 tròn Tím 0,63 tròn tím 0,42 tròn tím 0,19 tròn vàng 0,1 tròn tím đậm 19: 1 0,96 tròn Hồng 0,90 tròn tím 0,77 tròn tím 0,65 tròn tím 0,52 tròn vàng 0,51 tròn Hồng 0,26 tròn xanh 0,2 tròn tím đậm 10 : 1 0,97 tròn Hồng 0,90 tròn tím 0,77 tròn tím 0,70 tròn tím 0,61 tròn vàng 0,55 tròn Hồng 0,32 tròn xanh 0,26 tròn tím đậm Kết luận: Như vậy, phần chiết n-hexan có rất nhiều chất với độ phân cực khác nhau, thể hiện ở Rf phân tán. Các tỷ lệ dung môi điclometan - etyl axetat với tỷ lệ khác nhau 49:1, 19:1 và 10:1 có thể được sử dụng để triển khai sắc ký cột bởi sự phân giải khá tốt. Phân tích phần chiết etyl axetat vỏ thân cây Vông nem (EB2) Tiến hành khảo sát TLC so sánh phần chiết etyl axetat vỏ thân cây Vông nem (EB2) song song với phần chiết n-hexan từ vỏ thân (EB1) cho các kết quả định tính tương tự. Phần chiết etyl axetat (EB2) do đó đã không được tiếp tục phân tách sắc ký cột. Kết quả cụ thể được trình bày trong Bảng 5. Bảng 5: Phân tích TLC phần chiết etyl axetat (EB2) Hệ dung môi n-hexan-axeton Rf Dạng vệt Hiện màu 49 : 1 0,94 tròn hồng 0,90 tròn tím 0,84 tròn nâu 0,78 tròn tím 0,63 tròn tím 0,42 tròn tím 0,19 tròn vàng 0,1 tròn tím đậm 19: 1 0,96 tròn hồng 0,90 tròn tím 0,77 tròn tím 0,65 tròn tím 0,52 tròn vàng 0,51 tròn hồng 0,26 tròn xanh 0,2 tròn tím đậm 10 : 1 0,97 tròn hồng 0,90 tròn tím 0,77 tròn tím 0,70 tròn tím 0,61 tròn vàng 0,55 tròn hồng 0,32 tròn xanh 0,26 tròn tím đậm Kết luận: Kết quả này cho thấy, trong vỏ thân Vông nem có chứa một hàm lượng lớn các chất chính. Các chất này xuất hiện trong cả hai phần chiết. Chúng tôi đi đến quyết định tập trung phân tách các chất từ phần chiết EB1. Phân tích phần chiết etyl axetat gỗ cây Vông nem (EW1) Sau khi sử dụng một số hệ dung môi với các tỷ lệ khác nhau chúng tôi nhận thấy hệ điclometan-etyl axetat 19:1 (v/v) cho khả năng phân giải tốt đối với phần chiết etyl axetat. Kết quả cụ thể được trình bày trong các Bảng 6. Bảng 6: Phân tích TLC phần chiết etyl axetat gỗ cây Vông nem (EW1) STT Rf Dạng vệt Hiện màu 1 0,94 Tròn hồng 2 0,84 Tròn tím 3 0,69 Tròn tím 4 0,62 Tròn tím 5 0,56 Tròn vàng 6 0,4 Tròn xanh 7 0,37 Tròn tím 8 0,2 Tròn tím đậm Kết luận: Như vậy, phần chiết n-hexan có rất nhiều chất với độ phân cực khác nhau, thể hiện ở Rf phân tán. Các tỷ lệ dung môi điclometan-etyl axetat với tỷ lệ khác nhau 49:1, 19:1 và 10:1 có thể được sử dụng để triển khai sắc ký cột bởi sự phân giải khá tốt. PHÂN TÁCH CÁC PHẦN CHIẾT TỪ CÂY VÔNG NEM Phân tách phần chiết n-hexan lá cây Vông nem (EL1) Các kết quả phân tích TLC phần chiết n-hexan cho hệ dung môi phân giải tốt nhất trên chất hấp phụ silica gel là n-hexan-axeton. Các hệ dung môi n-hexan-axeton với các tỷ lệ 95:5, 10:1, 6:1 và 3:1 đã được chọn làm hệ dung môi rửa giải gradient cho sắc ký cột (CC). Phân tách sắc ký gradient (CC) phần chiết n-hexan trên chất hấp phụ silica gel cho 8 nhóm phân đoạn từ EL1.1 đến EL1.8. Nhóm phân đoạn EL1.4 được rửa bằng n-hexan cho 1-octacosanol (M). Nhóm phân đoạn EL1.5 được rửa bằng n-hexan cho chất β-sitosterol (C). EL1 (15 g) EL1.1 - EL1.3 1-7 (0,5 g) M (15 mg) EL1.4 7-9 (3,2 g) EL1.5 10-13 (0,7 g) rửa bằng n-hexan rửa bằng n-hexan C (0,3 g) EL1.6 -EL1.8 14-30 (1,9 g) Dội cột (2 g) CC, gradient, silica gel n-hexan; n-hexan-axeton 95:5, 10:1, 6:1 và 3:1; MeOH Quá trình phân tách phần chiết n-hexan lá cây Vông nem (EL1) được trình bày trong Sơ đồ 2. Sơ đồ 2 : Phân tách phần chiết n-hexan lá cây Vông nem (EL1) Phân tách phần chiết điclometan lá cây Vông nem (EL2) Các kết quả phân tích TLC phần chiết điclometan cho hệ dung môi phân giải tốt nhất trên chất hấp phụ silica gel là n-hexan-axeton. Các hệ dung môi n-hexan-axeton với các tỷ lệ 20:1, 10:1 và 6:1 đã được chọn làm hệ dung môi rửa giải gradient cho sắc ký cột (CC). Từ phần chiết điclometan (EL2) đã phân lập được apigenin A dưới dạng bột vô định hình màu trắng. Quá trình phân tách phần chiết điclometan lá cây Vông nem (EL2) được trình bày trong Sơ đồ 3. EL2 (11 g) EL2.1 -EL2.3 1-11 (1,8 g) EL2.4 -EL2.8 12-19 (0,9 g) EL2.9 -EL2.10 20-27 (0,8 g) EL2.11 28-31 (0,5 g) EL2.12 -EL2.13 32-34 (0,2 g) CC, gradient, silica gel n-hexan; n-hexan-axeton 20:1, 10:1, 6:1; MeOH EL2.11.1 1-9 (0,1 g) EL2.11.2 10-17 (0,07 g) EL2.11.4 24-34 (0,1 g) EL2.11.3 18-23 (0,05 g) CC, silica gel n-hexan-etyl axetat 4:1 A (20 mg) Kết tinh lại Sơ đồ 3 : Phân tách phần chiết điclometan lá cây Vông nem (EL2) Phân tách phần chiết etyl axetat lá cây Vông nem (EL3) Từ phần chiết etyl axetat (EL3) một chất bột màu vàng trong EtOAc đã được kết tinh. Chất này được rửa với các dung môi n-hexan và điclometan thu được chất R tinh khiết (vitexin). Các kết quả phân tích TLC phần chiết etyl axetat cho hệ dung môi phân giải tốt nhất trên chất hấp phụ silica gel là n-hexan-etyl axetat-axit formic với tỷ lệ 20:20:1. Hệ dung môi n-hexan-etyl axetat-axit formic với tỷ lệ 20:20:1 đã được chọn làm hệ dung môi rửa giải cho sắc ký cột (CC). Phân tách sắc ký gradient (CC) phần chiết etyl axetat trên chất hấp phụ silica gel cho 4 nhóm phân đoạn từ EL3.1 đến EL3.4. Do hàm lượng chất trong các nhóm phân đoạn này rất thấp nên việc phân lập các chất trong phần chiết này không được tiếp tục thực hiện. Quá trình phân tách phần chiết etyl axetat lá cây Vông nem (EL3) được trình bày trong Sơ đồ 4. EL3 (5 g) EL3.1 1-4 (<0,1 g) EL3.2 5-7 (< 0,1 g) EL3.3 8-11 (< 0,1 g) EL3.4 12-18 (< 0,1 g) CC, silica gel n-hexan–etyl axetat–axit formic 20:20:1 EL3 (4,8 g) R (0,2 g) Dội cột (2 g) rửa n-hexan, điclometan Sơ đồ 4: Phân tách phần chiết etyl axetat lá cây Vông nem (EL3) Phân tách phần chiết n-hexan vỏ thân cây Vông nem (EB1) Từ dịch chiết n-hexan (EB1) kết tủa được một chất bột màu trắng. Bột này được rửa với các dung môi n-hexan và điclometan thu được S là hỗn hợp phức tạp của các tecpen glycosid (phổ 1H-NMR). Các kết quả phân tích TLC với các hệ dung môi khác nhau cho thấy phần chiết n-hexan (EB1) được phân tách tốt trên chất hấp phụ silica gel bằng các hệ dung môi điclometan-EtOAc với các tỷ lệ lần lượt là 49:1, 20:1 và 10:1. Các hệ dung môi này đã được chọn làm hệ dung môi rửa giải gradient cho sắc ký cột (CC). Phân tách sắc ký phần chiết n-hexan trên chất hấp phụ silica gel cho 8 nhóm phân đoạn từ EB1.1 đến EB1.8. Nhóm phân đoạn EB1.3 được phân tách bằng sắc ký cột thường với hệ dung môi n-hexan-EtOAc 9:1 cho 1-octacosanol (M), chất này đã nhận được từ phần chiết n-hexan của lá cây Vông nem (EL1) (phân tích TLC và co-TLC). Nhóm phân đoạn EB1.4 và EB1.5 được rửa bằng n-hexan cho chất C (β-sitosterol, phân tích TLC và co-TLC). Các nhóm phân đoạn EB1.6 được phân tách hai lần bằng sắc ký cột thường với các hệ dung môi n-hexan-EtOAc 6:1 cho 5 nhóm phân đoạn EB1.6.1 - EB1.6.5 và n-hexan-EtOAc (8:1) để phân tách nhóm phân đoạn EB1.6.2 cho các chất scandenon (T) và 6,8-điprenylgenistein (X). Nhóm phân đoạn EB1.8 được rửa bằng n-hexan cho soyasapogenol (H). Quá trình phân tách phần chiết n-hexan gỗ cây Vông nem (EB1) được trình bày trong Sơ đồ 5. EB1 (14 g) EB1.1 -EB1.2 1-2 (15 mg) EB1.3 3-4 (1 g) EB1.4 -EB1.5 5-7 (0,8 g) EB1.7 11-20 (0,5 g) EB1.8 20-25 (0,5 g) CC, gradient, silica gel điclometan, điclometan-EtOAc 49:1, 20:1, 10:1; EtOAc C (0,1 g) EB1.6 8-10 (1,5 g) rửa bằng n-hexan M (15 mg) CC, silica gel n-hexan-EtOAc 6:1 EB1.6.2 1-6 (0,01 g) EB1.6.2 7-17 (0,15 g) EB1.6.2 19-23 (0,03 g) T (130 mg) X (20 mg) H (0,1 g) rửa bằng n-hexan EB1.6.1 1-25 (0,1 g) EB1.6.2 26-42 (0,3 g) EB1.6.3-5 43-65 (0,6 g) CC, silica gel n-hexan-EtOAc 8:1 rửa bằng n-hexan rửa bằng n-hexan, kết tinh lại trong điclometan CC, silica gel n-hexan-EtOAc 9:1 EB1.3.6 21-32 (0,05 g) EB1.3.1-5 1-20 (0,2 g) EB1.3.7-9 33-65 (0,3 g) rửa bằng n-hexan, kết tinh lại trong điclometan Sơ đồ 5: Phân tách phần chiết n-hexan vỏ thân cây Vông nem (EB1) Phân tách phần chiết etyl axetat gỗ cây Vông nem (EW1) Các kết quả phân tích TLC với các hệ dung môi khác nhau cho thấy phần chiết etyl axetat gỗ cây Vông nem (EW1) được phân tách tốt trên chất hấp phụ silica gel bằng các hệ dung môi điclometan -EtOAc với các tỷ lệ lần lượt là 49:1, 20:1 và 10:1. Các hệ dung môi này đã được chọn làm hệ dung môi rửa giải gradient cho sắc ký cột (CC). Phân tách sắc ký phần chiết n-hexan trên chất hấp phụ silica gel cho 5 nhóm phân đoạn từ 5 nhóm phân đoạn từ EW1.1 đến EW1.5. Nhóm phân đoạn EW1.2 được phân rửa bằng n-hexan cho 1-octacosanol (M) nhận được từ phần chiết n-hexan của lá cây Vông nem. Nhóm phân đoạn EW1.3 được rửa bằng n-hexan cho β-sitosterol (C). Nhóm phân đoạn EW1.4 được rửa bằng n-hexan cho soyasapogenol (H). EW1 (4 g) EW1.1 1 (0,3 g) EW1.2 2-3 (0,45 g) EW1.3 4-5 (0,1 g) EW1.5 10-11 (0,1 g) Dội cột (0,8 g) CC, gradient, silica gel điclometan; điclometan-EtOAc 49:1, 20:1, 10:1; EtOAc C (50 mg) EW1.4 6-9 (0,5 g) H (40 mg) rửa bằng n-hexan M (10 mg) rửa bằng n-hexan rửa bằng n-hexan Quá trình phân tách phần chiết etyl axetat gỗ cây Vông nem (EW1) được trình bày trong Sơ đồ 6. Sơ đồ 6: Phân tách phần chiết etyl axetat gỗ cây Vông nem (EW1) CẤU TRÚC CỦA CÁC HỢP CHẤT ĐƯỢC PHÂN LẬP Từ các phần chiết lá cây Vông nem các hợp chất 1-octacosanol (M) và β-sitosterol (C) (EL1), apigenin (A) (EL2) và vitexin (R) (EL3) đã được phân lập. Từ các phần chiết vỏ thân cây Vông nem (EB1) các hợp chất 1-octacosanol (M), β-sitosterol (C), soyasapogenol B (H), scandenon (T) và 6,8-điprenylgenistein (X) đã được phân lập. Từ phần chiết etyl axetat gỗ cây Vông nem (EW1) các hợp chất 1-octacosanol (M), β-sitosterol (C) và soyasapogenol B (H) đã được phân lập. 1-Octacosanol (M) Hợp chất M được phân lập bằng sắc ký cột dưới dạng chất bột vô định hình màu trắng, Rf = 0,57 (TLC, silica gel, hệ dung môi n-hexan-EtOAc 5:1). Phổ 1H-NMR (CDCl3) của chất (M) cho các tín hiệu cộng hưởng từ proton ở δH 0,88 (3H, t, J = 7,0 Hz) của một nhóm metyl liên kết với một nhóm metylen, tín hiệu dải rộng của các nhóm metylen của một mạch ankyl ở δH 1,18-1,36 và một nhóm –CH2-CH2-OH liên kết với mạch ankyl [δH 1,55 (1H, quintet, J = 7,0 Hz, H2-2) và 3,63 (2H, dt, J = 5,5 Hz, 6,5 Hz, H2-1)]. Chiều dài của mạch ankyl đã được xác định là 25 nhóm metylen dựa trên tỷ lệ các đường cong tích phân trên phổ 1H-NMR. Trên cơ sở phổ 1H-NMR, chất M đã được xác định là 1-octacosanol (CH3-(CH2)26-CH2-OH). 1-Octacosanol là thành phần của sáp lá thực vật như của Triticum aestirum (Gramineae) và Beta vulgaris (Chenopodiaceae). Apigenin (A) Hợp chất A được phân lập dưới dạng bột vô định hình màu vàng nhạt, Rf = 0,88 (TLC, silica gel, hệ dung môi n-hexan-EtOAc 10:1). A Phổ 1H-NMR (DMSO-d6) của chất A cho các tín hiệu cộng hưởng từ proton của một vòng benzen thế 1,4 [δH 6,92 (2H, d, J = 9,0 Hz) và 7,91 (2H, d, J = 9,0 Hz)], các proton ở vị trí meta so với nhau của một vòng benzen thế 4 lần [δH 6,18 (1H, d, J = 2,0 Hz) và 6,47 (1H, d, J = 2,0 Hz)]. Các dữ kiện phổ này cùng với sự xuất hiện của một tín hiệu singlet ở δH 12,95 của một nhóm hiđroxi liên kết hiđro, có thể là với một nhóm cacbonyl ở C-4 đã cho giả thiết về một cấu trúc flavonoit cho chất A. Sự xuất hiện của tín hiệu proton đặc trưng ở H-3 của một flavon [δH 6,76 (s)] đã xác định A là apigenin (4',5,7-trihiđroxiflavon) [6]. Apigenin là một tác nhân kháng khuẩn, chống viêm và chất ức chế nhiều enzyme. Apigenin cũng là aglycon của nhiều hợp chất glycosid từ thực vật. β-Sitosterol (C) Hợp chất C được phân lập dưới dạng tinh thể hình kim màu trắng, đ.n.c. 135-136oC, Rf = 0,3 (TLC, silica gel, hệ dung môi n-hexan-axeton 10:1). C Hợp chất này được nhận dạng là β-sitosterol trên cơ sở so sánh TLC và co-TLC với chất chuẩn β-sitosterol. Vitexin (R) Hợp chất R được phân lập dưới dạng bột vô định hình màu vàng nhạt. Hợp chất R đã được xác định là một flavon C-glucosid dựa trên các dữ kiện phổ 1H-NMR, 13C-NMR và DEPT. Phổ 1H-NMR (DMSO-d6) của hợp chất R cho các tín hiệu proton của 2 doublet tương tác octo với nhau [δH 6,89 (2H, d, J = 8,5 Hz) và 8,02 (2H, d, J = 8,5 Hz)]; các tín hiệu này được gán tương ứng cho các vị trí H-3'/H-5' và H-2'/H-6' của vòng B, một singlet của H-3 [δH 6,77 (1H, s)], một singlet của một proton duy nhất của vòng A [δH 6,28 (1H, s)] và các tín hiệu ở trường thấp của nhóm 5-OH tạo liên kết hiđro với nhóm cacbonyl ở C-4 và một proton anomeric của một gốc đường [δH 4,69 (1H, d, J = 10,0 Hz)]. So sánh các tín hiệu cộng hưởng từ cacbon 13 của chất R với của apigenin đã xác định được chất R là một apigenin C-glucosid [29]. Các sự thay đổi độ chuyển dịch hóa học quan sát được chủ yếu ở C-7 (∆δC -1,6), C-8 (∆δC +10,0) và C-9 (∆δC -1,4). Gốc đường đã được xác định là một nhóm glucopyranosyl dựa trên các phổ 13C-NMR và DEPT [δC 61,3 (t), 70,5 (d), 70,8 (d), 73,4 (d), 78,6 (d) và 81,8 (d)]. Các giá trị δC đã hoàn toàn xác định khả năng liên kết của nhóm glucopyranosyl vào C-8 của vòng A của apigenin [6], gây ra sự chuyển dịch δC ở các vị trí C-7, C-8 và C-9. Trên cơ sở các dữ kiện phổ hợp chất R đã được xác định là apigenin 8-C-β-D-glucopyranosid (vitexin) [5]. Cấu hình β của proton anomeric đã được xác định từ hằng số J = 10,0 Hz. Phổ ESI-MS của chất R cho pic ion ở m/z 433,67 ([M + H]+) phù hợp với khối lượng phân tử của vitexin (C21H20O10). R Soyasapogenol B (H) Hợp chất H được phân lập dưới dạng tinh thể hình kim màu trắng, đ.n.c. 257-258oC, Rf = 0,16 (TLC, silica gel, hệ dung môi n-hexan-EtOAc 4:1). H Trên phổ 1H-NMR (CDCl3 và CD3OD) xuất hiện các tín hiệu cộng hưởng từ proton của 7 nhóm metyl bậc ba (7s) [δH 0,85; 0,91; 0,92; 0,95; 1,03; 1,11 và 1,23], 2 nhóm oximetin [δH 3,39 và 3,41 (mỗi tín hiệu 1H, dd)], một nhóm hiđroximetylen dưới dạng 2 doublet AB [δH 3,32 và 4,19 (mỗi tín hiệu 1H, d, J = 11,0 Hz)] và một nối đôi thế ba lần [δH 5,3 (1H, t, J = 3,5 Hz)]. Phổ 13C-NMR và DEPT (CDCl3 và CD3OD) của H cũng khẳng định các dữ kiện phổ 1H-NMR về 7 nhóm metyl bậc ba (7q) [δC 16,0; 16,8; 19,6; 22,3; 24,9; 28,2 và 32,2], 2 nhóm oximetin [δC 76,2 (d) và 80,3 (d)], một nhóm hiđroximetylen [δC 64,3 (t)] và một nối đôi thế ba lần [δC 122,3 (d) và 143,7 (s)]. Các tín hiệu cộng hưởng từ cacbon 13 còn lại trong số 30 tín hiệu được quan sát là 9 nhóm metylen (9t) [δC 18,3; 23,6; 25,7; 27,2; 28,4; 33,1; 38,3; 42,0 và 46,0], 3 nhóm metin (3d) [δC 44,9, 47,7 và 55,8] và 6 cacbon bậc 4 (6s) [δC 30,3; 36,6; 37,3; 39,5; 41,1 và 42,3]. Các dữ kiện phổ NMR đã giả thuyết cho một cấu trúc tritecpenoit olean-12-en của chất H. Sau đó, sự so sánh các giá trị độ chuyển dịch hóa học δH và δC của chất H với của mẫu chuẩn β-amyrin đã khẳng định cho cấu trúc này. Hơn nữa, một nhóm oximetin [δH 3,39 (1H, dd, J = 12 Hz, 4,5 Hz); δC 80,3 (d)] đã được xác định ở C-3 phù hợp với sự đóng vòng tritecpenoit đi từ oxidosqualen. Hóa lập thể của nhóm 3-OH đã được xác định là β (equatorial) dựa trên hằng số tương tác Jax-ax = 12,0 Hz và δC 80,3. Nhóm hiđroximetin đã được xác định ở C-24 trên cơ sở so sánh các dữ kiện phổ 13C-NMR của H với các cấu trúc olean-12-en tương tự ở vòng A [27]. Việc xác định nhóm oximetin còn lại [δH 3,41 (1H, dd, J = 8,0 Hz, 3,5 Hz); δC 76,2 (d)] dựa trên sự so sánh các độ chuyển dịch hóa học δC ở các vòng D/E và nhóm 28-CH3. Trong trường hợp nhóm hiđroxi được liên kết vào vị trí C-16 các giá trị δC tương ứng là khoảng 65,9 (C-16), 36,8 (C-17), 30,5 (C-22) và 21,3 (C-28) [9]. Các giá trị δC nhận được rõ ràng là được xác định cho nhóm hiđroximetin ở C-22, cụ thể là δC 76,2 (C-22), 37,3 (C-17), 28,4 (C-16) và 28,2 (C-28). Hóa lập thể của nhóm 22-OH đã được xác định là β (equatorial) dựa trên độ chuyển dịch hóa học δC 76,2 và các hằng số tương tác của H-22 (δH 3,41; J = 8,0 Hz, 3,5 Hz) (xem Hình 4). Hình 4: Hóa lập thể của nhóm 22-OH Các dữ kiện phổ NMR của H hoàn toàn phù hợp với cấu trúc của soyasapogenol B [13]. Cuối cùng, các phổ 2 chiều (2D-NMR) bao gồm 1H-1H COSY, HSQC và HMBC đã được đo để khẳng định lại cấu trúc của hợp chất này. Trên phổ 1H-1H COSY với sự tham khảo phổ HSQC, các tương tác H-3 ↔ H2-1 ↔ H2-2, H5 ↔H2-6↔ H2-7, H-9 ↔ H2-11 ↔ H2-12, H2-15 ↔ H2-16, H2-18 ↔ H2-19 và H2-21↔ H2-22 đã được thiết lập. Vị trí của nhóm 3-OH cũng được xác định qua các tương tác HMBC giữa H-3 (δH 3,39) với C-3 (δC 80,3), giữa H3-23 (δH 1,23) và H2-24 (δH 3,32 và 4,19) với C-3. Vị trí của nhóm hiđroxi thứ hai đã được khẳng định nhờ phổ HMBC ở C-22 qua các tương tác quan trọng giữa H-22 (δH 3,41) và C-20 (δC 30,3), giữa H-30 (δH 0,85) và C-22 (δC 76,2) và giữa H-22 và C-28 (δC 28,2). Các tương tác 1H-1H COSY và HMBC quan trọng được biểu diễn trên Hình 5. Hình 5: Các tương tác 1H-1H COSY () và HMBC (→) quan trọng của chất H Phổ ESI-MS của chất H cho pic ion ở m/z 459,09 ([M + H]+) phù hợp với khối lượng phân tử của soyasapogenol B (C30H50O3). Scandenon (T) Hợp chất T được phân lập dưới dạng tinh thể hình kim màu vàng lục, đ.n.c. 162-164oC, Rf = 0,44 (TLC, silica gel, hệ dung môi n-hexan-axeton 5:1). T Phổ 1H-NMR (CDCl3), 13C-NMR và DEPT của chất T cho các tín hiệu cộng hưởng từ proton và cacbon 13 của một dẫn xuất isoflavon của genistein khi được so sánh với phổ 1H-NMR của 6,8-điprenylgenistein (X). Các tín hiệu này bao gồm H-2/C-2 của khung isoflavon [δH 7,88 (1H, s); δC 152,7 (d)], nhóm 5-OH liên kết hiđro nội phân tử [δH 13,0 (1H, s)] với nhóm cacbonyl ở C-4 [δC 181,5 (s)] và vòng B thế 1,4 [δH 6,81(2H, d, J = 8,5 Hz) và 7,33 (2H, d, J = 8,5 Hz)]. Isoflavon này có thể được dẫn xuất từ 6,8-điprenylgenistein (X) với một nhóm prenyl đã được đóng vòng loại hiđro và được liên kết với vòng A của isoflavon ở C-6/C-7 hoặc C-7/C-8 [δH 1,47 (6H, s), 5,62 (1H, d, J = 10,0 Hz) và 6,73 (1H, d, J = 10,0 Hz); δC 28,2 (q), 77,8 (s), 122,9 (s) và 128,1 (d)]; nhóm isoprenyl còn lại xuất hiện ở δH 1,68 (s), 1,81 (s), 3,39 (2H, d, J = 7,5 Hz) và 5,18 (1H, t, J = 7,5 Hz). Vị trí của vòng pyran ở C-7/C-8 hoặc C-6/C-7 có thể được phân biệt dựa trên độ chuyển dịch hoá học cacbon 13 của nhóm metin olefinic (C-1") của hệ vòng pyran. Giá trị δC 115,9 (d) của C-1" của chất T đã xác định chất này là một 7,8-pyranoisoflavon (scandenon); trong trường hợp một 6,7-pyranoisoflavon (osajin) giá trị này là ở khoảng δC 121,3. Trên cơ sở các dữ kiện phổ NMR, cấu trúc của chất T đã được xác định là scandenon [15]. Phổ ESI-MS của chất T cho pic ion ở m/z 405,23 ([M + H]+) khẳng định cho công thức phân tử của scandenon (C25H24O5). 6,8-Điprenylgenistein (X) Hợp chất X được phân lập dưới dạng bột vô định hình màu trắng, Rf = 0,37 (TLC, silica gel, hệ dung môi n-hexan-axeton, 5:1). X Phổ 1H-NMR (CDCl3) của chất X cho các tín hiệu cộng hưởng từ proton của các cặp proton đối xứng ở vị trí octo, một vòng benzen thế hai lần 1,4 [δH 6,85 (2H, d, J = 8,5 Hz) và 7,36 (2H, d, J = 8,5 Hz)] và 2 nhóm γ,γ-đimetylallyl (isoprenyl) bao gồm các proton của hai nhóm isoprenyl metylen ở δH 3,47 (4H, brt, J = 6,0 Hz), hai proton của hai nối đôi thế ba lần ở δH 5,23 (1H, brt, J = 6,0 Hz) và 5,27 (1H, brt, J = 6,0 Hz) và các nhóm metyl gắn với liên kết đôi ở δH 1,74 (s), 1,76 (s), 1,83 (s) và 1,84 (s). Các dữ kiện phổ này hoàn toàn phù hợp với các dữ kiện phổ 13C-NMR và DEPT. Trên phổ 13C-NMR (CDCl3) các tín hiệu cộng hưởng từ cacbon 13 của vòng benzen thế hai lần 1,4 xuất hiện ở δc 115,6 (d), 123,21 (s), 130,4 (d) và 159,6 (s). Các tín hiệu cacbon 13 của nhóm isoprenyl cộng hưởng ở δc 17,8 (q) và 17,9 (q); 21,7 (t); 25,7 (q) và 25,8 (q); 121,13 (d) và 121,6 (d) và 134,1 (s) và 135,5 (s) [8]. Các tín hiệu của một vòng benzen thế 6 lần khác trong số đó có 3C liên kết với oxi giả thiết về sự liên kết với 2 nhóm isoprenyl nêu trên [δc 105,4 (s), 105,8 (s), 110,3 (s), 153,4 (s), 155,9 (s) và 157,6 (s)] với các cacbon của vòng. Do các tín hiệu cộng hưởng từ δH 7,89 (1H, s), δc 152,6 (d) và 181,4 (s, C=O) đã cho giả thiết về một khung cacbon isoflavon của X, sự sắp xếp các tín hiệu trên là hoàn toàn phù hợp với một 5,7,4'-trihiđroxiisoflavon (genistein) được điprenyl hóa. Nhóm hiđroxi ở C-5 cộng hưởng ở δH 13,1 (s) do tạo liên kết hiđro nội phân tử với nhóm cácbonyl ở C-4. Các sự chuyển dịch của các tín hiệu cộng hưởng từ cacbon 13 về phía trường thấp của C-6 (∆δC +11,6) và C-8 (∆δC +11,5) và trường cao của C-5 (∆δC -7,8), C-7 (∆δC -7,1) và C-9 (∆δC -5,4) của X khi được so sánh với của genistein [5] phù hợp với sự liên kết của 2 nhóm isoprenyl vào các vị trí này. So sánh các dữ kiện phổ 1H-NMR và 13C-NMR của X với các giá trị của tài liệu tham khảo đã khẳng định cấu trúc của X là 6,8-điprenylgenistein [14, 25]. Phổ ESI-MS của chất X cho một pic ion ở m/z 407,14 ([M + H]+) phù hợp với công thức phân tử của 6,8-điprenylgenistein (C25H26O6). Chương 4: THỰC NGHIỆM THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT Sắc ký lớp mỏng (TLC) được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn silica gel Merck (Darmstadt, CHLB Đức) DC-Alufolien 60 F254 có chiều dày 0,2 mm trên nền nhôm. Sắc ký cột thường (CC), sắc ký cột nhanh (FC) và sắc ký cột tinh chế (Mini-C) được thực hiện trên silica gel Merck (Darm-Stadt, CHLB Đức) cỡ hạt 63-200 μm, 63-100 μm và 40-63 μm. Phổ hồng ngoại (IR) được ghi trên thiết bị Impact-410 Nicolet FT-IR spectrophotometer. Phổ khối lượng phun bụi điện tử (ESI-MS) được ghi trên thiết bị LC-MS-Obbitrap-XL (Thermo Scientific). Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13 (13C-NMR) với chương trình DEPT và phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều (2D NMR) 1H-1H COSY, HSQC và HMBC được ghi trên thiết bị Bruker AV 500 spectrometer. Độ chuyển dịch hóa học (δ) được biểu diễn theo ppm. Tetrametylsilan (TMS) là chất chuẩn nội zero. NGUYÊN LIỆU THỰC VẬT Nguyên liệu thực vật là lá, vỏ thân và gỗ cây Vông nem (Erythrina orientalis (L.) Murr., Fabaceae) tươi được thu hái tại Hà Nội vào tháng 10 năm 2008 (lá) và tháng 4 năm 2009 (vỏ thân và gỗ). Mẫu thực vật được lưu tiêu bản tại Phòng thí nghiệm Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội. ĐIỀU CHẾ CÁC PHẦN CHIẾT TỪ CÂY VÔNG NEM Lá, vỏ thân và gỗ cây Vông nem được hong trong bóng râm rồi sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 50oC. Mẫu đã khô hoàn toàn được xay thành bột mịn. Ba mẫu trên được ngâm chiết theo cùng một quy trình như sau: Mẫu đã xay mịn được ngâm chiết với MeOH khan ở nhiệt độ phòng trong 3 lần, mỗi lần trong 3 ngày. Sau khi đã lọc bỏ bã các dịch chiết MeOH được gộp lại và cất loại dung môi dưới áp suất giảm cho một phần chiết MeOH. Phần chiết MeOH được hòa tan trong nước cất, sau đó chiết lần lượt với các dung môi n-hexan, điclometan và etyl axetat theo độ phân cực tăng dần. Gộp các dịch chiết tương ứng nhận được từ lá, vỏ thân và gỗ Vông nem, làm khô bằng Na2SO4, cất loại kiệt dịch chiết đã được gạn bỏ Na2SO4 dưới áp suất giảm thu được các phần chiết n-hexan, điclometan và etyl axetat tương ứng. Quy trình chung điều chế các phần chiết từ lá, vỏ thân và gỗ cây Vông nem được trình bày tóm tắt ở Sơ đồ 1, Mục 3.2, Chương 3: Kết quả và Thảo luận. Hiệu suất thu nhận các phần chiết 3 mẫu lá, thân và gỗ cây Vông nem (tính theo lượng nguyên liệu khô) được đưa ra trong Bảng 7. Bảng 7: Hiệu suất thu nhận các phần chiết từ cây Vông nem Nguyên liệu (khối lượng) Phần chiết Khối lượng (g) Hiệu suất (%) lá (2 kg) n-hexan (EL1) 40 2 điclometan (EL2) 11,4 0,57 etyl axetat (EL3) 5 0,25 vỏ thân (1,1 kg) n-hexan (EB1) 14 1,3 etyl axetat (EB2) 23 2 gỗ (0,3 kg) etyl axetat (EW1) 4 1,3 PHÂN TÍCH CÁC PHẦN CHIẾT BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG Phân tích sắc ký lớp mỏng (TLC) được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn silica gel Merck (Darmstadt, CHLB Đức) DC-Alufolien 60 F254 có chiều dày 0,2 mm trên nền nhôm. Thuốc thử hiện màu là dung dịch 1% vanilin/H2SO4 đặc , bản mỏng sau đó được hơ nóng ở 120oC. Phân tích phần chiết n-hexan lá cây Vông nem (EL1) Hệ dung môi triển khai là n-hexan-axeton với tỷ lệ khác nhau 10:1, 6:1 và 3:1. Kết quả phân tích TLC phần chiết n-hexan lá cây Vông nem (EL1) được trình bày ở Bảng 1, Mục 3.3, Chương 3: Kết quả và Thảo luận. Phân tích phần chiết điclometan lá cây Vông nem (EL2) Hệ dung môi triển khai là n-hexan-axeton với các tỷ lệ 20:1, 10:1 và 6:1. Kết quả phân tích TLC phần điclometan của vỏ thân cây Vông nem (EL2) được trình bày ở Bảng 2, Mục 3.3, Chương 3: Kết quả và Thảo luận. Phân tích phần chiết etyl axetat lá cây Vông nem (EL3) Hệ dung môi triển khai là n-hexan-etyl axetat-axit formic với tỷ lệ 20:20:1. Kết quả phân tích TLC phần chiết etyl axetat lá cây Vông nem (EL3) được trình bày ở Bảng 3, Mục 3.3, Chương 3: Kết quả và Thảo luận. Phân tích phần chiết n-hexan vỏ thân cây Vông nem (EB1) Hệ dung môi triển khai là điclometan-etyl axetat với các tỷ lệ 49:1, 19:1 và 10:1. Kết quả phân tích TLC phần chiết n-hexan vỏ thân cây Vông nem (EB1) được trình bày ở Bảng 4, Mục 3.3, Chương 3: Kết quả và Thảo luận. Phân tích phần chiết điclometan vỏ thân cây Vông nem (EB2) Hệ dung môi triển khai là điclometan - etyl axetat với các tỷ lệ 49:1, 19:1 và 10:1. Kết quả phân tích TLC phần chiết n-hexan vỏ thân cây Vông nem (EB2) được trình bày ở Bảng 5, Mục 3.3, Chương 3: Kết quả và Thảo luận. Phân tích phần chiết etyl axetat gỗ cây Vông nem (EW1) Hệ dung môi triển khai là điclometan-etyl axetat với tỷ lệ 19:1. Kết quả phân tích TLC phần chiết n-hexan gỗ cây Vông nem (EW1) được trình bày ở Bảng 6, Mục 3.3, Chương 3: Kết quả và Thảo luận. PHÂN TÁCH CÁC PHẦN CHIẾT VÀ PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT Phân tách phần chiết n-hexan lá cây Vông nem (EL1) Phần chiết n-hexan (EL1) (15 g) được phân tách bằng sắc ký cột trên silica gel (Merck, cỡ hạt 0,063-0,2 mm). Rửa giải với hệ dung môi gradient n-hexan-axeton với các tỷ lệ 95:5, 10:1, 6:1 và 3:1, thu được 30 phân đoạn, mỗi phân đoạn 100 ml. Cuối cùng dội cột bằng MeOH. Các phân đoạn cho sắc ký đồ TLC giống nhau được gộp lại thành 8 nhóm phân đoạn từ EL1.1 đến EL1.8. Nhóm phân đoạn EL1.4 (3,2 g) được rửa bằng n-hexan cho chất bột vô định hình màu trắng kí hiệu là M (15 mg). Nhóm phân đoạn EL1.5 (0,7 g) được rửa bằng n-hexan cho chất bột vô định hình màu trắng kí hiệu là C (0,3 g) Quá trình phân tách phần chiết n-hexan (EL1) được trình bày trong Sơ đồ 2, Mục 3.4.1, Chương 3: Kết quả và Thảo luận. Phân tách phần chiết điclometan lá cây Vông nem (EL2) Phần chiết điclometan (EL2) (11 g) được phân tách bằng sắc ký cột trên silica gel (Merck, cỡ hạt 0,063-0,2 mm). Rửa giải với hệ dung môi gradient n-hexan-axeton với tỷ lệ 20:1, 10:1 và 6:1, thu được 33 phân đoạn, mỗi phân đoạn 50 ml. Cuối cùng dội cột bằng MeOH. Các phân đoạn cho sắc ký đồ TLC giống nhau được gộp lại thành 13 nhóm phân đoạn từ EL2.1 đến EL2.13. Phân đoạn EL2.11 (0,2 g) được phân tách bằng sắc ký cột với hệ dung môi n-hexan-EtOAc 4:1 thu được 34 phân đoạn, mỗi phân đoạn 5 ml. Tiếp tục khảo sát sắc ký lớp mỏng, gộp các phân đoạn giống nhau, thu được 4 nhóm phân đoạn EL2.11.1 đến EL2.11.4 trong đó nhóm phân đoạn EL2.11.3 (phân đoạn 18-23) là chất bột vô định hình màu trắng kí hiệu là A (20 mg). Quá trình phân tách phần chiết điclometan (EL2) được trình bày trong Sơ đồ 3, Mục 3.4.2, Chương 3: Kết quả và Thảo luận. Phân tách phần chiết etyl axetat lá cây Vông nem (EL3) Phần chiết etyl axetat (EL3) được kết tinh trong EtOAc cho một chất bột màu vàng, chất này được rửa lần lượt với các dung môi n-hexan và điclometan cho chất R (0,2 g). Phần chiết etyl axetat (EL3) (5 g) được phân tách bằng sắc ký cột trên silica gel (Merck, cỡ hạt 0,063-0,2 mm), rửa giải với hệ dung môi n-hexan-etyl axetat-axit fomic với tỷ lệ 20:20:1 cho 18 phân đoạn, mỗi phân đoạn 50 ml. Cuối cùng dội cột bằng MeOH. Các phân đoạn cho sắc ký đồ TLC giống nhau được gộp lại thành 4 nhóm phân đoạn từ EL3.1 đến EL3.4. Quá trình phân tách phần chiết etyl axetat (EL3) được trình bày trong Sơ đồ 4, Mục 3.4.3, Chương 3: Kết quả và Thảo luận. Phân tách phần chiết n-hexan vỏ thân cây Vông nem (EB1) Từ dịch chiết n-hexan (EB1) kết tủa được một chất bột màu trắng. Bột này được rửa với các dung môi n-hexan và điclometan thu được S là hỗn hợp phức tạp của các tecpen glycosid (phổ 1H-NMR). Phần chiết n-hexan (EB1) (14 g) được phân tách bằng sắc ký cột trên silica gel (Merck, cỡ hạt 0,063-0,2 mm). Rửa giải với hệ dung môi điclometan-EtOAc với các tỷ lệ là 49:1, 19:1 và 10:1, thu được 25 phân đoạn, mỗi phân đoạn 50 ml. Cuối cùng dội cột bằng EtOAc. Các phân đoạn cho sắc ký đồ TLC giống nhau được gộp lại thành 8 nhóm phân đoạn từ EB1.1 đến EB1.8. Nhóm phân đoạn EB1.3 (1 g) được phân tách bằng sắc ký cột thường với hệ dung môi n-hexan-EtOAc 9:1, thu được 70 phân đoạn, mỗi phân đoạn 5 ml. Sắc ký lớp mỏng cho phép gộp các phân đoạn thành 9 nhóm phân đoạn từ EB1.3.1 đến EB1.3.9 trong đó nhóm phân đoạn EB1.3.6 (phân đoạn 24-33) là chất bột vô định hình màu trắng (15 mg) và được định tính là chất M nhận được từ phần chiết n-hexan lá cây Vông nem (phân tích TLC và co-TLC). Các nhóm phân đoạn EB1.4 và EB1.5 được rửa bằng n-hexan cho tinh thể hình kim màu trắng (100 mg). Phân tích định tính sắc ký lớp mỏng với mẫu chuẩn β-sitosterol chúng tôi cho kết quả chất mới được phân lập này β-sitosterol (C). Phân đoạn EB1.6 (1,5 g) được phân tách bằng sắc ký cột thường với hệ dung môi n-hexan-EtOAc 6:1, thu được 65 phân đoạn, mỗi phân đoạn 5 ml. Phân tích sắc ký lớp mỏng đã gộp các phân đoạn có sắc ký đồ TLC giống nhau thành 5 nhóm phân đoạn EB1.6.1 đến EB1.6.5. Tiếp tục sử dụng phương pháp sắc ký cột thường với hệ dung môi n-hexan-EtOAc 8:1 để phân tách nhóm phân đoạn EB1.6.2 thu được 23 phân đoạn. Từ 2 nhóm phân đoạn 7-17 và 19-23 kết tinh cho 2 loại tinh thể màu xanh nhạt, hình kim và màu trắng, hình nấm. Rửa các tinh thể bằng n-hexan và kết tinh lại trong điclometan thu được 2 chất tinh khiết, kí hiệu là T (130 mg) và X (20 mg). Nhóm phân đoạn EB1.8 (0,5 g) được rửa bằng n-hexan thu được tinh thể hình kim màu trắng, kí hiệu là H (0,1 g). Quá trình phân tách phần chiết n-hexan vỏ thân cây Vông nem (EB1) được trình bày trong Sơ đồ 5, Mục 3.4.4, Chương 3: Kết quả và Thảo luận. Phân tách phần chiết etyl axetat gỗ cây Vông nem (EW1) Phần chiết etyl axetat (EW1) (4 g) được phân tách bằng sắc ký cột thường trên silica gel (Merck, cỡ hạt 0,063-0,2 mm). Rửa giải với hệ dung môi điclometan-EtOAc với các tỷ lệ là 49:1, 19:1 và 10:1, thu được 11 phân đoạn, mỗi phân đoạn 50ml. Cuối cùng dội cột bằng EtOAc. Các phân đoạn cho sắc ký đồ TLC giống nhau được gộp lại thành 5 nhóm phân đoạn từ EW1.1 đến EW1.5. Nhóm phân đoạn EW1.2 (0,45 g) được rửa bằng n-hexan cho chất bột vô định hình màu trắng (10 mg) và được định tính là chất M nhận được từ phần chiết n-hexan lá cây Vông nem (phân tích TLC và co-TLC). Nhóm phân đoạn EW1.3 (0,1 g) được rửa bằng n-hexan cho tinh thể hình kim màu trắng (50 mg). Phân tích định tính sắc ký lớp mỏng với chuẩn β-sitosterol chúng tôi cho kết quả chất mới được phân lập này là β-sitosterol (C). Nhóm phân đoạn EW1.4 (0,5 g) được rửa bằng n-hexan cho tinh thể hình kim màu trắng (40 mg). Phân tích sắc ký lớp mỏng so sánh (TLC và co-TLC) với chất H nhận được từ phần chiết n-hexan của vỏ thân cây Vông nem (EB1) cho thấy chất mới được phân lập là H. Quá trình phân tách phần chiết etyl axetat gỗ cây Vông nem (EW1) được trình bày trong Sơ đồ 6, Mục 3.4.5, Chương 3: Kết quả và Thảo luận. HẰNG SỐ VẬT LÝ VÀ DỮ KIỆN PHỔ CỦA CÁC HỢP CHẤT ĐƯỢC PHÂN LẬP 1-Octacosanol (C28H58O) (M) Bột vô định hình màu trắng. Rf = 0,57 (TLC, silica gel, hệ dung môi n-hexan-EtOAc 5:1), hiện màu tím với thuốc hiện 1% vanilin/ H2SO4 đặc . 1H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ 0,88 (3H, t, J = 7,0 Hz, 29-CH3), 1,18-1,36 (50H, brs, 2H-3→2H-27), 1,55 (2H, quintet, J = 7,0 Hz, 2H-2), 3,63 (2H, dt, J = 5,5 Hz, 6,5 Hz, 2H-1). Apigenin (A) Bột vô định hình màu vàng nhạt. Rf = 0,88 (TLC, silica gel, hệ dung môi n-hexan-EtOAc 10:1), hiện màu tím với thuốc hiện 1% vanilin/ H2SO4 đặc . 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ 6,18 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-6), 6,47 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8), 6,76 (1H, s, H-3), 6,92 (2H, d, J = 9,0 Hz, H-2', H-6'), 7,91 (2H, d, J = 9,0 Hz, H-3', H-5'), 12,95 (1H, s, 5-OH). β-Sitosterol (C) Tinh thể hình kim màu trắng, đ.n.c. 135-136oC. Rf = 0,3 (TLC, silica gel, hệ dung môi n-hexan-axeton 10:1), hiện màu tím với thuốc hiện 1% vanilin/ H2SO4 đặc . Vitexin (R) Bột vô định hình màu vàng. ESI-MS: m/z 433,67 (C21H21O10, [M + H]+). 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ 3,25-3,39 (2H, m, H-3", H-4", H-5"), 3,53 (1H, t, J = 5,0 Hz, H-6"a), 3,77 (1H, brd, J = 9,0 Hz, H-6"b), 3,85 (1H, t, J = 8,5 Hz, H-2"), 4,58 (1H, brs, -OH), 4,69 (1H, d, J = 10,0 Hz, H-1"), 4,96 (2H, brs, 2-OH), 6,28 (1H, s, H-6), 6,77 (1H, s, H-3), 6,89 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-3', H-5'), 8,02 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2', H-6'), 13,2 (1H, brs, 5-OH). 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6): δ 61,3 (t, C-6"), 70,5 (d, C-4"), 70,8 (d, C-2"), 73,4 (d, C-1"), 78,6 (d, C-3"), 81,8 (d, C-5"), 98,1 (d, C-6), 102,4 (d, C-3), 104,0 (s, C-8), 104,6 (s, C-10), 115,8 (d, C-3', C-5'), 121,6 (s, C-1'), 128,9 (d, C-2', C-6'), 155,9 (s, C-9), 160,4 (s, C-5'), 161,1 (s, C-4'), 162,5 (s, C-7), 163,9 (s, C-2), 182,1 (s, C-4). Soyasapogenol B (H) Tinh thể hình kim màu trắng, đ.n.c. 257-258oC. ESI-MS: m/z 459,09 (C30H51O3, [M + H]+). Rf = 0,16 (TLC, silica gel, hệ dung môi n-hexan-EtOAc 4:1), hiện màu tím đậm với thuốc hiện 1% vanilin/ H2SO4 đặc . 1H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ 0,85 (1H, m, H-5), 0,85 (3H, s, 30-CH3), 0,91 (3H, s, 29-CH3), 0,92 (3H, s, 25-CH3), 0,95 (3H, s, 26-CH3), 0,98 (1H, m, H-19a), 1,03 (3H, s, 28-CH3), 1,11 (3H, s, 27-CH3), 1,23 (1H, m, H-1a), 1,23 (3H, s, 23-CH3), 1,25 (1H, m, H-15a), 1,37 (1H, m, H-16a), 1,40 (1H, m, H-6b), 1,40 (1H, m, H-7b), 1,40 (1H, m, H-21a), 1,44 (1H, m, H-21b), 1,48 (1H, m, H-7a), 1,54 (1H, brs, H-9), 1,60 (1H, m, H-19b), 1,64 (1H, m, H-6a), 1,66 (1H, m, H-1b), 1,71 (1H, m, H-16b), 1,75 (1H, m, H-15b), 1,86 (2H, m, H2-11), 2,06 (1H, brd, J = 12,5 Hz, H-18), 3,32 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-24a), 3,39 (1H, dd, J = 12,0 Hz, 4,5 Hz, H-3), 3,41 (1H, dd, J = 8,0 Hz, 3,5 Hz, H-22), 4,19 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-24b), 5,3 (1H, t, J = 3,5 Hz, H-12). 13C-NMR (125 MHz, CDCl3): δ 16,0 (q, C-25), 16,8 (q, C-26), 18,3 (t, C-6), 19,6 (q, C-30), 22,3 (q, C-23), 23,6 (t, C-11), 24,9 (q, C-27), 25,7 (t, C-15), 27,2 (t, C-2), 28,2 (q, C-28), 28,4 (t, C-16), 30,3 (s, C-20), 32,2 (q, C-29), 33,1 (t, C-7), 36,6 (s, C-10), 37,3 (s, C-17), 38,3 (t, C-1), 39,5 (s, C-8), 41,1 (s, C-14), 42,0 (t, C-21), 42,3 (s, C-4), 44,9 (d, C-18), 46,0 (t, C-19), 47,7 (d, C-9), 55,8 (d, C-5), 64,3 (t, C-24), 76,2 (d, C-22), 80,3 (d, C-3), 122,3 (d, C-12), 143,7 (s, C-13). Scandenon (T) Tinh thể hình kim màu vàng lục, đ. n. c. 162-164oC. Rf = 0,44 (TLC, silica gel, hệ dung môi n-hexan-axeton 5:1), hiện màu xanh lục với thuốc hiện 1% vanilin/ H2SO4 đặc . ESI-MS: m/z 405,23 (C25H25O5, [M + H]+). 1H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ 1,47 (6H, s) (4''-CH3, 5''-CH3), 1,68 (3H, s, 5'''-CH3), 1,81 (3H, d, 4'''-CH3), 3,39 (2H, d, J = 7,5 Hz, H-1'''), 5,18 (1H, t, J = 7,5 Hz, H-2'''), 5,62 (1H, d, J = 10,0 Hz, H-2''), 5,84 (1H, brs, 4'-OH), 6,73 (1H, d, J = 9,5 Hz, H-1''), 6,81 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-3', H-5'), 7,33 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2', H-6'), 7,88 (1H, s, H-2), 13,0 (1H, s, 5-OH) 13C-NMR (125 MHz, CDCl3): δ 17,9 (q, 4'''-CH3), 21,3 (t, C-1'''), 25,7 (q, 5'''-CH3), 28,2 (q, 4''-CH3, 5''-CH3), 77,8 (s, C-3''), 105,5 (s, C-6), 105,9 (s, C-10), 107,6 (s, C-8), 115,7 (d, C-3', C-5'), 115,9 (d, C-1''), 121,9 (d, C-2'''), 122,9 (s, C-1'), 123,4 (s, C-3), 128,1 (d, C-2''), 130,3 (d, C-2', C-6'), 131,7 (s, C-3'''), 152,7 (d, C-2), 154,8 (s, C-9), 154,9 (s, C-5), 156,1 (s, C-7), 157,0 (s, C-4'), 181,5 (s, C-4). 6,8-Điprenylgenistein (X) Bột vô định hình màu trắng. Rf = 0,37 (TLC, silica gel, hệ dung môi n-hexan-axeton 5:1), hiện màu vàng nhạt với thuốc hiện 1% vanilin/ H2SO4 đặc . ESI-MS: 407,14 (C25H27O6), [M+H]+). 1H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ 1,74 (3H, d, J = 1,0 Hz, 3''-CH3), 1,76 (3H, d, J = 1,0 Hz, 3''-CH3), 1,83 (3H, s, 3'''-CH3), 1,84 (3H, s, 3'''-CH3), 3,47 (4H, brt, J = 6,0 Hz) (H-1'', H-1'''), 5,23 (1H, brt, J = 6,0 Hz), 5,27 (1H, brt, J = 6,0 Hz) (H-2'', H-2'''), 6,85 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-3', H-5'), 7,36 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2', H-6'), 7,89 (1H, s, H-3), 13,1 (1H, s, 5-OH). 13C-NMR (125 MHz, CDCl3): δ 17,8 (q), 17,9 (q), (C-4'', C-5''), 21,7 (t, C-2'', C-2'''), 25,7 (q), 25,8 (q) (C-4'', C-5'''), 105,4 (s, C-10), 105,8 (s, C-8), 110,3 (s, C-6), 115,6 (d, C-3', C-5'), 121,3 (d, C-2''), 121,6 (d, C-2'''), 123,21 (s, C-1'), 123,24 (s, C-3), 130,4 (d, C-2', C-6'), 134,1 (s, C-3''), 135,5 (s, C-3'''), 152,6 (d, C-2), 153,4 (s, C-9), 155,9 (s, C-5), 157,6 (s, C-7), 159,6 (s, C-4'), 181,4 (s, C-4). KẾT LUẬN Luận văn thạc sĩ “Nghiên cứu hóa thực vật cây Vông nem (Erythrina orientalis (L.) Murr., Fabaceae” thực hiện các nghiên cứu thành phần hóa học của cây Vông nem và đã thu được các kết quả nghiên cứu chính và có các đóng góp mới sau: 1. Đã xây dựng được quy trình chiết phân lớp các hợp chất hữu cơ theo độ phân cực tăng dần và phân bố các hợp chất hữu cơ từ lá, vỏ thân và gỗ cây Vông nem (Erythrina orientalis (L.) Murr., Fabaceae) vào các phần chiết với các hiệu suất chiết tương ứng so với lượng mẫu nguyên liệu khô là n-hexan (EL1, 2%), điclometan (EL2, 0,57%) và etyl axetat (EL3, 0,25%) (từ lá cây Vông nem); n-hexan (EB1, 1,3%) và etyl axetat (EB2, 2%) (từ vỏ thân cây Vông nem) và etyl axetat (EW1, 1,3%) (từ gỗ cây Vông nem). 2. Đã phân tích sắc kí lớp mỏng (TLC) các phần chiết nhận được để xác định các điều kiện sắc kí định tính các phần chiết và xác định các hệ dung môi thích hợp cho phân tách sắc kí gradient các phần chiết. 3. Đã xây dựng các quy trình phân tách sắc ký cột gradient CC theo độ phân cực và các phương pháp tinh chế (sắc ký và kết tinh) để phân lập được 7 hợp chất thành phần chính từ các phần chiết từ lá (EL1, EL2 và EL3); từ vỏ thân (EB1) và từ gỗ cây Vông nem (EW1). 4. Đã xác định được cấu trúc của các hợp chất được phân lập bằng các phương pháp sắc ký (β-sitosterol, TLC và co-TLC) và các phương pháp phổ (ESI-MS và 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, 1H-1H COSY, HSQC và HMBC) là 1-octacosanol, apigenin, vitexin, soyasapogenol B, scandenon và 6,8-điprenylgenistein. Ngoài các hợp chất flavon được prenyl hóa đặc trưng cho các loài Erythrina, scandenon và 6,8-điprenylgenistein, apigenin và dẫn xuất C-glucosid của hợp chất này, vitexin, soyasapogenol B, một aglycon của một số hợp chất glycosid và 1-octacosanol đã lần đầu tiên được phân lập từ chi Erythrina (Fabaceae). TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Đỗ Tất Lợi (2005), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, 787, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội. Võ Văn Chi (1997), Từ điển cây thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học, Thành phố Hồ Chí Minh. Tiếng Anh Deshpande V. H., Pendse A. D., Pendse R. (2007), “Erythrinins A, B and C, three new isoflavones from the bark of Erythrina variegata”, Indian J. Chem., 15B, 205-207. Ghosal S., Ghosh D. K., Dutta S. K. (1970), “Occurrence of erysotrine and other alkaloids in Erythrina variegata”, Phytochemistry, 9, 2397- 2398. Harborne J. B., Mabry T. J. (1982), The flavonoids: Advances in research, Chapman and Hall, London. Harbone J. B., Baxter H., Moss G. P. (1999), Phytochemical Dictionary: A Handbook of bioactive compounds from plants, Taylor & Francis, London. Hegde V. R., Dai P., Patel M. G., Puar M. S., Das P., Pai J., Bryant R., Cox P. A. (1997), “Phospholipase A2 inhibitors from an Erythrina species from Samoa”, Journal of Natural Products, 60, 537-539. Ito K. (1999), “Studies on the alkaloids of Erythrina plants”, Yakugaku Zasshi, 119 (5), 340-356. Kundakovic T., Fokialakis N., Nagiatis P., Kovacevic N., Chinou I., “Triterpenic derivatives of Achillea alexandri-regis Bornm. & Rudski, Chem. Pharm. Bull., 52, 1462-1465 (2004). Mahato S. B. (1991), “Tritecpenoid saponins from Medicago chispida”, Phytochemistry, 30 (10), 3389-3393. Monache G. D., Sairria R.; Vitali R., Vitali A., Botta B., Monacelli B., Pasqua G., Palocci C., Cerria E. (1994), “Two isoflavones and a flavone from the fruits of Maclura pomifera”, Phytochemistry, 37 (3), 893-898 Sato M., Tanaka H., Fujiwara S., Hirata M., Yamaguchi R., Etoh H., Tokuda C. (2003), “Antibacterial property of isoflavonoids isolated from Erythrina variegata against cariogenic oral bacteria”, Phytomedicine, 10, 427-433. Sato M., Tanaka H., Yamaguchi R., Kato K., Etoh H. (2004), “Synergistic effects of mupirocin and an isoflavanone isolated from Erythrina variegata on growth and recovery of methicillin-resistant Staphylococcus aureus” Int. J. Antimicrob. Agents, 24, 241-246. Singhal A. K. , Sharma R. P., Thyagarajan G., Herz W., Govindan S. V. (1980), “New prenylated isoflavones and a prenylated dihydroflavonol from Milletia pachicarpa”, Phytochemistry, 19, 929-934. Tanaka H., Tanaka T., Etoh H. (1996), “A pterocarpan from Erythrina orientalis”, Phytochemistry, 42, 1173-1475. Tanaka H., Tanaka T., Etoh H. (1997), “A pterocarpan from Erythrina orientalis”, Phytochemistry, 45, 205-207. Tanaka H., Tanaka T., Etoh H. (1998), “Two pterocarpans from Erythrina orientalis”, 47, 475-477. Tanaka H., Tanaka T., Hosoya A., Kitade Y., Etoh H. (1998), “Three isoflavones from Erythrina orientalis”, 48, 355-357. Tanaka H., Doi M., Etoh H., Watanabe N., Shimizu H., Hirata M., Ahmad M., Qurashi I., Khan M. R. (2001), “Revised structures for senegalensin and euchrenone b10”, Journal of Natural Products, 64, 1336-1340. Tanaka H., Sato M., Fujiwara S., Hirata M., Etoh H., Takeuchi H. (2002), “Antibacterial activity of isoflavonoids isolated from Erythrina variegata against methicillin-resistant Staphylococcus aureus”, Lett. Appl. Microbiol., 35, 494-498. Tanaka H., Hirata M., Etoh H., Watanabe N., Shimizu H., Ahmad M., Terada Y., Fukai T. (2002), “Two diphenylpropan-1,2-diol syringates from the roots of Erythrina variegata”, J. Nat. Prod., 65, 1933-1935. Tanaka H., Hirata M., Etoh H., Shimizu H., Sako M., Murata J., Murata H., Darnaedi D., Fukai T. (2003), “Eryvarins F and G, two 3-phenoxychromones from the roots of Erythrina variegata”, Phytochemistry, 62, 1243-1246. Tanaka H., Oh-Uchi T., Etoh H., Sako M., Sato M., Fukai T., Tateishi Y. (2003), “An arylbenzofuran and four isoflavonoids from the roots of Erythrina poeppigiana”, Phytochemistry, 63, 597-602. Tanaka H., Hirata M., Etoh H., Sako M., Sato M., Murata J., Murata H., Darnaedi D., Fukai T. (2004), “Six new constituents from the Roots of Erythrina variegata”, Chem. Biodiversity, 1, 1101-1108. Taylor R. B., Corley D. G., Tempesta M. S., Fomum Z. T., Ayafor J. F., Wandji J., Ifeadike P. N. (1986), J. Nat. Prod., 49, 670. Tellikepalli H., Gollapudi S. R., Shokri A. K., Velazquez L., Sandamann R. A., Veliz E. A., Jagannadha Rao K. V. (1990), “ Isoflavonoids and a cinnamylphenol from root extracts of Erythrina variegata”, Phytochemistry, 29, 2005-2007. Woldermichael G. M., Wink M. (2002), “Triterpene glycosides of Lupimus angustifolius”, Phytochemistry, 60, 323-327. Xiaoli L., Naili W., Sau W. M., Chen A. S., Xinsheng Y. (2006), “Four new isoflavonoids from the stem bark of Erythrina variegata”, Chem. Pharm. Bull., 54, 570-573. Xie C., Veitch N. C., Houghton P. J., Simmonds M. S. J. (2003), “Flavone C-glycosides from Viola yedoensis Makino”, Chem. Pharm. Bull., 51, 1204-1207. Zhang Y., Li X. L., Lai W. P., Chen B., Chow H. K., Wu C. F., Wang N. L., Yao X. S., Wong M. S. (2007), “Anti-osteoporotic effect of Erythrina variegata L. in ovariectomized rats”, J. Ethnopharmacol., 109, 165-169. Zhang Y., Li X. L., Yao X. S., Wong M. S. (2008), “Osteogenic activities of genistein derivatives were influenced by the presence of prenyl group at ring A”, Arch. Pharm. Res., 31, 1534-1539.