Đề tài Nghiên cứu xây dựng công nghệ sản xuất các loại đường chức năng dùng trong công nghiệp thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm

B .K H & C N V C N T P B .K H & C N V C N T P B.KH&CN VCNTP Bộ khoa học và công nghệ Viện Công nghiệp thực phẩm 301 Nguyễn Trãi, Thanh Xuân, Hà Nội Báo cáo tổng kết đề tài kh&CN cấp nhà n−ớc Mã số KC 04.28 Nghiên cứu xây dựng công nghệ sản xuất các loại đ−ờng chức năng dùng trong công nghiệp thực phẩm, d−ợc phẩm và mỹ phẩm M∙ số: KC-04-28 Chủ nhiệm đề tài cấp nhà n−ớc: TS. Nguyễn Thị Minh Hạnh Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Công nghiệp Thực phẩm 5787 09/5/2006 Hà Nội, 2006 Bản quyền: Đơn xin sao chép toàn bộ hoặc từng phần tài liệu này phải gửi đến Viện tr−ởng Viện Công nghiệp Thực phẩm, trừ trong tr−ờng hợp sử dụng với mục đích nghiên cứu. 1 B .K H & C N V C N TP B .K H & C N V C N TP B.KH&CN VCNTP Bộ khoa học và công nghệ Viện Công nghiệp thực phẩm 301 Nguyễn Trãi, Thanh Xuân, Hà Nội Báo cáo tổng kết đề tài kh&CN cấp nhà n−ớc Mã số KC 04.28 Nghiên cứu xây dựng công nghệ sản xuất các loại đ−ờng chức năng dùng trong công nghiệp thực phẩm, d−ợc phẩm và mỹ phẩm M∙ số: KC-04-28 Chủ nhiệm đề tài cấp nhà n−ớc: TS. Nguyễn Thị Minh Hạnh Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Công nghiệp Thực phẩm Hà Nội, 2006 Bản quyền: Đơn xin sao chép toàn bộ hoặc từng phần tài liệu này phải gửi đến Viện tr−ởng Viện Công nghiệp Thực phẩm, trừ trong tr−ờng hợp sử dụng với mục đích nghiên cứu. 2 Bộ khoa học và công nghệ Viện Công nghiệp thực phẩm 301 Nguyễn Trãi, Thanh Xuân, Hà Nội Báo cáo tổng kết Đề tài cấp nhà n−ớc: Nghiên cứu xây dựng công nghệ sản xuất các loại đ−ờng chức năng dùng trong công nghiệp thực phẩm, d−ợc phẩm và mỹ phẩm. M∙ số: KC-04-28 Chủ nhiệm đề tài cấp nhà n−ớc: TS. Nguyễn Thị Minh Hạnh Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Công nghiệp Thực phẩm Hà Nội, 2006 Tài liệu này đ−ợc chuẩn bị trên cơ sở kết quả thực hiện đề tài cấp Nhà n−ớc, M∙ số: KC 04 – 28 3 Bài tóm tắt Mục tiêu của đề tài: “Nghiên cứu xây dựng công nghệ sản xuất các loại đ−ờng chức năng dùng trong công nghiệp thực phẩm, d−ợc phẩm và mỹ phẩm” là : Xây dựng đ−ợc quy trình công nghệ sản xuất và tinh chế maltooligosacarit, xylitol, β-glucan từ sản phẩm và phụ phẩm nông nghiệp trên cơ sở áp dụng công nghệ enzim và công nghệ vi sinh Ph−ơng pháp nghiên cứu: Đề tài sử dụng các ph−ơng pháp phân lập giống, tuyển chọn giống truyền thống và hiện đại (sử dụng các ph−ơng pháp đột biến gen, biến đổi gen... ) để nâng cao hiệu suất lên men, công nghệ vi sinh, công nghệ enzim để sản xuất ra sản phẩm nhằm nâng cao chất l−ợng và tránh ô nhiễm môi tr−ờng, hạ giá thành sản phẩm. Các ph−ơng pháp tinh sạch sản phẩm hiện đại nh−: Trao đổi ion, sắc ký, lọc màng...ứng dụng các thiết bị hiện đại để thu hồi sản phẩm đảm bảo độ sạch và chất l−ợng của sản phẩm: Sấy phun, cô đặc chân không, cô đặc bằng màng, sắc ký....Phân tích chất l−ợng nguyên liệu và sản phẩm bằng các thiết bị hiện đại: Sắc kí khí, sắc ký lỏng cao áp, quang phổ hấp phụ nguyên tử...ứng dụng các ph−ơng pháp phân tích sử dụng chế phẩm sinh học: kít chuẩn, các chế phẩm enzim phân tích, các cột cố định.... cho quá trình công nghệ. Kết quả nổi bật của đề tài: 1- Maltooligosacarit - Đã xây dựng đ−ợc quy trình công nghệ sản xuất maltooligosacarit với các điều kiện công nghệ sau: + Xử lý nguyên liệu : rửa lại bột 3 lần với tỉ lệ n−ớc dùng là 1: 5 . + Quá trình chuyển hoá tinh bột thành maltooligosacarit giàu maltotrioza: Quá trình dịch hoá: Nồng độ tinh bột: 25%, nồng độ enzim alpha -amylaza: 0,1% so với tinh bột, pH = 6,5- 7,0, nhiệt độ: 950c, thời gian: 30 phút. Quá trình đ−ờng hoá: Nồng độ dịch thuỷ phân: 22 0 Bx, DE dịch hoá: 20, nồng độ enzim pullulanaza: 1%, thời gian: 15 giờ, nhiệt độ: 550C, pH = 6,5. Đã nghiên cứu nâng cao hàm l−ợng maltotrioza trong thành phần sản phẩm maltooligosacarit bằng enzim AMT tăng thêm gần 50% so với sử dụng enzim pulullanaza Làm sạch dịch thuỷ phân bằng than hoạt tính: Thời gian tẩy màu 30 phút, nhiệt độ: 800C, tỷ lệ than hoạt tính: 1,5% so với tinh bột, nồng độ chất khô: 20- 250Bx. Đã sản xuất thử nghiệm trên quy mô pilot 100kg/mẻ, sản phẩm sản xuất ra đạt chất l−ợng DE=38,5 với các thành phần: Glucoza 7,15mg/ml, maltoza 39,52mg/ml, maltotrioza 54,5mg/ml, maltopentan 72,31mg/ml, maltohexan 47,23mg/ml, các oligo khác: 9,3mg/ml. Đã sản xuất thử trên quy mô công nghiệp công suất 2.500kg bột/mẻ tại Công ty cổ phẩm thực phẩm Minh d−ơng. Sản phẩm thu đ−ợc đem ứng dụng cho sản xuất bánh kem tại Công ty bánh kẹo Hải hà, sản xuất đồ uống sữa ngô, kem, bột cacao hoà tan tại Viện cơ điện, Công ty kem Băng Kỳ Lân, Công ty Chế biến ca phê cacao Hoàng Anh đạt kết quả tốt, thay thế đ−ợc đ−ờng kính, giữ đ−ợc màu t−ơi của sản phẩm, độ ổn định (khả năng định hình, độ huyền phù…) tốt hơn dùng đ−ờng kính. 2- β- glucan - Đã phân lập và chọn đ−ợc môi tr−ờng thích hợp cho sự phát triển của các chủng nấm men, tạo đ−ợc chủng S.cerevisiae đột biến từ chủng hoang dại phân lập đ−ợc từ bã men bia. Đã xây dựng công nghệ tách chiết β-glucan từ thành tế bào nấm men S.cerevisiae: Sản phẩm β- glucan từ chủng nấm men S.cerevisiae 1 có một loại mạch 1,6 β-glucan, từ 4 chủng nấm men S.cerevisiae 3 có hai loại mạch 1,6 β-glucan và 1,3 β-glucan, từ chủng S.cerevisiae 1 có trên 80% hexoza và 0,99% protein, từ chủng S.cerevisiae 2 và S.cerevisiae 3 có hàm l−ợng protein khoảng 1,2% và hơn 50% hexoza. - Chế phẩm có tác dụng phục hồi số l−ợng tế bào bạch cầu máu ngoại vi và khả năng thực bào của đại thực bào ổ bụng của động vật gây suy giảm miễn dịch thực nghiệm bằng chiếu xạ. Chế phẩm β-glucan từ chủng S.cerevisiae 1 có tác dụng tốt đối với hệ thống miễn dịch không đặc hiệu ở nồng độ nghiên cứu. Đã ký đ−ợc một hợp đồng hợp tác sản xuất chế phẩm β– glucan phục vụ cho y d−ợc với quân y viện 103 và một hợp đồng hợp tác nghiên cứu và chuyển giao công nghệ với trung tâm hóa d−ợc 3-Xylitol - Đã tuyển chọn đ−ợc 9 chủng có hiệu suất chuyển hóa lớn hơn 45%, hiệu suất cao nhất đạt đ−ợc là 70,1%. Định tên các chủng bằng ph−ơng pháp đọc trình tự vùng D1/D2 của ARN ribosom 26S. - Đã tìm đ−ợc nguyên liệu thích hợp sản xuất xylitol là lõi ngô có thành phần xyloza cao, ít ảnh h−ởng đối với tế bào nấm men trong quá trình lên men. Đã xây dựng quy trình thủy phân lõi ngô, xử lý dịch xyloza làm nguyên liệu lên men, quy trình lên men dịch xyloza thành xylitol. - Đã tiến hành lên men xylitol quy mô thử nghiệm và quy mô lớn để tạo dịch chứa xylitol. Hiệu suất chuyển hóa xyloza thành xylitol đạt đ−ợc là 70- 80%. - Đã đ−a ra quy trình tinh chế xylitol từ dịch lên men với độ tinh khiết đạt 98% - Đã ứng dụng chế phẩm xylitol vào sản xuất kẹo và thuốc đánh răng có chứa xylitol. 4 - Đề tài đã tạo ra 5 mẫu sản phẩm, xây dựng đ−ợc 6 quy trình công nghệ, có hồ sơ đăng ký Bảo hộ sáng chế và giải pháp hữu ích tại Cục Sở hữu trí tuệ, ký đ−ợc 2 hợp đồng chuyển giao công nghệ, đào tạo đ−ợc 3 thạc sỹ, 4 kỹ s−, đăng đ−ợc 4 bài báo tại hội nghị CNSH lần thứ 9 ở Indonesia. Đề tài đã đ−ợc nhận cúp vàng tại hội chợ techmart 2005 5 Danh sách những ng−ời thực hiện Chủ nhiệm đề tài : TS. Nguyễn Thị Minh Hạnh Cán bộ tham gia nghiên cứu chính: TT Tên Phần thực hiện Cơ quan 1 Ths. Ngô Thị Vân Maltooligosacarit Viện Công nghiệp Thực phẩm 2 CN. Nguyễn Thị Bích Liên Maltooligosacarit Viện Công nghiệp Thực phẩm 3 KTV. Nguyễn Thuỳ Linh Maltooligosacarit Viện Công nghiệp Thực phẩm 4 Ths. Đàm Lam Thanh Maltooligosacarit Viện Công nghiệp Thực phẩm 5 TS. Đỗ Tuyết Mai Maltooligosacarit Viện Công nghiệp Thực phẩm 6 Ths. Trần Thị Châu Maltooligosacarit Viện Công nghiệp Thực phẩm 7 TS. Vũ Nguyên Thành Xylitol Viện Công nghiệp Thực phẩm 8 Ths. D−ơng Anh Tuấn Xylitol Viện Công nghiệp Thực phẩm 9 CN. Đào Anh Hải Xylitol Viện Công nghiệp Thực phẩm 10 Ths. Nguyễn H−ơng Giang Xylitol Viện Công nghiệp Thực phẩm 11 Ths. Đinh Thị Mỹ Hằng Xylitol Viện Công nghiệp Thực phẩm 12 TS. Phạm Việt C−ờng Beta-glucan Viện Công nghệ sinh học 13 TS. Nguyễn Thị Kim Cúc Beta-glucan Viện Công nghệ sinh học 14 CN. Phạm Đức Thuận Beta-glucan Viện Công nghệ sinh học 15 CN. Trần Thị Thanh Huyền Beta-glucan Viện Công nghệ sinh học 16 CN. Hoàng Thị H−ơng Beta-glucan Viện Công nghệ sinh học 6 Mục Lục TT Nội dung Trang 1. Mở đầu 1 2. Tổng quan 3 2.1 Đ−ờng chức năng: Xylitol, maltooligosacarit giàu maltotrioza, beta-glucan 3 2.2 Nguyên liệu dùng cho sản xuất maltooligosacarit, xylitol, β- glucan 8 2.2.1 Tinh bột 8 2.2.2 Enzim thuỷ phân tinh bột 13 2.2.2.1 α –amylaza 13 2.2.2.2 Enzim pullulanaza 18 2.2.3 Nguyên liệu dùng trong sản xuất xylitol 22 2.2.4 Nguồn nguyên liệu chứa β- glucan 26 2.3 ứng dụng của maltooligosacarit, xylitol, β- glucan 28 2.3.1 Những ứng dụng của maltooligosacarit giàu maltotrioza 28 2.3.2 ứng dụng của xylitol 29 2.3.3 ứng dụng của β- glucan 30 2.3.3.1 ứng dụng β -glucan trong thực phẩm 30 2.3.3.2 ứng dụng β-glucan trong y d−ợc, mỹ phẩm 32 2.3.3.3 ứng dụng β - glucan trong nuôi trồng thủy sản 34 2.4 Công nghệ sản xuất maltooligosacharit giàu maltotrioza, xylitol, β- glucan trên thế giới 36 2.5 Tình hình sản xuất và tiêu thụ maltooligosacarit, xylitol, β- glucan trên thế giới và trong n−ớc 45 3. Nguyên liệu và ph−ơng pháp nghiên cứu 53 3.1 Nguyên vật liệu 53 7 3.2 Các ph−ơng pháp nghiên cứu 54 3.2.1 Ph−ơng pháp vi sinh 3.2.2 Ph−ơng pháp công nghệ 57 3.2.3 Ph−ơng pháp hóa học, hóa lý, hoá sinh, hóa phân tích 58 3.2.4 Ph−ơng pháp kỹ thuật gen 67 4 Kết quả nghiên cứu và thảo luận 65 4.1 Nghiên cứu công nghệ sản xuất maltooligosacarit bằng ph−ơng pháp enzim 65 4.1.1 Nghiên cứu lựa chọn ph−ơng pháp xử lý nguyên liệu cho quá trình phân cắt mạch 65 4.1.2 Nghiên cứu lựa chọn enzim cho quá trình phân mạch tinh bột tạo maltooligosacarit giàu maltotrioza 65 4.1.3 Nghiên cứu các điều kiện công nghệ cho quá trình thủy phân tinh bột bằng enzim alpha- amylaza 67 4.1.3.1 Nghiên cứu xác định nồng độ tinh bột thích hợp. 68 4.1.3.2 Nghiên cứu xác định pH thích hợp cho quá trình dịch hóa 70 4.1.3.3 Nghiên cứu xác định nhiệt độ tối −u cho quá trình dịch hóa 71 4.1.3.4 Nghiên cứu xác định nồng độ enzim alpha - amylaza trong quá trình dịch hóa 72 4.1.3.5 Nghiên cứ u ảnh h−ởng của thời gian trong quá trình dịch hóa 74 4.1.4 Nghiên cứu xác định các điều kiện thích hợp cho quá trình đ−ờng hóa. 75 4.1.4.1 Nghiên cứu xác định nồng độ cơ chất thích hợp cho quá trình đ−ờng hoá 75 4.1.4.2 Nghiên cứu xác định pH thích hợp quá trình đ−ờng hóa 77 4.1.4.3 Nghiên cứu xác định nhiệt độ đ−ờng hóa thích hợp 78 4.1.4.4 Nghiên cứu xác định nồng độ enzim pullulanaza đến quá trình đ−ờng hóa 79 4.1.4.5 Nghiên cứu xác định thời gian đến quá trình đ−ờng hóa 81 4.1.4.6 Nghiên cứu nâng cao hiệu suất thủy phân tinh bột thành maltotrioza 84 8 4.1.5 Nghiên cứu quá trình làm sạch và thu hồi sản phẩm 85 4.1.5.1 Nghiên cứu xác định tỷ lệ than hoạt tính dùng để tẩy màu 85 4.1.5.2 Nghiên cứu xác định nồng độ dịch phù hợp cho quá trình lọc 86 4.1.5.3 Thu hồi sản phẩm bằng ph−ơng pháp sấy phun 87 4.1.6 Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất maltooligosacarit 88 4.1.6.1 Quy trình sản xuất maltooligosacarit giàu maltotrioza 88 4.1.6.2 Quy trình tinh sạch maltooligosacarit 90 4.1.7 Sản xuất thử nghiệm trên quy mô x−ởng thực nghiệm 100kg/mẻ 91 4.1.7.1 Các thiết bị sử dụng 91 4.1.7.2 Sản xuất thử nghiệm 91 4.1.8 Sản xuất thử nghiệm trên quy mô công nghiệp 93 4.1.8.1 Các thiết bị chính 93 4.1.8..2 Kết quả sản xuất 96 4.1.9 ứng dụng trong quy mô công nghiệp 97 4.1.9.1 Đánh giá khả năng ứng dụng của sản phẩm maltooligosacarit trong sản xuất bánh kẹo tại Công ty bánh kẹo Hải hà 97 4.1.9.2 ứng dụng của sản phẩm maltooligosacarit trong sản xuất đồ uống sữa ngô 99 4.1.9.3 ứng dụng của sản phẩm maltooligosacarit trong sản xuất sản phẩm kem tại Coiong ty kem Băng Kỹ Lân 100 4.1.9.4 Sử dụng sản phẩm trong sản xuất các sản phẩm của Công ty Chế biến cà phê cacao Hoàng Anh 101 4.2 Nghiên cứu công nghệ sản xuất chế phẩm β - glucan 101 4.2.1 Phân lập và tuyển chọn chủng Saccharomyces cerevisiae từ bã men bia 101 4.2.1.1 Phân lập và tuyển chọn 101 4.2.1.2 Xác định môi tr−ờng thích hợp cho sự phát triển của tế bào nấm men 102 4.2.1.3 Tìm nhiệt độ phát triển thích hợp cho tế bào nấm men 105 4.2.2 Tạo chủng Saccharomyces cerevisiae đột biến 107 9 4.2.3 Quy trình lên men thu nhận sinh khối Saccharomyces cerevisiae 107 4.2.4 Tách và thu nhận thành tế bào Saccharomyces cerevisiae 108 4.2.5 Quy trình tách chitin, manoprotein khỏi thành tế bào 109 4.2.6 Thu nhận β– glucan tổng số 110 4.2.6.1 Xác định hàm l−ợng protein và hàm l−ợng hexoza trong sản phẩm β – glucan từ chủng S. cerevisiae nghiên cứu và từ bã men bia 111 4.2.6.2 Xác định hàm l−ợng axit amin tự do trong sản phẩm β– glucan tách chiết từ thành tế bào của các chủng S. cerevisiae nghiên cứu 112 4.2.6.3 Kiểm tra cấu trúc β- glucan bằng ph−ơng pháp cộng h−ởng từ hạt nhân 113 4.2.7 Nghiên cứu tác dụng phục hồi đáp ứng miễn dịch của chế phẩm β- – glucan trên thực nghiệm 114 4.3 Nghiên cứu công nghệ sản xuất xylitol 120 4.3.1 Nghiên cứu công nghệ sản xuất xyloza 120 4.3.1.1 Xác định điều kiện thủy phân nguyên liệu 120 4.3.1.2 Lựa chọn nguyên liệu thủy phân 122 4.3.1.3 Thủy phân nguyên liệu để thu hồi xyloza 123 4.3.1.4 Nghiên cứu công nghệ làm sạch và thu hồi xyloza 125 4.3.2 Nghiên cứu công nghệ lên men xylitol từ xyloza 128 4.3.2.1 Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu đặc điểm chủng giống 128 4.3.2.2 Nghiên cứu công nghệ lên men 146 4.3.2.2. 1 Nghiên cứu ảnh h−ởng của thành phần môi tr−ờng đến quá trình lên men 146 4.3.2.2. 2 Nghiên cứu ảnh h−ởng của nồng độ dịch thủy phân và chế độ xử lý đến quá trình lên men 148 4.3.2.2. 3 Nghiên cứu động học của quá trình lên men 149 10 4.3.3 Nghiên cứu công nghệ chiết tách, làm sạch và thu hồi xylitol 152 4.3.3.1 Nghiên cứu công nghệ làm sạch dịch sau lên men 152 4.3.3.2 Nghiên cứu công nghệ thu hồi xylitol 153 4.3.4 ứng dụng chế phẩm xylitol 154 4.4 −ớc tính giá thành sản phẩm xylitol, maltooligosacarit giàu maltotrioza, β -glucan 156 5 Kết luận 158 Tài liệu tham khảo 160 Phụ lục 11 Danh mục các bảng TT Tên bảng Trang Bảng 2.1 Hàm l−ợng xylitol trong một số loại rau quả và các sản phẩm có nguồn gốc rau quả 4 Bảng 2.2 Các đặc tính của một số đ−ờng thành phần trong hỗn hợp maltooligosacarit 6 Bảng 2.3 Khả năng hút ẩm của maltooligosacarit 6 Bảng 2.4 Các thành phần chính của thành tế bào Saccharomyces . cesevisea 8 Bảng 2.5 Thành phần hóa học của củ sắn 13 Bảng 2.6 Tác dụng của ion kim loại lên hoạt lực của St. griseus amylaza 17 Bảng 2.7 Tác dụng của S . griseus amylaza lên các cơ chất khác nhau 18 Bảng 2.8 Một số tính chất enzim pullulanaza 19 Bảng 2.9 Tốc độ thủy phân liên kết α - 1,6 glucozit trong các oligosacarit phân nhánh bởi enzim pullulanaza từ 2 chủng A. aerogenes và S. mitis 20 Bảng 2.10 ảnh h−ởng của enzim pullulanaza từ chủng K. pneumonia trên cơ chất mạch nhánh 21 Bảng 2.11 Thành phần của một số loại lignocelluloza thực vật 23 Bảng 2.12 Thành phần đ−ờng của hemicelluloza ở một số loại gỗ 24 Bảng 2.13 Sử dụng maltooligosacarit giàu trong chế biến bánh Gyuhi 29 Bảng 2.14 Thành phần phản ứng và sản phẩm của ph−ơng pháp sản xuất xylitol từ axit xylonic 38 Bảng 2.15 Thành phần phản ứng và sản phẩm của phản ứng đồng phân 38 12 hóa D- xyluloza Bảng 2.16 L−ợng sản xuất và giá cả của các loại đ−ờng trên thế giới 46 Bảng 2.17 Các β- glucan có hoạt tính sinh học th−ờng đ−ợc sử dụng 49 Bảng 4.1 Xác định l−ợng n−ớc rửa bột 65 Bảng 4.2 Hàm l−ợng maltotrioza trong dịch đ−ờng hóa sử dụng pullulanaza của hãng Novo và Amano 66 Bảng 4.3 Xác định nồng độ tinh bột thích hợp cho quá trình dịch hóa 69 Bảng 4.4 ảnh h−ởng pH đến quá trình dịch hóa 70 Bảng 4.5 ảnh h−ởng của nhiệt độ đến quá trình dịch hóa 71 Bảng 4.6 Xác định nồng độ enzim α – amylaza thích hợp 73 Bảng 4.7 ảnh h−ởng của thời gian đến quá trình dịch hóa 74 Bảng 4.8 ảnh h−ởng của nồng độ cơ chất trong quá trình đ−ờng hóa 76 Bảng 4.9 Xác định pH thích hợp cho quá trình đ−ờng hóa 78 Bảng 4.10 ảnh h−ởng của nhiệt độ đ−ờng hóa 79 Bảng 4.11 ảnh h−ởng của nồng độ enzim pullulanaza dùng cho đ−ờng hóa 80 Bảng 4.12 ảnh h−ởng của thời gian đến quá trình đ−ờng hóa 82 Bảng 4.13 Phân tích dịch thành phẩm 83 Bảng 4.14 Xác định l−ợng enzim AMT cho tỉ lệ maltotrioza cao 84 Bảng 4.15 ảnh h−ởng của tỉ lệ than hoạt tính đến màu của dịch 85 Bảng 4.16 ảnh h−ởng của nồng độ chất khô của dịch đ−ờng đến khả năng lọc 86 Bảng 4.17 Điều kiện kỹ thuật cho sấy phun dịch maltooligosacarit 87 Bảng 4.18 Chất l−ợng sản phẩm bột maltooligosacarit giàu maltotrioza(sản xuất bằng enzim pullulanaza) 92 13 Bảng 4.19 Đặc tính sinh lý sinh hóa của chủng nấm men phân lập 101 Bảng 4.20 OD600 của tế bào các chủng nấm men ở các thời điểm khác nhau 102 Bảng 4.21 Mật độ tế bào của 3 chủng nấm men trên các môi tr−ờng nghiên cứu (CFU/ml) 103 Bảng 4.22 OD600 của tế bào các chủng nấm men theo nhiệt độ 105 Bảng 4.23 Một số đặc điểm của chủng nấm men đột biến bằng tia UV 107 Bảng 4.24 Trọng l−ợng thành tế bào thu đ−ợc với các nồng độ kiềm và nhiệt độ. 108 Bảng 4.25 Hàm l−ợng manoprotein t−ơng ứng với nồng độ NaOH và nhiệt độ. 109 Bảng 4.26 Nồng độ NaOH và nhiệt độ thu nhận glucan tổng số 110 Bảng 4.27 Hàm l−ợng protein và hexoza trong sản phẩm glucan của các chủng nấm men nghiên cứu 111 Bảng 4.28 Hàm l−ợng các axit amin tự do trong sản phẩm β – glucan tách chiết từ thành tế bào của các chủng S. cerevisiea 112 Bảng 4.29 Kết quả thực nghiệm 116 Bảng 4.30 Phần trăm đ−ờng khử có trong dịch thủy phân trấu ở các điều kiện I, II, III, IV, V 121 Bảng 4.31 Kết quả thủy phân các loại nguyên liệu khác nhau 122 Bảng 4.32 Hàm l−ợng glucoza và xyloza có trong dịch thủy phân tr−ớc và sau khi cô đặc 123 Bảng 4.33 Kết quả xử lý dịch thủy phân lõi ngô bằng Ca(OH)2, H3PO4 125 Bảng 4.34 Sinh tr−ởng của nấm men trên các môi tr−ờng chứa dịch thủy phân nồng độ khác nhau 126 Bảng 4.35 Nguồn gốc của các chủng nấm men phân lập đ−ợc 130 14 Bảng 4.36 Khả năng chuyển hóa xyloza thành xylitol của các chủng nấm men phân lập đ−ợc 135 Bảng 4.37 Phân nhóm các chủng có khả năng chuyển hóa xyloza thành xylitol 140 Bảng 4.38 Phân loại bằng ph−ơng pháp giải trình tự vùng D1/D2 của ARN ribosome 26 S 142 Bảng 4.39 Kết quả phân loại 47 chủng nấm men có khả năng chuyển hóa xyloza thành xylitol bằng kỹ thuật Fingerprinting và giải trình tự D1/D2 của ARN ribosome 26 S 143 Bảng 4.40 Hiệu suất chuyển hóa xyloza thành xylitol của 24 chủng nấm men đ−ợc phân loại bằng ph−ơng pháp dọc trình tự vùng D1/D2 của ARN ribosome 26 S 145 Bảng 4.41 ảnh h−ởng của thành phần môi tr−ờng đến khả năng chuyển hóa xyloza thành xylitol 146 Bảng 4.42 ảnh h−ởng của nồng độ dịch thủy phân và chế độ xử lý tới quá trình lên men 148 Bảng 4.43 Động học của quá trình lên men xylitol với nguồn xyloza là dịch thủy phân rơm 150 Bảng 4.44 Kết quả phân tích dịch xylitol thành phẩm 153 15 Danh mục các hình TT Tên hình Trang Hình 1 Công thức cấu tạo của xylitol 4 Hình 2 Cấu trúc phân tử của maltotrioza 6 Hình3 Cấu trúc thành ngoài tế bào nấm men 7 Hình 4 Cấu trúc β- glucan 8 Hình 5 Sơ đồ cấu trúc của amyloza 10 Hình 6 Sơ đồ cấu trúc của amylopectin 10 Hình 7 Tác dụng của enzim α - amylaza lên tinh bột hoà tan tạo maltotrioza 17 Hình 8 Sơ đồ tổng quát các con đ−ờng sản xuất các sản phẩm hữu cơ từ nguồn nguyên liệu lignocelluloza 22 Hình 9 Quá trình tạo thành HMF và furfural từ các đ−ờng glucozavà xyloza 26 Hình10 Sơ đồ biểu diễn các sản phẩm trung gian của quá trình thủy phân tinh bột 36 Hình 11 Quá trình thủy phân và hydro hóa xylan thành xylitol 37 Hình12 Con đ−ờng sử dụng xyloza của vi sinh vật 39 Hình 13 Con đ−ờng sử dụng xyloza và mối quan hệ với các con đ−ờng khác trong quá trình trao đổi chất của tế bào vi sinh vật 41 Hình 14 Dectin-1 trung gian cho hiệu quả sinh học của β-glucan 48 Hình15 Một số hình ảnh về quá trình thủy phân lõi ngô thu hồi dịch chứa xyloza 124 Hình 16 Sinh tr−ởng bằng nấm men trên môi tr−ờng dịch thủy 128 16 phân rơm và lõi Hình17 Hình thái một số chủng nấm men phân lập đ−ợc 132 Hình 18 Hình thái một số chủng nấm men phân lập đ−ợc 133 Hình 19 Phổ Fingerprinting sử dụng mồi MTS2 của 47 chủng nấm men có khả năng chuyển hóa xyloza thành xylitol 139 Hình 20 Sản phẩm PCR của các chủng nấm men đ−ợc nhân với cặp mồi 141 Hình 21 Động học của quá trình lên men xylitol 150 17 Danh mục các đồ thị TT Tên đồ thị Trang Đồ thị 1 Hàm l−ợng maltotrioza trong dịch đ−ờng hóa 67 Đồ thị 2 Xác định nồng độ tinh bột thích hợp trong quá trình dịch hóa 69 Đồ thị 3 ảnh h−ởng của nhiệt độ tới quá trình dịch hóa 72 Đồ thị 4 Xác định nồng độ enzim  – amylaza thích hợp 73 Đồ thị 5 ảnh h−ởng của thời gian trong quá trình dịch hóa 75 Đồ thị 6 ảnh h−ởng của nồng độ cơ chất tới quá trình đ−ờng hóa 77 Đồ thị 7 ảnh h−ởng của nồng độ enzim pullulanaza sử dụng đ−ờng hóa 81 Đồ thị 8 ảnh h−ởng của thời gian tới quá trình đ−ờng hóa 82 Đồ thị 9 Tốc độ sinh tr−ởng của chủng S. cerevisiea 1 104 Đồ thị 10 Tốc độ sinh tr−ởng của chủng S. cerevisiea 2 104 Đồ thị 11 Tốc độ sinh tr−ởng của chủng S. cerevisiea 3 105 Đồ thị 12 Tốc độ sinh tr−ởng của chủng S. cerevisiea 1 theo nhiệt độ 106 Đồ thị 13 Tốc độ sinh tr−ởng của chủng S. cerevisiea 2 theo nhiệt độ 106 Đồ thị 14 Tốc độ sinh tr−ởng của chủng S. cerevisiea 3 theo nhiệt độ 106 18 1. Mở đầu Nâng cao giá trị của các sản phẩm nông nghiệp và các phụ phẩm của sản xuất công nghiệp bằng sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật đang là vấn đề đ−ợc cả thế giới quan tâm. N−ớc ta là một n−ớc có kinh tế chủ yếu là nông nghiệp, để phát triển một nền kinh tế bền vững không gì hơn là áp dụng khoa học kỹ thuật chế biến các nông sản và phụ phẩm thành các sản phẩm có giá trị kinh tế cao. Một sản phẩm đ−ợc sản xuất từ tinh bột là maltooligosacarit, nhờ có nhiều tính chất −u việt nh− : có độ ngọt thấp (khoảng30% với sacaroza), khả năng duy trì độ ẩm cao, hạn chế sự hình thành màu trong quá trình chế biến, khả năng chống táo bón tốt khi hấp thụ vào cơ thể và đặc biệt có thể hấp thụ vào máu một cách từ từ do đó giữ ổn định độ đ−ờng trong máu với thời gian dài nên maltooligosacarit giàu maltotrioza đ−ợc ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm nh− một loại đ−ờng chức năng để chế biến các món ăn tráng miệng, kẹo cao su, bánh ngọt, kem bơ, mứt, các loại n−ớc ép trái cây, soda, n−ớc uống tăng lực, cà phê hòa tan, chế biến cá đông lạnh…. Sản phẩm sản xuất từ phế phụ liệu nông nghiệp là xylitol. Xylitol là loại đ−ờng đơn, hiện nay đ−ợc sử dụng rộng rãi trong một số dạng thực phẩm cũng nh− trong y d−ợc. Xylitol có trong một số hoa quả và có vị ngọt nhẹ. L−ợng calo của xylitol chỉ bằng 40% so với sacaroza do vậy có thể dùng để chống béo. Xylitol đ−ợc hấp thụ và sử dụng trong cơ thể theo cơ chế khác so với glucoza nên đ−ợc dùng cho ng−ời bị tiểu đ−ờng. Một trong những tính năng nổi trội là xylitol có khả năng chống sâu răng và một số bệnh răng miệng khác. Chính vì lẽ đó xylitol đ−ợc cho vào kẹo cao su, thuốc đánh răng và đ−ợc coi nh− một loại chất ngọt thế hệ mới. Hiện trên thế giới có khoảng 28 n−ớc sản xuất maltooligosacarit, xylitol, trong đó chủ yếu là Phần lan, Nhật bản, Trung Quốc, Thuỵ điển, Đức, Mỹ, Hàn Quốc. Nấm men bia đ−ợc loại ra trong quá trình sản xuất bia có thể sử dụng để sản xuất β-glucan. β-glucan là một trong những polysacarit có nhiều nhất trong màng tế bào nấm men và tồn tại nh− một homopolyme của glucoza, liên kết với nhau qua cầu nối α -(1,3) hoặc α -(1,6)- D-glycosidic. Những năm gần đây, β-glucan phân lập từ màng tế bào nấm men ngày càng đ−ợc chú ý. Các hợp chất này có nhiều hoạt tính sinh học khác nhau nh− tăng c−ờng miễn dịch, kháng khối u và là tác nhân bảo vệ phóng xạ, kích thích hệ thống 19 miễn dịch. ở Việt nam việc nghiên cứu sản xuất maltooligosaccarit, β-glucan và xylitol còn rất mới mẻ. Cho tới nay maltooligosaccarit, β - glucan và xylitol sử dụng tại Việt Nam hoàn toàn thông qua nhập khẩu từ n−ớc ngoài. Hiện nay chế biến tinh bột đang đ−ợc Chính phủ quan tâm đặt lên hàng đầu. Do vậy việc tiếp thu và tăng giá trị của sản phẩm dạng đ−ờng bột cũng nh− các phế phụ liệu của chúng sẽ là chìa khoá cho việc thúc đẩy sản xuất nông nghiệp cũng nh− phát triển bền vững của ngành công nghệ sinh học. Để góp phần nâng cao giá trị kinh tế của nông sản, tạo ra đ−ợc sản phẩm mới theo kịp xu h−ớng phát triển công nghệ của thế giới, đề tài KC. 04-28 đ−ợc tiến hành với các nội dung sau: - Nghiên cứu công nghệ sản xuất maltooligosacarit bằng ph−ơng pháp enzim - Nghiên cứu công nghệ sản xuất xylitol bằng ph−ơng pháp lên men - Nghiên cứu công nghệ sản xuất β - glucan từ nấm men - ứng dụng maltooligosacarit, xylitol, β- glucan trong công nghiệp thực phẩm, d−ợc phẩm và mỹ phẩm 20 2. Tổng quan 2.1. Đ−ờng chức năng: Xylitol, maltooligosacarit giàu maltotrioza, β- Glucan Với sự phát triển của nền kinh tế công nghiệp làm thay đổi cuộc sống hàng ngày của con ng−ời. Cuộc sống trở nên hối hả hơn, công việc bận rộn hơn, ít có thời gian giành cho nghỉ ngơi và chú ý đến chất l−ợng của bữa ăn, môi tr−ờng sống bị ô nhiễm vì bụi bẩn, tiếng ồn, hóa chất …vì vậy sức khỏe của mọi ng−ời đều bị ảnh h−ởng. Rất nhiều bệnh tật phát sinh nh− tim mạch, huyết áp, béo phì, tiểu đ−ờng…nh−ng những thói quen trong sinh hoạt và đặc biệt là những thói quen đ−ợc hình thành trong xã hội công nghiệp vẫn tiếp tục đ−ợc duy trì và phát triển làm cho nguy cơ nhiễm bệnh càng ngày càng tăng. Để làm giảm nguy cơ về bệnh tật phát sinh, một loạt các nghiên cứu sản xuất thực phẩm chức năng đã đ−ợc tiến hành và đ−a vào sản xuất. Đ−ờng chức năng là một trong những sản phẩm đ−ợc nghiên cứu sản xuất và ứng dụng nhiều nhất . Với những tính chất chung nh− tiêu hóa từng phần và hấp phụ chậm ở ruột non của ng−ời, không làm tăng nhanh l−ợng đ−ờng glucoza trong máu, giúp cơ thể cân bằng đ−ợc nhu cầu về hydratcarbon, l−ợng calo cung cấp trung bình khoảng 2,4kcal/g, quá trình lên men đ−ờng chức năng chủ yếu ở đại tràng. Các axit béo mạch ngắn đ−ợc tổng hợp từ đ−ờng chức năng, nhất là axit butyric làm ảnh h−ởng đến bacteria flora của ruột non nên có thể sẽ giúp ngăn ngừa các bệnh về tiêu hóa ở đại tràng. Do có những chức năng nh− vậy nên đ−ờng chức năng đ−ợc nghiên cứu sản xuất rất nhiều. Xylitol là một đ−ờng chức năng, đ−ợc cấu tạo bởi 5 cacbon (1,2,3,4,5 pentahydroxy pentane). Xylitol có độ ngọt t−ơng đ−ơng với đ−ờng mía và có giá trị năng l−ợng bằng 1/3 giá trị năng l−ợng của đ−ờng mía [40]. Xylitol tồn tại với hàm l−ợng nhỏ trong tự nhiên ở nhiều loại rau quả khác nhau. Xylitol cũng đ−ợc tạo ra với một hàm l−ợng nhỏ trong quá trình trao đổi chất thông th−ờng của cơ thể [40]. 21 Một số đặc tính lý hóa của xylitol: Hình 1: Công thức cấu tạo của xylitol Trọng l−ợng phân tử: 152,15 Dạng tồn tại: Tinh thể trắng, không mùi Nhiệt độ sôi: 126° C (ở 760 mm Hg) Nhiệt độ nóng chảy: 92° tới 96° C Độ tan ở 20° C: 169 g xylitol tan hết trong trong 100 g n−ớc, ít tan trong ethanol và methanol pH trong n−ớc (1g/10 ml) : 5 - 7 Nhiệt năng tan: - 34.8 cal/g (thu nhiệt) Giá trị năng l−ợng: 4.06 Kcal/g Bảng 2.1. Hàm l−ợng xylitol trong một số loại rau quả [10]. Loại thực phẩm Hàm l−ợng xylitol (mg/100g chất khô) Loại thực phẩm Hàm l−ợng xylitol (mg/100g chất khô) Chuối 21 Bí ngô Mâm xôi 268 Rau bina 107 Dâu tây 362 Su hào 94 Mận vàng 935 Cà 180 Cà rốt 86,5 Tỏi tây 53 Rau diếp quăn 258 Thì là 92 Hành 89 Nấm trắng 128 Rau diếp 131 Hạt dẻ 14 Xúp lơ 300 N−ớc cà rốt 12 22 Maltooligosacarit giàu maltotrioza là hỗn hợp gồm các oligo mạch thẳng có từ 2 đến 10 gốc glucoza liên kết với nhau qua liên kết α -1,4 glucozit nh−: maltoza (G2), maltotrioza (G3), maltotetraoza (G4), maltopentanoza (G5), maltohexanoza (G6)… Maltooligosacarit giàu maltotrioza là sản phẩm có chứa hàm l−ợng maltotrioza cao đ−ợc sản xuất từ tinh bột với sự tham gia xúc tác của enzim vi sinh vật. Sản phẩm đ−ợc sử dụng rất rộng rãi trong nhiều lĩnh vực vì những tính chất sau[11,17, 22, 50,116]: - Độ ngọt thấp chỉ bằng 30 % so với đ−ờng sacaroza ở dung dịch 10% nhiệt độ 25 0 C, do đó có thể thay thế đ−ờng sacaroza trong các thực phẩm để giảm độ ngọt sản phẩm mà không ảnh h−ởng đến h−ơng vị vốn có của sản phẩm. - Tác dụng chống táo bón - Đặc biệt maltooligosacarit giàu maltotrioza có thể hấp thụ từ từ trong máu cung cấp năng l−ợng cho cơ thể một cách đều đều, giữ ổn định độ đ−ờng trong máu trong thời gian dài - Tác dụng làm giảm tích tụ máu, sự sản sinh axit lactic với một l−ợng lớn, phản ứng trong tuyến tuỵ và nhanh chóng tăng khả năng chịu đựng của cơ thể cũng nh− khả năng làm việc - Đ−ợc dùng để căn chỉnh kích th−ớc màng, ổn định các tính chất của các sản phẩm thực phẩm và nguyên liệu. - Độ hòa tan giảm theo nồng độ dịch, maltooligosacarit giàu maltotrioza có khả năng hút ẩm rất cao và có độ nhớt trung bình. Chính vì vậy maltooligosacarit giàu maltotrioza có khả năng duy trì độ ẩm cao, giữ đ−ợc độ ẩm phù hợp trong thực phẩm đặc biệt trong các loại bánh t−ơi. - Khi bổ sung vào thực phẩm, đồ uống maltooligosacarit giàu maltotrioza là tác nhân kìm hãm sự hình thành màu, vì nó thay thế một phần glucoza nên hàm l−ợng glucoza thấp. Hơn nữa sẽ ngăn cản sự kết tinh đ−ờng sacaroza và bảo vệ cấu trúc của sản phẩm trong thời gian bảo quản. 23 Bảng 2.2. Các đặc tính của một số đ−ờng thành phần trong hỗn hợp maltooligosacarit[54]. maltoza (G2) maltotrioza (G3) maltotetraoza (G4) maltopentanoza (G5) maltohexanoza (G6) Côngthức C12H22O11 C18H32O16 C24H42O21 C30H52O26 C36H62O31 Trọngl−ợng phân tử 360,32 504,44 666,5 8 828,73 990,87 [α]20 D +130,0 + 132.5 0 +164,0 + 166.0 0 +176,0+ 178.0 0 +182,0 + 184.0 0 +182,0 + 184.0 0 Khả năng hút ẩm là một trong những tính chất quan trọng của maltooligosacarit giàu maltotrioza, vì nó có tác dụng duy trì độ ẩm cao và giữ đ−ợc độ ẩm phù hợp trong các sản phẩm thực phẩm đặc biệt trong các loại bánh t−ơi. Bảng 2.3. Khả năng hút ẩm của maltooligosacarit [116 ] 240C* G3 > G4 > G5 = G7 > G11 > G2 300C G3 > G4 = G7 > G5 > G6 > G11 > G2 380C G3 > G4 = G5 > G7 > G6 > G11 > G2 ở điều kiện độ ẩm 90% và nhiệt độ môi tr−ờng là 240C, 300C, 380C thì khả năng hút ẩm của G3 cao hơn G4 và các đ−ờng thành phần khác. Đặc biệt là G2 có khả năng hút ẩm thấp nhất. Hình 2: Cấu trúc phân tử của maltotrioza Phân tử maltotrioza ( 0- α– D – Glucopyranosyl- (1-4)- 0- α – D – Glucopyranosyl- (1-4) D – Glucopyranosyl ) gồm ba đơn vị glucoza kết hợp với nhau bằng liên kết α -1,4 glucozit [34]. T−ơng tự nh− maltotrioza (G3), maltotetraoza (G4) có 4 đơn vị glucoza kết hợp với nhau bằng liên kết α -1,4 glucozit, maltopentanoza (G5) có 5 đơn vị glucoza kết hợp với nhau, maltohexanoza(G6) có 6 đơn vị glucoza kết hợp với nhau … 24 β- glucan là một trong những polysacharit phong phú nhất trong thành tế bào nấm men và tồn tại nh− chất trùng hợp của đ−ờng glucoza liên kết qua β-1,3-D-glucosidic hoặc β-1,6-D-glucosidic. Trong nấm men Saccharomyces cerevisiae, thành tế bào chủ yếu chứa β-1,3-D-glucan, β-1,6-D-glucan, chitin và mannoprotein, chúng liên kết với nhau bằng liên kết cộng hóa trị. Mannoprotein, với khối l−ợng protein khoảng 100 KDa liên kết với β-1,6-D-glucan qua gốc glycosyl-phosphatidyl-inositol chứa 5 gốc manosyl liên kết α. Đầu khử của β-1,6-D-glucan liên kết với đầu không khử của β-1,3-D-glucan. Chitin gắn thẳng vào nhánh β-1,6-D-glucan. Mối liên kết này có vài trò trung tâm trong cấu trúc thành tế bào nấm men. Phần lớn β-1,3 có cấu trúc xoắn, những sợi xoắn này gồm chuỗi polysacarit đơn hoặc ba chuỗi liên kết với nhau bằng liên kết hydro. D−ới kính hiển vi điện tử, các sợi có đ−ờng kính từ 10- 30nm, luôn gắn với các chuỗi bên, mỗi chuỗi có đ−ờng kính 0,5-1nm. Cho đến nay vẫn ch−a có số liệu trực tiếp về chiều dài của các chuỗi bên. Các chuỗi bên dài tạo ra các “polysacarit” với các đầu khử cuối [1, 21]. Hình 3 : Cấu trúc thành ngoài tế bào nấm men 25 Hình 4: Cấu trúc β- glucan Bảng 2.4 : Các thành phần chính của thành tế bào Saccharomyces cerevisiae Thành phần (Mức độ polyme hoá) Trọng l−ợng phân tử trung bình (KDa) % trọng l−ợng thành tế bào Tỉ lệ mol t−ơng đối β-1,3 glucan (1500) 240 50 1,0 β-1,6 glucan (150) 24 10 2 Mannoprotein 100 - 200 40 1,2-2,4 Chitin(120) 25 1-3 0,1-0,3 2.2. Nguyên liệu dùng cho sản xuất maltooligosacarit, xylitol, β- glucan 2.2.1 Tinh bột Trong tự nhiên tinh bột là một hợp chất hữu cơ đ−ợc phân bố rộng rãi sau xenluloza. Tinh bột là một polysaccarit chủ yếu có trong các hạt hòa thảo và cây có củ. L−ợng tinh bột ở ngô, lúa mỳ vào khoảng 60- 75%, lúa gạo có thể đạt đến 75- 80%, củ sắn 12- 33%, củ khoai tây 24-26% (bột sắn có 70-81% tinh bột, bột khoai tây 70-75%), tinh bột gạo nếp, ngô nếp amylopectin gần nh− 100%, trái lại trong tinh bột đậu xanh hàm l−ợng amyloza chiếm khoảng 50%[2,4, 7, 19,25 ]. Ngoài ra tinh bột còn có nhiều trong các loại rau quả và là nguồn dinh d−ỡng chính cung cấp 26 calo cho ng−ời và gia súc[7]. Tinh bột đ−ợc cấu tạo từ nhiều gốc monosacarit kết hợp với nhau nên có khối l−ợng phân tử lớn và không có tính khử, d−ới tác dụng của các chất khử tinh bột không có khả năng nhận oxy để tạo thành axit hoặc nhận hydro để tạo thành r−ợu[4]. Tinh bột đ−ợc cấu tạo bởi hai cấu tử : amyloza và amylopectin. Amyloza th−ờng chiếm 12-25% còn amylopectin chiếm 75-85% phân tử tinh bột. Phân tử l−ợng của amyloza là 3.105-1.106 còn phân tử l−ợng của amylopectin là 5.104- 1.106 [17, 22, 30]. Phân tử amyloza và phân tử amylopectin đều đ−ợc cấu thành từ các monosacarit. Phân tử amyloza có các gốc glucoza gắn với nhau bằng liên kết α - 1,4 glucoizit thông qua cầu oxi giữa các nguyên tử cácbon thứ nhất và thứ t− của glucoza tạo nên một chuỗi dài 200-1000 đơn vị glucoza, mạch tạo thành của phân tử amyloza là mạch thẳng. Còn phân tử amylopectin, ngoài liên kết α- 1,4 glucozit còn có liên kết nhánh α- 1,6 glucozit, vì vậy ngoài cấu trúc mạch thẳng, amylopectin còn có cấu trúc mạch nhánh, thông th−ờng có 20-30 gốc glucoza giữa 2 điểm phân nhánh [30, 33, 50]. Hai cấu tử của tinh bột là amyloza và amylopectin có tính chất hoá lý khác nhau. Amyloza khi tác dụng với phân tử iot có màu xanh, còn amylopectin cho màu nâu. Amyloza dễ tan trong n−ớc ấm và tạo nên một dung dịch có độ nhớt không cao. Dung dịch của amyloza không bền khi nhiệt độ hạ thấp, các dung dịch đậm đặc của amyloza nhanh chóng tạo gel tinh thể và kết tủa không thuận nghịch. Khả năng thoái hoá này phụ thuộc vào pH, sự có mặt của các ion kim loại, nồng độ amyloza và khối l−ợng phân tử của amyloza. Amylopectin có độ kết tinh thấp, là phân tử hấp thụ nhiều n−ớc khi nấu chín tinh bột và là thành phần chủ yếu tạo nên sự tr−ơng phồng của hạt tinh bột. Khi tinh bột đ−ợc xử lý đồng thời bằng n−ớc và nhiệt sẽ tạo ra hiện t−ợng hồ hoá. Nhiệt độ hồ hoá của các loại tinh bột trong khoảng 55-700C, hạt tinh bột sẽ tr−ơng phồng lên hấp thụ n−ớc vào các nhóm hydroxyt phân cực, khi đó độ nhớt của dịch tinh bột tăng lên rất cao, các hạt tinh bột tr−ơng nở và kết dính vào với nhau tạo thành paste. Nếu dịch tinh bột đặc khi làm nguội paste tinh bột sẽ tạo thành gel cứng [50, 68,114]. Về mặt cảm quan tinh bột là các hạt rất mịn, màu trắng. Để bảo quản tốt, ng−ời ta giữ độ ẩm của tinh bột trong khoảng 12-14% nhằm ngăn ngừa sự phát triển của vi sinh vật [114]. Trong công nghiệp thực phẩm, tinh bột đ−ợc sử dụng để tạo sợi, tạo 28 các hạt tinh bột hòa tan và thủy phân một phần các cấu tử của tinh bột, hạ độ nhớt của dung dịch[109,113]. Tinh bột là nguồn nguyên liệu quan trọng đặc biệt để sản xuất maltooligosacarit, maltodextrin và glucoza và các sản phẩm thuỷ phân tinh bột khác. Tr−ớc đây, thủy phân tinh bột nhờ xúc tác của axit, công nghệ này đòi hỏi các thiết bị chịu axit, không điều chỉnh để tạo thành các sản phẩm mong muốn và ảnh h−ởng không tốt đến môi tr−ờng. Ngày nay với sự pháp triển của khoa học công nghệ đã nghiên cứu và sản xuất ra nhiều loại enzim trong đó phải kể đến nhóm enzim thuỷ phân tinh bột amylaza. Enzim amylaza xúc tác phản ứng thuỷ phân tinh bột triệt để, có tính đặc hiệu cao tạo ra các sản phẩm mong muốn. Tùy thuộc vào mức độ thủy phân và bản chất, nguồn gốc của enzim sử dụng có thể thu đ−ợc các sản phẩm khác nhau: siro glucoza, glucoza bột, siro maltoza, siro fructoza, maltooligosacarit … Tinh bột sắn. Tinh bột sắn cũng có cấu tạo bởi hai cấu tử amyloza và amylopectin giống nh− các tinh bột khác. Amyloza chiếm 12-18%, amylopectin chiếm 78-80%. Nhiệt độ hồ hoá tinh bột sắn bắt đầu là 58oC và kết thúc ở 68oC. Kích th−ớc hạt tinh bột sắn 15-20nm [7]. Theo tiêu chuẩn của Mỹ, các loại sắn tốt có pH= 4,5-6,5, tinh bột sắn đ−ợc sấy khô có màu trắng, óng ánh khi nhìn d−ới ánh nắng, hàm l−ợng tinh bột >85%, độ ẩm 12%[114].. Hạt tinh bột sắn có nhiều hình dạng: hình tròn, bầu dục bề mặt nhẵn. D−ới ánh sáng phân cực có thể thấy rõ các liên kết ngang với mật độ từ trung bình tới dày đặc. Hàm l−ợng amylopectin, amyloza trong tinh bột sắn liên quan tới độ kết dính khi nấu chín và nhiều tính chất ứng dụng công nghiệp. Tinh bột sắn có độ nở và độ hòa tan cao, ở dạng keo có độ trong lớn, có khả năng tr−ơng nở tốt và xu thế thoái hóa thấp. Độ trong lớn và tính không vị của tinh bột sắn đ−ợc sử dụng trong công nghệ thực phẩm. Khi làm nguội tinh bột sắn ở dạng keo, các phân tử polysacarit có thể tạo một dạng cấu trúc gel có độ bền cao đ−ợc sử dụng trong các thực phẩm cần đ−ợc bảo quản trong thời gian dài[9] Tinh bột sắn về cảm quan có màu sáng trắng, khi hồ hoá độ nhớt tăng rất nhanh, độ kết dính cao hơn các tinh bột khác nh− tinh bột khoai lang, khoai tây... Tinh bột sắn không có mùi đặc tr−ng nh−ng khi hồ hóa có mùi đặc tr−ng dễ phân biệt với các 29 loại tinh bột khác. ở n−ớc ta sắn đ−ợc trồng nhiều nhất là ở những vùng đồi núi, chịu đ−ợc các điều kiện khí hậu khắc nghiệt và không đòi hỏi sự chăm sóc nhiều, tinh bột sắn là nguồn nguyên liệu dồi dào và rẻ tiền nhất, giá 1 kg bột sắn khô chỉ khoảng 3000- 3.500 đ. Tinh bột sắn là nguồn nguyên liệu sử dụng trong nhiều ngành công nghiệp nh− công nghiệp thực phẩm (dùng trong sản xuất siro glucoza, đ−ờng glucoza, mì chính..) công nghiệp giấy và công nghiệp dệt [114]. Tình hình sản xuất và sử dụng sắn ở Việt Nam và trên thế giới. Hiện nay Việt nam sản xuất đ−ợc trên 2 triệu tấn sắn t−ơi mỗi năm, đứng thứ 11 thế giới về sản l−ợng sắn và là n−ớc xuất khẩu tinh bột sắn đứng thứ 3 trên thế giới sau Thái Lan và Indonexia[8]. Thái Lan là n−ớc trồng sản và xuất khẩu sắn đứng đầu thế giới, có trên 55% sản l−ợng sắn của Thái Lan đ−ợc sử dụng d−ới dạng sắn lát phơi khô dùng làm thức ăn gia súc, trong đó 90% đ−ợc xuất khẩu sang Châu Âu và chỉ có 10% tiêu thụ nội địa. Gần 45% sản l−ợng còn lại đ−ợc chế biến thành các sản phẩm, 60% sản phẩm loại này đ−ợc xuất khẩu[8].. Trong chiến l−ợc toàn cầu, sắn đang đ−ợc tôn vinh là một trong những cây l−ơng thực dễ trồng, thích hợp với những vùng đất nghèo, là cây công nghiệp triển vọng, có khả năng cạnh tranh cao với nhiều cây trồng khác. ở Việt Nam cây sắn đang đ−ợc chuyển đổi nhanh chóng vai trò từ cây l−ơng thực truyền thống sang cây công nghiệp. Sự hội nhập đang mở rộng thị tr−ờng sắn, tạo nên những cơ hội chế biến tinh bột, tinh bột biến tính, sắn lát, sắn viên để xuất khẩu và sử dụng trong công nghiệp thực phẩm, thức ăn gia súc, nguyên liệu cho các ngành công nghiệp. Theo niên giám thống kê năm 2003 cho thấy diện tích diện tích: 329,4 nghìn ha và sản l−ợng đạt 4157,7 nghìn tấn[8]. Hiện nay Việt Nam đã có 41 nhà máy chế biến tinh bột sắn và đang đ−ợc xây dựng với tổng công suất thiết kế khoảng 3.130 tấn bột/ ngày. Nhiều nhà máy chế biến tinh bột sắn đã và đang đ−ợc đầu t− xây dựng, trong đó nhà máy Vedan ở Đồng Nai với vốn đầu t− n−ớc ngoài và công suất lớn nhất Đông Nam á. Xây dựng công nghệ sản xuất các sản phẩm từ tinh bột sắn là một h−ớng đầu t− có tiềm năng lớn cho cây sắn nói riêng và cho ngành nông nghiệp nói chung. [4] Cây sắn đầu tiên mọc ở vùng hoang vu Trung và Nam Châu Mỹ, về sau đ−ợc trồng lan rộng sang Châu Phi, Châu á. Cho tới nay sắn đ−ợc trồng ở hầu hết các 30 quốc gia trên thế giới nh− : Các n−ớc nằm trong vĩ độ 300 Bắc và 300 Nam, các n−ớc Châu Mỹ La tinh, Khu vực Đông Nam á. ở Việt nam sắn đ−ợc trồng vào cuối thế kỷ 19 và đ−ợc coi là loại cây hoa mầu quan trọng. Bảng 2.5: Thành phần hoá học của củ sắn [4] Thành phần Sắn vàng Sắn trắng N−ớc (%) 63,18 61,90 Tinh bột (%) 34,20 32,90 Đạm toàn phần (%) 0,61 0,13 Chất béo(%) 0,20 0,21 Chất khoáng(%) 0,50 0,53 Vitamin B1 (mg%) 31 58 Vitamin B2 (mg%) 75 75 Cây sắn hiện nay đang đ−ợc đánh giá là cây l−ơng thực mang tính công nghiệp có triển vọng và có khă năng cạnh tranh với các loại cây trồng khác. N−ớc ta đang mở rộng thị tr−ờng tiêu thụ sắn với các loại sản phẩm: sắn lát, tinh bột sắn và tinh bột biến tính... sử dụng trong công nghiệp thực phẩm, thức ăn gia súc và các ngành công nghiệp khác. 2.2.2 Enzim thuỷ phân tinh bột 2.2.2.1. α –amylaza Theo danh pháp quốc tế, α-amylaza gọi là α-1,4 glucan–4 glucanohydrolaza (EC 3.2.1.1), có khả năng phân cắt các liên kết α -1,4 glucozit trong phân tử polysacarit một cách ngẫu nhiên không theo trật tự nào. Do đó α - amylaza có thể thuỷ phân đ−ợc amyloza, amylopectin, glycogen và các sản phẩm trung gian của quá trình thủy phân. Nh−ng không có khả năng thủy phân liên kết α - 1,6 và α - 1,3 glucozit [2,5,11, 26]. α - amylaza có trong n−ớc bọt, tuyến tụy, dịch tiêu hóa của ng−ời và động vật, trong hạt nảy mầm nh− mầm hạt, mầm cây, hạt hoà thảo, đặc biệt có rất nhiều trong chế phẩm nuôi cấy nấm mốc, vi khuẩn. Nh−ng nguồn sản xuất dồi dào và phong phú nhất là các chủng vi sinh vật nh−: nấm mốc, nấm men và vi khuẩn. 31 Amylaza là enzim thủy phân tinh bột, đồng thời là một chế phẩm sinh học đ−ợc sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm, đặc biệt trong sản xuất siro oligosacarit, maltoza và glucoza... Enzim amylaza đ−ợc dùng từ lâu đời theo ph−ơng pháp cổ truyền, để thủy phân tinh bột trong sản xuất mạch nha, r−ợu, bia…. Việc sử dụng amylaza ngày càng trở nên rộng rãi hơn kể từ khi có α -amylaza sinh tổng hợp từ một số chủng vi sinh vật nh− Bacillus lichemiformis đ−ợc phát hiện là có tính bền nhiệt [ 38, 91]. α - amylaza đ−ợc phân bố rộng rãi trong các tế bào vi sinh vật. Các vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp α -amylaza là các chủng Bacillus (nh− Bacillus acidoaldarius, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis, Bacillus stearothermophilus) và một số chủng Streptomyces aureofacien, Thermophilus vulgaris, Pseudomonas, aspergillus, Endomycosis….[ 9, 12, 26, 116, 118] α -amylaza từ các chủng vi sinh vật khác nhau có nhiều tính chất giống nhau nh−ng cũng có các tính chất khác nhau. Chúng giống nhau chủ yếu về tính năng tác dụng với cơ chất nh−ng lại rất khác nhau về khả năng bền vững với nhiệt độ và pH đồng thời các sản phẩm thuỷ phân cơ chất của chúng cũng rất khác nhau. Vì vậy ng−ời ta chia α - amylaza của nấm mốc làm 2 loại : chịu axít và kém chịu axít còn α-amylaza từ vi khuẩn cũng có 2 loại kém bền nhiệt và bền nhiệt. Các α -amylaza thu nhận từ xạ khuẩn và nấm men có hoạt lực không cao, vì vậy phần lớn nghiên cứu đ−ợc tập trung vào α -amylaza của nấm mốc và vi khuẩn. Các chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp α- amylaza nh− : Aspergillus, Rhizopus[12,20]. Xạ khuẩn và nấm men Endomycopsis cũng có khả năng tổng hợp α - amylaza, tuy nhiên hoạt lực α - amylaza của chúng không cao [104,118]. α -amylaza của nấm mốc đ−ợc chia làm 2 loại: chịu axít và kém chịu axít, th−ờng hoạt động ở pH axít. α -amylaza của nấm mốc lần đầu tiên đ−ợc phát hiện từ chủng Aspergillus oryzae, sau này ng−ời ta tìm thấy A. niger, A awamori, Rhizopus ulencer, R. nevear cũng có khả năng tổng hợp α–amylaza[26, 68, 117]. α -amylaza của vi khuẩn có 2 loại: chịu nhiệt và kém chịu nhiệt, th−ờng hoạt động ở pH trung tính hoặc kiềm nhẹ. α -amylaza của vi khuẩn là loại bền với nhiệt nhất so với các loại α -amylaza sinh ra từ các chủng vi sinh vật khác. α -amylaza của 32 chủng Bacillus stearothermophilus ở nhiệt độ 60-70oC bị mất hoạt lực sau 24 giờ; ở 90oC giảm hoạt lực 17% sau 6 phút, trong khi α -amylaza của chủng Bacillus subtilis bị mất hoạt lực hoàn toàn [117,118]. Trong công nghiệp, α -amylaza của vi khuẩn đ−ợc sử dụng rộng rãi nhất vì nó th−ờng không có độc tố, có hoạt lực cao và chịu đ−ợc nhiệt độ cao, trong khi α- amylaza của nấm mốc bị mất hoạt tính ngay sau khi hồ hoá. Vi khuẩn Bacillus có khả năng sinh tổng hợp α - amylaza mạnh và có ý nghĩa trong công nghiệp nh− chủng : Bacillus subtilis, B. coagulans, B. stearothermophilus, B. licheniformis [73, 75]. α - amylaza có bản chất là protein nên tan trong n−ớc và không bị phân hủy bởi proteaza. α -amylaza còn đ−ợc gọi là enzim kim loại vì trong phân tử của enzim có ít nhất 1 ion Ca++ nằm ở trung tâm hoạt động. Số l−ợng ion Ca++ trong phân tử enzim, mức độ liên kết của các ion Ca++ với proein rất khác nhau và phụ thuộc vào nguồn gốc của từng loại α -amylaza. Tất cả các enzim α -amylaza đều chứa từ 1-30 nguyên tử Ca++/mol enzim. Hoạt lực của enzim không thay đổi khi thay thế tất cả các ion Ca++ bằng ion Mg++, loại trừ ion Ca++ ở trung tâm hoạt động. Khi tách ion Ca++ ra khỏi enzim bằng EDTA thì enzim bị mất khả năng hoạt động, không còn khả năng thủy phân cơ chất và bị biến tính khi đun nóng, đặc biệt bị thủy phân bởi proteaza. Vì vậy, ion Ca++ đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì cấu trúc phân tử cũng nh− khả năng hoạt động của enzim [2,3,20]. Phần lớn α - amylaza đều có trọng l−ợng phân tử t−ơng đối gần nhau khoảng 50.000 đơn vị, nh−ng với α - amylaza của B. stearothermophilus trọng l−ợng phân tử chỉ có 15.000. α - amylaza có nguồn gốc khác nhau hoạt động thích hợp ở các điều kiện nhiệt độ, pH khác nhau. Maining và Campell đã xác định đ−ợc nhiệt độ tối −u cho α - amylaza từ chủng B. stearothermophilus là 55-700C, của B. subtilis là 600C, của B. licheniformis là 90-1050C [ 28, 39, 90]. α - amylaza của nấm mốc có nhiệt độ tối −u thấp hơn so với α- amylaza của vi khuẩn và chịu đ−ợc pH axit hơn. pH hoạt động của α - amylaza từ nấm mốc là 4,5 -5,0; của vi khuẩn là 5,8 – 7,0. Nếu pH < 4,0 thì α- amylaza của vi khuẩn bị mất hoàn toàn hoạt lực [104] 33 Cơ chế tác dụng của α –amylaza lên phân tử tinh bột Cơ chế chung của enzim α - amylaza là thủy phân không định vị các liên kết α- 1,4 glucozit của polysacarit. enzim này thuộc loại endoenzim, có nghĩa enzim tấn công các liên kết nội phân tử. Tác dụng của α - amylaza lên amyloza và amylopectin dẫn đến giảm độ nhớt , làm mất khả năng nhuộm màu với iốt và đ−ờng khử tăng. Tuy nhiên α- amylaza thuỷ phân liên kết α-1,6 glucozit và không tấn công liên kết α -1,4 glucozit gần kề với α -1,6 glucozit trong phân tử tinh bột và glycogen vì vậy sau khi thuỷ phân sẽ tạo ra một l−ợng các oligosacarit nhánh, panoza, α-dextrin phân tử l−ợng thấp chứa liên kết α -1,6 glucozit. [2,5] Tất cả các α-amylaza đều có khả năng phân hủy nhanh chóng phân tử tinh bột, làm thay đổi màu của iốt và giảm độ nhớt của tinh bột một cách nhanh chóng. Các sản phẩm thủy phân của α -amylaza là các oligosacarit, maltotrioza, maltodextrin và một l−ợng ít glucoza, maltoza . α -amylaza tác động rất yếu đối với các oligosacarit phân tử thấp nh− maltotrioza, maltoza. α-amylaza thuỷ phân amylopectin thành các dextrin có chứa nhiều hơn 4 đơn vị glucoza liên kết với nhau qua liên kết α -1,6 glucozit . Các α -amylaza từ các chủng vi sinh vật khác nhau, khi thuỷ phân tinh bột tạo thành các dextrin có phân tử l−ợng khác nhau. α -amylaza của chủng Bacillus subtilis tạo thành các dextrin có 9-10 cấu trúc glucoza, α -amylaza của Bacillus amyloliquefaciens tạo thành α-dextrin có chứa liên kết nhánh và không nhiều hơn 9 cấu trúc glucoza [103,114]. Phản ứng thuỷ phân của enzim dịch hoá α - amylaza Tinh bột + N−ớc G1 + G2 + G3 +G4 + G5+ G6+ các oligosacarit nhánh Enzim α - amylaza tạo maltotrioza α - amylaza tạo maltotrioza đ−ợc Wako tìm thấy năm 1978, là α - amylaza ngoại bào đ−ợc sinh tổng hợp tù chủng Streptomyces griseus, đây là enzim ngoại bào thứ 3 đ−ợc tìm thấy sau các enzim α - amylaza tạo maltohexaoza và maltotetraoza. O-O-O-O* O-O-O + O* 34 O-O-O-O-O* O-O-O + O-O* O-O-O-O-O-O* O-O-O + O-O-O* Hình 7:Tác dụng của enzim α - amylaza lên tinh bột hoà tan tạo maltotrioza Đặc biệt enzim này thuỷ phân cơ chất theo h−ớng từ ngoài vào và hình thành phân tử maltotrioza từ cuối đầu không khử của maltooligosaccarit và α-1,4-glucan. Enzim này có thể thuỷ phân triệt để mạch amyloza ngắn (DP 20), đồng thời thuỷ phân tinh bột hoà tan, tinh bột ngô (Waxy) và glycogen với các mức độ t−ơng ứng 55%, 51%, 40%. Sự tác dụng t−ơng tự nh− của β - amylaza, cắt từng đoạn của phân tử cơ chất. Tính chất của enzim : enzim hoạt động ở pH=5,6-6 và nhiệt độ 45oC. ở pH=3,5- 6,5 enzim hoạt động với 80% hoạt lực. Enzim bền nhiệt ở 40oC nh−ng ở nhiệt độ > 45oC enzim nhanh chóng mất hoạt lực. Trọng l−ợng phân tử của enzim là 55.000 do bằng SDS disc electrophoresis. Tác dụng của ion kim loại lên hoạt lực của enzim đ−ợc chỉ ra ở bảng sau: Bảng 2.6: Tác dụng của ion kim loại lên hoạt lực của amylaza từ chủng St. griseus Chất phản ứng(2mM) Hoạt lực(%) Không có ion kim loại 100 LiCl 131 CuCl2 15,5 SrCl2 104 CoCl2 86,6 NiCl2 74,2 CaCl2 90,7 MgCl2 88,7 ZnCl2 46,4 SnCl2 89,7 BaCl2 101 HgCl2 0 35 Bảng 2.7: Tác dụng amylaza từ chủng S. griseus lên các cơ chất khác nhau Cơ chất Tỷ lệ thuỷ phân t−ơng ứng Tinh bột hoà tan 100 Amyloza 114 Waxy beta-dextrin 0 Waxy starch 91,6 Oyster glycogen 62,6 Phytoglycogen 40,2 Pullulan 0 Beta-cyclodextrin 0 2.2.2.2 Enzim pullulanaza. Theo danh pháp quốc tế enzim pullulanaza gọi là pullulan 6- glucanohydrolaza (EC. 3.2.1.41). Pullulanaza còn có tên gọi khác poly- α - 1,6- maltotrioza, thuỷ phân triệt để 63-α – maltotriosylmaltotetraoza đến maltotrioza[113, 116, 118]. Pullulanaza là enzim thủy phân liên kết α -1,6 glucozit trong phân tử amylopectin, α- dextrin, glycogen, pullulan, tuy nhiên nó không có tác dụng đối với amyloza và các oligosacarit mạch thẳng. Pullulanaza có trong thực vật nh− : Đậu Hà lan, cây yến mạch, malt, gạo,… nh−ng nguồn sản xuất dồi dào và phong phú nhất là các chủng vi sinh vật. Pullulanaza lần đầu tiên đ−ợc tìm thấy từ Klebsiella pneumoniae (tên gọi khác Aerobacter aerogenes) [78], sau này ng−ời ta phát hiện thấy pullulanaza đ−ợc sinh tổng hợp từ các nguồn vi sinh vật rất đa dạng nh− : Encherichia intermedia, Streptococcus mitis, Bacillus acidopullulyticus, Streptomyces flavochromogenas, Oryza sativa, Hordeum valgare, Bacillus macerans, Bacillus polymyxa[38,56,118,116], Aerobacter aerogenes, Pseudomonas stutzeri, Bacillus amyloliquefaciens[ 71, 89,103, 118 ]… Pullulanaza từ chủng K. pneumoniae đ−ợc dùng trong nghiên cứu cấu trúc của tinh bột và glycogen, thuỷ phân cấu trúc phân nhánh α -1,6 glucozit. Trong sản xuất các loại đ−ờng glucoza, maltoza, maltotrioza từ tinh bột trên quy mô công nghiệp ng−ời ta ứng dụng pullulanaza từ K.pneumoniae và B. acidopullulyticus để tăng hiệu suất chuyển hoá[22,36]. Ví dụ trong công nghệ sản xuất maltoza nếu kết hợp 36 pullulanaza với α – amylaza và β - amylaza thì hiệu suất chuyển hoá tăng 97%. Ngoài ra pullulanaza còn đ−ợc sử dụng để sản xuất cyclodextrin nhánh mà gốc maltooligosyl liên kết với gốc hydroxyl ở vị trí C6 của phân tử cyclodextrin bằng cách ủ hỗn hợp maltooligosacarit và cyclodextrin với pullulanaza. Tất cả các pullulanaza đ−ợc biết đến ngày này đều không có khả năng thuỷ phân cyclodextrin[36]. Ngày nay cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật AND tái tổ hợp ng−ời ta đã tách gen pullulanaza từ chủng Desulfurococcus mucosus DSM2162 ghép vào B. subtilis JA803 để sinh tổng hợp enzim pullulanaza[36]. Enzim pullulanaza từ các chủng vi sinh vật khác nhau, có những đặc tính kỹ thuật giống và khác nhau. Bảng d−ới cho thấy một số đặc tính kỹ thuật của enzim pullulanaza từ 2 chủng K.pneumoniae và B. acidopullulyticus. Hiện nay 2 chủng này đ−ợc sử dụng để sinh tổng hợp enzim trên quy mô công nghiệp của 2 hãng nổi tiếng thế giới đó là Nhật bản và Đan mạch. Bảng 2.8 : Một số tính chất của enzim pullulanaza[116] Pullulanaza K. pneumoniae B. acidopullulyticus Nội bào Ngoài bào Chủng 11647 Chủng 11777 Trọng l−ợng phân tử 90.000 66.000 100.000 90.000 Hoạt lực / mg protein 7.000(1) 7.200(1) 100(2) 50(2) pH tối −u 6.0 6.6 5.2 5.5 Khoảng pH ổn định 5.5- 12 5.0-11.5 4-9 4-9 Khả năng chịu nhiệt 400C 45-550C 550C 550C Điểm đẳng điện 3.8- 4.46 3.7- 4.3 5.0 4.9 Kiểu hoạt động endo endo endo endo (1) Sử dụng cơ chất pullulan, (2) Sử dụng cơ chất là amylopectin Phần lớn pullulanaza đều có trọng l−ợng phân tử t−ơng đối gần nhau khoảng 90.000- 100.000, nh−ng với pullulanaza của Bacillus polymyxa trọng l−ợng phân tử chỉ có 48.000[116]. Trọng l−ợng phân tử đ−ợc xác định bằng điện di gel của 2 chủng K. pneumoniae và B. acidopullulyticus là 66.000 – 90.000[117]. Pullulanaza có nguồn gốc khác nhau hoạt động thích hợp ở các điều kiện nhiệt độ, pH khác nhau. Nhiệt độ tối −u cho hoạt động của pullulanaza từ chủng Bacillus 37 sp. 202-1 là 550C[9], chủng Streptococcus mitis là 300C[20]. Pullulanaza từ chủng B. acidopullulyticus hoạt động thích hợp nhất ở pH 5,5 và nhiệt độ 55 0C, tuy nhiên nhiệt độ thích hợp cho sinh tổng hợp enzim từ chủng này là 350C[51, 73]. pH tối −u cho hoạt động của pullulanaza từ K. pneumoniae là 6,0 –7,0 và enzim duy trì đựơc 80 % hoạt lực khi pH 5-10 [76], nhiệt độ hoạt động thích hợp là 55 0C và nhiệt độ enzim ổn định 40- 55 0C. Enzim pullulanaza có tác dụng thủy phân liên kết -1,6 glucozit của pullulan để sản xuất ra maltotrioza. Độ nhớt của dịch pullulan giảm dần và hàm l−ợng đ−ờng khử tăng theo thời gian thuỷ phân. Giai đoạn đầu của phản ứng enzim là sự tạo thành hex- và nona- oligosacarit, sau đó maltotrioza đ−ợc hình thành ở giai đoạn sau[116]. Pullulanaza có tác dụng thủy phân liên kết α -1,6 glucozit của phân tử amylopectin, các oligosacarit mạch nhánh nên giá trị DE tăng theo thời gian phản ứng. Khả năng thuỷ phân của pullulanaza từ chủng Streptococcus mitis trên cơ chất amylopectin và glycogen là 50% và 30%[113]. Pullulanaza không thuỷ phân các liên kết α -1,6 glucozit trong isopanoza, isomaltoza và một số mạch nhánh ngắn. Bảng sau cho thấy tốc độ thuỷ phân mối liên kết α-1,6 glucozit trong các oligosacarit phân nhánh Bảng 2.9. Tốc độ thuỷ phân liên kết -1,6 glucozit trong các oligosacarit phân nhánh bởi enzim pullulanaza từ 2 chủng A. aerogenes và S. mitis[116 ] Cơ chất A. aerogenes S. mitis Pullulan 100 100 62- α - Maltosylmaltotrioza 23 3.8 63- α - Maltosylmaltotrioza 55 7.7 63- α - Maltotriosylmaltotrioza 91 128 63- α - Maltosylmaltotetraoza 171 23 63- α - Maltotriosylmaltotetraoza 112 283 Pullulanaza từ 2 chủng A. aerogenes và S. mitis thuỷ phân pullulan với tốc độ 100. Tuy nhiên với cơ chất là các oligosacarit mạch nhánh, pullulanaza từ các nguồn khác nhau có tốc độ thuỷ phân khác nhau, ví dụ với cơ chất là 63- α - maltotriosylmaltotetraoza thì tốc độ thuỷ phân của pullulanaza từ chủng A. 38 aerogenes là 112 và pullulanaza từ S. mitis là 283, nếu cơ chất là 62- α - maltosylmaltotrioza thì tốc độ thuỷ phân của pullulanaza từ chủng A. aerogenes chỉ đạt 23 và pullulanaza từ S. mitis là 3.8[ 113, 116 ]. Pullulanaza kết hợp enzim α -amylaza trong thuỷ phân tinh bột để sản xuất ra một loạt các maltooligosacatit khác nhau nh− : maltoza, maltotrioza, maltotetraoza, maltopentaoza, maltohexaoza, maltoheptaoza… và làm tăng đ−ờng khử theo thời gian thuỷ phân. Pullulanaza từ chủng K. pneumonia tác dụng lên mối liên kết α-1,6 glucozit (điểm phân nhánh) trong các cơ chất khác nhau đ−ợc thể hiện trong bảng trên[116,118 ]. enzim pullulanaza thuỷ phân liên kết α-1,6 glucozit trong tinh bột và glycogen sản xuất ra một loạt các maltooligosacarit và làm tăng c−ờng độ màu xanh với dung dịch iốt. Đặc biệt pullulanaza thuỷ phân liên kết α -1,6 glucozit trong các oligosacarit mạch nhánh tốt nh− với pullulan, tinh bột và glycogen Bảng 2.10 : ảnh h−ởng của enzim pullulanaza từ chủng K. pneumonia trên cơ chất mạch nhánh[116]. α- amylolysis(%) Cơ chất Tr−ớc khi thuỷ phân mạch nhánh Sau khi thuỷ phân mạch nhánh Amylopectin 50 95 Glycogen 38 46 Amylopectin beta- LD 0 97 Glycogen beta- LD 0 31 Sau khi thuỷ phân nhánh với xúc tác của enzim pullulanaza thì hầu hết cơ chất có mạch nhánh (α- amylolysis) đều chuyển thành dạng mạch thẳng (α- amylolysis). Ví dụ tr−ớc khi thuỷ phân amylopectin là 50%, sau khi thuỷ phân chỉ còn 5% , hiệu suất chuyển hoá đạt 90%. Tr−ớc khi thuỷ phân glycogen thì phần trăm α - amylolyis là 38%, sau khi thuỷ phân phần trăm α - amylolysis tăng lên 46%. Với α - limit dextrin tr−ớc khi thuỷ phân thì phần trăm α - amylolyis là 0%, sau khi thuỷ phân phần trăm α - amylolysis tăng lên 97%[116]. 39 2.2.3 Nguyên liệu dùng trong sản xuất xylitol Xylitol đ−ợc sản xuất trực tiếp từ xyloza theo con đ−ờng tổng hợp hóa học hoặc lên men nhờ vi sinh vật. Nguồn xyloza dùng trong tổng hợp hóa học hoặc lên men nhờ vi sinh vật th−ờng đ−ợc lấy từ dịch thủy phân gỗ, rơm rạ, bẹ ngô và các nguyên liệu có nguồn gốc thực vật giàu xylan khác. Các nguyên liệu thực vật này đ−ợc thủy phân bằng enzim hoặc axit d−ới các điều kiện khác nhau, kết quả là thu đ−ợc một hỗn dịch có chứa các đ−ờng, chủ yếu là xyloza, và các sản phẩm phụ khác sinh ra trong quá trình thủy phân nh− axit acetic, lignin, phenol... Sơ đồ trong hình d−ới nêu ra con đ−ờng tổng quát để sản xuất các sản phẩm sinh học từ nguồn nguyên liệu sinh khối thực vật. Hình 8 . Sơ đồ tổng quát các con đ−ờng sản xuất các sản phẩm hữu cơ từ nguồn nguyên liệu lignocelluloza. Lignocelluloza đ−ợc cấu tạo từ celluloza, hemicelluloza, lignin và các thành phần phụ khác. Thuật ngữ holocelluloza th−ờng đ−ợc dùng để chỉ các loại carbohydrat có Sinh khối thực vật (Thủy phân bằng axit, enzim) Acetyl Các đ−ờng pentoza Các đ−ờng hexoza Lignin Axit acetic Lên men, Tổng hợp hóa học Lignin, các phenol Nấm men Alcohol Ketane Axit hữu cơ Các polyol Vitamin Protein Chất béo Ethanol Butanol Isopropanol 2,3 Butanediol Acetone Axit hữu cơ Axit acetic Axit butyric Glycerol Arabitol Xylitol Erythritol 40 trong thực vật hoặc các tế bào vi sinh vật. Do đó holocelluloza bao gồm celluloza và hemicelluloza. Bảng 2.11: Thành phần của một số loại lignocelluloza thực vật [86]. Thành phần (% trọng l−ợng khô) Loại nguyên liệu Celluloza Hemicelluloza Lignin Thân ngô* 15 35 8 Lõi ngô 4 35 15 Bẹ ngô 40 25 17 Rơm 35 25 12 Rơm lúa mì 30 50 20 Bã mía 40 24 25 Chú thích: * - Có chứa 20% tinh bột Celluloza là thành phần chính của thành tế bào thực vật bậc cao. Celluloza là polyme không phân nhánh đ−ợc cấu tạo từ các monome là β-D-glucoza. Tuy nhiên, đơn vị cơ bản để cấu thành nên celluloza là các cellobioza, một dime bao gồm hai phân tử glucoza. Hemicelluloza là một di polime đ−ợc cấu thành từ các đ−ờng pentoza (xyloza, arabinoza), các đ−ờng hexoza (mannoza, glucoza, galactoza) và các axit. Không giống nh− celluloza, hemicelluloza không đồng nhất về mặt hóa học. Hemicelluloza của gỗ cứng chứa chủ yếu là xylan trong khi hemicelluloza của gỗ mềm lại chứa chủ yếu là glucomannan. Xylan của rất nhiều thực vật là các dị polysaccharide với bộ khung đ−ợc cấu tạo từ các đơn vị β-D-xylopyranose. Ngoài xyloza, xylan còn chứa arabinoza, axit glucuronic hoặc dạng 4-Ο-methyl ête của nó, axit acetic, axit ferulic và axit p-coumaric. Thông th−ờng, l−ợng hemicelluloza chiếm 15 đến 30 % trọng l−ợng khô của gỗ. Hemicelluloza dễ bị thủy phân bằng axit để tạo thành các thành phần monome bao gồm glucoza, mannoza, galactoza, xyloza, arabinoza và một l−ợng nhỏ rhamnoza, axit glucuronic, axit methyl glucuronic… Hemicelluloza của gỗ mềm và gỗ cứng có cấu trúc và thành phần khác nhau, thành phần cấu tạo này ảnh h−ởng đến thành phần của dịch thủy phân và các chất ức chế đ−ợc tạo thành trong quá trình thủy phân [16, 97]. 41 Bảng 2.12. Thành phần đ−ờng của hemicelluloza ở một số loại gỗ [97]. Nguyên liệu Glucan Mannan Galactan Xylan Cây tổng quán sủi 40,5 1,5 0,8 16,1 Cây d−ơng 43,2 2,2 0,5 15,1 Gỗ cứng Cây bulô 47,7 1,7 0,7 20,0 Cây thông 42,4 11,8 1,9 4,7 Gỗ mềm Cây vân sam 41,6 11,5 2,0 4,7 Ghi chú: Giá trị trong bảng là giá trị phần trăm tính theo trọng l−ợng khô Có vài cách để thủy phân gỗ để thu hồi xyloza, các ph−ơng pháp chung nhất th−ờng đ−ợc chia thành hai loại: thủy phân bằng ph−ơng pháp enzim và thủy phân bằng ph−ơng pháp hóa học. Ngoài hai ph−ơng pháp chính trên còn có một số ph−ơng pháp khác để phân cắt hemicelluloza thành các monome của nó chẳng hạn nh− ph−ơng pháp dùng tia gama, chùm electron ... tuy nhiên các ph−ơng pháp này không có ý nghĩa ứng dụng thực tiễn. Ph−ơng pháp thủy phân bằng enzim đ−ợc thực hiện nhờ các enzim thủy phân celluloza hay còn đ−ợc gọi là các cellulaza. Khi thủy phân lignocelluloza ng−ời ta th−ờng dùng một hỗn hợp các enzim do cơ chế hoạt động và cơ chất của các enzim này là khác nhau. Thông th−ờng ng−ời ta th−ờng dùng hỗn hợp các enzim bao gồm endoglucanaza, exoglucanaza, β-glucosidaza và cellobiohydrolaza. Các endoglucanaza có tác dụng phân cắt ngẫu nhiên các chuỗi celluloza để tạo thành các polysaccarit ngắn hơn, trong khi các exoglucanaza tác dụng vào dầu tận cùng không khử của các chuỗi polysaccarit này để tạo thành các glucoza. Tùy thuộc vào mục đích của việc thủy phân, chẳng hạn nh− muốn thu đ−ợc l−ợng đ−ờng chính là glucoza hay xyloza mà ng−ời ta sử dụng hỗn hợp các loại enzim khác nhau với hàm l−ợng và nồng độ khác nhau [97]. Khó khăn lớn nhất trong việc thủy phân lignocelluloza bằng ph−ơng pháp enzim nằm ở bản chất hóa học của celluloza. Cấu trúc mạng l−ới của lignin-hemicelluloza, dạng kết tinh của celluloza và diện tích bề mặt nhỏ của nó làm cho lignocelluloza kháng lại tác dụng của các enzim thủy phân. Do đó, để quá trình thủy phân đạt đ−ợc hiệu suất cao thì ng−ời ta phải xử lý cơ học và hóa học các nguyên liệu tr−ớc khi đ−a 42 vào thủy phân nhằm phá hủy một phần cấu trúc hoá học bền vững của lignocelluloza [97]. Đối với ph−ơng pháp thủy phân lignocelluloza bằng các tác nhân hóa học, ng−ời ta th−ờng dùng các xít nh− H2SO4, HCl hoặc các kiềm nh− NaOH ở điều kiện nhiệt độ và áp suất cao để phân cắt các thành phần polyme có trong lignocelluloza thành các đ−ờng và các oligosaccarit. Trong các loại tác nhân trên thì H2SO4 đ−ợc −a dùng hơn cả vì ph−ơng pháp tiến hành đơn giản và hiệu quả cao. Điều kiện thủy phân th−ờng dùng là: nồng độ axit từ 0.25% tới 12%, nhiệt độ từ 100 đến 125°C trong thời gian 40 đến 75 phút [40, 112, 97]. Nh− đã trình bày ở phần trên, cả quá trình thủy phân bằng enzim hoặc bằng axit đều cần có b−ớc xử lý nguyên liệu tr−ớc khi đ−a vào thủy phân để nhằm đạt đ−ợc hiệu suất thủy phân cao. Đối với ph−ơng pháp thủy phân bằng hóa học, quá trình xử lý và thủy phân có thể đ−ợc tiến hành đồng thời trong một b−ớc. Nguyên liệu tr−ớc khi đ−a vào thủy phân th−ờng đ−ợc chặt nhỏ sau đó đ−ợc thủy phân ở các điều kiện khác nhau và cuối cùng ng−ời ta tiến hành lọc để thu hồi dịch thủy phân. Dịch này đ−ợc trung hòa, xử lý để loại bỏ các thành phần không cần thiết và chất ức chế sau đó đ−ợc dùng làm nguồn xyloza cho tổng hợp hóa học hoặc lên men. Các sản phẩm trung gian tạo ra trong quá trình thủy phân Sản phẩm thủy phân lignocelluloza ngoài thành phần chính là các đ−ờng còn có các sản phẩm phụ khác đ−ợc sinh ra trong quá trình thủy phân, đặc biệt là đối với quá trình thủy phân bằng axit. Các sản phẩm phụ chủ yếu là các furan, các axit hữu cơ và các hợp chất phenol. Furfural và 5-hydroxymethyl furfural (HMF) là các furan quan trọng nhất. Chúng đ−ợc tạo thành trong quá trình phân hủy các đ−ờng pentoza và các đ−ờng hexoza. Phản ứng hóa học hình hành HMF từ glucoza và furfural từ xyloza [86, 97]. 43 Hình 9. Quá trình tạo thành HMF và furfural từ các đ−ờng glucoza và xyloza. Các axit hữu cơ cũng là các sản phẩm phụ đ−ợc sinh ra trong quá trình thủy phân, các axit chủ yếu bao gồm axit levulinic, axit formic và axit acetic. Trong các axit này thì axit acetic là đối t−ợng đ−ợc quan tâm hơn cả vì nó đ−ợc tạo thành với hàm l−ợng cao nhất và có hiệu ứng ức chế quá trình lên men tạo thành xylitol của vi sinh vật. Axit acetic đ−ợc tạo thành từ quá trình thủy phân các gốc acetyl có trong hemicelluloza. Trong quá trình thủy phân gỗ cứng thì l−ợng axit acetic đ−ợc sinh ra nhiều hơn so với quá trình thủy phân các nguyên liệu gỗ mềm. Ngoài ra quá trình thủy phân còn tạo ra các hợp chất thơm và các hợp chất phenol nh− phenol, vanilin, axit vanillic, vanillyl alcohol, axit 4-hydroxybenzoic, 4-hydroxybenzaldehyd, axit coumaric, syringaldehyd, axit syringic, cinnamaldehyd, dihydroconiferyl alcohol, hydroquinone, catechol, veratrol, acetoguaiaceton, axit homovanillic, formaldehyde, maltol, 2-hydroxymethylfuran, dihydroxyaceton, glyceraldehyd và methylglyoxal [86, 97]. Rất nhiều trong số các sản phẩm phụ đ−ợc sinh ra trong quá trình thủy phân có tác dụng ức chế quá trình lên men đặc biệt là axit furfural, HMF và axit acetic. Để chuyển hóa xyloza có trong dịch thủy phân thành xylitol với hiệu suất cao nhờ vi sinh vật, các hợp chất này cần đ−ợc loại bỏ trong b−ớc xử lý dịch tr−ớc khi lên men [67, 79]. 2.2.4 Nguồn nguyên liệu chứa β- glucan [42, 43, 44] Glucan thu đ−ợc từ các nguồn khác nhau nh−: thực vật, tế bào nấm men, nấm... Glucan nói chung đ−ợc miêu tả nh− polymer của glucoza và có một số hoạt tính sinh học nh− hoạt hóa hệ miễn dịch, chống ung th−, kích thích sinh tr−ởng. 44 β- glucan trong yến mạch và lúa mạch có rất ít hoặc không có hoạt tính. Nh−ng β- glucan trong n−ớc của yến mạch có thể giảm nguy cơ bệnh tim. Các loại thực phẩm giàu β-glucan tan trong n−ớc hiện nay đã có trên thị tr−ờng. β- glucan tìm thấy trong nấm lớn có phân nhánh chỉ với một phân tử glucoza và chỉ tăng c−ờng miễn dịch đến một mức nào đó. Bên cạnh đó, β- glucan chiết từ thành tế bào nấm men bánh mỳ phân nhánh rất mạnh và nó có khả năng tăng hoạt tính miễn dịch mạnh nhất trong tất cả các loại β- glucan. β-1,3-D-glucan đã đ−ợc chiết từ thành tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae (lên men bánh mỳ) và đ−ợc đặt tên vào đầu năm 1960 bởi nhóm nghiên cứu ở Mỹ (tr−ờng Tổng hợp Tulane, khoa Y học, chuyên ngành sinh lý học). β- glucan đã đ−ợc tách chiết từ các chủng nấm men nh− Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces delbrueckii, Candida albicans, Candida cloacae, Candida tropicalis, Hansenula henricii. Tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae tuy có cấu tạo đơn bào nh−ng cũng mang đầy đủ tính chất của cơ thể sống, chúng có cấu tạo từ màng, nguyên sinh chất và nhân. Thành tế bào nấm men quyết định hình dạng của tế bào và tính toàn vẹn của tổ chức tế bào trong suốt quá trình phát triển và phân chia tế bào. Có 3 nhóm chính của polisacarit trong thành tế bào là manose (mannoprotein chiếm gần 40% tổng l−ợng sinh khối tế bào), gluco (β - glucan chiếm gần 60% tổng l−ợng sinh khối tế bào) và polime của N-acetylglucosamin(chitin chiếm khoảng 2% tổng l−ợng sinh khối tế bào). β- glucan đ−ợc chia thành hai nhóm tùy theo ph−ơng thức liên kết: chuỗi dài có 1500 đơn vị β-1,3 glucan chiếm 85% tổng l−ợng glucan trong thành tế bào. Chuỗi ngắn có 150 đơn vị β-1,6 glucan chiếm khoảng 15% tổng l−ợng glucan của thành tế bào. Phức hệ β-1,3- glucan – Chitin là yếu tố cấu tạo chính của màng tế bào bên trong. β-1,6-glucan liên kết các thành phần bên trong và bên ngoài của màng tế bào. Trên bề mặt ngoài của màng tế bào là mannoprotein bó rất chặt và hạn chế sự thẩm thấu của màng tế bào. β-1,3 - glucan tạo thành mạng l−ới sợi của mặt trong màng tế bào với trọng l−ợng phân tử 240000 và chiều dài tối đa của sợi khoảng 600nm. Chitin là một polyme của N- acetin- glucosamin và ng−ời ta nhận thấy thành phần này nằm 45 sát sẹo chồi. Phân tích các vết sẹo chồi bằng cách xử lý thành tế bào bằng các enzim lytic thích hợp đã chỉ ra rằng chitin là thành phần tạo vòng xung quanh vết sẹo chồi. Mannoprotein màng tế bào nấm men là những polipeptit glycosyl hóa cao, th−ờng 50-95% cacbonhydrat theo trọng l−ợng, vì vậy có thể coi nó nh− proteoglucan nấm men. [13] Màng tế bào nấm men còn có chứa 6-7%protein và th−ờng protein của nó liên kết vững chắc với phần hydrocacbon và tạo thành các phức chất giàu l−u huỳnh. Ngoài protein, màng tế bào nấm men còn có chứa lipit, nitơ, các loại axit amin và các chất khoáng. Trên thành tế bào Saccharomyces cerevisiae có khá nhiều lỗ nhỏ, qua các lỗ này chất dinh d−ỡng đ−ợc đ−a vào trong tế bào và các sản phẩm trao đổi chất đ−ợc thải ra ngoài môi tr−ờng xung quanh. 2.3. ứng dụng của maltooligosacarit, xylitol, β- glucan 2.3.1 Những ứng dụng của maltooligosacarit giàu maltotrioza Maltooligosacarit giàu maltotrioza đựơc ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt trong công nghiệp thực phẩm : Trong công nghiệp bánh kẹo maltooligosacarit đ−ợc sử dụng trong sản xuất Kẹo ngọt, các món tráng miệng, chewing gum, bánh ngọt, bánh n−ớng, kem bơ, kem sữa trứng, kem sợi, kẹo mềm nhân cà phê (Yokan- tên gọi của Nhật bản), kẹo thạch (Manju- tên gọi của Nhật bản ), bánh nhân táo…[11, 23, 30, 76]. Trong công nghiệp chế biến thực phẩm: mứt, mứt cam, chế biến cá nấu hoặc n−ớng đông lạnh (Surimi: Kamaboko, Chikwa- các tên gọi của Nhật bản), cá xay đông lạnh, các món ăn từ biển, làm vỏ bánh Gyoza và Shumai…[11, 52, 55, 76]. Trong công nghệ đồ uống: Các loại n−ớc ép trái cây, soda, n−ớc uống tăng lực trong thể thao, đồ uống có cồn, n−ớc uống có vị chua, cà phê hòa tan…76,89,90]. Dùng làm chất kết dính, kẹo gum, làm dịu h−ơng, tăng vị cho đồ uống, sử dụng để thay thế sacaroza và glucoza, bổ sung vào thành phần bơ, sữa bột, cà phê hoà tan… [76,120] Một ví dụ về sử dụng maltooligosacarit giàu maltotrioza thay thế siro glucoza trong chế biến bánh “Gyuhi”, một loại bánh cổ truyền Nhật bản[116] 46 Bảng 2.13 Sử dụng maltooligosacarit giàu trong chế biến bánh Gyuhi Công thức Thành phần Đối chứng MS 25% MS 50% Tinh bột gạo 200 g 200g 200g Đ−ờng trắng tinh luyện 375g 375g 350g Siro glucoza ngô 85,4 0Bx 146g - - Siro hỗn hợp maltooligosacarit ( 76,4 0Bx) - 164g 227g N−ớc 279g 261g 223g Tổng cộng 1000 g 1000g 1000g MS: siro maltooligosacarit giàu maltotrioza Ng−ời ta đo độ cứng của bánh sau 7 ngày bảo quản, kết quả cho thấy mẫu đối chứng bánh cứng nhất sau đó đến mẫu 25% MS và mẫu 50 % MS thì độ cứng của bánh là thấp nhất. Trên thế giới maltooligosacarit giàu maltotrioza đ−ợc nghiên cứu sản xuất và ứng dụng từ nhiều năm nay khi công nghệ enzim vi sinh vật phát triển. Nhất là ở một số n−ớc phát triển nh−: Nhật bản, Trung quốc, Thái Lan, Mỹ, Canada,… Sản phẩm maltooligosacarit giàu maltotrioza đã đ−ợc sản xuất và tiêu thụ với số l−ợng lớn mỗi năm trong các ngành công nghiệp thực phẩm, d−ợc phẩm… Sản phẩm maltooligosacarit đ−ợc sản xuất ở nhà máy Kaisai sugar, Osaca - Nhật bản có thành phần nh− sau: Hàm l−ợng glucoza: 3,1%, maltoza : 37,5%, maltotrioza : 25%, > G4 : 35%.[118] 2.3.2 ứng dụng của xylitol Đ−ợc phát hiện lần đầu tiên vào năm 1891 bởi Fischer, xylitol lần đầu tiên đ−ợc sử dụng làm thực phẩm khi cuộc khủng hoảng đ−ờng diễn ra trong thời kì chiến tranh thế giới thứ II. Kể từ đó, hàng loạt các −u điểm của xylitol không ngừng đ−ợc phát hiện và khám phá. Cho đến nay, xylitol đã và đang đ−ợc sử dụng rộng rãi trong nhiều loại sản phẩm khác nhau ở nhiều quốc gia trên thế giới. Phạm vi ứng dụng của xylitol chủ yếu thuộc về hai lĩnh vực là trong công nghiệp thực phẩm và trong d−ợc phẩm. Trong ngành công nghiệp thực phẩm, xylitol đ−ợc sử dụng trong chế biến các loại đồ uống, bánh kẹo ... Do xylitol có độ ngọt t−ơng đ−ơng với saccaroza và tạo cảm 47 giác mát lạnh trong miệng do đặc điểm mất nhiệt khi hoà tan. Đặc tính này làm xylitol rất hấp dẫn trong một số sản phẩm thực phẩm, đặc biệt là đồ uống. Quá trình đồng hóa xylitol trong cơ thể không phụ thuộc vào insulin nên xylitol đ−ợc sử dụng trong ngành d−ợc phẩm để làm nguồn đ−ờng thay thế cho các bệnh nhân bị mắc bệnh tiểu đ−ờng. Xylitol còn có khả năng ức chế sự phát triển của một số vi sinh vật, đặc biệt là Streptococcus mutants, Streptococcus pneumoniae do đó xylitol đ−ợc bổ sung vào n−ớc xúc miệng, thuốc đánh răng, keo cao su ... nhằm chống sâu răng. Các nghiên cứu gần đây ở trẻ nhỏ cho thấy xylitol còn có vai trò trong việc điều trị bệnh viêm tai giữa ở trẻ em [106]. Việc sử dụng xylitol trong điều trị viêm tai giữa ở trẻ em không chỉ tránh đ−ợc vấn đề kháng kháng sinh mà còn tránh đ−ợc các phản ứng phụ nh−: phát ban, tiêu chảy, t−a l−ỡi do Candida, hiện t−ợng th−ờng gặp phải khi sử dụng kháng sinh [99, 100,105]. Ngoài những ứng dụng điển hình trên, một sồ tài liệu còn cho rằng xylitol có vai trò trong việc ngăn chặn sự phát triển của Helicobacter pylori một trong các tác nhân gây bệnh viêm loét dạ dày, ngăn ngừa bệnh loãng x−ơng ở ng−ời già và phụ nữ thông qua quá trình tăng c−ờng hấp thụ canxi ở thành ruột. 2.3.3 ứng dụng của β- glucan [ 42, 43, 44, 15, 63, 96, 46, 84] 2.3.3.1 ứng dụng β -glucan trong thực phẩm: Thức ăn sợi là một nhóm cơ chất tổng hợp, đa dạng, mà tính chất chung của chúng là kháng những enzym phân hủy ở ng−ời. Thức ăn có hàm l−ợng sợi cao có lợi vì nhiều nguyên nhân: - Giúp cho quá trình tiêu hóa tốt hơn vì bản thân nó không bị tiêu hóa nh−ng vẫn đ−ợc vận chuyển qua đ−ờng tiêu hóa, vì vậy nó sẽ đẩy thức ăn ch−a tiêu hóa hết ra ngoài tr−ớc nó. - Làm sạch vi khuẩn trong hệ tiêu hóa và đảm bảo sự làm việc chính xác của nhu động ruột. - Thức ăn có l−ợng xơ cao làm giảm cholesterol huyết thanh và l−ợng triglyceride, giảm nguy cơ ung th− ruột. - Ngoài ra nó còn làm giảm các vấn đề khác có liên quan đến tiêu hóa kém nh− tạo mụn nhọt, viêm ruột. Vai trò của cấu trúc sợi đối với sức khỏe con ng−ời đã hoàn toàn đ−ợc công nhận, tuy nhiên ng−ời ta vẫn ch−a biết rõ về cơ chế hoạt động của nó. 48 β- glucan tổng từ thành tế bào nấm men có một số tính chất quan trọng nên nó thích hợp nh− chất phụ gia trong thực phẩm. Glucan tự nhiên, rất sạch có dung tích giữ n−ớc cao và không tạo gel, chúng gồm các đơn vị glucoza liên kết với nhau qua các cầu nối β - 1,3 và β - 1,6, không bị phân hủy bởi enzim tiêu hóa ở ng−ời, vì vậy chúng thích hợp nh− nguồn xơ thực phẩm. Khi glucan đi qua ruột già, nó bị phân hủy một phần bởi hệ vi khuẩn ruột kết mà không làm mất tính giữ n−ớc của chúng. Quá trình lên men này tạo ra các chuỗi axit béo ngắn (chủ yếu acetat, propionat và butyrat) có lợi cho tế bào nhầy lót ruột kết và ruột nói chung. Dung tích giữ n−ớc của glucan từ thành tế bào nấm men lớn hơn rất nhiều so với những chất xơ hiện có nh− polysacarit đậu t−ơng, các loại sợi thực vật và hạt khác. Ngoài ra, có thể sử dụng ph−ơng pháp hóa học hoặc enzim học để thay đổi cấu trúc glucan đồng thời thay đổi luôn khả năng hấp thụ n−ớc của nó. Với ph−ơng pháp tách chiết và làm sạch đặc biệt, β-glucan tổng từ thành tế bào nấm men đ−ợc sử dụng nh− nguồn sợi trong thực phẩm cho ng−ời và động vật. Glucan đ−ợc sử dụng làm phụ gia cho thực phẩm để tăng sự tiêu hóa và chữa rối loạn tiêu hóa. Hỗn hợp có rất nhiều tác dụng: - Cung cấp nguồn xơ thực phẩm. - Cung cấp chất đóng cục phân. - Cung cấp nguồn axit béo chuỗi ngắn qua lên men vi khuẩn trong ruột già, cải thiện sự tiêu hóa, giúp ích cho các tế bào màng trong ruột kết và ruột nói chung. Để khẳng định hiệu quả của glucan nh− một phụ gia có lợi trong thực phẩm, các nhà khoa học đã sử dụng chuột đồng vị lipoprotein profile máu của chúng giống của ng−ời. Chuột đ−ợc nuôi bằng thức ăn có hàm l−ợng cholesterol cao (0,2% cholesterol và 10% dầu dừa), sau 7 tuần l−ợng cholesterol trong máu của chúng dao động từ 267-279mg/dl. Sáu tuần tiếp theo, chuột thí nghiệm đ−ợc nuôi với thức ăn có bổ sung 5% cám yến mạch, cám lúa mỳ hoặc glucan từ thành tế bào nấm men. Kết quả nhận đ−ợc cho thấy glucan giảm l−ợng cholesterol tổng (42%), LDL cholesterol (69%) và tăng đáng kể l−ợng HDL cholesterol (16%). Glucan cũng có hiệu quả giảm l−ợng cholesterol trong huyết thanh. Khi chuột đ−ợc nuôi ở chế độ dinh d−ỡng giàu cholesterol đồng thời với 5% glucan hoặc cám yến mạch, sau 4 tuần glucan giảm l−ợng cholesterol tổng xuống 13% so với 6% của cám yến mạch. LDL đã giảm 15% trong nhóm ăn thêm glucan và 4% trong nhóm ăn thêm cám. 49 Những kết quả trên cho thấy β-glucan là nguồn phụ gia có giá trị trong công nghiệp thực phẩm. 2.3.3.2. ứng dụng β-glucan trong y d−ợc, mỹ phẩm Nh− chúng ta đã biết, glucan đ−ợc miêu tả nh− polyme của glucoza và nhận đ−ợc từ nấm men, vi khuẩn, nấm và thực vật. β-glucan có vai trò nh− một chất có hoạt tính sinh học nhằm điều chỉnh miễn dịch và đã đ−ợc công bố trên các tài liệu hơn 40 năm qua. Những năm 40, tiến sỹ Pillemer Louis công nhận hiệu ứng kháng khối u của thành tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae, đ−ợc gọi là Zymosan và đ−ợc bán rất lâu ở Mỹ nh− thuốc chống khối u của hãng Sigma Chemicals. Zymosan là chất thô vì nó liên kết với protein, lipit và các hợp chất khác có trong thành tế bào[19]. Đến đầu những năm 60, nhóm nghiên cứu của tr−ờng Đại Học Tulane, khoa Y học đã tách chiết đ−ợc β-1,3 D-glucan từ nấm men bánh mỳ. Nhiều nghiên cứu đã cho thấy β -glucan khi ở dạng hạt nhỏ hay ở dạng hòa tan đều có khả năng điều chỉnh miễn dịch giúp cho vật chủ tăng c−ờng hoạt tính kháng khuẩn. Từ những nghiên cứu cơ sở tác dụng của β-glucan lên hệ thống miễn dịch của chuột, các nhà khoa học đã tiến hành nghiên cứu trên rất nhiều loài động vật khác nhau nh− tôm, cá, gà, thỏ. … β-glucan đều có hoạt tính gây kích thích miễn dịch. Bốn cơ chế miễn dịch chính của β- glucan là: - Tạo ra các bạch cầu (hematopoiesis) để phá hủy nguồn bệnh. - Huy động tế bào (khả năng của các bạch cầu chuyển đến chỗ bị th−ơng). - Năng lực thực bào hay khả năng nhấn chìm tế bào lạ. - Tạo ra các chất trung gian hoạt hóa oxy và các nhân tố khác giết chết vật thể lạ. Cơ chế để β-glucan thể hiện hiệu quả và có lợi là kết hợp với thụ quan glucan đặc hiệu nằm trên tế bào đại thực bào, nh− vậy nó sẽ hoạt hóa tế bào này. Một khi đại thực bào đã đ−ợc hoạt hóa, chúng sinh ra một loại protein tế bào gọi là cytokine có nhiệm vụ chuyển thông tin cần thiết đến các tế bào miễn dịch khác và cuối cùng hoạt hóa hoặc hiệu chỉnh chức năng của hệ thống miễn dịch[46]. β-1,3 glucan còn có khả năng cảm ứng hoạt tính của tế bào Langerhans khi bôi lên da. Tế bào Langerhans là một loại tế bào đại thực bào chuyên hóa nằm trên da 50 hoạt động t−ơng tự nh− đại thực bào. β-1,3 glucan làm se lỗ chân lông, giảm số l−ợng, độ sâu, độ dài của nếp nhăn, cảm ứng tổng hợp collagen và elastin, giảm màu đỏ, giảm sự kích thích và sự khô của da, giảm số l−ợng và kích cỡ th−ơng tổn trên da. β-1,3 glucan có thể thêm vào kem bôi da, mỹ phẩm, thuốc mỡ, n−ớc thơm, kem cạo râu và nói chung là tất cả các sản phẩm tiếp xúc trực tiếp với da [96]. Trên cơ sở những kết quả này, ng−ời ta đã kết luận rằng β- glucan đại diện cho một loạt kích thích miễn dịch mà loại kích thích này hoạt động thông qua sự phát triển từng b−ớc một giống nh− sự tiến triển có tính bảo tồn của hệ thống đáp ứng miễn dịch bẩm sinh chống lại tác nhân gây bệnh. Tuy nhiên, các nghiên cứu cũng cho rằng, tác dụng của β -glucan còn tùy thuộc vào nguồn gốc, cách tách chiết, nồng độ và cách thức đ−a vào (bao gồm vào màng bụng, tĩnh mạch, vào d−ới da, vào theo đ−ờng miệng) sẽ cho kết quả khác nhau ngay cả trên cùng một đối t−ợng thí nghiệm [96,46]. β-glucan uống có hiệu ứng cao chống nhiễm bệnh than đ−ợc Vetvicka V. và cs. chứng minh trên đối t−ợng chuột. Những kết quả b−ớc đầu cho thấy β-1,3 glucan tăng đáng kể l−ợng động vật sống sót và kéo dài thời gian sống của những động vật bị nhiễm bệnh ở liều gây chết. Những nghiên cứu về liều l−ợng sử dụng beta-glucan chứng minh rằng liều phòng ngừa hàng ngày từ 2-20mg/kg đảm bảo hiệu quả tốt nhất chống bệnh than đối với chuột. Bên cạnh đó, β-glucan còn có hiệu quả kháng khối u, làm giảm kích cỡ khối u và sự phân bố mạch. Những kết quả này cho thấy β- 1,3 glucan hoạt động bằng cách kích thích các cơ chế bảo vệ của hệ miễn dịch của cơ thể chủ, tr−ớc tiên là đại thực bào, bạch cầu trung tính và các tế bào tự nhiên. β- 1,3 glucan cũng làm giảm nguy cơ ung th−, làm chậm quá trình phát triển của di căn trong mô hình ung th− ruột kết. Tất cả những nghiên cứu đã đ−ợc công bố chứng minh rằng liệu pháp miễn dịch β-1,3 glucan là hoạt hóa các tế bào miễn dịch bẩm sinh, kích thích hoạt tính diệt khối u, sản sinh ra cytokines và phát sinh những đáp ứng trung gian tế bào. Việc sử dụng β-1,3 glucan cũng là mối quan tâm đặc biệt đối với bệnh nhân ung th− phải điều trị bằng hóa chất hoặc chiếu xạ vì β-1,3 glucan có khả năng tăng nhanh sự phục hồi máu khi bị chiếu xạ ở liều gây chết và d−ới mức gây chết. β-1,3 glucan cũng có thể kích thích sự phục hồi của tủy x−ơng sau hóa trị liệu và ngăn cản biến chứng nhiễm bệnh trong quá trình điều trị [46,119,62]. 51 2.3.3.3. ứng dụng β - glucan trong nuôi trồng thủy sản β -glucan đ−ợc biết nh− một chất tăng c−ờng hệ thống miễn dịch và có hiệu lực tăng c−ờng hệ thống miễn dịch của vật chủ (Yadomae T. và Ohno N.,1996) [63]. Tôm sú là mặt hàng xuất khẩu chủ lực của nhiều n−ớc châu á trong đó có Việt Nam. Nh−ng các loại bệnh virut và vi khuẩn ảnh h−ởng nghiêm trọng đến sản l−ợng tôm và dẫn đến ảnh h−ởng nền kinh tế của đất n−ớc. Đã có một số nghiên cứu sử dụng β- glucan nh− một chất kích thích hệ thống miễn dịch tiềm năng trong nuôi trồng thuỷ sản [45]. Hệ prophenoloxidaza (proPO) đ−ợc đánh giá giữ vai trò quan trọng trong hệ thống bảo vệ của các loài giáp xác (Smith V.J., Soderhall K., 1983), vì vậy hoạt tính PO trong hemocyte của P.monodon đ−ợc sử dụng nh− một chỉ thị để xác định đặc tính kích thích miễn dịch của β-glucan. Kết quả thí nghiệm in vitro của Suphantharika và cs.(2003) cho thấy β-glucan tăng hoạt tính PO trong tất cả hemocyte đ−ợc xử lý. β- glucan từ nấm men bánh mì (YGT) có thành phần β-glucan cao hơn 40% so với β- glucan từ bã men bia (BYG) và YGT tăng hoạt tính PO cao hơn BYG gấp 2 lần. Nh− vậy hoạt tính PO không những phụ thuộc vào l−ợng β-glucan mà có lẽ còn phụ thuộc vào các tính chất lý học khác nh− trọng l−ợng phân tử và cấu trúc hoá học của β- glucan [ Adachi Y., et al., 1999; Sandula J., et al., 1999]. Thí nghiệm invivo khi cho tôm ăn thêm 0,2% β-glucan cũng nhận đ−ợc những kết quả khả quan nh− trong thí nghiệm in vitro[45]. Nh−ng trong thí nghiệm này, YGT cho đáp ứng thấp hơn so với BYG. Điều này có thể giải thích do sự khác biệt thời gian xử lý: ở thí nghiệm in vitro, hemocyte tiếp xúc trực tiếp với β-glucan trong 30 phút, còn trong thí nghiệm in vivo β-glucan đ−ợc cho ăn trong 3 ngày. Nh−ng β- glucan và các sản phẩm phân huỷ của nó làm thế nào đ−ợc hấp thu vào hệ tiêu hoá và nó kích thích hemocyte thế nào để hoạt hoá hoạt tính PO vẫn còn ch−a rõ [Itami t. et al., 1998]. Loại glucan nấm men đặc biệt rất có hiệu quả nh− một d−ợc phẩm phòng bệnh cho động vật d−ới n−ớc lớp Osteichthyes và Crustacea. Osteichthyes là lớp cá giữ vai trò quan trọng trong nền th−ơng nghiệp nh− cá trích, cá thu, cá ngừ, cá trống, cá chỉ vàng, cá tuyết, cá basa. D−ợc phẩm phòng bệnh này đặc biệt có hiệu quả để bảo vệ thành viên họ Salmonidae và các loại cá cảnh, cá trong bể nuôi. Crustacea là d−ới 52 giới quan trọng của loài giáp xác bao gồm tôm, cua. Chế phẩm này cũng đặc biệt có giá trị đối với họ Penaeidae. Loại glucan đặc biệt này đ−ợc tách từ thành tế bào nấm men, có chuỗi glucopyranoza từ 400-1500 đơn vị và chủ yếu là liên kết β-1,3 glycosydic với ít nhất một đơn vị glucopyranoza gắn vào chuỗi bên bằng liên kết β- 1,6 glycosydic. Mỗi chuỗi bên có từ 1-10 đơn vị glucopyranoza và loại chế phẩm này đ−ợc gọi là M- glucan. Kết quả thí nghiệm của Rostad Gunnar và cs. (1995) cho thấy khi bổ sung glucan vào thức ăn hàng ngày của Salmo salar với hàm l−ợng 1g/kg thức ăn trong 12 tuần tr−ớc khi cho nhiễm nguồn bệnh, l−ợng cá sống sót tăng lên rất nhiều. Cụ thể đối với Vibrio salmonicida subsp. salmonicida gây bệnh furuncolusis, lô thí nghiệm cá đ−ợc ăn thức ăn bổ sung M-glucan sẽ chết ít hơn 33% so với đối chứng. Kết quả t−ơng tự đối với Vibrio anguillarum serotype 1, cá non trong lô thí nghiệm chết 15%, trong khi ở lô đối chứng, cá chết đến 85%. Với thí nghiệm tiêm 0,2 ml dung dịch chứa 2mg M-glucan trực tiếp d−ới bụng cá, sau 3 tuần tiêm một l−ợng vi khuẩn gây bệnh cho cá, M-glucan cũng làm giảm đáng kể tỉ lệ cá bị chết. M-glucan còn là một tá d−ợc với vaccine tăng sức đề kháng của cá lớp Osteichthyes, đặc biệt là cá hồi Atlantic (Salmo salar). Kết quả thí nghiệm cho thấy khi Salmo salar non (30g/con) đ−ợc tiêm d−ới bụng một l−ợng dung dịch vaccine và 0,5mg M-glucan, hoặc chỉ có M-glucan hoặc vaccine, tỉ lệ cá chết sẽ t−ơng ứng 20 %, 28%, 38%. Riêng ở lô đối chứng khi cá chỉ đ−ợc tiêm dung dịch muối sinh lý, sau khi bị xử lý với nguồn bệnh, tỉ lệ cá chết cuối cùng là 42%. Nh− vậy, sự kết hợp giữa M-glucan và vaccine furunculosis là ph−ơng pháp hiệu quả nhất để tăng sức đề kháng của Salmo salar đối với furunculosis. Kết quả t−ơng tự cũng nhận đ−ợc đối với bệnh vibriosis do các loại vi khuẩn chi Vibrio khác nhau gây nên [95]. Hiệu quả của M-glucan nh− một d−ợc phẩm phòng bệnh để tăng sức đề kháng của tôm sú lớn (Penaeus monodon ) cũng đã đ−ợc một số tác giả nghiên cứu. Tôm non đ−ợc bổ sung 5g glucan/kg thức ăn hàng ngày, sau 5 tuần chúng bị nhiễm bởi nguồn bệnh virut và hỗn hợp Vibrio harenggii và Vibrio parahemolytiens. Bảy tuần sau khi bị nhiễm, l−ợng tôm bị chết trong lô đối chứng là 80%, trong khi ở lô thí nghiệm tôm đ−ợc nuôi với thức ăn có bổ sung M-glucan l−ợng tôm chết giảm xuống 50% [45]. 53 2.4 Công nghệ sản xuất maltooligosacarit giàu maltotrioza, xylitol, β-glucan trên thế giới Maltooligosacharit giàu maltotrioza đ−ợc sản xuất chủ yếu bằng ph−ơng pháp enzim thông qua phản ứng thủy phân tinh bột. Trong quá trình thủy phân tinh bột nhờ enzim tiến hành qua hàng loạt các sản phẩm trung gian có phân tử l−ợng khác nhau gọi là dextrin. Lúc đầu thu đ−ợc các dextrin phân tử l−ợng lớn khác biệt với tinh bột về cấu trúc cũng nh− tính chất tác dụng với iốt đó là giai đoạn dịch hoá tinh bột. Sau đó các dextrin thu đ−ợc có phân tử l−ợng càng nhỏ và tính chất tác dụng với iốt cũng thay đổi. Maltooligosacarit đ−ợc sản xuất từ tinh bột với sự xúc tác của 2 loại enzim α - amylaza và pullulanaza kết hợp với nhau, chia ra làm 2 giai đoạn: giai đoạn đầu là dịch hoá và giai đoạn sau là đ−ờng hoá Từ cơ chất ban đầu là tinh bột đến sản phẩm cuối cùng là các oligosacarit, phản ứng thủy phân qua hàng loạt các sản phẩm trung gian theo sơ đồ sau[114]: Tinh bột Amylodextrin + iot Màu xanh tím Erithirodextrin + iot Màu tím Acrodextrin + iot Màu tím nhạt Maltodextrin + iot Màu nâu tím Maltooligosacarit + iot không màu Hình 10: Sơ đồ biểu diễn các sản phẩm trung gian của quá trình thủy phân tinh bột 54 Để sản xuất xylitol ng−ời ta có thể tiến hành theo hai ph−ơng pháp hóa học hoặc lên men . Ph−ơng pháp hóa học để sản xuất xylitol dựa trên quá trình hydro hóa D-xyloza hoặc dịch thủy phân hemicelluloza giàu xyloza. Ng−ời ta cho dịch thủy phân hemicelluloza tác dụng với hydro sử dụng chất xúc tác Raney nickel ở 135°C trong điều kiện áp xuất 40 atmosphe trong vòng 2,5 giờ. ở điều kiện này xyloza và các carbohydrat khác bị hydro hóa thành các polyol t−ơng ứng của chúng. Theo ph−ơng pháp này, khoảng 60% l−ợng xylan ban đầu đ−ợc chuyển thành xylitol. Sau khi phản ứng, dịch hydro hóa đ−ợc kết tinh để thu hồi xylitol. Phần xylitol không kết tinh trong dung dịch sau đó đ−ợc cho vào cột sắc ký chứa các nhựa trao đổi cation nh− sulfonated polystyrene divinylbenzene ở dạng canxi hoặc stronti. Dịch thu hồi từ sắc ký cột có chứa nhiều các polyol khác nhau nh− mannitol, arabitol, galactitol, sorbitol và xylitol. Các phân đoạn có chứa nhiều xylitol đ−ợc cô đặc và kết tinh một lần nữa để thu hồi xylitol. Quá trình kết tinh đ−ợc tiến hành ở điều kiện -15°C trong vòng một tuần có bổ sung các các hạt xylitol đ−ợc nghiền nhỏ làm mầm cho quá trình kết tinh. Sau khi kết tinh, các tinh thể xylitol đ−ợc thu hồi bằng ph−ơng pháp ly tâm hoặc lọc. Phần dịch sau kết tinh vẫn còn chứa một l−ợng xylitol nhất định không đ−ợc kết tinh, ng−ời ta cho quay vòng dịch này nhiều lần ở các lần kết tinh và cô đặc tiếp theo nhằm thu hồi tối đa l−ợng xylitol có trong dung dịch [10, 37]. Hình 11. Quá trình thủy phân và hydro hóa xylan thành xylitol. (a) xylan (C5H8O4)n, n~200; (b) D-xyloza - C5H10O5, (c) xylitol - C5H12O5. Ngoài ph−ơng pháp sản xuất xylitol trực tiếp từ xyloza, Heikkila đề xuất ph−ơng một ph−ơng pháp sản xuất xylitol từ axit xylonic[40]. Theo ph−ơng pháp này, các axit xylonic đ−ợc hydroxy hóa trong vòng 3 giờ ở điều kiện 110°C và 13,000 kPa sử 55 dụng ruteni làm chất xúc tác. Thành phần nguyên liệu ban đầu và sản phẩm đ−ợc trình bày trong bảng sau. Bảng 2.14. Thành phần phản ứng và sản phẩm của ph−ơng pháp sản xuất xylitol từ axit xylonic [40]. Các chất Hàm l−ợng tr−ớc phản ứng (% trọng l−ợng khô) Hàm l−ợng trong sản phẩm (% trọng l−ợng khô) Axit xylonic 94,2 8,3 Xylitol 0 75,9 Arabitol 0 6,6 Xyloza 1,1 0 Dung dịch xylitol đ−ợc lọc, cô đặc đến nồng độ 92,2% xylitol sau đó đ−ợc bổ sung 0,05g tinh thể xylitol nghiền nhỏ trên một lít và kết cho kết tinh. Sau khi kết tinh, các tinh thể xylitol đ−ợc tách ra khỏi dung dịch bằng cách ly tâm 4500 vòng/phút trong 5 phút. Hiệu suất hình thành các tinh thể xylitol là 0,297g/g với độ sạch lên tới 68% [40]. Ngoài hai ph−ơng pháp sản xuất xylitol từ xyloza và axit xylonic, xylitol còn đ−ợc sản xuất từ D-xyluloza. Theo ph−ơng pháp này dung dịch syro D-xyluloza (bao gồm 95% xyluloza, 1% arabitol, 3% xylitol và 1% các chất khác)đ−ợc đồng phân hóa ở 65°C, pH 7,7. Dịch đồng phân thu đ−ợc có thành phần đ−ợc trình bày trong bảng2.15 Bảng 2.15. Thành phần phản ứng và sản phẩm của phản ứng đồng phân hóa D-xyluloza. Các chất Thành phần dịch siro xyluloza (% trọng l−ợng khô) Sản phẩm đồng phân hóa (% trọng l−ợng khô) D-arabitol 1 1 D-xyluloza 95 25 D-xyloza 0 70 Xylitol 3 3 Các chất khác 1 1 Vuorinen đề xuất một ph−ơng pháp khác để sản xuất xylitol từ D-glucoza, D- fructose và D-galactoza [112]. D-glucoza (1050 g) đ−ợc phân cắt oxi hóa trong nồi 56 hấp ở dạng dung dịch có chứa NaOH (18g), n−ớc (264 g), methanol (100 g) và natri arabinonate (16 g). Nồi phản ứng đ−ợc điều áp bằng oxy (ở 85°C) để hình thành các tinh thể natri arabinonate. Các tinh thể natri arabinonate đ−ợc thu hồi bằng ly tâm, hòa tan trong n−ớc và axit hóa thành axit arabinonic. Axit arabinonic đ−ợc cô chân không và kết tinh tạo thành các tinh thể D-arabino-1,4-lactone. Các tinh thể D- arabino-1,4-lactone đ−ợc chuyển thành arabitol trong điều kiện có mặt chất xúc tác ruteni với hiệu suất 90%, sau đó arabitol đ−ợc kết tinh. Sau đó ở lần phản ứng thứ hai, các tinh thể arabitol đ−ợc chuyển thành xylitol với hiệu suất 90% trong điều kiện có mặt chất xúc tác ruteni. Ph−ơng pháp này có giá thành đắt và không có hiệu quả khi áp dụng sản xuất ở quy mô lớn. Đối với ph−ơng pháp ứng dụng công nghệ sinh học, xylitol đ−ợc tạo thành bởi các vi sinh vật sử dụng xyloza làm nguồn cácbon. Các vi sinh vật này biến đổi xyloza thành xylitol nhờ enzim phụ thuộc NADPH có tên là xyloza reductase. Con đ−ờng và các enzim tham gia vào quá trình sử dụng xyloza bởi vi sinh vật đ−ợc trình bày trong hình sau. Hình 12. Con đ−ờng sử dụng xyloza của vi sinh vật Ngoài ra xylitol còn đ−ợc tạo thành từ D-xyluloza nhờ Mycobacterium smagematis. Dung dịch chứa 2% D-xyluloza đ−ợc lên men trong điều kiện hiếu khí và kị khí kết quả thu đ−ợc các dung dịch chứa 0,8% và 1,4% xylitol. Hiệu suất chuyển hóa xyloza thành xylitol nhờ Mycobacterium smagematis trong điều kiện kị khí lên tới 74% [10]. 57 Vi sinh vật trong sản xuất xylitol Về mặt lý thuyết, xylitol có thể đ−ợc sản xuất sử dụng bất kể chủng vi sinh vật nào có khả năng sử dung xyloza và tạo sản phẩm trung gian là xylitol. Tuy nhiên hầu hết các vi sinh vật hứa hẹn khả năng ứng dụng trong sản xuất xylitol đ−ợc biết cho đến nay vẫn là nấm men [2]. Rất nhiều các chủng nấm men tạo ra các enzim reductaza, các enzim này xúc tác cho phản ứng khử các đ−ờng thành các r−ợu đ−ờng t−ơng ứng [83]. Con đ−ờng sử dụng xyloza của vi sinh vật đ−ợc trình bày trong hình 6, xylitol đ−ợc tổng hợp trong b−ớc đầu tiên khi xyloza bị khử d−ới tác dụng của enzim xyloza reductaza. Xylitol sau đó đ−ợc chuyển hóa qua một loạt các b−ớc. Tr−ớc hết xylitol bị oxi hóa thành xyluloza d−ới tác dụng của enzim xylitol dehyerogenaza, xyluloza sau đó đ−ợc phospho hóa thành xyluloza-5-phosphate d−ới tác dụng của enzim xyluloza kinase (hay còn đ−ợc gọi là xylulokinaza). Sau đó xyluloza-5-phosphate đ−ợc chuyển hóa thành pyruvate và ethanol quá một số b−ớc trung gian khác. Các phản ứng trong chu trình này diễn ra không hoàn toàn chặt chẽ với nhau do đó một l−ợng xylitol nhất định luôn đ−ợc tạo ra trong môi tr−ờng [61]. Rất nhiều các chủng nấm men có khả năng sử dụng xyloza và tạo thành xylitol trong quá trình trao đổi chất [, 72, 86, 92, 110]. Các chủng này th−ờng thuộc về các chi Candida, Hansentla, Kluyveromyces, Pichia và Pachysolen. Đặc biệt là các loài thuộc về chi Candida nh− Candida tropicalis, Candida guillermondii và Candida parapsilosis đã đ−ợc công bố trong nhiều tài liệu về khả năng tạo thành xylitol với nồng độ t−ơng đối cao trong môi tr−ờng [77, 94]. Việc sử dụng các vi sinh vật ở dạng tự nhiên trong sản xuất xylitol cũng gặp phải các khó khăn trở ngại nhất định. Trở ngại chính là các chủng này th−ờng tạo thành xylitol với nồng độ thấp, ngoài ra chúng còn có thể là các vi sinh vật có khả năng gây bệnh. Do đó, nhiều tài liệu đã đề cập đến các ph−ơng pháp cải biến các chủng vi sinh vật có trong tự nhiên sử dụng các ph−ơng pháp nh− đột biến và kỹ thuật di truyền để tạo ra các chủng mới có khả năng tạo ra xylitol với hiệu suất cao [ 53, 59, 101]. Trong US. Patent số 6,217,007 tác giả Apajalahti đã mô tả các ph−ơng pháp gây đột biến để tạo ra các chủng nấm men bị khiếm khuyết một số enzim nhất định trong quá trình trao đổi xyloza. Kết quả là các chủng thu đ−ợc tạo ra l−ợng xylitol thừa trong môi tr−ờng cao hơn rõ rệt so với các chủng ban đầu . 58 Hình 13. Con đ−ờng sử dụng xyloza và mối quan hệ với các con đ−ờng khác trong quá trình trao đổi chất của tế bào vi sinh vật Các điều kiện ảnh h−ởng đến quá trình lên men xylitol nhờ vi sinh vật - ảnh h−ởng của nồng độ xyloza Nồng độ xyloza trong dịch lên men ban đầu có thể ảnh h−ởng đến hàm l−ợng xylitol đ−ợc tạo thành và hiệu suất chuyển hóa xyloza thành xylitol của vi sinh vật [72]. Tùy thuộc vào chủng giống và điều kiện nuôi cấy mà hàm l−ợng xyloza tối −u là khác nhau. Việc tìm ra nồng độ xyloza tối −u trong lên men là một trong những khâu quan trọng ảnh h−ởng đến hiệu suất chuyển hóa. Horitsu và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu ảnh h−ởng của nồng độ D-xyloza lên quá trình tạo thành xylitol của vi sinh vật ở các nồng độ khác nhau từ 100 g/lít đến 300 g/lít. Kết quả đã tìm ra đ−ợc nồng độ D-xyloza tối −u đối với Candida tropicalis là 172 g /lít. Nồng độ này đối với C. guilliermondii FTI20037 là 15-60 g/lít [83]. - ảnh h−ởng của các loại đ−ờng khác Ngoài xyloza, nồng độ các loại đ−ờng khác cũng có ảnh h−ởng đến hiệu suất và nồng độ xylitol đ−ợc tạo thành trong canh tr−ờng. Yahashi và cộng sự đã tiến hành Đ−ờng phân # Chu trình Kreb # Chuỗi hô hấp 59 bổ sung D-glucoza vào môi tr−ờng lên men xylitol đối với chủng C. tropicalis. D- glulose đ−ợc sử dụng nhanh hơn so với D-xyloza trong pha sinh tr−ởng của tế bào. Kết quả là việc thêm glucoza vào môi tr−ờng lên men đã làm cho hiệu suất chuyển hóa xylitol của chủng này tăng lên 1,2 đến 1,3 lần so với không bổ sung glucoza. Sau 32 giờ lên men ng−ời ta đã thu đ−ợc 104,5 g/lít xylitol với hiệu suất chuyển hóa là 0,82 g/g [115]. Tuy nhiên, đối với các chủng giống khác nhau thì hiệu ứng ảnh h−ởng của glucoza cũng khác nhau. Đối với chủng Candida guilliermondii FTI 20037 khi thêm glucoza vào môi tr−ờng lên nem đã làm giảm hiệu suất tạo thành xylitol từ 0,66g/g xuống còn 0,45g/g [93]. Nh− vậy việc nghiên cứu ảnh h−ởng của các loại đ−ờng khác đối với từng chủng vi sinh vật đ−ợc sử dụng là cần thiết để có thể đặt đ−ợc hiệu suất chuyển hóa tối −u. - ảnh h−ởng của điều kiện nuôi cấy Các điều kiện nuôi cấy và lên men nh− độ tuổi của giống, tỉ lệ tiếp giống, thành phần của môi tr−ờng, thời gian, nhiệt độ lên men, mức độ sục khí cũng nh− pH môi tr−ờng có ảnh h−ởng đáng kể đến hiệu suất tạo thành xylitol [82, 110]. Felipe và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu ảnh h−ởng của các điều kiện nuôi cấy đối với chủng C. guilliermondii FTI20037 [35]. Nồng độ xyloza trong dịch lên men thay đổi từ 37,6 đến 74,2 g/lít, tỉ lệ tiếp giống từ 0,1 đến 6,0 g/lít và độ tuổi của giống thay đổi từ 16 đến 48 giờ. Với nồng độ xyloza ban đầu là 54,5 g/lít và tỉ lệ tiếp giống là 3,0g/lít hiệu suất xylitol tối đa thu đ−ợc là 0,74g/g với năng suất 0,75 g/lít/giờ. Nồng độ oxy trong môi tr−ờng cũng có ảnh h−ởng đáng kể lên quá trình lên men D-xyloza bởi nấm men [72]. Vandeska và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu quá trình tạo thành xylitol ở các điều kiện sục khí khác nhau sử dụng chủng C. boidinii [111]. Môi tr−ờng lên men gồm yeast nitrogen base 1,7 g/lít, urea 5g/lít, axit casamino 5g/lít, D-xyloza 130 g/lít, mức độ thông khí oxy đ−ợc thay đổi từ 10 đến 30 mM/lít/giờ. Kết quả hiệu suất xylitol cao nhất 0,48 g/g đã đạt đ−ợc với nồng độ oxy là 14 mM/lit/giờ. ở nồng độ oxy 10 mM/lit/giờ hiệu suất chuyển hóa xylitol là 0,38 g/g và ở nồng độ oxy 30 mM/lit/giờ hiệu suất chuyển hóa giảm xuống chỉ còn 0,23 g/g. Nh− vậy việc tăng hay giảm nồng độ oxy trong dịch lên men khỏi giá trị 14 mM/lit/giờ đều làm giảm l−ợng xylitol đ−ợc tạo thành một cách đáng kể. 60 - ảnh h−ởng của các chất ức chế Qúa trình lên men sản xuất xylitol th−ờng lấy nguyên liệu từ dịch thủy phân hemicelluloza. Nh− đã trình bày ở phần tr−ớc, quá trình thủy phân các nguyên liệu lignocelluloza th−ờng tạo ra các sản phẩm phụ nh− axit acetic, furfural, 5 hydroxymethylfurfural và các sản phẩm phụ khác đ−ợc tạo ra do quá trình phân giải của lignin. Các sản phẩm phụ này có tính độc với nhiều loại vi sinh vật và có ảnh h−ởng không tốt đến quá trình lên men cũng nh− hiệu suất chuyển hóa xyloza thành xylitol của vi sinh vật. Để giảm thiểu tác dụng độc của các hợp chất này ng−ời ta đã tiến hành nhiều ph−ơng pháp khử độc khác nhau bao gồm axit hóa, trung hòa, cho bay hơi, xử lý trao đổi ion và hấp phụ bằng than hoạt tính