Đề tài Khảo sát môi trường nhân giống cấp một, cấp hai thích hợp cho hệ sợi nấm tăng trưởng tốt

1 Phần 1. MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Những năm gần đây, ngoài giá trị dinh dưỡng đã được biết đến từ rất lâu, nấm còn được đề cập đến như một nguồn dược liệu quý giá có khả năng chữa trị được nhiều bệnh như nấm linh chi (Ganoderma lucidium), nấm hầu thủ (Hericium enrinaceum)… Khoa học phát triển, dược tính của nấm ngày càng được phát hiện nhiều. Nó có khả năng chữa trị các bệnh về tim mạch, ung thư, nâng cao sức đề kháng của cơ thể… Trong điều kiện khí hậu ở Việt Nam rất thích hợp cho việc nuôi trồng các loại nấm, vừa tận dụng những thuận lợi có sẵn vừa tạo ra nguồn nguyên liệu phục vụ cho nhu cầu chữa bệnh trong nước. Do đó việc tìm ra phương pháp cũng như môi trường nuôi trồng thích hợp đối với từng loại nấm để đạt được hoạt tính nhiều nhất là điều cần thiết. Người ta biết đến hiệu quả chữa bệnh của nấm vân chi thông qua hai hợp chất chính trích từ nấm này là PSP (polysaccharide peptide) và PSK (polysaccharide Kureha). Các chất này được coi là có khả năng chữa trị ung thư, tăng miễn dịch cơ thể, chống các phản ứng phụ của xạ trị và hoá trị, ức chế sự nhân lên của HIV… Nhưng hiện nay, ở Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu về vân chi và ngành trồng nấm vân chi lại chưa phát triển. Trong khi đó ở Nhật và các nước khác đã có rất nhiều sản phẩm thương mại từ vân chi. Các biệt dược bào chế từ nấm vân chi Trametes versicolor đứng đầu trong 10 loại thuốc chống ung thư được tiêu thụ mạnh nhất tại thị trường Nhật Bản, với doanh số năm 1991 đạt tới 358 triệu USD, vượt xa cả Tamoxifen, interferon, cis-Blastin. Những sản phẩm thương mại từ PSP và PSK chiếm 25% thị phần ở thị trường Nhật (1991). Với mong muốn phát triển hơn nữa khả năng nuôi trồng và ứng dụng nấm vân chi trong ngành dược phẩm, chúng tôi thực hiện đề tài: Khảo sát sinh trưởng một chủng nấm vân chi đen Trametes versicolor có nguồn gốc từ Trung Quốc. 2 1.2. Mục đích đề tài 9 Khảo sát môi trường nhân giống cấp một, cấp hai thích hợp cho hệ sợi nấm tăng trưởng tốt. 9 Khảo sát sự tăng sinh khối nấm trong môi trường lỏng trên các môi trường với thành phần dinh dưỡng khác nhau, thu lấy sinh khối và ly trích, định lượng hợp chất chính trong sợi nấm. 9 Khảo sát môi trường nuôi trồng quả thể và quan sát khả năng ra quả thể của nấm vân chi trong điều kiện TpHCM. 1.3. Yêu cầu 9 Tìm ra môi trường nhân giống cấp một, nhân giống cấp hai thích hợp nhất đối với sự phát triển của hệ sợi nấm vân chi. 9 Tìm ra môi trường có sinh khối phát triển mạnh nhất, kinh tế nhất và có hàm lượng dược chất nhiều nhất. 9 Xác định điều kiện, môi trường nuôi trồng quả thể thích hợp. 1.4. Hạn chế đề tài 9 Do giới hạn về trang thiết bị, hoá chất nên không xác định được hết các thành phần dược chất có trong nấm cũng như không tinh khiết được hợp chất trích mà chỉ dừng lại ở mức định lượng hợp chất thô trích từ nấm. 9 Trong quá trình nuôi trồng, chỉ thu được một số quả thể, chưa đủ để đánh giá năng suất của nấm vân chi trên các nghiệm thức nuôi trồng ra quả thể. 3 Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Khái quát về nấm trồng 2.1.1. Giới thiệu sơ lược [2],[8],[17], [18], [30] Tất cả sinh vật sống đều thuộc một trong năm giới. Nấm thuộc một giới riêng gọi là giới nấm (theo hệ thống phân loại của R.H. Whitaker, 1969). Nấm bao gồm cả nấm mốc, nấm men và các loài nấm lớn có quả thể. Nấm không quang hợp được. Do đó nó bắt buộc phải sống trên những chất hữu cơ hoại mục hoặc sống nhờ các động thực vật khác. Nấm là sinh vật hoại sinh, phân huỷ các chất hữu cơ để lấy chất dinh dưỡng. Nấm dinh dưỡng bằng cách tiến hành sự hấp thụ thức ăn trên toàn bộ bề mặt của sợi nấm thông qua phương thức thẩm thấu. Trong trường hợp nấm dinh dưỡng bằng những chất hữu cơ cần thiết đã có sẵn gọi là dị dưỡng (heterotrophe); bằng những chất hữu cơ chết gọi là hoại sinh (saprophyte). Nấm sử dụng các mô sống để dinh dưỡng gọi là ký sinh (parasite). Trong tự nhiên, nấm đóng một vai trò quan trọng, là máy tái chế sơ cấp. Chúng tạo ra các enzyme để phân huỷ vật chất hữu cơ (thường là các cấu tử gỗ). Phần lớn nấm có khả năng sản sinh ra các enzyme phá huỷ nguyên liệu thực vật thuộc lớp nấm túi (Ascomycetes) và nấm đảm (Basidiomycetes). Nấm cư trú trên gỗ đã chết chủ yếu phân hủy một hoặc nhiều cấu tử gỗ, gây mục mạnh. Hiện nay khoá phân loại nấm hiện đại bao gồm các ngành và ngành phụ như sau: • Ngành nấm nhày (Myxomycota) • Ngành nấm thật (Eumycota) 9 Ngành phụ Nấm tiên mao (Mastigomycotina) 9 Ngành phụ Nấm tiếp hợp (Zygomycotina) 9 Ngành phụ Nấm túi (Ascomycotina) 9 Ngành phụ Nấm đảm (Basidiomycotina) 9 Ngành phụ Nấm bất toàn (Deuteromycotina) 4 2.1.2. Giá trị của nấm [27],[29],[30],[33] Nấm từ rất lâu đã được biết đến như là một nguồn thức ăn dinh dưỡng giàu đạm, chất xơ, vitamin và tất cả những chất cần thiết cho sự tăng trưởng, phát triển, và sự sống của một người khoẻ mạnh. Từ hàng ngàn năm qua, ở châu Á, cả nấm ăn được và nấm không ăn được đều được sử dụng vì mục đích dinh dưỡng, bồi bổ khí huyết hoặc làm thuốc. Người ta dùng tất cả các bộ phận của nấm. Ngoài giá trị dinh dưỡng, nấm còn có khả năng phòng và trị một số bệnh. Càng ngày người ta càng phát hiện ra nhiều dược chất có tính miễn dịch từ nấm. Quá trình tìm kiếm dược phẩm miễn dịch đã diễn ra ở châu Á (nhất là các nước Trung Quốc, Nhật Bản) từ rất lâu nhưng ở Phương Tây còn chưa chú trọng lắm. Dược phẩm miễn dịch có thể được xem như là chất có hiệu quả trong liệu pháp miễn dịch khi uống vào. Có hơn 50 loài nấm được xếp vào dạng nấm dược liệu có hoạt tính chữa bệnh in vitro hay trên các mẫu động vật thí nghiệm. Một số chất trích từ nấm được phát hiện có hoạt tính tăng cường hệ miễn dịch tiềm năng, hoạt tính miễn dịch chống lại tế bào ung thư hơn hẳn các hoá dược kháng ung thư. Tất cả đều không độc, hiệu quả và rất dễ dung nạp. Nổi bậc nhất có 6 nhóm chất sau: Lentinan, AHCC (trích từ nấm hương Lentinus edodes), Schizophyllan (Nấm chân chim Schizophyllum commune), Grifron-D (Nấm gà gỗ Grifola frondosa), PSP, PSK ( Nấm vân chi Trametes versicolor). Các dịch trích chủ yếu được chiết từ quả thể nấm và sinh khối từ hệ sợi (nuôi cấy lên men trong môi trường lỏng). Cả thành phần tế bào và các hợp chất biến dưỡng thứ cấp của nấm đều có tác dụng trên hệ miễn dịch của tế bào chủ và do đó có thể chữa được nhiều bệnh khác nhau. Hướng kết hợp các tác nhân có tiềm năng miễn dịch với các liệu pháp chống ung thư như giải phẫu, hoá trị, xạ trị đã đạt được bước tiến đáng kể ở Trung Quốc, Nhật Bản nơi mà nấm được xem như một nguồn kháng ung thư hàng thế kỷ qua. 2.2. Tổng quan về nấm vân chi Trametes versicolor (L.:Fr) Pilat 2.2.1. Giới thiệu về nấm vân chi: tên gọi và vị trí phân loại Vân chi có nhiều tên gọi rất khác nhau. Tên tiếng Anh là Turkey tail (đuôi gà tây). Ở Trung Quốc, người ta gọi là “Yunzhi” có nghĩa là loại nấm có hình dạng như 5 mây. Người Nhật thì gọi là “Karawatake” do người ta hay tìm thấy chúng ở những nơi gần bờ sông. [19] , [22] Vân chi có tên khoa học phổ biến hiện nay là Trametes versicolor sau một thời gian dài được nghiên cứu và đặt tên khác nhau. Trametes versicolor (L.:Fr) Pilat, tức là loài Coriolus versicolor (L.:fr) Quél, được chính Carl von Linnaeus tìm ra và đặt tên đầu tiên: Boletus versicolor L. (1753). Sau đó Christiaan Hendrik Persoon (1805) lại xác định với tên Boletus vulutinus Pers., và Elias Magnus Fries (1821) đưa vào chi Polyporus (với hai loài: P. versicolor Fr và P. Vulutinus Fr). Lucien Quélet (1886) lại đưa vào Coriolus. Sau 50 năm, Abert Pilát (1936) đề nghị và được đa số các nhà nấm học thống nhất xếp vào chi Trametes, họ polyporacea. Các hệ thống phân loại về sau cũng phù hợp với quan điểm trên, nên hầu hết những tác giả gần đây đều sử dụng danh pháp đã chỉnh lý: Trametes versicolor.[14] Vân chi là một loại nấm lớn thuộc phân lớp Basidiomycetes gồm khoảng 22 000 loài đã biết. Nấm vân chi gây hoại sinh cây bệnh, cư trú trên gỗ đã chết, thuộc loại nấm gây mục trắng mạnh có thể phá huỷ đồng thời tất cả các cấu tử gỗ (hemicellulose, cellulose, lignin), giúp phá vỡ các gốc cây già, cây chết vì thế chất dinh dưỡng của cây sẽ trở về đất để tái sử dụng. Nấm vân chi không độc đối với người nhưng cũng không ăn được vì nó là dạng nấm gỗ. [14], [18] Vị trí phân loại nấm vân chi [1],[3],[7],[12], [17] Giới nấm : Fungi Ngành nấm thật : Eumycota Ngành phụ nấm đảm : Basidiomycotina Lớp nấm đảm : Basidiomycetes Phân lớp nấm đảm đơn bào : Holobasidiomycetidae Nhóm bộ : Hymenomycetes Bộ nấm lỗ : Aphyllophorales Họ nấm nhiều lỗ : Polyporaceae Chi : Trametes Loài : Trametes versicolor 6 2.2.2. Đặc điểm hình thái cấu tạo của Trametes versicolor [3],[14],[19],[22], [31] Hình 2.1: Quả thể nấm vân chi Trametes versicolor Vân chi là loại nấm hàng năm, không cuống, phát triển một bên. Khi non quả thể có dạng nhiều u lồi tròn, mọc thành dạng vành với mép tán màu trắng-trắng kem. Nấm trưởng thành có dạng quả giá, chất da hoá gỗ. Quả thể hình nan quạt có nhiều vân đồng tâm, chồng chất xen kẽ nhau như ngói lợp, nhìn rất giống đuôi gà tây đang xòe. Mũ nấm mỏng, phẳng hoặc hơi quăn hình bán nguyệt, mọc thành cụm kích thước 1 – 6 x 1 – 10 cm. Mặt trên tai nấm có lớp lông mịn, mền như nhung, có màu sắc rất khác nhau tùy chủng từ đen, nâu, xám, xanh đến đo đỏ, trắng hay vàng nhạt. Màu sắc các chủng vân chi phụ thuộc vào môi trường và hệ di truyền. Mặt dưới tai nấm màu trắng, màu kem hay hơi xám có hàng ngàn ống nhỏ. Tất cả các chủng vân chi đều có các ống nhỏ ở mặt dưới, đây là đặc điểm giúp phân biệt vân chi với nấm Stereum hissutum. Các ống này rất nhỏ khoảng 4 – 5 ống/mm, có vách ngăn ngang dày. Miệng ống tròn hay hơi tròn. Các ống này giúp gia tăng diện tích mang bào tử. Thịt nấm màu trắng hoặc trắng kem, gồm nhiều sợi dày 0,6 – 2,5 mm. 2.2.3. Đặc điểm vi học [14], [21] Hệ sợi kiểu trimitic, sợi dinh dưỡng trong suốt, có vách mỏng, có khoá rõ ràng, đường kính cỡ 2,5 – 3 µm; sợi cứng ở vùng thịt nấm có vách rất dày, không thấy có vách ngăn tế bào, đường kính tới 4 – 6 µm, rất hiếm khi thấy phân nhánh; sợi bện cũng có vách ngăn ngang, đường kính sợi nhỏ hơn (2 – 4 µm). Không thấy có liệt bào, song 7 có thấy cystidioles dạng fusoid, kích thước 15 – 20 x 4 – 5 µm, có khoá ở phần gốc. Đảm bào hình chùy có bốn tiểu bính (nơi đính của bốn bào tử), có khoá ở phần gốc. Bào tử đảm hình trụ, hơi cong hình quả dưa gang, trong suốt, nhẵn, kích thước 5 – 6 x 1,5 – 2 µm. 2.2.4. Đặc điểm phân bố [19],[22], [25], [34] Vân chi là loại nấm phá gỗ, mọc hoang, thường mọc trên các cây thân gỗ đã chết hoặc khô, đặc biệt là gỗ sồi, dễ dàng tìm thấy ở nhiều nơi trên thế giới. Vân chi thích hợp đối với những nơi có nhiều mưa, ẩm ướt, gần bờ sông… ở vùng ôn đới Bắc Mỹ, châu Á, châu Âu và là loại nấm sinh sản nhiều nhất ở Bắc Bán Cầu. Ở Việt Nam cũng tìm thấy nấm này, nhất là vào mùa mưa. Nhật, Trung Quốc và một vài nước khác đang trồng và chiết xuất PSP, PSK từ vân chi. Ở Việt Nam, TS Lê Xuân Thám (Trung tâm kỹ thuật hạt nhân TpHCM) đã mang một giống chuẩn từ Nhật về, đây là loại mặt trên tai nấm có những vân đồng tâm nâu đen đến đen. Hiện nay giống này đang được trồng thử trên Đà Lạt và cũng được Trung tâm nghiên cứu linh chi và nấm dược liệu TpHCM trồng thử nghiệm trong điều kiện khí hậu của thành phố, đã ra quả thể (tai nấm) tại TpHCM. 2.2.5. Chu trình sống [3] Tầng đảm Đảm Kết hợp nhân ở đảm Hình thành bào tử đảm Quả thể Sợi nấm song hạch Bào tử đảm nảy mầm Sự kết hợp sơ cấp Sơ đồ 2.1: Chu trình phát triển của nấm vân chi 8 2.2.6. Quy trình nuôi trồng nấm [3],[12],[13] 2.2.6.1. Chọn dòng và giữ giống Gọt sạch chất bẩn bám ở chân Rửa dung dịch chlorine 1% Rửa nước vô trùng 3 lần Đặt lên giấy Lau cồn Tách đôi Tách thịt ấ Tai nấm Mô thịt Bào tử Ngâm nước vô trùng 4 giờ Cấy truyền lên môi trường thạch nghiêng hoặc thạch đĩa Petri. Nuôi ủ ở nhiệt độ phòng Kiểm tra tạp nhiễm Giống gốc Giữ giống Nhân giống cho sản xuất Giá thể có hệ sợi Sơ đồ 2.2: Quy trình phân lập tổng quát Có nhiều cách để phân lập nấm để tạo giống gốc nhưng hiệu quả nhất là phân lập từ quả thể. Vì đây là phương pháp nhân giống vô tính. Trong khi tách hệ sợi nấm thì không rõ có đúng là nấm cần phân lập hay nấm mốc hoặc nấm dại khác. Còn dùng bào tử nấm cũng không đơn giản vì đây là giai đoạn sinh sản hữu tính, nên nấm hình thành có thể thay đổi đặc tính. Ngoài ra, phương pháp phân lập từ quả thể hạn chế được hiện tượng bị lẫn hay nhiễm tạp các loại vi sinh vật khác vì sử dụng trực tiếp các mô thịt nấm. Nguyên tắc của phương pháp này là chọn tai nấm điển hình và ở giai đoạn trưởng thành, để dễ đánh giá chất lượng giống. Mô thịt nấm tách ở những vị trí kín đáo, ít tiếp xúc với các nguồn bệnh nhất. Môi trường phân lập thường là môi trường dinh dưỡng bao gồm ba thành phần cơ bản. 9 Đường: glucose hay saccharose với liều lượng 2 – 3 %. 9 Thạch: 2%. 9 9 Chất bổ sung: nước chiết (lấy từ các nguồn tự nhiên như khoai tây, nước giá, carot…) và hóa chất (chủ yếu gồm các khoáng N, P, K, Mg…). Khi có được giống thuần, cấy sợi nấm từ môi trường phân lập vào ống nghiệm chứa môi trường thạch nghiêng để giữ giống. Môi trường giữ giống có thể giống môi trường phân lập. Khi giữ giống, bảo quản ống nghiệm trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4 – 10oC và mỗi tháng cấy lại một lần. Ở các cơ quan giữ giống cấp nhà nước các giống nấm phải được giữ trong nitơ lỏng (-195oC) hoặc dùng phương pháp đông khô hay các phương pháp khác để bảo quản lâu dài và giữ ổn định được hoạt chất từng giống. 2.2.6.2. Quy trình nhân giống cấp một và cấp hai Giống cấp một: là các ống thạch nghiêng được cấy từ các ống nấm đã phân lập, thuần khiết và được cấy truyền sang nhiều ống để làm giàu lượng giống thuần. Giống cấp hai: là giống được cấy hệ sợi từ môi trường cấp một vào trong các chai thuỷ tinh hay các túi chất dẻo có miệng là ống nhựa có nút bằng nút bông mỡ. Giống cấp hai có thể chế tạo bằng nhiều công thức khác nhau. Tất cả đều là môi trường xốp với nguyên liệu chính là ngũ cốc, cám, mùn cưa và có thể bổ sung một số chất dinh dưỡng khác. Bảo quản giống cấp hai được thực hiện ở nhiệt độ phòng (29 ± 2oC). 2.2.6.3. Quy trình nuôi trồng ra quả thể Giá thể nuôi trồng nấm rất đa dạng: mùn cưa, gỗ khúc hay các nguồn phế phẩm nông nghiệp như cùi bắp, bã mía, rơm rạ… 10 Mùn cưa bổ sung dinh dưỡng Phối trộn Ẩm độ: 62 – 65 % Chai nhựa (thủy tinh), bao PP,PE Phân lập Giống gốc MT thạch Khử trùng Túi phôi, chai phôi Nhân giống Giống sản xuất MT hạt Cưa khúc Gỗ khúc Cấy giống Cấy giống Ủ tối 21 – 26oC Pha sợi hoàn chỉnh Phòng tưới Nhiệt độ: 15 – 24oC Độ ẩm: 85 – 95% Ánh sáng: 100 – 25 lux Hệ sợi lan kín giá thể Quả thể Hệ sợi lan kín giá thể Quả thể Thu hoạch chế biến Bảo quản Thu hoạch chế biến Bảo quản Cây gỗ mềm Quả thể nấm Sơ đồ 2.3: Quy trình nuôi trồng nấm a. Quy trình nuôi trồng trên gỗ khúc Cây gỗ chặt hạ, bỏ cành, cưa thành khúc 80 – 120 cm, mặt cắt quét vôi, chất đóng ủ khoảng 1 tháng. Sau đó tiến hành các bước sau: 9 Cấy giống Giống sản xuất là giống hỗn hợp mùn cưa, cám, bột bánh dầu, hạt ngũ cốc… Dùng búa hoặc khoan đột những hàng lỗ so le, đường kính 1 – 1,5 cm dọc theo khúc gỗ, cách nhau 5 cm, sâu 3 – 5 cm. 11 Gieo meo giống cho đầy lỗ cấy, sau đó đậy lại bằng chính miếng gỗ đục từ lõi ra. Dán giấy parafin hoặc nhỏ sáp lên bao bọc kín lỗ cấy. Thao tác đột lỗ cấy và gieo meo giống nên làm kế tiếp nhau và nhanh để tránh nhiễm tạp. 9 Nuôi ủ gỗ Sau khi gieo meo giống, gỗ được ủ ở điều kiện: độ ẩm 75 – 85 %, nhiệt độ khoảng 25 – 30oC. Sau 15 – 20 ngày, kiểm tra sự lan tỏa của sợi nấm và chuyển sang ủ trong đất với cát. Tưới phun giữ ẩm trong khoảng 30 ngày. 9 Vùi đất Chỉ có linh chi mới vùi đất, còn vân chi và một số nấm khác người ta đem vào nhà tưới tiếp tục tưới phun cho đến khi xuất hiện quả thể. Các khúc gỗ được cưa thành đoạn 15 – 20 cm (có thể kiểm tra thấy hệ sợi nấm lan trắng mặt gỗ). Vùi cắm các khúc gỗ xuống nền đất đã làm kỹ và khử trùng diệt mối mọt, sâu bọ,… Bên trên làm thành mái vòm che mưa nắng và ánh sáng trực xạ. Người ta thường vùi các khúc gỗ để nhô lên cỡ 5 – 7 cm. Tưới phun sương giữ ẩm độ không khí 80 – 95% và thông thoáng. Sau 15 – 20 ngày sẽ có sự xuất hiện mầm quả thể, tiếp tục tưới phun và chăm sóc cẩn thận vì giai đoạn này nấm rất hay bị sâu. b. Quy trình nuôi trồng trên giá thể tổng hợp 9 Phối trộn cơ chất Tận dụng các loại phế liệu nông nghiệp (cùi bắp, rơm rạ, mùn cưa… đã được xay nhuyễn). Tỉ lệ mùn cưa khô nên đạt 30 – 60%, phần còn lại dùng rơm rạ băm nhỏ, trấu, bã trà khô, vỏ hạt bông, vỏ quả đậu phộng, cành thân cây nhỏ… Xử lý hỗn hợp cơ chất này với nước vôi 1,5%. Nguồn dinh dưỡng bổ sung quan trọng là các loại cám ngũ cốc, tỉ lệ nên phối trộn khoảng 15 – 20%. Nên cho thêm (NH4)2SO4 (0,5%), superphosphate (1 – 1,5%) và MgSO4.7H2O (0,05%). Độ ẩm sau cùng đạt 65 – 70%. 12 9 Khử trùng giá thể Sau khi đã nhồi cơ chất tổng hợp vào túi PP hay chai PP với lượng khoảng 0,5 – 1,5 kg, tiến hành hấp khử trùng giá thể. Khử trùng kỹ: 2 giờ trong nồi autoclave hoặc bằng hơi nước nóng ở 121oC/2 – 4 giờ. Sau đó lấy ra để nguội. 9 Cấy giống Cấy giống vào giữa khối cơ chất (khoảng 3 – 5% khối lượng giống so với cơ chất). Nuôi ủ trong buồng tối, ở 25 – 30oC, sau 25 – 35 ngày hệ sợi sẽ lan hầu khắp giá thể. 9 Tưới đón nấm Hệ sợi bắt đầu bện kết sau 25 – 30 ngày. Tại thời điểm này, cần chuyển túi (chai) vào nhà trồng có ánh sáng khuếch tán nhẹ, nhiệt độ hạ thấp 21oC ± 3oC. Có thể vùi đất, treo, xếp trên giàn kệ, mở nút túi cho mầm nấm vươn ra dễ dàng. Duy trì độ ẩm phòng nuôi cấy ở 80 – 90%. Thông thoáng phòng nuôi cho quả thể lớn. Tuỳ theo loài nấm mà thời gian thu hoạch thay đổi từ 35 – 45 ngày đến vài tháng. Sau cùng sẽ tiến hành thu hoạch quả thể và chế biến bảo quản. 2.2.6.4. Quy trình nuôi trồng thu sinh khối Ngoài công nghệ nuôi trồng trên giá thể tổng hợp hay trên gỗ khúc, người ta còn tiến hành thu sinh khối nấm trong các nồi lên men. Hiện nay nhiều xí nghiệp dược phẩm đã sản xuất sinh khối nấm vân chi theo phương pháp lên men chìm trong các nồi lên men với các thông số kỹ thuật sau: 9 Môi trường sử dụng: bột khô dầu đậu tương (1%), glucose (3%), bột nấm men khô (0,2%), (NH4)2SO4 (0,25%), MgSO4 (0,05%), KH2PO4 (0,1%), dầu đậu tương để khử bọt (0,2%) 9 Lượng môi trường trong nồi lên men: 60 – 70% 9 pH trước khử trùng: 6,0 9 Lượng cấy giống vào: 0,5% 9 Áp suất nồi lên men: 0,5 kg/cm2 9 Nhiệt độ nuôi cấy: 26 – 28oC 9 Tốc độ khuấy: 180 rpm 9 Chế độ thổi khí vô trùng: 1:0,3 – 1:0,5 (V/V.min) 13 9 Thời gian lên men: khoảng 48 giờ 2.2.7. Giá trị dược tính của nấm vân chi [3], [19],[25], [27] Đã có hơn 400 khảo cứu về thành phần hoá học, dược lý lâm sàng nấm vân chi công bố khắp thế giới. Trong cuốn “Dược vật học” đời nhà Minh (Trung Quốc) ghi lại rằng: “Nấm vân chi đen và lục bồi bổ khí huyết, tăng năng lượng cuộc sống, và nó còn có tác dụng làm vững gân cốt. Nếu dùng vân chi trong một thời gian dài sẽ làm cho con người cảm thấy khoẻ mạnh, yêu đời, sôi nổi và sống lâu hơn”. Vân chi được dùng dưới dạng trà có tác dụng hạ thấp lượng cholesterrol máu, áp suất máu, chống chứng rối loại nhịp tim, điều khiển nồng độ đường trong máu. Ở châu Á, nấm được dùng chung với các thành phần thảo mộc khác để chữa trị ung thư. Các báo cáo từ những năm 1960 đã cho thấy lợi ích về sức khỏe trong điều trị ung thư dạ dày khi uống trà “Saruno-koshikake” có chứa nấm vân chi Trametes versicolor. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng nấm này có hoạt tính kháng khuẩn, kháng virus và kháng khối u. Ngày nay, vân chi được sử dụng như một loại dược liệu trong hỗ trợ điều trị ung thư. Ở Nhật, năm 1987, PSK-chất trích từ vân chi chiếm ¼ thị phần dược phẩm trị ung thư (Fukushima, 1989). Ở Trung Quốc, vân chi được sử dụng để điều trị nhiều loại ung thư và cũng được dùng để trị bệnh viêm gan mãn tính, viêm nhiễm đường hô hấp, viêm cơ quan bài tiết và cơ quan tiêu hoá. Ngoài ra trong các bài thuốc cổ truyền của Trung Quốc, vân chi được dùng để tăng cường hiệu quả cho hệ miễn dịch, loại bỏ độc tố cơ thể, giảm đờm, tăng năng lượng và làm tinh thần sảng khoái, kéo dài tuổi thọ, hạ nhiệt do vân chi có tính hàn, vị ngọt. Trong điều trị ung thư, khi sử dụng kết hợp PSP, PSK (hợp chất trích từ nấm) với hoá trị hay xạ trị sẽ làm tăng tỉ lệ sống còn của bệnh nhân ung thư và làm giảm các triệu chứng do hoá trị hay xạ trị gây ra. Các hợp chất trích từ vân chi rất an toàn khi sử dụng, không có phản ứng phụ, không độc. Chỉ tìm thấy một biểu hiện nhỏ khi sử dụng PSK là nó làm đen các đầu ngón tay ở một số rất ít bệnh nhân chịu tác dụng điều trị (khoảng 4/77 người mắc phải). Một số biệt dược của nấm vân chi: Vân chi, Lục bảo Vân chi, (PSK) VPS – Coriolus versicolor, Coriolus-VPS® , PSK® , Yunzhi Polysaccharide peptide (Trade mark Qing Kang), PSP polysaccharide-peptide (Landford). 14 2.2.8. Các giá trị khác của vân chi [18] Nấm vân chi sản xuất ra các enzyme phá gỗ như: laccaza, mangan peroxidaze (MnP), lignin peroxidaze (LnP). Các enzyme này đang được nghiên cứu ứng dụng trong lĩnh vực tẩy trắng bột cellulose. Laccaza từ nấm vân chi có thể phân huỷ một phần hợp chất clo của CPC, có thể declo hoá nhiều hợp chất clophenol do đó được dùng trong xử lý chất thải, khử màu chất thải từ khâu tẩy trắng. 2.2.9. Thành phần hoá học sơ bộ nấm vân chi [20] Bảng 2.1: Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hoá thực vật Dịch ether Dịch cồn Dịch acid Acid béo - Acid hữu cơ + Alcaloid + - + Triterpenoid tư do + Anthraglycosid - - Anthocyanidin - Coumarin + Chất khử + + Flavonoid - - Saponin + + Tanin + + Tinh dầu - Polyphenol + Hợp chất polyuronic + Polysaccharide + + Acid amin + + Ghi chú: +: dương tính; -: âm tính Trong thành phần nấm vân chi có acid hữu cơ, alcaloid, chất khử, triterpenoid, coumarin, saponin, tanin, polyphenol, hợp chất uronic, acid amin và polysaccharide. Trong đó polysaccharide là thành phần dược tính được quan tâm, nghiên cứu nhiều nhất. 15 2.3. Một số khái niệm sinh hoá 2.3.1. Khái niệm về polysaccharide [10],[15] Các glucid thuộc nhóm polysaccharide là các hợp chất cao phân tử khác nhau bởi thành phần monosaccharide, độ dài của chuỗi và mức độ phân nhánh. Trong phân tử polysaccharide, các monosaccharide liên kết với nhau bằng liên kết glycosid, vì vậy các polysaccharide rất dễ bị thủy phân thành các loại đường đơn. Công thức tổng quát là (C6H10O5)n. Tuỳ theo thành phần của monosaccharide mà polysaccharide được chia làm 2 nhóm: polysaccharide đồng thể (homopolysaccharide) và polysaccharide dị thể (heteropolysaccharide). 2.3.1.1. Polysaccharide đồng thể là các polymer cấu tạo bởi nhiều monosaccharide giống nhau gồm có: - Tinh bột: Là sản phẩm quang hợp của thực vật, là chất dự trữ quan trọng tích lũy trong củ, quả, hạt và là hợp chất hữu cơ được tạo thành bởi nhiều phân tử glucose liên kết với nhau theo liên kết glycosidic 1-4 gồm có 2 dạng: • Amylose: tan trong nước, cho phản ứng màu xanh với iod, mạch thẳng, là chuỗi không phân nhánh của gốc α-D-glucopyranose gắn nhau bởi liên kết glycosidic 1-4. • Amylopectin: cho phản ứng màu tím đỏ với iod, có cấu trúc phân nhánh được cấu tạo bởi nhiều phân tử glucose nối với nhau bởi liên kết glycosidic 1-4 và 1-6. - Glycogen: có nhiều mạch phân nhánh, TLPT 400 000 – 4 000 000 gồm khoảng 2 400 – 24 000 gốc glucose. - Cellulose: là thành phần chủ yếu của vách tế bào, thường liên kết với các chất khác như lignin, hemicellulose, pectin, không tan trong nước, tan trong dung dịch amoniac của hydroxyd đồng. Cellulose là chuỗi dài không phân nhánh với số gốc glucose từ hàng nghìn đến hàng chục triệu, các gốc này liên kết nhau bằng liên kết β-glycosidic 1-4. - Chitin: có cấu trúc gần giống với cellulose, chúng được thành lập từ các dẫn xuất của glucose là N-acetyl glucosamine, chúng nối với nhau bằng liên kết glycosidic 1-4. Chitin có nhiều trong nấm men và ở động vật không xương sống. 16 2.3.1.2. Polysaccharide dị thể: là những polymer được cấu tạo bởi nhiều monosaccharide khác nhau. - Hemicellulose: là polysaccharide có nhiều trong rơm, rạ, gỗ… chúng không tan trong nước nhưng tan trong dung dịch kiềm, trong thành phần cấu tạo thường gặp glucose, fructose, mannose, arabinose, xilose và galactose. - Peptidoglycan: là những polysaccharide mạch thẳng cấu tạo nên thành tế bào vi khuẩn, gồm các chuỗi disaccharide lập lại. - Glucosaminoglycan: là thành phần của matrix ngoài tế bào, là những glucid phức tạp đặc trưng bởi các chuỗi disacharide lập lại gồm có đường amin và acid uronic. Các glucosaminoglycan quan trọng: 9 Acid hyaluronic: cấu tạo bởi chuỗi disaccharide lập lại bao gồm acid D- glucoronic và N-acetylglucosamin. Nó có TLPT trên 1 triệu, tạo thành dung dịch trong nhớt có tác dụng làm trơn hoạt dịch của các khớp và thủy tinh dịch của mắt, giúp cho sự vận động và ngăn chặn sự xâm nhập của nhiều chất độc đối với cơ thể. Acid hyaluronic còn là thành phần chính của matrix ngoài tế bào, của sụn và gân làm tăng tính co giãn của các tổ chức này. Enzyme hyaluronidase xúc tác sự thuỷ phân liên kết glucosid của hyaluronat và có hoạt tính mạnh trong tinh dịch, nọc rắn và một số vi khuẩn. 9 Condrotin sulfat: là một glucosaminoglycan gồm acid glucuronic và N-acetyl galacyosamin sulfat. Nó có nhiều trong tố chức sụn, tổ chức liên kết (gân, da, van tim và thành động mạch). 9 Heparin: là glucosaminoglycan gồm acid iduronic và glucosamin gắn sulfat. Nó ngăn chặn chuyển hoá prothrombin thành thrombin do đó có tác dụng chống đông máu, còn giải phóng lipoproteinase từ tổ chức vào huyết tương. Enzyme này xúc tác sự phân hủy các phức hợp lipoprotein trong quá trình vận chuyển và chuyển hoá lipid. - Proteoglycan: (thành phần matrix ngoài tế bào) là polysaccharide tạp gồm một chuỗi hyaluronat rất dài liên kết không cộng trị với nhiều phân tử protein lõi. Mỗi phân tử lõi lại gắn liên kết không cộng trị với nhiều phân tử glycosaminoglycan ngắn hơn (condroitin sulfat, keratan sulfat, heparin sulfat) bằng các cầu glycosid nối các gốc đường với nhóm OH của serin hoặc threonin trong phân tử protein (liên kết O- 17 glycosid). Các proteoglycan đóng vai trò cấu tạo đối với cơ thể (tạo tính co giãn, tính nhớt, độ trơn tại các khớp, tổ chức liên kết, mô nâng đỡ và các dịch che phủ các cơ quan). - Glycoprotein và glycolipid: màng tế bào động vật chứa khoảng 5% glycid dưới dạng glycoprotein và glycolipid. Đó là những hợp chất có cấu trúc mạch thẳng có từ 1 đến 15 gốc đường trong đó nhiều protein và một số lipid của màng tế bào gắn với các olygosaccharide bằng liên kết cộng hoá trị. 2.3.2. Amino acid [10],[20] Là đơn vị cấu tạo của protein, là dẫn xuất từ acid carboxylic trong đó có một hoặc hai nguyên tử hydrogen của gốc ankyl được thay thế bởi nhóm amine (NH2) ở vị trí carbon alpha so với nhóm carboxyl (COOH) nên gọi là α-amino acid. H - CαH – COOH R + NH2 H2N - CαH – COOH R Acid amin có các tính chất sau: • Tính hoạt quang: đó là khả năng làm quay mặt phẳng phân cực của ánh sáng. • Tính lưỡng tính: acid amin thể hiện đồng thời cả tính acid và tính base. Tùy điều kiện môi trường acid amin có thể tồn tại dưới dạng cation, anion hoặc muối nội trung hoà điện (ion lưỡng cực). Phản ứng tạo màu của acid amin với thuốc thử ninhydrin và các chất khác được dùng làm phản ứng phát hiện trong các phương pháp phân tích acid amin. Trong nấm vân chi có các acid amin chủ yếu như: glutamic, aspartic và một số acid amin dạng trung hoà. 2.3.3. Chuỗi liên kết β-D-glucan [27] [32] Các proteoglycan trích từ nấm vân chi chủ yếu là liên kết β-D-glucan. Cấu trúc β- D-glucan là một cấu trúc lập lại, gồm nhiều phân tử D-glucose nối với nhau bằng các nối β tạo dạng mạch thẳng. Các nối β được tạo từ vị trí C1 của vòng saccharide đứng trước với vị trí C3 của vòng kế tiếp (β1-3), từ C1 đến C4 (β1-4), hoặc từ C1 đến C6 18 (β1-6). Hầu hết các proteoglycan thường có một chuối chính, hoặc là chuỗi β1-3, chuỗi β1-4 hoặc kết hợp hai chuỗi β1-3, β1-4 với một chuỗi phụ β1-6. Các glucan gắn với protein là có tiềm năng miễn dịch lớn hơn rất nhiều so với các glucan tương ứng không kết hợp với protein. Hình 2.2: Cấu trúc chuỗi beta-glucan trích từ nấm (Kidd, 2000) 2.4. Thành phần dược tính chính trích từ nấm vân chi [25], [28], [33], [34] Vào khoảng năm 1965, ở Nhật, một kỹ sư hoá học đã khám phá ra thành phần trị ung thư của nấm vân chi sau khi ông này quan sát thấy người hàng xóm mắc bệnh ung thư hiểm nghèo đã được chữa khỏi sau khi sử dụng vân chi. Điều này đã dẫn đến sự khám phá ra PSK (polysaccharide Kureha). Sau đó, hợp chất PSP (polysaccharide peptide) - chất có cấu tạo gần giống PSK cũng đã được phân lập lần đầu tiên tại Trung Quốc năm 1983. Các chất này đều được xem là những chất kích thích hệ miễn dịch và có hoạt tính kháng ung thư, thúc đẩy quá trình sản xuất tế bào miễn dịch, giảm nhẹ các triệu chứng do hoá trị, xạ trị, giảm đau, chống viêm nhiễm (Altern Med Rev 2-2000). Dịch trích polysaccharide peptide từ nấm (thuật ngữ gọi là proteoglycan) là những chuỗi polypeptide hay những phân tử protein nhỏ gắn kết chặt với các chuỗi polysaccharide β-D-glucan, là thành phần hiệu quả trong chữa trị các chứng ung thư: dạ dày, thực quản, ruột kết và ung thư ngực… Polysaccharide được tìm thấy trong các vách tế bào không tiêu hoá được của vân chi có cấu trúc 3 chiều với các chuỗi bên (chuỗi đường mạch thẳng) mọc nhánh xung quanh cấu trúc trục chính (lõi protein hay polypeptide), các chuỗi bên có chức năng sinh học hay hoạt tính miễn dịch cho phép sự tương tác giữa các chuỗi nhánh bên với các thụ thể trên các tế bào miễn dịch khác nhau. Thụ thể cho β-glucan được tìm thấy trên nhiều tế bào khác nhau: Tế bào tự sát 19 thương (NK), tế bào bạch cầu trung tính, tế bào bạch cầu đơn nhân to, đại thực bào và tế bào lympho B, lympho T. Nhiều nghiên cứu báo cáo rằng β-1,3-glucan là chất kích hoạt hệ miễn dịch chống ung thư tự nhiên ở người và phần glucan có thể kích ứng sự co lại của khối u (Luzio et al, 1980; Mansell et al, 1975; Morikawa et al, 1985). Theo các nhà khoa học thì chỉ có polysaccharide nối với peptide mới tạo ra hiệu quả kháng ung thư. Các thành phần này không bị ảnh hưởng bởi quá trình tiêu hoá nên có hiệu quả khi uống. 9 Thành phần các yếu tố có trong dịch trích [25] Carbon : 40,5% Hydrogen : 60,2% Nitrogen : 5,2% Oxygen : 47,5% 9 Thành phần hoá học dịch trích [25] Hydrate carbon: 42 – 43 % (91 – 93 % chuỗi beta-glucan chứa các polymer có glucose) Protein : 28 – 35 % Ẩm độ : 7 – 7,6 % Khoáng : 6 – 7 % Phần còn lại là đường tự do và aminoacid 2.4.1. PSK (polysaccharide - Kureha) 2.4.1.1. Cấu tạo [27] PSK được ly trích từ chủng vân chi CM-101 bằng nước và bằng phương pháp muối hoá. Trong thành phần cấu tạo gồm 62% polysaccharide và 38% protein. Thành phần glucan gồm có một chuỗi chính β1-4 và các chuỗi phụ β1-3, β1-6 liên kết nhau bằng các nối O-glycosidic hay N- glycosidic. Phần peptide rất giàu các acid amin như aspartic, glutamic và một số acid amin acid khác. PSK có trọng lượng phân tử khoảng 94 – 100 kDa. Phần polysaccharide gồm các monosaccharide: glucose, galactose, mannose, xylose, fucose. Các nghiên cứu với PSK được đánh dấu phóng xạ C14 đã xác nhận rằng phổ nguyên tử của nó được hấp thụ trong 24h sau khi đưa vào cơ thể 20 chuột. PSK không độc, liều LD50 thấp và không xuất hiện các dị hình trong các thử nghiệm độc tính cấp và bán cấp. 2.4.1.2. Dược tính [20], [24], [27], [32], [33] Năm 1971, hơn 200 dược chất hoá lý có khả năng kháng khối u được chọn lọc bởi các nhà nghiên cứu Nhật, PSK là liệu pháp chữa trị tốt nhất vì nó bảo vệ hệ miễn dịch bằng cách trung hoà các thuốc hoá trị và các quá trình gây độc của tế bào ung thư. PSK có khả năng tăng cường hoạt động miễn dịch tế bào và miễn dịch thể dịch. Khi PSK được dùng kết hợp với phương pháp xạ trị thí nghiệm trên chuột, người ta quan sát thấy có sự hồi phục hệ miễn dịch thể dịch đã suy yếu. Các nghiên cứu trên động vật xác nhận thêm rằng PSK cảm ứng tế bào T diệt và phục hồi lại các thông số miễn dịch bị suy yếu trong khi đó sẽ ức chế các hợp chất gây ức chế miễn dịch. PSK ngăn chặn các phản ứng phụ khi dùng kết hợp với các tác nhân hoá trị như 5-FU (5-fluorouracil), doxorubicin, cyclophosphamide (CPA), tegafur, cis-Blastin và mitomycin-C (MMC) để chữa trị ung thư, gia tăng khả năng sống còn của các bệnh nhân ung thư dạ dày ở các giai đoạn III và IV (Kaibara et al, 1970). PSK kích ứng sự biểu hiện cytokine trong các tế bào máu đơn nhân vùng ngoại vi in vitro. Sự biểu hiện gen TNF-α (yếu tố gây hoại tử khối u) và interleukin-8 (IL-8) được cảm ứng mạnh ở những người tình nguyện khoẻ mạnh và những bệnh nhân ung thư dạ dày khi dùng PSK, mặc dù đáp ứng của mỗi người mỗi khác. Có tác dụng ngăn chặn sự phát triển khối u in vitro. PSK gia tăng khả năng sống còn, ức chế sự hình thành và di căn của các tác nhân gây ung thư hoặc các khối u tạo ra do phóng xạ. PSK cũng ức chế sự phát triển trở lại sau hậu phẫu hoặc sự di căn các tế bào khối u ở các mẫu động vật thí nghiệm, cơ chế có lẽ là ngăn chặn sự di chuyển, sự xâm nhập, sự gắn kết với các tế bào màng trong và sự phát triển. Các kết quả nghiên cứu cũng cho thấy tác động hỗ trợ hiệu quả giữa PSK và liệu pháp sinh học gồm vaccin L1210 gắn với concanavalin A (lectin gây phân bào) và kháng thể đơn dòng chống lại các tế bào ung thư ruột kết. Thí nghiệm của Pang ZJ và CS đã chứng minh PSK cải thiện hoạt tính enzyme glutathione peroxidase thông qua sự cảm ứng dịch mã sự biểu hiện của mRNA. 21 PSK biểu hiện hoạt tính kháng virus và có thể có hiệu quả kháng sự nhiễm HIV bằng cách biến đổi receptor virus hoặc bằng cách ngăn chặn nó kết hợp với tế bào bạch huyết. Một cơ chế khác giải thích tính kháng virus của PSK là nó kích thích sự sản xuất interferon, IL-1 ở tế bào người. PSK cũng có tính kháng sinh mạnh, hiệu quả trên Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Cryptococcus neoformans, Psedomonas aeruginosa, Candida albicans và vài loại vi trùng khác gây bệnh ở người. 2.4.2. PSP (polysaccharide-peptide) 2.4.2.1. Cấu tạo [27] PSP được ly trích từ hệ sợi nấm vân chi chủng COV-1. Trong thành phần cấu tạo có khoảng 90% polysaccharide và 10% peptide. Thành phần chuỗi polypeptide có trong PSP tương tự như trong chuỗi proteoglycan PSK, rất giàu aspartic acid và glutamic acid. Tuy nhiên PSP khác PSK về thành phần các đường đơn trong chuỗi polysaccharide, PSP thiếu fucose nhưng lại có arabinose và rhamnose. Chuỗi polysaccharide là các β-glucan thật sự: phương pháp sắc kí khí và khối phổ đã chứng minh liên kết chính trong chuỗi là 1-4, 1-2, và 1-3 glucose cùng với một lượng nhỏ các liên kết 1-3, 1-4 và 1-6 galactose; 1-3 và 1-6 mannose; 1-3, 1-4 arabinose, trong đó cũng thấy xuất hiện vài liên kết α. Trọng lượng phân tử của PSP khoảng 100 kDa. 2.4.2.2. Dược tính [22], [28], [29] Các nghiên cứu về dược lý đã chứng minh rằng PSP ảnh hưởng mạnh mẽ đến sức khỏe và năng lượng, được xem là loại chất cảm ứng điều hoà sinh học mới. PSP không gây hại đối với các tế bào bình thường. PSP có khả năng phân biệt giữa tế bào thường và tế bào ung thư. Có thể tiêu diệt tế bào ung thư mà không gây bất cứ sự thay đổi hay tạo độc tố trên tế bào (Mei-po Yang, Hongkong university). Tỉ lệ phần trăm bệnh nhân trải qua thử nghiệm hiệu quả của PSP trong các giai đoạn II và III cho thấy tỉ lệ sống còn gia tăng đáng kể so với nhóm đối chứng: 90 – 97 % đối với ung thư dạ dày, 82 – 87 % đối với ung thư thực quản, 70 – 86 % đối với ung thư phổi. PSP là chất đầy tiềm năng và hiệu quả trong điều trị ung thư. 22 9 PSP gia tăng chức năng miễn dịch của cơ thể bình thường. Tăng sự biểu hiện của gen Interleukin-6 (IL-6) trong các tế bào lympho máu ngoại vi (PBL) ở người và do đó sản xuất ra IL-6 và cũng hoạt hoá tế bào bạch cầu để gia tăng quá trình sản xuất interferon α và γ lên gấp 2 – 4 lần. Gia tăng mạnh mẽ chỉ số thực bào, trị số HC50, kháng thể ở chuột, tăng PBL từ phase G1 đến phase S, thúc đẩy sự phát sinh PBL. Thúc đẩy sự phát sinh tế bào lympho T và tế bào tiền tế bào T ở tuyến ức và lách, tăng cường hoạt tính tế bào lympho B. 9 PSP trung hoà quá trình ức chế miễn dịch do khối u gây ra ở động vật. Làm ngưng quá trình tiêu biến của tuyến ức ở chuột mang bệnh Sarcoma. Trung hoà sự trương phồng của gan khi mắc bệnh ung thư cổ trướng Ehrlich. Chống lại quá trình ức chế kháng thể của tế bào ung thư Sarcoma ở chuột. Tăng giá trị bổ thể huyết thanh C3 trong chuột mắc bệnh Sarcoma. 9 PSP trung hoà quá trình ức chế miễn dịch do tác dụng của các hoá dược trong điều trị ung thư. Ức chế quá trình tiêu biến tế bào bạch cầu do cyclophosphamine (CPA) gây ra và rút ngắn thời gian phục hồi tế bào bạch cầu. Chống lại quá trình ức chế của CPA trên IL-2 và tế bào T tự sát thương. Phục hồi lại phản ứng mẫn cảm loại chậm bị ức chế bởi CPA. Dùng kết hợp với các phương pháp hoá trị và xạ trị sẽ làm giảm các tác dụng phụ của hoá dược và có hiệu quả cao hơn. 9 PSP ức chế sự phát triển của tế bào ung thư ở người và động vật thí nghiệm PSP (50 mg/kg, ip hoặc po) có thể ức chế sự phát triển của Sarcoma 180 ở chuột. PSP (100 µg/ml) có thể ức chế quá trình tổng hợp nucleic acid của tế bào ung thư cổ trướng Ehrlich. Ức chế sự phát triển tế bào ung thư bạch cầu P388, tế bào u tủy, tế bào ung thư gan, tế bào ung thư phổi Lewis ở chuột. Nó có thể ức chế sự phát triển của tế bào ung thư dạ dày, ung thư tuyến phổi ở người, ung thư tế bào bạch cầu đơn nhân to, ung thư mô bạch huyết ở da. Nó cũng gây ra sự tiêu biến tế bào ung thư và sự tích tụ NST mà không tạo ra bất kỳ độc tố nào trên tế bào fibroblast hay tế bào chủ (Liang-Zhong Xu, Bao-zhen Zhong, 2003). 23 Huyết thanh bạch cầu (ALS) có thể được trung hoà. Hoạt tính kháng khối u của PSP có liên quan với sự gia tăng tế bào lympho T. Tăng sự sản xuất các hợp chất nitơ trung gian, anion superoxide và yếu tố gây hoại tử ung thư. 9 Một số hiệu quả khác của PSP. Cải thiện sự thèm ăn của chuột khi dùng kết hợp với CPA. Giảm phản ứng đau của động vật khi chịu các tác nhân kích thích như điện, acid acetic, nước nóng. Ức chế hệ thần kinh trung ương và giảm hoạt tính tự phát của chuột. Tăng khả năng chịu đựng trong điều kiện thiếu oxy đối với chuột thí nghiệm. Biểu hiện khả năng ức chế sự tương tác giữa HIV-1 gp120 và làm bất động thụ thể CD4 (IC50=6,25µg/ml), ức chế enzyme glycohydralase gắn với sự glycosic virus và làm giảm độc tố tế bào. Do đó hướng sắp tới PSP sẽ được nghiên cứu để tạo thành tác nhân kháng virus in vivo. Ngoài ra, PSP còn được ứng dụng trong chữa trị các bệnh viêm nhiễm virus và bệnh gan. 2.4.3. So sánh giữa PSK và PSP [28] PSP và PSK là chuỗi proteoglycan, có trọng lượng phân tử khoảng 100 kDa, thành phần polysaccharide đều không có N-acetylamino-hexose trong khi tất cả chuỗi polysaccharide khác có. PSP và PSK đều được xem là những chất gây biến đổi các đáp ứng sinh học có khả năng trị ung thư và làm tăng miễn dịch, nhưng những nghiên cứu và thử nghiệm lâm sàn cho thấy PSP và PSK có một số khác biệt. Bảng 2.2: So sánh giữa PSK và PSP Đặc điểm so sánh Giống nhau Khác nhau Chủng loại Vân chi Trametes versicolor PSP: chủng COV-1 từ Trung Quốc. PSK: CM-101 từ Nhật. Dạng dược phẩm PSP: dạng viên PSK: dạng gói Màu bột Nâu PSP: nâu PSK: nâu đậm Dạng nguyên liệu thô Hệ sợi 24 Kỹ thuật lên men Nguồn carbon chính là glucose lên men ở 25oC, 3 ngày hoặc 26oC, pH = 5 – 7. PSP: nguồn nitơ từ bột đậu nành PSK: nguồn nitơ từ pepton và cao nấm men. Thời gian lên men của PSP (64 giờ) nhanh gấp 3 lần PSK. Phương pháp chiết Chiết bằng nước nóng. PSP: tủa bằng cồn. PSK: sử dụng phương pháp muối hoá với (NH4)2SO4 để tủa. Phần đường Galactose, glucose, mannose, xylose PSP: arabinose, rhmanose PSK: fucose - Ngăn chặn sự tổng hợp acid nucleic của tế bào Ehrlich ascitic và sự phát triển của tế bào ung thư Sarcoma-180, bạch cầu P388… PSP: tỉ lệ ngăn chặn trên P388 là 90 – 96 % (1mg/kg). PSK: có tỉ lệ là 61 – 90 % (1mg/kg) PSP: tỉ lệ ức chế sự tổng hợp RNA, DNA của tế bào Ehrlich là 47%, 65%. PSK: 39%, 34%. - Phục hồi lại phản ứng mẫn cảm bị ức chế bởi các dược chất hoá học và bảo tồn lượng bạch cầu. Mức ngăn chặn của PSP, đối với bệ Sarcoma trên chuột là 43%, PSK 28%. Dược tính Gia tăng hoạt tính đại thực bào, hàm lượng globulin miễn dịch, bổ thể C3, kháng thể HC50, và IL-2 tế bào lympho-T PSP có thể làm tăng hàm lượng α- và β-ITF tạo bởi tế bào bạch cầu gấp 2 – 4 lần. Độc tính LD50>20g/kd, không đôc, không làm xuất hiện các dị hình, không ảnh hưởng đến sinh sản. PSP có thể tạo ra phản ứng độc bằng cách tập hợp nhiễm sắc thể của các tế bào ung thư phổi nhưng không độc trên chuột bình thường. Tác dụng trị liệu Làm giảm độc và phản ứng phụ của hoá trị và xạ trị, tăng chức năng miễn dịch, tăng hiệu quả chữa trị, kéo dài tuổi thọ và tăng chất lượng cuộc sống. PSP làm tăng sự thèm ăn, làm giảm đau. 25 2.5. Phương pháp chiết xuất hợp chất thô từ nấm (Phương pháp trích ly) [5] 2.5.1. Khái niệm Chiết là phương pháp sử dụng dung môi để tách các chất tan ra khỏi một hỗn hợp các chất. Tùy theo cơ chế và đặc điểm, quá trình chiết được phân ra: 9 Chiết lỏng - lỏng với cơ chế chính là quá trình phân bố của chất tan trong hai chất lỏng không đồng tan với nhau theo định luật phân bố. 9 Chiết rắn - lỏng với cơ sở chính là sự hoà tan của chất tan vào dung môi. 2.5.2. Các quá trình xảy ra trong chiết xuất 2.5.2.1. Quá trình hoà tan Sự hoà tan là một quá trình vật lý trong đó chất tan được solvat hoá và kéo vào dung môi. Sự hòa tan này không có chọn lọc, tất cả những chất tan được trong dung môi đều có mặt trong dịch chiết. Quá trình hoà tan nhanh hay chậm phụ thuộc vào khả năng hòa tan của chất tan trong dung môi, diện tích bề mặt tiếp xúc của chất tan với dung môi, nhiệt độ và sự khuếch tán của chất tan trong dung môi. Nồng độ dung dịch phụ thuộc vào bản chất của dung môi và của chất tan, số lượng của dung môi và của chất tan. 2.5.2.2. Quá trình khuếch tán Quá trình khuếch tán xảy ra nhằm làm triệt tiêu sự chênh lệch nồng độ giữa dung dịch ở những nơi dung môi tiếp xúc với chất tan và dung dịch ở những nơi dung môi không hoặc ít tiếp xúc với chất tan. Sự khuếch tán thúc đẩy quá trình hoà tan và kéo chất tan từ các tế bào vỡ ra khỏi tế bào đi vào dịch chiết. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình khuếch tán: 9 Sự chêch lệch nồng độ 9 Nhiệt độ 9 Độ nhớt của dung môi 2.5.2.3. Quá trình thẩm tích Việc di chuyển chất tan phân tử nhỏ qua các kênh bào tương (Plasmodesmata, ống trao đổi) trong quá trình chiết xuất được thực hiện bởi sự khuếch tán thụ động theo 26 gradient nồng độ. Sự thẩm tích làm cho quá trình hòa tan chiết xuất có tính chọn lọc hơn. Các yếu tố ảnh hưởng: Cấu trúc vách tế bào, kích thước chất tan, nhiệt độ. 2.5.3. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình chiết xuất 2.5.3.1. Nguyên liệu Bản chất của nguyên liệu: bề dày của vách tế bào, đường kính của ống trao đổi là hai yếu tố quan trọng nhất. Mức độ chia nhỏ của nguyên liệu: Nguyên liệu càng được chia nhỏ, quá trình chiết càng nhanh. Tuy nhiên cách chia nhỏ phải phù hợp với từng loại nguyên liệu và dung môi. Chất tan: Độ tan trong dung môi của chất tan càng lớn, quá trình chiết xảy ra càng nhanh. Kích thước phân tử chất tan càng lớn, tốc độ khuếch tán và khả năng qua vách tế bào càng lớn. 2.5.3.2. Dung môi Khả năng hoà tan của dung môi: Khả năng hoà tan của dung môi với chất tan càng lớn, quá trình hoà tan càng nhanh làm cho quá trình chiết xảy ra nhanh hơn. Dung môi phân cực hoà tan các chất phân cực, dung môi kém phân cực hoà tan các chất kém phân cực. Độ nhớt của dung môi: Độ nhớt càng thấp, quá trình chiết xảy ra càng nhanh. Sự thấm dung môi qua vách tế bào: Nguyên liệu còn tươi, còn nhiều nước làm chậm quá trình chiết đối với các dung môi kém phân cực. 2.5.3.3. Kỹ thuật chiết Tốc độ của quá trình chiết phụ thuộc các yếu tố: 9 Sự khuấy trộn: Làm cho quá trình chiết xảy ra nhanh hơn. 9 Nhiệt độ, áp suất: Tăng nhiệt độ, tăng áp suất làm tăng tốc dộ chiết. 9 Chất trợ tan: Các chất diện hoạt có tác dụng đẩy nhanh quá trình chiết. 9 Siêu âm và vi sóng: Làm tăng chuyển động nhiệt của các phân tử chất tan và dung môi, tăng sự hoà tan và quá trình khuếch tán. 27 2.5.4. Các phương pháp chiết 2.5.4.1. Chiết các nguyên liệu tươi Nguyên liệu được cắt nhỏ, ngâm ngập trong dung môi và được xay nhỏ bằng một cánh khuấy quay với tốc độ rất cao (khoảng 10 000 vòng/phút) trong một thời gian ngắn (5 – 10 phút). Quá trình chiết này được thực hiện trong máy khuấy có tốc độ cao nên được gọi là turbo-extraction. 2.5.4.2. Phương pháp ngâm Ngâm là một phương pháp chiết gián đoạn trong đó lượng dung môi được tiếp xúc đồng thời với toàn bộ lượng nguyên liệu trong những dụng cụ thích hợp. 9 Phương pháp ngâm lạnh: Nguyên liệu được ngâm với dung môi ở nhiệt độ phòng. Thời gian ngâm thường không dưới 12 giờ để đảm bảo quá trình chiết được căn bản hoàn tất. 9 Phương pháp ngâm nóng: Là phương pháp ngâm được thực hiện ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ phòng nhưng dưới nhiệt độ sôi của dung môi. Do có sự gia nhiệt nên quá trình chiết xảy ra nhanh hơn, dịch chiết thu được có nồng độ cao hơn và ít tốn dung môi hơn. 9 Chiết bằng Soxhlet và Kumagawa: Là phương pháp ngâm nóng nhiều lần lần với một lượng nhỏ dung môi. Kumagawa cho phép chiết ở nhiệt độ gần với nhiệt độ sôi của dung môi còn Soxhlet gần với phương pháp ngâm lạnh hơn. 9 Chiết bằng dung môi ở nhiệt độ sôi: Là phương pháp ngâm được thực hiện ở nhiệt độ sôi của dung môi. Ưu điểm của phương pháp là quá trình chiết xảy ra nhanh; khuyến điểm là cần phải có dụng cụ, thiết bị thích hợp. 2.5.4.3. Chiết bằng phương pháp ngấm kiệt Là phương pháp chiết liên tục trong đó dung môi được đi qua nguyên liệu theo một hướng nhất định, với một tốc độ nhất định. Quá trình hoà tan xảy ra trong phương pháp ngấm kiệt không giống nhau trong toàn bộ khối nguyên liệu mà theo gradient nồng độ, dung môi /dịch chiết đi từ nơi nguyên liệu có lượng hoạt chất thấp tới nơi có lượng hoạt chất cao hơn. Quá trình ngấm kiệt được tiến hành dưới nhiệt độ thường hay ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ phòng nhưng dưới nhiệt độ sôi của dung môi. Bình 28 chiết được thiết kế với bộ phận gia nhiệt và bảo ôn, dung môi được đưa vào bình ở nhiệt độ cao. 29 Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện 3.1.1. Thời gian Đề tài được tiến hành từ tháng 3 năm 2005 đến tháng 8 năm 2005. 3.1.2. Địa điểm Trung tâm nghiên cứu Linh chi và Nấm dược liệu – Công ty cổ phần dược liệu TW2 thành phố Hồ Chí Minh. Phòng vi sinh - Bộ môn Công Nghệ sinh Học - Trường đại học Nông Lâm TpHCM. 3.2. Nguyên liệu, dụng cụ, thiết bị, hoá chất 3.2.1. Nguyên liệu Nấm vân chi đen Trametes versicolor có nguồn gốc từ Trung Quốc do Trung tâm nghiên cứu Linh chi và nấm dược liệu thuộc Công ty cổ phần Dược Liệu TW2 TpHCM cung cấp. 3.2.2. Hoá chất, môi trường sử dụng 3.2.2.1.Hoá chất: Cồn 96oC, Vôi bột, Urea, DAP (diamon phosphat), SA (sulphat amon), Nitrate canxi, supe lân, NPK 20-20-15, Dynamic lifter. 3.2.2.2. Các môi trường sử dụng a. Môi trường PSA (Potato saccharose agar) [2] Khoai tây : 200g Saccharose : 20g Agar : 20g Nước cất cho đủ : 1000ml 30 b. Môi trường bán tổng hợp - BTH (Khoai tây - muối khoáng) [2] Khoai tây : 200g Saccharose : 20g KH2PO4 : 3g MgSO4 : 1,5g Agar : 20g Nước cất vừa đủ : 1000ml c. Môi trường Crapek [2] Saccharose : 30g NaNO3 : 3g KH2PO4 : 1g MgSO4 : 0,5g KCl : 0,5g FeSO4 : 0,01g Agar : 20g Nước cất vừa đủ : 1000ml d. Môi trường dinh dưỡng bổ sung Nước chiết giá: 100g giá đậu + nước  xay nhuyễn  lọc bỏ bã và bổ sung nước cho đủ để tạo 1 lít dung dịch nước chiết giá. Nước chiết bắp: 100g bắp xay + nước  nấu chín  lọc bỏ bã và bổ sung nước cho đủ để tạo 1 lít dung dịch nước chiết bắp. Nước chiết khoai tây: khoai tây (200g) gọt vỏ, rủa sạch, cắt sợi, nấu và lọc lấy nước chiết + nước cất để tạo dung dịch nước khoai tây 1 lít. e. Môi trường nhân giống cấp hai Môi trường hạt: Chọn loại lúa gạo tốt, ngâm nước 24 giờ, nấu vừa nứt vỏ trấu, vớt ra để ráo, bổ sung lớp cám bắp 5%. Phân lúa vào các chai thuỷ tinh không quá 2/3 thể tích. Hấp khử trùng bằng hơi nước nóng ở 121oC trong 2 giờ. Để nguội 24 giờ cấy giống gốc từ môi trường thạch, nuôi ủ ở nhiệt độ phòng (30 ± 2oC) để tạo giống trung gian. Môi trường bắp xay: Bắp xay nấu cho nở và bổ sung các thành phần dinh dưỡng. 31 Môi trường mùn cưa: Mùn cưa cao su khô còn tốt trộn với vôi bột 1%, bổ sung nước, ủ qua đêm và tạo độ ẩm môi trường khoảng 60%. Bảng 3.1: Hàm lượng khoáng đa lượng cơ bản trong mùn cưa (%)[11] Cơ chất Nguyên tố Mùn cưa gỗ cao su Mùn cưa gỗ lim Mùn cưa gỗ tạp N 1,68 ± 0,20 1,02 ± 0,20 1,27 ± 0,20 P 0,48 ± 0,04 0,37 ± 0,03 0,43 ± 0,06 K 1,18 ± 0,05 0,73 ± 0,04 0,77 ± 0,05 Ca 0,12 ± 0,03 0,15 ± 0,05 0,23 ± 0,06 Mg 0,04 ± 0,01 0,03 ± 0,01 0,03 ± 0,01 Bảng 3.2: Hàm lượng khoáng đa lượng cơ bản trong các loại bột (%) [11] Bột Nguyên tố Cám gạo Cám bắp Bột bã đậu phộng N 3,64 ± 0,70 3,08 ± 0,46 8,86 ± 0,54 P 1,37 ± 0,31 1,92 ± 0,22 0,88 ± 0,41 K 0,65 ± 0,16 0,24 ± 0,14 0,72 ± 0,18 Bảng 3.3: Hàm lượng khoáng trong nước dừa (Vanderberlt, 1954) Nguyên tố Hàm lượng (µg/100ml) Nguyên tố Hàm lượng (µg/100ml) K 3,12 Fe 0,01 Ca 1,50 Cu 0,04 Na 2,09 S 3,40 Mg 3,00 P 3,70 3.2.3. Dụng cụ, thiết bị Các dụng cụ, thiết bị cần sử dụng: đĩa petri, bình tam giác, chai thuỷ tinh, giấy lọc, máy đo pH, tủ ủ, cân điện tử, tủ sấy, nồi hấp autoclave, tủ cấy. 32 3.3. Phương pháp tiến hành thí nghiệm 3.3.1. Quan sát hình thái giải phẫu quả thể nấm vân chi 3.3.1.1 Hình thái cấu tạo quả thể Quan sát hình dạng quả thể, cấu tạo quả thể hoàn chỉnh, thân nấm và lớp bào tầng, cấu trúc cắt ngang quả thể, chụp hình. Quan sát hệ sợi trên quả thể dưới kính hiển vi vật kính X40 và chụp hình. 3.3.1.2. Hệ sợi tơ thứ cấp Lấy mẫu hệ sợi lan trên môi trường thạch cho lên mặt lame, không nhuộm màu mẫu, dùng lamelle đè nhẹ, quan sát dưới kính hiển vi vật kính X40, quan sát hình dạng hệ sợi, vách ngăn ngang, mấu liên kết và sau đó chụp hình. 3.3.1.3. Đảm và đảm bào tử Lấy cốc thuỷ tinh có đựng nước (không đầy đến miệng cốc), đặt quả thể nấm lên trên (quả thể nấm phải lớn hơn đường kính cốc) hướng lớp bào tầng về phía miệng cốc, để nơi kín gió. Sau 1 – 2 ngày, lấy bào tử có trong cốc, quan sát dưới kính hiển vi vật kính X40 và chụp hình. 3.3.2. Khảo sát đặc điểm dinh dưỡng, sinh lý của hệ sợi nấm vân chi trên môi trường thạch 3.3.2.1. Khảo sát tốc độ lan của hệ sợi trên các môi trường dinh dưỡng khác nhau Thí nghiệm được tiến hành trên 5 môi trường với thành phần dinh dưỡng khác nhau. 9 Môi trường 1: PGA 9 Môi trường 2: Bán tổng hợp (Khoai tây - muối khoáng) 9 Môi trường 3: Crapek 9 Môi trường 4: PGA + 10% nước dừa 9 Môi trường 5: PGA + 10% nước chiết giá Tất cả các môi trường đều được hấp khử trùng 121oC/ 30phút, để nguội 50 – 55oC và đổ vào đĩa petri vô trùng. Mỗi môi trường đổ 10 đĩa. Sau 24h, cấy vào mỗi đĩa 1 hạt lúa từ môi trường nhân giống cấp hai (môi trường hạt). Tiến hành ủ ở nhiệt độ 33 phòng (30 ± 2oC). Ba ngày sau khi cấy, bắt đầu tiến hành đo đường kính hệ sợi lan theo thời gian. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. 3.3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ Môi trường sử dụng là môi trường bán tổng hợp – BTH (khoai tây - muối khoáng). Khử trùng môi trường 121oC/ 30 phút sau đó đổ vào đĩa petri vô trùng (mỗi môi trường đổ 10 đĩa). Sau 24h, cấy vào mỗi đĩa một hạt lúa từ môi trường hạt. Tiến hành ủ ở hai mức nhiệt độ 27 ± 2oC và nhiệt độ phòng (30 ± 2oC). Sau 3 ngày tiến hành thu thập số liệu. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. 3.3.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của pH Môi trường dùng làm thí nghiệm là môi trường bán tổng hợp – BTH (khoai tây - muối khoáng), điều chỉnh về các pH khác nhau: 5; 5,5; 6; 6,5; 7. Điều chỉnh pH acid dùng dung dịch HCl 1M và pH kiềm dùng NaOH 1M. Khử trùng môi trường 121oC/ 30 phút, mỗi thí nghiệm đổ 10 đĩa, sau 24h cấy giống. Ủ nhiệt độ phòng (30 ± 2oC). Bắt đầu đo và thu thập số liệu sau 3 ngày. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. 3.3.3. Khảo sát môi trường nhân giống cấp hai Thí nghiệm được tiến hành trên các môi trường có bổ sung thành phần dinh dường khác nhau để tìm môi trường nhân giống cấp hai tối ưu. 9 MT 1: Lúa 90% Mùn cưa 5% Cám gạo 5% 9 MT 2: Lúa 90% Mùn cưa 5% Cám bắp 5% 9 MT 3: Lúa 80% Mùn cưa 5% Bắp xay 15% 9 MT 4: Bắp xay 50% Cám gạo 25% Mùn cưa 25% 34 9 MT 5: Bắp xay 50% Mùn cưa 25% Đậu xanh 25% 9 MT 6: Bắp xay 50% Mùn cưa 50% 9 MT 7: Mùn cưa 50% Cám gạo 50% (NH4)2SO4 0,2% 9 MT 8: Mùn cưa 50% Cám gạo 50% Urea 0,1% 9 MT 9: Mùn cưa 50% Cám bắp 50% Tất cả các môi trường đều được bổ sung nước để tạo ẩm độ (khoảng 60%) cho hệ sợi nấm phát triển. Mỗi môi trường phân vào 10 ống nghiệm, hấp khử trùng bằng hơi nước nóng 121oC/2 giờ. Sau 24 giờ cấy giống từ môi trưòng hạt, ủ ở nhiệt độ phòng (khoảng 30 ± 2oC). Tiến hành đo và thu thập số liệu sau 4, 6, 8, 10 và 12 ngày. Thí nghiệm được bố trí 3 lần lặp lại. Các chỉ tiêu theo dõi, quan sát. - Tốc độ tăng trưởng của hệ sợi qua các ngày 4, 6, 8, 10, 12 ngày sau khi cấy. - Màu sắc hệ sợi trên ống nghiệm. 3.3.4. Khảo sát môi trường nuôi trồng ra quả thể Thử nghiệm khả năng cho quả thể trên các môi trường sau: 9 MT 1: Mùn cưa + Cám gạo 5% + Urea 0,25% 9 MT 2: Mùn cưa + Cám gạo 5% + Urea 0,25% + DAP 0,25% 9 MT 3: Mùn cưa + cám gạo 5% + SA 0,5% + DAP 0,25% 9 MT 4: Mùn cưa + Cám gạo 5% + Nitrate Canxi 0,5% + DAP 0,25% 9 MT 5: Mùn cưa + Cám gạo 5% + NPK 20-20-15 0,5% 9 MT 6: Mùn cưa + Cám gạo 10% 9 MT 7: Mùn cưa + Cám bắp 10% 9 MT 8: Mùn cưa + Cám gạo 5% + Supe lân 0,5% + Urea 0,25% 35 9 MT 9: Mùn cưa + Urea 0,25% + DAP 0,25% 9 MT 10: Mùn cưa + Cám 5% + Dynamic lifter 0,25% Môi trường mùn cưa sau khi trộn vôi 1%, ủ qua đêm, được bổ sung chất dinh dưỡng khác nhau và cho vào bịch polypropylen. Mỗi bịch nặng 600g và có ẩm độ 65%. Mỗi công thức cho vào 10 bịch, hấp khủ trùng bằng hơi nước nóng ở 121oC/2 giờ. Sau 24 giờ, để cho các bịch môi trường thật nguội và cấy giống từ môi trường lúa. Ủ ở nhiệt độ phòng, theo dõi thời gian xuất hiện hệ sợi nấm trên các bịch môi trường và thời gian xuất hiện tai nấm ở các nghiệm thức. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. 3.3.5. Khảo sát khả năng tạo sinh khối trên môi trường lỏng Các môi trường thí nghiệm là môi trường lỏng không có agar. TN 1: Thử nghiệm trên 3 loại môi trường với thành phần dinh dưỡng khác nhau 9 Môi trường tự nhiên: PS (khoai tây + đường) 9 Môi trường bán tổng hợp (BTH): khoai tây + muối khoáng + đường 9 Môi trường tổng hợp: Crapek Mục đích thí nghiệm: dựa trên lượng sinh khối thu được từ các môi trường trong TN1, chọn môi trường có lượng sinh khối nhiều nhất để làm đối chứng cho TN2. TN 2: Thử nghiệm trên các môi trường được bổ sung các nguồn dinh dưỡng tự nhiên MT 1: PS + 5% Nước chiết bắp MT 2: PS + 10% Nước chiết bắp MT 3: PS + 15% Nước chiết bắp MT 4: PS + 5% Nước chiết giá MT 5: PS + 10% Nước chiết giá MT 6: PS + 15% Nước chiết giá MT 7: PS + 5% Nước dừa MT 8: PS + 10% Nước dừa MT 9: PS + 15% Nước dừa MTĐC: MT TN1 Cho 50ml môi trường vào chai thuỷ tinh (250ml hay 500ml). Mỗi môi trường thực hiện 10 chai, hấp khử trùng bằng hơi nước nóng ở 121oC/30phút. Để nguội một 36 ngày, cấy giống từ môi trường lúa, mỗi chai môi trường cấy một hạt lúa. Ủ ở nhiệt độ phòng (30 ± 2oC), tiến hành thu và cân sinh khối sau 5, 10, 15 ngày. Xử lý số liệu để chọn ra môi trường tạo sinh khối nhiều nhất. 3.3.6. Định lượng polysaccharide thô ly trích từ nấm vân chi đen Trametes versicolor Sinh khối thu được từ TN1 và TN2  sấy ở 45oC đến khối lượng không đổi  xay nhuyễn  cân P(g)  ly trích  lọc trên giấy đã cân bì  sấy khô ở 45oC  định lượng. So sánh tỉ lệ hợp chất polysaccharide thô thu được giữa các nghiệm thức. So sánh tỉ lệ polysaccharide thô trích từ hệ sợi và quả thể nấm vân chi. 9 Sinh khối lấy từ môi trường BTH  sấy khô  xay nhuyễn  cân P(g)  ly trích l định lượng. 9 Quả thể nấm  sấy khô  xay nhuyễn  cân P(g)  ly trích l định lượng. 37 Bột nấm P(g) -Nguyên liệu : nước = 1:35 – 40 -Đun cách thuỷ 60 phút -Lọc Dịch chiết lần 1 Bã lần 1 -Nguyên liệu : nước = 1:10 -Cách thuỷ 60 phút -Lọc Dịch chiết lần 2 Bã lần 2 -Nguyên liệu : nước = 1:10 -Đun cách thuỷ 60 phút -Lọc Dịch chiết lần 3 Bã lần 3 Dịch chiết vân chi -Cô cách thuỷ Cao nước -Tủa bằng cồn 96o -Lọc tủa Polysaccharide thô Sơ đồ 3.2: Quy trình ly trích hợp chất thô từ nấm vân chi [16], [20] 38 3.4. Phương pháp xử lý số liệu Số liệu được xử lý theo phương pháp xác suất thống kê dựa trên cơ sở phân tích dữ liệu khoa học bằng chương trình MS-EXCEL Trung bình mỗi mẫu: Xtb = n Xi Xi: trị số của mẫu N: số lượng mẫu Phương sai của nghiệm thức S2 S2 = 2 1 1 )( − −∑ = n XtbXi n i Độ lệch chuẩn của nghiệm thức: độ lệch chuẩn của mẫu là S. Độ lệch chuẩn nói lên mức độ chêch lệch giữa các số liệu. Số liệu càng rời rạc thì độ lệch chuẩn càng lớn; ngược lại số liệu càng tập trung thì độ lệch chuẩn càng nhỏ. S = 2S 95% các giá trị thống kê được của các môi trường sẽ nằm trong khoảng: Xtb ± S Tốc độ lan hệ sợi trung bình của mỗi nghiệm thức (N) N = k Xtb k: số ngày tơ lan Phần mềm Statgraphics Vers 7.0 Sử dụng phần mềm này để xác định sự khác biệt giữa các giá trị thu nhận được của các nghiệm thức thí nghiệm ở mức α = 0,05 hay LSD (95%) (Least Significant Difference). 9 Hai nghiệm thức có trung bình cách nhau một khoảng nhỏ hơn LSD (95%) thì xem như không khác nhau ở mức α = 0,05. 9 Ngược lại, nếu trung bình của hai nghiệm thức cách nhau một khoảng lớn hơn LSD (95%) thì xem như hai mẫu khác nhau ở mức α = 0,05. 39 Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Quan sát hình thái giải phẫu 4.1.1. Hình thái cấu tạo quả thể Hình 4.1: Quả thể nấm Vân chi đen Trametes versicolor (theo chiều từ trên xuống, trái qua phải: Hình 4.1a, Hình 4.1b, Hình 4.1c, Hình 4.1d ) 9 Hình 4.1a: Mặt trên nấm vân chi với những đường đồng tâm màu xám tro, nâu đen đến đen 9 Hình 4.1b: Quả thể nấm vân chi gồm nhiều lớp đan xen nhau 9 Hình 4.1c: Quả thể nâm vân chi cắt ngang 9 Hình 4.1d: Mặt dưới tai nấm vân chi Quả thể vân chi khi non mọc thành từng u lồi tròn màu trắng, trắng kem hay hơi ngã màu nâu, càng lớn sẽ xuất hiện dạng vành gồm nhiều lớp đan xen chồng chất lên nhau như ngói lợp. Mủ nấm hình quạt, cứng mỏng. Mép mủ mỏng, sắc cạnh, nguyên hay xẻ thuỳ sâu nông không theo quy luật. Mặt trên tai nấm có lớp lông mịn, dày, ngắn khoảng 0,3 – 0,5 mm. Lớp lông mịn này tạo thành nhiều đường đồng tâm có màu sắc thay đổi từ đen, nâu đen, xám tro đến nâu đất. Càng ra phía ngoài mép tán, màu sắc của các đường đồng tâm càng nhạt, càng ngã sang nâu nhiều hơn đen, mép tán có lớp 40 lông mịn màu trắng hay hơi vàng nâu. Tuy nhiên ở những vùng tán nấm nhận ít ánh sáng thì có màu vàng nâu, màu nâu, tương tự những tán nằm phía dưới cũng xuất hiện màu nâu nhiều hơn. Mặt dưới tai nấm là lớp bào tầng màu trắng - trắng kem có nhiều lỗ nhỏ. Miệng lỗ nguyên, có dạng gần tròn hay oval. Phần thịt nấm mỏng, màu trắng, trắng kem, dày 1 – 2 mm. Hệ sợi trong phần thịt nấm rất dai, bện kết chặt với nhau, quan sát thấy có hai loại sợi: 9 Sợi cứng vách dày 1,5 – 2,7 µm, thẳng, trong suốt, không có vách ngăn ngang, đường kính 3 – 6,5 µm, rất ít khi phân nhánh. 9 Sợi bện ngắn, ngoằn ngoèo, phân nhánh rất rõ, đường kính 2 – 4 µm, vách dày 0,7 – 1,7 µm. Hình 4.2: Hệ sợi trích từ quả thể nấm vân chi 4.1.2. Hình thái cấu tạo hệ sợi hệ sợi thứ cấp Nấm Vân chi Trametes versicolor xuất hiện 3 loại hệ sợi. Khi quan sát hiển vi không nhuộm màu, cả 3 loại sợi đều không màu, trong suốt. Sợi dinh dưỡng có vách tế bào dày 0,34 – 0,6 µm, vách ngăn ngang mỏng, đường kính 2,7 – 4,4 µm, không phân nhánh hoặc ít phân nhánh. Sợi bện có vách tế bào dày hơn sợi dinh dưỡng, không có vách ngăn ngang, phân nhánh nhiều, đường kính 2,5 – 4,5 µm. Sợi cứng ở vùng thịt nấm có vách dày chiếm gần 2/3 đường kính, không có vách ngăn ngang, không phân nhánh, có đường kính 3,4 – 6,1 µm. 41 a b c Hình 4.3: Hệ sợi vân chi lấy từ môi trường thạch a: Sợi dinh dưỡng; b: Sợi cứng; c: Sợi bện 4.1.3. Đảm và bào tử đảm Không quan sát được đảm, chỉ quan sát được bào tử đảm. Bào tử đảm trong suốt, nhẵn, thon dài hơi cong giống hình quả dưa gang, vách mỏng, có đường kính 1,7 – 2,4 µm, chiều dài 3,4 – 5,1 µm. 42 Hình 4.4: Bào tử nấm vân chi 4.2. Khảo sát đặc điểm dinh dưỡng, sinh lý của hệ sợi nấm vân chi trên môi trường thạch 4.2.1. Khảo sát đường kính tăng trưởng của hệ sợi trên các môi trường dinh dưỡng khác nhau Kết quả đo đường kính hệ sợi lan trên 5 môi trường thạch dinh dưỡng khác nhau được trình bày ở Bảng 4.1 Bảng 4.1: Đường kính hệ sợi lan trên 5 môi trường theo thời gian Đường kính hệ sợi lan (mm) Thời gian (ngày) MT1 MT2 MT3 MT4 MT5 3 39,82 ± 3,90 27,63 ± 1,19 37,76 ± 0,98 41,31 ± 1,54 39,57 ± 2,51 4 62,15 ± 3,24 45,42 ± 0,58 59,56 ± 3,00 65,58 ± 1,62 60,57 ± 0,33 5 79,24 ± 0,24 60,22 ± 0,67 78,11 ± 3,10 82,81 ± 1,35 78,79 ± 2,75 0 20 40 60 80 100 1 2 3 4 5 Môi trường m m 3N 4N 5N Biểu đồ 4.1: Biểu diễn đường kính hệ sợi lan trên 5 môi trường dinh dưỡng theo thời gian 43 Quan sát hệ sợi lan đến ngày thứ 5 nhận thấy: Trên MT2, hệ sợi lan chậm và lan thưa nhất, mức độ tập trung hệ sợi mỏng, đường kính tăng trưởng có sự sai khác đối với tất cả các môi trường còn lại; ở MT4 (môi trường PSA có bổ sung nước dừa), hệ sợi lan nhanh nhất do trong nước dừa có một số khoáng cần thiết và một số loại vitamin có tác dụng kích thích sự tăng trưởng hệ sợi nấm, nhưng so về mặt thống kế không có sự sai khác có ý nghĩa giữa đường kính hệ sợi lan trên MT4 với MT1, MT4 với MT5, nhưng có sự sai khác giữa MT4 với MT3 (môi trường PSA có bổ sung khoáng chất tổng hợp). Tuy nhiên ở MT3, hệ sợi mọc dày nhất, xuất hiện sắc tố sớm hơn các môi trường còn lại. Thời gian hệ sợi bắt đầu xuất hiện sắc tố (màu nâu vàng hay nâu đen) là khoảng 6 – 8 ngày sau khi cấy và càng để lâu hệ sợi càng dai. Như vậy, để nhân giống hiệu quả, MT4 (gồm khoai tây + 10% nước dừa + đường) là môi trường thích hợp nhất và thời gian nhân giống tốt nhất là khoảng 6 – 8 ngày sau khi cấy. Hình 4.5: Đường kính hệ sợi tăng trưởng trên các môi trường dinh dưỡng sau 4 ngày cấy 44 4.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ Kết quả đo đường kính hệ sợi lan trên môi trường BTH ở hai mức nhiệt độ được trình bày ở Bảng 4.2. Bảng 4.2: Đường kính hệ sợi lan trên môi trường BTH ở hai mức nhiệt độ theo thời gian Đường kính hệ sợi lan (mm) Thời gian (ngày) 30oC 27oC 3 37,76 ± 2,98 33,46 ± 3,66 4 59,56 ± 3,00 52,18 ± 3,16 5 78,11 ± 3,10 72,26 ± 1,89 0 20 40 60 80 100 30 27 Nhiệt độ (oC) m m 3N 4N 5N Biểu đồ 4.2: Biểu diễn đường kính hệ sợi nấm vân chi lan trên môi trường BTH ở nhiệt độ 27oC và 30oC theo thời gian Đường kính hệ sợi lan ở nhiệt độ phòng (30 ± 2oC) lớn hơn ở nhiệt độ mát (27 ± 2oC) về mặt thống kê có sự sai khác có ý nghĩa. Vì đây là loài nấm có nguồn gốc từ Trung Quốc nên có thể nhiệt độ thích hợp cho sự hình thành quả thể là thấp, nhưng khi quan sát trên môi trường thạch thì khác, ở nhiệt độ phòng hệ sợi vẫn phát triển tốt. Do đó khi phân lập hay nhân giống chỉ cần để ở nhiệt độ phòng cũng đạt được năng suất mong muốn. 45 Hình 4.6: Đường kính hệ sợi lan trên môi trường BTH ở 27oC và 30oC vào ngày thứ 4 4.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của pH Số liệu thu thập trong 5 ngày đo đường kính của hệ sợi nấm vân chi lan trên môi trường BTH ở các pH khác nhau được trình bày trong Bảng 4.3. Bảng 4.3: Đường kính hệ sợi lan trên môi trường BTH ở các pH khác nhau theo thời gian Đường kính hệ sợi lan (mm) Thời gian (ngày) pH7 pH6,5 pH6 pH5,5 pH5 3 24,93 ± 2,17 30,60 ± 3,03 33,06 ± 3,59 35,21 ± 3,29 36,15 ± 3,20 4 37,50 ± 2,32 46,88 ± 2,81 53,10 ± 2,64 57,38 ± 4,26 57,61 ± 3,22 5 49,15 ± 2,06 61,18 ± 2,00 70,10 ± 3,71 75,64 ± 3,22 74,38 ± 3,27 0 20 40 60 80 7 6,5 6 5,5 5 pH m m 3N 4N 5N Biểu đồ 4.3: Biểu diễn đường kính hệ sợi lan trên môi trường BTH ở các pH khác nhau theo thời gian 46 Phân tích số liệu nhận xét thấy, ở pH 5,5 hệ sợi nấm vân chi lan nhanh, dày, đều, có đường kính tăng trưởng lớn nhất; tuy nhiên tốc độ lan ở pH 5 và pH 5,5 không có sự khác biệt về mặt thống kê; ở pH 7 hệ sợi lan chậm nhất, khác biệt so với tất cả pH còn lại. pH càng cao khả năng lan của hệ sợi càng chậm, khi vượt quá pH 9 thì hệ sợi có thể chết [3]. Vậy trong nhân giống cấp một cần điều chỉnh pH môi trường nằm trong khoảng 5 – 5,5. Hình 4.7: Đường kính hê sợi lan trên môi trường BTH ở các pH vào ngày thứ 4 4.3. Khảo sát môi trường nhân giống cấp hai (môi trường hạt) Kết quả đo chiều dài hệ sợi lan trên các môi trường nhân giống cấp hai được thể hiện ở Bảng 4.4 Bảng 4.4: Chiều dài hệ sợi lan trên các môi trường nhân giống cấp hai Chiều dài hệ sợi lan (mm) Môi trường Ngày thứ 4 Ngày thứ 6 Ngày thứ 8 Ngày thứ 10 Ngày thứ 12 1 40,33 ± 3,18 57,14 ± 3,20 73,86 ± 3,05 85,28 ± 3,75 92,94 ± 4,07 2 39,61 ± 2,37 57,56 ± 1,90 74,19 ± 2,16 88,42 ± 0,52 102,17±0,44 3 37,08 ± 1,10 52,56 ± 0,77 68,44 ± 0,38 82,33 ± 0,67 94,92 ± 1,37 4 33,61 ± 3,13 47,46 ± 3,50 63,31 ± 2,16 73,11 ± 2,50 82,06 ± 3,00 5 38,08 ± 1,72 55,97 ± 1,89 73,56 ± 1,50 88,36 ± 2,29 100,92±1,91 6 34,92 ± 2,17 50,50 ± 2,68 66,78 ± 1,58 79,42 ± 1,88 94,39 ± 1,64 7 35,11 ± 1,90 47,11 ± 3,36 60,31 ± 4,04 70,31 ± 4,89 77,89 ± 4,01 8 33,50 ± 3,66 45,39 ± 3,62 58,28 ± 2,61 67,67 ± 4,06 75,42 ± 3,64 9 37,92 ± 1,91 53,75 ± 2,27 70,58 ± 2,48 83,39 ± 2,64 92,14 ± 2,66 47 0 20 40 60 80 100 120 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Môi trường m m 4N 6N 8N 10N 12N Biểu đồ 4.4: Biểu diễn chiều dài hệ sợi lan trên các môi trường nhân giống cấp hai Kết quả sau 12 ngày đo cho thấy: hệ sợi lan trên các môi trường lúa, bắp xay có bổ sung dinh dưỡng tốt hơn lan trên các môi trường mùn cưa. Hệ sợi ở các môi trường lúa và trên môi trường bắp xay lan nhanh, dày, màu trắng, bện kết chặt với nhau, còn trên môi trường mùn cưa, hệ sợi lan chậm hơn, mức độ tập trung hệ sợi thưa, khả năng bện kết yếu. Khi phân tích thống kê các số liệu thu thập được, MT8 là môi trường có hệ sợi lan chậm và yếu nhất, MT2 và MT5 là môi trường có hệ sợi lan nhanh, mạnh, dày, có chiều dài hệ sợi lan dài và khác biệt so với các môi trường còn lại. Vậy để đạt được năng suất cao trong nhân giống trung gian có thể chọn MT2 hoặc MT5; nhưng để nhân giống số lượng lớn phục vụ sản xuất, MT2 (Lúa, Mùn cưa, Cám bắp) tối ưu hơn MT5 (Bắp xay, Mùn cưa, Đậu xanh) vì giá thành MT2 kinh tế hơn, mức độ lan của hệ sợi đồng đều hơn và sự chêch lệch giữa các số liệu thu thập từ MT2 thấp hơn MT5. Trên các môi trường, hệ sợi bắt đầu xuất hiện sắc tố từ ngày thứ 15 sau khi cấy. Khi có sự xuất hiện sắc tố (màu vàng hay vàng nâu) thì hệ sợi bện chặt lại với nhau và rất dai. Do từ ngày thứ 15, hệ sợi bắt đầu già và dai, vậy nên tiến hành cấy chuyền hay cấy sang môi trường nuôi trồng tốt nhất là khi hệ sợi được 12 – 15 ngày tuổi. 48 Hình 4 .8: Hệ sợi lan trên các môi trường nhân giống trung gian sau 7 ngày cấy 4.4. Khảo sát môi trường nuôi trồng ra quả thể Các bịch môi trường sau khi cấy giống được ủ ở nhiệt độ phòng (29 ± 2oC). Qua quá trình quan sát sự xuất hiện hệ sợi nấm trên các môi trường nuôi trồng nhận thấy kết quả được thể hiện ở Bảng 4.5: Bảng 4.5: Tỉ lệ xuất hiện hệ sợi trên các môi trường nuôi trồng Tỉ lệ xuất hiện hệ sợi (%) Môi trường Ngày thứ 6 Ngày thứ 9 Ngày thứ 12 1 64,3 85,6 100 2 57,1 78,5 100 3 92,3 100 100 4 92,9 100 100 5 85,7 100 100 6 71,4 96,4 100 7 96,8 100 100 8 14,3 53,8 84,6 9 37,0 92,3 100 10 57,1 96 100 49 Như vậy về cơ bản đến ngày thứ 12 thì ở tất cả các môi trường thí nghiệm đều có sự hình thành hệ sợi, và tuỳ thuộc vào từng loại môi trường mà tốc độ hệ sợi lan ở mỗi nghiệm thức có sự khác nhau. Tiến hành quan sát tiếp sự phát triển của hệ sợi nấm, nhận thấy sau 1 tháng, hệ sợi đã lan đầy bịch môi trường, hệ sợi lan chậm nhất ở MT8, nhanh nhất là ở MT3. Tỉ lệ hệ sợi lan kín bịch môi trường ở các công thức là: MT1 (94%), MT2 (85,4%), MT3 (98%), MT4 (69,2%), MT5 (65,1%), MT6 (80,4%), MT7 (74,1%), MT8 (36%), MT9 (47%), MT10 (57,1%). Nhưng ở MT6, MT7 có sự xuất hiện mầm quả thể đầu tiên sau 2,5 tháng nuôi trong điều kiện sản xuất tại Trung tâm nghiên cứu Linh chi và nấm dược liệu TpHCM. Ba tháng sau khi cấy, tất cả môi trường đều xuất hiện mầm quả thể, trong đó tỉ lệ nảy mầm của mỗi nghiệm thức lại có sự khác biệt nhau: MT1 (26,5%), MT2 (8,6%), MT3 (15,8%), MT4 (12,1%), MT5 (5,9%), MT6 (40,5%), MT7 (26,3%), MT8 (11,1%), MT9 (0%), MT10 (10,3%). Như vậy, MT6 (Mùn cưa + Cám gạo 10%) là môi trường có sự hình thành quả thể sớm và có tỉ lệ nảy mầm cao nhất. Do giới hạn về mặt thời gian và vì đây là giống mới, có nguồn gốc từ Trung Quốc chưa thích nghi tốt với điều kiện khí hậu ở Việt Nam, lượng nấm hình thành không nhiều và không đồng đều giữa các nghiệm thức nên không thể tiến hành thu hái tai nấm và định lượng để xác định môi trường cho quả thể nhiều nhất. Thí nghiệm chỉ dừng ở mức quan sát môi trường có sự hình thành hệ sợi và xuất hiện mầm sớm nhất. 4.5. Khảo sát khả năng tạo sinh khối trên môi trường lỏng TN1: Khảo sát khả năng tạo sinh khối nấm vân chi trên 3 loại môi trường dinh dưỡng khác nhau Sinh khối thu được từ 3 loại môi trường nuôi cấy lỏng được trình bày ở Bảng 4.6 Bảng 4.6: Sinh khối nấm vân chi trên môi 3 trường lỏng Sinh khối (gam) Thời gian (ngày) PS BTH CRAPEK 5 0,0195 ± 0,0068 0,0713 ± 0,0185 0,0059 ± 0,0010 10 0,1289 ± 0,0007 0,2350 ± 0,0290 0,0241 ± 0,0046 15 0,2101 ± 0,0042 0,4323 ± 0,0375 0,0459 ± 0,0047 50 0,2101 0,0459 0,4323 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 PS CRA BTH Môi trường Si nh k hố i ( g) 5N 10N 15N Biểu đồ 4.5: Biểu diễn sinh khối nấm vân chi được tạo ra trên 3 môi trường Ba môi trường bổ sung với các thành phần dinh dưỡng khác nhau có sự khác biệt từng đôi một về khả năng tạo sinh khối, sinh khối nấm phát triển mạnh nhất ở môi trường khoai tây có bổ sung hoá chất tổng hợp (BTH), trên môi trường Crapek (gồm toàn hoá chất tổng hợp không có nguồn dinh dưỡng tự nhiên) hệ sợi tăng trưởng chậm nhất, sinh khối tạo ra ít, không thích hợp để nuôi lấy sinh khối. Vậy để tạo lượng sinh khối lớn trong sản xuất, có thể sử dụng môi trường BTH (nước chiết khoai tây + khoáng tổng hợp). Hình 4.9: Sinh khối nấm vân chi trong 3 môi trường lỏng 51 TN2: Thử nghiệm khả năng tạo sinh khối trên các môi trường dinh dưỡng tự nhiên Lượng sinh khối thu được từ 10 môi trường trong TN2 được trình bày ở Bảng 4.7 Bảng 4.7: Sinh khối vân chi trên các môi trường bổ sung dinh dưỡng tự nhiên Sinh khối nấm vân chi (gam) Môi trường 5 ngày 10 ngày 15 ngày 1 0,0274 ± 0,0173 0,1153 ± 0,0115 0,1581 ± 0,0092 2 0,0259 ± 0,0066 0,1330 ± 0,0226 0,2276 ± 0,0188 3 0,0361 ± 0,0101 0,1419 ± 0,0161 0,2433 ± 0,0156 4 0,0359 ± 0,0046 0,1141 ± 0,0089 0,1973 ± 0,0173 5 0,0338 ± 0,0050 0,1204 ± 0,0138 0,2047 ± 0,0181 6 0,0290 ± 0,0040 0,1474 ± 0,0030 0,2074 ± 0,0133 7 0,2074 ± 0,0133 0,1234 ± 0,0029 0,3402 ± 0,0156 8 0,0142 ± 0,0049 0,1293 ± 0,0083 0,2332 ± 0,0164 9 0,0320 ± 0,0040 0,1248 ± 0,0155 0,2289 ± 0,0130 10 0,0713 ± 0,0185 0,2348 ± 0,0290 0,4323 ± 0,0375 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 0,45 0,5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Môi trường ga m 5N 10N 15N Biểu đồ 4.6: Biểu diễn lượng sinh khối trong các môi trường có bổ sung thành phần dinh dưỡng tự nhiên 52 Kết quả cho thấy sự tích luỹ sinh khối có sự khác nhau trên các môi trường thí nghiệm. Trong tất cả các ngày thu hoạch (5, 10, 15 ngày), sinh khối tạo ra trên MT10 (môi trường khoai tây + muối khoáng) đều cao nhất (vào ngày thứ 15, lượng sinh khối thu được trên MT10 lớn hơn MT3 1,78 lần; cao hơn MT6 2,08 lần; hơn MT7 1,27 lần). Từ kết quả thu nhận cho thấy lượng hoá chất tổng hợp bổ sung (KH2PO4, MgSO4, Peptone) có tác dụng tích cực thúc đẩy quá trình tăng trưởng hệ sợi hơn các nguồn dinh dưỡng bổ sung tự nhiên (nước chiết bắp, nước chiết giá đậu, nước dừa). Khi xét đến hiệu quả của từng nguồn dinh dưỡng bổ sung, nhận thấy có kết quả như sau: sinh khối tạo ra trong môi trường PS có bổ sung nước bắp với các nồng độ khác nhau có sự sai khác có ý nghĩa, môi trường có bổ sung nước chiết bắp 15% có sinh khối cao hơn các nồng độ bổ sung khác (5% và 10%), như vậy lượng nước bắp bổ sung có ảnh hưởng đến lượng sinh khối tạo ra, nồng độ bổ sung càng cao cho lượng sinh khối tạo ra càng nhiều. Môi trường PS có bổ sung nước chiết giá đậu với các nồng độ khác nhau (5%, 10%, 15%) cho lượng sinh khối tạo ra không có sự khác biệt về mặt thống kê, do vậy nồng độ nước chiết giá bổ sung không ảnh hưởng đến lượng sinh khối tạo ra. Trong khi môi trường PS có bổ sung nước dừa có sự khác biệt rõ rệt giữa các nồng độ bổ sung. Lượng nước dừa bổ sung ở nồng độ 5% cho lượng sinh khối cao nhất, khác biết có ý nghĩa so với hai nồng độ bổ sung 10% và 15%. Sinh khối thu được từ hai môi trường có bổ sung 10% và 15% nước dừa thì tương đương nhau, không có sự sai khác. Như vậy, MT10 – môi trường BTH (khoai tây muối khoáng) là môi trường thích hợp nhất được sử dụng trong nuôi cấy để thu nhận sinh khối nấm vân chi. 4.6. Định lượng hợp chất polysaccharide thô trích từ hệ sợi nấm vân chi TN1: Định lượng hợp chất polysaccharide thô trích từ sinh khối nấm vân chi thu được trên 3 môi trường PS, BTH, CRAPEK Kết quả trích ly hợp chất polysaccharide thô từ sinh khối nấm vân chi trên 3 môi trưởng lỏng được trình bày ở Bảng 4.8. Bảng 4.8: Tỉ lệ polysaccharide thô trích từ sinh khối thu được trên 3 môi trường PS(%) BTH (%) CRA (%) Lần 1 10,89 11,38 0 Lần 2 11,03 10,65 0 Lần 3 10,43 11,44 0 Tỉ lệ TB 10,76 11,16 0 53 10,78 11,16 0 0 2 4 6 8 10 12 PS BTH CRA Môi trường % p ol ys ac ch ar id e th ô Biểu đồ 4.7 : Biểu diễn tỉ lệ polysaccharide thô trích từ sinh khối thu được trên 3 môi trường lỏng Vì lượng sinh khối thu được từ môi trường Crapek rất ít nên không tiến hành trích và định lượng. Lượng polysaccharide thô trích từ sinh khối thu được trên môi trường PS và BTH cho tỉ lệ tương đương nhau, khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê. Về mặt kinh tế, nếu sử dụng sinh khối cho mục đích ly trích polysaccharide thô thì môi trường BTH là môi trường thích hợp nhất dùng trong nuôi cấy chìm hệ sợi. TN2: Định lượng hợp chất polysaccharide thô trích từ các môi trường PSA có bổ sung các nguồn dinh dưỡng khác nhau. Kết quả trích ly lượng polysaccharide thô từ sinh khối nấm vân chi thu được trong 10 môi trường nuôi cấy lỏng được thể hiện ở Bảng 4.9 Bảng 4.9: Tỉ lệ hợp chất polysacharide thô trích từ sinh khối nấm vân chi thu được trong 10 môi trường nuôi cấy lỏng Môi trường Tỉ lệ polysaccharide thô (%) 1 11,16 ± 0,63 2 11,65 ± 0,12 3 12,38 ± 0,43 4 11,68 ± 1,87 5 14,02 ± 1,53 6 14,55 ± 0,68 7 12,96 ± 1,86 8 21,75 ± 3,35 9 15,05 ± 2,62 10 11,16 ± 0,44 54 11,1611,65 12,3811,68 14,0214,55 12,96 21,75 15,05 11,16 0 5 10 15 20 25 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Môi trường % p ol ys ac ch ar id e th ô Biểu đồ 4.8: Biểu diễn tỉ lệ polysaccharide thô trích từ sinh khối hệ sợi nấm vân chi thu được trên 10 môi trường lỏng Trên sơ đồ biểu diễn, dễ dàng nhận thấy MT8 có tỉ lệ polysaccharide thô cao nhất, cao hơn môi trường đối chứng 1,95 lần, còn các môi trường còn lại tỉ lệ polysaccharide thô chiết được không sai khác hay mức độ sai khác không đáng kể. Trên môi trường PS có bổ sung nước chiết bắp với các nồng độ khác nhau cho tỉ lệ chiết không có khác biệt nhau, nhưng lượng nước chiết bắp bổ sung càng nhiều thì tỉ lệ polysaccharide thô chiết được càng cao. Trên môi trường có bổ sung nước giá, tỉ lệ polysaccharide thô thu được cao nhất là trong môi trường PS có bổ sung 15%, tuy nhiên tỉ lệ này không có sự sai khác so với nồng độ 10% nhưng sai khác với nồng độ 5%, vậy ở mức bổ sung 15% nước chiết giá cho tỉ lệ polysaccharide thô cao nhất và tỉ lệ không tăng nữa khi bổ sung nồng độ cao hơn. Môi trường PS bổ sung nước dừa với các nồng độ khác nhau có sự sai khác từng đôi một. Lượng polysaccharide thô cao nhất thu được từ sinh khối MT8. Trong khi MT10 (môi trường đối chứng), tuy có lượng sinh khối tạo ra cao nhưng tỉ lệ polysaccharide thô ly trích lại không cao hơn những công thức khác. Nếu tính ra khối lượng polysacchride thô thu được trong 1 lít môi trường nuôi cấy theo công thức: sinh khối ngày thứ 15 x tỉ lệ trích x (1000ml/50ml), thì lượng polysaccharide thô thu nhận được thể hiện trong Bảng 4.10 55 Bảng 4.10: Khối lượng polysaccharide thô trích được từ sinh khối nấm trong 1 lít môi trường Môi trường Khối lượng polysaccharide thô (mg/l) 1 353 2 530 3 602 4 461 5 574 6 603 7 882 8 1014 9 689 10 965 353 530 602 461 574 603 882 1014 689 965 0 200 400 600 800 1000 1200 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Môi trường po ly sa cc ha rid e th ô (m g/ l) Biểu đồ 4.9: Biểu diễn khối lượng polysaccharide thô trích được từ sinh khối nấm trong 1 lít môi trường Qua bảng phân tích, ta nhận thấy MT1, MT2, MT3 có sự gia tăng khối lượng polysacharide thô tỉ lệ thuận với nồng độ nước chiết bắp bổ sung. MT4, MT5, MT6 cũng có sự gia tăng khối lượng polysaccharide tỉ lệ thuận với nồng độ nước chiết bắp 56 bổ sung nhưng sự gia tăng này không đáng kể, do vậy nồng độ bổ sung 15% nước chiết giá được coi là tối ưu đối với các môi trường có bổ sung nước chiết giá dùng trong nuôi cấy lấy sinh khối ly trích hợp chất polysaccharide thô. Ở các môi trường có bổ sung nước dừa (MT7, MT8, MT9), có sự gia tăng khối lượng polysaccharide thô từ MT7 sang MT8 nhưng ở MT9 khối lượng có sự suy giảm, vậy môi trường có nồng độ bổ sung 10% nước dừa (MT8) là môi trường tối ưu cho khối lượng polysaccharide thô cao nhất (1014mg/l), cao hơn môi trường đối chứng – MT10 (965mg/l). Tuy lượng polysaccharide thô thu nhận từ MT8 cao hơn MT10 không nhiều, nhưng so về giá thành để tạo 1lít MT8 và 1lít MT10 thì MT8 là môi trường tốt nhất, thích hợp nhất được sử dụng với mục đích lấy hợp chất polysaccharide làm chất chống ung thư. TN3: Ảnh hưởng của nguồn nguyên liệu trích Kết quả trích ly hợp chất polysaccharide thô từ quả thể và hệ sợi nấm vân chi được trình bày ở Bảng 4.10 Bảng 4.11: Tỉ lệ polysaccharide thô chiết được từ các nguồn nguyên liệu khác nhau (%) QUẢ THỂ HỆ SỢI Lần1 7,36 11,38 Lần 2 7,92 10,65 Lần 3 7,78 11,44 Tỉ lệ TB (%) 7,69 11,16 7,69 11,16 0 2 4 6 8 10 12 Qthể Hsợi Nguyên liệu % po ly sa cc ha rid e th ô Biểu đồ 4.10: Biểu diễn tỉ lệ polysaccharide thô chiết được từ hai nguồn nguyên liệu khác nhau 57 Tỉ lệ polysaccharide thô chiết được từ quả thể nấm thấp hơn rất nhiều so với tỉ lệ từ hệ sợi. Do quả thể có vách tế bào cứng rắn và dày hơn, mức độ chia nhỏ nguyên liệu thấp hơn hệ sợi nên quá trình chiết xảy ra chậm và mức độ lôi kéo các chất chiết ra dung môi thấp do vậy tỉ lệ polysaccharide thô thu được từ quả thể thấp hơn hệ sợi. 58 Phần 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Nấm vân chi có tên khoa học là Trametes versicolor, là giống mới có nguồn gốc từ Trung Quốc. Môi trường nhân giống cấp một thích hợp: Môi trường PSA + 10% nước dừa pH thích hợp : 5,5 Nhiệt độ thích hợp cho hệ sợi tăng trưởng tốt: 30oC ± 2oC Môi trường nhân giống cấp hai thích hợp: Môi trường hạt gồm: Lúa 90%, Mùn cưa 5%, Cám bắp 5%. Môi trường tạo sinh khối tốt nhất là môi trường BTH (nước chiết khoai tây và muối khoáng). Môi trường nuôi cấy cho tỉ lệ hợp polysaccharide thô cao nhất là môi trường PSA + Nước dừa 10%. Vậy nuôi cấy với mục đích lấy polysaccharide làm dược phẩm hổ trợ trong điều trị ung thư thì môi trường PSA + Nước dừa 10% là môi trường thích hợp. Môi trường tạo quả thể thích hợp: Môi trường Mùn cưa + Vôi bột 0,25% + Cám gạo 10%. 5.2. Đề nghị Khảo sát nhiệt độ, ẩm độ thích hợp sau khi hệ sợi lan đầy bịch từ đó hoàn thiện quy trình nuôi trồng nấm vân chi đen Trametes versicolor, thuần hoá giống cho phù hợp với điều kiện tại TpHCM, ứng dụng trong sản xuất lớn. Để tiếp tục theo dõi lượng sinh khối và tỉ lệ polysaccharide chiết từu hệ sợi vân chi trên môi trường lỏng, cần thực hiện bổ sung thêm vài nồng độ nước chiết bắp cao hơn. Thực hiện giai đoạn sau ly trích hợp chất thô, thử nghiệm các phương pháp chiết xuất để tinh sạch hợp chất mong muốn. Thử nghiệm các chất có dược tính trích từ nấm trên các mẫu động vật bệnh in vitro. 59 Phần 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 1. Vũ Văn Chuyên, 1970. Thực vật học, tập 1. Nhà xuất bản Y học và Thể dục thể thao, Hà Nội. 2. Nguyễn Lân Dũng, 2002. Công nghệ nuôi trồng nấm, tập 1, tái bản lần thứ nhất. Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội. 3. Nguyễn Lân Dũng, 2002. Công nghệ nuôi trồng nấm, tập2, tái bản lần thứ nhất. Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội. 4. Phùng Võ Cẩm Hồng, 2003. Kỹ thuật phân tích, phòng phân tích hoá lý, Đại học Nông lâm TP Hồ Chí Minh. 5. Trần Hùng và CSV, 2004. Giáo trình Phương pháp nghiên cứu dược liệu, bộ môn dược liệu, Trương đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh. 6. Nguyễn Ngọc Kiểng, 2000. Giáo trình Toán-Thống kê sinh vât, Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh. 7. Trịnh Tam Kiệt, Võ Văn Chi, Trần Đình Nghĩa và Đặng Thị Sy, 1982. Thực tập phân loại học thực vật- thực vật bậc thấp. Nhà xuất bản Đại học và trung học chuyên nghiệp, Hà Nội. 8. Lê Văn Liễu, 1977. Một số nấm ăn được và nấm độc. Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội. 9. Trần Thị Ngọc Mỹ, 2004. Khảo sát khả năng nuôi trồng và định tính các hoạt chất có dược tính ở nấm vân chi (Trametes ochracea). Khoá luận tốt nghiệp Cử nhân Công nghệ Sinh học, Đại học Khoa học Tự nhiên, TP Hồ Chí Minh. 10. Nguyễn Phước Nhuận và CSV, 2001. Giáo trình Sinh hóa học, Đại học Nông lâm, TP Hồ Chí Minh. 11. Lê Xuân Thám, 1996. Nghiên cứu đặc điểm sinh học và đặc điểm hấp thụ khoáng Nấm Linh Chi Ganoderma lucidium (Leyss. exFr) Karst bằng phân tích hạt nhân, đánh dấu đồng vị và kỹ thuật liên hợp. Luận án Phó tiến sĩ khoa học Sinh học, Hà Nội. 12. Lê Xuân Thám, 1996. Nấm linh chi Ganoderma - Nguồn dược liệu quý ở Việt Nam. Nhà xuất bản Mũi Cà Mau 13. Lê Xuân Thám, 1999. Nấm trong công nghệ và chuyển hoá môi trường, Tập 1, Nấm hầu thủ Hericium erinaceum. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, TpHCM. 60 14. Lê Xuân Thám, Trần Hữu Độ, Tamikazu Kume, 1999. Bổ sung vào nhóm nấm chống ung thư ở Việt Nam: Nấm vân chi Trametes versicolor (L.:Fr) Pilát. Tạp chí dược học, số 2: tr 13-15. 15. Nguyễn Xuân Thắng, 2004. Hoá sinh học. Nhà xuất bản Y học, Hà Nội. 16. Phạm Thị Thanh Thảo, 2003. Nghiên cứu chế biến nước uống từ nấm Linh chi. Khoá luận tốt nghiệp Kỹ sư công nghệ thực phẩm, Đại học Bách khoa TP Hồ Chí Minh. 17. Dương Đức Tiến , Võ Văn Chi, 1978. Phân loại học thực vật - Thực vật bậc thấp. Nhã xuất bản đại học và trung học chuyên nghiệp, Hà Nội. 18. Hồ Sĩ Tráng, 2004. Cơ sơ hoá học gỗ và cellulose, Tập 2. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. 19. Cổ Đức Trọng, 2002. Nấm Vân chi một vị thuốc quý cần chú ý. Tạp chí thuốc và Sức khoẻ, số 214: tr 14-15, Nhà xuất bản Khoa học TP Hồ Chí Minh. 20. Lê Thị Tuyết Vân, 2004. Tiêu chuẩn hoá nấm Vân chi Trametes versicolor (L.:Fr) Pilátt, Coriolus vesicolor (L.: Fr) Quél. Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Dược học, Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh Tài liệu tiếng Anh và từ Internet 21. R.L Gilbertson, L.Ryvanden. North American polypores, vol 2. Meg asporaporia- Wrightoporia, Norway- Oslo-Fungiflora 22. 23. versicolor.html 24. Physical characteristics of Coriolus versicolor 25. 26. 27. Parris M. Kidd, Ph.D. the use of mushroom glucan and proteoglycan in cancer treatment 28. Yang QY. Yunzhin polysaccharide PSP and the general aspects of its reseach. Dept of Biol of Shanghai Teachers University 61 29. Medicinal Mushroom 30. Sinthujah Jeganathan, 2003. Potential of fungi used in Chinese remedies for cancer treament 31. Tom volk’s Fungus of the monht for august 1997 Tomvolkfungi.net 32. Beta-glucan: Adjunctive nutritional Support for health 33. Trametes versicolor extract 34. Barrie Cassileth, K.Simon Yung. Coriolus versicolor