Đề tài Đặc điểm sinh học của cá rô phi

1 I. GIỚI THIỆU 1.1. Đặt vấn đề Theo đề án phát triển nuơi cá rơ phi giai đoạn 2003 – 2010 của Bộ Thủy sản, mục tiêu đến năm 2010 nhằm tăng diện tích nuơi lên 10.000 ha, 1 triệu m3 lồng, sản lượng 200.000 tấn với giá trị xuất khẩu đạt 150 triệu USD. Trong chương trình phát triển nuơi trồng thủy sản thời kỳ 1999 – 2010, Bộ Thủy sản đã xếp cá rơ phi vào vị trí hàng đầu trong các lồi thủy hải sản nuơi (Trích bởi Nguyễn Thị Ngọc Bích, 2005). Trên thế giới, hiện nay cá rơ phi nuơi xếp vị trí thứ ba về sản lượng, đạt 1.374.239 tấn vào năm 2002, cĩ giá trị 1.706.538.200 USD (năm 2000) (http:// ag.arizona.edu/azaqua/ista/market/htm), dự đốn trong vài năm tới sản lượng cá rơ phi nuơi sẽ đạt vị trí hàng đầu. Những thành quả đạt được và mục tiêu phấn đấu của nghề nuơi cá rơ phi rất hứa hẹn nhưng cũng đặt ra nhiều vấn đề cần được giải quyết thỏa đáng. Một trong số những vấn đề đĩ là bệnh trên cá nuơi. Song song với sự mở rộng quy mơ và áp dụng nhiều mơ hình nuơi tiên tiến để nâng cao năng suất là sự gia tăng về bệnh. Bệnh là một trong những nguyên nhân chính kìm hãm sự phát triển nghề nuơi thủy sản hiện nay. Từ khi bắt đầu nghề nuơi thủy sản thâm canh, việc kiểm sốt bệnh dựa chủ yếu vào các biện pháp hĩa trị liệu. Tuy nhiên các biện pháp này bộc lộ nhiều nhược điểm. Điều này dẫn đến các áp lực từ phía người tiêu dùng, các tổ chức chính phủ và mơi trường về nhu cầu được hưởng thụ các sản phẩm nuơi trồng an tồn về mặt vệ sinh thực phẩm và mơi trường bảo đảm sản xuất bền vững. Trước các thực tế đĩ, việc dùng vaccine để kiểm sốt bệnh là một sự lựa chọn đúng đắn. Nghiên cứu vaccine dùng trong thủy sản là sự kế thừa hợp lí nghiên cứu vaccine dùng trong chăn nuơi và chăm sĩc sức khỏe con người. Bệnh do vi khuẩn Streptococcus sp. được báo cáo đầu tiên tại Nhật Bản vào năm 1958 trên lồi cá hồi nuơi (Hoshina và ctv., 1958; trích bởi Yanong và Floyd, 2001) . Bệnh cĩ tỉ lệ chết cao, cĩ thể lên tới 100% trong vịng vài ngày phát bệnh. Hiện nay, bệnh do vi khuẩn Streptococcus sp. đã được phát hiện trên nhiều đối tượng nuơi và tại nhiều nơi trên khắp thế giới: Viễn Đơng, Hoa Kỳ, Nam Phi, Trung Mỹ, Nhật, Israel, ... 2 Hiện nay trên thế giới cĩ nhiều cơng trình nghiên cứu về khả năng đáp ứng miễn dịch của cá đối với vi khuẩn Streptococcus sp. cũng như vaccine phịng bệnh trên. Một số cơng trình đĩ như: Alkhlaghi và ctv.(1996) nghiên cứu cách cấp vaccine dạng FKC cĩ thêm chất bổ trợ; Eldar và ctv.(1997) nghiên cứu về thời gian tạo đáp ứng miễn dịch sau khi cấp vaccine ở cá hồi đạt tới 4 tháng; Eldar và ctv. (1995), Bercovier và ctv. (1997) nghiên cứu hiệu lực của vaccine phịng Streptococcus difficile; Bunch và Bejerano (1997) nghiên cứu các ảnh hưởng của các yếu tố mơi trường lên sự nhạy cảm của cá rơ phi lai do Streptococcus sp.; các cơng trình nghiên cứu của nhĩm các nhà khoa học tại phịng thí nghiệm nghiên cứu sức khỏe động vật thủy, Bộ nơng nghiệp Hoa Kỳ ( Aquatic Animal Health Research Laboratary, ARS, USDA) gồm: Shoemaker C.A., Klesius P. H., Evans J. J.. Họ đã lấy bằng sáng chế về vaccine phịng bệnh do Streptococcus iniae tại Hoa Kỳ. Tuy nhiên ở nước ta các cơng trình nghiên cứu về bệnh trên cá rơ phi chưa nhiều, chỉ cĩ vài cơng trình nghiên cứu chủ yếu tập trung vào ký sinh trùng như cơng trình nghiên cứu của Bùi Quang Tề và ctv. (1999; trích bởi Võ Văn Tuấn, 2005), và hầu như chưa cĩ hoặc cĩ rất ít cơng trình cĩ tầm cỡ nghiên cứu về tác nhân vi khuẩn gây bệnh trên cá rơ phi cũng như các cơng trình nghiên cứu về vacine và các chế phẩm miễn dịch phịng bệnh cho cá. Vì vậy để đáp ứng nhu cầu thực tiễn trong việc nuơi và phịng trị bệnh hữu hiệu , được sự phân cơng của Bộ mơn Cơng nghệ sinh học, Trường Đại học Nơng lâm Tp. Hồ Chí Minh, chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài “ Điều chế kháng huyết thanh thỏ và khảo sát đáp ứng miễn dịch của cá rơ phi đỏ đối với vi khuẩn Streptococcus sp. ”. 1.2. Mục tiêu: Xác định mức độ tạo đáp ứng miễn dịch của thỏ khi tiêm FKC của vi khuẩn Streptococcus sp. nhằm điều chế kháng huyết thanh thỏ kháng Streptococcus sp. dùng cho mục đích chẩn đốn. Xác định ảnh hưởng của mật độ nuơi lên đáp ứng miễn dịch và tỷ lệ cảm nhiễm của cá rơ phi đỏ đối với vi khuẩn Streptococcus sp. . Xác định thời gian tạo đáp ứng miễn dịch đặc hiệu của cá đối với vi khuẩn Streptococcus sp.. 3 II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Một số đặc điểm sinh học của cá rơ phi 2.1.1. Nguồn gốc Cá rơ phi cĩ nguồn gốc từ Châu Phi. Năm 1924, cá rơ phi được nuơi đầu tiên ở Kenya và sau đĩ nuơi rộng rãi nhiều nước ở Châu Phi và trên thế giới, nhiều nhất là những nước nhiệt đới và cận nhiệt đới. Chỉ vài chục năm gần đây, việc nuơi cá rơ phi mới thực sự phát triển mạnh và trở thành một ngành nuơi cĩ qui mơ cơng nghiệp, cho sản lượng thương phẩm lớn và đạt hiệu quả kinh tế cao. Rơ phi đỏ (Oreochromis sp.) được lai tạo từ cá bố cĩ dạng đột biến lặn màu đỏ của lồi O. mossambicus, cịn mẹ thì cũng cùng giống Oreochromis nhưng cĩ thể thuộc lồi khác. Tất cả chúng đều cĩ tên tiếng Anh chung là Red Tilapia. Rơ phi đỏ được phân lập lần đầu tiên ở Đài Loan trong những năm 70 của thế kỷ trước từ thế hệ lai giữa con màu đỏ O. mossambicus với con màu đen hoang dại của rơ phi sơng Nile O. niloticus (Mai Chi, 2002). Cá rơ phi đỏ được nhập vào nước ta từ Thái Lan năm 1985. 2.1.2. Phân loại Lớp : Osteichthyes Lớp phụ : Actynopterigii Bộ : Perciformes Bộ phụ : Perciidae Họ : Cichlidae Giống : Tilapia, Sarotherodon và Oreochromis. Việc phân loại cá rơ phi dựa vào tập tính sinh sản của các lồi được nhiều nhà khoa học cơng nhận. Ở giống Oreochromis, cá đực làm tổ và cá cái ấp trứng trong miệng. Ở giống Sarotherodon thì cả con đực và con cái đều ấp trứng ở trong miệng. Ở giống Tilapia thì cần giá thể khi đẻ trứng, cá đực và cá cái cùng tham gia bảo vệ tổ (Võ Văn Tuấn, 2005). 2.1.3. Mơi trƣờng sống Các lồi cá rơ phi phát triển tốt ở nhiệt độ 20 – 310C, ngưỡng nhiệt độ thấp gây chết cá là 10 – 110C, chết nĩng ở 420C (Theo Nguyễn Văn Tư, 2003). Mơi trường 4 sống cĩ pH thích hợp từ 6,5 – 8,5, tuy nhiên cá cĩ thể sống ở pH = 4 và pH = 11 nhưng sinh trưởng khơng tốt. Rơ phi sống được ở cả mơi trường nước ngọt lẫn nước mặn với độ muối lên đến 32‰ và trong mơi trường cĩ nồng độ oxy hịa tan thấp (Trích bởi Võ Văn Tuấn, 2005). 2.1.4. Đặc điểm sống và tập tính dinh dƣỡng Trứng cá rơ phi thụ tinh được ấp trong miệng cá mẹ (ở giống Oreochromis) ở 28 0C sẽ nở sau 4 ngày. Cá bột sau khi nở 3 – 5 ngày tuổi thì cĩ thể bơi lội tự do ở bên ngồi. Khi cĩ dấu hiệu nguy hiểm thì cá mẹ tìm cách báo động cho cá con biết để bơi vào miệng mẹ (Mai Đình Yên và ctv., 1982; trích bởi Võ Văn Tuấn, 2005). Giai đoạn này cá ăn phiêu sinh động (Zooplankton) nhỏ như là Moina, Daphnia, Cyclops. Cá 20 ngày tuổi trở lên chọn thức ăn giống như cá trưởng thành. Cá trưởng thành ăn thực vật hoặc ăn tạp mà thành phần thức ăn gồm thực vật thủy sinh và mùn bã hữu cơ (Bowen, 1982; trích bởi Võ Văn Tuấn, 2005). 2.1.5. Đặc điểm sinh sản  Mùa vụ sinh sản Rơ phi đẻ quanh năm (trừ những ngày quá lạnh hoặc quá nĩng), đẻ nhiều nhất từ tháng 5 đến tháng 10. Mỗi năm đẻ từ 5 – 11 lứa, mỗi lứa đẻ 100 – 3400 trứng. Trong một buồng trứng thường cĩ 5 lứa trứng.  Tuổi thành thục Cá rơ phi thành thục sinh dục rất sớm, bắt đầu sinh sản sau khi nở 3 – 4 tháng. Cỡ cá thành thục nhỏ nhất khoảng 40g. Thời gian tái thành thục khoảng 1 – 2 tháng.  Phân biệt đực cái ở cá rơ phi Khi đến tuổi phát dục thì ở mép các vây đuơi, vây lưng và vây bụng ở cá đực cĩ màu sắc rực rỡ từ hồng đến xanh đen, trong khi đĩ thì cá cái khơng cĩ sự thay đổi về màu sắc mà bụng của nĩ phát triển rất nhanh. Ngồi ra ta cĩ thể phân biệt được cá rơ phi đực cái ngay khi chúng cịn nhỏ, cỡ 6 – 7 cm, bằng cách nhìn vào vùng lỗ huyệt. Cách phân biệt này càng chính xác khi cá gần thành thục sinh dục. + Cá đực cĩ 2 lỗ: phía trước là lỗ hậu mơn, phía sau là rãnh huyệt (cịn gọi là huyệt niệu sinh dục). + Cá cái cĩ 3 lỗ: lỗ hậu mơn, lỗ niệu và lỗ sinh dục. 5  Tập tính sinh sản Tùy theo lồi mà cá rơ phi cĩ tập tính sinh sản khác nhau. Đối với lồi cá rơ phi đen và vằn khi sinh sản, cá đực làm tổ bằng cách đào hố trên đáy ao và chiến đấu chống lại cá đực khác, cá cái thành thục đi đến nơi làm tổ mà ở đĩ các cá đực đang phơ diễn một cách tích cực. Việc bắt cặp và đẻ xảy ra nhanh. Con cái nhanh chĩng nhặt trứng vào miệng ngay khi trứng được thụ tinh bởi con đực và tìm nơi trú ẩn. Thời gian ấp khoảng 10 ngày, sau đĩ cá mẹ tiếp tục chăm sĩc khoảng 1 – 4 ngày thì cá con cĩ thể tự đi kiếm ăn. Con cái sau thời kì ấp trứng và chăm sĩc cá con sẽ ăn tích cực và hồi phục, thường kéo dài 2 – 4 tuần, trước khi no sẳn sàng đẻ trở lại. Hình 2.1. Cá rơ phi đỏ (điêu hồng) 2.2. Tình hình nuơi cá rơ phi trên thế giới và ở Việt Nam 2.2.1. Trên thế giới Hiện nay cĩ trên 85 quốc gia nuơi cá rơ phi trên khắp các châu lục trên thế giới. Trung Quốc là nước dẫn đầu thế giới về sản lượng cá rơ phi nuơi, đạt 315.000 tấn, chiếm 48% sản luợng chung của thế giới. Nhìn chung cá rơ phi được đánh bắt tự nhiên ngày càng khan hiếm nên lượng cá bán trên thị trường hiện nay chủ yếu là cá nuơi. Năm 2000, sản lượng cá rơ phi nuơi đạt 754.000 tấn (Theo FAO, 2001.). Về quy mơ châu lục, các quốc gia ở châu Á là nơi nuơi nhiều cá rơ phi nhất, cung ứng 62% sản lượng tồn thế giới, đạt 620.100 tấn, kế đến là các quốc gia thuộc châu Đại Dương, đạt 280.050 tấn, châu Phi: 114.000 tấn, châu Mỹ: 84.450 tấn . Về thị trường cá rơ phi: hiện nay thị trường về cá rơ phi rất lớn đã gĩp phần đẩy nhanh tốc độ phát triển nghề nuơi này. Thị trường cĩ nhu cầu lớn về dạng con cịn 6 sống, nguyên con tươi, đơng lạnh hoặc xơng khĩi. Mỹ là thị trường cá rơ phi lớn nhất thế giới, chiếm 88%. Năm 1993, Mỹ chỉ nhập cĩ 14.528 tấn thì đến năm 2000 đã là 61.762 tấn. Năm 2001, cá rơ phi nhập khẩu vào Mỹ tăng 39% về khối lượng, trong đĩ Việt Nam tham gia được gần 60 tấn (Báo Khoa học phổ thơng và Nhà văn hĩa khoa học, 2002; trích www.ctu.edu.vn/colleges/uquaculture/aquafishdata/index.htm). Bảng 2.1: Sản lƣợng và giá thành cá rơ phi của một số nƣớc sản xuất trên thế giới năm 2000 (Theo Fitzsimmons, 2002, trích www.ctu.edu.vn/colleges/uquaculture/aquafishdata/index.htm) Quốc gia Sản lượng (Tấn) Giá thành (USD/kg) Quốc gia Sản lượng (Tấn) Giá thành (USD/kg) Trung Quốc Mexico Philippines Đài Loan Indonesia Thái Lan 150.000 102.000 95.000 90.000 50.000 40.000 1,0 1,3 1,1 1,5 1,2 1,3 Brazil Cuba Colombia Ecuador Costa Rica 45.000 39.000 23.000 15.000 10.000 1,1 1,1 1,3 1,1 1,2 Bảng 2.2.: Sản lƣợng và giá trị xuất khẩu cá rơ phi sang Mỹ của một số quốc gia (Theo NASSA, 2002; trích bởi www.ctu.edu.vn/colleges/uquaculture/aquafishdata/index.htm) Quốc gia Sản lượng (kg) Giá trị (USD) Quốc gia Sản lượng (kg) Giá trị (USD) Trung Quốc Costa Rica Ecuador Honduras Indonesia 13.589.832 3.108.922 5.159.163 1.437.708 2.217.74 19.711.012 16.485.179 32.719.948 8.634.514 10.916.541 Jamaica Panama Đài Loan Thái Lan Việt Nam 119.111 352.553 29.808.742 259.596 59.897 766.096 2.110.785 34.459.643 941.509 206.274 7 2.2.2. Ở Việt Nam Sau một thời gian dài bị lãng quên, năm 1994 nhờ tiếp nhận một số dịng cá rơ phi vằn cĩ phẩm chất tốt và áp dụng nhiều cơng nghệ tiến bộ đã làm thức dậy nghề nuơi cá rơ phi ở nước ta. Một số cơ sở tại miền Nam đã mạnh dạn đầu tư nuơi cá rơ phi theo phương pháp cơng nghiệp. Năm 1996, sản lượng cá rơ phi nuơi ở nước ta ước tính đạt 15.000 tấn (Nguyễn Cơng Dân và ctv., 1997; trích bởi Trần Văn Vỹ, 1999) 2.2.3. Các tiến bộ kĩ thuật trong nghề nuơi cá rơ phi Hiện nay trong nghề nuơi cá rơ phi nhiều kĩ thuật mới đã được áp dụng để khắc phục nhược điểm về mùi bùn, cá chậm lớn do mang trứng, tỉ lệ phi lê thấp với mục đích cuối cùng là thu được sản phẩm từ cá sau cùng cĩ giá trị thương mại cao, được thị trường chấp nhận (Báo Khoa học phổ thơng và Nhà văn hĩa khoa học, 2002; trích website: www.ctu.edu.vn/colleges/uquaculture/aquafishdata/index.htm). Các loại hình nuơi cá rơ phi hiện nay khá phong phú. Ngồi phương thức nuơi ao, hầm cịn cĩ phương thức nuơi bè trên sơng, kênh, rạch, ao, hồ, nuơi trên dịng nước chảy, kênh mương dẫn nước, trong bể chứa, nuơi trong ruộng lúa và nuơi bè cả trên mặt biển như ở Philippines (Báo Khoa học phổ thơng và Nhà văn hĩa khoa học, 2002; trích www.ctu.edu.vn/colleges/uquaculture/aquafishdata/index.htm). Một tiến bộ nữa trong nghề nuơi cá rơ phi là việc thực hiện các chương trình cải thiện giống, tạo giống mới với mục đích hoặc là cải thiện tốc độ sinh trưởng của cá, hoặc là tạo cho cá cĩ màu sắc hợp thị hiếu như cá rơ phi đỏ - điêu hồng (Mai Chi, 2002). Hiện nay trên thế giới giống cá rơ phi được nuơi nhiều nhất là cá rơ phi sơng Nile (Oreochromis niloticus) và cá rơ phi vằn (O. mossambicus). Cá rơ phi sơng Nile chiếm tỉ lệ nuơi cao nhất và tăng từ 33% (66.000 tấn) vào năm 1984 lên 72% (474.000 tấn) vào năm 1995. Nĩ được nuơi nhiều nhất ở Đài Loan (tỉ lệ 39% ), Philipines (16%), Mexico (13% ), Mỹ (5,8% ) với nhiều dạng cá lai nuơi như: O. niloticus, O.aureus, O. mossambicus, O. hornorum và cá rơ phi đỏ. Hiện nay nhiều nước đang tuyển chọn cá rơ phi dạng đỏ, như cá rơ phi đỏ của Singapore chọn từ O. mossambicus Mutante (Pruginin và ctv.,1988), của Florida là cá lai F1 giữa O. mossambicus Albina X O. urolepis hornorum (Sipe, 1985), của Tailandesa chọn từ O.niloticus Roja, của Manzala chọn từ cặp lai O. aureus Roja X O. niloticus (Egipcia) Roja (Mc Andrew và ctv., 1988; Tave, 1991), giống Yumbo No 1 lai giữa dạng Florida đỏ và O. niloticus (Castillo, 1990); giống Yumbo No 2 lai giữa Red Tilapia USA và Red Tilapia Israel,... 8 Hoặc sản xuất giống cá rơ phi đơn tính bằng cách cho cá con ăn thức ăn cĩ tỉ lệ đạm cao, phối trộn với methlytestosterone sẽ cho tỉ lệ đực rất cao (Báo Khoa học phổ thơng và nhà văn hĩa khoa học, 2002; trích www.ctu.edu.vn/colleges/aquaculture/aquafishdata/index.htm ). 2.3. Tình hình dịch bệnh ở cá rơ phi Cùng với sự gia tăng mật độ trong hệ thống nuơi là sự gia tăng về bệnh. Trong thời gian gần đây, người nuơi luơn phải đương đầu với vấn đề bệnh trên động vật thủy sản. Bệnh trên cá rơ phi xảy ra khắp nơi, trong đĩ một số đã phát triển thành những trận dịch. Đài Loan là nước từng đã hứng chịu rất nhiều trận dịch trên cá rơ phi. Chien (1991; trích bởi Nguyễn Tri Cơ, 2004) đã mơ tả bệnh trong một hệ thống nuơi cá rơ phi vằn do Saprolegnia sp. gây ra. Trận dịch năm 1992 đã làm chết rất nhiều cá rơ phi trong những ao nuơi nước ngọt ở miền Đơng và Nam Đài Loan, sau đĩ lan rộng ra các đảo trong khu vực ở cả nước lợ và nước mặn (Huang và ctv., 1998). Tại Israel, một tác nhân gây bệnh rất giống nấm Branchiomyces đã làm chết 85% cá rơ phi đỏ và cá rơ phi lai. Tại một đầm nuơi cá rơ phi nước lợ ở Hưng Yên thuộc tỉnh Quảng Ninh đã xảy một trận dịch vào cuối năm 1997, nguyên nhân do đĩa Piscicola sp. và đã làm chết khoảng 20 – 25 tấn cá (Bùi Quang Tề, 2001; trích bởi Võ Văn Tuấn, 2005). 2.4. Tình hình nghiên cứu bệnh trên cá rơ phi 2.4.1. Trên thế giới Hiện nay trên thế giới đã cĩ một số cơng trình nghiên cứu về bệnh trên cá rơ phi do các tác nhân vi khuẩn như: Miyazaki và ctv. (1984; trích bởi Nguyễn Tri Cơ, 2004) nghiên cứu mơ học cá bị nhiễm Pseudomonas fluorescens và Streptococcus sp., Chang và Plumb (1996; trích bởi Nguyễn Tri Cơ, 2004) nghiên cứu mơ học cá rơ phi vằn nhiễm Streptococcus sp. và ảnh hưởng của độ mặn lên quá trình nhiễm Streptococcus sp. của cá rơ phi vằn, Bunch và Bejerano (1997; trích bởi Nguyễn Tri Cơ, 2004) nghiên cứu ảnh hưởng của những yếu tố mơi trường lên sự nhạy cảm của cá rơ phi lai đối với bệnh do Streptococcus sp., Huang và ctv. (1996; trích bởi Nguyễn Tri Cơ, 2004) nghiên cứu dịch tể học và khả năng sinh bệnh của Staphylococcus epidermidis trên cá rơ phi nuơi ở Đài Loan và các tác giả này kết luận rằng S. epidermidis là một tác nhân gây bệnh ở cá rơ phi,... 9 2.4.2. Tại Việt Nam Hiện nay ở Việt Nam các cơng trình nghiên cứu về bệnh cá rơ phi chưa nhiều, chỉ cĩ vài cơng trình nghiên cứu chủ yếu tập trung vào kí sinh trùng và hầu như chưa cĩ hoặc cĩ rất ít cơng trình cĩ tầm cỡ nghiên cứu về tác nhân virus hay vi khuẩn gây bệnh trên cá rơ phi. Những cơng trình nghiên cứu ở Việt Nam như: nghiên cứu về kí sinh trùng trên một số dịng cá rơ phi vằn ở Bắc Ninh và Quảng Ninh (Bùi Quang Tề và ctv., 1999; trích bởi Nguyễn Tri Cơ, 2004) hay nghiên cứu về kí sinh trùng ở những giai đoạn khác nhau trên ba dịng cá rơ phi nuơi (O. niloticus) như dịng Thái, dịng Việt và dịng GIFT (Genetical Improved Farm Tilapia) tại miền Bắc Việt Nam (Bùi Quang Tề và Vũ Thị Lụa, 1999; trích bởi Nguyễn Tri Cơ, 2004). 2.5. Một số thơng tin về liên cầu khuẩn Streptococcus iniae gây bệnh trên cá rơ phi 2.5.1. Đặc điểm hình thái, sinh lí, sinh hĩa Streptococcus iniae là một lồi vi khuẩn thuộc giống Streptococcus. Streptococcus gồm vài lồi được xác định là tác nhân gây bệnh trên nhiều kí chủ. Phần lớn các lồi trong giống này vẫn chưa được xác định đầy đủ. Các đặc điểm dùng để định danh Streptococcus sp. thơng thường trên lồi hữu nhũ khơng được áp dụng nhiều khi xác định tác nhân gây bệnh trên cá. Một số lồi vi khuẩn thuộc giống Streptococcus gây bệnh trên cá đã được xác định, bao gồm: Streptococcus difficile phát hiện ở Israel, S. milerri (Austin và Austin, 1999), S. parauberis phân lập từ lồi cá bơn nuơi ở miền Bắc Tây Ban Nha (Austin và Austin, 1999), S. iniae được phát hiện trên nhiều lồi và cả ở thú hữu nhủ (Austin và Austin, 1999; trích bởi Yanong và Floyd, 2001). Ngồi ra cịn một số lồi vi khuẩn cĩ mối quan hệ họ hàng rất gần gũi với Streptococcus và gây ra các triệu chứng bệnh tương tự như: Lactococcus garvieae (Austin và Austin, 1999), L. piscium và Vagococcus salmoninarum (Yanong và Floyd, 2001). Tất cả chúng gây ra hội chứng bệnh cĩ tên là bệnh do liên cầu khuẩn (streptococcosis). Bệnh streptococcosis được Hoshina và ctv. báo cáo đầu tiên vào năm 1958 ở Nhật Bản trên lồi cá hồi nuơi. Streptococcus iniae cùng với vi khuẩn Lactococcus garvieae là những tác nhân gây bệnh chủ yếu của bệnh streptococcosis ở cá, theo ước tính nĩ là nguyên nhân gây ra 50% số cái chết trong tháng đầu của vụ nuơi và tới 80% số cá nuơi bị tổn thất khi kết thúc vụ nuơi, đặc biệt nghiêm trọng nếu bệnh xảy ra trong những tháng mùa lạnh . 10 S. iniae được phân lập đầu tiên trên lồi cá heo vùng sơng Amazone vào thập niên 70 của thế kỷ trước. Tuy nhiên nĩ chỉ được coi là tác nhân gây bệnh sau một vụ bộc phát trên cá rơ phi lai vào năm 1994 (Yanong và Floyd, 2001). S. iniae cĩ thể gây bệnh trên cả cá lẫn thú, kể cả con người (Austin và Austin, 1999; Weistein và ctv., 1997). S. iniae cĩ dạng hình cầu, cĩ thể đứng riêng lẻ, thành từng cặp hoặc tạo thành chuỗi dài. Vi khuẩn S. iniae bắt màu Gram dương . Đặc điểm này của nĩ khá hữu ích cho cơng tác phân lập vì thơng thường các tác nhân vi khuẩn gây bệnh trên cá thuộc nhĩm vi khuẩn Gram âm. Vi khuẩn S. iniae phát triển tốt trên các mơi trường thạch Tryptic Soyar Agar, Brain Heart Infusion, Muller – Hinton và thạch máu cừu. Nhiệt độ nuơi cấy thích hợp từ 25 – 28oC. Sau 48h nuơi cấy, vi khuẩn tạo thành khuẩn lạc nhỏ (0,5 – 0,7mm) màu trắng đục. Một số chủng khuẩn lạc trong suốt cĩ tính nhầy sau 24h nuơi cấy. Trên mơi trường thạch máu, khuẩn lạc tạo vịng dung huyết beta nhỏ, trong suốt, rìa khơng rõ. Vi khuẩn khơng phát triển ở điều kiện pH 9,6, NaCl 6,5%, nhiệt độ 10 và 45oC (Nguyen và Kanai, 1999). S. iniae thủy phân esculin và tinh bột, khơng thủy phân gelatin. Vi khuẩn lên men đường glucose, maltose, mannitol, khơng lên men arabinose, lactose, raffinose và xylose. Về đặc điểm sinh hĩa khác, S. iniae cho phản ứng catalase, oxydase, VP, indol và H2S âm tính; MR và DNase dương tính (Nguyen và Kanai, 1999)..... Hình 2.2 : Hình thái vi khuẩn Streptococcus sp. (Nguồn: Nguyễn Thị Ngọc Bích, 2005) 11 2.5.2. Lồi cá nuơi cảm nhiễm Rất nhiều báo cáo khoa học đề cập đến bệnh do S. iniae trên cá rơ phi (Oreochromis sp.) nuơi cơng nghiệp tại nhiều quốc gia trên thế giới. Tại Nhật Bản, các lồi cá nuơi cảm nhiễm như: cá cam (Seriola quinqueriata), cá bơn (Paralichthys olivaceus), cá hồng (Pargrus major) và các cá nuơi nước ngọt như: ayu (Phecoglosus alivaceus) chịu rất nhiều thiệt hại do S. iniae gây bệnh. Một số lồi cá nuơi ở các nước châu Á khác như: cá chẽm (Lates calcarifer), cá mú (Epinephelus sp.), cá hồng (Lutijanus sp.) cũng bị nhiễm S. iniae (Dương Phượng Uyên, 2005). 2.5.3. Triệu chứng và bệnh tích Hầu hết bệnh xâm nhiễm ở cá là do các mầm bệnh cơ hội. Điều đĩ cĩ nghĩa là chỉ với sự hiện diện của mầm bệnh trong mơi trường khơng thể bộc phát bệnh được, chỉ khi cĩ các yếu tố khác tạo thuận lợi cho mầm bệnh hoặc hệ thống miễn dịch của kí chủ bị suy yếu, khi đĩ cá sẽ trở nên nhạy cảm với mầm bệnh. Các yếu tố đĩ gọi chung là stress. Một số yếu tố gây stress như: nhiệt độ nước cao vào mùa hè, mật độ nuơi cao, do vận chuyển, do đánh bắt, chất lượng nước nuơi kém với nồng độ nitrite và amonia cao. Tuy nhiên, theo Ferguson và ctv. (1994; trích bởi Yanong và Floyd, 2001), vi khuẩn Streptococcus khơng phải là mầm bệnh cơ hội thật sự. Bệnh thường xảy ra với tỉ lệ cá chết rất cao, hơn 50% trong thời gian từ 3 – 7 ngày (Yanong và Floyd, 2001) . Tỉ lệ cá chết cao và tập trung vào các tháng cuối mùa hè và đầu mùa thu. Đây là khoảng thời gian cĩ nhiệt độ nước cao nhất trong năm. Tại các thời điểm khác trong năm cá chỉ chết rải rác, ngoại trừ vào những tháng mùa đơng lúc nhiệt độ nước xuống thấp, cho nên ở các nước ơn đới vào mùa này rất hiếm gặp cá chết vì bệnh trên. Về độ tuổi cá nhiễm bệnh, hầu hết các báo cáo đều đề cập bệnh xảy ra trong giai đoạn nuơi thương phẩm (Dương Phượng Uyên, 2005). Cá bệnh cĩ triệu chứng chung khá điển hình trên nhiều lồi. Cá bơi lờ đờ hay mất định hướng gần mặt nước. Bên ngồi quan sát thấy cá bị trướng bụng do tích tụ dịch viêm xoang bụng, xuất huyết điểm, cĩ đốm đỏ ở vùng quanh miệng và hậu mơn xuất hiện nặng ở vây lưng và ngực, xuất huyết, viêm cĩ mủ, lồi một hoặc cả hai mắt. Bên trong nội quan gan, lách, thận nhạt màu và sưng to. S. iniae cịn nhiễm ở não làm cá bơi bất thường. Tuy nhiên, một vài trường hợp cá bệnh nhưng khơng cĩ biểu hiện triệu chứng rõ ràng cho đến khi chết (Yanong và Floyd, 2001). 12 Perrera và ctv. (1998) nghiên cứu bệnh tích vi thể học của cá rơ phi lai (O. niloticus X O. aureus) nhiễm S. iniae, kết quả cho thấy sự xâm nhập của vi khuẩn vào tế bào ở mắt, màng não gây viêm hạt màng não. Các ổ viêm cĩ rất nhiều vi khuẩn trong nhu mơ thận là bệnh tích thường quan sát được. Vi khuẩn phát triển quanh mao tĩnh mạch và tạo bệnh tích viêm hạt ở nhu mơ gan. Nhu mơ lách cũng nhiễm khuẩn rất nặng. Một số trường hợp cĩ thể quan sát được viêm bao tim và cơ tim. Trong máu, vi khuẩn phát triển tự do trong huyết tương hoặc bị thực bào bởi đại thực bào (Trích bởi Dương Phượng Uyên, 2005). 2.5.4. Huyết thanh học Pier và ctv. (1978) điều chế kháng huyết thanh thỏ kháng S. iniae. Kháng huyết thanh thỏ này khơng cho phản ứng ngưng kết với bất kỳ lồi vi khuẩn thuộc giống Streptococcus nào khác. Các chủng S. iniae phân lập tại Nhật Bản cĩ hai dạng khuẩn lạc khác nhau sau 24h ủ trên các mơi trường thạch thích hợp. Một loại khuẩn lạc cĩ tính nhầy, trong và một dạng khơng nhầy, đục. Khuẩn lạc nhầy cĩ thể chuyển thành khuẩn lạc khơng nhầy khi kéo dài thời gian ủ nhưng khơng xảy ra trường hợp ngược lại. Kháng huyết thanh thỏ điều chế từ tế bào vi khuẩn của chủng khuẩn lạc nhầy sẽ cho phản ứng ngưng kết với cả hai khuẩn lạc nhầy và khơng nhầy. Tuy nhiên, kháng huyết thanh thỏ điều chế từ tế bào vi khuẩn của chủng khuẩn lạc khơng nhầy sẽ chỉ cho phản ứng ngưng kết với dạng khuẩn lạc đĩ. Vi khuẩn tạo khuẩn lạc nhầy cĩ độc lực mạnh hơn vi khuẩn tạo khuẩn lạc khơng nhầy. 2.5.5. Dịch tễ học  Nguồn vi khuẩn lây nhiễm S. iniae hiện diện trong mơi trường nước ngọt và nước biển, cĩ thể được phân lập quanh năm. Tuy nhiên, vào mùa đơng vi khuẩn hiện diện ở mật độ rất thấp và chỉ cĩ thể phân lập khi sử dụng mơi trường canh tăng sinh chọn lọc. Tương tự, S. iniae cũng được phân lập từ nhớt da, chất bẩn tích tụ trong bể nuơi (Nguyen và ctv., 2002). Cá cịn sống sĩt sau dịch bệnh cĩ khả năng là nguồn thải S. iniae vào nước (Bromage và ctv., 1999; trích bởi Dương Phượng Uyên, 2005).  Đƣờng lây nhiễm Cá cĩ thể được gây nhiễm bằng cách tiêm, ngâm, cho ăn thụ động bằng thức ăn chứa vi khuẩn (Nguyen và ctv., 2000), nuơi chung cá khỏe và cá bệnh 13 (Perera và ctv., 1997) hay bằng cách khá đặc biệt qua niêm mạc mũi (Evans và ctv., 2000). Zlotkin và ctv. (1998) báo cáo khả năng lây truyền S. iniae từ cá mang khuẩn trong tự nhiên vào cá nuơi (Trích bởi Dương Phượng Uyên, 2005).  Sinh bệnh học Vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể cá qua các vết trầy xước ở da và vây. Tại đây, vi khuẩn gia tăng số lượng và bị thực bào bởi các đại thực bào. Đại thực bào mang vi khuẩn theo máu trở về thận và lách. Vi khuẩn khơng bị tiêu diệt bởi đại thực bào gia tăng số lượng tại hai cơ quan trên và khi vượt qua sức chống chịu của cơ thể cá sẽ tiếp tục nhiễm vào máu, sau đĩ được di chuyển đến khắp nơi trong cơ thể gây nhiễm khuẩn tồn thân (Nguyen và ctv., 2001). 2.5.6. Phịng trị bệnh  Phịng bệnh Các biện pháp như giảm mật độ nuơi, tránh cho ăn dư thừa, vệ sinh bể nuơi cần được thực hiện thường xuyên. Tránh đến mức tối đa chuyển đàn, chia đàn, phân cỡ cá trong thời gian dịch bệnh thường xảy ra.  Trị bệnh Kháng sinh diệt khuẩn phổ rộng hay diệt khuẩn Gram dương với tác dụng tồn thân cĩ hiệu quả điều trị tốt. Erythromycin và một số kháng sinh khác như doxycycline, kitasamycin, alkyl-trimethyl-ammonium-calcium-oxytetracycline, josamycin, oleandomycin và lincomycin cũng thường được sử dụng trị bệnh do liên cầu khuẩn ở Nhật Bản (Kitao và Aoki, 1979).  Vaccine Rất nhiều nghiên cứu về vaccine phịng bệnh do S. iniae đã được cơng bố ở nhiều nơi, như: cơng trình của Bercovier và ctv. (1997) nghiên cứu về vaccine phịng bệnh gây ra do Streptococci và các vi khuẩn cĩ quan hệ họ hàng khác trên cá hồi và cá rơ phi, Alkhlaghi và ctv. (1996), Eldar và ctv. (1997), nhiều chương trình nghiên cứu của nhĩm nhà nghiên cứu tại Phịng thí nghiệm nghiên cứu sức khỏe động vật thủy, Trung tâm nghiên cứu Nơng nghiệp thuộc Bộ Nơng nghiệp Hoa kỳ (Aquatic Aniamal Health Research Laboratory, ARS, USDA) gồm: Shoemaker C. A. , Klesius P. H. , Evans J. J. về vaccine phịng bệnh trên ở cá hồi và cá rơ phi,... Tuy nhiên, vaccine được thương mại cịn rất hạn chế, chỉ cĩ một vài sản phẩm như: sản phẩm 14 Aquavac TM Garvetti TM dạng cung qua thức ăn và ngâm của hãng Schering – Plough Aquaculture, ... 2.6. Khái quát về hệ thống đáp ứng miễn dịch của thú. Cột mốc đầu tiên trong miễn dịch học chỉ cách đây hơn một thế kỷ với nghiên cứu của Pasteur trên bệnh tụ huyết trùng ở gia cầm. Cùng với sự phát hiện đĩ, các nghiên cứu tiếp theo đã dần làm sáng tỏ giả thuyết của Pasteur lúc đĩ cũng như làm sáng tỏ hệ thống đáp ứng miễn dịch trên nhiều lồi động vật. Hệ thống miễn dịch ở thú chia làm 2 nhĩm: miễn dịch tự nhiên (miễn dịch khơng đặc hiệu) và miễn dịch thu được (miễn dịch đặc hiệu). 2.6.1. Miễn dịch tự nhiên ở thú Miễn dịch tự nhiên được quy định bởi đặc tính của giống, lồi sinh vật. Loại miễn dịch này đã cĩ sẵn khi cơ thể được sinh ra và nĩ được di truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác. Những yếu tố cấu thành miễn dịch tự nhiên gồm:  Sự đề kháng ở biểu mơ Những yếu tố đề kháng ở biểu mơ Những yếu tố cơ học: các tế bào biểu mơ ở đường hơ hấp tiết dịch nhày, hệ thống nhung mao ở đường hơ hấp, nước mắt ở tuyến lệ, nước tiểu cĩ tác dụng thải vi sinh vật ra ngồi. Những yếu tố sinh học: surfactans (do tế bào thực bào ở phổi sản xuất) ngăn ngừa sự dính bám và thải loại vi sinh vật; lactoferrin cĩ ở sữa mẹ, nước mắt, nước bọt, mồ hơi, chất nhầy niêm mạc mũi, phế quản, cổ tử cung, mật và tinh dịch ngăn chặn sự phân chia tế bào vi sinh vật; lysozyme do bạch cầu hạt tiết, cĩ tác dụng làm vỡ peptidoglycan trong cấu phần vách tế bào vi khuẩn; tallow là các acid béo tự do do tuyến mồ hơi tiết, cĩ vai trị diệt nấm; acid cĩ trong dạ dày, âm đạo ngăn chặn sự sinh trưởng của vi khuẩn. Những quá trình tế bào ở biểu mơ Cĩ khá nhiều loại tế bào cùng tham gia vào sức đề kháng ở biểu mơ : lớp nhung mao của biểu mơ đường hơ hấp sản xuất chất nhầy tạo phản xạ ho, đẩy chất lạ ra ngồi; đại thực bào ở phế nang tiêu diệt tất cả vi khuẩn thơng thường (trừ vi khuẩn lao) Những yếu tố đề kháng bên trong Hiện diện trong máu và các mơ, phân biệt thành quá trình dịch thể và tế bào. 15 Những yếu tố dịch thể: lysozyme cĩ trong dịch khớp và dịch não tủy; transferrin cĩ cấu trúc tương tự như lactoferrin cĩ tác dụng ngưng trùng; bổ thể là hệ thống gồm 9 loại enzyme cĩ mặt thường xuyên trong huyết thanh, cĩ vai trị trong sự phản vệ, opsonin hĩa, sự ly giải, ngăn ngừa và loại bỏ sự hình thành phức hợp kháng nguyên và kháng thể quá lớn trong cơ thể, kích hoạt sự trưởng thành của lympho bào B và sự thực bào; C – reactive protein xuất hiện trong giai đoạn đầu của quá trình nhiễm khuẩn, kích thích dịng thác bổ thể theo con đường cổ điển; interferon (IFN) do tế bào đơn nhân, các loại đại thực bào và tế bào lympho tiết ra, cĩ vai trị trong sự miễn dịch với virus và kí sinh trùng.  Những quá trình tế bào Sự thực bào Các tế bào làm nhiệm vụ thực bào gồm bạch cầu đa nhân trung tính (tiểu thực bào) và bạch cầu đơn nhân lớn (đại thực bào). Những tế bào này tiền thân ở tủy xương, nhưng khi đã được biệt hĩa thì phĩng thích vào máu để làm nhiệm vụ thực bào. Quá trình thực bào gồm các giai đoạn sau: hĩa hướng động là sự kích động và lơi kéo các các bạch cầu đa nhân trung tính và đại thực bào rời dịng máu đến nơi nhiễm trùng nhờ một yếu tố hĩa học tiết ra từ hệ thống bổ thể; nhận diện dựa vào khả năng nhận biết cấu trúc kháng nguyên của vật xâm nhập khác kháng nguyên của cơ thể; ăn vào và đào thải, đưa các phân tử kháng nguyên và các vật chất lạ khỏi dịng máu. Tính gây độc tế bào Những tế bào cĩ hoạt tính gây độc tế bào là lympho hạt lớn, bạch cầu đơn nhân. Quá trình gây độc tế bào cũng trải qua tế bào nhận diện, sau đĩ là giai đoạn tiết ngoại bào là các hạt vào trong tế bào đích, các hạt này sẽ kết hợp với các tiểu thể sống của tế bào đích và làm tế bào bị chết. Về phương diện chức năng, người ta phân biệt 2 loại tế bào: tế bào lympho hạt lớn gọi là tế bào diệt K (killer cell) và tế bào diệt tự nhiên NK (natural killer cell). Tính gây độc khơng đặc hiệu đĩng một vai trị rất quan trọng trong sức đề kháng của cơ thể, cĩ vai trị trong việc nhận diện sớm và giúp loại bỏ những tế bào bướu, phản ứng loại bỏ mảnh ghép ... Sự sản xuất các hợp chất hoạt mạch 16 Gồm các chất như: histamin, leucotrienes... sinh ra gián tiếp trong quá trình hoạt hĩa hệ thống bổ thể và hệ thống đơng máu, cĩ tác động gây co mạch máu trung tâm và giãn mạch máu ngoại biên. 2.6.2. Miễn dịch thu đƣợc ở thú Miễn dịch thu được hay cịn gọi là miễn dịch đặc hiệu là loại miễn dịch mà cơ thể tiếp thu được trong quá trình sống  Đáp ứng miễn dịch thể dịch ở thú Với sự tham gia quan trọng của kháng thể. Các kháng thể được các tế bào lympho sản xuất và đã được tạo ra trước khi cĩ kháng nguyên xâm nhập. Các kháng thể được các kháng nguyên chọn lựa cho mình (Theo thuyết lựa chọn của Jener – Burnet, trích bởi Lê Văn Hùng, 2002). Mỗi một tế bào lympho của một nhĩm được biệt hĩa trong tủy xương và đã được chương trình hĩa để sản xuất một và chỉ một kháng thể, nĩ đặt kháng thể này trên bề mặt ở lớp ngồi của nĩ để tác động như một receptor. Các tế bào lympho nhận tín hiệu khi tiếp xúc với kháng nguyên sẽ tăng sinh mãnh liệt để tạo ra một dịng tương bào sản xuất kháng thể thuộc loại mà tế bào lympho bố mẹ đã được chương trình hĩa. Kết quả cuối cùng là cơ thể tạo lượng kháng thể đặc hiệu rất cao chống lại sự xâm nhập của kháng nguyên. Kháng thể cịn được gọi là globulin miễn dịch (immunoglobulin = Ig), cĩ bản chất protein. Ở người và động vật cĩ vú tồn tại 5 lớp Ig: IgA, IgG, IgM, IgD và IgE cĩ chức năng được thể hiện qua bảng 2.3. Các Ig đều là protein hình cầu, cĩ hai chuỗi polypeptide nặng kí hiệu là chuỗi H (heavy chain) và hai chuỗi nhẹ kí hiệu là L (light chain). Sự khác biệt chủ yếu giữa hai lớp Ig với nhau là ở chuỗi nặng. Các chuỗi H hoặc L trên cùng một phân tử kháng thể bao giờ cũng giống nhau hồn tồn từng đơi một (Lê Văn Hùng, 2002).  Miễn dịch qua trung gian tế bào Là kết quả của sự hoạt hĩa các lympho T và đại thực bào bởi kháng nguyên. Khi đưa một lượng nhỏ kháng nguyên đặc hiệu vào cơ thể, thì tại nơi đưa vào sẽ xảy ra phản ứng viêm. Phản ứng viêm do sự tương tác giữa lympho T mẫn cảm với kháng nguyên đặc hiệu gọi là sự quá mẫn muộn (delayed hypersensivity). Người ta coi quá mẫn muộn là một biểu hiện của đáp ứng miễn dịch tế bào. 17 Khi kháng nguyên xâm nhập vào cơ thể sẽ kích thích sự hoạt động biệt hĩa của dịng tế bào lympho T, các quần thể sau khi được biệt hĩa sẽ tăng sinh nhanh chĩng và tạo ra một số lượng lớn sẵn sàng làm nhiệm vụ tấn cơng kháng nguyên. Bảng 2.3 : Chức năng sinh học của 5 lớp Ig (Nguồn : Đặng Đức Trạch và ctv., 1987; trích bởi Hồng Hải Hĩa, 2001) Lớp kháng thể Hoạt động hữu ích Hoạt động gây tổn thương. IgG Trung hịa độc tố Ngưng kết Opsonin hĩa Tan vi khuẩn (kết hợp với bổ thể) Phức hợp kháng nguyên – kháng thể đọng lại trong cơ thể gây tổn thương. IgM Trung hịa độc tố Ngưng kết Tan vi khuẩn (phối hợp với bổ thể) Thụ thể trên bề mặt lympho bào B dành cho kháng nguyên Như trên IgA Trung hịa độc tố Ngưng kết Opsonin hĩa Như trên IgD Thụ thể trên bề mặt lympho bào B dành cho kháng nguyên Như trên IgE Làm thay đổi tính thẩm thấu của thành mao mạch Gây phản vệ quá mẫn tức khắc và tồn thân ngay tại chỗ Những tế bào lympho tham gia vào đáp ứng miễn dịch tế bào thuộc về hai tiểu quần thể lympho T sau: Tiểu quần thể lympho T gây quá mẫn muộn (TDTH = delayed type hypersensivity T lymphocyte) : cĩ chức năng sản xuất các yếu tố hịa tan gọi là lymphokin, tác động đến các loại bạch cầu khác, đặc biệt là đại thực bào. Chúng cĩ vai 18 trị rõ rệt trong đáp ứng miễn dịch tế bào chống lại các vi sinh vật kí sinh bên trong tế bào, trong hiện tượng mẫn cảm do tiếp xúc, phản ứng thải bỏ mảnh ghép. Tiểu quần thể lympho T gây độc (TC = cytotoxic T lymphocyte) cĩ khả năng tiêu diệt tế bào đích, những tế bào đã bị vi sinh vật gây bệnh đột nhập vào bên trong tế bào chất hoặc nhân. Các quần thể tế bào khác như: tế bào T cảm ứng TI (inducer T lymphocyte), tế bào T hỗ trợ TH, tế bào T ức chế TS (T cell suppressor)... cĩ vai trị điều hịa đáp ứng miễn dịch hoặc điều hịa mối quan hệ phức tạp giữa các tế bào cùng tham gia đáp ứng miễn dịch. Lymphokin: hiện nay phát hiện được hơn 90 loại lymphokin ở thú. Chúng cĩ bản chất là protein do tế bào lympho tiết ra với các chức năng khác nhau, mà một trong những chức năng đĩ là kích thích khả năng thực bào của các đại thực bào đơn nhân và bạch cầu trung tính (Lê Văn Hùng, 2002). 2.7. Khái quát về hệ thống miễn dịch của cá Lớp cá là lớp động vật cĩ xương sống nguyên thủy nhất, được coi là gạch nối quan trọng giữa các lồi động vật khơng xương sống và các lồi động vật cĩ xương sống bậc cao hơn (Stoskopf S.K., 1993). Ở cá tồn tại cơ chế thực bào với các tế bào thực bào đơn nhân và tế bào hạt của động vật khơng xương sống, chúng cũng là các sinh vật đầu tiên thể hiện được hai cơ chế miễn dịch thể dịch và miễn dịch qua trung gian tế bào như ở các lồi hữu nhũ (Stoskopf S.K., 1993). Ngoại trừ một số lồi cá sống ở nhiệt độ thấp khơng phát triển hệ thống đáp ứng miễn dịch (Fox, 2005). Cũng như tất cả các cơ thể sống khác, cá cĩ đặc tính quan trọng là nhận biết và dung nạp những cái của bản thân, đồng thời nhận biết và thải bỏ những cái khơng phải của bản thân, xa lạ với cơ thể (Đỗ Ngọc Liên, 1999). Dưới một phức hệ phức tạp tương tác giữa các tế bào được biết đến là hệ thống miễn dịch, chúng nhận biết tác nhân gây bệnh và các chất lạ rồi khởi động một loạt các phản ứng khác nhau nhằm loại bỏ chúng ra khỏi cơ thể. Đĩ cịn được gọi là sự đáp ứng miễn dịch. Những đáp ứng miễn dịch nĩi chung được chia thành 2 lớp lớn: các đáp ứng miễn dịch tự nhiên (khơng đặc hiệu) và các đáp ứng miễn dịch thu được (miễn dịch đặc hiệu). 2.7.1. Đáp ứng miễn dịch tự nhiên ở cá Là các đáp ứng miễn dịch nhờ vào các hàng rào cơ học và sinh học một cách khơng đặc hiệu. 19 Các tế bào tham gia vào đáp ứng miễn dịch tự nhiên Đây là các tế bào quan trọng nhất trong đáp ứng miễn dịch ở cá (Fox, 2005). Bạch cầu đơn nhân chỉ cĩ số lượng giới hạn trong vịng tuần hồn máu ngoại vi, trong khi đại thực bào cĩ nhiều trong các mơ. Chúng tham gia vào sự thực bào và sản sinh ra các yếu tố tương tự cytokine như: interleukin-1 (IL – 1), yếu tố hoại tử khối u (TNF – tumor necrosis factor) kích hoạt các đáp ứng tiếp theo (Fox, 2005) Neutrophil: là các tế bào thứ cấp xuất hiện trong giai đoạn sớm của sự viêm (Manning, 1994; trích bởi Stoskopf S.K., 1993.), nĩ sản sinh cytokine để lơi kéo các tế bào cĩ chức năng miễn dịch khác tới vùng đã bị nhiễm (Fox, 2005) . Tế bào giết tự nhiên ( Natural killer cell) cĩ các thể nhận (receptor) gắn bám vào tế bào đích và li giải nĩ. Các tế bào này quan trọng trong sự đáp ứng miễn dịch với mầm bệnh virus và kí sinh trùng (Fox, 2005). Ngồi ra cịn cĩ một số tế bào tham gia vào sự thực bào khác như: bạch cầu cĩ hạt ưa acid (Mainwaring và Rowley, 1985), tiểu cầu (Ferguson, 1976; Lester và Budd, 1979), tế bào lớp lĩt nội mơ của xoang máu, tế bào hình trụ ở mang cá (Chilmonczyk và Monge, 1980), tế bào nội mơ ở dạ dày (Woodhead, 1981) và các đại thực bào trong tâm nhĩ (Ferguson, 1975) (Trích bởi Stoskopf S. K., 1993). Sự thực bào Sự thực bào là cơ chế phịng vệ nguyên thủy nhất (Fox, 2005), khởi nguyên của nĩ là một chức năng phục vụ cho nhu cầu dinh dưỡng ở động vật cấp thấp, nĩ đã tiến hĩa độc lập thành chức năng phịng vệ ở động vật cĩ xương sống (Stoskopf S.K., 1993). Cơ chế của sự thực bào bao gồm: nhận biết tác nhân ngoại nhiễm, gắn bám vào tác nhân ngoại nhiễm, hút nuốt và tiêu hĩa. Cơ chế của việc nhận biết và gắn bám với tác nhân ngoại nhiễm khơng được hiểu biết rõ. Ở cá xương, thận và lách là hai cơ quan chính bắt giữ kháng nguyên cho tế bào thực bào hoạt động chức năng. Cĩ hai loại tế bào thực bào: Bạch cầu đơn nhân và đại thực bào. Bạch cầu cĩ hạt. Da và lớp nhớt của cá Khơng như lớp da của động vật cĩ xương sống bậc cao, da cá được cấu tạo bởi các tế bào sống khơng được keratin hố (Robert và Bullock, 1980; trích bởi Stoskopf S. K., 1993). Da cá cũng mau lành hơn nếu cĩ thương tổn . Sự tồn tại của lớp chất nhớt 20 phía mặt ngồi da cá là một điều đặc biệt mà các lớp động vật khác khơng cĩ được. Nĩ ức chế sự phát triển của các vi sinh vật. Người ta tìm thấy trong chất nhớt của da các chất: lysozyme, bổ thể, kháng thể tự nhiên, bacteridosin (Diconza, 1970; Fletcher và White, 1973; Ourth, 1980; trích bởi Stoskopf S. K., 1993). Các kháng thể tự nhiên trong lớp nhớt này đặc hiệu với các epitope cĩ chứa thành phần carbohydrate của vách tế bào kháng nguyên. Trong lớp nhớt cịn phát hiện cĩ cả kháng thể đặc hiệu. Các phân tử hịa tan trong đáp ứng miễn dịch khơng đặc hiệu Gồm một số chất sau: lectines, lytic enzyme, transferrin/lactoferrin, ceruloplasmin, protein C – raeactive, interferon (IFN) đảm nhận các chức năng bổ trợ cho các đáp ứng miễn dịch của cơ thể. Bổ thể Bổ thể là một kháng thể khơng đặc hiệu cĩ trong huyết thanh tươi của các lồi động vật, cĩ tác dụng làm tan vi khuẩn đã được kháng thể cảm ứng. (Nguyễn Vĩnh Phước, 1979; trích bởi Hồng Hải Hĩa, 2001.) Trong huyết thanh cá tồn tại khoảng hơn 20 loại bổ thể khác nhau, chúng hoạt động qua hai cơ chế: hoặc tương tác với kháng thể đặc hiệu, hoặc hoạt động một cách khơng đặc hiệu với các phân tử ở bề mặt vật kí sinh (Sakai, 1992; trích bởi Fox, 2005.). 2.7.2. Đáp ứng miễn dịch thu đƣợc ở cá ( miễn dịch đặc hiệu) Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu cĩ tính đặc hiệu cao đối với tác nhân gây bệnh . Sự đáp ứng này càng hồn thiện sau mỗi lần tiếp xúc với tác nhân gây bệnh. Hệ thống miễn dịch đặc hiệu cĩ thể ghi nhớ lại tác nhân gây bệnh và ngăn cản tác động gây bệnh của chúng ở lần tiếp xúc lặp lại tiếp theo (Đỗ Ngọc Liên, 1999). Sự đáp ứng miễn dịch đặc hiệu bao gồm: Miễn dịch thể dịch: Với vai trị tham gia quan trọng của các tế bào lympho B. Ở cá, do thiếu tủy sống, sự trưởng thành và tăng sinh của các tế bào lympho B diễn ra ở lách và phần trước của thận (Đỗ Ngọc Liên, 1999). Cá chỉ tổng hợp được một lớp Ig (immunoglobulin) tương đương với IgM ở thú. IgM ở cá xương cĩ dạng tetreametric, ở cá sụn cĩ dạng pentametric, trong khi ở cá mập và cá đuối cĩ dạng monometric (Ambrosius và ctv., 1982; trích bởi Stoskopf S. K., 1993). IgM là dạng Ig chủ yếu được tạo ra trong các đáp ứng miễn dịch thì đầu ở 21 thú. Ở cá khơng cĩ kháng thể IgG. IgM cĩ vai trị hoạt hĩa bổ thể, cĩ vai trị trong sự opsonin hĩa, trung hịa virus và sự ngưng kết (Tizard, 1987; trích bởi Stoskopf S.K., 1993). Ở lớp nhớt của cá cũng cĩ sự cĩ mặt của các kháng thể loại IgM và Ig tương tự như IgA ở thú (St-Louis-Cornier và ctv., 1984; Lobb, 1987; trích bởi Stoskopf, 1993). Miễn dịch qua trung gian tế bào: Các lympho bào T sinh ra từ tuyến ức của cá giúp cho sự đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào . Sau các đáp ứng của đại thực bào, các lympho bào T – helper sẽ được kích hoạt, trưởng thành thành các tế bào effector. Nĩ nhận diện được kháng nguyên và gắn bám vào kháng nguyên thơng qua các thể nhận trên bề mặt của các đại thực bào, từ đĩ kích thích đại thực bào sản sinh các loại cytokine. Cytokine tác động gián tiếp gây ra một loạt các phản ứng nhờ các quần thể tế bào khác. 2.8. Giới thiệu về chất bổ trợ 2.8.1. Nguyên lý tác dụng của chất bổ trợ Cơ chế tác động của chất bổ trợ dùng trong vaccine được giải thích như sau: Chất bổ trợ cĩ tác dụng gây viêm, kích thích quá trình thực bào, giúp quá trình đáp ứng miễn dịch xảy ra mạnh hơn. Các chất bổ trợ hấp thu kháng nguyên và thải kháng nguyên từ từ ra từ chỗ tiêm. Chất bổ trợ cịn cĩ tác dụng lên tế bào lympho T hỗ trợ (TH). 2.8.2. Các loại chất bổ trợ thơng dụng Các nhà khoa học đã tìm ra hàng trăm chất cĩ tác dụng như chất bổ trợ cho vaccine. Tuy nhiên đa số trong các chất này, ngồi tính làm tăng khả năng miễn dịch và kéo dài thời gian miễn dịch cho vaccine, chúng lại cĩ độc tính tương đối cao, vì thế khơng được sử dụng rộng rãi mà chỉ cĩ ý nghĩa trong nghiên cứu và trong phịng thí nghiệm. Để chọn chất bổ trợ ta nên cân nhắc giữa độ an tồn và tính kích thích miễn dịch sao cho phù hợp. Hiện nay các chất bổ trợ được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất vaccine gồm các nhĩm:  Nhĩm chất vơ cơ Nhơm hydroxit (Al(OH)3) – keo phèn 22 Nhơm phosphat (AlPO4) Nhơm kali sulfat (AlK(SO4)2.12H2O) – phèn chua  Nhĩm chất hữu cơ Gồm những chất chủ yếu như protamin, mỡ động vật, dầu thực vật, dầu khống. Qua nhiều thực nghiệm cho thấy: một chất bổ trợ được chọn dùng để chế vaccine, ngồi hoạt tính kích thích sinh miễn dịch khơng đặc hiệu mạnh mẽ cịn phải cĩ tính an tồn cao, nghĩa là khơng gây phản ứng phụ sau khi tiêm (Nguyễn Mạnh Thắng, 2003). 2.9. Một số nét về vaccine phịng bệnh cho cá 2.9.1. Nguyên tắc ứng dụng vaccine Nguyên tắc của việc ứng dụng vaccine là dựa vào hai đặc tính cơ bản của đáp ứng miễn dịch đặc hiệu. Đĩ là tính đặc hiệu và sự ghi nhớ miễn dịch. Các tế bào ghi nhớ cho phép hệ thống miễn dịch phát triển sự đáp ứng mạnh hơn khi cĩ lần tiếp xúc lặp lại với kháng nguyên. Sự đáp ứng thứ cấp này đồng thời nhanh hơn và cĩ hiệu quả hơn sự đáp ứng ban đầu. Nguyên tắc của vaccine là sử dụng các vi sinh vật (vi khuẩn, virus) hoặc độc tố của chúng đã được cải biến (làm yếu, gây chết) làm cho chúng trở nên một tác nhân khơng gây bệnh nhưng khơng làm mất tính kháng nguyên của chúng (Nguyễn Đình Bảng và Nguyễn Thị Kim Hương, 2003). Miễn dịch học cá cĩ lịch sử ngắn hơn nhiều so với miễn dịch học người và thú. Báo cáo đầu tiên về vaccine trên cá là nghiên cứu về vaccine phịng bệnh furunculosis của Duff vào năm 1942 (Souter, 1983), đến nay đã cĩ nhiều cơng trình nghiêu cứu về vaccine cho cá. Đặc biệt từ khi nhiều nhược điểm của các biện pháp phịng trị bệnh theo con đường hố trị liệu bộc lộ nhiều nhược điểm, gây tác hại đến người tiêu dùng và mơi trường, việc nghiên cứu và sử dụng vaccine phịng bệnh cho cá càng thêm sự khích lệ. Nhưng để đạt được một loại vaccine hiệu quả cả về mặt kinh tế và mơi trường thật là khĩ (Aasjord và Slinde, 1994). Kể từ năm 1976 cho đến năm 1993, trong vịng gần 20 năm chỉ cĩ 3 loại vaccine cho cá được thương mại hố, đĩ là: vaccine phịng bệnh enteric – redmouth, vaccine phịng bệnh furunculosis, vaccine phịng bệnh do vibrio (Souter, 1983). 2.9.2 Các dạng vaccine dùng cho cá Vaccine chết (killed vaccine) là dạng vi sinh vật đã được bất hoạt thơng qua các phương pháp xử lí hố – lí. Hầu hết các vacine được thương mại hiện nay để phịng 23 các bệnh trên động vật thuỷ sản đều dựa vào phương pháp xử lí bằng formalin (Austin, 1984; trích bởi Stoskopf S. K., 1993). Ngồi ra cịn sử dụng một số hố chất như: chloroform và phenol, hoặc các tác nhân vật lí như: sodium hydroxide, sodiumdodecyl sulfate, nhiệt độ để giết chết vi sinh vật (Stoskopf S. K., 1993). Vaccine nhược độc (attenuated vaccine): dùng các vi sinh vật đã được làm yếu, bằng cách: xử lí vi sinh vật với hố chất ở nồng độ cận ngưỡng chết, xử lí nhiệt độ thấp. Phương pháp thơng thường là nuơi cấy chúng ở mơi trường khơng thích hợp hoặc với nhiệt độ khơng thuận lợi cho sự sinh trưởng. Tuy nhiên vaccine dạng này vẫn chưa được thương mại hĩa vì những e ngại là vi sinh vật dùng chế vaccine cĩ thể trở nên cĩ độc lực mạnh hơn . Hiện nay ngồi hai dạng vaccine phổ biến trên, các nhà nghiên cứu đang hướng đến sản xuất vaccine tiểu đơn vị (subunit vaccine) và các loại peptide tổng hợp dùng làm vaccine phịng bệnh cho cá. 2.9.3. Các phƣơng pháp chủng vaccine cho cá Việc chủng vaccine trên cá cĩ nhiều sự lựa chọn hơn so với trên thú và con người. Hiện nay hầu hết các loại vaccine sử dụng cho động vật cĩ xương sống là ở dạng tiêm (injection) , cĩ thể tiêm dưới da, tiêm cơ hay tiêm xoang bụng (Souter, 1983; Stoskopf S. K., 1993). Ở cá, sự tiêm xoang bụng (intraperitoneal = i.p.) cho hiệu giá kháng thể cao hơn với nhiều lồi vi khuẩn và virus (Austin, 1984; Wolf, 1988), nhưng nếu tiêm chủng với số lượng cá lớn sẽ khơng khả thi. Các đường chủng khác như chủng qua đường miệng thơng qua thức ăn hoặc qua đường hậu mơn. Tuy nhiên phương pháp này khơng hiệu quả bởi vì vaccine bị phá hủy ở đường tiêu hĩa của cá (Austin và Austin, 1987). Vì vậy, việc cấp qua lỗ hậu mơn sẽ tránh được tác động phân hủy vaccine ở đường ruột cá nhưng tốn nhiều cơng nên chẳng ưu việt hơn phương pháp cấp bằng đường tiêm vào xoang bụng. Để chủng vacine với số lượng cá lớn, phương pháp ngâm và tắm là thích hợp nhất. Các phương pháp này thích hợp với cá nhỏ, nhưng cũng khơng nên chọn cá quá nhỏ vì sẽ tạo đáp ứng miễn dịch kém do hệ thống miễn dịch chưa trưởng thành (Tatner và Horne, 1984; Manning và Mugal, 1985, trích bởi Aasjord và Slinde, 1994). 2.10. Giới thiệu về phản ứng ngƣng kết dùng trong chẩn đốn miễn dịch học 2.10.1. Định nghĩa kháng nguyên và kháng thể 24 Kháng nguyên (Antigen) Kháng nguyên là những dị chất đối với cơ thể, cĩ đặc tính khi vào cơ thể sẽ kích thích sinh ra những chất phản ứng đặc hiệu, đối lập với chúng, gọi là kháng thể. Kháng thể sinh ra sẽ phản ứng một cách đặc hiệu với kháng nguyên tương ứng (Nguyễn Vĩnh Phước, 1979). Kháng thể (Antibody) Kháng thể là các protein của huyết thanh được gọi tên chung là globulin miễn dịch (immunoglobulin), được sinh ra trong huyết thanh khi một kháng nguyên xâm nhập vào cơ thể, cơ thể phản ứng bằng cách sản sinh ra kháng thể để chống lại kháng nguyên. Tính chất đặc hiệu của kháng thể là kết hợp một cách đặc hiệu với kháng nguyên đã sinh ra nĩ (Đặng Đức Trạch và ctv., 1987; trích bởi Hồng Hải Hĩa, 2001). 2.10.2 Phản ứng ngƣng kết Là sự dính các vi khuẩn vào nhau thành đám nhờ cĩ kháng thể tương ứng và khi cĩ mặt dung dịch nước muối sinh lí (chất điện phân) (Vương Thị Việt Hoa và ctv., 1999). Đối với các kháng nguyên hữu hình như xác vi khuẩn, khi gặp kháng thể đặc hiệu, các vi khuẩn sẽ kết lại với nhau thành đám lớn, mắt thường cĩ thể quan sát được. Đĩ là hiện tượng ngưng kết trực tiếp. Khi cơ thể được miễn dịch, trong huyết thanh cĩ chứa nhiều kháng thể đặc hiệu. Khi cho kháng nguyên hữu hình (tế bào vi khuẩn đã chết) trộn với kháng thể đặc hiệu tương ứng, các vi khuẩn phân tán rời xa nhau trong hỗn dịch, sẽ kết lại với nhau qua cầu nối kháng thể đặc hiệu. Do mỗi cầu nối với các kháng nguyên dưới hình thức mạng lưới nhiều chiều, tạo nên những đám ngưng kết biểu hiện bằng những đám ngưng kết lổn nhổn như những hạt cát hoặc những cụm bơng lơ lửng. Trong thực tế, phản ứng ngưng kết xảy ra được cịn phụ thuộc nhiều điều kiện khác nhau. (Lê Văn Hùng, 2002). Kháng thể gây ngưng kết gọi là kháng thể ngưng kết, cịn kháng nguyên kích thích sinh ra kháng thể ngưng kết gọi là kháng nguyên ngưng kết. Phản ứng tạo ra cặn lợn cợn. Khơng phải chỉ cĩ vi khuẩn cĩ khả năng ngưng kết mà cả hồng cầu, nấm men, nấm mốc, tinh trùng... cũng cĩ khả năng gây ngưng kết (Vương Thị Việt Hoa và ctv., 1999 25 III. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 3.1.1. Thời gian Từ ngày 1/3/2005 đến ngày 15/7/2005 3.1.2. Địa điểm Địa điểm thu mẫu: tại các bè nuơi xảy ra dịch bệnh. Địa điểm thí nghiệm: Trại thực nghiệm thủy sản, Khoa Thủy sản, Trường đại học Nơng lâm Tp. Hồ Chí Minh. Địa điểm phân tích mẫu: Phịng Bệnh học, Khoa Thủy sản, Trường đại học Nơng lâm Tp. Hồ Chí Minh. 3.2. Vật liệu và trang thiết bị nghiên cứu  Dụng cụ Đĩa petri Que cấy Lame và lamelle Ðèn cồn Erlen, bình tam giác Ống nghiệm Bơm tiêm Kéo Kẹp Ðĩa microplate 96 giếng (dạng hình chữ "U"). Pipetman và pipette  Thiết bị Kính hiển vi Tủ lạnh Cân phân tích Bể xi măng nuơi 0,75 m3 Máy sục khí Máy lắc (Stuart Scientific) 26 Máy ly tâm (Hettich Zentrifugen)  Vật liệu Vi khuẩn Streptococcus sp. phân lập từ cá bị nhiễm bệnh do Streptococcus sp. tại thời điểm thực hiện đề tài. Thỏ Cá rơ phi đỏ  Hĩa chất Nước cất Dầu khống Cồn 96o Nước muối sinh lý 0,9% Mơi trường thạch dinh dưỡng NA (Nutrient Agar) Mơi trường canh dinh dưỡng NB (Nutrient Broth) Glycerol Thuốc gây mê (Ethylenglycol monophenylether – C2H10O2) Dung dịch formalin 36% (Xưởng sản xuất thực nghiệm, Cơng ty hĩa chất vật liệu điện và vật tư khoa học kỹ thuật - Bộ Thương mại) . 3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 3.3.1. Phƣơng pháp thu mẫu cá bệnh Dụng cụ: túi nylon, bình oxy. Nguyên tắc thu mẫu: Ghi các triệu chứng cá bệnh trước khi thu mẫu. Khơng thu mẫu cá đã chết, mẫu thu phải cĩ những biểu hiện bệnh lí đặc trưng. Số lượng mẫu thu: 5 – 10 mẫu. 3.3.2. Phƣơng pháp bảo quản và vận chuyển mẫu Mẫu cá bệnh được cho vào túi nylon chứa từ 1/3 – 1/2 lượng nước, sau đĩ bơm khí oxy vào rồi cột chặt túi lại. Vận chuyển mẫu cá bệnh đến nơi phân tích (Phịng thí nghiệm) càng nhanh càng tốt. 27 3.3.3. Phƣơng pháp phân lập vi khuẩn gây bệnh Phương pháp chung được thể hiện qua sơ đồ dưới đây: Mẫu cá Mổ khám Ghi nhận các dấu hiệu bệnh tích Lấy mẫu vi khuẩn (gan, thận, não) Cấy mẫu lên mơi trường NA Xem xét khuẩn lạc Ghi nhận kết quả  Phƣơng pháp kiểm tra dấu hiệu bên ngồi và mổ khám bệnh tích -Kiểm tra các dấu hiệu bên ngồi: quan sát cách cá bơi, mắt, vảy, da, vây bụng, hậu mơn và mang của cá bệnh, nhận định sự khác biệt so với cá khỏe. -Mổ khám bệnh tích bên trong: +Mổ xoang bụng cá: trước khi tiến hành mổ cá, cá cần được đánh vẩy sạch tại vị trí cần mổ, sau đĩ dùng bơng tẩm cồn 70o sát trùng thật kĩ tại khu vực mổ để tránh sự nhiễm tạp của các vi khuẩn từ bên ngồi. -Đặt cá với phần bụng quay về phía người mổ. -Cắt bỏ vây lưng và vây ngực. -Mổ xoang bụng cá bằng 3 đường cắt: Đường thứ nhất: bắt đầu từ phía trước hậu mơn cho đến phần đầu, dừng trước nắp mang. Đường thứ hai: bắt đầu từ trước hậu mơn hướng lên phía trên theo thành bụng tiếp giáp thân về phía đầu đến phần mở của mang cá. Đường thứ ba: nối hai đường cắt trên. 28 Não cá (màu trắng đục) Hình 3.1 : Đƣờng cắt giải phẫu xoang cơ thể cá. -Dùng kẹp đã khử trùng gắp bỏ phần cơ bụng cá đã cắt. -Quan sát các mơ và cơ quan sau: Quan sát dịch nhầy xoang bụng và màu của dịch nhầy, chất dịch cĩ nhiều hay ít. Gan: kiểm tra màu sắc, bề mặt, rìa của gan. Lách: như trên Thận: kiểm tra màu sắc, kích cỡ. + Mổ phần đầu cá: dùng kéo cắt một đường ngay phía sau mắt cá, một đường ngay trên đỉnh nắp mang sao cho đối xứng qua sống lưng cá. Chiều dài đường cắt khoảng 1 cm. Cắt bỏ phần cơ và sụn giữa hai đường cắt, sẽ bộc lộ phần não của cá. Hình 3.2 : Giải phẫu não cá 29  Phƣơng pháp phân lập vi khuẩn Mẫu vi khuẩn thường được lấy ở gan, thận và não. Trong nghiên cứu này chúng tơi chọn mẫu từ thận và não cá vì sẽ hạn chế được sự nhiễm tạp các vi sinh vật khơng mong muốn từ bên ngồi. Dùng kẹp gạt các phần nội tạng sang một bên, thận cá nằm sâu trong xoang bụng cá, ngay phía dưới xương sống. Dùng mũi kéo đã khử trùng cắt một vết nhỏ trên thận. Đưa que cấy vịng nhúng vào chỗ cắt, sau đĩ cấy ria trên mơi trường thạch NA. Ủ ở nhiệt độ phịng trong 18 – 24 h. Đối với mẫu cấy từ não cũng thực hiện tương tự như khi lấy mẫu ở thận.  Phƣơng pháp xác định vi khuẩn Streptococcus sp. cĩ trong mẫu Sau 24h nuơi cấy mẫu, ta tiến hành quan sát màu sắc, hình thái và mật độ của khuẩn lạc đã mọc. Khuẩn lạc Streptococcus sp. trên mơi trường NA cĩ màu trắng đục, hình trịn, rìa đều, bĩng, lồi thấp, tâm hơi đậm, đường kính từ 0,5 – 0,7 mm. Chọn khuẩn lạc cĩ đặc điểm trên cấy chuyền sang đĩa mơi trường NA mới, ủ ở nhiệt độ phịng trong 24 h để phân lập dịng vi khuẩn. Từ đĩa cấy chuyền thu được, tiến hành lưu trữ vi khuẩn làm giống trong mơi trường canh NB cĩ bổ sung 50% glycerol (v/v). Để quan sát hình thái vi khuẩn, ta thực hiện bằng cách: dùng que cấy lấy một ít khuẩn từ một khuẩn lạc cĩ hình thái đặc trưng trên cho lên lam kính cĩ sẵn một giọt nước muối sinh lí, quan sát hình thái vi khuẩn với vật kính 40 của kính hiển vi. Streptococcus sp. cĩ dạng hình cầu, cĩ thể đứng riêng lẻ, thành từng cặp hoặc tạo thành chuỗi dài. Trong mơi trường canh, Streptococcus sp. cĩ dạng chuỗi dài hơn trong mơi trường thạch. 3.3.4. Phƣơng pháp nuơi cấy và thu sinh khối vi khuẩn Streptococcus sp. dạng FKC (Formalin Killed Cell)  Phƣơng pháp nuơi cấy tăng sinh vi khuẩn Dùng que cấy vịng đã khử trùng lấy một ít vi khuẩn từ ống giống vi khuẩn gốc cấy lên đĩa mơi trường NA, ủ ở nhiệt độ phịng trong 24h. Đây là bước tăng sinh sơ khởi (tiền tăng sinh) để chọn được khuẩn lạc như mong muốn và số lượng cần thiết. 30 Chọn khuẩn lạc mong muốn cấy vào bình mơi trường NB. Nút chặt bình, nuơi cấy lắc ở nhiệt độ phịng trong 24h. Yêu cầu là bình nuơi cấy phải lớn để cĩ thể thu được sinh khối vi khuẩn mong muốn.  Phƣơng pháp tạo FKC Sau 24 h nuơi cấy, mơi trường trở nên đục do vi khuẩn phát triển nhiều. Để kiểm tra sự tạp nhiễm, lấy mẫu cho lên lam kính, quan sát dưới kính hiển vi với vật kính 40, xem xét hình thái đặc trưng của vi khuẩn và các vi sinh vật cĩ hình thái khác. Dùng pipette hút dung dịch formalin 36% với số thể tích bằng 0,5% thể tích mơi trường cĩ trong bình (Theo Aasjord P. M. và Slinde E., 1994). Trộn đều, để qua đêm. Với nồng độ trên, formalin sẽ giết chết hết số vi khuẩn cĩ trong bình. Đem li tâm huyền dịch vi khuẩn ở 6000 vịng/phút trong 20 phút. Hút bỏ phần nước nổi. Rửa lại bằng nước muối sinh lí 0,9% liên tiếp 3 lần để xả sạch hết formalin. Xác vi khuẩn thu được sẽ cĩ màu trắng, đựơc gọi là vi khuẩn dạng FKC. Số vi khuẩn thu được đem cân để xác định khối lượng, rồi pha lỗng bằng nước muối sinh lí để thu được huyễn dịch FKC cĩ nồng độ 10 mg/ml. Để kiểm chứng vi khuẩn đã bị tiêu diệt hồn tồn, dùng que cấy vịng lấy một ít mẫu cấy từ bình nuơi NB đã cho formalin lên đĩa mơi trường NA, đem ủ ở nhiệt độ phịng. Quan sát sự xuất hiện khuẩn lạc vi khuẩn trong một tuần liên tục. Nếu khơng thấy bất kì khuẩn lạc xuất hiện thì vi khuẩn đã hồn tồn bị tiêu diệt. 3.3.5. Phƣơng pháp cấp huyền dịch vi khuẩn dạng FKC và gây cảm nhiễm cho cá Chúng tơi chọn phương pháp cấp FKC của vi khuẩn Streptococcus sp. bằng phương pháp tiêm xoang bụng (intraperitoneal = i.p.) vì nĩ tạo cho cá đáp ứng miễn dịch tốt hơn các phương pháp khác (Klesius và ctv., 2000; Stoskopf S. K., 1993). Gây cảm nhiễm cho cá cũng bằng phương pháp tiêm trên. Xi lanh dùng để tiêm phải cĩ dung tích và mũi kim thích hợp với từng kích cỡ cá để tránh gây stress cho cá cĩ thể dẫn đến tử vong. Trong nghiên cứu này, chúng tơi chọn xi lanh bằng plastic cĩ dung tích 1ml. Liều tiêm phụ thuộc vào kích cỡ cá. Đối với cá cĩ trọng lượng nhỏ hơn 50 g/cá thể: tiêm liều 0,1 ml. Đối với cá cĩ trọng lượng lớn hơn 50 g/cá thể: liều 0,2 ml. Liều tiêm này được áp dụng cho cả tiêm FKC và gây cảm nhiễm. 31 3.3.6. Phƣơng pháp lấy máu và thu huyết thanh. Lấy máu cá Vào những ngày theo định kì lấy máu cá, sử dụng 3 con cá bất kì trong lơ để lấy 3 mẫu máu. Cá sau khi lấy máu được loại bỏ khỏi lơ thí nghiệm. Để lấy mẫu máu, dùng bơm tiêm bằng plastic loại 5 ml, đầu kim 26G * 1/2. Theo Smith và ctv. (1952; trích bởi Stoskopf M. K., 1993), xi lanh bằng plastic được khuyến cáo sử dụng hơn so với xi lanh bằng thuỷ tinh vì nĩ ít làm cho máu chĩng đơng hơn, cũng như nĩ dễ kiếm, rẻ và đã được tiệt trùng sẵn. Đâm mũi kim vào cơ phía mặt bụng cá, hơi chệch về phía trước hậu mơn so với phần đầu một chút cho đến khi nào chạm vào xương sống cá. Tiếp tục đẩy nhẹ, giữ chặt và hút máu cho chảy vào xi lanh. Vì máu cá ít cho nên cần phải thao tác nhanh, nếu khơng máu sẽ đơng lại bịt kín mũi kim gây trở ngại cho thao tác lấy. Máu lấy được cho chảy từ từ vào thành xi lanh rồi để nằm nghiêng trong 15 – 20 phút cho máu đơng lại. Cần nới pitton ra xa phần máu để tạo khoảng trống cho huyết thanh chảy ra, cũng như khi thu huyết thanh sẽ khơng làm vỡ hồng cầu, ảnh hưởng đến chất lượng huyết thanh. Mẫu máu thu được được mang lên phịng thí nghiệm để thu huyết thanh và thử phản ứng ngưng kết. Nếu chưa thực hiện cơng việc tiếp theo thì để mẫu máu qua đêm trong ngăn mát của tủ lạnh. Lấy máu trên thỏ: Thỏ được lấy máu ở tĩnh mạch vành tai. Các chú ý khi lấy máu thỏ cũng tương tự như lấy máu trên cá. Hình 3.3. Thao tác lấy mẫu máu trên cá 32 Thu huyết thanh Cĩ thể thu huyết thanh bằng cách chắt lấy huyết thanh sau khi để xi lanh nằm nghiêng, các thành phần trong huyết tương đã đơng lại. Hoặc li tâm mẫu máu, cách này sẽ thu được nhiều huyết thanh và huyết thanh trong hơn. 3.3.7. Phƣơng pháp thực hiện phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính Dùng một phiến kính sạch, nhỏ lên đĩ một giọt huyết thanh của cá hay thỏ, sau đĩ nhỏ vào một giọt kháng nguyên đã biết, trộn đều, đọc kết quả trong vài phút. Nếu trong huyết thanh cĩ kháng thể tương ứng thì sự kết hợp kháng nguyên – kháng thể sẽ tạo thành đám ngưng kết dạng lấm tấm như hạt cát hay dạng bơng. Phản ứng ngưng kết mạnh khi cho kết quả trong 5 phút. Để so sánh, thực hiện mẫu đối chứng tương tự như trên nhưng với một kháng nguyên khác. Hình 3.4 : Phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính 3.3.8. Phƣơng pháp xác định hiệu giá của phản ứng ngƣng kết Sử dụng đĩa microplate 96 giếng (giếng chữ U) để thực hiện phản ứng ngưng kết. Kháng nguyên sử dụng là dung dịch FKC nồng độ 10 mg/ml. Thực hiện chuỗi pha lỗng huyết thanh bậc 2: Cho 25 μl nước muối sinh lý vào tất cả các giếng trừ giếng H1. Cho 25 μl huyết thanh vào các giếng H1 và G1. Dùng pipetman để trộn hỗn hợp ở trong giếng G1. Như vậy ta sẽ được hỗn hợp huyết thanh pha lỗng 2 lần. Chuyển 25 μl của giếng G1 sang giếng F1. Tiếp tục thực hiện như thế cho đến giếng A1 (chú ý: nhớ hút bỏ 25 μl hỗn hợp huyết thanh và nước muối ra khỏi giếng cuối cùng). Kháng nguyên Kháng thể 33 Đối với huyết thanh từ thỏ đối chứng cũng làm đồng thời để dễ kiểm sốt được kết quả. Thêm 25 μl huyền phù vi khuẩn vào mỗi giếng, rồi bọc đĩa lại bằng một miếng phim. Đặt đĩa lên máy vortex và tiến hành vortex trong 2 phút. Kết quả sẽ được ghi nhận lại ở giếng cuối cùng cĩ xuất hiện sự ngưng kết Giếng H1 G1 F1 E1 D1 C1 B1 A1 Nước muối sinh lý ( l) 25 25 25 25 25 25 25 Huyết thanh ( l) 25 25 Vi khuẩn ( l) 25 25 25 25 25 25 25 25 Tổng cộng ( l) 50 50 50 50 50 50 50 50 Hình 3.5 : Sơ đồ biểu diễn cách xác định hiệu giá của phản ứng ngƣng kết 3.4. Cách bố trí và tiến hành thí nghiệm Chúng tơi bố trí và tiến hành 4 thí nghiệm sau: 3.4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát khả năng tạo đáp ứng miễn dịch trên thỏ, bƣớc đầu điều chế kháng huyết thanh dùng cho chẩn đốn và điều trị. Vật liệu và dụng cụ: + Thỏ: 2 con, trọng luợng mỗi con là 1,5 kg. Một con để tiêm huyền dịch FKC của vi khuẩn Streptococcus sp., con cịn lại được tiêm nước muối sinh lí 0,9%. Thỏ được nuơi trong chuồng cĩ kích thước 40 x 60 x 40cm. Cho thỏ ăn thức ăn tự nhiên được rửa sạch như rau muống, cà rốt … + Vi khuẩn Streptococcus sp. dạng FKC: được chuẩn bị theo qui trình 3.3.4 + Dầu khống: đĩng vai trị là chất bổ trợ (adjuvant) để tăng hiệu lực tạo đáp ứng miễn dịch trên thỏ. + Bơm tiêm để tiêm huyễn dịch FKC và lấy máu thỏ loại 5 ml. 34 Cách tiến hành: + Nhũ hĩa 1ml FKC và 1ml dầu khống (tỉ lệ 1:1) bằng cách cho vào ống ly tâm cĩ nắp và lắc mạnh. Dùng ống tiêm 5ml hút dung dịch trên. + Cắt lơng lưng thỏ một vùng rộng phía mặt lưng, tiêm 1ml dung dịch trên dưới da thỏ. Sau đĩ, thỏ được tiêm huyền dịch FKC lặp lại theo định kỳ: sau 2 tuần (14 ngày), 4 tuần (28 ngày), 5 tuần (35 tuần). Thỏ đối chứng tiêm nước muối sinh lí. Đồng thời tại các thời điểm này, chúng ta lấy mẫu máu từ thỏ, thu huyết thanh và thử phản ứng ngưng kết với kháng nguyên (vi khuẩn Streptococcus sp.) để xác định mức độ tạo kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên. Trên thỏ đối chứng cũng thực hiện cách thử nghiệm tương tự như trên. Bảng 3.1 : Lịch tiêm huyền dịch vi khuẩn Streptococcus sp. dạng FKC cho thỏ Ngày tiêm Loại để tiêm Vị trí tiêm Liều tiêm (ml) Ngày lấy máu Ngày thứ 1 Ngày thứ 14 Ngày thứ 28 Ngày thứ 35 Ngày thứ 42 FKC + DK FKC + DK FKC + DK FKC FKC Dưới da Dưới da Dưới da Dưới da Tĩnh mạch tai 1 1 1 1 1 Ngày thứ 14 Ngày thứ 28 Ngày thứ 35 Ngày thứ 42 Ngày thứ 49 Chú thích: FKC: các tế bào của vi khuẩn Streptococcus sp. được giết bởi dung dịch formalin. DK: dầu khống 3.4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của mật độ nuơi cá rơ phi đỏ (Oreochromis sp.) đối với vi khuẩn Streptococcus sp. đã đƣợc tiêm vi khuẩn dạng FKC trƣớc đĩ Dụng cụ và vật liệu: + Cá rơ phi đỏ: cĩ trọng lượng trung bình là 34,6 g. Được nuơi trong điều kiện thí nghiệm 1 tháng trước khi tiến hành thí nghiệm. Cá được nuơi bằng thức ăn viên cơng nghiệp. Sau khi tiêm gây cảm nhiễm, cá khơng được cho ăn. 35 + Bể xi măng: cĩ thể tích 0,75 m3, đặt trong nhà cĩ mái che, sục khí liên tục và thay nước hàng ngày. + Huyền dịch của vi khuẩn Streptococcus sp. dạng FKC: chuẩn bị tương tự như mục 3.3.4. + Vi khuẩn Streptococcus sp.: cùng dịng vi khuẩn điều chế FKC. Trước tiên vi khuẩn được nươi cấy tăng sinh trên mơi trường thạch NA, ủ ở nhiệt độ phịng trong 24h. Sau đĩ thu nhân sinh khối vi khuẩn. Pha lỗng vi khuẩn bằng nước muối sinh lí 0,9%. Vi khuẩn được xác định nồng độ bằng cách thực hiện theo phương pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa thạch. Cách thực hiện: Thí nghiệm được bố trí thành 6 lơ gồm: 3 lơ thí nghiệm (E1, E2, E3) và 3 lơ đối chứng (C1, C2, C3) với các mật độ cá nuơi khác nhau: 25 con (mật độ nuơi thấp), 50 con (mật độ nuơi trung bình), 100 con (mật độ nuơi cao). Tiêm cá vi khuẩn Streptococcus sp. dạng FKC như mục 3.3.5. Cá ở lơ đối chứng tiêm nước muối sinh lí. 14 ngày sau khi chủng cá, thực hiện gây cảm nhiễm (tiêm thử thách) tất cả số cá (cả lơ thí nghiệm và lơ đối chứng) với vi khuẩn Streptococcus sp. cịn sống cĩ nồng độ 8,5*105 CFU/ml với liều tiêm và cách tiêm như mục 3.3.5. Sau khi gây cảm nhiễm, cá khơng được cho ăn. Tiếp tục theo dõi trong 14 ngày, mỗi ngày kiểm tra xem cĩ cá chết hay hấp hối khơng. Nếu cĩ thì tiến hành phân tích quan sát dấu hiệu, mổ khám bệnh tích và phân lập vi khuẩn để xác định nguyên nhân. Sau thời gian thí nghiệm, tất cả số cá cịn lại được giải phẩu để phân lập vi khuẩn gây bệnh giống như phân lập mẫu cá bệnh thu ngồi tự nhiên. 36 Hình 3.6: Bể bố trí thí nghiệm 2 Tĩm tắt thí nghiệm được thể hiện qua bảng 3.2 Bảng 3.2. : Cách bố trí thí nghiệm 2 Lơ Các thơng số Lơ thí nghiệm Lơ đối chứng E1 E2 E3 C1 C2 C3 Số cá (con) Loại chủng Liều chủng (ml/cá thể) Nồng độ vi khuẩn (CFU/ml) Liều gây cảm nhiễm (ml) Thời gian theo dõi sau khi gây cảm nhiễm (ngày) 25 FKC 0,1/0,2 8,5*10 5 0,1/0,2 14 50 FKC 0,1/0,2 8,5*10 5 0,1/0,2 14 100 FKC 0,1/0,2 8,5*10 5 0,1/0,2 14 25 NMSL 0,1/0,2 8,5*10 5 0,1/0,2 14 50 NMSL 0,1/0,2 8,5*10 5 0,1/0,2 14 100 NMSL 0,1/0,2 8,5*10 5 0,1/0,2 14 Chú thích: FKC: Formalin Killed Cell – Các tế bào vi khuẩn được giết bởi formalin NMSL: Nước muối sinh lí 0,9%. 37 3.4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát thời gian tạo đáp ứng miễn dịch dặc hiệu trên cá rơ phi đỏ (Oreochromis sp.) sau khi tiêm huyền dịch dạng FKC của vi khuẩn Streptococcus sp. Vật liệu và dụng cụ: + Cá rơ phi đỏ cĩ trọng lượng trung bình là 87,3 g được mua từ bè nuơi của nơng dân, cá được nuơi trong điều kiện thí nghiệm 1 tháng trước khi tiến hành thí nghiệm. Cá được cho ăn thức ăn viên cơng nghiệp. + Bể nuơi: là bể xi măng, cĩ thể tích 0,75 m3, đặt trong mái che, sục khí liên tục và được thay nước đã được khử chlorine hàng ngày. + Huyền dịch dạng FKC của vi khuẩn Streptococcus sp.: chuẩn bị theo mục 3.3.4 + Thuốc gây mê: loại ethylenglycol monophenylether + Bơm tiêm: loại 1 ml dùng dể tiêm vaccine, loại 5ml dùng để lấy mẫu máu. + Lam kính + Nước muối sinh lí + Máy li tâm Cách tiến hành: Thí nghiệm được chia thành 2 lơ: A1 và A2. Mỗi lơ bố trí 50 con cá. Chuẩn bị huyễn dịch vi khuẩn Streptococcus sp. dạng FKC cĩ nồng độ 1 mg/ml bằng cách pha lỗng với nước muối sinh lí 0,9%. Tiêm với liều 0,2 ml vào xoang bụng cá. Lơ A2 được tiêm nhắc với liều lượng như trên vào ngày thứ 15 sau khi tiêm lần thứ nhất. Trước khi tiêm, cá được gây mê. Sau khi tiêm, định kì lấy máu cá, thu huyết thanh, thử phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính. Thực hiện liên tục cho đến khi nào khơng phát hiện kháng thể đặc hiệu với vi khuẩn Streptococcus sp. Tồn bộ thí nghiệm được tĩm tắt theo bảng 3.3: 38 Bảng 3.3 : Cách bố trí thí nghiệm 3 Lơ thí nghiệm A1 A2 Tổng số cá (con) Số lần tiêm (lần) Nồng độ vaccine (mg/ml) Liều tiêm (ml/cá thể) Ngày lấy máu kể từ sau khi tiêm 50 1 1 0,2 7, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 50 2 1 0,2 15, 20, 25, 30. 3.4.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát khả năng phịng bệnh do vi khuẩn Streptococcus sp. trên cá rơ phi đỏ đã đƣợc tạo đáp ứng miễn dịch bằng cách tiêm FKC trƣớc đĩ. Dụng cụ và vật liệu: + Cá điêu hồng từ thí nghiệm 3: sau 30 ngày được tiêm FKC của vi khuẩn Streptococcus sp. lần đầu + Bể nuơi: bể xi măng, cĩ thể tích 0,75 m3, sục khí liên tục và thay nước hàng ngày để đảm bảo chất lượng nước. + Vi khuẩn Streptococcus sp.: chuẩn bị tương tự như thí nghiệm 2 + Bơm tiêm: loại 1 ml + Kéo, kẹp, đĩa petri Cách tiến hành: Tồn bộ thí nghiệm 4 được tĩm tắt theo bảng 3.4 39 Bảng 3.4. : Cách bố trí thí nghiệm 4 Tên lơ thí nghiệm B1 B2 B3 Số cá (con) Nguồn lấy Số lần đã tiêm FKC trước đĩ (lần) Thời gian chờ trước khi thử thách (ngày) Liều tiêm thử thách (ml/cá thể) Nồng độ vi khuẩn (CFU/cá thể) Thời gian theo dõi sau khi tiêm (ngày) 15 A1 1 30 0,2 1,58*10 6 14 15 A2 2 30 0,2 1,58*10 4 14 15 A2 2 30 0,2 1,58*10 6 14 Thí nghiệm được chia thành 3 lơ: B1, B2, B3. Mỗi lơ bố trí 15 con cá. Gây cảm nhiễm cho cá với vi khuẩn Streptococcus sp. cịn sống bằng cách tiêm vào xoang bụng cá với nồng độ và liều tiêm như bảng 3.4. Trước khi tiêm, cá được gây mê. Thí nghiệm được theo dõi trong 14 ngày sau khi tiêm, mỗi ngày kiểm tra xem cĩ cá chết hay hấp hối khơng. Nếu cĩ thì tiến hành phân tích, quan sát dấu hiệu và mổ khám bệnh để tìm nguyên nhân. Sau thời gian theo dõi, tồn bộ số cá cịn lại được giải phẫu để phân lập vi khuẩn gây bệnh giống như phân lập mẫu cá bệnh thu ngồi tự nhiên. 40 IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả thí nghiệm 1 Bảng 4.1 : Kết quả kiểm tra hiệu giá ngƣng kết của kháng huyết thanh thỏ tại những thời điểm khác nhau Thời gian (ngày) Thỏ Loại tiêm Kết quả thử nghiệm sự ngưng kết Hiệu giá (lần pha lỗng) 0 ĐC NMSL - TN FKC + DK (da) - 14 ĐC NMSL - TN FKC + DK (da) - 28 ĐC NMSL - TN FKC + DK (da) + 1 35 ĐC NMSL - TN FKC (da) + 2 42 ĐC NMSL - TN FKC (tai) + 4 49 ĐC X - TN X + 8 Chú thích: NMSL: nước muối sinh li,9% FKC: Formalin Killed Cell DK: dầu khống ĐC: đối chứng TN: thí nghiệm (+): phản ứng ngưng kết dương tính (–): phản ứng ngưng kết âm tính. X: khơng tiêm Trong 4 tuần đầu tiên, chúng tơi thực hiện tiêm thỏ bằng FKC cĩ trộn dầu khống nhưng khi kiểm tra hiệu giá ngưng kết, kết quả âm tính, riêng ngày 28 thấy cĩ ngưng kết nhưng rất yếu. Pha lỗng huyết thanh ra 2 lần thì khơng cịn ngưng kết. 41 TN A B Sau ngày 28, chúng tơi tiêm FKC khơng cĩ dầu khống. Kết quả thể hiện trong lần lấy máu vào ngày 35, 42. Lượng kháng thể tăng lên rõ rệt. Vào ngày 49, chúng tơi thu kháng huyết thanh và thực hiện hiệu giá ngưng kết. Cĩ phản ứng ngưng kết giữa kháng nguyên – kháng thể khi pha lỗng huyết thanh 8 lần. Điều đĩ chứng tỏ, trong 4 tuần đầu, khả năng đáp ứng miễn dịch chưa mạnh. Cĩ thể do một nguyên nhân là sự nhũ hĩa giữa dầu khống và FKC được thực hiện khơng hiệu quả. Chú thích: A: Dương tính: vi khuẩn bất hoạt phân tán đều ở đáy giếng. B: Âm tính: vi khuẩn bất hoạt lắng tụ tạo thành đốm trắng nhỏ ở đáy giếng. ĐC: thỏ đối chứng. TN: thỏ thí nghiệm. Hình 4.1. : Kết quả ngƣng kết trên đĩa 96 giếng Chúng tơi cũng thực hiện các thử nghiệm ngưng kết nhanh trên phiến kính giữa huyết thanh thỏ với vi khuẩn Streptococcus sp. dạng FKC và vi khuẩn cịn sống phân lập từ cá rơ phi đỏ cảm nhiễm vào các thời điểm kiểm tra hiệu giá ngưng kết. Các kết quả thu được tương ứng với kết quả kiểm tra hiệu giá ngưng kết. ĐC TN 42 4.2. Kết quả thí nghiệm 2 Sau khi phân lập được chủng vi khuẩn Streptococcus sp. từ mẫu bệnh phẩm, chúng tơi tiến hành điều chế dạng FKC và tiêm cho cá. 14 ngày sau khi chủng, cũng từ chủng vi khuẩn chúng tơi sử dụng để gây cảm nhiễm cho cá với liều lượng 8,5*105 CFU/ml nhằm xác định hiệu lực phịng bệnh của cá tiêm FKC. Thí nghiệm được theo dõi trong 14 ngày tính từ lúc tiêm huyền dịch vi khuẩn. Kết quả gây cảm nhiễm được trình bày qua bảng 4.2 Bảng 4.2 : Số cá chết trong 14 ngày theo dõi Tên lơ C1 C2 C3 E1 E2 E3 Số cá trong lơ (con) 25 50 100 25 50 100 Số cá chết Ngày thứ 1 Ngày thứ 2 Ngày thứ 3 Ngày thứ 4 Ngày thứ 5 Ngày thứ 6 Ngày thứ 7 Ngày thứ 8 Ngày thứ 9 Ngày thứ 10 Ngày thứ 11 Ngày thứ 12 Ngày thứ 13 Ngày thứ 14 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 3 1 0 0 1 1 2 0 2 0 0 0 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 2 5 2 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Tổng 3 1 12 3 3 11 Tỉ lệ (%) 12 2 12 12 6 11 43 Bảng 4.2 cho thấy khơng cĩ sự khác biệt về tỉ lệ chết nếu so sánh trong cùng một mật độ nuơi giữa cá được tiêm FKC và cá đối chứng (tiêm nước muối sinh lí): 12% (lơ E1) và 12% ( lơ C1) (mật độ nuơi thấp), 2% (lơ C2) và 6% (lơ C2) (mật độ trung bình), 12% (lơ E3) và 11% (lơ C3) (mật độ cao). Kết quả cũng tương tự khi so sánh tỉ lệ chết của các mật độ nuơi khác nhau trong cùng điều kiện thí nghiệm. Theo kết quả nghiên cứu của Shoemaker C.A và ctv. (2000) về ảnh hưởng của mật độ nuơi và liều cảm nhiễm của vi khuẩn Streptococus iniae lên cá rơ phi (Oreochromis niloticus) với 3 mật độ: 5,6 g/l, 11,2 g/l, 22,4 g/l và gây cảm nhiễm cá với liều vi khuẩn từ 2,5*107 – 1*108 CFU/ml bằng phương pháp ngâm, cho thấy mật độ cĩ ảnh hưởng đến tỉ lệ chết của cá. Mật độ nuơi thấp sẽ cho tỉ lệ chết thấp hơn. Cĩ lẽ trong thí nghiệm này, liều tiêm chưa đủ dể tạo độc lực mạnh làm chết cá. Bảng 4.2 cũng cho thấy số cá chết thường tập trung trong tuần lễ đầu tiên sau khi tiến hành cảm nhiễm vi khuẩn cho cá. Những ngày cịn lại khơng cĩ cá chết, chỉ cĩ duy nhất ở lơ cá đối chứng cĩ mật độ nuơi 100 con/bể (Lơ C3). Theo kết quả nghiên cứu của Chang và Plumb (1996), cá chết cĩ những triệu chứng bệnh lí khá điển hình như mắt lồi và giác mạc đục. Song trong thí nghiệm mà chúng tơi tiến hành khơng ghi nhận được các triệu chứng bệnh tích điển hình như vậy. Nhưng khi phân lập thì xác định được chủng vi khuẩn Streptococcus sp. trong mẫu bệnh phẩm. Điều này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Klesius và ctv. (1999) với một liều chủng vaccine S. iniae dạng FKC qua con đường i.p. trên cá rơ phi (Oreochromis niloticus) đã làm giảm tỉ lệ chết xuống 91,3% và ngăn ngừa được các triệu chứng như: bơi lội bất thường, lồi mắt và giác mạc đục trên cá cĩ trọng lượng 25 g và 100 g. Trong thí nghiệm của chúng tơi, cá cĩ trọng lượng trung bình là 34,6 g và tỉ lệ sống sĩt trên nhĩm tiêm FKC là 88 – 94%. Cũng theo nghiên cứu sau đĩ của Klesius và ctv. (2000) trên cùng đối tượng, Klesius cho rằng hiệu lực của vaccine phụ thuộc vào độ tuổi của cá, cá nhỏ sẽ tạo đáp ứng miễn dịch kém hơn so với cá lớn. Kết luận này cũng được Muzquiz và ctv. (1999; trích bởi Klesius và ctv., 2000) đưa ra nhưng trên đối tượng nuơi là cá hồi. Từ thí nghiệm 2 chúng tơi cũng ghi nhận các kết quả tương tự như các kết quả của các cơng trình nghiên cứu trước đây. Theo ghi nhận của chúng tơi thì hầu hết các cá chết trong thời gian theo dõi cá nhỏ, cĩ trọng lượng cơ thể từ 15 – 20 g. Điều này phù hợp với kết luận ở trên. 44 Việc phân lập vi khuẩn từ cá chết trong thời gian theo dõi phát hiện thấy vi khuẩn Streptococcus sp. trong mẫu bệnh phẩm, theo chúng tơi cĩ lẽ liều tiêm chưa đủ tạo độc lực mạnh, và bản thân cá tồn tại sức đề kháng với mầm bệnh. Tuy nhiên sự loại thải vi khuẩn xảy ra khơng hồn tồn, một số ít vi khuẩn vẫn xâm nhập vào các nội quan nhưng chưa tạo độc lực đủ mạnh để gây nên các triệu chứng bệnh đặc trưng. Tuy nhiên, nếu so sánh về tỉ lệ chết với nhĩm cá đối chứng, rõ ràng huyễn dịch FKC đã chuẩn bị khơng chứng tỏ được hiệu quả. Nếu nghi ngờ một số yếu tố tạo stress cĩ tác động đến tỉ lệ chết thì theo kết quả nghiên cứu cứu Evans và ctv., (1999) vaccine làm giảm sự tạo stress khi cĩ mầm bệnh xâm nhiễm. Trong nghiên cứu này của ơng, đối tượng nghiên cứu là cá rơ phi vằn (O. niloticus) và vaccine phịng bệnh do S. agalactiae. Sau khi hết thời gian theo dõi 14 ngày, chúng tơi tiến hành giải phẫu tất cả số cá cịn lại, phân tích vi sinh vật giống như phân tích mẫu cá bệnh thu ngồi tự nhiên. Kết quả phân tích qua giải phẫu được thể hiện qua bảng 4.3 Bảng 4.3: Số cá phát hiện cĩ nhiễm Streptococcus sp. qua giải phẫu Lơ C1 C2 C3 E1 E2 E3 Số cá giải phẫu (con) Kết quả phát hiện Tổng số cá nhiễm (con) Tỉ lệ sau cùng (%) 22 0 3 12 49 0 1 2 88 12 24 24 22 0 3 12 47 0 3 6 89 5 16 16 Qua bảng 4.3 cho thấy cĩ 17 con phát hiện cĩ nhiễm Streptococcus sp., tập trung vào các lơ cá mật độ cao 100 con/bể: 5 con ở lơ E3 và 12 con ở lơ C3. Kết quả này đã bộc lộ tỉ lệ cảm nhiễm ở lơ nuơi mật độ cao (100 con/bể) giữa cá cĩ tiêm và khơng tiêm FKC cĩ sự khác biệt rõ rệt (16% so với 24%). Cá được tiêm FKC cĩ khả năng chống stress tốt hơn cá khơng tiêm FKC, giảm được tỉ lệ cảm nhiễm vi khuẩn. Bảng 4.3 cũng thể hiện tỉ lệ cảm nhiễm với vi khuẩn của cá ở mật độ nuơi cao cao hơn so với nuơi ở mật độ thấp (25 con/bể và 50 con/bể) trong cả lơ đối chứng và lơ tiêm FKC, chứng tỏ sức đề kháng của cá kém hơn khi nuơi ở mật độ cao. 45 Hình 4.2 : Hình thái khuẩn lạc của vi khuẩn Streptococcus sp. trên mơi trƣờng NA sau 24h nuơi cấy 4.3. Kết quả thí nghiệm 3 Mẫu máu cá được lấy định kì, thu huyết thanh và thử nghiệm phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính với vi khuẩn dạng FKC nhằm phát hiện kháng thể đặc hiệu với vi khuẩn Streptococcus sp. Kết quả thử nghiệm ngưng kết được thể hiện trong bảng 4.4 Bảng 4.4: Kết quả thực hiện phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính của các mẫu thu đƣợc với vi khuẩn Streptococcus sp. Lơ A1(tiêm FKC 1 lần) A2 (được tiêm nhắc) Số mẫu máu mỗi lần thu (mẫu) 3 3 Ngày lấy máu, thử phản ứng ngưng kết 7 10 15 20 25 30 35 40 45 20 25 30 Kết quả + + + + + + + + - + + + Chú thích: (+) : dương tính (–) : âm tính 46 Do số lượng cá cĩ giới hạn (50 con/lơ) và vì phải trích lấy thực hiện tiếp thí nghiệm 2 sau 30 ngày theo dõi, nên chúng tơi chỉ theo dõi khả năng tạo kháng thể đến ngày thứ 45 đối với lơ cá tiêm FKC liều đơn. Đối với lơ tiêm FKC nhắc lại, huyết thanh cá được theo dõi đến ngày thứ 30. Khả năng tạo đáp ứng miễn dịch ở cá điêu hồng diễn ra trong thời gian được 40 ngày. Đến ngày thứ 45 thì hồn tồn khơng phát hiện được nữa. Điều này phù hợp với các nghiên cứu trên cá nĩi chung. Các nghiên cứu đĩ cho rằng việc tạo đáp ứng miễn dịch trên cá sau khi tiếp xúc với tác nhân gây bệnh thường kéo dài khoảng vài tháng nếu khơng cĩ sự tiếp xúc lặp lại sau đĩ như nghiên cứu của Eldar và ctv. (1997) trên cá hồi (Oncorhynchus mykiss) với vaccine phịng Streptococcus iniae khi tiêm qua xoang bụng chỉ với liều đơn cĩ thể phát hiện kháng thể đặc hiệu trong 4 tháng. Khả năng tạo kháng thể tốt nhất vào khoảng 3 tuần đầu sau khi cá được chủng vaccine. Điều này căn cứ vào thời gian phản ứng ngưng kết xảy ra và mức độ tạo thành ngưng kết giữa kháng nguyên và kháng thể. Kết quả này chúng tơi khơng thể hiện ra đây nhưng qua các thử nghiệm đã được ghi nhận . Tất cả số mẫu huyết thanh thử nghiệm đều cho phản ứng. Như vậy khả năng tạo đáp ứng rất đồng đều giữa các cá thể trong đàn . Dù khơng tiếp tục theo dõi trên lơ được tiêm FKC nhắc lại, nhưng chắc chắn thời gian tạo đáp ứng miễn dịch với vi khuẩn Streptococcus sp. sẽ kéo dài hơn với lơ chỉ chủng liều đơn . Cĩ thể là do cá lớn, trọng lượng trung bình là 87,3 g nên khả năng tạo đáp úng miễn dịch tốt. 4.4. Kết quả thí nghiệm 4 Kết quả theo dõi số cá chết hoặc hấp hối và số cá cảm nhiễm được thể hiện qua bảng 4.5 47 Bảng 4.5. Kết quả theo dõi trong suốt thí nghiệm 4 Tên lơ thí nghiệm B1 B2 B3 Nguồn lấy (lơ) A1 A2 A2 Số cá trong lơ (con) 15 15 15 Số cá chết (con) 0 0 0 Số cá mổ khám (con) 15 15 15 Số cá phát hiện cĩ nhiễm (con) 0 0 0 Tỉ lệ tổng nhiễm (%) 0 0 0 Bảng 4.5 cho thấy khơng cĩ cá hấp hối hay chết trong suốt thời gian theo dõi, cũng như sau khi mổ khám vào cuối thí nghiệm, khơng phát hiện thấy cá nhiễm vi khuẩn Streptococcus sp. Qua kết quả thu được từ thí nghiệm 3, chúng tơi phát hiện cá cĩ thể tạo được kháng thể đặc hiệu trong thời gian 40 ngày. Kết quả đĩ là trên cá rơ phi được chủng liều đơn. Vì cá cĩ các tế bào cĩ chức năng ghi nhớ miễn dịch trong hệ thống miễn dịch nên sẽ tạo được đáp ứng mạnh hơn trong lần tiếp xúc lặp lại với cùng loại kháng nguyên, cho nên trên cá được tiêm FKC lặp lại, thời gian sản xuất kháng thể đặc hiệu sẽ dài hơn. Theo Klesius và ctv., (1999) khả năng miễn dịch kháng S. iniae của cá rơ phi phụ thuộc vào kháng thể kháng S. iniae cả về lượng và chất. Kết quả thu được từ thí nghiệm 3 cho thấy rằng trong khoảng tháng đầu tiên sau khi tiêm FKC, cá tạo được lượng kháng thể kháng vượt trội. Cá được tiêm thử thách sau giao đoạn này nên khả năng kháng bệnh sẽ cao. Ở thí nghiệm này, cá tạo đáp ứng miễn dịch tốt mặc dù được thử thách với nồng độ vi khuẩn rất cao là 1,58*106 CFU/ml. Hơn nữa, cá được thí nghiệm ở đây là cá lớn (trọng lượng trung bình là 87,3 g) nên khả năng đề kháng và tạo đáp ứng miễn dịch tốt hơn so với cá nhỏ. Điều này chúng tơi đã thảo luận ở trên. Kết quả thu được cũng gần giống với kết quả nghiên cứu của Klesius và ctv. (1999) đạt từ 84,2 – 94,7% khi các nhà nghiên cứu tiến hành trên cá cĩ trọng lượng trung bình là 100 g cĩ tỉ lệ sống sĩt tương đối (RPS – relative percent survival) nhưng liều thử thách cao hơn 1*108 CFU/cá thể, thời gian theo dõi dài hơn tới 60 ngày. Với thời gian tạo kháng thể như thế thì vi khuẩn đã bị trung hịa hồn tồn, cơ lập và loại thải khỏi cơ thể trong những ngày đầu. Điều này được chứng minh qua việc 48 khơng phát hiện được vi khuẩn trong nội quan của cá khi mổ khám – phân lập sau khi hết 14 ngày theo dõi. Như vậy, việc tiêm cho cá rơ phi cĩ trọng lượng trung bình là 87,3 g với huyền dịch FKC của vi khuẩn Streptococcus sp. bằng phương pháp tiêm i.p. đã giúp cá khơng bị cảm nhiễm vi khuẩn đã dùng gây bệnh . 49 V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Ở thỏ cĩ xảy ra sự đáp ứng miễn dịch với vi khuẩn Streptococcus sp. nhưng khả năng tạo đáp ứng miễn dịch chưa cao trong 7 tuần (49 ngày) khảo sát. Khả năng tạo đáp ứng miễn dịch trên cá cĩ trọng lượng 34,6 g kém, khơng đủ để bảo vệ cơ thể cá khỏi nhiễm bệnh do Streptococcus sp. Mật độ nuơi cĩ ảnh hưởng lên tỉ lệ cảm nhiễm vi khuẩn Streptococcus sp. giữa mật độ cao (100 con/1m3) và mật độ thấp (25 con/m3), giữa mật độ cao và mật độ trung bình (50 con/m3) dù đã được hay chưa được kích thích đáp ứng miễn dịch trước đĩ. Tuy nhiên, giữa mật độ nuơi thấp và mật độ nuơi trung bình, tỉ lệ cảm nhiễm khơng cĩ sự khác biệt. Cá cĩ trọng lượng 87,3 g cho đáp ứng miễn dịch cao khi tiêm xoang bụng (i.p.) với FKC của vi khuẩn Streptococcus sp., thời gian tạo kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên vi khuẩn Streptococcus sp. khi tiêm liều đơn kéo dài được 40 ngày. Cá cĩ trọng lượng 87,3 g đã được kích thích tạo đáp ứng miễn dịch trong 30 ngày cĩ tỉ lệ nhiễm Streptococcus sp. sau khi gây nhiễm là 0,00% trên tất cả các lơ. 5.2. Đề nghị Trên cá Tiếp tục theo dõi khả năng đáp ứng miễn dịch của cá khi được kích thích miễn dịch lặp lại về thời gian, cường độ đáp ứng. Tiếp tục khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố khác ảnh hưởng đến tỉ lệ chết vì bệnh do vi khuẩn Streptococcus sp, từ đĩ đưa ra chiến lược quản lí và kiểm sốt dịch bệnh để đạt được hiệu quả kinh tế cao nhất và an tồn cho mơi trường. Nghiên cứu sản xuất vaccine phịng bệnh do vi khuẩn Streptococcus sp. và các bệnh do vi khuẩn khác cho cá. Trên thỏ Tiếp tục khảo sát đáp ứng của thỏ với các chất bổ trợ khác. Nghiên cứu điều chế kháng huyết thanh thỏ cĩ hiệu giá ngưng kết cao hơn với vi khuẩn Streptococcus sp. dùng cho chẩn đốn bệnh. 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 1/ Báo Khoa học phổ thơng và Nhà văn hĩa khoa học, 2002. Hội thảo chuyên đề: Thủy sản: nuơi trồng, chất lượng và xuất khẩu. Website: www.ctu.edu.vn/colleges/aquaculture/aquafishdata/index.htm. 2/ Dương Phượng Uyên, 2005. Khảo sát kỹ thuật nuơi và bệnh do Streptococcus sp. trên cá rơ phi nuơi bè. Khĩa luận tốt nghiệp kỹ sư Thủy sản, trường Đại học Nơng lâm Tp. Hồ Chí Minh. 3/ Đỗ Ngọc Liên, 1999. Miễn dịch học cơ sở. Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội, 240 trang. 4/ Hồng Hải Hĩa, 2001. Chẩn đốn huyết thanh học bệnh thương hàn gà do Samonella gallinarum – pullorum bằng phương pháp ngung kết nhanh trên phiến kính. Luận văn tốt nghiệp thạc sỹ Khoa Chăn nuơi – Thú y, Đại học Nơng Lâm Tp. HCM 5/ Lê Văn Hùng, 2002. Miễn dịch học thú y. Nhà xuất bản Nơng nghiệp, Tp. HCM, Việt Nam. 192 trang. 6/ Mai Chi, 2002. Thấy cá điêu hồng tìm hiểu nguồn gốc rơ phi đỏ. Báo Khoa học phổ thơng số 638 : 43 – 46. 7/ Nguyễn Đình Bảng và Nguyễn Thị Kim Hương, 2003. Vaccine và chế phẩm miễn dịch trong phịng và điều trị. Nhà xuất bản Y học, Hà Nội. 8/ Nguyễn Mạnh Thắng, 2003. Nghiên cứu sử dụng montanide – 50 làm chất bổ trợ miễn dịch cho vaccine tụ huyết trùng. Luận văn tốt nghiệp thạc sỹ Khoa Chăn nuơi – Thú y, Đại học Nơng Lâm Tp. HCM . 9/ Nguyễn Thị Ngọc Bích, 2005. Khảo sát một số đặc điểm gây bệnh của các vi khuẩn phân lập từ cá rơ phi nuơi bè. Khĩa luận tốt nghiệp kỹ sư Thủy sản, Trường Đại học Nơng lâm Tp. Hồ Chí Minh. 10/ Nguyễn Tri Cơ, 2004. Điều tra tình hình nuơi và dịch bệnh trên cá rơ phi nuơi bè ở đồng bằng sơng Cửu Long và cách phịng trị. Khĩa luận tốt nghiệp kỹ sư Thủy sản, Trường Đại học Nơng lâm Tp. Hồ Chí Minh. 51 11/ Nguyễn Vĩnh Phước, 1977. Vi sinh vật thú y. Tập 1. Nhà xuất bản ĐH và THCN, Hà Nội. 12/ Trần Văn Vỹ, 1999. 35 câu hỏi đáp về nuơi cá rơ phi. Nhà xuất bản Nơng nghiệp, Hà Nội. 13/ Võ Văn Tuấn, 2005. Hiện trạng và tình hình bệnh vi khuẩn trên cá rơ phi đỏ nuơi lồng bè tại tỉnh Đồng Nai. Khĩa luận tốt nghiệp kỹ sư Thủy sản, trường Đại học Nơng lâm Tp. Hồ Chí Minh. 14/ Vương Thị Việt Hoa, Vũ Thị Lâm An, Tơ Minh Châu, Nguyễn Thị Ngọc Diệp, Lâm Thanh Hiền và Nguyễn Thúy Hương, 1999. Vi sinh vật học đại cương.Tủ sách trường Đại học Nơng lâm Tp. Hồ Chí Minh, 220 trang. 52 Tài liệu tiếng nƣớc ngồi 1/ Aasjord P. M. and Slinde E., 1994. Fish vaccine: development, production and use of bacterial vaccine with special reference to salmon. Fisheries processing biotechnological application (Martin A. M.). Chapman & Hall, London, England, p. 432 – 465. 2/ Chang P.H. and Plumb J.A., 1996. Histopathology of experimental Streptococcus sp. infection tilapia (Oreochromis niloticus) and channel catfish (Ictalurus punctatus) (Rafinesque). Journal of fish disease.: 236. 3/ Eldar A., Horovitcz C. and Bercovier H., 1997. Development and efficacy of affecting mortality of Streptococcus iniae infection infarmed rainbow trout. Vet. Immunol. Immunpathol. Vol.56, no. 1 – 2:175 – 183. 4/ Evans J.J, Klesius P.H., Shoemaker C.A. and Fitzpatrick B.T., 2005. Streptococcus agalactiae vaccination and infection stress in Nile tilapia, Oreochromis niloticus. Journal of Applied Aquaculture 13 (issue 3/4):105 – 115. 5/ Fox J. M., 2005. Immune respone of aquatic organisms. Website: www.sci.tamuec.edu/pals/index/WEBPAGE/immune.ppt 6/ Klesius P.H., Shoemaker C.A and Evans J.J, 2000. Efficacy of single and combined Streptococcus iniae isolate vaccine administered by intraperitoneal and intramuscular routes in tilapia (Oreochromis niloticus). Aquaculture 188: 237 – 246. Elsivier science B.V, Armterdam, NL. 7/ Klesius P.H., Shoemaker C.A and Evans J.J., 1999. Efficacy of a killed Streptococcus iniae vaccine in tilapia (Oreochromis niloticus). Bull. Ass. Fish Pathol 19 (1): 1-3. 8/ Nguyen H.T. and Kanai K., 1999. Selective agars for the isolation of Streptococcus iniae from Japanese flounder, Paralichthys olivaceus, and its cultural environment. Journal of Applied Microbiology 86 : 769 – 776. 9/ Popma T., Masser M., 1999. Tilapia, life history and biology. Website: www.aquanic.org/publicat/usda_rac/srac/283fs.pdf. 10/ Roberson B.S., 1990. Bacterial agglutination. Techniques in fish immunology (J.S Stolen, TC Pletcher, D.P. Anderson, B.S Roberson, W.B. van Muiswinkel), SOS Publications, New Jesey, USA, p. 81 – 86. 53 11/ Shoemaker C.A., Klesius P.H and Evans J.J., 1999. Density and dose: factors affecting mortality of Streptococcus iniae infected tilapia (Oreochromis niloticus). Aquaculture 188: 229 – 235. 12/ Souter W. B., 1983. Immunization with vaccines. A guide to integrated fish health management in the Great Lakes basin (Meyer F. P., Warren J. W., Carey T. G.), Ann Arbor, Michigan, USA , p. 111 – 119. Website: www.glfc. Org/pubs/special_pubs/sp83_2/pdf/chap13.pdf 13/ Stoskopf M. K., 1993. Clinical examination and procedures. Fish medicine (Stoskopf M. K.), W. B. Sounder, Philadelphia, USA, p. 62 – 78. 14/ Stoskopf S. K., 1993. Immunology. Fish medicine (Stoskopf M. K. ), W. B. Sounder, Philadelphia, USA, p. 149 – 159. 15/ Weistein M.R et al., 1997. Invasive infections due to a fish pathogen, Streptococcus iniae. The New England Journal of Medicine 337 (9): 589 – 595. Website: www.nejm.org. 16/ Yanong R.P.E. và Floyd R.F, 2001. Streptococcal infections of fish. Website: www.edis.ifas.ufl.edu/FA057-25k