Các phương pháp chuyên dùng trong kiểm định chất lượng thủy sản

MỤC LỤC I.LỜI MỞ ĐẦU …………………………………………………………………………………. 2 II.PHƯƠNG PHÁP LẤY MẪU …………………………………………………...……….. 3 1.Mục đích và yêu cầu ……………………………………………………………………….……… 3 2.Thủ tục lấy mẫu và quản lý mẫu …………………………………………………………………... 3 2.1. Trách nhiệm của người phụ trách phịng thí nghiệm……………………………………………. 3 2.2. Trách nhiệm của người lấy mẫu………………………………………………………………… 3 2.3. Quy định lấy mẫu………………………………………………………..……………………… 3 III. PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA NHANH………………………………………………………… 6 1.Kiểm tra hàm lượng Urê trong thủy sản…………………………………………………………… 6 2.Kiểm nhanh dư lượng Chloramphenicol…………………………………………………………… 8 3.Phân tích thủy ngân bằng phương pháp CV-AAS……………………………………………. 9 4. Nguyên tắc kỹ thuật nguyên hĩa khơng ngọn lửa……………………………………………. 11 IV. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ……………………………………………………….. 14 1. Phương pháp định lượng Sulfit trong sản phẩm thủy sản ……………………………………. 14 2. Phương pháp định tính axit boric và muối borat trong sảm phẩm thủy sản………………… 15 3. Phương pháp định tính Urê trong sản phẩm thủy sản……………………………………….. 16 4. Phương pháp định lượng bằng sắc ký ion muối Polyphosphat trong sản phẩm thủy sản….. 16 5. Phương pháp định lượng bằng sắc ký khí hàm lượng…………………………………………. 18 6. Ứng dụng của phương pháp nguyên tử hĩa bằng ngọn lửa………………………………….. 23 7. Salmonella trong sản phẩm thuỷ sản..................................................................................... 24 TÀI LIỆU THAM KHẢO…………………………………………………………………………. 26 LỜI MỞ ĐẦU Ngành thủy sản thế giới và nước ta đang cĩ những bước phát triển nhanh chĩng trong nhiều lĩnh vực như kỹ thuật nuơi trồng thủy sản, kỹ thuật khai thác thủy sản, quản lý mơi trường - nguồn lợi thủy sản, quản lý dịch bệnh thủy sản, cơng nghệ sinh học ứng dụng trong thủy sản và chế biến thủy sản. Ngành thủy sản đã và đang trở thành ngành kinh tế mũi nhọn của nhiều quốc gia, trong đĩ cĩ Việt Nam. Ở nước ta, Đồng Bằng Sơng Cửu Long (ĐBSCL) cĩ vị trí và vai trị rất quan trọng đối với sự phát triển thủy sản của cả nước, chiếm trên 80% tổng diện tích nuơi và sản lượng nuơi của cả nước. Vệ sinh an tồn thực phẩm trong cả nước nĩi chung và của TP nĩi riêng đang tạo nhiều lo lắng cho người dân. Thực chất, nhiều sự kiện như việc tiếp tục sử dụng những hố chất cấm dùng trong nuơi trồng, chế biến, bảo quản sản phẩm thủy sản,và việc sản xuất một số sản phẩm kém chất lượng. Gần đây một số vấn đề liên quan đến quản lý an tồn vệ sinh thực phẩm, sự khác biệt giữa các kết quả phân tích kiểm tra chất lượng sản phẩm vừa gây khơng ít khĩ khăn cho người sản xuất vừa tạo thêm lo lắng cho người tiêu dùng trong khi chúng ta đang cố gắng tạo những ưu thế về nhiều mặt để cĩ nhiều lợi thế nhất với cương vị l một thành viên bình đẳng của WTO. Theo hệ thống cảnh báo và thơng báo của Châu Âu, năm 2004, trong số hàng thực phẩm Việt Nam xuất sang châu Âu, cĩ 59 lơ khơng đạt chất lượng (Việt Nam xếp thứ 13 trongsố các nước bị cảnh báo), con số nầy là 124 vàViệt Nam xếp thứ 7 trong năm 2005. Trong 6 tháng đầu năm 2007, nhiều lơ hàng nơng thủy sản xuất khẩu bị Hoa kỳ, Canada, Nhật, Nga, Singapore từ chối. Những sự kiện ấy phản ánh phần nào những tồn đọng, bất cập trong sản xuất của các doanh nghiệp Việt Nam trong khi đĩ đã vào WTO thì phải chấp nhận cạnh tranh khốc liệt về chất lượng ngay cả trên sân nhà. Đặc biệt về phía người tiêu dùng, ở các nước phát triển, họ rất quan tâm đến chất lượng hàng hĩa, đặc biệt chất lượng thực phẩm, do đĩ tạo được sức ép rất lớn trên nhà sản xuất cũng như nhà quản lý. Người tiêu dùng Việt Nam chắc chắn cũng cĩ yêu cầu bức xúc về chất lượng hàng hĩa, tuy nhiên do cuộc sống nĩi chung cũng cịn khơng ít khĩ khăn cho nên yêu cầu về chất lượng vẫn chưa đủ mạnh để cĩ thể tạo sức ép hữu hiệu trên sản xuất cũng như trên quản lý. Tuy nhiên đĩ vẫn là những quan tâm hang đầu của các bà nội trợ. Vấn đề then chốt là làm thế nào quản lý được tốt chất lượng nơng thủy sản thực phẩm Việt Nam khơng nhiễm vi sinh, khơng chứa hĩa chất bị cấm, hĩa chất ngồi danh mục cho phép, hay bị nhiễm hĩa chất quá giới hạn cho phép hầu nâng cao năng lực cạnh tranh doanh nghiệp, bảo đảm an tồn cho người tiêu dùng, đĩng gĩp được phần quan trọng vào phát triển kinh tế-xã hội của đất nước. Việc kiểm tra chất lượng thủy sản vẫn con gặp nhiều hạn chế do số phịng thử nghiệm cĩ trình độ và kinh nghiệm cịn ít và việc mở rộng hoạt động kiểm nghiệm đánh giá, chứng nhận chất lượng sản phẩm hàng hĩa cho tổ chức, cá nhân trong và ngồi nước chưa thật phổ biến. PHƯƠNG PHÁP LẤY MẪU Mục đích và yêu cầu: Trong kiểm nghiệm vi sinh, cơng đoạn lấy mẫu dù được thực hiện bên ngồi phịng thí nghiệm nhưng lại là một cơng đoạn rất quan trọng trong kiểm định chất lượng thủy sản. Mọi sai sĩt trong cơng đoạn này ( Ví dụ: Lượng mẫu khơng đủ, mẫu bị nhiễm bẩn từ mơi trường ngồi, bị nhiễm bẩn từ dụng cụ, bị biến đổi do các quá trình lý, hĩa, sinh học trong khi bảo quản) đều cĩ thể dẫn đến những sai lệch nghiêm trọng trong kết quả phân tích.Vì vậy, thực hiện cơng đoạn này nghiêm túc và đúng quy cách sẽ gĩp phần khơng nhỏ vào sự chính xác của kết quả phân tích. Việc lấy mẫu phải đảm bảo hai điều kiện sau: Mẫu lấy phải đại diện được cho lơ hàng hoặc nơi lấy mẫu ( khi kiểm tra vệ sinh cơng nghiệp) và được nhận dạng rõ ràng. Hàm lượng các chất hay các VSV cần xác định khơng được biến đổi kể từ khi lấy mẫu đến khi phân tích. Để đáp ứng hai điều kiện trên, ngồi việc xây dựng kế hoạch, chương trình lấy mẫu cho các thơng tin cần thiết, phịng kiểm nghiệm cịn phải thiết lập và tuân thủ nghiêm ngặt các quy định trong thủ tục lấy và quản lý mẫu, mọi thành viên cĩ liên quan cần phải đảm bảo di trì ổn định các đặc tính của mẫu trước khi đưa vào thử nghiệm. Thủ tục lấy mẫu và quản lý mẫu: Trách nhiệm của người phụ trách phịng kiểm nghiệm: Chỉ định người lấy mẫu cụ thể: người đã được đào tạo hoặc đã được hướng dẫn kỹ thuật lấy mẫu. Đảm bảo mẫu được lấy theo đúng yêu cầu:cĩ đầy đủ chương trình/kế hoạch, phương pháp lấy mẫu thích hợp. 2.2.Trách nhiệm của người lấy mẫu: Đọc kỹ tài liệu làm căn cứ lấy mẫu tương ứng. Chuẩn bị đủ các trang bị, dụng cụ lấy mẫu và bảo quản mẫu phù hợp. Chuẩn bị biên bản lấy mẫu, nhãn mẫu. 2.3.Quy định lấy mẫu: Kế hoạch lấy mẫu: Lượng mẫu để kiểm tra lơ hàng tùy thuộc vào sản phẩm cụ thể, nhưng khơng được ít hơn yêu cầu kiểm nghiệm.Theo quy định của tiêu chuẩn Việt Nam thì lượng mẫu lấy khơng lớn hơn 0.1% lơ hàng, lơ hàng càng lớn, tỷ lệ lấy mẫu càng thấpnhưng khơng ít hơn 2 đơn vị sản phẩm. Tùy vào mục đích kiểm tra các chỉ tiêu chất lượng thủy sản sẽ cĩ những phương pháp lấy mẫu và cách lấy mẫu khác nhau. Và chọn các thiết bị phân tích tối ưu cho từng lợi chỉ tiêu đĩ. Mật độ VSV trong thực phẩm được giới hạn bởi một số lượng nhất định tùy thuộc vào: nhĩm VSV cần phân tích (tổng số tạp khuẩn hiếu khí, tổng số coliforms . . .), đối tượng thực phẩm (hàng đơng, hàng luộc) và luật về vệ sinh an tồn thực phẩm của từng quốc gia nhập khẩu. Việc xác định số lượng VSV trong thực phẩm cĩ thể khơng phản ánh chính xác số lượng VSVthực tế cĩ trong mẫu, vì thế theo quy ước, một khoảng giới hạn tính theo cấp độ được thiết lập để nhận biết mẫu thực phẩm khơng đạt yêu cầu: Cấp 1: Là cách lấy mẫu cổ điển, trogn đĩ việc đánh giá kết quả kiểm nghiệm chỉ dựa trên một giá trị duy nhất của mẫu, vd: tiêu chuẩn của VN và một số nước châu Á …cho phép tổng số vi khuẩn hiếu khí trong mặt hàng thủy sản đơng lạnh là <1.000.000 VSV/g sản phẩm. Cấp 2: Kế hoạch lấy mẫu loại 2 được dùng cho các thử nghiệm định tính VSV gây bệnh, vd: lấy một số lượng mẫu nhất định (n=5,10,20, hay nhiều hơn) để phân tích định tính VSV gây bệnh. Kết quả được coi là khơng đạt khi 1 trong số 5 mẫu (n=5) bị phát hiện cĩ VSV gây bệnh. Số lượng mẫu thử phụ thuộc vào mối nguy tiềm ẩn trong từng loại thực phẩm. Thực phẩm cĩ nguy cơ cao là những loại thực phẩm khơng qua gia nhiệt trước khi sử dụng hoặc những thực phẩm cĩ tính nhạy cảm cao như các loại thực phẩm dành cho trẻ em, người già…. Cấp3: Khoảng đạt yêu cầu khi mật độ VSV nhỏ hơn thơng số giới hạn dưới (m), khoảng giới hạn chấp nhận cĩ điều kiện (vd: c/n = 2/5) khi mật độ vi sinh lớn hơn giới hạn dưới nhưng nhỏ hơn giới hạn trên (M). Khoảng khơng chấp nhận khi mật độ này cao hơn giới hạn trên (M).Giới hạn trên (M) thường cao hơn ít nhất 10 lần so với giới hạn dưới (m). Ví dụ: n=5, c=2, m=105, M=106 (trong đĩ: n là số mẫu thử nghiệm, c là số mẫu được phép nằm trong khoảng giữa m và M) Vị trí lấy mẫu: Giá trị kết quả từ các phịng thí nghiệm phụ thuộc rất nhiều vào vị trí và cách lấy mẫu. Trong kiểm nghiệm vi sinh, đối với các loại mẫu thịt hay cá, nơi nhiễm chủ yếu là bề mặt sản phẩm. Vì thế cĩ thể sử dụng các dụng cụ lấy mẫu bề mặt để quét trên bề mặt sản phẩm hay cắt mẫu trên bề mặt với độ dày khoảng 2-3mm. Đối với các thực phẩm đã đĩng gĩi, lấy mẫu từ các gĩi lớn từ đĩ lấy ra các đơn vị bao gĩi nhỏ hơn. Mẫu kiểm phải mang tính đại diện cho lơ thực phẩm, bằng khơng phải lấy nhiều mẫu hơn Mẫu kiểm của một lơ hàng lớn hoặc mẫu thực phẩm chưa bao gĩi tối thiểu phải đạt 200g, trong khi mẫu sản phẩm bao gĩi tối thiểu chỉ cần 100g, với sản phẩm bao gĩi, chỉ những sản phẩm cịn nguyên bao mới được dùng để phân tích, Dụng cụ lấy mẫu và thùng chứa mẫu: Dụng cụ lấy mẫu thường làm bằng các loại vật liệu khác nhau như vật dụng dung để lấy mẫu đơng lạnh là các khoan tay đã được vơ trùng, hay các dao, thìa, kéo được hấp, sấy hoặc rửa trong các dung dịch tẩy trùng… để cho mẫu vào trong bình chứa. Ghi kí hiệu – nhận dạng mẫu thử Phịng kiểm nghiệm phải cĩ qui định riêng về ghi kí – mã hiệu của mẫu thử sao cho cĩ thể nhận dạng được mẫu thử trong suốt quá trình từ khi lấy mẫu đến khi trả phiếu kết quả phân tích, khơng để xảy ra nhầm lẫn do việc sử dụng kí hiệu khơng rõ rang hoặc ghi sai so với nguồn gốc của mẫu, ví dụ: Việc ghi kí hiệu riêng cho từng phân xưởng, kí hiệu riêng trên bao bì nguyên liệu của khách hàng… Kí mã hiệu này sẽ xuất hiện trên mẫu và trên tất cả các giấy tờ, sổ sách cĩ liên quan đến mẫu thử như: biên bản lấy mẫu, phiếu giao nhận mẫu sổ nhận mẫu báo cáo kết quả thử nghiệm, phần mẫu lưu ( nếu cĩ). Kí mã hiệu ghi trên mẫu phải đảm bảo bền vững với các tác nhân vật lý như khơng bị phai mực, được ghi trên nhãn cĩ độ bám dính tốt. Bảo quản và vận chuyển mẫu Các mẫu sau khi lấy được bảo quản tách biệt nhau trong các thùng bảo quản mẫu, làm lạnh bằng các bao nước đá. Nước đá phải được bảo quản sao cho khơng được tan chảy quá nhanh trong quá trình vận chuyển mẫu đến phịng thí nghiệm. Tại phịng thí nghiệm mẫu được chuyển vào trong tủ đơng và được phân tích ngay trong thời gian cĩ thể được. Nếu khơng thể phân tích ngay, mẫu phải được bảo quản ở -200C cho đến khi phân tích. Nếu các mẫu khơng thể bảo quản đơng, cĩ thể bảo quản trong tủ lạnh 0 – 40C nhưng khơng được quá 36 giờ. Các loại thực phẩm như đồ hộp, thực phẩm cĩ độ ẩm thấp, hay thực phẩm khĩ hư hỏng cĩ thể bảo quản ở nhiệt độ phịng cho đến khi phân tích. Tốt nhất nên giữ mẫu trong các bao bì ban đầu. Nếu phải chuyển mẫu qua bao bì khác, mẫu phải được chứa đựng trong bao bì vơ trùng/sạch và làm bằng vật liệu khơng ảnh hưởng đến chất lượng và tình trạng ban đầu của mẫu, làm sai lệch kết quả phân tích. Mẫu phải được bảo quản trong điều kiện thích hợp trước khi vận chuyển về phịng kiểm nghiệm. Các vật dụng chứa mẫu phải được thiết kế sao cho mẫu khơng bị nhiễm bẩn và tránh các hiện tượng thay đổi khác do các yếu tố cơ, lý, hĩa học. Chế độ bảo quản mẫu: Đối với mẫu mau hỏng (Sushi các loại, đơng IQF, dạng hút chân khơng, dạng ướt đá) : Phải được bảo quản lạnh ngay sau khi lấy mẫu bằng thùng cách nhiệt cĩ đá để duy trì mẫu ở nhiệt độ thấp ( 0 – 40C). Mẫu cần được để trong bao bì kín, tránh tiếp xúc trực tiếp với nước đá. Mẫu khơng thuộc mẫu mau hỏng: Sử dụng các bao túi kín, nhiệt độ bảo quản trong thời gian vận chuyển khơng vượt quá 450C. Mẫu dạng đơng block: khơng được để tan đá một phần hoặc tồn bộ trước khi về đến phịng kiểm nghiệm. Yêu cầu về mẫu kiểm: Mẫu được chấp nhận khi Dụng cụ chứa mẫu khơng rị rỉ, cĩ nắp đậy kín, khơng bị rứt, thủng gây nhiễm bẩn vào mẫu. Mẫu dạng hút chân khơng: bao bì kín, khơng cĩ khí bên trong. Mẫu dạng block, dạng nguyên con phải nguyên vẹn, khơng giập nát. Mẫu phải được phân tích trong vịng 24 giờ từ khi lấy. Trong trường hợp xác định được thời gian sử dụng, yêu cầu về nhiệt độ và thời gian chờ kiểm cĩ thể rộng hơn.Mẫu kiểm dạng đơng phảo được bọc để chống mất nước và giữ ở nhiệt độ tối đa 180C cho đến khi phân tích. Thực phẩm đơng lạnh: Mẫu kiểm hang đơng phải được rã đơng ở 40C trong vịng 18 giờ. Những mẫu cĩ kích thước nhỏ hoặc dễ tan cĩ thể đặt trong tủ ấm ( ≤ 370C ) để rã đơng. Quá trình rã đơng phải được hồn tất trong vịng 15 phút. KIỂM TRA NHANH Kiểm tra hàm lượng Urê trong thủy sản: Giấy thử urê và dụng cụ cảm biến urê do một nhà khoa học vừa mới chế tạo TS.Trần Bích Lam, Khoa Kỹ thuật Hĩa học – Trường ĐH Bách khoa (ĐH Quốc gia TPHCM) và các cộng sự vừa thành cơng trong việc chế tạo 2 dụng cụ phân tích nhanh giúp xác định urê trong thực phẩm. Đĩ là giấy thử urê và dụng cụ cảm biến urê - cĩ thể cho kết quả chỉ trong vịng 10-15 phút. Theo TS Lam thì 21/30 mẫu thử nghi vấn (cá, tơm, mực, muối dùng ướp cá, nước đá ướp cá, nước rỉ từ xe ướp cá...) cho kết quả cĩ chứa hàm lượng urê quá cao. Cĩ nhiều nguyên nhân dẫn đến sự cĩ mặt của urê trong thực phẩm, ngồi lượng urê nội sinh thì urê được dùng để bổ sung vào mơi trường lên men, dùng trong thức ăn cho bị sữa, thậm chí để ướp thủy hải sản. Cĩ trường hợp urê cịn được những đối tượng gian lận cho thêm vào sản phẩm nhằm làm tăng độ đạm tổng, dẫn đến việc xác định sai hàm lượng protein và giá trị dinh dưỡng thật của thực phẩm. Ngồi ra, urê cịn xuất hiện trong nguồn nước ơ nhiễm và thực phẩm bị nhiễm phân - nguyên nhân gây ra một số bệnh và dịch bệnh liên quan đến đường ruột, viêm gan A, viêm gan E... “Vì thế, kiểm sốt hàm lượng urê trong thực phẩm là việc làm cần thiết để bảo vệ sức khỏe cho người tiêu dùng”- TS Lam nhấn mạnh. Giấy thử urê: Được làm từ một loại cellulose cĩ đủ độ dai, cứng để khi đưa vào mơi trường dung dịch lỏng vẫn giữ được hình dạng. Phải đủ độ xốp để cĩ thể thấm được dung dịch lên nĩ. Giấy thử này hoạt động trên nguyên lý ứng dụng thành tựu của enzym học để phân tích nhanh. Giới hạn phát hiện là 50 ppm. Nếu được thương mại hĩa, mỗi miếng giấy thử chỉ cĩ giá khoảng 900 đồng, sử dụng cho một lần thử. Phưong pháp: Đặt đầu trắng của giấy thử vào dung dịch cần thử và chờ khoảng 15 phút. Khi đĩ, dung dịch sẽ tự thấm lên giấy và giấy sẽ đổi màu. Nếu trong dung dịch cĩ urê thì cột màu sẽ chuyển sang màu hồng hay đỏ. Dung dịch chứa càng nhiều urê thì màu đỏ càng đậm hơn. Nếu cá nhiễm urê thì giấy thử sẽ chuyển sang màu đỏ Dụng cụ cảm biến urê (urea biosensor) Cảm biến này được chế tạo trên cơ sở máy đo pH được gắn cố định enzym urease Ngồi việc xác định mẫu cĩ urê hay khơng cịn cĩ khả năng cho biết hàm lưọng của urê. Dụng cụ cảm biến biosensor cĩ giá khoảng 600.000 đồng/chiếc, khơng giới hạn thời gian và số lần sử dụng. Nguyên tắc: Nếu dung dịch thử cĩ chứa urê thì sẽ phản ứng với enzym làm tăng pH. Dựa vào khoảng pH biến đổi cĩ thể biết được cĩ urê hay khơng và lượng urê là bao nhiêu. Phưong pháp: Nhúng điện cực của dụng cụ cảm biến vào dung dịch, để khoảng 10 phút và dựa vào đường chuẩn để biết được nồng độ urê. Nhờ tính tiện dụng và thời gian cho kết quả nhanh, các dụng cụ này cĩ thể trở thành cơng cụ đắc lực cho các bà nội trợ chọn lựa thực phẩm an tồn cho gia đình, những người giám sát an tồn vệ sinh thực phẩm, các trạm thu mua sữa, thủy hải sản... NITRIT Nitrite là một hĩa chất cĩ tác dụng chống thối, làm tươi thực phẩm Nhiều loại thực phẩm trên thị trường được ướp chất này để bảo quản. Nitrit là một dạng hĩa chất cực độc - chất gây bệnh ung thư.Tuy nhiên, nếu ăn thực phẩm chứa độc tố này sẽ dễ bị ngộ độc, về lâu dài cĩ thể ung thư dạ dày, đại tràng. Chỉ cần dùng thẻ cĩ tẩm dung dịch quết lên thực phẩm, sau năm phút người tiêu dùng sẽ biết chính xác hàm lượng nitrit cĩ trong thực phẩm. Kiểm nhanh dư lượng Chloramphenicol: Chloramphenicol là một loại kháng sinh phổ rộng, nĩ được sử dụng thường xuyên cho quá trình chế biến thực phẩm cĩ nguồn gốc động vật nhờ cĩ các đặc tính kháng khuẩn và dược động học tuyệt vời của nĩ. Tuy nhiên, trong cơ thể người nĩ lại cĩ thể gây ra những độc tính huyết học, cụ thể là thiếu máu biến dạng với 1 hàm lượng nào đĩ chưa được xác định rõ. Điều này dẫn đến việc Chlorampheni col đã bị cấm sử dụng trong việc điều trị cho súc vật dùng làm nguyên liệu chế biến thực phẩm. Dư lượng Chloramphenicol trước đây thường được phát hiện bằng phương pháp miễn dịch phĩng xạ (radioimmunologically) hoặc sắc ký khí (gas chromatographically). Dụng cụ: Dụng cụ phát hiện nhanh dư lượng Chloramphenicol (40 chiếc). Chất hút ẩm (một miếng cho mỗi gĩi). Chất đệm PBST (một lọ cho mỗi bộ). Ống nhỏ giọt sử dụng một lần (một ống cho mỗi gĩi). Tờ hướng dẫn sử dụng. NGUYÊN LÝ: Nguyên tắc của xét nghiệm này là phản ứng kháng nguyên - kháng thể. Xét nghiệm nhanh bằng 1 bước duy nhất này là một xét nghiệm miễn dịch cạnh tranh, trong đĩ chất dị (detector reagent) bao gồm những mảnh vàng keo (colloidal gold) được tráng phủ bởi các kháng thể kháng Chloramphenicol tinh khiết ái lực. Trong khi đĩ chất phát hiện (capture reagent) là một phức hợp Chloramphenicol-protein được đính trên màng của dụng cụ xét nghiệm. Trong quá trình xét nghiệm, mẫu thử đi qua màng này. Càng cĩ nhiều chất phân tích trong mẫu thử, chúng sẽ càng cạnh tranh mạnh hơn với Chloramphenicol đính trên màng để gắn kết với các kháng thể của chất dị (cĩ số lượng giới hạn). Chloramphenicol, nếu tồn tại trong mẫu thử với hàm lượng trên 0,1 ppb  sẽ ngăn chặn sự gắn kết của chất dị với Chloramphenicol đính trên màng, cho ra kết quả dương tính. Các ưu điểm của phương pháp này: Sử dụng đơn giản, khơng cần phải cĩ trình độ hoặc kỹ năng đặc biệt. Khơng cần trang bị kiến thức đặc biệt, chỉ cần đọc kỹ hướng dẫn sử dụng trước khi thực hiện. Rẻ tiền, và khơng cần phải trang bị các máy mĩc đắt tiền và chuyên dùng. Kết quả dễ xem xét và đánh giá. Cĩ thể thực hiện ngồi trời, tại điểm thu mua/ thanh tra. Tiết kiệm thời gian: chỉ cần vài phút để đọc kết quả. Chính xác: phát hiện chính xác đến ngưỡng của các thiết bị thơng dụng hiện nay, và tương thích với các quy định hiện hành trên thế giới. Sạch và an tồn: khơng gây hại cho sức khỏe người, súc vật và mơi trường. Dễ bảo quản: bảo quản trong điều kiện bình thường, ở nhiệt độ phịng. Phân tích thủy ngân bằng phương pháp CV-AAS Phương pháp: Phương pháp hĩa hơi lạnh chỉ được dùng để xác định thủy ngân vì ở nhiệt độ phịng, Hg tồn tại ở thể lỏng với áp suất hơi bão hịa khá cao 1,3.10-3 mm Hg(1,71.10-6atm ở 25o C). Mặt khác ở thể hơi thì Hg tồn tại ở trạng thái đơn phân tử, cho nên thay vì sử dụng nhiệt độ cao để nguyên tử hĩa Hg từ các hợp chất của thủy ngân người ta sử dụng chất khử mạnh để khử trực tiếp Hg2+ về Hg0 dễ bay hơi và dịng thời sử dụng một dịng khí mang sục vào dung dịch lơi cuốn hơi Hg đến ống thạch anh, tại đĩ tiến hành đo độ hấp thu ở bước sĩng 253.7 nm từ đèn HCL. Khí mang thường sử dụng là Ar, N2 hoặc khơng khí sạch. Chất khử mạnh được sử tốt hiện nay là NaBH4 (E0H+/H = -2.107 V) khử Hg2+ ( ) trong mơi trường acid HCl theo phản ứng: BH4 - + 3 H2O + H+ = H3BO3 + 8 H HgCl42- + 2 H = Hg 0 + 2 H ++ 8 Cl- Mẫu thủy sản được vơ cơ hĩa bằng acid nitric đậm đặc trong bình phá mẫu bẳng nhựa teflon cĩ nắp vặn kín. Thủy ngân trong dung dịch mẫu bị hydride hĩa bằng dịng khí hydro. Hydride thủy ngân dễ bay hơi bị cuốn theo dịng khí hydro và được bơm vào hệ thống quang phổ hấp thụ nguyên tử. Tại đây hydride thủy ngân bị phân hủy thành hơi thủy ngân và được xác định theo phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử khơng dùng ngọn lửa. các phản ứng xảy ra trong hệ thống bay hơi : NaBH4 + HCl = NaCl + BH2 + 2H 4H + HgCl2 = HgH2 + 2 HCl HgH2 = Hg + H2 Thiết bị và dụng cụ: Máy quang phổ hấp thu nguyên tử sử dụng đèn cathode thủy ngân rỗng với hệ thống bay hơi nguyên tử hydride. Bình phá mẫu bằng nhựa teflon cĩ năp vặn kín dung tích 50 ml. Tủ sấy nhiệt độ 150 0C. Dụng cụ thủy tinh đã được rửa sạch bằng acid nitric nồng độ 8N và tráng lại bằng nước cất trước khi sử dụng. Cân phân tích cĩ độ chính xác loại đến 0.01g và loại đến 0.0001g. Hĩa chất và chất chuẩn: Acid nitric đậm đặc. Acid sunfuric đậm đặc. HCl 1N. Dung dịch hịa tan cho khoảng 300 – 500 ml nước cất vào bình định mức1000 ml, cho thêm 58 ml acid nitric và 67 mn acid sulfuric, sau đĩ định mức đến vạch bằng nước cất. Dung dịch NaOH 0.25M: hịa tan 10 g NaOH trong 1000ml nước cất . Dung dịch tetrahydrua boric natri (NaBH4) nồng độ 3%: hịa tan 1.5 g NaBH4 trong 10 ml dung dịch NaOH. Dung dịch thủy ngân chuẩn: Dung dịch chuẩn gốc 1mg/ml: hịa tan 1.000g Hg trong 1000 ml H2SO4 1N. Dung dịch chuẩn trung gian 1 mg/ml: pha lỗng 1ml dung dịch chuẩn gốc thành 1000 ml bằng dung dịch H2SO4 1N. Dung dịch chuẩn làn việc: pha lỗng dung dịch chuẩn trung gian thành các dung dịch chuẩn làm viếc cĩ hàm lượng Hg lần lượt là 0.0; 2.0; 4.0;6.0; 8.0; 10.0 mg/l bằng dung dịch acid nitric 1N. Phương pháp tiến hành: Vơ cơ hĩa mẫu Cân khoảng 1.00 g mẫu sao cho khối lượng khơ khơng nhiều hơn 300mg. Đối với mẫu cĩ hàm lượng chất béo cao, lượng mẫu dùng sao cho khối lượng khơ khơng lớn hơn 200mg. cho mẫu vào bình phá mẫu, thêm 5ml acid nitric đậm đặc rồi vặn chặt nắp đậy kín bình lại. Để bình vào tủ sấy đã đặt ở nhiệt độ 1500C trong vịng 30 – 60 phút hoặc cho đến khi dung dịch trở nên trong. Lấy bình ra khỏi tủ sấy, để nguội đến nhiệt độ phịng rồi mở nắp và chuyển dung dịch mẫu vào bình định mức 250ml. Tráng rửa bình phá mẫu bằng khoảng 95ml dung dịch hịa tan (IV.3.2.d), rĩt nước rửa vào bình định mức bằng nước cất cho đến vạch rồi lắc đều. Chuẩn bị mẫu trắng Mẫu trắng được chuẩn bị bằng cách thay 1g mẫu bằng 1mm nước cất rồi tiến hành các bước như vơ cơ hĩa mẫu. Tiến hành phân tích Tối ưu hĩa các điều kiện làm việc của máy quang phổ hấp thu nguyên tử nà hệ thống bay hơi nguyên tử hydride. Nối hệ thống nhưng chưa nối đầu khí vào của bình đun chứa mẫu điều chỉnh lưu lượng khơng khí đầu ra của bơm để đạt được lưu lượng khoảng 2 l/phút bằng cách điều chỉnh tốc độ của bơm thơng qua điện áp kế. Nối hồn chỉnh hệ thống thiết bị theo sơ đồ lắp đặt hệ thống quang phổ hấp thu nguyên tử, Xây dựng đường chuẩn bằng cách bơm các mẫu chẩu với hàm lượng Hg lần lượt là 0.0; 2.0; 4.0;6.0; 8.0; 10.0 ppb rồi xác định độ hấp thu của chúng thơng qua diện tích peak. Khi đường chuẩn cĩ độ tuyến tính tốt, tiến hành bơm các dung dịch mẫu thử và mẫu trắng rồi xác định độ hấp thụ của chúng thơng qua diện tích peak.Tính hàm lượng thủy ngân trong mẫu thơng qua đường chuẩn sau khi đã trừ đi mẫu trắng. Yêu cầu về độ tin cậy của phép phân tích: Độ lặp lại của 2 lần bơm: độ lệch chuẩn (CVs ) tính theo độ hấp thụ của 2 lần bơm liên tiếp của cùng một dịch chuẩn phải nhỏ hơn 0.5%. Độ thu hồi (R) được xác định bằng cách sử dụng 5 mẫu đã cho vào một lượng dung dịch Hg chuẩn biết chính xác nồng độ. Độ thu hồi tính dược phải nằm trong khoảng 85% - 100%, độ thu hồi trung bình phải lớn hơn 90%. Tính kết quả : Hàm lượng Hg trong mẫu thử thủy sản được tính theo cơng thức sau: Trong đĩ: CHg là hàm lượng Hg cĩ trong mẫu thử (mg/l) MHg là hàm lượng Hg cĩ trong dịch mẫu tính được theo đường chuẩn (mg/l) V là thể tích dung dịch dùng để hịa tan mẫu thử (ml) M là khối lượng mẫu thử (g) 4. Nguyên tắc kỹ thuật nguyên hĩa khơng ngọn lửa - Nguyên tắc kỹ thuật nguyên hĩa khơng ngọn lửa là dùng năng lượng của dịng điện cơng suất lớn hay năng lượng của dịng cao tần cảm ứng để nguyên tử hĩa gần như tức khắc mẫu chúa chất phân tích trong cuvet graphite và trong mơi trường khí trơ để tạo ra các nguyên tử tự do ở trạng thái hơi cĩ khả năng hấp thụ bức xạ đơn sắc tạo ra phố hấp thụ nguyên tử của nĩ. Mẫu chứa nguyên tố cần xác định được đưa vào lị graphite bằng bộ hút mẫu tự động hoặc bằng tay với thể tích rất nhỏ từ 20 µm - 50 µm. Quá trình phân tích nguyên tố trong lị graphite bằng phương pháp này xảy ra theo 4 giai đoạn kế tiếp nhau trong tổng thời gian là 60 – 80s. Các giai đoạn đĩ là : Sấy khơ mẫu: làm cho dung mơi hịa tan mẫu bay hơi nhẹ nhàng và hồn tồn nhưng khơng làm mất mẫu. Tro mẫu hĩa: nhằm mục đích đốt cháy các hợp chất hữu cơ cĩ trong mẫu sau khi sấy khơ. Mỗi nguyên tố đều cĩ nhiệt độ tro hố mẫu giới hạn cho nĩ trong phép đo GF- AAS. Nhiệt độ tro hĩa giới hạn của mỗi nguyên tố là khác nhau. nĩ phụ thuộc vào bản chất của mỗi nguyên tố và phụ thuộc vào dạng hợp chất mà nguyên tố đĩ tồn tại cũng như nền màu. Nguyên tử hĩa: thực hiện nguyên tử hĩa trong thời gian rất ngắn, thơng thường từ 3-6 s nhưng tốc độ tăng nhiệt độ lại rất lớn thường cỡ 18000C/s- 2500 0C/s. mỗi nguyên tố đều cĩ nhệt độ nguyên tử hĩa tới hạn cho nĩ trong phép đo GF-AAS. Nhiệt độ này phụ thuộc vào bản chất của mỗi nguyên tố và cũng phụ thuộc vào bản chất mà nguyên tố đĩ tồn tại và thành nền của mẫu, nên tiến hành nguyên tử hĩa ở nhiệt độ khơng được lớn hơn nhiệt độ tới hạn và chọn thời gian nguyên tử hĩa sao cho peak cường độ vạch phổ nhọn. Làm sạch cuvet: thực hiện ở nhiệt độ trên 27000C để bốc hơi tất cả các chất cịn lại trong lị, chuẩn bị cho lần phân tích tiếp theo. Khí argon tinh khiết 99.999% được dùng làm mơi trường cho quá trình nguyên tử hĩa. Các nguyên tố Hg, Cd, Pb, As đều cĩ nhiệt độ hĩa hơi thấp vì vậy nếu tro hĩa cũng như nguyên tử hĩa ở nhiệt độ cao thì xảy ra sự mất mát đáng kể các nguyên tố phân tích. Để khắc phục người ta sử dụng các chất modifier trong phân tích các nguyên tố trên bằng phương pháp GF-AAS. Các chất modifier tạo với nguyên tố phân tích bền với nhiệt nên cho phép tro hĩa và nguyên tử hĩa ở nhiệt độ cao hơn, làm tăng độ nhạy của phương pháp Pd là chất cĩ tác dụng modifier rất mạnh trong việc xác định hầu hết các nguyên tố phân tích. Pd loại trừ được nhiễu hĩa học nĩi chung cũng như cho phép tiến hành nguyên tử hĩa ở nhiệt độ cao mà khơng bị hao hụt chất phân tích. Trong quá trình nguyên tử hĩa hợp kim Pd – kim loại bay hơi một cách đột ngột và hồn tồn giúp ổn định tín hiệu hấp thu của kim loại. Ngồi ra mỗi nguyên tố cịn cĩ thể sử dụng các chất modifier khác nhau tùy theo yêu cầu của nhà sản xuất hoặc khi cĩ sự nhiễu rõ. Đối với phép đo GF – AAS phần lớn các trường hợp phải hiệu chỉnh nền. Ngoại trừ trường hợp đo ở λ > 450 nm. Một trong các kĩ thuật hiệu chỉnh cản nhiễu do matrix là hiệu chình nền dựa trên hiệu ứng Zeeman. Nguyên tắc theo sơ đồ trên: Bức xạ phát ra từ đèn HCL hoặc EDL là bức xạ khơng phân cực sau khi khi đi qua phân kính cực quay bức xạ này tách thành 2 thành phần phân cực mà các mặt phẳng phân cực trực giao với nhau. một từ trường mạnh được áp vào hơi nguyên tử trong lị graphite. Từ trường tách ra các mức năng lượng điện của nguyên tử thành vài vạch hấp rất sít nhau ( gần bằng 0.1 nm). Bức xạ phân cực đi qua hơi nguyên tử đặt trong từ trường. Ở nửa chu kì quay, tại đĩ thành phần phân cực cĩ mặt phẳng song song với trường ngồi ta đo được tín hiệu Vmẫu + matrix. ở giữa chu khì quay tiếp theo tại đĩ thành phần phân cực trực giao với từ trường ngồi ta đo được tín hiệu Vmatrix. Vậy : Vmẫu = Vmatrix - Vmẫu + matrix Các ứng dụng: Xác định Pb Nhiệt độ tro hĩa 8000C. Nhiệt độ nguyên tử hĩa 12000C. Các chất modifier thường được dùng là: 50 µg NH4NO3,hoặc 50 µg La(NO3)2,hoặc 50 µg Mg(NO3)2,hoặc 50 µg ascorbic acid Tín hiệu hấp thụ: 20µL của 1.7 µg/L dung dịch Pb cho tín hiệu 0.1A Xác định Cd: + Khi khơng cĩ modifier : Nhiệt độ tro hĩa 3000C. Nhiệt độ nguyên tử hĩa 9000C. + Khi cĩ modifier 10 µg Pd(NO3)2 hoặc 20 µg NH4NO3 hoặc 20 µg Mg(NO3)2: Nhiệt độ tro hĩa 8000C. Nhiệt độ nguyên tử hố 10000C Tín hiệu hấp thu : 20µL của 0.6 µg/L dung dịch Cd cho tín hiệu khoảng 0.1A. Xác định As : + Khơng cĩ modifier nhiệt độ tro hĩa 4000C: Nhiệt độ nguyên tử hĩa 21000C. + Khi cĩ modifier 20 µg Ni(NO3)2. Nhiệt độ tro hĩa 12000C. Nhiệt độ nguyên tử hĩa 26000C. Tín hiệu hấp thu: 20 µL của 0.6 µg/L dung dịch As cho tín hiệu khoảng 0.1A. Xác định thủy ngân : + Khi khơng cĩ modifier Nhiệt độ tro hĩa 2000C. Nhiệt độ nguyên tử hĩa 7500C. + Cĩ modifier 50 µg (NH4)2Cr2O7 hoặc 500 µg vàng hoặc 500 µg Pd. Nhiệt độ tro hĩa 5000C. Nhiệt độ nguyên tử hĩa 7500C. Tín hiệu hấp thu 20µL của 60 µg/L dung dịch Hg cho tín hiệu cỡ 0.1A. Ưu nhược điểm của phương pháp GF-AAS Ưu điểm: Cĩ độ nhạy cao cỡ ppb, cĩ khi gấp hàng trăm đến hàng ngàn lần phép đo F-AAS. Do đĩ khi phân tích hàm lượng vết các kim loại trong mẫu thực phẩm khơng cần phải làm giàu mẫu. Phép đo địi hỏi lượng mẫu nhỏ mỗi lần đo chỉ cần từ 20 µL - 50 µL dung dịch mẫu. Do đĩ khơng cần lượng lớn mẫu phân tích ít tốn hĩa chất cũng như các dung mơi tinh khiết cao, đắt tiền.Thao tác đo dễ dàng và cĩ thể xác định liên tiếp nhiều nguyên tố trong cùng một mẫu. Kết quả phân tích ổn định, sai số nhỏ. Nhược điểm: Do cĩ độ nhạy cao nên tránh sự nhiễm bẩn, các dụng cụ hĩa chất phải cĩ độ tinh khiết cao. Ảnh hưởng của phổ nền lớn nhưng hiện nay đã khắc phục được bằng các hệ thống bổ chính nền để đảm bảo độ nhạy cỡ ppb đối với nhiều nguyên tố. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH THEO TIÊU CHUẨN CHẤT LƯỢNG Phương pháp định lượng Sulfit trong sản phẩm thủy sản Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng sulfit trong thủy sản và sản phẩm thủy sản. Giới hạn phát hiện của phương pháp là 10 mg/g. 1.2. Phương pháp tham chiếu Tiêu chuẩn này được xây dựng dựa theo phương pháp của Ủy ban Phân tích thực phẩm khối Bắc Âu NMKL số 132 - 1989 (NODISK METODIKKOMMITTE FOR LIVSMEDEL Nordic committee on food analysis - Sulphite Spectrophotometric determination in foods). 1.3.Nguyên tắc Mẫu sản phẩm được axit hĩa bằng axit sulfuric H2SO4 và chưng cất trong thiết bị Kjeldahl bán vi lượng. Hơi SO2 tạo thành phản ứng với 2,2'- đinitro-5,5'-đithiobenzoic axit (DTNB) trong cốc nhận để hình thành phức axit 5-mercapto-2- nitrobenzoic cĩ mầu vàng chanh đậm. Cường độ mầu của phức axit được đọc trên máy quang phổ tại bước sĩng l là 412 nm. Nồng độ của SO2 trong mẫu được tính tốn theo cường độ mầu của phức axit theo phương pháp ngoại chuẩn. 1.4. Phương pháp tiến hành Chuẩn bị mẫu Chuẩn bị mẫu thử: đồng nhất mẫu thử bằng máy nghiền đồng thể .Cân 2 mẫu, mỗi mẫu 5,00 g trong cốc cĩ mỏ 100 ml. Trộn đều mẫu đã cân với 15 ml nước cất. Chuẩn bị mẫu trắng: mẫu trắng là mẫu được xác định trước khơng chứa sulfit. Chuẩn bị mẫu trắng giống như đối với chuẩn bị mẫu thử quy định như trên. Lập đường chuẩn Cho vào 2 bình tam giác dung tích 250 ml, mỗi bình 5 ml dung dịch chuẩn Iot Chuẩn độ với dung dịch chuẩn đisulfit (0,0005 M) (0,064mg SO2/ml) đến mầu vàng nhạt. Thêm dung dịch hồ tinh bột và tiếp tục chuẩn độ cho đến khi dung dịch đổi mầu. Dùng pipette nhỏ lần lượt 0,1, 2, 3, 4, và 5 ml dung dịch đisufit đã được chuẩn độ ở trên vào trong các bình định mức 50 ml cĩ chứa 25 ml dung dịch thuốc thử 2,2'-đinitro-5,5'-đithiobenzoic axit (DTNB). Sau đĩ, pha lỗng đến vạch với dung dịch đệm phosphat pH=8 rồi để yên trong 10 phút. Hiệu chỉnh máy quang phổ UV-VIS với nước cất ở 412 nm (độ hấp thu là 0 đối với nước cất). Xác định lần lượt độ hấp thụ của các dung dịch đã được chuẩn bị ở trên bằng máy quang phổ. Thành lập đồ thị theo các giá trị của độ hấp thu và nồng độ sulfit của dãy chuẩn theo mg/ml. Hàm lượng SO2 trong dịch mẫu được tính theo đường hồi quy tuyến tính của đồ thị thu được sau khi hiệu chỉnh với giá trị hấp thu của mẫu trắng. Tiến hành thực nghiệm Chuyển mẫu trắng và các mẫu thử đã chuẩn bị theo Điều 5.1 lần lượt vào các bình chưng cất. Tráng rửa các cốc đựng mẫu với 10 ml nước cất rồi cho hết vào bình chưng cất. Lắp đặt bình vào bộ chưng cất Kjeldahl bán vi lượng, dung tích 100 ml. Đặt bình tam giác thu hồi chứa 50 ml DTNB ở đầu ra của ống ngưng tụ. Nối các đường dẫn khí nitơ và nước làm nguội vào thiết bị chưng cất. Cho vào bình chưng cất 20 ml axit sulfuric 10 N qua chiếc phễu gắn ở phía trên bộ chưng cất và nhanh chĩng đĩng kín hệ thống lại.Chưng cất trong vịng 4 phút. Lấy bình hứng ra khỏi bộ chưng cất. Rửa bình ngưng và ống nối với dung dịch đệm phosphat pH = 8, chuyển dịch rửa vào bình thu hồi. Chuyển tồn bộ dịch cất vào bình định mức dung tích 50ml rồi rửa bình thu hồi với dung dịch đệm phosphat .Chuyển dịch rửa vào bình định mức rồi định mức với dung dịch đệm. Đọc chỉ số ABS sau 10 phút với bước sĩng 412 nm và dùng nước cất là dung dịch so sánh. Nếu trị số ABS > 1,5, phải pha lỗng dung dịch với hỗn hợp với tỷ lệ 1:1 của dung dịch đệm phosphat và dung dịch thuốc thử DTNB rồi tiến hành đọc lại. 1.5. Tính kết quả Tính nồng độ dung dịch gốc đisulfua theo cơng thức sau: Trong đĩ: V0 là số ml dung dịch iot 0.05M được sử dụng tại Điều 5.2.1. VSO2 là số ml dung dịch gốc đisulfit 0.0005M dùng cho chuẩn độ, C0 là nồng độ của dung dịch iot , tính theo mol/1, MV là phân tử gam của SO2 (64,06 g/mol). Tính hàm lượng SO2 trong mẫu . Tính lượng SO2 trong dung dịch mẫu từ đường chuẩn . Tính nồng độ SO2 trong mẫu theo cơng thức sau: Trong đĩ: A là nồng độ SO2 tìm thấy từ đường chuẩn, tính theo mg/ml, V là thể tích của dịch cất , tính theo ml, g là hệ số pha lỗng , g = 1 nếu khơng pha lỗng, m là khối lượng mẫu cân, tính theo g 1.6.Báo cáo kết quả Hàm lượng của sufit là giá trị trung bình của 2 lần thử song song tính theo mg/kg. Phương pháp định tính axit boric và muối borat trong sảm phẩm thủy sản. Phạm vi áp dụng: Tiêu chuẩn này quy định phương pháp định tính axit boric và muối borat của nĩ trong sản phẩm thủy sản. Giới hạn phát hiện của phương pháp là 0,1 %. Phương pháp tham chiếu: Tiêu chuẩn này được xây dựng dựa theo phương pháp chính thức của Hiệp hội các nhà hĩa học phân tích quốc tế AOAC 970.33 -1995 (AOAC official method 970.33 - Boric acid and borates in food) và Thường quy kỹ thuật định tính và bán định lượng xít boric hoặc natri borat trong thực phẩm (Quyết định số 3390/QĐ-BYT ngày 28/91/2000 của Bộ Y tế). Nguyên tắc Mẫu sản phẩm được chiết thử sơ bộ bằng dung dịch nước cất hoặc thử xác nhận bằng than hĩa trước khi chiết. Axit boric và muối cĩ trong dịch chiết đã được xít hĩa tác dụng với curcumin trên giấy nghệ tạo thành phức mầu cam đỏ. Trong mơi trường hơi amoniac (NH3) mầu cam đỏ chuyển thành mầu xanh lục và trở lại mầu đỏ bởi hơi axit clohyđric (HC1). Phương pháp tiến hành: Thử sơ bộ. Dùng đũa thủy tinh khuấy trộn đều 25 g mẫu đã xay nghiền với 10 ml nước cất trong bình tam giác 125 ml rồi đậy miệng bình bằng mặt kính đồng hồ. Đun từ từ bình tam giác trên bếp điện cho đến sơi dung dịch. Chú ý phải lắc đều khi đun. Làm nguội mẫu rồi lọc dịch trong bằng giấy lọc whatman số 02. Axit hĩa dịch lọc bằng axit HCl đậm đặc tới khi pH = 5 rồi rĩt dịch vào trong ống nghiệm 15 ml. Nhúng một đầu giấy nghệ vào trong ống nghiệm chứa dịch mẫu cho ngập khoảng 1/2 chiều dài tờ giấy. Lấy giấy ra rồi để khơ tự nhiên. Quan sát mẫu của giấy thử, tiến hành đọc kết quả . Thử xác nhận: Tiến hành thử khẳng định đối với các mẫu cho kết quả dương tính trong phép thử sơ bộ theo quy trình sau: Kiểm hĩa 25 g mẫu với nước vơi hoặc sữa vơi trong chén sứ . Đun từ từ mẫu trong chén sứ trên bếp điện cho bay hơi đến khơ. Đặt chén sứ vào trong lị nung ở nhiệt độ 3500c trong 4 giờ cho đến khi các chất hữu cơ cháy thành than hồn tồn. Sau đĩ, để nguội rồi hịa tan cặn với 4 ml nước cất và thêm từng giọt axit HCl đậm đặc cho đến khi dung dịch cĩ tính axit rõ rệt (pH = 5). Lọc dung dịch vào ống nghiệm. Nhúng một đầu giấy nghệ vào trong ống nghiệm chứa dịch mẫu cho ngập khoảng 1/2 chiều dài tờ giấy. Lấy giấy ra rồi để khơ tự nhiên. Quan sát mầu của giấy thử, tiến hành đọc kết quả . Đọc kết quả: Nếu cĩ borat trong mẫu thì giấy nghệ chuyển sang mầu cam đỏ đặc trưng. Đặt giấy nghệ lên miệng ống nghiệm chứa dung dịch amoni hyđroxit NH4OH đậm đặc. Giấy nghệ phải chuyển sang mầu xanh lục và trở lại mầu đỏ khi đặt giấy trên ống nghiệm chứa axit HCl . 3. Phương pháp định tính Urê trong sản phẩm thủy sản 3.1. Phạm vi áp dụng: Tiêu chuẩn này quy định phương pháp định tính urê trong sản phẩm thủy sản. Giới hạn phát hiện của phương pháp là 0,5 %. Nguyên tắc : Mẫu sản phẩm được chiết với dung dịch nước. Urê cĩ trong dịch chiết phản ứng với thuốc thử p - đimetylaminobenzalđehyt tạo phức mầu vàng chanh đặc trưng. Phương pháp tiến hành: Chuẩn bị mẫu Đồng nhất khoảng 200 g mẫu thủy sản bằng máy nghiền đồng thể . Cân 25 g mẫu đã xay nghiền đưa vào bình tam giác dung tích 50 ml. Thêm 25 ml nước cất rồi khuấy trộn đều bằng đũa thủy tinh. Sau đĩ, đậy miệng bình bằng mặt kính đồng hồ . Đun từ từ bình tam giác trên bếp điện cho đến sơi. Chú ý, khi đun phải lắc đều. Làm nguội mẫu rồi dùng giấy lọc Whatman để lọc lấy dịch trong. Tiến hành: Nhỏ 5 - 6 giọt dịch mẫu vào trong ống nghiệm chứa 5 ml dung dịch thuốc thử urê. Đun nĩng dung dịch trong 1 phút. Quan sát mầu dung dịch. Tiến hành đọc kết quả Đọc kết quả: Kết luận mẫu cĩ Urê nếu mầu dung dịch trong ống nghiệm chuyển sang mầu vàng chanh đậm. Nồng độ của Urê trong mẫu càng cao thì mầu vàng của dung dịch càng đậm. Phương pháp định lượng bằng sắc ký ion muối Polyphosphat trong sản phẩm thủy sản 4.1.Phạm vi áp dụng: Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng muối polyphosphat bao gồm ortophosphat (monophosphat), pyrophosphat (điphosphat), tripolyphosphat trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng sắc ký ion. Phương pháp tham chiếu: Tiêu chuẩn này được xây dựng dựa theo phương pháp của Trung tâm Hĩa học tư pháp quốc gia của Cục Thực phẩm dược phẩm Hoa Kỳ (National Forensic Chemistry Center, U.S. Food and Drug Administration, Cincinnati, Ohio: De- termination of tripolyphosphate and related hydrolysis products in processed shrimp). Nguyên tắc: Polyphosphat trong mẫu thủy sản được chiết tách bằng nước cất khử ion. Dịch chiết được làm sạch bằng phương pháp chiết pha rắn (SPE) trên cột chiết pha rắn C18. Hàm lượng polyphosphat cĩ trong dịch chiết được xác định trên máy sắc ký ion sử dụng hệ thống phản ứng sau cột với tác chất phản ứng là sắt nitrate trong axit percloric và đầu dị UV tại bước sĩng là 330 cm theo phương pháp ngoại chuẩn. Phương pháp tiến hành: Chuẩn bị mẫu thử: Cân chính xác 0,5 g mẫu thủy sản (ký hiệu m) đã được đồng nhất vào trong chai nhựa dung tích 100 ml . Thêm 50 ml nước cất khử ion vào trong chai rồi lắc mạnh trong 30 phút trên máy lắc mẫu. Sau đĩ, ly tâm chai trong 10 phút ở tốc độ 3000 vịng/phút trên máy ly tâm. Lọc dịch chiết qua màng lọc mẫu 0,45 âm . Chuẩn bị mẫu trắng: Tiến hành chuẩn bị mẫu trắng giống như chuẩn bị đối với mẫu thử nhưng thay 0,5 g thủy sản bằng 0,5 ml nước cất đã khử ion. Làm sạch dịch chiết: Chuẩn bị cột: Nối cột chiết pha rắn C18 vào đầu ra của một xilanh thủy tinh 100 ml. Thêm lần lượt 10 ml metanol, 10 ml nước cất đã khử ion vào xanh thủy tinh. Loại bỏ dung dịch chảy qua cột. Làm sạch dịch chiết: Cho dịch chiết thu được ở trên vào các cột C18 đã được chuẩn bị . Sau khi cho dịch chiết vào cột, thu dịch ra khỏi cột vào bình định mức 100 ml (đã bỏ 2 ml đầu). Sau đĩ, tráng rửa bình chứa 3 lần, mỗi lần bằng 2 ml nước cất khử ion. Cho nước tráng qua cột rồi gom dịch qua cột vào bình định mức trên. Định mức tới vạch bằng nước cất (ký hiệu v). Tiến hành phân tích các dịch thu được trên máy sắc ký ion. Tiến hành phân tích trên máy sắc ký ion : Điều kiện phân tích +Đặt chế độ làm việc cho máy sắc ký ion như sau: Cột sắc ký ion: Dionex IonPac (L x ID: 250 x 4 mm, tiền cột IonPac NG1 (L x ID: 4 x 50mm). Nhiệt độ cột: Nhiệt độ trong phịng. Pha động: Dung dịch axit Nitric 70 mm Tốc độ dịng: 0,5 ml/phút. Bước sĩng cài đặt cho đầu dị UV là 330 nm Thể tích tiêm: 100 m l +Điều kiện trong hệ thống phản ứng sau cột: Tác nhân: 1g/l sắt nitrat trong axit Percloric 2 % Tốc độ dịng là 0,5 ml/phút: Nhiệt độ phản ứng trong ống teflon nhiệt độ trong phịng. Ổn định cột sắc ký trong 30 phút bằng pha động. Tiêm các dung dịch chuẩn vào máy sắc ký. Mỗi dung dịch tiêm 2 lần, tính diện tích pic trung bình. Dựng đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa các chiều cao pic thu được và nồng độ từng loại phosphat theo quan hệ tuyến tính bậc 1 (phương trình y = ax + b). Tiêm dung dịch mẫu thử và dung dịch mẫu trắng đã được làm sạch vào hệ thống sắc ký, mỗi mẫu 2 lần. Tính kết quả thu được. Yêu cầu về độ tin cậy của phép phân tích : Độ lặp lại của 2 lần tiêm: Độ lệch chuẩn (CVS) tính theo diện tích pic sắc ký của 2 lần tiêm cùng một dung dịch chuẩn pyrophosphat 10 m g/ml và 25m g/ml phải nhỏ hơn 1,2 %. Đường chuẩn đối với mỗi loại phosphat phải cĩ độ tuyến tính tốt, hệ số tương quan hồi quy tuyến tính (R2) phải lớn hơn hoặc bằng 0,99. Khoảng tuyến tính: Ortophosphat: 10 - 100 m g/ml Pyrophosphat: 0,5 - 50 m g/ml Tripolyphosphat: 10 - 500 m g/ml. Tính kết quả: Hàm lượng các phosphat cĩ trong mẫu được tính trên cơ sở đường chuẩn thu được (5.4.3). Với đường chuẩn ở dạng y = ax + b, hàm lượng các phosphat cĩ trong mẫu được tính theo cơng thức sau: Trong đĩ: C là nồng độ các phosphat cĩ trong mẫu, tính theo m g/g Y là hiệu số giữa diện tích pic của dịch chiết và diện tích pic cĩ trong mẫu trắng tiêm vào máy, tính theo đơn vị diện tích. a, b là các thơng số của đường chuẩn được xác định. F là hệ số pha lỗng mẫu và cĩ giá trị bằng tỷ số giữa thể tích dịch chiết thu được sau khi làm sạch và khoa lượng mẫu m sử dụng . Phương pháp định lượng bằng sắc ký khí hàm lượng Cloramphenicol trong sản phẩm thủy sản 5.1. Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng cloramphenicol (sau đây gọi tắt là CAP) trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng hệ thống sắc ký khí (sau đây gọi tắt là GC). Giới hạn phát hiện của phương pháp là 0,3 m g/kg. 5.2. Phương pháp tham chiếu Tiêu chuẩn này được xây dựng dựa theo phương pháp được cơng bố trong tạp chí của Hiệp hội các nhà hĩa học phân tích; tập 77, số 3, năm 1994 (Journal of AOAC intemational; Voi. 77, No. 3, 1994: Gas chromatographic determination of chloramphenicol residues in shrimp). 5.3. Nguyên tắc CAP trong mẫu thủy sản được chiết tách bằng etyl axetat. Dịch chiết sau đĩ được cơ cạn, cặn được xử lý với sylon (chất tạo dẫn xuất trimetylsylyl), để tạo dẫn xuất trimetylsylyl của CAP. Hàm lượng dẫn xuất CAP được xác định trên hệ thống GC với đầu dị bắt giữ điện tử (sau đây gọi tắt là ECD) theo phương pháp nội chuẩn. HỆ THỐNG SẮC KÝ KHÍ : Hình 1: Hệ thống sắc ký khí Nguyên tắc hoạt động: Mẫu khảo sát dạng lỏng hay khí được bơm vào bộ nạp mẫu 2 (nếu mẫu lỏng sẽ được gia nhiệt tại đây để chuyển sang dạng khí), được khí mang cung cấp từ hệ thống 1 (bao gồm bình khí và bộ điều chỉnh lưu lượng) dẫn vào hệ thống cột tách 3 nằm trong buồng điều nhiệt. Sau khi được tách, các cấu tử lần lượt đi vào detector 4 và được chuyển thành tín hiệu điện. Tín hiệu này được khuếch đại rồi chuyển sang bộ ghi 5. Ở các máy hiện đại, thay vì chuyển sang bộ ghi, tín hiệu sẽ được chuyển sang tích phân kế và máy tính. Tại đây, các tín hiệu được xử lý và chuyển sang bộ phận in kết quả 6. Trên sắc đồ nhận được ở bộ phận in kết quả 6 ta thu được các tín hiệu ứng với các cấu tử gọi là peak với thời gian lưu tR của peak là đại lượng dùng để định tính, còn diện tích của peak được sử dụng để định lượng. tR(A) tR(B) t 5.4. Phương pháp tiến hành Chuẩn bị mẫu thử Cân 10,0 g mẫu thủy sản đã được nghiền nhuyễn cho vào ống ly tâm thủy tinh dung tích 50 ml. Thêm 100 ml dung dịch M - CAP làm việc và 20 ml etyl axetat vào trong ống rồi nghiền bằng máy nghiền đồng thể trong khoảng 10-15 giây. Sau đĩ, ly tâm trong 5 phút ở tốc độ 3000 vịng/phút. Gạn dịch trong vào bình quả lê 100 ml. Cho thêm 20 ml etyl axetat vào phần cặn trong ống ly tâm rồi trộn đều. Sau đĩ, ly tâm trong 5 phút ở tốc độ 3000 vịng/phút. Gạn dịch trong vào bình quả lê ở trên. Cĩ dịch trong bình quả lê trên máy cơ quay chân khơng cho đến khi cịn khoảng 2,0 - 4,0 ml dung dịch ở nhiệt độ 500c. Chuyển dịch cịn lại sang ống ly tâm 50 ml bằng pipet Pasteur. Rửa bình quả lê 3 lần, mỗi lần bằng 2,0 ml etyl axetat. Tất cả dịch rửa được cho vào ống ly tâm. Cơ cạn dung dịch trong ống ly tâm bằng dịng khí nitơ ở nhiệt độ 50 0C. Thêm 25 ml dung dịch muối NaCl 4 % , 2 ml methanol và 15 ml hexan vào ống ly tâm. Đậy nắp ống ly tâm và lắc thật mạnh trong 1 phút. Sau đĩ, ly tâm trong 1 phút ở tốc độ 800 vịng/phút. Loại bỏ lớp hexan ở trên bằng pipet Pasteur. Lặp lại quá trình này thêm 2 lần, mỗi lần 15 ml hexan. CAP trong pha nước được chuyển sang pha hữu cơ bằng cách lắc mạnh với 15 ml etyl axetat trong 30 giây. Ly tâm hỗn hợp trong 1 phút ở tốc độ 800 vịng/phút. Dùng pipet Pasteur chuyển lớp etyl axetat ở trên vào bình quả lê 100 ml. Lặp lại quá trình này một lần nữa với 15 ml etyl axetat. Dịch chiết cũng được đưa vào bình quả lê. Cơ hỗn hợp dịch chiết cịn lại khoảng 2 - 4 ml trên máy quay chân khơng ở nhiệt độ 550c. Chuyển lượng dịch cịn lại vào ống ly tâm 15 ml. Rửa bình quả lê 3 lần, mỗi lần với 2 ml etyl axetat. Cơ cạn dịch thu được bằng dịng nitơ ở nhiệt độ 500c. Chuyển tiếp sang bước tạo dẫn xuất Sylyl . Chuẩn bị mẫu trắng: Mẫu trắng được định nghĩa là mẫu thủy sản đã được xác định khơng cĩ cloramphenicol. Tiến hành chuẩn bị mẫu trắng giống như chuẩn bị đối với mẫu thử quy định ở trên. Chuẩn bị mẫu để xác định độ thu hồi : Cho thêm 30,0 ml dung dịch chuẩn CAP 0,1m g/ml và 30 m l dung dịch chuẩn M-CAP 0,1 m g/ml vào 10,0g mẫu trắng rồi tiến hành chuẩn bị mẫu giống như chuẩn bị đối với mẫu thử quy định ở trên. Tạo dẫn xuất Sylyl: Thêm 100 m l Sylon vào cặn trong ống ly tâm, đĩng nắp rồi lắc mạnh trên máy rung trộn mẫu. Đặt ống ly tâm vào trong bể điều nhiệt ở nhiệt độ 55 0c trong 40 phút: Làm bay hơi dung dịch trong ống cho đến gần khơ (lưu ý khơng để khơ hồn tồn) dưới dịng nitơ tại nhiệt độ trong phịng. Thêm 500ml toluen rồi lắc mạnh cho tan cặn hồn tồn. Tiến hành phân tích trên hệ thống GC Điều kiện phân tích: Đặt chế độ làm việc cho hệ thống GC như sau: +Chương trình nhiệt độ cột: Tăng từ nhiệt độ 1500C lên nhiệt độ 2700C Với tốc độ 200 0 C/phút, giữ 8,5 phút. Tăng từ nhiệt độ 2700C lên nhiệt độ 2900C Với tốc độ 200C/phút, giữ 2,0 phút. + Nhiệt độ đầu tiêm: 2700C: + Nhiệt độ detector: 3400C. + Tốc độ dịng khí mang He: 1 ml/phút. + Khí bổ trợ: N2 theo điều kiện của GC. + Thể tích tiêm: 1 m l. Ổn định cột sắc ký trong 3 giờ tại chế độ làm việc. Tiêm các dung dịch chuẩn đã được tạo dẫn xuất trước và sau mỗi 5 dung dịch thử. Xác định tỷ số diện tích pic (CAP/M-CAP). Tiêm các dung dịch đã được tạo dẫn xuất của mẫu thử, mẫu trắng, mẫu xác định độ thu hồi vào hệ thống GC mỗi mẫu 2 lần. Tính kết quả thu được theo Điều 6. Yêu cầu về độ tin cậy của phép phân tích Độ lặp lại của 2 lần tiêm: Độ lệch chuẩn (CVS) tính theo diện tích pic sắc ký của 2 lần tiêm cùng một dung dịch chuẩn phải nhỏ hơn 0,5 %. Độ thu hồi (R): Độ thu hồi được xác định cho mỗi lần chạy mẫu. Độ thu hồi tính được phải lớn hơn 80%. Kiểm tra xác nhận (confirmatory test) : Đối với các mẫu đã phát hiện Cloramphenicol bằng phương pháp GC-ECD này, phải kiểm tra xác nhận kết quả bằng GC-MS. 5.5. Tính kết quả Hàm lượng cloramphenicol (C CAP) được tính theo cơng thức: Trong đĩ: X là tỷ số trung bình diện tích pic (CAP/M- CAP) cho dung tích mẫu thử. C là hàm lượng của CAP trong dung dịch các chuẩn đã được dẫn xuất , tính theo ng/g. V là thể tích cuối cùng của dung dịch mẫu thử, tính theo ml. Y là tỷ số diện tích trung bình CAP/M-CAP trong dung dịch các chuẩn đã được dẫn xuất W là khối lượng mẫu thử, tính theo g/l Ngồi ra, người ta cịn đáng giá kết quả thử nghiện dư lượng Chloramphenicol trong thủy sản bằng Kít Elisa thơng qua phân tích khẳng định bằng LC-MS/MS Yêu cầu của một số thị trường về giới hạn phát hiện (LOD) của phương pháp phân tích các chỉ tiêu kháng sinh cấm được thống kê trong bảng 1. Bảng 1: Yêu cầu của các thị trường về giới hạn phát hiện của phương pháp phân tích một số kháng sinh cấm TT Kháng sinh cấm Chỉ tiêu kiểm tra Giới hạn phát hiện tối thiểu EU Mỹ Nhật Chloramphenicol Chloramphenicol (CAP) 0.3 ppb 0.3 ppb 0.5 ppb Malachite green/Leucomalachite green Malachite green / Leucomalachite green (MG/LMG) 2.0 ppb 2.0 ppb 2.0 ppb Furazolidone 3-amino-2-oxazolidone (AOZ) 1.0 ppb 1.0 ppb 1.0 ppb Furaltadone 5-methylamorfolino-3-amino-2-oxazolidone (AMOZ) 1.0 ppb 1.0 ppb 1.0 ppb Nitrofurantoin 1-aminohydantoin (AHD) 1.0 ppb 1.0 ppb 1.0 ppb Nitrofurazone Semicarbazide (SEM) 1.0 ppb 1.0 ppb 1.0 ppb Các phương pháp phân tích sử dụng sắc ký cĩ ghép khối phổ như GC-MS, GC-MS/MS, LC-MS, LC-MS/MS đều đáp ứng được yêu cầu và được các cơ quan thẩm quyền của các nước nhập khẩu chấp nhận. Tuy nhiên những phương pháp này địi hỏi đầu tư chi phí cao về thiết bị, chi phí vận hành, kỹ năng và trình độ của kiểm nghiệm viên. Do vậy nĩ khơng phù hợp cho các phịng kiểm nghiệm qui nhỏ hay những phịng kiểm nghiệm của địa phương. Vài năm gân đây, cách tiếp cận mới về phương pháp phân tích dựa trên phản ứng giữa kháng nguyên-kháng thể (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)) đã trở thành một cơng cụ khá hữu hiệu và được cơ quan thẩm quyền chấp thuận cho phép sử dụng với mục đích thử nghiệm sàng lọc (Screening method). Liên minh châu Âu (Chỉ thị 657/EC/2002) cho phép sử dụng phương pháp ELISA trong phân tích dư luợng các hĩa chất kháng sinh cấm, tuy nhiên cĩ những yêu cầu rất khắt khe về giới hạn phát hiện và độ khơng đảm bảo đo và các tỷ lệ dương tính giả và âm tính giả của xét nghiệm. Từ năm 2002 đến nay, phương pháp ELISA đã được sử dụng trong phân tích sàng lọc tại phịng kiểm nghiệm của các Trung tâm Kiểm tra Chất lượng và Thú y Thuỷ sản vùng đối với các chỉ tiêu CAP, AOZ và AMOZ. Tất cả các mẫu phát hiện dương tính trên ELISA được kiểm tra khẳng định trên LC-MS/MS. Để cĩ cơ sở xem xét tính hữu dụng của các phép thử trên ELISA trong kiểm tra và chứng nhận chất lượng thực phẩm thuỷ sản, trong phạm vi báo cáo này, chúng tơi sẽ đưa ra những đánh giá về kết quả phân tích CAP trên ELISA. Nội dung của báo cáo sẽ xem xét đến hai vấn đề chính là tỉ lệ phát hiện dương giả trên ELISA; và độ tương đồng kết quả kiểm nghiệm giữa hai phương pháp phân tích trên ELISA và LC-MS/MS. Kết quả đánh giá dựa trên số liệu thống kê kết quả phân tích tại phịng kiểm nghiệm của NAFIQAVED 4 – Tp Hồ Chí Minh, từ ngày 1/1/2006 đến tháng 7/2007. Phương pháp phân tích Tĩm tắt qui trình thử nghiệm Elisa sử dụng trong thực nghiệm Kít thử Elisa: Kit thử của các hãng R-Biopharm và TAPB. Qui trình chuẩn bị mẫu: Dư lượng CAP trong 3g mẫu đuợc ly trích bằng 6ml ethyl acetate. Dịch chiết đuợc cơ đến khơ ở 50oC dưới dịng nitơ. Cặn khơ được hồ tan trong 1ml đệm và làm sạch bằng 1ml hexan. Hàm luợng CAP trong dịch chiết đuợc phân tích với kit thử ELISA. Qui trình thử nghiệm với ELISA: qui trình xác định hàm lượng CAP trong dịch chiết trên Elisa tuân thủ theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất. Mỗi loạt thử nghiệm đều cĩ kèm theo mẫu chứng âm và chứng dương để kiểm sốt chất lượng kết quả thử nghiệm. Giới hạn phát hiện: 0,1ppb Tĩm tắt qui trình thử nghiệm LC-MS/MS sử dụng trong thực nghiệm Các mẫu phát hiện dương tính trên ELISA (phần 2.2.1) được phân tích khẳng định trên LC-MS/MS theo qui trình tĩm tắt như sau: Thiết bị: Hệ thống LC-MS/MS: Waters Quattro-micro API (tripple quadrupole, ESI(-) Qui trình chuẩn bị mẫu: Dư lượng CAP trong 3g mẫu đuợc ly trích bằng 6ml ethyl acetate. Dịch chiết đuợc cơ đến khơ ở 50oC dưới dịng nitơ. Cặn khơ được hồ tan trong 1ml NaCl 4%, làm sạch sơ bộ bằng 1ml hexan và sau đĩ được làm tinh sạch bằng cột C18. Hàm luợng CAP trong dịch giải hấp đuợc phân tích trên LC-MS/MS Phân tích trên LC-MS/MS: Các thơng số chính: LC: Pha động: ACN: H20 (80:20) Tốc độ dịng: 0,3ml Thể tích tiêm:10ul MS/MS: ESI (-) MRM : 321->152 321->194 321->256 326->157 Mỗi loạt thử nghiệm đều cĩ kèm theo mẫu chứng âm và chứng dương để kiểm sốt chất lượng kết quả thử nghiệm. Nội chuẩn CAP-d5 được sử dụng để hạn chế tối đa ảnh hưởng của nền mẫu (biological maxtrices) đối với kết quả phân tích. Ngồi ra, hàng năm phịng kiểm nghiệm đều tham gia các chương trình thử nghiệm thành thạo do FAPAS tổ chức (thuộc Phịng Thí nghiệm Trung tâm của Vương quốc Anh - Central Science Laboratory, UK) và đạt kết quả tốt (Z score < 2). So sánh sự tương đồng kết quả phân tích giữa ELISA và LC-MS/MS Kết quả thực nghiệm trên các mẫu thuỷ sản nhiễm CAP của ELISA và LC-MS/MS được trình bày trong các biểu đồ từ 1-7. Các giá trị hàm lượng CAP xác định được bằng ELISA và LC-MS/MS trên cùng một mẫu được thể hiện trên cùng một cột. Biểu đồ:.Mẫu ghẹ, cua 6.Ứng dụng của phương pháp nguyên tử hĩa bằng ngọn lửa 6.1. Nguyên tắc của phương pháp Trong phương pháp mày người ta dùng năng lượng nhiệt của ngọn lửa đèn để hĩa hơi và nguyên tử hĩa mẫu phân tích. Các loại đèn khí được áp dụng là: C2H2/Khơng khí , N2O/ C2H2 hay C2H2/O2. bằng phương pháp nguyên tử hĩa này cĩ thể dịnh lưỡng được các hầu hết các kim loại và một số á kim như As, Si, Se, Te. Muốn đo phổ hấp thu F-AAS, trước hết chuẩn bị mẫu phân tích ở dạng dung dịch. Sau đĩ dẫn mẫu vào ngọn lửa đèn khí để hĩa hơi và nguyên tử hĩa nguyên tố cần phân tích thành đám hơi nguyên tử. một đèn HCL phát ra một tia đơn sắc đặc trưng cho nguyên tố cần đo xuyên qua đám hơi nguyên tử. Đo độ hấp thu căn cứ vào đường chuẩn để xác định hàm lượng nguyên tố trong mẫu. 6.2.Ứng dụng: Xác định Pb Nếu nguồn nguyên tử hĩa là ngọn lửa sử dụng hỗn hợp khí C2H2/Khơng khí, tốc độ đo ở bước sĩng 283,3 nm, thì phương pháp cho phép xác định Pb đến nồng đơ 0.04 mg/l với giới hạn phát hiện là 0.01 mg/l. các chất gây nhiễu chủ yếu ở nồng độ cao là Al, Si, Sr, Mg, Ca. bước sĩng 283.3 nm thường được sử dụng đo phổ hấp thu của Pb. Các bước sĩng 217 nm và 261.4 nm ít được đo. Xác định Cd Dùng ngọn lửa C2H2/Khơng khí tốc, độ nhiên liệu 1.0-1.3 l/m, đo độ hấp thụ của Cd ở bước sĩng 228.8 nm. Giới hạn phát hiện cỡ 0.0005 mg/l. mức độ cao của các chất rắn khơng hịa tan cĩ thể là nguyên nhân của tín hiệu nền, và nếu trong dung sịch chúa lượng lớn silicate thì làm suy giảm sự đáp ứng của Cd. Xác định As Đối với các As cĩ các vạch hấp thụ ở vùng tử ngoại chân khơng. Vùng này bị hấp thu rất mạnh bởi khơng khí và sản phẩm cháy của các chất hữu cơ nên phép định lượng cĩ độ nhạy thấp. nguồn nguyên tử hĩa là Nitrous- Oxide/Acetylen và đo ở bước sĩng 193.7 nm thì các hiệu ứng phân tán rất rõ vì vấy nên sử dụng hiệu chỉnh nền để loại bỏ. Xác định thủy ngân Nếu nguồn nguyên tử hĩa là ngọn lửa C2H2/Khơng khí đo ở bước sĩng 253.7 nm, phương pháp cho phép xác định trực tiếp thủy ngân với giới hạn phát hiện là 0.2 mg/l. Co gây nhiễu khi xác định thủy ngân, nồng độ lớn của Co sẽ hâp thụ ở vạch cộng hưởng 253.7 nm của thủy ngân. Dung dịch Co 1000 mg/l cho độ dấp thụ xấp xỉ 10 %. 7. Salmonella trong sản phẩm thuỷ sản - Phương pháp định tính bằng kỹ thuật Polymerase Chain Reaction 7.1 Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định phương pháp định tính Salmonella trong sản phẩm thuỷ sản bằng kỹ thuật Polymerase Chain Reaction (sau đây gọi tắt là PCR). Kỹ thuật PCR là kỹ thuật dùng để khuếch đại số lượng bản sao của một trình tự AND đích qua các chu kỳ gồm 3 bước: biến tính ADN, bắt cặp bổ sung với mồi và tổng hợp mạch mới nhờ enzym ADN polymerase. 7.2. Nguyên tắc Phương pháp định tính này dựa vào việc xác định đoạn ADN đích cĩ được khuếch đại hay khơng. Quá trình xác định được thực hiện bằng cách điện di sản phẩm khuếch đại trên gel agarose, nhuộm màu ADN bằng etyl bromua và quan sát bằng đèn UV cĩ bước sĩng là 302 mm. Nếu trong mẫu cĩ gen đích, trên bảng gel điện di sẽ xuất hiện sản phẩm khuếch đại cĩ kích thước phù hợp với độ dài của đoạn ADN đích đã định. Nếu trong mẫu khơng cĩ gen đích, trên gel diện di khơng xuất hiện sản phẩm khuếch đại hay sản phẩm khuếch đại cĩ kích thước khơng phù hợp với đoạn ADN đích. 7.3 Phương pháp tiến hành Lấy mẫu: Cân chính xác 25 g mẫu (hoặc một khối lượng chính xác tuỳ theo yêu cầu) rồi cho vào bình tam giác hoặc bao PE vơ trùng. Tăng sinh: Nhằm làm tăng số lượng Salmonella trong mẫu, các tế bào bị suy yếu hay tổn thương cũng được phục hồi và phát triển. Giai đoạn này được tiến hành trong mơi trường khơng chọn lọc và trên nguyên tắc cứ một phần khối lượng mẫu sẽ bổ sung 9 phần khối lượng mơi trường tăng sinh. Nếu lấy 25 g mẫu, phải bổ sung 225 g mơi trường tăng sinh dung dịch pepton đệm.Ủ mẫu cĩ mơi trường tăng sinh ở nhiệt độ 37,0oC 1,0oC trong khoảng 18 giờ 2 giờ. Xử lý mẫu giải phĩng AND: Giai đoạn này nhằm thu nhận sinh khối sau khi tăng sinh, rửa sạch mơi trường sau khi nuơi cấy, phá vỡ tế bào để giải phĩng ADN. Cách xử lý như sau: Lắc đều canh khuẩn tăng sinh. Hút 0,5 ml vào trong ống eppendorf cĩ thể tích 1,5 ml, ly tâm với tốc độ 10 000 vịng/phút trong 5 phút rồi loại bỏ phần mơi trường lỏng bên trên. Rửa sinh khối bên dưới với nước cất vơ trùng rồi tiếp tục ly tâm với chế độ như trên để loại bỏ phần nước. Huyền phù sinh khối trong ống với 0,5 ml nước cất vơ trùng. Ðun sơi cách thuỷ trong 10 phút. Ly tâm huyền dịch sau khi đun với tốc độ 10 000 vịng/phút trong 5 phút để lắng các mảnh vỡ tế bào xuống đáy. Phần dịch trong bên trên được coi là khuơn ADN để tiến hành phản ứng khuếch đại. Khuếch đại: Giai đoạn này nhằm làm tăng số lượng bản sao đoạn ADN đích trên máy luân nhiệt (thermocycler) bằng hai mồi đặc trưng. Quá trình khuếch đại được tiến hành trong khoảng 30 chu kỳ. Chuẩn bị ống khuếch đại: Hút 45 ml hỗn hợp khuếch đại PCR 1,1 x cho vào trong ống nghiệm PCR cĩ thể tích 0,2 hoặc 0,5 ml, thêm vào 1 ml mỗi mồi invA1 và invA2 cĩ nồng độ 6 pM và 3 ml mẫu khuơn ADN. Tổng thể tích trong một ống khuếch đại là 50 ml. Ðối chứng dương: thay dịch khuơn ADN mẫu bằng dịch ADN của Salmonella chuẩn đã biết. Ðối chứng âm: thay dịch khuơn ADN mẫu bằng nước cất vơ trùng. Chương trình khuếch đại: Các ống khuếch đại được đặt vào trong máy luân nhiệt. Chương trình khuếch đại như sau: Duy trì nhiệt độ 95oC trong 5 phút để làm biến tính hồn tồn các sợi ADN trong mẫu. Tiếp theo là 35 chu kỳ, mỗi chu kỳ cĩ 3 bước như sau: 95oC/60 giây; 54oC/45 giây và 72oC/60 giây. Sau khi kết thúc 35 chu kỳ, mẫu được giữ ở nhiệt độ 72oC trong 10 phút, sau đĩ giữ ổn định ở nhiệt độ 20oC cho đến khi điện di. Ðiện di sản phẩm khuếch đại Chuẩn bị gel điện di agarose 1%: Gel agarose 1 % pha trong đệm TAE 1x được đun chảy hồn tồn và đổ vào khay điện di đã cĩ sẵn các lược để tạo giếng. Gel điện di phải cĩ độ dày khoảng 3 - 4 mm. Gel sau khi chuẩn bị được ngâm chìm hồn tồn trong đệm TAE. Chuẩn bị dịch điện di: Mẫu sau khi khuếch đại được nhuộm với 10 ml đệm tải mẫu 6x rồi trộn thật đều. Ðiện di: Một giếng trong gel điện di được sử dụng cho thang ADN chuẩn hay mẫu đối chứng dương. Nạp 10 ml dịch điện di đã chuẩn bị vào trong gel agarose. Tiến hành điện di trong 60 phút ở hiệu điện thế 100 vơn. Nhuộm ADN, quan sát sản phẩm khuếch đại Chuẩn bị dung dịch nhuộm mẫu: Pha dung dịch nhuộm ADN như sau: cho 0,2 ml etyl bromua 10 mg/ml vào 0,5 lít nước, pha vào trong khay chứa cĩ miệng rộng hơn bản gel điện di. Nhuộm gel: Ngâm bản gel đã điện di vào dung dịch nhuộm trong 10 phút. Rửa gel bằng nước trong khoảng 3 - 5 phút để loại bỏ phần etyl bromua dư. Quan sát, chụp hình: Cho bản gel đã nhuộm lên hộp đèn soi UV, đĩng kính bảo vệ, bật đèn rồi quan sát các vạch sáng đỏ của ADN xuất hiện trên bản gel. Sau đĩ, chụp hình để lưu trữ kết quả. 7.4. Ðọc và giải thích kết quả Kết quả phân tích chỉ được xem xét kết luận khi mẫu đối chứng dương tính cĩ sản phẩm khuếch đại ADN với kích tước 520 bp và mẫu đối chứng âm khơng cĩ sản phẩm này. Mẫu được kết luạn là dương tính Salmonella khi cĩ sản phẩm khuếch đại 520 bp trên bản gel. Mẫu được kết luận là âm tính khi khơng cĩ sản phẩm khuếch đại, hay sản phẩm khuếch đại cĩ kích thước khác hơn 520 bp. 7.5. Qui định về đảm bảo an tồn Trong quá trình tiến hành thao tác phải thực hiện đúng các qui định sau đây: Thuốc nhuộm etyl bromua là một chất độc cĩ thể gây ung thư cho người và động vật. Do đĩ, khi sử dụng hố chất này phải cĩ găng tay và kính bảo hộ. Dung dịch sau khi sử dụng phải cho chảy qua than hoạt tính trước khi đổ bỏ. Chỉ được bật đèn UV để quan sát ADN sau khi đã đĩng kính bảo vệ. Nghiêm cấm sử dụng các dụng cụ liên quan đến sản phẩm sau khuếch đại cho việc tăng sinh hay chuẩn bị mẫu. Phịng thí nghiệm phải được bố trí riêng biệt khu chuẩn bị mẫu trước khi khuếch đại và khu xử lý sản phẩm sau khi khuếch đại để tránh hiện tượng nhiễm chéo gây kết quả dương tính giả.  TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Sổ tay kiểm nghiệm vi sinh thực phẩm thủy sản-NXB.Nơng nghiệp-Hà Nội 2004 [2] Specific detection of Salmonella spp. by multiplex polymerase chain reaction. (JS. WAY, KL. JOSEPHSON, SD. PILLAI, M. ABBASZADAGAN, CP. GERBA AND IL. PEPPER. - Appl. Environ. Microbiol., 59 (5) : 1473 - 1479, 1993). [3] [4]www.google.com [5] www.ndl.com.vn