Biểu hiện gen mã hóa leucoanthocyanidin reductase phân lập từ chè trung du xanh (camellia sinensis var. macrophylla) trong vi khuẩn e. coli

Hoàng Thị Thu Yến và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 187(11): 129 - 135 129 BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA LEUCOANTHOCYANIDIN REDUCTASE PHÂN LẬP TỪ CHÈ TRUNG DU XANH (Camellia sinensis var. macrophylla) TRONG VI KHUẨN E. COLI Hoàng Thị Thu Yến1*, Huỳnh Thị Thu Huệ2 1Trường Đại học Khoa học - ĐH Thái Nguyên, 2Viện Nghiên cứu hệ gen - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam TÓM TẮT Hàm lượng polyphenol quyết định đến màu sắc, độ chát và hương vị của nước chè, catechins và dẫn xuất của nó chiếm khoảng 70% polyphenol tổng số. Leucoanthocyanidin reductase (LAR) là một trong hai enzyme chìa khóa tham gia vào con đường sinh tổng hợp catechins ở chè. Gen mã hóa LAR có 3 locus trên hệ gen (CsLAR1, CsLAR2, CsLAR3) trong đó CsLAR1 được chứng minh tham gia sinh tổng hợp catechin và gallocatechin từ leucoanthocyanidin. Chè Trung du từ lâu đã được coi là khởi thủy của cây chè Việt Nam, có 2 dòng chính là Trung du xanh và Trung du tím. Gen CsLAR1 được phân lập từ chè Trung du xanh có một số khác biệt về trình tự amino acid so với các trình tự đã công bố, một số sai khác nằm trong các vùng quy định chức năng của CsLAR1. Nghiên cứu này trình bày kết quả tạo CsLAR1 tái tổ hợp. Gen CsLAR1 được gắn vào vecotor biểu hiện pET32a(+), sau đó biến nạp vào vi khuẩn E. coli chủng Rosetta, sử dụng IPTG cảm ứng biểu hiện CsLAR1 tái tổ hợp. CsLAR1 thu được tồn tại ở cả dạng không tan và dạng tan. Từ khóa: chè Trung du, chè Trung du xanh, Leucoanthocyanidin reductase, catechins, catechin, gallocatechin, CsLAR1 MỞ ĐẦU* Chất lượng sản phẩm chè được đánh giá chủ yếu dựa trên thành phần hóa học có trong chè. Theo thống kê của Harbowy (1997) [5], thành phần hóa học chính trong chất rắn chiết xuất từ chè xanh là polyphenol, chiếm 30-40% khối lượng, tiếp theo là các hợp chất chứa N có khoảng 15% bao gồm caffein (khoảng 2- 5%), protein (6%) và các amino acid (5%). Điều đặc biệt là ngoài các amino acid phổ biến, theanine là amino acid chỉ có ở trong chè chiếm đến 3%. Thành phần hydratcacbon ở chè có khoảng 11% bao gồm các polysaccharide, pectin và các gốc đường tự do. Ở chè có khoảng 3-4% lipid, tuy nhiên khả năng hòa tan của lipid trong dịch chiết xuất là thấp hơn. Ngoài ra, trong chè còn có axit hữu cơ, các vitamin, muối khoáng, các sắc tố như chlorophyll, carotene đặc biệt là tinh dầu và các hợp chất dễ bay hơi liên quan đến tạo hương vị trong chế biến chè chỉ chiếm một phần rất nhỏ. * Tel: 0982 752153, Email: [email protected] Hàm lượng polyphenol quyết định đến màu sắc, độ chát của nước chè và góp phần tạo hương vị của chè. Hầu hết các đặc tính có lợi cho sức khỏe con người đã được chứng minh là do các hợp chất polyphenol có trong chè [5]. Catechins và dẫn xuất của nó còn được gọi là các flavan-3-ol chiếm khoảng 70% polyphenol tổng số [18]; [20]; [23]. Catechins có nhiều lợi ích sức khỏe cho con người như khả năng chống oxi hóa [10], các hoạt tính phòng ngừa ung thư tuyến tiền liệt và buồng trứng [2]; [14], chống ung thư và bệnh tiểu đường [8]; [21]; [25], ngăn chặn bệnh tim mạch [3]; [25]; đặc biệt catechins có thể cũng đóng vai trò trong chống lại tác nhân gây bệnh [11]. Thành phần catechins bao gồm Epicatechin (EC), Epicatechin gallate (ECG), Epigallocatechin (EGC), Epigallocatechin gallate (EGCG), catechin (C) và Gallocatechin (GC) [26]. Các nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng cả thành phần và sự tích lũy catechins có tương quan cao với mức độ biểu hiện của các gen [7]; [13]; [19]; [24] (hình 1). Hoàng Thị Thu Yến và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 187(11): 129 - 135 130 C4H Naringenin chalcone 4-Coumaroyl coA CHS CHI F3H Phenylalanine Cinnamic acid 4-Coumaric acid PAL 4CL leucodelphinidin DFR Leucocyanidin Catechin (C) LAR Epicatechin (EC) ANS Cyanidin Leucoanthocyanin Gallocatechin (GC) Delphinidin Epigallocatechin (EGC) LARANR ANR Epicatechin gallate (ECG) Epigallocatechin gallate (EGCG) FGS FGS ANS flavanones Dihydroflavonol Leucoanthocyanidin Hình 1. Con đường sinh tổng hợp catechins ở chè [9]; [19] PAL (phenylalanine ammonialyase); 4CL (4-coumarate: CoA ligase); C4H (cinnamate 4-hydroxylase); CHI (chalcone isomerase); CHS (chalcone synthase); DFR (dihydroflavonol reductase); F3H (flavanone 3β-hydroxylase); LAR (leuacoanthocyanidin reductase); ANR (anthocyanidin reductase); ANS (anthocyanin synthase); FGS (flavan-3-ol gallate synthase) Catechins của chè được tổng hợp theo các nhánh khác biệt dưới sự xúc tác trực tiếp của 2 enzyme leucoanthocyanidin reductase (LAR) và anthocyanidin reductase (ANR). Hai enzyme này đóng vai trò chìa khóa xác định thành phần catechins bao gồm: Catechins được epimer hóa còn gọi là epicatechin (EGCG, ECG, EGC và EC) và catechins không được epimer hóa (GC và C) [11]; [12]; [22]. LAR xúc tác chuyển hóa leucocyanidin, leucoanthocyanin thành C và GC. Trong khi ANR xúc tác tổng hợp EC và EGC từ anthocyanin. Sau đó, EC và EGC được ester hóa tạo thành ECG và ECCG [1]; [15]; [16]; [23]. Tuy nhiên, nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng sự biểu hiện của LAR (CsLAR1) ở thuốc lá cho kết quả tích lũy epicatechin cao hơn catechin, điều này cho thấy LAR có thể cũng có thể tham gia vào sự tổng hợp epicatechin [11]. LAR là hợp chất không màu, dễ dàng bị oxy hóa và ngưng tụ hình thành sắc tố trong quá trình lên men chè và thuộc siêu họ dehydrogenase [23]. Bằng phương pháp tiếp cận di truyền ngược, các nhà nghiên cứu đã chỉ ra LAR có ba locus gen được đặt tên là CsLAR1, CsLAR2, CsLAR3 và đăng kí trên GenBank với mã số tương ứng KY615698, KY615700, KY615699. cDNA đầy đủ của ba gen CsLAR1, CsLAR2 và CsLAR3 là 1518, 1401 và 1595 bp với khung đọc mở (ORFs) tương ứng 1029, 984 và 1197 bp. Kết quả nghiên cứu cho thấy CsLAR1, CsLAR2 và CsLAR3 có sự tương đồng trình tự amino acid 99; 82; 74% so với gen CsLAR được công bố trên GenBank mang mã số GU992401. Trong các locus gen mã hóa LAR, thì CsLAR1 đã được nghiên cứu biểu hiện ở E. coli và trên cây thuốc lá [4]; [11]; [17]. Gen CsLAR1 được phân lập từ chè Hoàng Thị Thu Yến và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 187(11): 129 - 135 131 Trung du xanh có một số sai khác về trình tự amino acid so với các trình tự đã công bố, một trong số các sai khác đó nằm trong các vùng quy định chức năng của LAR [6]. Do đó trong nghiên cứu này, chúng tôi tiếp tục tiến hành tạo CsLAR1 tái tổ hợp từ gen phân lập từ chè Trung du xanh nhằm tạo nguyên liệu nghiên cứu làm sáng tỏ chức năng của enzyme này. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Nguyên liệu Vector tạo dòng pJET1.2 mang gen CsLAR1 từ chè Trung du xanh (pJET1.2 _CsLAR1) và vector biểu hiện pET32a(+) được lưu giữ tại Phòng Đa dạng sinh học hệ gen, Viện nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và công nghệ Việt Nam. Phương pháp Thiết kế cấu trúc biểu hiện gen CsLAR1 Từ kết quả nghiên cứu bản đồ cắt giới hạn của gen CsLAR1 công bố trên GenBank (GU992401), sơ đồ cấu tạo của vector tách dòng pJET1.2 (Thermo scientific) và vector biểu hiện pET32a(+) (Novagen), cho thấy hai điểm cắt của enzyme cắt giới hạn BamHI và XhoI không có trong trình tự gen CsLAR1, có trong vùng đa tách dòng của vector pJET1.2 và pET32a(+). Chính vì vậy, các đoạn nhận biết của các enzyme cắt giới hạn được thiết kế thêm vào đầu 5’ của mồi để khuếch đại gen từ cDNA chè Trung du xanh. Trên cơ sở đó, mô hình cấu trúc biểu hiện gen CsLAR1 trong vector pET32a(+) được mô tả như hình 2. Tạo vector biểu hiện gen CsLAR1 Vector pJET1.2 mang gen CsLAR1 từ giống chè Trung du xanh đã được cắt bằng hai enzyme giới hạn BamHI và XhoI để thu đoạn gen CsLAR1 có kích thước 1026 bp. Đồng thời, phản ứng cắt bằng BamHI và XhoI cũng được tiến hành với vector pET32a(+). Tiếp sau đó, phản ứng lai gen CsLAR1 vào vector pET32a(+) được tiến hành ở điều kiện 22oC trong 1 giờ. Sản phẩm của quá trình lai được biến nạp vào tế bào vi khuẩn E. coli DH10B. Sau khi biến nạp bằng phương pháp sốc nhiệt, dịch tế bào này được nuôi trên đĩa LB có bổ sung ampicillin. Sau đó, một số khuẩn lạc được chọn và nuôi trong môi trường LB có bổ sung kháng sinh ampicillin ở điều kiện 37oC, nuôi lắc 200 vòng/phút, qua đêm để tách plasmid. Plamid thu được được phân tích bằng enzyme giới hạn và PCR. Biểu hiện gen CsLAR1 Cấu trúc biểu hiện gen mã hóa CsLAR1 trong vector pET32a(+) được biến nạp vào 2 chủng tế bào biểu hiện là Rosetta1, Rosetta2 theo phương pháp sốc nhiệt (Novagen). Dịch nuôi tế bào được cấy trải trên đĩa LB có bổ sung kháng sinh ampicillin, nuôi qua đêm ở điều kiện 37oC. Tiếp theo, cảm ứng biểu hiện gen CsLAR1 trong các chủng biểu hiện ở nồng độ IPTG 0,05 mM dưới điều kiện 37oC trong 5 giờ. Sau đó, các tế bào được thu và xử lý trước khi kiểm tra protein tổng số trên gel polyacrylamide 14%. Trx.tagRBS Histag-Stag-Thrombin-Entorokinase Gen CsLAR1 His tag AUG - 109 aa 54 aa 342 aa STOP 6 aa 5 aa - TAA BamHI XhoI Hình 2. Mô hình cấu trúc biểu hiện gen CsLAR1 RBS: Trình tự nhận biết của ribosome; Trx.tag giúp tăng cường protein tái tổ hợp ở dạng tan trong nước, Histag, Stag là trình tự giúp phát hiện và tinh chế protein tái tổ hợp, Thrombin và Enterokinase là trình tự giúp cắt chuỗi amino acid của protein tái tổ hợp KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Biến nạp cấu trúc biểu hiện mang gen CsLAR1 vào vi khuẩn E. coli DH10b Hoàng Thị Thu Yến và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 187(11): 129 - 135 132 Đoạn gen CsLAR1 từ giống chè Trung du xanh đã được tạo dòng trong vector pJET1.2, plasmid tái tổ hợp này được cắt bằng hai enzyme giới hạn BamHI và XhoI để thu đoạn gen CsLAR1 có kích thước 1026 bp. Đồng thời, phản ứng cắt bằng BamHI và XhoI cũng được tiến hành với vector pET32a(+) (Hình 3). Kb M 1 2 1,0 6,0 3,0 Hình 3. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm cắt plasmid bằng BamHI và XhoI 1: Sản phẩm cắt enzyme giới hạn từ dòng plasmid pJET1.2_CsLAR1 2 và vector pET32a(+) bằng BamHI và XhoI Trên hình 3 cho thấy, plasmid tái tổ hợp bị cắt thành hai đoạn: Một đoạn lớn có kích thước tương ứng với kích thước vector pJET1.2 (~ 3,0 kb) và một đoạn nhỏ hơn có kích thước khoảng 1,0 kb tương ứng đoạn gen CsLAR1. Trong khi đó, vector pET32a(+) đã được mở vòng có kích thước ~5,9 Kb. Tiếp theo, chúng tôi thực hiện phản ứng lai gen CsLAR1 vào vector pET32a(+), biến nạp vào tế bào vi khuẩn E. coli DH10B và nuôi trên môi trường LB chọn lọc. Plasmid được tách từ các dòng khuẩn lạc thu được và kết quả điện di được trình bày ở hình 4. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 (-) Hình 4. Kết quả điện di kiểm tra plasmid tách từ các khuẩn lạc (-): vector pET32a(+) không mang đoạn chèn, 1 – 15: 15 dòng plasmid Kết quả điện di kiểm tra plasmid hình 4 cho thấy, trong 15 dòng thu được chỉ có duy nhất dòng số 07 thấp hơn đối chứng là vector pET32a(+) không mang đoạn chèn. Do đó, chúng tôi lựa chọn ngẫu nhiên một số dòng plasmid cao hơn đối chứng để phân tích chọn vector biểu hiện pET32a(+)_CsLAR1. Chọn lọc dòng plasmid mang gen CsLAR1 Các dòng plasmid được tiến hành phản ứng cắt kiểm tra bằng hai enzyme giới hạn BamHI và XhoI, sản phẩm của phản ứng cắt được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8% (Hình 5). Kb M 1 2 3 1,0 6,0 3,0 5,9 kb ~1,0 kb 1,0 0,5 3,0 Kb M 1 2 3 (+) (-) 1,0 kb A B Hình 5. Kết quả điện di kiểm trả sản phẩm cắt kiểm tra plasmid pET32a(+)_CsLAR1 bằng BamHI và XhoI và PCR khuếch đại gen Hình 5A (M: Maker 1kb, 1 - 3: Sản phẩm cắt enzyme giới hạn từ 3 dòng plasmid pET32a(+)_CsLAR1); hình 5B (M: Maker 1 kb, (+): Sản phẩm PCR từ đối chứng dương là plasmid pJET1.2_CsLAR1, (-): Sản phẩm PCR đối chứng âm là H2O; 1 - 3: Sản phẩm PCR từ plasmid pET32a(+)_CsLAR1) Hoàng Thị Thu Yến và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 187(11): 129 - 135 133 Trên hình 5A cho thấy plasmid, plasmid tách chiết được cắt kiểm tra bằng enzyme giới hạn BamHI và XhoI, DNA plasmid bị cắt thành hai đoạn: Một đoạn lớn có kích thước tương ứng với kích thước vector pET32a(+) (5,9 kb) và một đoạn nhỏ hơn có kích thước khoảng 1,0 kb tương ứng với đoạn gen CsLAR1. Như vậy, chúng tôi đã tạo được vector pET32a(+) mang gen CsLAR1. Để chắc chắn hơn, chúng tôi thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi nhân gen CsLAR1. Sản phẩm PCR từ 3 dòng plasmid đều lên băng đậm và rõ nét có kích thước khoảng 1,0 kb tương ứng với kích thước của đoạn gen CsLAR1 (hình 5B). Như vậy, chúng tôi đã tạo được dòng biến nạp vào E. coli DH10B mang đúng plasmid pET32a(+)_CsLAR1. Biểu hiện gen CsLAR1 Gen mã hóa CsLAR1 từ giống chè Trung du xanh phân lập có kích thước 1,029 kb, mã hóa 337 amino acid. Kết quả này giống với kích thước gen CsLAR1 của các mẫu chè đã được nghiên cứu và công bố [4]; [11]. Hệ số tương đồng di truyền trình tự amino acid giữa chè Trung du xanh với các trình tự đã công bố và đăng ký trên ngân hàng GenBank. CsLAR1 thuộc siêu họ dehydrogenase, đã được phân tích có chứa 3 motif bảo thủ giữa các loài: Motif RFLP, ICCN và THD. CsLAR1 có 2 vùng chức năng chính, vùng liên kết với NADP giàu glycine ở đầu N (vị trí 18-24); vùng xác định sự đặc hiệu cơ chất chứa các amino acid ở vị trí 118H, 133Y và 136K [17]. CsLAR1 phân lập từ chè Trung du xanh có tính bảo thủ ở các amino acid liên kết với cơ chất, còn vùng liên kết với NADP tất cả các mẫu công bố đều là S, còn mẫu chè Trung du xanh là C. Motif RFLP và THD có tính bảo thủ cao, trong khi motif ICCN của CsLAR1 từ chè Trung du xanh có 1 vị trí amino acid khác biệt so với các trình tự còn lại [6]. Sau khi thiết kế thành công, vector tái tổ hợp pET32a(+)_CsLAR1 được biến nạp vào 2 chủng tế bào biểu hiện là Rosetta1, Rosetta2 và kiểm tra biểu hiện CsLAR1 trong các chủng mang vector tái tổ hợp này. Để lựa chọn chủng biểu hiện thích hợp nhất, chúng tôi chọn ngẫu nhiên một khuẩn lạc trên mỗi đĩa biến nạp và tiến hành cảm ứng biểu hiện gen CsLAR1. Kết quả kiểm tra protein tổng số được thể hiện ở Hình 6. Hình 6. Kết quả điện di sản phẩm protein CsLAR1 M: Thang protein chuẩn của Fermentas, (-): Đối chứng âm là chủng không được cảm ứng, ts: protein tổng số, tan: Protein thu được ở pha tan, tủa: Protein thu được ở pha tủa Gen CsLAR1 có độ dài 1026 bp tương ứng với sản phẩm protein lý thuyết là khoảng 37,62 kDa cùng với đoạn trình tự TrxA mã hoá cho protein thioredoxin (11,8 kDa), His- Taq (1,68 kDa), S-Taq (1,7 kDa), thrombin (0,63 kDa), enterkinase (0,61 kDa). Như vậy, protein tái tổ hợp thu được có kích thước lý thuyết khoảng 54,04 kDa. Hình ảnh điện di protein tổng số cho thấy sản phẩm điện di của các chủng Rosetta1, Rosetta2 có xuất hiện một băng protein đậm khác biệt so với đối chứng là chủng không được cảm ứng. Băng protein này nằm ở khoảng kích thước tương đương với kích thước của protein CsLAR1 và các phần của vector pET32a(+) (27,72 kDa) trên lý thuyết. Trong đó, băng protein CsLAR1 ở chủng Rosetta1 to và đậm hơn so với chủng Rosetta2 thể hiện lượng protein thu được nhiều hơn. Đồng thời chúng tôi cũng đánh giá độ tan của protein CsLAR1 ở cả 2 chủng Rosetta1, Rosetta2 trong môi trường nước. Chúng tôi nhận thấy rằng, ở cả 2 chủng, protein CsLAR1 hầu hết biểu hiện ở dạng Hoàng Thị Thu Yến và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 187(11): 129 - 135 134 không tan, chỉ một lượng nhỏ ở dạng tan. Như vậy, chúng tôi đã biểu hiện thành công vector tái tổ hợp pET32a(+)_CsLAR1 trong các chủng Rosetta1, Rosetta2. KẾT LUẬN Gen CsLAR1 phân lập từ chè Trung du xanh được gắn vào vecotor biểu hiện pET32a(+) và biến nạp vào vi khuẩn E. coli chủng Rosetta. CsLAR1 tái tổ hợp được biểu hiện trong E. coli tồn tại ở cả dạng không tan và dạng tan. Lời cảm ơn Công trình được thực hiện tại Phòng Di truyền phân tử và tế bào, Khoa Công nghệ Sinh học (Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên); Phòng Đa dạng sinh học hệ gen, Viện nghiên cứu hệ gen (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) với hỗ trợ kinh phí từ đề tài cấp Bộ Giáo dục và Đào tạo: "Nghiên cứu tạo thư viện cDNA/EST, giải mã và phân tích sự biểu hiện các gen liên quan đến quá trình tổng hợp polyphenol ở chè trồng tại Thái Nguyên", mã số B2016-TNA-24. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Ashihara H., Deng W. W., Mullen W. & Crozier A. (2010), "Distribution and biosynthesis of flavan-3-ols in Camellia sinensis seedlings and expression of genes encoding biosynthetic enzymes", Phytochemistry, 71(5-6), pp. 559-566. 2. Bemis D. L., Katz A. E. & Buttyan R. (2006) "Clinical trials of natural products as chemopreventive agents for prostate cancer". Expert Opin. Investig Drugs, 15(10), pp. 1191-1200. 3. Bordoni A., Hrelia S., Angeloni C., Giordano E., Guarnieri C., Caldarera C. M. & Biagi P. L. (2002), "Green tea protection of hypoxia/reoxygenation injury in cultured cardiac cells", J. Nutr. Biochem., 13(2), pp. 103-111. 4. Chen C., Wei K., Wang L., Ruan L., Li H., Zhou X., Lin Z., Shan R. & Cheng H. (2015), "Expression of Key Structural Genes of the Phenylpropanoid Pathway Associated with Catechin Epimerization in Tea Cultivars", Front Plant Sci., 8, pp. 702-712. 5. Harbowy M. E. & Balentine D. A. (1997), "Tea chemistry", Critical Reviews ill Plant Sciences, 16(5), pp. 415-480. 6. Hoàng Thị Thu Yến, Dương Trung Thành, Phạm Thị Hằng, Dương Trung Dũng & Huỳnh Thị Thu Huệ (2018) "Phân lập và mô tả trình tự các gen mã hóa leucoanthocyanidin reductase và anthocyanidin reductase từ chè Trung du xanh Thái Nguyên (Camellia sinensis)", Tạp chí Công nghệ Sinh học, 16(3), tr. 234-242. 7. Jiang X., Liu Y., Li W., Zhao L., Meng F., Wang Y., Tan H., Yang H., Wei C., Wan X., Gao L. & Xia T. (2013), "Tissue-specific, development-dependent phenolic compounds accumulation profile and gene expression pattern in tea plant (Camellia sinensis)". PLoS One, 8(4), pp. 62315-62329. 8. Kao Y. H., Chang H. H., Lee M. J. & Chen C. L. (2006), "Tea, obesity, and diabetes". Mol. Nutr. Food Res., 50(2), pp. 188-210. 9. Liu M., Tian H. L., Wu J. H., Cang R. R., Wang R. X., Qi X. H., Xu Q. & Chen X. H. (2015), "Relationship between gene expression and the accumulation of catechin during spring and autumn in tea plants (Camellia sinensis L.)". Hortic. Res., 2, pp. 15011-15019. 10. Luximon-Ramma A., Neergheen V. S., Bahorun T., Crozier A., Zbarsky V., Datla K. P., Dexter D. T. & Aruoma O. I. (2006), "Assessment of the polyphenolic composition of the organic extracts of Mauritian black teas: a potential contributor to their antioxidant functions". Biofactors, 27(1-4), pp. 79-91. 11. Pang Y., Abeysinghe I. S., He J., He X., Huhman D., Mewan K. M., Sumner L. W., Yun J. & Dixon R. A. (2013), "Functional characterization of proanthocyanidin pathway enzymes from tea and their application for metabolic engineering", Plant Physiol, 161(3), pp. 1103-1116. 12. Punyasiri P. A., Abeysinghe S. B. & Kumar V. (2005), "Preformed and induced chemical resistance of tea leaf against Exobasidium vexans infection", J. Chem. Ecol., 31(6), pp. 1315-1324. 13. Rani A., Singh K., Ahuja P. S. & Kumar S. (2012), "Molecular regulation of catechins biosynthesis in tea [Camellia sinensis (L.) O. Kuntze]", Gene, 495(2), pp. 205-210. 14. Ravindranath M. H., Saravanan T. S., Monteclaro C. C., Presser N., Ye X., Selvan S. R. & Brosman S. (2006), "Epicatechins Purified from Green Tea (Camellia sinensis) Differentially Suppress Growth of Gender-Dependent Human Cancer Cell Lines", Evid. Based Complement Alternat Med., 3(2), pp. 237-247. 15. Singh K., Rani A., Paul A., Dutt S., Joshi R., Gulati A., Ahuja P. S. & Kumar S. (2009), "Differential display mediated cloning of Hoàng Thị Thu Yến và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 187(11): 129 - 135 135 anthocyanidin reductase gene from tea (Camellia sinensis) and its relationship with the concentration of epicatechins", Tree Physiol, 29(6), pp. 837-846. 16. Tanner G. J., Francki K. T., Abrahams S., Watson J. M., Larkin P. J. & Ashton A. R. (2003), "Proanthocyanidin biosynthesis in plants. Purification of legume leucoanthocyanidin reductase and molecular cloning of its cDNA". J. Biol. Chem., 278(34), pp. 31647-31656. 17. Wang P., Zhang L., Jiang X., Dai X., Xu L., Li T., Xing D., Li Y., Li M., Gao L. & Xia T. (2017), "Evolutionary and functional characterization of leucoanthocyanidin reductases from Camellia sinensis", Planta, 247, pp. 139-154. 18. Wang Y. S., Gao L. P. & Shan Y. (2012), "Influence of shade on flavonoid biosynthesis in tea (Camellia sinensis (L.) O.Kuntze)", Sci. Hort, 141, pp. 7–16. 19. Wei K., Wang L., Zhang C., Wu L., Li H., Zhang F. & Cheng H. (2015), "Transcriptome Analysis Reveals Key Flavonoid 3'-Hydroxylase and Flavonoid 3',5'-Hydroxylase Genes in Affecting the Ratio of Dihydroxylated to Trihydroxylated Catechins in Camellia sinensis". PLoS One, 10(9), pp. 137925-137937. 20. Winkel-Shirley B. (2001), "Flavonoid biosynthesis. A colorful model for genetics, biochemistry, cell biology, and biotechnology". Plant Physiol, 126(2), pp. 485-493. 21. Wolfram S., Wang Y. & Thielecke F. (2006), "Anti-obesity effects of green tea: from bedside to bench", Mol. Nutr. Food Res., 50(2), pp. 176-187. 22. Wu Z. J., Li X. H., Liu Z. W., Xu Z. S. & Zhuang J. (2014), "De novo assembly and transcriptome characterization: novel insights into catechins biosynthesis in Camellia sinensis", BMC Plant Biol., 14, pp. 277-292. 23. Xie D. Y., Sharma S. B., Paiva N. L., Ferreira D. & Dixon R. A. (2003), "Role of anthocyanidin reductase, encoded by BANYULS in plant flavonoid biosynthesis", Science, 299(5605), pp. 396-399. 24. Xiong L., Li J., Li Y., Yuan L., Liu S., Huang J. & Liu Z. (2013), "Dynamic changes in catechin levels and catechin biosynthesis-related gene expression in albino tea plants (Camellia sinensis L.)", Plant Physiol Biochem., 71, pp. 132-143. 25. Yang T. T. & Koo M. W. (2000), "Inhibitory effect of Chinese green tea on endothelial cell- induced LDL oxidation", Atherosclerosis, 148(1), pp. 67-73. 26. Zhen Y. S., Chen Z. M., Cheng S. J. & Chen M. L. (2002), Tea: bioactivity and therapeutic potential, London, Taylor & Francis, pp. 280. SUMMARY EXPRESSION OF GENE ENCODING LEUCOANTHOCYANIDIN REDUCTASE ISOLATED FORM GREEN TRUNG DU TEA (Camellia sinensis var. macrophylla) IN E. COLI Hoang Thi Thu Yen 1* , Huynh Thi Thu Hue 2 1 TNU-University of Sciences 2Institute of genome research - Vietnam Academy of Science and Technology The content of polyphenol determines the color, harshness and favor of tea, catechins and its derivatives account for about 70% of total polyphenols. Leucoanthocyanidin reductase (LAR) is one of two key enzymes involved in the biosynthesis pathway of catechins in tea. Gene encoding LAR has three loci on genome (CsLAR1, CsLAR2, CsLAR3) in which CsLAR1 confirmed that the formation of C and GC proceeded from leucoanthocyanidins. Trung du tea has been considered as the origin of Vietnamese for a long time and has two major clones: the green and purple Trung du tea. CsLAR1 gene isolated from the green Trung du tea has some of distinct amino acids when compared to published sequences, some of them belong to function domains. This study presents the results of producing recombinant CsLAR1. CsLAR1 gene is ligated into pET32a(+) and then transfered to E. coli stain Rosetta, using IPTG induce expression of CsLAR1. Recombinant CsLAR1 obtained in both insoluble and soluble forms. Key words: Trung du tea, green Trung du tea, Leucoanthocyanidin reductase, catechins, catechin, gallocatechin, CsLAR1 Ngày nhận bài: 15/10/2018; Ngày phản biện: 23/10/2018; Ngày duyệt đăng: 31/10/2018 * Tel: 0982 752153, Email: [email protected]