Báo cáo ứng dụng sắc kí khí

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC Lớp: K13S2 ****** GVHD: Th.S Cao Ngọc Minh Trang SVTH: Trần An Phương Nguyễn Khánh Ly Võ Doãn Trung Hoàng Thị Minh Nhật Võ Quốc Cường Trần Thị Huỳnh Tư Nguyễn Thị Ngọc Anh Nguyễn Thùy Trang Phạm Hoàng Ngọc Thủy Tháng 11/2010 SẮC KÍ KHÍ (Gas chromatography – GC) Sắc kí khí : Nguyên tắc: GC dựa trên nguyên tắc sau: khi một hỗn hợp các chất bay hơi được khí mang (pha động) vận chuyển qua cột chứa một chất hấp phụ rắn hoặc thông thường hơn là qua một pha lỏng hấp phụ lên một chất rắn (pha tĩnh), mỗi thành phần hơi đó được phân bố trong khí mang và chất rắn hoặc chất lỏng. Tùy theo thời gian lưu, mỗi thành phần hơi sẽ thoát ra khỏi cột sắc ký ở các thời gian khác nhau và được xác định bởi detector thích hợp, có thể xác định định tính cũng như định lượng. Ưu điểm: Khả năng phân tách rất cao, ngay cả đối với những hỗn hợp phức tạp. Độ nhạy, độ chính xác và độ tin cậy rất cao. Thời gian phân tích ngắn. Có thể phân tích hàng loạt. Cấu tạo: 6 1 3 4 5 7 8 9 2 Thiết bị GC: 1. Bộ cung cấp khí mang; 2. Bộ điều chỉnh áp suất; 3. Bộ đo lưu lượng; 4. Bộ nạp mẫu; 5. Cột sắc ký; 6. Buồng ổn nhiệt; 7. Detector; 8. Bộ khuếch đại điện tử; 9. Bộ xử lý tín hiệu Cột sắc ký: Có hai cột: cột nhồi và cột hở hay cột mao quản. Cột nhồi: Thường chế tạo dạng ống bằng thép không gỉ, thủy tinh. Đường kính 1,6 – 9,5 mm, chiều dài khoảng 3m. Trong sắc ký khí – rắn vật liệu nhồi cột thường là Silicagel, polime xốp hoặc sàng phân tử như Zeolit. Trong sắc ký khí – lỏng chất nhồi cột đóng vai trò chất mang pha lỏng (pha tĩnh), chất lỏng là chất không bay hơi được tẩm lên chất mang thành một lớp mỏng. Chất lỏng thường dùng là dầu Silicol, polietilen glycol… Chất mang thường là đất Diatomit, gạch chịu lửa nghiền. Cột mao quản: Thường dùng là cột mao quản hở, trên thành cột có một lớp chất lỏng mỏng, đều, đường kính trong của cột nhỏ hơn 1mm, chiều dài từ 30 – 90 mm. Cột thường được chế tạo từ kim loại, thủy tinh hoặc chất dẻo. Khí mang: Trong GC, khí mang là khí dùng để vận chuyển các chất khí nghiên cứu qua cột sắc ký, đó chính là pha động. Khí mang phải là các khí trơ, không tương tác với mẫu, với pha tĩnh, với các bộ phận tiếp xúc, phải có độ tinh khiết cao (ít nhất là 99,995%), phải chọn cho phù hợp với Detector và các yêu cầu khác về phân tích. Ngoài ra phải chọn khí mang có giá thành rẻ và an toàn, tùy từng trường hợp có thể dùng N2, H2, He, Ar, O2 và không khí. + Detector: Ghi các tín hiệu thu được từ quá trình sắc ký, phân tích tín hiệu và biết được các chất cần phân tích, tách. Trong GC hiện nay người ta sử dụng Detector dẫn nhiệt, Detector ion hóa ngọn lửa, Detector hấp thụ electron Phân tích bằng GC: Phân tích định tính:Từ sắc ký đồ ta sẽ nhận được các tín hiệu ứng với từng cấu tử gọi là các pic sắc ký. Thời gian lưu hay thể tích lưu của pic là đặc trưng định tính cho chất cần tách. So sánh thời gian lưu (thể tích lưu) của mẫu thử với mẫu chuẩn ghi ở cùng điều kiện. Phân tích định lượng: Tín hiệu thu được ở Detector tỷ lệ với nồng độ hoặc hàm lượng các cấu tử. Tín hiệu ở đây thường là chiều cao pic, diện tích pic. Để đạt được hiệu quả phân tích đúng, điều cần thiết là phải tách các cấu tử cần nghiên cứu một cách hoàn chỉnh, không có sự xen phủ pic này với pic khác. ỨNG DỤNG CỤ THỂ CỦA SẮC KÝ KHÍ Thuốc trừ sâu gốc phospho hữu cơ trong thuỷ sản và sản phẩm thuỷ sản – Phương pháp định lượng bằng sắc ký khí Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này qui định phương pháp xác định hàm lượng các thuốc trừ sâu gốc phospho hữu cơ (sau đây gọi tắt là OP) gồm 5 loại thuốc trừ sâu chính: dimethoate, chlorfenvinphos, chlorpyrifos, methidathion và phosmet trong thuỷ sản và sản phẩm thuỷ sản bằng hệ thống sắc ký khí (sau đây gọi tắt là GC). Giới hạn phát hiện của phương pháp từ 0,2 đến 1mg/kg. Phương pháp tham chiếu Tiêu chuẩn này được xây dựng dựa theo phương pháp so sánh các kỹ thuật làm sạch trong các phương pháp phân tích chọn lọc dư lượng các thuốc trừ sâu OP trong nhuyễn thể (đăng trong Journal of AOAC international phần 79, số 1, trang 123-131, năm 1996). Nguyên tắc Thuốc trừ sâu OP trong mẫu thủy sản được chiết tách ra bằng hỗn hợp axetonitril-axeton. Dịch chiết được làm sạch trên cột silicagel, sau đó được chiết tách làm 2 phân đoạn. Hàm lượng các thuốc trừ sâu OP trong các phân đoạn chiết được xác định trên hệ thống GC với 2 đầu dò: đầu dò bắt giữ điện tử (ECD) và đầu dò ion hoá nhiệt phát hiện nitơ-phospho (NPD). Thiết bị, dụng cụ, hoá chất, dung dịch thử và dung dịch chuẩn Thiết bị và dụng cụ: Máy sắc ký khí với đầu dò ECD và NPD. Cột sắc ký thủy tinh (có van khoá), kích thước L x ID là 150 x 5mm và 50 x 20mm. Cột mao quản (cho máy GC): loại HP Ultra 2, kích thước L x ID = 25 m x 0,2 mm, độ dày lớp pha tĩnh là 0,33 mm hoặc tương đương. Máy cô quay chân không. Máy nghiền đồng thể. Máy trộn cao tốc. Tủ sấy. Lò nung. Cân phân tích có độ chính xác 0,0001 g. Các dụng cụ thuỷ tinh, bình định mức. Hoá chất: Hoá chất phải là loại tinh khiết được sử dụng để phân tích, gồm: Hexan loại dùng cho GC. Etyl axetat loại dùng cho HPLC. Sunfat natri dạng hạt, được làm khô bằng sấy qua đêm ở nhiệt độ 350oC và giữ trong chai thuỷ tinh. Axeton loại dùng cho GC. Axetonitril loại dùng cho GC Khí mang: heli loại dùng cho GC. Bông thuỷ tinh (SUPELCO, 2-0411). Silicagel cỡ hạt 60 mesh: silica-60 (Merck, Darmstadt, Germany). Silicagel đã được hoạt hoá: cân một lượng silicagel, rửa sạch bằng điclometan rồi cho vào trong chén sứ và để trong tủ sấy ở nhiệt độ 120oC trong vòng 12 giờ. Sau đó, dùng giấy thiếc bọc kín miệng chén sứ rồi để lại vào tủ sấy ở nhiệt độ 120oC trước khi sử dụng. Xelit Các chất chuẩn thuốc trừ sâu OP (Promochem, Wesel, Germany): dimethoate, chlorfenvinphos (đồng phân E+Z), chlorpyrifos, methidathion và phosmet. Dung dịch thử và dung dịch chuẩn Dung dịch rửa giải: hỗn hợp gồm dung dịch axetonitril và axeton theo tỷ lệ về thể tích là 9:1 được pha trước khi sử dụng. Chuẩn bị các dung dịch chuẩn thuốc trừ sâu OP trong axeton từ các chất chuẩn tinh khiết (lớn hơn 99%). Tuỳ theo nồng độ thuốc trừ sâu có trong ống chuẩn, dùng bình định mức và lượng axeton thích hợp. (Chú thích: các chuẩn phải được bảo quản ở nhiệt độ - 20oC). Chuẩn thu hồi: pha các chuẩn của các OP trong dung môi axeton để có hàm lượng trong khoảng 0,005 - 50 mg/ml. Dung dịch chuẩn trung gian: pha loãng các chuẩn ban đầu trong axeton được các chuẩn trung gian. Dung dịch chuẩn công tác: các chuẩn công tác được chuẩn bị từ các chuẩn trung gian được pha loãng trong hexan để bơm vào GC. Phương pháp tiến hành Chuẩn bị mẫu thử: Cân chính xác 5g mẫu (ký hiệu m) đã được nghiền bằng máy nghiền đồng thể rồi cho vào cốc thuỷ tinh có mỏ. Thêm 1g xelit, 30g sunfat natri khan rồi nghiền đều. Tiếp tục thêm vào 150ml hỗn hợp dung dịch axetonitril-axeton theo tỷ lệ về thể tích là 9:1 rồi trộn hỗn hợp trong 3 phút trong máy trộn cao tốc để chiết lấy các thuốc trừ sâu từ mẫu. Sau đó, lọc dung dịch bằng giấy lọc. Sản phẩm chiết được cô đặc trên máy cô quay đến khoảng 5ml, sau đó cô tiếp cho đến khô trên máy cô quay trong chế độ chân không ở nhiệt độ 40oC. Thêm vào dịch thu được 1ml hexan rồi làm sạch dịch chiết theo. Chuẩn bị mẫu trắng Mẫu trắng được định nghĩa là mẫu thủy sản đã được xác định không có chứa thuốc trừ sâu gốc OP. Tiến hành chuẩn bị mẫu trắng giống như chuẩn bị đối với mẫu thử theo qui định tại. Chuẩn bị mẫu để xác định độ thu hồi Thêm 1ml dung dịch chuẩn có hàm lượng từ 0,005 đến 50mg/ml vào 5g mẫu trắng, trộn đều mẫu bằng máy nghiền đồng thể Tiến hành chuẩn bị mẫu giống như chuẩn bị đối với mẫu thử theo qui định trên. Làm sạch dịch chiết Chuẩn bị cột gồm: bông thuỷ tinh; 1,3g silicagel đã được hoạt hoá, 1g sunfat natri khan. Trước khi tiến hành phân tích, cho vào cột 5ml etyl axetat và sau đó là 5ml hexan . Làm sạch dịch chiết Chuyển dịch thu được vào các cột sắc ký đã được chuẩn bị Rửa dung dịch trong cột với 5ml hexan, sau đó với 2ml hỗn hợp hexan-etyl axetat theo tỷ lệ về thể tích là 95:5. Tiếp theo, rửa giải với 8ml hỗn hợp hexan-etyl axetat theo tỷ lệ về thể tích là 50:50 rồi tách lấy phân đoạn 1. Sau đó, tiếp tục rửa giải với 5ml etyl axetat rồi tách lấy phân đoạn 2. Tốc độ rửa giải phải luôn điều chỉnh đạt 10giọt/phút. Thu các phân đoạn chiết vào các bình thuỷ tinh đáy tròn của máy cô quay chân không. Tiến hành cô trên máy cô quay cho đến khô. Sau đó, thêm chính xác 1ml hexan vào từng bình, lắc cho tan đều rồi hút để bơm vào máy GC theo. Tiến hành phân tích trên GC Ðiều kiện phân tích Máy sắc ký khí sử dụng đầu dò ECD và NPD, chọn chế độ bơm tự động, mỗi lần một lượng 2ml theo chế độ tiêm không chia. Chế độ nhiệt của hệ thống GC: Nhiệt độ của buồng tiêm: 2700C Nhiệt độ đầu dò ECD: 3000C, tốc độ dòng N2: 60ml/phút Nhiệt độ đầu dò NPD: 2700C, tốc độ dòng He: 30ml/phút, H2: 3ml/phút, không khí: 100ml/phút. Chương trình nhiệt độ cột (mô tả chi tiết trong Biểu đồ 1): Duy trì ở 90oC trong 1 phút; tăng 30oC/phút, lên tới 180oC; tăng 4oC/phút, lên tới 270oC và duy trì ở 270oC trong 20 phút Cột sắc ký: Cột mao quản HP Ultra 2, chất nhồi cột chứa 5% metylsilicol, chiều dài 25m, đường kính trong 0,2mm, độ dày lớp pha tĩnh 0,33mm. Khí: Khí mang: heli, tốc độ 0,5ml/phút. Tiến hành phân tích Tiêm các dung dịch chuẩn công tác vào máy GC theo thứ tự từ nồng độ thấp đến cao. Mỗi dung dịch tiêm 2 lần, tính diện tích pic trung bình. Dựng đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa các diện tích pic thu được và nồng độ từng loại thuốc trừ sâu theo quan hệ tuyến tính bậc 1 (phương trình y = ax+b). Tiêm dung dịch mẫu thử, dung dịch mẫu trắng, dung dịch xác định độ thu hồi đã được làm sạch vào hệ thống GC. Mỗi dung dịch mẫu tiêm 2 lần. Tính giá trị trung bình. Yêu cầu về độ tin cậy của phép phân tích Ðộ lặp lại của 2 lần tiêm Ðộ lệch chuẩn (CVS) tính theo diện tích píc sắc ký của 2 lần tiêm cùng một dung dịch chuẩn phải nhỏ hơn 0,5%. Ðộ thu hồi (R) Ðộ thu hồi được xác định bằng cách sử dụng 10 mẫu trắng đã được bổ sung một lượng dung dịch chuẩn để tính đuợc hàm lượng chính xác. Ðộ thu hồi tính được phải nằm trong khoảng từ 70 đến 110% (tuỳ theo hàm lượng OP có trong mẫu). Ðường chuẩn của mỗi cấu tử phải có độ tuyến tính tốt, hệ số tương quan hồi quy tuyến tính (R2) phải lớn hơn hoặc bằng 0,99. Tính kết quả Hàm lượng từng loại thuốc trừ sâu có trong mẫu được tính trên cơ sở đường chuẩn thu được. Với đường chuẩn ở dạng y =ax+b, hàm lượng từng loại thuốc trừ sâu có trong mẫu được tính theo công thức sau: (Y - b) C (mg/kg) = ------------ x F A Trong đó: - C là nồng độ từng loại thuốc trừ sâu có trong mẫu, tính theo mg/kg. - Y: là hiệu số giữa diện tích pic của dịch chiết và diện tích pic có trong mẫu trắng tiêm vào GC, tính theo đơn vị diện tích. - a, b: là các thông số của đường chuẩn y = ax + b, được xác định theo trên - F: là hệ số pha loãng mẫu và có giá trị bằng tỉ số giữa thể tích phân đoạn dịch chiết thu được sau khi làm sạch và khối lượng mẫu m sử dụng. Phân tích thành phần acid béo bằng phương pháp sắc kí khí Để phân tích thành phần acid béo, thường dùng phương pháp sắc kí khí. Do đó dẫn xuất methyl ester của acid béo thì có nhiệt độ hóa hơi thấp hơn nhiều so với acid béo tự do nên hỗn hợp acid béo được tạo thành dẫn xuất methyl ester trước khi đưa vào phân tích. Cũng có thể chuyển acid béo thành methyl ester có thể dùng xúc tác kiềm hoặc acid, tuy nhiên khi dùng BF3 làm xúc tác trong phương pháp acid sẽ làm biến đổi cấu trúc không gian của liên kết đôi thành các dạng liên hợp CLA, vì vậy làm sai lệch kết quả khi phân tích CLA (acid linoleic nối đôi liên hợp - C= C- C= C- ) Dụng cụ, thiết bị: Phễu chiết 100ml, bình cầu 250ml có hai cổ, ống nghiệm, pipet tự động, syringe tiêm mẫu 10 microlit. Máy ly tâm Hệ thống thiết bị phân tích sắc kí khí Hóa chất Hexan Dung dịch metanolat natri Dung dịch metalonic HCl Phương pháp chuẩn bị methyl ester Nguyên lí: Triglycerid được chuyển ester hóa với methanol trong môi trường CH3ONa. Acid béo tự do còn lại sau phản ứng được methyl ester hóa bằng môi trường acid. Sản phẩm methyl ester của acid béo được trích ra khỏi hỗn hợp bằng hexan. Phương pháp tạo dẫn xuất methyl ester của các acid béo: Cân chính xác khoảng 20÷30mg lipid, cho vào ống nghiệm. Sau đó cho vào 1ml hexan và 0,15ml dung dịch metalonat natri, lắc thật kĩ trong khoảng 1 phút rồi để yên ở nhiệt độ thường 30 phút. Tiếp theo cho vào 1ml metanolic HCl, lắc thật kĩ rồi cho để cho phản ứng xảy ra trong vòng 45 phút. Sau đó li tâm ống nghiệm 3000 vòng/ phút. Dung dịch trong ống nghiệm sẽ bị tách thành 3 pha. Dùng pipet tự động hút lấy pha trên cùng có chứa methyl ester của acid béo đem phân tích trên máy sắc kí khí. Dẫn xuất methyl ester được bảo quản trong điều kiện chống oxi hóa và bảo lạnh cho tới khi phân tích. Phân tích thành phần methyl ester trên máy sắc kí khí: Giới thiệu về hệ thống thiết bị: Bình chứa khí mang Bộ phận điều chỉnh áp suất Van bộ phận lọc Lò Đầu bơm mẫu Cột mao quản Đầu dò Bộ phận xử lí số liệu Đầu dò: Sử dụng đầu dò ion hóa bằng ngọn lửa để phân tích chất béo (FID). Đây là một đầu dò có độ nhạy cao, độ tuyến tính tương đối rộng, khá nhạy nếu chất hữu cơ chứa nhiều CH. Nguyên lí hoạt động đầu dò này là sẽ đốt cháy những chất ra khỏi cột phân tích bằng ngọn lửa có khí hidro đang cháy. Khi một chất hữu cơ bị đốt cháy dưới tác dụng của ngọn lửa tạo ra bởi sự đốt cháy hydro, có sự tạo thành các gốc CHn*, OH*, O2* ở biên ngọn lửa. Các gốc tự do phản ứng sinh ra CHO+: C* + OH* CHO+ + e- Tiến hành phân tích mẫu Trình tự tiến hành: Khởi động máy Cho chạy pha động Cài đặc chương trình chạy sắc kí Bơm mẫu Chạy sắc kí phân tích mẫu Thu nhận và xử lí số liệu Báo cáo và trình bày kết quả phân tích. Thực hiện Điều kiện phân tích: Sử dụng cột mao quản DB- 1 (ID = 0,25nm, l= 30m ), là loại cột không phân cực Pha tĩnh 100% dimethylpolysiloxane Pha động khí nitơ Ditector FID Cài đặc chương trình chạy sắc kí: Nhiệt độ injector 250oC Nhiệt độ detector 250oC Lưu lượng H2 40ml/min Lưu lượng dòng khí mang N2 400ml/min Nhiệt độ cột 180oC trong 2 phút, tăng 2,5oC/phút tới 205oC, tăng 3,5oC/phút tới 230oC, dừng 2 phút, tăng 5oC/phút tới 250oC Áp suất đầu vào của khí mang 14psi Split ratio 1/25 Hoặc dung cột DB-5 (0,25mm, 30m) là một loại phân cực yếu. Pha tĩnh có 95% là dimethylpolysilosane, 5% là dimethylpolysilosane với chương trình chạy phân tích. Cài đặc chương trình chạy sắc kí: Nhiệt độ injector 270oC Nhiệt độ detector 270oC Chế độ bơm mẫu có lưu dòng, split ratio 1/60 Lưu lượng H2 40ml/min Lưu lượng dòng khí mang N2 400ml/min Nhiệt độ cột 180oC trong 2 phút, tăng 2,5oC /phút tới 205oC, tăng 3,5oC/phút tới 230oC, dừng 2 phút, tăng 5oC/phút tới 250oC Áp suất đầu vào của khí mang 14psi Bơm mẫu: Dùng syringe với tiêm kim đầu nhọn, bơm trực tiếp khoảng 2 microlit dẫn xuất methyl ester của các acid béo vào cột sắc kí khí qua bộ phận tiêm mẫu Có thể thay đổi chương trình nhiệt độ nhằm làm giảm bớt thời gian phân tích khi có các khoảng trống không có mũi. Trong quá trình phân tích phải giữ vận tốc truyền thẳng của khí mang khi qua cột là không đổi để mũi sắc kí nhọn và đối xứng. Thời gian phân tích mẫu là do chế độ nhiệt độ cài đặt, thông thường 30 phút. Để xác định vị trí các acid béo trên sắc kí đồ dùng phương pháp nội chuẩn là bổ sung một chất chuẩn có nồng độ biết trước ngay trong mẫu trước khi xử lí. Thường dùng acid có cacbon lẻ (C15: 0) hoặc acid không có trong mẫu. Để xác định trình tự có thể dùng hai mẫu chuẩn ở hai đầu. Nồng độ chất bổ sung phải gần nồng độ acid béo trong mẫu. Hay dùng phương pháp ngoại chuẩn, tức là dùng chất chuẩn xây dựng đường chuẩn. Khi đó phải có đủ chất chuẩn, thực hiện phải cùng điều kiện, lượng mẫu bơm vào phải cố định, đường chuẩn phải tuyến tính. Hệ số tương quan của đường chuẩn R2 phải gần bằng 1. Xử lí kết quả: Xem so sánh sắc kí đồ của chuẩn và mẫu. Dựa vào thời gian lưu của các peak chuẩn để xác định vị trí của các acid béo và thứ tự của các acid béo trên sắc kí đồ. So sánh diện tích peak và chiều cao peak của các acid trên sắc kí đồ của mẫu và các nồng độ chuẩn trong dung dịch hỗn hợp chuẩn. Lập đường chuẩn từ các nồng độ chuẩn. Công thức tính kết quả: Hàm lượng mỗi acid béo trong mẫu lipid phân tích được tính bằng tỷ lệ phần trăm theo công thức: Bi= Với Bi nồng độ acid béo i (%) SM diện tích của peak acid béo i trên sắc kí đồ của mẫu SC diện tích của peak acid béo i trên sắc kí đồ của chuẩn C nồng độ acid béo chuẩn i tính theo đường chuẩn tổng diện tích của các peak acid béo trên sắc kí đồ của mẫu.