Tài liệu Bài giảng Đại cương về sắc ký – Nguyễn Đức Tuấn: Đại Cương Về Sắc Ký
(Chromatography)
PGS.TS. Nguyễn Đức Tuấn
Bộ môn Hóa Phân Tích – Kiểm Nghiệm
Khoa Dược – Đại học Y Dược TPHCM
Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM
Đại Cương Về Sắc Ký
Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM
Mục tiêu
- Trình bày được định nghĩa sắc ký, các giai đoạn của quá trình
sắc ký, phân loại sắc ký, hai yếu tố chủ yếu quyết định quá trình
tách sắc ký, nguyên tắc của sắc ký hấp phụ, phân bố, trao đổi ion,
rây phân tử, ái lực
- Giải thích được ý nghĩa của các thông số sắc ký
- Ứng dụng được cách định tính, định lượng bằng phương pháp sắc ký
Đại Cương Về Sắc Ký
Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM
Dàn bài
- Lịch sử - Định nghĩa
- Quá trình sắc ký
- Phân loại các phương pháp sắc ký
- Sự tách sắc ký và sắc ký đồ
- Các thông số đặc trưng của sắc ký
- Ứng dụng của sắc ký
Lịch sử - Định nghĩa
...
57 trang |
Chia sẻ: Đình Chiến | Ngày: 13/07/2023 | Lượt xem: 192 | Lượt tải: 0
Bạn đang xem trước 20 trang mẫu tài liệu Bài giảng Đại cương về sắc ký – Nguyễn Đức Tuấn, để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
Ñaïi Cöông Veà Saéc Kyù
(Chromatography)
PGS.TS. Nguyeãn Ñöùc Tuaán
Boä moân Hoùa Phaân Tích – Kieåm Nghieäm
Khoa Döôïc – Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM
Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM
Ñaïi Cöông Veà Saéc Kyù
Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM
Muïc tieâu
- Trình baøy ñöôïc ñònh nghóa saéc kyù, caùc giai ñoaïn cuûa quaù trình
saéc kyù, phaân loaïi saéc kyù, hai yeáu toá chuû yeáu quyeát ñònh quaù trình
taùch saéc kyù, nguyeân taéc cuûa saéc kyù haáp phuï, phaân boá, trao ñoåi ion,
raây phaân töû, aùi löïc
- Giaûi thích ñöôïc yù nghóa cuûa caùc thoâng soá saéc kyù
- ÖÙng duïng ñöôïc caùch ñònh tính, ñònh löôïng baèng phöông phaùp saéc kyù
Ñaïi Cöông Veà Saéc Kyù
Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM
Daøn baøi
- Lòch söû - Ñònh nghóa
- Quaù trình saéc kyù
- Phaân loaïi caùc phöông phaùp saéc kyù
- Söï taùch saéc kyù vaø saéc kyù ñoà
- Caùc thoâng soá ñaëc tröng cuûa saéc kyù
- ÖÙng duïng cuûa saéc kyù
Lòch söû - Ñònh nghóa
Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM
Ether daàu hoûa
Saéc toá
TV
CaCO
3
Chlorophyl
Xanthophyl
t0 t1
1906: Mikhail Tswett – saéc kyù loûng
haáp phuï treân coät
1938: Izmailov & Schraiber – xaây
döïng phöông phaùp SKLM
1958: Stahl – hoaøn thieän phöông
phaùp SKLM
1941: Martin & Synge – ñaët neàn taûng
cho saéc kyù phaân boá: SKG vaø SKK
1952: Martin & James – baøi baùo ñaàu
tieân veà SKK
Cuoái naêm 1960: saéc kyù loûng cao aùp
ra ñôøi
1937 – 1972: 12 giaûi Nobel veà saéc kyù
Ñaàu naêm 2005: saéc kyù loûng sieâu aùp
2012: Sắc ký hội tu siêu hiệu năng
Lòch söû - Ñònh nghóa
Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM
Qui trình trong ñoù chaát tan ñöôïc taùch rieâng ra bôûi quaù trình dòch chuyeån
khaùc nhau veà ñoäng löïc hoïc cuûa chuùng trong moät heä thoáng hai hay nhieàu
pha. Moät trong caùc pha naøy chuyeån ñoäng moät caùch lieân tuïc theo moät höôùng
nhaát ñònh vaø trong pha naøy caùc chaát rieâng bieät theå hieän linh ñoä khaùc nhau laø
do coù söï khaùc nhau veà phaân boá, haáp phuï, ñieän tích, kích thöôùc phaân töû, ñoä
hoøa tan vaø aùp suaát hôi
Saéc kyù ñoøi hoûi hai pha:
Pha ñoäng: loûng, khí, loûng sieâu tôùi haïn
Pha tónh: coá ñònh trong coät hay treân beà maët chaát mang raén trô hoùa hoïc
Chaát raén hay chaát loûng ñöôïc taåm, haáp phuï hay lieân keát hoùa hoïc
chaát mang
Töông taùc vôùi chaát tan theo caùc cô cheá haáp phuï, phaân boá, trao ñoåi
ion, aùi löïc
Phöông phaùp saéc kyù ñöôïc aùp duïng trong caùc ngaønh khoa hoïc khaùc nhau
Ngaønh Döôïc: nghieân cöùu, phaân tích, kieåm nghieäm thuoác
A
B
Hôïp chaát B
Hôïp chaát A
SAÉC KYÙ LOÛNG HIEÄU NAÊNG CAO
Quaù trình saéc kyù
Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM
Ñöa hoãn hôïp leân pha tónh
Khai trieån saéc kyù
Saéc kyù khai trieån
Saéc kyù röûa giaûi:
Quaù trình röûa giaûi
Dung moâi röûa giaûi (eluent)
Dung dòch röûa giaûi (eluate)
Phaùt hieän caùc chaát
Maøu cuûa chaát
Ñeøn töû ngoaïi
Phun thuoác thöû
Ñaàu doø (detector)
Maãu
Trieån khai saéc kyù
x x x O
X
A
F
Phaân loaïi caùc phöông phaùp saéc kyù
Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM
Theo baûn chaát vaät lyù caùc pha
Teân kyõ thuaät Pha tónh Loaïi caân baèng
Saéc kyù loûng (liquid
chromatography): pha
ñoäng laø chaát loûng
- Chaát loûng ñöôïc haáp
phuï treân 1 chaát raén
(chaát mang)
- Pha lieân keát
- Chaát raén
- Phaân boá giöõa hai pha
loûng
- Phaân boá giöõa pha loûng vaø
beà maët pha lieân keát
- Haáp phuï
Saéc kyù khí (gas
chromatography, GC):
pha ñoäng laø chaát khí
- Chaát loûng ñöôïc haáp
phuï treân chaát raén
- Pha lieân keát
- Chaát raén
- Phaân boá giöõa pha khí vaø
pha loûng
- Phaân boá giöõa pha khí vaø
pha lieân keát
- Haáp phuï
Saéc kyù loûng sieâu tôùi
haïn (supercritical fluid
chromatography, SFC):
pha ñoäng laø chaát loûng
sieâu tôùi haïn
- Pha lieân keát - Phaân boá giöõa pha loûng
sieâu tôùi haïn vaø pha lieân keát
Phaân loaïi caùc phöông phaùp saéc kyù
Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM
Theo phöông caùch cho pha ñoäng đi qua pha tónh
Saéc kyù khai trieån
Saéc kyù röûa giaûi
Theo phöông caùch löu giöõ pha tónh
Saéc kyù coät
Saéc kyù lôùp moûng
Saéc kyù giaáy
Phaân loaïi caùc phöông phaùp saéc kyù
Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM
Theo baûn chaát cuûa quaù trình saéc kyù
Saéc kyù haáp phuï
Saéc kyù phaân boá
Saéc kyù trao ñoåi ion
Saéc kyù raây phaân töû
Saéc kyù aùi löïc
Sắc ký cặp ion
Phaân loaïi caùc phöông phaùp saéc kyù
Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM
Thoâng thöôøng
Saéc kyù coät (Column Chromatography, CC)
Saéc kyù giaáy (Paper Chromatography, PC)
Saéc kyù lôùp moûng (Thin Layer Chromatography, TLC)
Saéc kyù khí (Gas Chromatography, GC)
Saéc kyù loûng hieäu naêng cao (High Performance Liquid
Chromatography, HPLC)
Saéc kyù loûng sieâu “hieäu naêng” (Ultra Performance Liquid
Chromatography, UPLC), UHPLC hoặc UFLC (Ultra Fast
Liquid Chromatography)
Sắc ký hội tụ siêu “hiệu năng” (Ultra Performance
Convergence Chromatography, UPCC, UPC2)
Cô cheá taùch – Phaân boá
Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM
Chaát phaân tích
hoøa tan trong
pha tónh loûng
bao treân beà
maët chaát mang
raén trô
K
S1 (pha 1) S2 (pha 2)
K: heä soá phaân boá
1
][
2
][
S
S
K
Chaát
mang
raén
Pha
tónh
Chaát
phaân
tích
A
B
D
C
C
K KD: heä soá phaân boá
bieåu kieán
Cô cheá taùch – Haáp phuï
Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM
n: soá mol pha ñoäng bò thay theá töø beà maët
S
2
: phaân töû chaát tan trong pha ñoäng
S
1
: phaân töû chaát tan bò haáp phuï
M
2
: phaân töû pha ñoäng
M
1
: phaân töû pha ñoäng bò haáp phuï
: beà maët hoaït ñoäng cuûa pha tónh
S
2
+ nM
1
S
1
+ nM
2
n
n
MS
MS
K
]][[
]][[
12
21
- Pha ñoäng luoân chaïy theo moät chieàu nhaát ñònh neân luoân xaûy ra quaù trình
haáp phuï vaø phaûn haáp phuï
- Caùc chaát tan seõ bò keùo theo pha ñoäng vaø coù aùi löïc khaùc nhau vôùi pha tónh
Chaát tan haáp
phuï treân beà
maët pha tónh
Cô cheá taùch – Trao ñoåi ion
Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM
Pha tónh laø caùc chaát trao ñoåi ion. Goàm 2 loaïi:
Nhöïa trao ñoåi cation (cationit):
Cationit acid maïnh -SO
3
-
H
+
Cationit acid yeáu -COO
-
H
+
Nhöïa trao ñoåi anion (anionit):
Anionit base maïnh -N(CH
3
)
3
+
OH
-
Anionit base yeáu -NH
3
+
OH
-
Tieán trình trao ñoåi: (M
x+
vaø A
x-
: ion chaát tan)
Cation: xRSO
3
-
H
+
+ M
x+
(RSO
3
-
)
x
M
x+
+ xH
+
Anion: xRN(CH
3
)
3
+
OH
-
+ A
x-
[RN(CH
3
)
3
+
]
x
A
x-
+ xOH
-
- Pha ñoäng thöôøng laø caùc dung dòch ñeäm coù pH vaø chaát ñieän ly thích hôïp.
- Pha ñoäng coù theâm moät soá dung moâi höõu cô nhö MeOH, EtOH,ñeå laøm
taêng ñoä hoøa tan hay ñoä choïn loïc cho chaát tan caùc ion chaát tan caïnh
tranh treân maïng ion
Ion
phaân
tích
Ion traùi
daáu
Ionit
Ñieän tích
coá ñònh
Quaù trình trao ñoåi ion
Cô cheá taùch – Trao ñoåi ion
Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM
Sử dụng nhựa trao đổi ion để khử khoáng nước
Cô cheá taùch – Raây phaân töû
Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM
- ÔÛ traïng thaùi caân baèng: C
s
C
m
C
s,
C
m:
noàng ñoä chaát tan trong pha tónh vaø pha ñoäng
Heä soá K ñöôïc tính theo phöông trình:
sV
mVR
V
mC
sCK
Trong ñoù:
V
m:
toång theå tích cuûa pha ñoäng naèm trong caùc loã xoáp
cuûa caùc haït pha tónh
V
S
: theå tích dung moâi giöõa caùc loã
V
R:
theå tích bò löu giöõ cuûa chaát tan
- Saéc kyù raây phaân töû = Saéc kyù loïc qua gel = Saéc kyù thaåm thaáu gel.
- Duøng trong sinh hoùa ñeå taùch caùc protein, caùc carbohydrat,
Cô cheá taùch – Aùi löïc
Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM
- Môùi vaø coù tính choïn loïc cao
- Döïa vaøo töông taùc ñaëc hieäu giöõa moät
loaïi phaân töû chaát tan vôùi moät phaân töû thöù
hai lieân keát coäng hoùa trò vôùi pha tónh
Ví duï: phaân töû lieân keát coäng hoùa trò vôùi
pha tónh laø moät khaùng theå cuûa moät
protein. Khi cho hoãn hôïp goàm haøng ngaøn
protein qua coät, chæ coù moät pretein phaûn
öùng vôùi khaùng theå ñöôïc giöõ laïi treân coät,
caùc protein coøn laïi ñöôïc röûa khoûi coät.
Protein bò giöõ laïi treân coät seõ ñöôïc taùch ra
khoûi khaùng theå baèng caùch thay ñoåi pH
hay noàng ñoä ion trong pha ñoäng.
Saéc kyù aùi löïc
Moät phaân töû
töông taùc vôùi
phaân töû lieân keát
coäng hoùa trò vôùi
pha tónh
Caùc phaân töû
khaùc ñöôïc röûa
khoûi coät
Quaù trình taùch saéc kyù
Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM
Hai caùch
taùch hai chaát
xen phuû
Söï taùch saéc kyù vaø
saéc kyù ñoà
Noàng ñoä
chaát tan taïi
caùc daõi A vaø
B treân coät
A B
A B
t1 t2
Caùc thoâng soá ñaëc tröng trong saéc kyù
Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM
Ñeå taùch saéc kyù ñöôïc toát:
Toác ñoä di chuyeån cuûa caùc
chaát tan
Hieän töôïng giaõn pic
Pic heïp vaø caân ñoái
Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM
Sắc ký giấy và sắc ký lớp mỏng
Vò trí caùc veát treân saéc kyù ñoà coù theå xaùc ñònh nhôø chæ soá R
f
(Retardation factor)
R
d
d
v
V
f
R
M
0
===> 0 R
f
1
x x
dM
dR
1 2
Ñöôøng
dung
moâi
- R
f
= 0: chaát tan hoaøn toaøn khoâng di chuyeån, naèm
taïi ñieåm xuaát phaùt
- R
f
= 1: chaát tan di chuyeån cuøng vôùi vaän toác cuûa
dung moâi
- d
R
: khoaûng di chuyeån ñöôïc cuûa chaát caàn taùch
- d
M
: khoaûng di chuyeån ñöôïc cuûa dung moâi
- v: vaän toác di chuyeån cuûa chaát caàn taùch
- V
0
: vaän toác di chuyeån cuûa dung moâi
Toác ñoä di chuyeån cuûa caùc chaát
Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM
Saéc kyù khí vaø saéc kyù loûng hieäu naêng cao
Thôøi gian löu t
R
(phuùt): thôøi gian caàn thieát ñeå moät chaát di chuyeån töø nôi
tieâm maãu qua coät saéc kyù, tôùi detector vaø cho pic treân saéc kyù ñoà (tính töø
luùc tieâm ñeán luùc xuaát hieän ñænh cuûa pic).
t
M
(hoaëc t
o
): thôøi gian löu cuûa
moät chaát khoâng bò löu giöõ, coøn
goïi laø thôøi gian cheát cuûa coät.
t
R
caøng lôùn, chaát tan bò löu giöõ
caøng maïnh vaø toác ñoä di chuyeån
cuûa noù caøng nhoû.
Thôøi gian löu hieäu chænh t'
R
ñöôïc
tính theo coâng thöùc:
t'
R
= t
R
- t
M
(hay t'
R
= t
R
- t
o
)
Toác ñoä di chuyeån cuûa caùc chaát
Thể tích chết của cột (mL)
vM 0,5 x 10
-3 x L x d2
L: chiều dài cột (mm)
d: đường kính trong của cột (mm)
Maùy HPLC
Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM
1
2 3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13 14
15
16
17
detector
18
1. Nguoàn heli
2. Bình dung moâi
3. Ñaàu phun
4. Ñaàu loïc
5. Van tyû leä dung moâi
6. Bôm
7. Van kieåm tra vaøo
8. Van kieåm tra ra
9. Khöû xung
10. Ñaàu thaûi
11. Van xaû
12. Moài bôm
13. Loïc dung moâi
14. Ñieàu hoøa aùp suaát
ngöôïc
15. Chuyeån ñoåi aùp suaát
16. Van tieâm maãu
17. Coät baûo veä + coät
saéc kyù
18. Tôùi detector.
Toác ñoä di chuyeån cuûa caùc chaát
Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM
Thôøi gian löu
t’
R
= t
R
– t
M
Heä soá dung löôïng k’
t
R
= t
M
(1 + k’)
k’: baûn chaát caùc pha, chaát tan, nhieät ñoä, ñaëc ñieåm coät
2 < k’ < 10 (coù theå chaáp nhaän ñeán 1 < k’ < 20)
Heä soá choïn loïc =
B löu giöõ maïnh hôn A neân > 1
1,05 < < 2,00
K
K
k
k
t
t
B
A
B
A
R B
R A
'
'
'
'
,
,
Diện tích pic, chiều cao pic
Hình daïng pic – Söï baát ñoái cuûa pic
Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM
Ñöôøng cong phaân boá
chuaån Gaussian
AC
BC
AF Heä soá ñoái xứng (0,8 < AF < 1,5)
BC: nöûa chieàu roäng phía sau cuûa pic ñöôïc ño ôû
1/10 chieàu cao cuûa pic.
AC: nöûa chieàu roäng phía tröôùc cuûa pic ñöôïc ño ôû
1/10 chieàu cao cuûa pic.
Heä soá keùo ñuoâi (1/20 chieàu cao)
AC
BCAC
As
2
Hình daïng pic – Söï baát ñoái cuûa pic
Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM
AC
BC
AF Heä soá ñoái xứng (0,8 < AF < 1,5)
Hieäu löïc coät vaø soá ñóa lyù thuyeát biểu kiến
Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM
2
2/1
2
54,516
W
t
W
t
H
L
N RR
N: soá ñóa lyù thuyeát biểu kiến
H: chieàu cao ñóa lyù thuyeát
W: chieàu roäng cuûa pic ôû ñaùy pic
W
1/2
: chieàu roäng cuûa pic ño ôû nöõa chieàu cao
N toát khi N gaàn baèng N
max
pd
L
N 4000max
L: chieàu daøi coät (cm)
d
p
: ñöôøng kính haït pha tónh (m)
Hieäu löïc coät vaø soá ñóa lyù thuyeát biểu kiến
Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM
Saéc kyù ñoà minh hoïa caùch tính N
Söï giaõn pic (peak spreading) – môû roäng daûi (band broadening)
Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM
Hieän töôïng ñaëc bieät trong saéc kyù
Nghieân cöùu qua thuyeát veà ñóa vaø thuyeát ñoäng hoïc
Laø keát quaû di chuyeån nhanh chaäm khaùc nhau cuûa caùc phaân töû cuøng moät
chaát khi qua coät
Pic ra muoän tuø hôn pic ra sôùm
Coät saéc kyù toát (hieäu löïc cao) seõ cho pic nhoïn (ít bò giaõn)
Söï giaõn pic vaø lyù thuyeát ñoäng hoïc
Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM
Phöông trình Van Deemter
Cu
u
B
AH
a
b
c e
d
Khueách taùn xoaùy A
Khueách taùn doïc B
Chuyeån khoái C
Moái lieân quan cuûa H vôùi caùc yeáu toá ñoäng hoïc
trong quaù trình röûa giaûi:
Khueách taùn chaát tan khi di chuyeån trong coät
Thieát laäp caân baèng theo töông taùc: chaát tan
– pha ñoäng – pha tónh
Toác ñoä cuûa caùc quaù trình töông taùc dieãn ra
trong coät
Khắc phục A
- Hạt pha tĩnh nhỏ
- Cột mao quản được bao pha tỉnh ở bề mặt bên trong
Söï giaõn pic vaø lyù thuyeát ñoäng hoïc
Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM
Phöông trình Van Deemter
Cu
u
B
AH
Khuếch tán xoáy A
Söï giaõn pic vaø lyù thuyeát ñoäng hoïc
Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM
Phöông trình Van Deemter
Cu
u
B
AH
Khuếch tán dọc B
Khắc phục B
- Sử dụng cột sắc ký có đường kính nhỏ
(Cột mao quản)
Söï giaõn pic vaø lyù thuyeát ñoäng hoïc
Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM
Phöông trình Van Deemter Cu
u
B
AH Chuyển khối C
Khắc phục C
- Cột mao quản bao một lớp pha tĩnh mỏng và đều
- Chất mang bao một lớp pha tĩnh mỏng và đều
- Tăng nhiệt độ cột giảm độ nhớt pha động và
giảm quá trình chuyển khối
Pha tĩnh
Chất mang
Söï môû roäng daûi do caùc nguyeân nhaân khaùc
Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM
Doøng chaûy taàng
H
r u
D
ex
M
2
24
H
ex
: yeáu toá aûnh höôûng ñeán H do nguyeân
nhaân khaùc
r (cm): baùn kính caùc oáng noái caùc boä phaän
cuûa maùy HPLC
u: toác ñoä doøng cuûa pha ñoäng
D
M
: heä soá khueách taùn trong pha ñoäng
Aûnh höôûng cuûa toác ñoä doøng leân hieäu löïc coät
Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM
(a) saéc kyù loûng
Toác ñoä doøng (cm/s)
H
(mm)
(b) Saéc kyù khí - loûng
H
(mm)
Toác ñoä doøng (cm/s)
Aûnh höôûng cuûa kích thöôùc haït nhoài coät
Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM
C u
f d p d c u
D
uM
M
( , , )2 2
Toác ñoä doøng (cm/giaây)
Chieàu cao
ñóa lyù
thuyeát H
(mm)
Aûnh höôûng cuûa côõ maãu leân hieäu löïc coät
Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM
HETP (mm)
g maãu/g chaát nhoài coät
Coät Spherisorb ODS
Phaân boá k’ = 4,3
Phaân boá k’ = 2,3
Haáp phuï
Pha ñaûo k’ = 4,3
Pha ñaûo k’ = 2,2
Pha ñaûo k’ = 1,2
Phaân boá k’ = 1,0
Ñoä phaân giaûi
Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM
R
t t
W W
s
R B R A
A B
2 ( ) ( )
R
s
= 0,75: hai pic khoâng taùch toát, coøn xen
phuû nhau nhieàu.
R
s
= 1,0 : hai pic taùch khaù toát, coøn xen
phuû nhau 4%.
R
s
= 1,5 : hai pic taùch hoaøn toaøn (chæ
xen phuû 0,3%).
Moái lieân quan giöõa R
s
– t
R
– H vaø k’
Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM
Rs là hàm
số của
k’(1+k’)
Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM
Aûnh höôûng cuûa hieäu löïc coät leân ñoä phaân giaûi
t
t
a)
b)
t
t
a)
b)
Gia taêng hieäu löïc coät
Aûnh höôûng cuûa hieäu löïc coät
leân ñoä phaân giaûi trong tröôøng
hôïp heä soá choïn loïc khoâng ñoåi
(a) Hieäu löïc coät thaáp
(b) Hieäu löïc coät cao
Hieäu löïc coät cao vaø heä soá choïn loïc giaûm
(a) Hieäu löïc coät toái ña vôùi heä soá choïn loïc
thaáp
(b) Gia taêng heä soá choïn loïc vaø vaãn giöõ
hieäu löïc coät toái ña
Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM
Ñoä phaân giaûi
R
N k
k
s
B
B
4 1
'
'
Taêng R
s
:
- Taêng N: baèng caùch duøng coät daøi hôn (aùp suaát, thôøi gian vaø ñoä roäng cuûa
pic cuõng taêng theo) hoaëc pha tónh coù kích thöôùc haït nhoû hôn. Cuõng coù
theå giaûm toác ñoä doøng pha ñoäng.
- Taêng k'
B
: baèng caùch thay ñoåi thaønh phaàn pha ñoäng (saéc kyù loûng), nhieät
ñoä (saéc kyù khí). k’
B
taêng seõ taêng thôøi gian phaân tích. Ñeå dung hoøa R
s
vaø
thôøi gian röûa giaûi : 2 < k’
B
< 5.
- Taêng baèng caùch thay ñoåi loaïi pha tónh hoaëc thaønh phaàn pha ñoäng, keå
caû pH. Vieäc taêng coù aûnh höôûng maïnh ñeán R
s
.
Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM
Ñònh tính vaø thöû tinh khieát
SKG & SKLM
Vò trí caùc veát treân saéc kyù ñoà coù theå xaùc ñònh nhôø chæ soá R
f
(Retardation factor)
R
d
d
v
V
f
R
M
0
===> 0 R
f
1
x x
dM
dR
1 2
Ñöôøng
dung
moâi
- R
f
= 0: chaát tan hoaøn toaøn khoâng di chuyeån,
naèm taïi ñieåm xuaát phaùt
- R
f
= 1: chaát tan di chuyeån cuøng vôùi vaän toác cuûa
dung moâi
- d
R
: khoaûng di chuyeån ñöôïc cuûa chaát caàn taùch
- d
M
: khoaûng di chuyeån ñöôïc cuûa dung moâi
- v: vaän toác di chuyeån cuûa chaát caàn taùch
- V
0
: vaän toác di chuyeån cuûa dung moâi
ÖÙng duïng cuûa saéc kyù
Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM
- Söû duïng chaát ñoái chieáu
R X
R X
R A
OX
OF
OA
OF
OX
OA
s
f
f
( )
( )
( )
* Hai chaát gioáng nhau laàn löôït phaûi coù R
f
vaø
R
s
baèng nhau.
* Hai chaát phaûi coù cuøng löôïng chaám nhö nhau
vaø ñöôïc trieån khai trong cuøng ñieàu kieän saéc kyù
x x x O
X
A
F
Saéc kyù ñoà saéc
kyù ñoái chöùng
ÖÙng duïng cuûa saéc kyù
SKG & SKLM
Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM
Saéc kyù khí vaø saéc kyù loûng hieäu naêng cao
Thôøi gian löu t
R
(phuùt): thôøi gian caàn thieát ñeå moät chaát di chuyeån töø nôi
tieâm maãu qua coät saéc kyù, tôùi detector vaø cho peak treân saéc kyù ñoà (tính töø
luùc tieâm ñeán luùc xuaát hieän ñænh cuûa peak).
t
M
(hoaëc t
o
): thôøi gian löu cuûa
moät chaát khoâng bò löu giöõ, coøn
goïi laø thôøi gian cheát.
t
R
caøng lôùn, chaát tan bò löu giöõ
caøng maïnh vaø toác ñoä di chuyeån
cuûa noù caøng nhoû.
Thôøi gian löu hieäu chænh t'
R
ñöôïc
tính theo coâng thöùc:
t'
R
= t
R
- t
M
(hay t'
R
= t
R
- t
o
)
ÖÙng duïng cuûa saéc kyù
Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM
* Hai chaát gioáng nhau laàn löôït phaûi coù t
R
vaø t’
R
baèng nhau
* Hai chaát phaûi coù cuøng theå tích tieâm maãu nhö nhau vaø
ñöôïc trieån khai trong cuøng ñieàu kieän saéc kyù
Neáu treân truïc hoaønh cuûa saéc kyù ñoà söû duïng ñôn vò ño laø theå
tích dung moâi:
- theå tích löu V
R
- theå tích löu hieäu chænh V'
R
- theå tích cheát cuûa coät V
M
(theå tích roãng V
o
):
theå tích dung
moâi töø nôi tieâm trong coät ñeán detector
ÖÙng duïng cuûa saéc kyù
Saéc kyù khí vaø saéc kyù loûng hieäu naêng cao
Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM
ÖÙng duïng cuûa saéc kyù
Ñònh löôïng
Nguyeân taéc chung: döïa treân söï so saùnh chieàu cao hoaëc dieän tích cuûa
pic trong maãu thöû vôùi moät hay nhieàu maãu chuaån.
Pic heïp vaø ñoái xöùng: ño chieàu cao cuûa pic
Pic tuø hay leäch phöông: ño dieän tích cuûa pic
Phöông phaùp ñònh löôïng
Xaây döïng ñöôøng chuaån (chuaån ngoaïi nhieàu ñieåm)
So saùnh tröïc tieáp (chuaån ngoaïi 1 ñieåm)
Theâm chuaån
Noäi chuaån
Chuaån hoùa dieän tích
Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM
ÖÙng duïng cuûa saéc kyù
Duøng ñöôøng chuaån (chuaån ngoaïi nhieàu ñieåm)
Pha caùc dung dòch chuaån coù noàng ñoä khaùc nhau
Tieán haønh saéc kyù caùc maãu chuaån
Veõ ñöôøng chuaån ñoä bieåu dieãn söï phuï thuoäc chieàu cao hay dieän tích pic
theo noàng ñoä
Tieán haønh saéc kyù maãu thöû. Döïa vaøo ñöôøng chuaån suy ra noàng ñoä maãu
thöû
Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM
ÖÙng duïng cuûa saéc kyù
So saùnh tröïc tieáp (chuaån ngoaïi 1 ñieåm)
Phaân tích baèng chieàu cao cuûa pic:
h
o
: Chieàu cao pic chuaån, h
x
: Chieàu cao pic thöû
Phaân tích baèng dieän tích pic:
S
o
: Dieän tích pic cuûa chuaån, S
x
: Dieän tích pic cuûa thöû
C C
h
h
x o
x
o
C C
S
S
x o
x
o
C
0
vaø C
x
caøng gaàn nhau keát quaû caøng chính xaùc
Phương pháp nội chuẩn
Kết quả phân tích không lặp lại khi áp dụng phương pháp ngoại chuẩn (xử
lý mẫu qua nhiều giai đoạn, hàm lượng chất phân tích thấp hay thể tích tiêm
mẫu không lặp lại)
Nguyên tắc
Thêm cùng hàm lượng một chất chuẩn khác (chuẩn nội) với chất cần
định lượng vào mẫu thử và chuẩn
Mẫu phân tích gồm nhiều chất: chọn một trong các chất làm chuẩn nội
Tỷ số diện tích pic của chất phân tích và chuẩn nội là thông số được sử
dụng để xây dựng đường chuẩn (S/SIS, C)
Yêu cầu của chuẩn nội
Pic của chuẩn nội phải tách khỏi pic của các thành phần khác
tR của chuẩn nội phải gần với tR của chất phân tích
Nồng độ chuẩn nội thêm vào gần bằng nồng độ chất phân tích
Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM
Phương pháp định lượng bằng HPLC
Phương pháp nội chuẩn
Độ nhạy phát hiện của chuẩn nội và chất phân tích thường khác nhau
Xác định yếu tố hiệu chỉnh Fs của chuẩn nội và chất phân tích
Sử dụng dung dịch chuẩn tinh khiết
F
S C
S C
s
i s
s i
Nồng độ Cx của mẫu thử có diện tích đỉnh Sx
C
S
S
C Fx
x
i
i s
- Cs: nồng độ của dung dịch chuẩn ngoại
- Ci: nồng độ của dung dịch chuẩn nội
- Ss: diện tích đỉnh của chuẩn ngoại
- Si: diện tích đỉnh của chuẩn nội
Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM
Phương pháp định lượng bằng HPLC
Phương pháp thêm chuẩn
Thêm một lượng xác định chất chuẩn vào dung dịch mẫu thử
Nồng độ Cx của mẫu thử có diện tích pic là Sx
Thêm C vào làm tăng S
Áp dụng khi có ảnh hưởng của chất phụ
C S
C
S
x x
Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM
Phương pháp định lượng bằng HPLC
Phương pháp qui về 100% diện tích pic
Hay áp dụng để xác định độ tinh khiết của hoạt chất
Yêu cầu
Mọi cấu tử trong hỗn hợp cần phân tích đều phải được rửa giải, phát
hiện và tách hoàn toàn
Sự đáp ứng của đầu dò trên các cấu tử là như nhau
zyx
x
AAA
A
X
100
%
- % X: giá trị % của cấu tử X trong hỗn hợp X, Y, Z
- Ax, Ay, Az: diện tích pic của cấu tử X, Y, Z
Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM
Phương pháp định lượng bằng HPLC
Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM
Ứng dụng HPLC trong KN dược liệu và HCTN
Định lượng dược liệu và HCTN – Không có chất chuẩn
Áp dụng phương pháp qui về 100% diện tích (xác định độ tinh khiết sắc ký)
Yêu cầu: tất cả các chất trong mẫu thử đều phải được tách và phát hiện
Giả định: mỗi chất trong hỗn hợp tiêm vào máy HPLC cho 1 pic duy nhất
Khối lượng của chất trong mỗi pic được tìm thấy
[S1/(S1 + S2 + + Sn)] x M
M: tổng khối lượng chất tan trong mẫu tiêm
Ứng dụng rất hạn chế khi định lượng đa thành phần
Có thể áp dụng để định lượng gần đúng các HCTN có độ tinh khiết cao
Pic dung môi và pic chính tương ứng với chất phân tích
Tỷ lệ % của diện tích pic cho biết hàm lượng tương đối của chất
Nên sử dụng pha động làm dung môi pha mẫu thử
Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM
Ứng dụng HPLC trong KN dược liệu và HCTN
Kiểm tra độ tinh khiết ginsenosid-Rg1 trước và sau khi tinh chế
Cột Supelcosil LC-18 (250 x 4,6 mm; 5 µm); Pha động: MeOH – H2O (60:40);
F = 0,9 ml/phút; Đầu dò PDA: 203 nm
Xác định độ tinh khiết
Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi lên độ phân giải
30%
MeOH
40%
MeOH
50%
MeOH
60% MeOH
70% MeOH
Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM
Ảnh hưởng của dung môi lên độ phân giải
50% MeOH
50% H2O
32% THF
68% H2O
25% THF
17% MeOH
58% H2O
Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM
Ảnh hưởng của pha tĩnh lên độ phân giải
Cột C18
Cột cyano
Cột phenyl
A. cortison; B. dexamethason; C. corticosteron; D. orthonitrophenol;
E. flourobenzen. Bước sóng phát hiện: 254 nm
Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM
Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM
ÖÙng duïng cuûa saéc kyù
Phương pháp nội chuẩn
1. Methyl parathion
2. Ciodrin
3. Parathion
4. Dyfonat
5. Diazinon
6. EPN
7. Ronnel
8. Trithion (nội chuẩn)
Thuốc bảo vệ thực vật lân hữu cơ
Phương pháp chuẩn hóa
diện tích pic
Các dẫn chất nitro benzen
Các file đính kèm theo tài liệu này:
- bai_giang_dai_cuong_ve_sac_ky_nguyen_duc_tuan.pdf