Ảnh hưởng của nồng độ sodium alginate, nồng độ môi trường và sucrose lên lưu trữ chồi in vitro của 2 giống lan dendrobium bằng kỹ thuật hạt nhân tạo

AGU International Journal of Sciences – 2019, Vol. 23 (2), 72 - 80 72 ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ SODIUM ALGINATE, NỒNG ĐỘ MÔI TRƯỜNG VÀ SUCROSE LÊN LƯU TRỮ CHỒI IN VITRO CỦA 2 GIỐNG LAN DENDROBIUM BẰNG KỸ THUẬT HẠT NHÂN TẠO Lê Thị Thúy1, Phạm Văn Lộc1, Trịnh Thị Hương1, Trần Thị Anh Thoa1, Trần Thị Cẩm Hường1, Trần Diễm Trinh1 1Trường Đại học Công nghệ Thực Phẩm TP Hồ Chí Minh Thông tin chung: Ngày nhận bài: 25/07/2018 Ngày nhận kết quả bình duyệt: 15/10/2018 Ngày chấp nhận đăng: 08/2019 Title: Effects of sodium alginate, medium and sucrose concentration on short term storage of In vitro shoot of two Dendrobium orchid species by artificial seed technique Keywords: Artificial seed, Dendrobium lituiflorum Lindl., Dendrobium polyanthum Wall. Ex Lindl., in vitro, preservation Từ khóa: Dendrobium lituiflorum Lindl., Dendrobium polyanthum Wall. Ex Lindl., in vitro, lan, hạt nhân tạo ABSTRACT Orchid flowers are favored in both spiritual and economic values. Among them, there are Dendrobium lituiflorum Lindl. and Dendrobium polyanthum Wall. Ex Lindl. that are beautiful and precious flowers. At present, the preservation of in vitro orchids is concerned. Artificial seed technique considered as an effective solution for short term storage of these valuable species. In this study, artificial seeds were produced in vitro by encapsulation of shoot with different concentration of sodium alginate (SA) solution and 100 mM calcium chloride solution. The result of this study indicated that the 40 g/l SA matrix, ½ Murashige and Skoog medium (MS) and no sugar were suitable for storage of in vitro shoot of Dendrobium lituiflorum Lindl. While, artificial seed with 50 g/l SA matrix, ¼ MS and no sugar were suitable for preservation of in vitro shoot of Dendrobium polyanthum Wall. Ex Lindl. Shoots in artificial seeds were transplanted into the regenerating medium, indicating that the shoots were normal and the survival rate of shoots were 100% after 28 days. TÓM TẮT Hiện nay, việc bảo quản các giống lan in vitro là vấn đề đang được quan tâm. Trong nghiên cứu này, sử dụng kỹ thuật hạt nhân tạo để bảo quản chồi in vitro của 2 giống lan hoàng thảo Dendrobium polyanthum Wall. Ex Lindl. và Dendrobium lituiflorum Lindl. là 2 loại lan rừng quý hiếm, cho hoa bền và đẹp. Để tạo hạt nhân tạo, chồi của 2 giống lan được bọc trong dung dịch sodium alginate (SA) nhờ quá trình trao đổi ion giữa SA và CaCl2. Kết quả nghiên cứu cho thấy, nồng độ SA 40 g/l bổ sung môi trường ½ MS và không bổ sung đường sucrose là thích hợp cho việc bảo quản chồi của giống lan Dendrobium lituiflorum Lindl. với tỷ lệ chồi sống và không nảy mầm bật ra khỏi hạt là 76,67% sau 42 ngày bảo quản. Trong khi đó, nồng độ SA 50 g/l bổ sung ¼ MS và không bổ sung đường sucrose thích hợp cho việc bảo quản chồi Dendrobium polyanthum Wall. Ex Lindl. với tỷ lệ chồi sống và không nảy mầm bật ra khỏi hạt là 80% sau 56 ngày bảo quản. Chồi của 2 giống lan trên sau thời gian bảo quản được cấy sang môi trường tái sinh cho thấy các chồi đều phát triển bình thường, tỷ lệ chồi tái sinh là 100% sau 28 ngày theo dõi. AGU International Journal of Sciences – 2019, Vol. 23 (2), 72 - 80 73 1. GIỚI THIỆU Lan là một trong những loài hoa được yêu thích vì màu sắc và kiểu dáng sang trọng, trang nhã. Ở Việt Nam, Dendrobium có đến 100 loài, được phân biệt bằng thân, lá và hoa. Dendrobium lituiflorum Lindl. (D.lituiflorum Lindl.) và Dendrobium polyanthum Wall. Ex Lindl. (D.polyanthum Wall. Ex Lindl.) là 2 loài lan rừng Việt Nam thuộc chi Dendrobium cho hoa đẹp, màu sắc hoa phong phú, hoa có hương thơm và lâu tàn. Trên thực tế, khi vi nhân giống các loài lan này trở nên phổ biến thì việc bảo quản chồi in vitro lan gặp nhiều khó khăn do chồi có thời gian bảo quản ngắn, chiếm nhiều diện tích và dễ tổn thương trong quá trình vận chuyển (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2006). Chồi in vitro phải được cấy chuyền nhiều lần trong quá trình bảo quản dẫn đến thoái hóa và thất thoát giống. Trước tình hình đó, những nỗ lực tìm kiếm phương pháp bảo quản giống không ngừng tăng lên và một trong những phương pháp đó là tạo hạt nhân tạo. Hạt nhân tạo là một dạng hạt mô phỏng hạt tự nhiên, trong điều kiện tối ưu thì hạt sẽ nảy mầm khỏi lớp vỏ nhân tạo, hoặc sẽ chuyển sang trạng thái ngừng sinh trưởng cho đến khi gặp điều kiện thuận lợi (Dương Tấn Nhựt, 2011). Trên thế giới, nhiều nghiên cứu tạo hạt nhân tạo để bảo quản PLBs của các loài lan khác nhau đã thực hiện và cho kết quả khả quan như lan Dendrobium Shavin White (Bustam và cs., 2012), Aranda x Vanda coerulea (Mohanty và cs., 2013), Cymbidium bicolor Lindl. (Mahendran, 2014). Tại Việt Nam, những nghiên cứu về bảo quản các vật liệu thực vật in vitro bằng kỹ thuật hạt nhân tạo còn rất hạn chế và hiện nay chưa có nghiên cứu nào công bố về việc bảo quản chồi lan Dendrobium bằng kỹ thuật hạt nhân tạo. Trong nghiên cứu này, trình bày kết quả ảnh hưởng của nồng độ sodium alginate, thành phần môi trường và nồng độ đường sucrose lên lưu trữ chồi in vitro của 2 giống lan Dendrobium bằng kỹ thuật hạt nhân tạo; từ đó tìm ra nồng độ thích hợp của 3 yếu tố trên đã làm chậm sinh trưởng của chồi lan, tăng thời gian bảo quản và làm tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo. 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu Mẫu chồi lan D.lituiflorum Lindl. 45 ngày tuổi được tái sinh từ PLBs in vitro nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung 15% nước dừa, 0,5 mg/l BA, 0,5 g/l than hoạt tính, 8 g/l agar và 30 g/l đường sucrose. Mẫu chồi lan D.polyanthum Wall. Ex Lindl. 30 ngày tuổi, tái sinh từ PLBs in vitro nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung 15% nước dừa, 1 mg/l BA, 30 g/1 đường, 8 g/l agar và 0,5 g/l than hoạt tính. Điều kiện nuôi cấy chồi: Chiếu sáng 16 giờ/ngày, cường độ chiếu sáng 2500 lux ± 500 lux, nhiệt độ: 25 oC ± 2 oC. 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Chuẩn bị các loại môi trường Dung dịch vỏ hạt: Pha 100 ml môi trường có bột sodium alginate (SA) với các nồng độ 30 g/l, 40 g/l, 50 g/l, khoáng MS (không có ion Ca2+) có nồng độ khác nhau gồm MS, ½ MS, ¼ MS và nước cất, bổ sung đường sucrose với các nồng độ từ 0 g/l – 50 g/l. Đun cách thủy hỗn hợp trên cho đến khi SA tan hoàn toàn. Dung dịch CaCl2.2H2O 100 mM: Cân 1,47 g CaCl2.2H2O và hòa tan trong 100 ml nước cất (Trần Thị Ngọc Lan và cộng sự, 2011). Tất cả các dung dịch được hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút. Quy trình tạo hạt: Cụm chồi in vitro của 2 giống lan Dendrobium trên được tách thành từng chồi riêng lẻ, cho chồi vào dung dịch vỏ hạt. Sử dụng ống nhỏ giọt để hút hỗn hợp gồm chồi và dung dịch vỏ hạt, nhỏ thành giọt vào dung dịch CaCl2.2H2O 100 mM. Sau 30 phút các hạt nhân AGU International Journal of Sciences – 2019, Vol. 23 (2), 72 - 80 74 tạo có kích thước 0,5 cm – 0,6 cm được tạo thành và được rửa lại 3 lần bằng nước cất vô trùng. Môi trường sinh trưởng của chồi lan: Môi trường khoáng MS bổ sung 30 g/l đường và 8 g/l agar. 2.2.2 Các thí nghiệm Ảnh hưởng của nồng độ sodium alginate đến bảo quản chồi lan: Môi trường tạo vỏ hạt với sự thay đổi nồng độ SA ở 30 g/l, 40 g/l và 50 g/l, được bổ sung môi trường MS không có ion Ca2+ và 30 g/l đường sucrose. Sau khi tạo hạt nhân tạo theo quy trình đã mô tả, hạt được bảo quản trong chai thủy tinh trắng, không chứa dung dịch bảo quản. Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên gồm 3 nghiệm thức với 3 lần lặp lại, mỗi lần 10 hạt nhân tạo. Sau mỗi 14 ngày bảo quản, quan sát tỉ lệ chồi sống và không nảy mầm bật ra khỏi hạt (%). Thí nghiệm kết thúc khi tỷ lệ hạt sống và không nảy mầm bật ra khỏi hạt gần bằng 50%, cấy hạt sang môi trường tái sinh và quan sát tỷ lệ chồi tái sinh, phát triển bình thường (%) sau 28 ngày. Ảnh hưởng của môi trường khoáng trong vỏ hạt nhân tạo đến sự bảo quản chồi lan Môi trường tạo vỏ hạt có nồng độ SA tốt nhất của thí nghiệm 1, môi trường khoáng có nồng độ thay đổi gồm MS, ½ MS, ¼ MS, nước cất (không bổ sung môi trường khoáng) và 30 g/l đường sucrose. Sau khi tạo hạt nhân tạo theo quy trình đã mô tả, hạt được bảo quản trong chai thủy tinh trắng, không chứa dung dịch bảo quản. Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên gồm 4 nghiệm thức với 3 lần lặp lại, mỗi lần 10 hạt nhân tạo. Sau mỗi 14 ngày bảo quản, quan sát tỉ lệ chồi sống và không nảy mầm bật ra khỏi hạt (%). Thí nghiệm kết thúc khi tỷ lệ chồi sống và không nảy mầm bật ra khỏi hạt gần bằng 50%, cấy hạt sang môi trường tái sinh và quan sát tỷ lệ chồi tái sinh và phát triển bình thường (%) sau 28 ngày. Ảnh hưởng của nồng độ đường trong vỏ hạt nhân tạo đến sự bảo quản chồi Môi trường tạo vỏ hạt là môi trường gồm có SA ở nồng độ tốt nhất của thí nghiệm 1, môi trường khoáng tốt nhất của thí nghiệm 2 và bổ sung đường sucrose với nồng độ thay đổi từ 0 g/l đến 50 g/l. Sau khi tạo hạt nhân tạo theo quy trình đã mô tả, hạt được bảo quản trong chai thủy tinh trắng, không chứa dung dịch bảo quản. Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên gồm 6 nghiệm thức với 3 lần lặp lại, mỗi lần 10 hạt nhân tạo. Sau mỗi 14 ngày bảo quản, quan sát tỉ lệ chồi sống và không nảy mầm bật ra khỏi hạt (%). Thí nghiệm kết thúc khi tỷ lệ chồi sống và không nảy mầm bật ra khỏi hạt gần bằng 50%, cấy hạt sang môi trường tái sinh và quan sát tỷ lệ chồi tái sinh và phát triển bình thường (%) sau 28 ngày. 2.2.3 Điều kiện thí nghiệm Thí nghiệm được thực hiện tại phòng Thí nghiệm công nghệ sinh học thực vật trường Đại học công nghiệp Thực phẩm TP Hồ Chí Minh với điều kiện: Chiếu sáng 16 giờ/ngày, cường độ chiếu sáng 2500 lux ± 500 lux, nhiệt độ: 25 oC ± 2 oC. 2.2.4 Xử lý số liệu Tất cả các thí nghiệm được lặp lại 3 lần, ghi nhận số liệu và xử lý thống kê bằng phần mềm Statgraphics Centurion XV. Sự sai biệt có ý nghĩa ở mức p ≤ 0,05. 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Ảnh hưởng của nồng độ SA lên bảo quản chồi của 2 giống lan Dendrobium lituiflorum Lindl., Dendrobium polyanthum Wall. Ex Lindl. Đã có nhiều nghiên cứu về hạt nhân tạo trên nhiều đối tượng khác nhau và chứng minh rằng nồng độ SA có ảnh hưởng đến sự hình thành hạt, khả năng nảy mầm và thời gian bảo quản hạt nhân tạo. Khi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nồng độ SA đến sự hình thành hạt và bảo quản chồi lan D.lituiflorum Lindl. và D.polyanthum Wall. Ex Lindl., thu được kết quả như bảng 1 và hình 1. AGU International Journal of Sciences – 2019, Vol. 23 (2), 72 - 80 75 Bảng 1. Tỷ lệ chồi sống – không bật ra khỏi hạt và tỷ lệ chồi tái sinh của lan D. lituiflorum Lindl. và D.polyanthum Wall. Ex Lindl. Nồng độ SA (g/l) Tỷ lệ chồi sống – không bật ra khỏi hạt của lan D. lituiflorum Lindl. (%) Tỷ lệ chồi sống – không bật ra khỏi hạt của lan D.polyanthum Wall. Ex Lindl. (%) Tỷ lệ chồi tái sinh (%) 14 ngày 28 ngày 35 ngày 14 ngày 28 ngày 35 ngày 30 83,33a 50,00a 36,67a 33,33a 0,00 a - 100 40 100,00b 63,33b 50,00b 73,33b 53,33ab 43,33a 100 50 96,67 b 46,67a 33,33a 76,67b 60,00b 56,67b 100 Các chữ cái a,b,c,... thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức tin cậy p ≤ 0,05 trong phép thử Duncan Hình thái hạt ở các nồng độ SA 30 g/l, 40 g/l, 50 g/l đều cho hạt tròn đều, bao bọc được chồi, ở nồng độ 30 g/l, 40 g/l có độ cứng vừa phải, chỉ có ở nồng độ 50 g/l là có vỏ hạt hơi cứng. Trên cả 2 giống lan, ở nồng độ SA 30 g/l cho thấy chồi trong hạt nhân tạo phát triển mạnh và bật ra khỏi hạt nhiều hơn so với các nghiệm thức khác. Điều này cho thấy nồng độ SA này không có ý nghĩa trong bảo quản chồi của 2 giống lan nêu trên. Khi nồng độ SA tăng lên 40 g/l và 50 g/l, thời gian bảo quản chồi trong hạt tăng lên. Đối với lan D.lituiflorum Lindl., nồng độ SA 40 g/l cho thời gian bảo quản cao nhất là 35 ngày với tỷ lệ hạt sống và chồi không nảy mầm bật ra khỏi hạt là 50%. Khi nồng độ SA tăng lên 50 g/l thì chồi trong hạt chết dần, do đó tỷ lệ hạt sống của nghiệm thức này giảm xuống. Đối với lan D.polyanthum Wall. Ex Lindl. thì nồng độ SA trong vỏ hạt là 50 g/l cho tỷ lệ chồi sống và chồi không nảy mầm bật ra khỏi hạt cao nhất. Kết quả này phù hợp với một số nghiên cứu trên các đối tượng như: loài Agave vera-cruz Mill của Tejavathi và cộng sự (2006), Địa lan (Cymbidium Madrit “Foest King”) của Trần Thị Ngọc Lan và cs. (2011), lan Hồ điệp (Phalaenopsis amabilis) của Dương Tấn Nhựt và cs. (2007), ở các nghiên cứu này kết quả cũng cho thấy với nồng độ SA càng cao đã ngăn cản sự phát triển và làm giảm sự nảy mầm của hạt. Sau thời gian bảo quản trong hạt, chồi của 2 giống lan được cấy sang môi trường tái sinh, kết quả cho thấy tỷ lệ chồi sống, tái sinh là 100% và sinh trưởng bình thường sau 28 ngày theo dõi, điều này chứng tỏ nồng SA 40 g/l và 50 g/l không ảnh hưởng lên sức sống của chồi sau thời gian bảo quản. AGU International Journal of Sciences – 2019, Vol. 23 (2), 72 - 80 76 Hình 1. Hạt nhân tạo của lan D. polyanthum Wall. Ex Lindl. và D.lituiflorum Lindl.; A1, A2, A3 lần lượt là hình hạt nhân tạo bảo quản chồi lan D.polyanthum Wall. Ex Lindl. ở nồng độ SA 50 g/l lúc mới tạo, sau thời gian bảo quản 35 ngày và chồi nảy mầm bật ra khỏi hạt; A4: chồi lan D. polyanthum Wall. Ex Lindl. trên môi trường tái sinh sau 28 ngày; A5, A6, A7 lần lượt là hình hạt nhân tạo bảo quản chồi lan D.lituiflorum Lindl. ở nồng độ SA 40 g/l lúc mới tạo, sau thời gian bảo quản 35 ngày và chồi nảy mầm bật ra khỏi hạt; A8: chồi lan D.lituiflorum Lindl. trên môi trường tái sinh sau 28 ngày. 3.2 Ảnh hưởng của môi trường vỏ hạt lên bảo quản chồi lan D.lituiflorum Lindl. và D.polyanthum Wall. Ex Lindl. Môi trường sử dụng để tạo vỏ hạt nhân tạo là môi trường MS và MS giảm dần khoáng đa lượng và vi lượng như ½ MS, ¼ MS và nước cất. Kết quả thể hiện ở bảng 2 và hình 2: Bảng 2. Tỷ lệ chồi sống – không bật ra khỏi hạt và tỷ lệ chồi tái sinh của lan D. lituiflorum Lindl. và D.polyanthum Wall. Ex Lindl. Môi trường Tỷ lệ chồi sống – không bật ra khỏi hạt của chồi lan D. lituiflorum Lindl. (%) Tỷ lệ chồi sống – không bật ra khỏi hạt của chồi lan D.polyanthum Wall. Ex Lindl.(%) Tỷ lệ chồi tái sinh (%) 14 ngày 28 ngày 42 ngày 14 ngày 28 ngày 42 ngày MS 100a 53,33a 40,00bc 93,33a 60a 43,33a 100 ½ MS 100a 76,67b 46,67c 100b 76,67b 50,00ab 100 ¼ MS 100a 73,33b 36,67b 100b 83,33b 63,33c 100 Nước cất 100a 46,67a 0,00a 90a 76,67b 60bc 100 Các chữ cái a,b,c,... thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức tin cậy p ≤ 0,05 trong phép thử Duncan A5 A2 A3 A1 A7 A6 A4 A8 AGU International Journal of Sciences – 2019, Vol. 23 (2), 72 - 80 77 Hình 2. Hạt nhân tạo của lan; B1, B2, B3 lần lượt là hình chồi lan D.polyanthum Wall. Ex Lindl. trong hạt nhân tạo bổ sung khoáng ¼ MS sau thời gian bảo quản 42 ngày, chồi nảy mầm bật ra khỏi hạt và chồi trên môi trường tái sinh sau 28 ngày; B4, B5, B6 lần lượt là là hình chồi lan D. lituiflorum Lindl. trong hạt nhân tạo bổ sung khoáng ½ MS sau thời gian bảo quản 42 ngày, chồi nảy mầm bật ra khỏi hạt và chồi trên môi trường tái sinh sau 28 ngày. Đối với lan D.lituiflorum Lindl., vỏ hạt nhân tạo với môi trường MS và ½ MS cho kết quả tốt hơn so với môi trường ¼ MS và môi trường không bổ sung khoáng (nước cất) với tỷ lệ hạt sống sót và không có chồi nảy mầm bật ra khỏi hạt lần lượt là 40% và 46,67%. Môi trường ¼ MS và nước cất là môi trường ít chất dinh dưỡng, không có khả năng cung cấp đủ dinh dưỡng để duy trì sự sống cho chồi lan. Đối với lan D.polyanthum Wall. Ex Lindl. có sự tăng dần thời gian bảo quản khi nồng độ khoáng trong môi trường vỏ hạt giảm dần. Sau 42 ngày, chồi được bảo quản trong môi trường khoáng ¼ MS có tỷ lệ chồi sống và không nảy mầm ra khỏi hạt là cao nhất 63,33%. Môi trường không bổ sung khoáng sau 35 ngày bảo quản thì nhiều chồi ở trong hạt đã dần chuyển màu, đến ngày 42 chồi bắt đầu chết. Điều này cho thấy giảm nồng độ khoáng trong môi trường vỏ hạt có ý nghĩa trong bảo quản. Tuy nhiên, chỉ giảm tới nồng độ nhất định vì khoáng cũng là một yếu tố không thể thiếu cho sự sống sót của chồi ở trong vỏ hạt nhân tạo. Gantait và cộng sự (2012), cũng nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ khoáng lên bảo quản lan Aranda Wan Chark Kuan ‘Blue’ x Vanda coerulea Grifft. Ex Lindl., cho thấy môi trường vỏ hạt bổ sung nồng độ khoáng giảm dưới ½ MS cũng đã làm giảm khả năng nảy mầm của hạt nhân tạo. Schnapp và Preece (1986) chứng minh việc giảm hàm lượng khoáng MS làm giảm sinh trưởng cây cà chua và cẩm chướng. Bonnier và Van Tuyl (1997) cũng đã bảo quản bốn loài lily bằng cách giảm hàm lượng khoáng trong môi trường nuôi cấy. 3.3 Ảnh hưởng của nồng độ đường trong vỏ hạt lên bảo quản chồi lan D.lituiflorum Lindl. và D.polyanthum Wall. Ex Lindl. Đã có nhiều tác giả hướng đến việc kích thích trạng thái ngủ của vật liệu trong hạt bằng cách xử lý với nồng độ đường sucrose cao hoặc môi trường không bổ sung đường để ức chế sự tăng trưởng của vật liệu. Trong thí nghiệm này, các nồng độ đường khác nhau được bổ sung vào môi trường vỏ hạt nhằm khảo sát sự ảnh hưởng của đường đến quá trình bảo quản hạt và thu được kết quả như bảng 3 và hình 3. B1 B2 B3 B4 B5 B6 AGU International Journal of Sciences – 2019, Vol. 23 (2), 72 - 80 78 Bảng 3. Tỷ lệ chồi sống – không bật ra khỏi hạt và tỷ lệ chồi tái sinh của lan D.lituiflorum Lindl. và D.polyanthum Wall. Ex Lindl Nồng độ đường (g/l) Tỷ lệ chồi sống – không bật ra khỏi hạt của chồi lan D. lituiflorum Lindl. (%) Tỷ lệ chồi sống – không bật ra khỏi hạt của chồi lan D.polyanthum Wall. Ex Lindl. (%) Tỷ lệ chồi tái sinh (%) 14 ngày 28 ngày 42 ngày 14 Ngày 28 ngày 42 ngày 56 ngày 0 100a 90,00b 76,67b 100b 100c 93,33e 83,33c 100 10 100a 86,67b 53,33a 96,67b 90,00bc 73,33cd 50,00ab 100 20 100a 86,67b 50,00a 83,33a 56,67a 43,33a - 100 30 100a 76,67a 46,67a 100b 83,33b 60,00b - 100 40 100a 93,33b 70,00b 100b 90,00bc 63,33bc 40,00a 100 50 100a 93,33b 73,33b 100b 93,33bc 76,67d 53,33b 100 Các chữ cái a,b,c,... thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức tin cậy p ≤ 0,05 trong phép thử Duncan Theo Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên (2006) cho rằng khi giảm nồng độ đường xuống thì tốc độ tăng trưởng của mẫu thực vật sẽ giảm. Khi nồng độ đường tăng gây ra áp lực thẩm thấu có thể kích thích các chồi chuyển sang trạng thái ngủ. Chính vì vậy, thời gian bảo quản hạt được kéo dài. Đối với lan D.lituiflorum Lindl., các nồng độ đường 0 g/l, 40 g/l và 50 g/l cho kết quả tốt hơn các nồng độ đường còn lại. Tuy nhiên, chồi ở nồng độ đường 50 g/l có dấu hiệu vàng và yếu. Đối với lan D.polyanthum Wall. Ex Lindl. cũng cho kết quả tương tự. Trong thí nghiệm này trên cả 2 giống lan, môi trường không bổ sung đường cho thời gian bảo quản dài nhất với tỷ lệ chồi sống và không bật ra khỏi hạt cao nhất. Chồi trên môi trường tái sinh sau thời gian bảo quản vẫn có khả năng phục hồi và phát triển bình thường. Janeiro và cs. (1997) cũng đã chỉ ra rằng, hạt nhân tạo không chứa sucrose trong lớp vỏ hạt cho tỷ lệ nảy mầm thấp hơn so với những phôi được bọc trong vỏ hạt có bổ sung thêm đường. Điều này rất có ý nghĩa trong việc bảo quản hạt nhân tạo. AGU International Journal of Sciences – 2019, Vol. 23 (2), 72 - 80 79 Hình 3. Hạt nhân tạo của lan; C1, C2, C3 lần lượt là hình chồi lan D.polyanthum Wall. Ex Lindl. trong hạt nhân tạo không bổ sung đường sau thời gian bảo quản 56 ngày, chồi nảy mầm bật ra khỏi hạt và chồi trên môi trường tái sinh sau 28 ngày; C4, C5 lần lượt là là hình chồi lan D.lituiflorum Lindl. trong hạt nhân tạo không bổ sung đường sau thời gian bảo quản 42 ngày và chồi nảy mầm bật ra khỏi hạt. 4. KẾT LUẬN Hạt nhân tạo với lớp vỏ được tạo từ 40 g/l sodium alginate bổ sung ½ MS và không bổ sung đường sucrose thích hợp cho bảo quản chồi lan D.lituiflorum Lindl. với tỷ lệ chồi sống và không nảy mầm bật ra khỏi hạt là cao nhất. Hạt nhân tạo với lớp vỏ được tạo từ 50 g/l sodium alginate bổ sung ¼ MS và không bổ sung đường sucrose lại thích hợp cho bảo quản chồi lan D.polyanthum Wall. Ex Lindl. với tỷ lệ sống và không nảy mầm bật ra khỏi hạt là 80% sau 56 ngày bảo quản. LỜI CẢM TẠ Các tác giả xin chân thành cảm ơn Trường ĐH Công nghiệp Thực phẩm TP Hồ Chí Minh đã hỗ trợ kinh phí và Phòng Thí nghiệm Công nghệ sinh học Thực vật đã tạo điều kiện để thực hiện nghiên cứu này. TÀI LIỆU THAM KHẢO Bonnier, F. J. M and Van Tuyl, J. M. (1997). Long term in vitro storage lily: effects of temperature and concentration of nutrients and sucrose. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 49: 81-87. Bustam, S., Sinniah, U.R., Kadir, M.A., Zaman, F.Q, Subramaniam, S. (2013). Selection of optimal stage for protocorm like bodys and production of artificial seeds for direct regeneration on different media and short term storage of Dendrobium Shavin White. Plant Growth Regul, 69: 215-24. Duong T.N., Tran T. N. T., M. T. N.H, N. T. T. H, P.X.H, Vo Q.L, and Teixeira da Silva, J. A. (2005). Artificial seeds for propagation and preservation of Cymbidium spp. Propagation of Ornamental Plants, 5(2), 67-73 Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thủy Tiên (2006). Công nghệ tế bào, NXB Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh. Trần Thị Ngọc Lan, Hoàng Văn Cường, Hoàng Xuân Chiến, Nguyễn Bá Nam, Nguyễn Du Sanh và Dương Tấn Nhựt (2011). Nghiên cứu tạo hạt nhân tạo của cây địa lan (Cymbidium madrit “Forest king” phục vụ công tác nhân giống và bảo quản. Tạp chí Công nghệ Sinh học, 9(4): 465 - 474. Gantait, S., Bustam, S., and Sinniah, U. R. (2012). Alginate-encapsulation, short-term storage and plant regeneration from PLBs of Aranda Wan Chark Kuan ‘Blue’× Vanda coerulea Grifft. C1 C2 C3 C4 C5 AGU International Journal of Sciences – 2019, Vol. 23 (2), 72 - 80 80 Ex Lindl.(Orchidaceae). Plant Growth Regulation, 68(2): 303-311. Janeiro, L. V., Ballester, A. and Vieitez, A. M. (1997). In vitro response of encapsulated somatic embryos of camellia. Plant cell, tissue and organ culture, 51(2): 119-125. Mahendran, G. (2014). Encapsulation of Protocorm of Cymbidium bicolor Lindl. for Short-Term Storage and Germplasm Exchange. Journal of Ornamental Plants, 4 (4): 17-27 Mohanty, P., Nongkling, P., Das, M. C., Kumaria, S. and Tandon, P. (2013). Short-term storage of alginate-encapsulated protocorm-like bodies of Dendrobium nobile Lindl.: an endangered medicinal orchid from North-east India, 3 Biotech, 3(3): 235-239. Murashige, T. and Skoog, F. (1962). A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia plantarum, 15(3): 473-497. Dương Tấn Nhựt (2011). Công nghệ sinh học thực vật tập 1, NXB Nông Nghiệp. Schapp, S. R. and Preece, J. E. (1986). In vitro growth reduction of tomato and carnation microplants. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 6: 3-8 Tejavathi, D. H., Gayathramma, K., and Sowmya, R. (2006). Production of plantlets from encapsulated in vitro shoot buds and somatic embryos of Agave vera-cruz Mill. Plant Cell Biotechnology and Molecular Biology, 7(3-4): 183-186.