Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định độc tố biển okadaic axit (thuộc nhóm DSP) và domoic axit (thuộc nhóm asp) trong phần ăn đuợc của loài nghêu trắng (meretrix lyrata) bằng phương pháp lc- Ms/ms - Nguyễn Hữu Phát

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 5 * 2018 Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 438 XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ĐỘC TỐ BIỂN OKADAIC AXIT (THUỘC NHÓM DSP) VÀ DOMOIC AXIT (THUỘC NHÓM ASP) TRONG PHẦN ĂN ĐUỢC CỦA LOÀI NGHÊU TRẮNG (MERETRIX LYRATA) BẰNG PHƯƠNG PHÁP LC- MS/MS Nguyễn Hữu Phát*, Lê Anh Tuấn* TÓM TẮT Đặt vấn đề: Các loài nhuyễn thể có thể tích lũy các độc tố gây hại cho sinh vật, những độc tố này được gọi là độc tố sinh học biển (marine toxins). Trên thế giới có 5 nhóm độc tố nhuyễn thể chính bao gồm: nhóm độc tố nhuyễn thể gây liệt cơ - Paralytic Shellfish Poisoning (PSP), nhóm độc tố nhuyễn thể gây tiêu chảy - Diarrhetic Shellfish Poisoning (DSP), nhóm độc tố nhuyễn thể gây mất trí nhớ - Amnesic Shellfish Poisoning (ASP), nhóm độc tố nhuyễn thể gây độc hệ thần kinh - Neurologic Shellfish Poisoning (NSP) và nhóm độc tố nhuyễn thể Azaspriaxit (AZA). Mục tiêu: Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định hàm lượng Okadaic axit và Domoic axit trong phần ăn được của M. lyrata bằng hệ thống LC-MS/MS AB Sciex Triple Quad 5500. Phương pháp nghiên cứu: Sử dụng hệ thống LC-MS/MS AB Sciex Triple Quad 5500 để phân tích Kết quả: Giới hạn định lượng của Domoic axit là 0,07 mg/kg với hiệu suất thu hồi từ 83-84% và giới hạn định lượng của Okadaic axit là 0,08 mg/kg với hiệu suất thu hồi từ 93-103%. Kết luận: Phương pháp có độ nhạy phù hợp với MRL do EU công bố, có độ ổn định và độ đúng đáp ứng với các thông số theo yêu cầu của quá trình xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp. Từ khóa: domoic axit, okadaic axit, meretrix lyrata ABSTRACT VALIDATION OF A LIQUID CHROMATOGRAPHY TANDEM MASS SPECTROMETRY METHOD FOR THE ANALYSIS OF OKADAIC AXIT (DSP GROUP) AND DOMOIC AXIT (ASP GROUP) IN EDIBLE PART OF WHITE CLAM (MERETRIX LYRATA) Nguyen Huu Phat, Le Anh Tuan * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol. 23 – No. 5 - 2019: 438 – 445 Background: Filter-feeding shellfish species such as mussels, oysters and clams can be contaminated with various types of lipophilic marine toxins. The most important marine phycotoxins are shellfish toxins and ciguatoxins. Until now, five groups of shellfish toxins have been distinguished, namely: paralytic shellfish toxins causing paralytic shellfish poisoning (PSP); diarrheic shellfish toxins causing diarrheic shellfish poisoning (DSP); amnesic shellfish toxins causing amnesic shellfish poisoning (ASP); neurotoxic shellfish toxins causing neurotoxic shellfish poisoning (NSP); and azaspiracid shellfish toxins causing azaspiracid shellfish poisoning (AZP). Objectives: To validate method for the analysis of Okadaic acid (DSP group) and Domoic acid (ASP group) in edible part of Meretrix lyrata. Methods: Chemical method is based on liquid chromatography (LC) coupled with (tandem) mass spectrometry (MS/MS). *Viện Y tế Công cộng TP. Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: ThS. Nguyễn Hữu Phát ĐT: 0969 241 883 Email: huuphatk@gmail.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 5 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 439 Results: The method performed very well with respect to accuracy, intraday precision (repeatability), inter- day precision (within-laboratory reproducibility), linearity, detection limit, specificity and ruggedness. The accuracy ranged from 83% to 84%, and the quantitation limit was 0.07 mg/kg for domoic acid. The accuracy ranged from 93% to 103%, and the quantitation limit was 0.08 mg/kg for okadaic acid. Conclusions: The LC-MS/MS method for the determination of Okadaic acid and Domoic acid has been successfully validated. Results of the validation process confirmed its fitness for purpose as a quantitative method. Based on these values for precision and recovery, it was concluded that the method is suitable for official control purposes to quantitatively determine Okadaic acid and Domoic acid. Key words: domoic acid, okadaic acid, meretrix lyrata ĐẶT VẤN ĐỀ Trong hệ sinh thái biển, phần lớn các loài vi tảo đóng vai trò quan trọng trong chuỗi thức ăn, chúng là nguồn dinh dưỡng chủ yếu của nhiều loài động vật phù du, ấu trùng, tôm cua, một số loài thân mềm ăn lọc, cá. Tuy nhiên, một phần nhỏ trong chúng, có chứa các độc tố gây hại cho sinh vật khác và được gọi là độc tố sinh học biển (marine toxins). Các chất độc này tích lũy trong cơ thể những loài nhuyễn thể ăn tảo, khuếch đại theo chuỗi thức ăn và gây ảnh huởng lớn đến sức khỏe của các loài đứng ở đỉnh của chuỗi thức ăn, trong đó có con người. Trên thế giới có 5 nhóm độc tố nhuyễn thể chính bao gồm: nhóm độc tố nhuyễn thể gây liệt cơ - Paralytic Shellfish Poisoning (PSP), nhóm độc tố nhuyễn thể gây tiêu chảy - Diarrhetic Shellfish Poisoning (DSP), nhóm độc tố nhuyễn thể gây mất trí nhớ - Amnesic Shellfish Poisoning (ASP), nhóm độc tố nhuyễn thể gây độc hệ thần kinh - Neurologic Shellfish Poisoning (NSP) và nhóm độc tố nhuyễn thể Azaspriaxit (AZA). Trong đó PSP, DSP và ASP là các nhóm độc tố đã được đưa vào quy định kiểm soát giới hạn tồn dư cho phép có trong các sản phẩm nhuyễn thể dùng cho con người. Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8340:2010(5) ban hành phương pháp xác định độc tố nhóm ASP trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ. Trong tiêu chuẩn này, độc tố ASP (domoic axit) được chiết từ thịt nhuyễn thể hai mảnh vỏ bằng dung dịch axit clohydric 0,1 M. Xác định hàm lượng domoic axit bằng HPLC dùng detector UV ở bước sóng 242 nm theo phương pháp ngoại chuẩn. Độc tố DSP trong thịt nhuyễn thể hai mảnh vỏ ở các dạng dẫn xuất axit okadaic (OA), dinophysistoxin-1 (DTX-1) và dinophysistoxin-2 (DTX-2) chứa nhóm chức cacboxyl, được chuyển sang dạng hợp chất phát huỳnh quang bằng phản ứng este hoá với 9-anthryl-diazometan (ADAM) và được định lượng bằng hệ thống HPLC dùng detector huỳnh quang. Phương pháp này được giới thiệu trong TCVN 8341:2010(6). Với bối cảnh các độc chất tồn dư có trong thực phẩm liên tục xuất hiện với tần suất dày đặc và tồn tại ở nhiều dạng phức tạp khác nhau thì phương pháp xác định dư lượng các chất cấm sử dụng đầu dò khối phổ giúp giảm thiểu tối đa khả năng xuất hiện dương tính giả trong các xét nghiệm. Do đó, nghiên cứu sẽ thực hiện xây dựng và thẩm định phương pháp xác định hàm lượng Okadaic axit và Domoic axit trong phần ăn được của M. lyrata bằng hệ thống LC- MS/MS AB Sciex Triple Quad 5500. Mục tiêu nghiên cứu Giới hạn dư lượng tối đa (MRL) các độc tố biển trong nhuyễn thể được EU ban hành vào năm 2004(3) áp dụng cho các độc tố PSP, ASP (tính theo domoic axit) và Okadaic lần lượt là 800 µg/kg, 20 mg/kg và 160 µg/kg. Bên cạnh đó, giới hạn hàm lượng các độc tố PSP, ASP và DSP đối với nhuyễn thể ở Việt Nam đã được quy định trong “TCVN 8681:2011 Nhuyễn thể hai mảnh vỏ đông lạnh”(7) với mức cho phép (mg/kg) lần lượt là 0,8; 20 và “không phát hiện”. Trong giới hạn của nghiên cứu này, quy trình Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 5 * 2018 Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 440 phân tích xác định hai hợp chất Okadaic axit và Domoic axit (đại diện cho nhóm DSP và ASP) trong phần ăn được của loài Nghêu trắng (Meretrix lyrata) sẽ được tập trung nghiên cứu. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Kể từ khi lần đầu tiên được phát hiện ở Nhật vào năm 1978, độc tố nhuyễn thể gây tiêu chảy (DSP) được nhận diện là nguy cơ nguy hiểm cho sức khỏe con người trên toàn thế giới. Tất cả các độc tố DSP đều là các hợp chất không phân cực, có khối lượng phân tử cao hơn 500 và dễ dàng được chiết bằng các dung môi hữu cơ. Hầu hết các độc tố DSP là các hợp chất polyether với cấu trúc đặc biệt chứa rất nhiều loại nhóm chức do đó chúng có độc tố cũng như tính chất hóa học khác nhau. Okadaic axit (OA) và dinophysistoxins (DTXs) được xem là hai hợp chất đại diện cho nhóm DSP và là nguyên nhân gây ra triệu chứng tiêu chảy(1) (Hình 1, Bảng 1). Domoic axit (DA) và đồng phân của nó được tích lũy trong nhuyễn thể là nguyên nhân gây ra ngộ độc với triệu chứng mất trí nhớ (ASP) cho con người. DA là hợp chất amino axit vòng, tan tốt trong nước được sản sinh bởi tảo đỏ ở biển thuộc hai giống là Chondria và Pseudonitzschia. Trường hợp ngộ độc ASP được ghi nhận đầu tiền vào năm 1987 ở Prince Edward Island (Canada). Ba người chết và gần 100 người nhập viện sau khi ăn vẹm vỏ xanh (Mytilus edulis) có chứa hàm lượng DA cao(4) (Hình 2). Hình 1: Công thức cấu tạo nhóm độc tố DSP Bảng 1: Công thức cấu tạo nhóm độc tố DSP Tên độc tố R1 R2 R3 R4 OA CH3 H H H DTX-1 CH3 CH3 H H DTX-2 H H CH3 H DTX-3 (dạng acylate của DTXs) CH3 hoặc H Axit béo Hình 2: Công thức cấu tạo nhóm độc tố ASP Nghêu trắng hay còn gọi là Nghêu Bến Tre (Sowerby, 1851), có tên khoa học là Meretrix lyrata, và còn có tên gọi khác là Lyrate Asiatic, phân bố phía Tây Thái Bình Dương, từ Đài Loan đến Việt Nam. Ở Việt Nam, nghêu thường phân bố nhiều ở vùng ven biển phía Nam, bao gồm các tỉnh: Tiền Giang, Bến Tre, Trà Vinh, Sóc Trăng, Bạc Liêu và Cà Mau. Nghêu là loài động vật thân mềm hai mảnh vỏ, sống trong lớp trầm tích đáy ở vùng cửa sông, có nguồn thức ăn là những loài vi tảo và các hạt rắn chứa chất hữu cơ lơ lửng trong nước hoặc tích lũy ở bề mặt lớp trầm tích. Một số loài vi tảo có khả năng sản sinh các độc tố biển và do đó tiềm ẩn khả năng gây nhiễm các chất độc này vào nghêu. Bên cạnh đó, nghêu là một trong những loài động vật thân mềm hai mảnh vỏ được sử dụng nhiều trong ẩm thực của người dân Việt Nam, do đó tồn tại nguy cơ gây ngộ độc khi ăn phải nghêu có chứa các độc tố biển. Phương pháp nghiên cứu Quy trình vận hành thiết bị và xử lý mẫu sẽ được tối ưu từ thông số ban đầu của Luckas et al (2015)(1,5) và Mcnabb et al (2005)(2). Các bước tiến hành cụ thể như sau: (1) Mẫu nghêu được tách bỏ vỏ, thu lấy phần thịt ăn được sau đó xay nhuyễn bằng máy đồng nhất mẫu và cân 4 g mẫu vào ống ly tâm 50 mL; Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 5 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 441 (2) Thêm 10 mL MeOH:H2O (50:50), đồng nhất bằng máy trong 1 phút, đánh siêu âm 5 phút; (3) Để nguội về nhiệt độ phòng, ly tâm 4000 vòng/phút trong 15 phút, chuyển dịch ly tâm vào bình định mức 20 mL; (4) Thực hiện tương tự bước (iii) với 5 mL MeOH:H2O (50:50); (5) Gộp dịch chiết lần 2 vào bình định mức 20 mL, định mức đến vạch bằng nước cất; (6) Lọc dịch chiết qua phin lọc có đường kính lỗ lọc là 0,45 µm; (7) Một phần dịch lọc được đem phân tích xác định Domoic axit, một phần đem thủy phân xác định Okadaic; (8) Hút 500 µL dịch chiết sau lọc vào vial, thêm 62,5 µL NaOH 2,5 M, vortex phút, ủ ở 75oC trong 40 phút; (9) Để nguội về nhiệt độ phòng, thêm 62,5 µL HCl 2,5 M, vortex 1 phút; (10) Dung dịch trong vial được đem phân tích trên thiết bị LC-MS/MS để xác định OA. Trước khi áp dụng bất kỳ phương pháp phân tích nào vào thực tế, cần phải tiến hành xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp (hay thẩm định) nhằm đảm bảo độ tin cậy của kết quả thu được. Các bước tiến hành và tiêu chí đánh giá kết quả của quá trình xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp được thực hiện theo hướng dẫn của tài liệu “Thẩm định phương pháp trong phân tích Hóa học và Vi sinh vật”(8), bao gồm các thông số như: xác định số điểm IP; xây dựng đường chuẩn; xác định giới hạn phát hiện – giới hạn định lượng của phương pháp (LOD - LOQ); độ lặp lại; độ tái lặp và độ đúng. Các bước thực hiện xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp cụ thể như sau: Khoảng tuyến tính Tiến hành đo dung dịch chuẩn các chất Domoic axit và Okadaic axit. Khoảng tuyến tính được lựa chọn sao cho khi thiết lập phương trình đường thẳng biểu diễn sự phụ thuộc của tín hiệu đo vào nồng độ có hệ số R2 ≥0,99. Giới hạn phát hiện (MLOD) và giới hạn định luợng (MLOQ) của phương pháp Ước lượng LOD lý thuyết bằng cách: (1) Phân tích các mẫu chuẩn có nồng độ thấp dần, LOD lý thuyết là giá trị nồng độ mà tại đó có Signal/Noise ≥3; (2) Phân tích 6 mẫu thêm ở nồng độ 5-7 lần LOD lý thuyết (nồng độ LOQ lý thuyết); (3) Tính giá trị trung bình XTB, độ lệch chuẩn SD từ 6 kết quả phân tích, (4) MLOD được tính theo công thức: MLOD =3×SD; (5) Đánh giá MLOD tính được theo tỉ số R, với: R = XTB/(3xSD); (6) Nếu 4< R <10 ta chấp nhận giá trị MLOD vừa tính được, nếu R <4 chứng tỏ MLOD thực tế lớn hơn giá trị vừa tính được và cần thêm chuẩn ở nồng độ cao hơn và tính toán lại giá trị MLOD, nếu R >10 chứng tỏ MLOD thực tế nhỏ hơn giá trị vừa tính được, cần thêm chuẩn ở nồng độ thấp hơn và tính toán lại giá trị MLOD; (7) Giới hạn định lượng được tính theo công thức MLOQ = 3xMLOD. Độ lặp lại Lựa chọn 3 giá trị nồng độ phân bố đều trong khoảng làm việc để đánh giá độ lặp lại, trong đó có một giá trị nồng độ tại MLOQ, ở mỗi nồng độ thực hiện phân tích lặp lại 6 lần, độ lặp lại được đánh giá thông qua giá trị độ lệch chuẩn tương đối RSD% = (SDx100)/XTB. Độ tái lặp nội bộ phòng thí nghiệm Thực hiện phân tích lặp lại 6 mẫu thêm chuẩn ở các nồng độ đã thực hiện khi đánh giá độ lặp lại với sự thay đổi một số điều kiện phân tích như: thiết bị phân tích, ngày phân tích, nhân viên phân tích. Tập hợp các kết quả phân tích trong điều kiện tái lặp nội bộ và lặp lại, ứng với mỗi giá trị nồng độ tính giá trị trung bình XTB, độ lệch chuẩn SD từ 12 kết quả phân tích. Hiệu suất thu hồi Dựa vào kết quả nồng độ tính (Cthu hồi) được trên các mẫu thêm chuẩn trong quá trình đánh Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 5 * 2018 Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 442 giá độ lặp lại và độ tái lặp nội bộ phòng thí nghiệm với nồng độ lý thuyết (Clý thuyết) thêm vào, hiệu suất thu hồi được tính toán theo công thức: H% = Cthu hồi x 100/Clý thuyết Độ không đảm bảo đo Mọi phép đo đều có sai số nhất định. Do vậy, ĐKĐBĐ là một phần quan trọng của kết quả đo, ĐKĐBĐ được tính thông qua độ tái lặp nội bộ phòng thí nghiệm kết hợp với độ chệch của phương pháp. Cách tính ĐKĐBĐ gồm các bước sau: (1) Tính ĐKĐBĐ theo độ tái lặp nội bộ phòng thí nghiệm (n: số lần phân tích lặp lại ở mỗi nồng độ), RSD% là RSD% lớn nhất trong số 3 giá trị RSD ứng với 3 nồng độ khảo sát. (2) Tính bias của 3 nồng độ, sau đó tính (3) Độ không đảm bảo đo của mẫu thêm chuẩn , được ước lượng dựa trên độ không đảm bảo đo của thể tích thêm chuẩn và độ không đảm bảo đo của chất chuẩn . (4) Tính ĐKĐBĐ theo độ chệch của phương pháp . (5) Tính ĐKĐBĐ tổng hợp (6) Tính ĐKĐBĐ mở rộng ( hệ số phủ, độ tin cậy 95%). KẾT QUẢ Điều kiện phân tích Bảng 2: Thông số DP, CE, chỉ số IP và cặp ion mẹ/ion con của Domoic axit và Okadaic axit ESI Ion mẹ Ion con DP CE IP Domoic axit + 312 266 45 15 4 + 312 161 45 20 Okadaic axit - 803.5 255 100 -60 4 - 803.5 113 100 -100 Áp dụng các thông số đã lựa chọn vào phân tích dung dịch mẫu thêm chuẩn, kết quả cho thấy píc chất phân tích tách rời khỏi các píc nhiễu và có hình dạng sắc nét phù hợp để phân tích định lượng (Hình 3, 4). Bảng 3: Thông số sắc ký lỏng và khối phổ trong phân tích Domoic axit và Okadaic axit Thông số Giá trị Thông số sắc kí lỏng Hệ pha động (A) MeOH:H2O (95:5) chứa 50 mM HCOOH và 2 mM HCOONH4 (B) H2O chứa 50 mM HCOOH và 2 mM HCOONH4 (A) (95:5) chứa 50 mM HCOOH và 2 mM HCOONH4 (B) H2O chứa 50 mM HCOOH và 2 mM HCOONH4 Cột C18 Inertsil 150mm x 5µm C18 Luna 100mm x 3µm Tốc độ dòng 0,8 mL/phút 0,4 mL/phút Chương trình gradient Thời gian %A %B 0.2 10 90 3.5 90 10 8 90 10 8,1->13,0 10 90 Thời gian %A %B 0.2 10 90 3.5 90 10 8 90 10 8,1->13,0 10 90 Thông số khối phổ CUR – Tốc độ dòng khí N2 làm sạch 20 psi 20 psi IS – Thế ion hóa 5500 V -5500 V CAD – Khí va đập Medium Medium TEM – Nhiệt độ hóa hơi dung môi 500 o C 500 o C GS1 – Khí phun sương 40 psi 40 psi GS2 – Khí thổi khô 40 psi 40 psi Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 5 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 443 XIC of +MRM (2 pairs): 312.000/266.000 Da ID: Domoic acid from Sample 35 (C3-06) of Data20181104-Domoic.wiff (Turbo Spray) Max. 2.3e5 cps. 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 11.0 11.5 12.0 12.5 1 131 262 392 523 653 784 914 1044 1175 1305 1436 1566 1697 1827 1957 2088 2218 2349 2479 2609 2740 2870 3001 3131 3262 Time, min 0.0 5.0e4 1.0e5 1.5e5 2.0e5 2.3e5 In te n .. . 6.52 1.78 12.141.64 12.32 XIC of +MRM (2 pairs): 312.000/266.000 Da ID: Domoic acid from Sample 35 (C3-06) of Data20181104-Domoic.wiff (Turbo Spray) Max. 2.3e5 cps. 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 11.0 11.5 12.0 12.5 1 131 262 392 523 653 784 914 1044 1175 1305 1436 1566 1697 1827 1957 2088 2218 2349 2479 2609 2740 2870 3001 3131 3262 Time, min 0.0 5.0e4 1.0e5 1.5e5 2.0e5 2.3e5 In te n .. . 6.52 1.78 12.141.64 12.32 XIC of +MRM (2 pairs): 312.000/161.000 Da ID: Domoic acid from Sample 35 (C3-06) of Data20181104-Domoic.wiff (Turbo Spray) Max. 6.3e4 cps. 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 11.0 11.5 12.0 12.5 1 131 262 392 523 653 784 914 1044 1175 1305 1436 1566 1697 1827 1957 2088 2218 2349 2479 2609 2740 2870 3001 3131 3262 Time, min 0.0 2.0e4 4.0e4 6.0e4 In te n .. . 8.66 6.52 10.227.486.45 2.15 7.99 Hình 3: Sắc ký đồ mẫu thêm chuẩn Domoic axit XIC of -MRM (2 pairs): 803.500/255.000 Da ID: Okadaic acid from Sample 24 (OA-MRL-06) of Data20190312-Validation OA.wiff (Turbo ... Max. 2.3e4 cps. 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 11.0 11.5 12.0 12.5 Time, min 0.0 5000.0 1.0e4 1.5e4 2.0e4 2.3e4 In te n si ty , cp s 6.59 XIC of -MRM (2 pairs): 803.500/255.000 Da ID: Okadaic acid from Sample 24 (OA-MRL-06) of Data20190312-Validation OA.wiff (Turbo ... Max. 2.3e4 cps. 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 11.0 11.5 12.0 12.5 Time, min 0.0 5000.0 1.0e4 1.5e4 2.0e4 2.3e4 In te n si ty , cp s 6.59 XIC of -MRM (2 pairs): 803.500/113.000 Da ID: Okadaic acid from Sample 24 (OA-MRL-06) of Data20190312-Validation OA.wiff (Turbo ... Max. 1.7e4 cps. 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 11.0 11.5 12.0 12.5 Time, min 0.0 5000.0 1.0e4 1.5e4 In te n si ty , cp s 1.10 10.71 5.10 11.004.96 5.261.15 6.595.62 5.983.88 9.804.09 9.496.69 11.519.997.483.64 Hình 4: Sắc ký đồ mẫu thêm chuẩn Okadaic axit Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp Độ đặc hiệu/chọn lọc của phương pháp Các hợp chất Domoic axit, Okadaic axit khi định lượng trên khối phổ MS/MS đều có số điểm IP là 4, phù hợp với yêu cầu cho độ đặc hiệu của phương pháp. Trong quá trình thực hiện xác định giá trị sử dụng phương pháp các mẫu blank đều cho kết quả không phát hiện và khi thêm chuẩn ở nồng độ gần LOQ các kết quả đều cho hiệu suất thu hồi tốt. Như vậy, phương pháp có độ chọn lọc cao cho các hợp chất Domoic axit, Okadaic axit. Khoảng tuyến tính của đường chuẩn Phương trình đường chuẩn (dạng đường tuyến tính bậc I) của Domoic axit nồng độ từ 10 - 100 µg/kg và Okadaic axit nồng độ từ 4 – 32 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 5 * 2018 Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 444 µg/kg cho hệ số R2 tốt (R2 >0,99), đó cũng là khoảng nồng độ làm việc. Bên cạnh đó, kết quả đánh giá hiệu ứng nền cũng cho thấy ảnh hưởng của nền lên sự thăng/gián tín hiệu đo đều nằm trong mức 20% ở tất cả các nồng độ của Domoic axit. Đối với Okadaic axit, vì nền mẫu có ảnh hưởng lớn đến tín hiệu đo, do đó đường chuẩn được xây dựng theo phương pháp dựng chuẩn trên nền (Hình 5, Bảng 4). Hình 5: Phương trình đường chuẩn Domoic axit và Okadaic axit Bảng 4: Kết quả của quá trình xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp Thông số Domoic axit Okadaic axit MLOQ (μg/kg) 70 80 MLOD (μg/kg) 23 26 Độ không đảm bảo đo (%) 22,21 25,35 Độ tái lặp (%) 5,0 6,1 Nồng độ khảo sát (μg/kg) 70 140 500 80 160 320 Độ lặp lại (%) 3,7 3,1 3,4 4,6 4,8 2,3 Độ thu hồi (%) 84 83 83 93 103 98 Giới hạn phát hiện của phương pháp (MLOD) và giới hạn định lượng (LOQ) Kết quả phân tích lặp lại 12 lần mẫu thêm chuẩn ở nồng độ 70, 80 µg/kg tương ứng với Domoic axit, Okadaic axit được sử dụng cho việc xác định hệ số R. Ở nồng độ thêm chuẩn này đều cho giá trị 4< R <10, do vậy giá trị nồng độ này được lựa chọn là MLOQ của phương pháp xác định các hợp chất Domoic axit và Okadaic axit. MLOQ của phương pháp nhỏ hơn MRPL của các hợp chất Domoic axit, Okadaic axit do EU đưa ra. Do đó, phương pháp đáp ứng được yêu cầu về độ nhạy cho phân tích các Domoic axit, Okadaic axit. Hiệu suất thu hồi (Recovery) và độ lặp lại (Repeatability) Kết quả phân tích lặp lại 6 mẫu thêm chuẩn ở nồng độ 70, 140, 500 µg/kg (Domoic axit); 80, 160, 320 µg/kg (Okadaic axit) cho thấy ở cả ba nồng độ khảo sát có RSD% và H% đều đáp ứng được tiêu chí theo AOAC cho từng nồng độ. Như vậy, phương pháp cho độ lặp lại và hiệu suất thu hồi phù hợp với yêu cầu. Độ tái lặp nội bộ trong phòng thí nghiệm (Reproductibility within laboratory) Phương pháp cho độ tái lặp tốt khi phân tích các hợp chất Domoic axit, Okadaic axit với độ lệch chuẩn tương đối RSD% ≤10%, đạt được tiêu chí chấp nhận Rw = RSD% <30%. Độ không đảm bảo đo Giá trị độ không đảm bảo đo của phương pháp cho các hợp chất Domoic axit, Okadaic axit lần lượt là 22,21% và 25,35%. BÀN LUẬN Quy trình phân tích mẫu Quy trình phân tích đơn giản chỉ gồm giai đoạn chiết với MeOH:H2O (50:50) cho xác định Domoic axit và thêm giai đoạn thủy phân với NaOH cho xác định Okadaic axit nhưng lại cho phép xác định đồng thời được cả hai độc tố thuộc hai nhóm khác nhau. Đầu dò khối phổ hai lần có độ nhạy và độ chọn lọc tốt khi phân tích các độc tố này, góp phần đáp ứng được yêu cầu của tiêu chuẩn và tránh được trường hợp dương tính giả. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 5 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 445 Các kết quả đánh giá thông số cho phương pháp đều đạt chứng minh phương pháp xây dựng được phù hợp định lượng hai độc tố Domoic axit và Okadaic axit trong nền mẫu nhuyễn thể hai mảnh vỏ. Phân tích mẫu Ứng dụng quy trình phân tích xây dựng được, tiến hành xác định dư lượng của các chất Domoic axit, Okadaic axit trong một số mẫu nghêu được mua tại các chợ trên địa bàn Thành Phố Hồ Chí Minh. Kết quả khảo sát bước đầu cho thấy toàn bộ các mẫu đều âm tính đối với các chất Domoic axit, Okadaic axit. Tuy nhiên, nghiên cứu chỉ hạn chế trong xét nghiệm hai chất đại diện của nhóm DSP và ASP vì vậy vẫn có khả năng tồn tại các chất độc khác thuộc hai nhóm này trong nghêu. Do đó để có thể kết luận chính hơn xác về sự hiện diện của các chất độc nhóm DSP, ASP trong nghêu, cần có một nghiên cứu sâu hơn trong tương lai về cả phạm vi lấy mẫu lẫn số lượng các chất độc thuộc hai nhóm DSP, ASP vừa nêu. KẾT LUẬN Nghiên cứu đã xây dựng được phương pháp cho phép xác định dư lượng các chất Domoic axit và Okadaic axit trong Nghêu. Phương pháp có độ nhạy phù hợp với MRL do EU công bố, có độ ổn định và độ đúng đáp ứng với các thông số theo yêu cầu của quá trình xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp. Trong giới hạn của nghiên cứu, nhóm tác giả chỉ phân tích 1 hợp chất tiêu biểu đại diện tương ứng cho nhóm độc tố biển. Tuy nhiên, các độc tố trong cùng 1 nhóm có tính chất hóa học khá giống nhau, do đó phương pháp đã nghiên cứu hoàn toàn có khả năng phân tích được tất cả các độc tố trong cùng một nhóm độc tố biển. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Luckas B, Erler K and Krock B (2015). Analysis of Marine Biotoxins Using LC-MS/MS. Natural Products from Marine Algae: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology, 1308:277-297. 2. Mcnabb P, Selwood AI and Holland PT (2005). Multiresidue Method for Determination of Algal Toxins in Shellfish: Single- Laboratory Validation and Interlaboratory Study. Journal of AOAC International, 88(3):761-772. 3. Official Journal of the European Union (2004). Regulation (Ec) No 853/2004 of The European Parliament and of The Council. Official Journal of the European Union, pp.98-102. 4. Quilliam MA (2003). Chemical methods for domoic axit, the amnesic shellfish poisoning (ASP) toxin. Manual on Harmful Marine Microalgae. Monographs on Oceanographic Methodology, 11(9):247-266. 5. Tiêu chuẩn Việt Nam (2010). Nhuyễn thể hai mảnh vỏ - Xác định hàm lượng độc tố gây mất trí nhớ (ASP) - Phương pháp Sắc ký lỏng hiệu năng cao. TCVN 8340:2010. 6. Tiêu chuẩn Việt Nam (2010). Nhuyễn thể hai mảnh vỏ - Xác định hàm lượng độc tố gây tiêu chảy (DSP) - Phương pháp Sắc ký lỏng hiệu năng cao. TCVN 8341:2010. 7. Tiêu chuẩn Việt Nam (2011). Nhuyễn thể hai mảnh vỏ đông lạnh. TCVN 8681:2011 8. Trần Cao Sơn (2010). Thẩm định phương pháp trong phân tích Hóa học và Vi sinh vật. Viện Kiểm Nghiệm An Toàn Vệ Sinh Thực Phẩm Quốc Gia, pp.10-59. Ngày nhận bài báo: 15/08/2019 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 31/08/2019 Ngày bài báo được đăng: 15/10/2019