Nhân dòng và phân tích trình tự promoter của LGF2 từ nhau thai chuột - Đỗ Mỹ Hiếu

Tài liệu Nhân dòng và phân tích trình tự promoter của LGF2 từ nhau thai chuột - Đỗ Mỹ Hiếu: TAÏP CHÍ KHOA HOÏC ÑAÏI HOÏC SAØI GOØN Soá 31 (56) - Thaùng 8/2017 11 Nhân dòng và phân tích trình tự promoter của gene Igf2 từ nhau thai chuột Cloning and analysing the sequence of Igf2 gene’s promoter from the mouse’s placenta Đỗ Mỹ Hiếu, Trường Đại học Sư phạm Huế Do My Hieu, Hue University of Education TS. Phạm Quang Chinh, Trường Đại học Sư phạm Huế Nguyen Thi Thu Hang, Ph.D., Hue University of Education TS. Trần Văn Giang, Trường Đại học Sư phạm Huế Tran Van Giang, Ph.D., Hue University of Education Tóm tắt Gene Igf2 (Insulin-like growth factor 2) là gene in dấu, chỉ biểu hiện trên allele có nguồn gốc từ cá thể đực (bố). Nó giữ nhiều chức năng quan trọng, cơ chế kiểm soát biểu hiện của gene Igf2 khá phức tạp và được điều khiển trực tiếp bởi các promoter. Hai promoter P2 và P3 của gene Igf2 đã được tách chiết, khuếch đại, tinh sạch và nhân dòng từ mô nhau thai chuột 17 ngày. Trình tự promoter P2 và P3 của gene Igf2 có chiều dài lần lượt là 420 và 21...

pdf9 trang | Chia sẻ: quangot475 | Ngày: 18/01/2021 | Lượt xem: 8 | Lượt tải: 0download
Bạn đang xem nội dung tài liệu Nhân dòng và phân tích trình tự promoter của LGF2 từ nhau thai chuột - Đỗ Mỹ Hiếu, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
TAÏP CHÍ KHOA HOÏC ÑAÏI HOÏC SAØI GOØN Soá 31 (56) - Thaùng 8/2017 11 Nhân dòng và phân tích trình tự promoter của gene Igf2 từ nhau thai chuột Cloning and analysing the sequence of Igf2 gene’s promoter from the mouse’s placenta Đỗ Mỹ Hiếu, Trường Đại học Sư phạm Huế Do My Hieu, Hue University of Education TS. Phạm Quang Chinh, Trường Đại học Sư phạm Huế Nguyen Thi Thu Hang, Ph.D., Hue University of Education TS. Trần Văn Giang, Trường Đại học Sư phạm Huế Tran Van Giang, Ph.D., Hue University of Education Tóm tắt Gene Igf2 (Insulin-like growth factor 2) là gene in dấu, chỉ biểu hiện trên allele có nguồn gốc từ cá thể đực (bố). Nó giữ nhiều chức năng quan trọng, cơ chế kiểm soát biểu hiện của gene Igf2 khá phức tạp và được điều khiển trực tiếp bởi các promoter. Hai promoter P2 và P3 của gene Igf2 đã được tách chiết, khuếch đại, tinh sạch và nhân dòng từ mô nhau thai chuột 17 ngày. Trình tự promoter P2 và P3 của gene Igf2 có chiều dài lần lượt là 420 và 212 nucleotid. Trình tự của các promoter này có độ tương đồng rất cao với trình tự (U71085.1) và (AH001929.2) trên GenBank. Từ khóa: gene in dấu, Igf2, nhau thai, nhân dòng, promoter. Abstract Gene Igf2 (Insulin-like growth factor 2) is an imprinted gene which is expressed from only one of the parental chromosomes. This gene plays a lot of important functions; the mechanism for controlling its expression is quite complex and is carried out by the promoters. The P2 and P3 promoters of Igf2 have been successfully split, amplified, purified and cloned from placental tissues of 17-day-old male mice. The P2 and P3 promoters of the Igf2 gene are 420 and 212 nucleotides in length, which are very much similar with GenBank sequences (U71085.1 and AH001929.2 respectively). Keywords: imprinted gene, Igf2, placenta, cloning, promoter. 1. Đặt vấn đề Động vật có vú là những loài có bộ nhiễm sắc thể lưỡng bội, đời con thừa hưởng bộ nhiễm sắc thể của cả bố và mẹ. Như vậy, chúng có hai bản sao của mỗi gene. Theo quy luật Mendel, thông thường cả hai bản sao từ bố hoặc mẹ của mỗi gene đều có sự biểu hiện như nhau. Thế nhưng, một số gene chỉ biểu hiện bản sao có nguồn gốc từ bố hoặc mẹ. Hiện tượng đó được gọi là in dấu hệ gene (Genomic imprinting). Có hơn 100 gene in dấu, trong đó điển hình là gene Igf2 (Insulin - like growth factor 2) nằm trên nhiễm sắc thể số 7 của chuột và số NHÂN DÒNG VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ PROMOTER CỦA GENE IGF2 TỪ NHAU THAI CHU T 12 11 của người [4 5]. Ở người, gene in dấu (Imprinting gene) này chỉ biểu hiện trên allele có nguồn gốc từ bố, còn bản sao này từ cơ thể mẹ truyền cho con thì không được biểu hiện [3]. Gene này mã hóa một protein hoạt động như một yếu tố điều hòa sinh trưởng, đặc biệt hoạt động mạnh trong giai đoạn phôi thai ở động vật có vú cũng như ở người. Gene Igf2 kiểm soát sự tăng sinh, sinh trưởng và biệt hóa của tế bào và đặc biệt là liên quan đến sự điều hòa phát triển phôi và sự phát triển của nhau thai. Với chức năng đó, gene Igf2 biểu hiện sớm trong quá trình phát triển phôi ở tất cả các loại mô nội bì, ngoại bì và trung bì, ở cơ thể trưởng thành, gene này biểu hiện thấp [1]. Gene Igf2 trên chuột được điều khiển bởi 4 promoter khác nhau và các promoter này có trình tự bảo thủ cao giữa gene Igf2 trên chuột và người và chúng chỉ biểu hiện trên allele có nguồn gốc từ cá thể đực (bố) truyền cho đời con [2]. Mức độ biểu hiện của gene này chủ yếu do các promoter quyết định, 4 promoter đã được biết liên quan đến sự biểu hiện của gene là P0, P1 và P2 và P3 [7]. Các promoter này điều khiển biểu hiện của 3 exon là exon 4, exon 5 và exon 6. Trong đó, exon 4 là exon đầu tiên và mang bộ ba mã hóa amino acid mở đầu. Hai promoter P2 và P3 biểu hiện phổ biến trong tất cả các mô và nằm gần exon 4, nên nó liên quan rất lớn đến cơ chế biểu hiện của gene Igf2. Khi nghiên cứu mức độ biểu hiện promoter P2 và P3 trên chuột thì thấy rằng hai promoter này biểu hiện cao hầu hết các mô cơ quan được nghiên cứu (gan, thận, tim). Còn các promoter khác như P0 và P1 thì biểu hiện khá thấp [3]. Vì vậy, xác định được trình tự của các promoter này trong nhau thai để từ đó nghiên cứu chính xác mức độ biểu hiện của gene Igf2 trong nhau thai chuột thực sự là cần thiết. 2. Nguyên liệu và phương pháp 2.1. Nguyên liệu và hóa chất 2.1.1. Nguyên liệu Các mẫu nhau thai chuột đực 17 ngày tuổi được thu nhận tại phòng thí nghiệm Giải phẫu - Sinh lý thuộc khoa Sinh, trường Đại học Sư phạm Huế, xử lý mẫu với nitơ lỏng và bảo quản ở nhiệt độ -20oC để tiến hành tách chiết ADN (Hình 1 A). Cặp mồi đặc hiệu được sử d ng để thực hiện quá trình khuếch đại và nh n dòng (Bảng 1). Bảng 1. Trình tự cặp mồi đặc hiệu sử dụng trong nghiên cứu Tên mồi Trình tự Chiều dài P2F 5'-CTATAAGAACCGGGGGTTGG-3' 21N P2R 5'-GGACAGGCGTGGCGGCGCTC-3' 20N P3F 5'-GGGAGTGGTCAGCAGGGAGGGG-3' 22N P3R 5'-CTCCTGGCTCCACAGCCCTG-3' 20N - Chủng vi khuẩn E. coli DH5α do Viện Công nghệ Sinh học, Đại học Huế cung cấp. - Vertor tạo dòng pGEM-T Easy (Promega) (Hình 1 B). ĐỖ MỸ HIẾU - PHẠM QUANG CHINH - TRẦN VĂN GIANG 13 Hình 1. Vị trí lấy mẫu tách chiết ADN (A). Cấu tạo vector pGEM-T Easy (Promega) (B) 2.1.2. Hóa chất và thiết bị Các hóa chất được sử d ng trong nghiên cứu: Các môi trường LB lỏng, LB đặc. Các dung dịch: phá tế bào (10mM Tris, 100mM EDTA, 2% SDS, pH 8,0), dung dịch tủa protein (Ammonium acetate 7,5 M), PCI (Phenol - Chloroform - Isoamylchloroform: 25:24:1), đệm TE (10Mm Tris-HCl; 1mM EDTA; pH 8,0), cồn rửa (70% EtOH). Tris, EDTA, SDS, ammonium acetate, protein K, agarose, chloroform, ethanol, loading dye (5X), ampicillin, Các thiết bị được sử d ng trong nghiên cứu như: Máy PCR (Mỹ), máy ly tâm lạnh (Đức), máy vortex (Đức), hệ thống đọc UV trực tiếp (Mỹ), hệ thống điện di (Mỹ). Máy pH tự động (Th y Sỹ), nồi khử trùng (Nhật Bản), tủ lạnh (Nhật Bản), tủ lắc (Đức), tủ cấy (Nhật bản), tủ ấm (Nhật bản), cân phân tích (Đức). 2.2. Phương pháp nghiên cứu Các phương pháp sinh học phân tử được tham khảo theo Sambrook và Ruesel (2001) [9] có cải tiến. Các thí nghiệm được thực hiện từ 10/2015 - 5/2017 tại phòng thí nghiệm trọng điểm Di truyền - Vi sinh thuộc khoa Sinh trường Đại học Sư phạm Huế. 2.2.1. Tách chiết ADN tổng số 2 ml dịch mô tế bào được giải đông ở nhiệt độ phòng. Thêm 40 µl proteinase (20µg/ml) đã được hòa tan trong đệm pK 2X. Sau 4 giờ ủ ở nhiệt độ 50°C, dịch tế bào được chiết với 4 ml phenol/chloroform (1:1). Ly tâm dịch chiết trong 30 phút ở 20°C (6000v/1phút). Dịch nổi được tủa bằng 8 ml (EtOH) 70% và 300 µl NaCl 5 M ở nhiệt độ -20°C trong 12 giờ hoặc qua đêm. Ly t m thu lấy tủa, rửa tủa bằng 500 µl (EtOH) 70%. Ly tâm loại bỏ cồn, làm khô ADN ở nhiệt độ phòng. 2.2.2. Phản ứng PCR Thành phần phản ứng PCR bao gồm: 1 µl ADN; 6 µl đệm 2X PCR master mix (2,4 mM dNTP mỗi loại; 0,3 đơn vị Taq ADN polymerase), 0,5 µl mồi xuôi, 0,5 µl mồi ngược và bổ sung nước vô trùng để đạt thể tích phản ứng là 12 µl. Phản ứng PCR được thực hiện theo chu trình sau: biến tính ADN bộ gene 95oC/5 phút; tiếp đến là 30 chu kỳ: 95oC/1 phút, 48oC/30 giây, 72oC/1 phút; cuối cùng là 72oC/10 phút [8]. 2.2.3. Điện di agarose gel Chuẩn bị agaro gel 0,8%, sau khi gel đã đông, tra mẫu vào các giếng, chạy với điện trường 100 V trong 30 phút. Sau khi kết thúc điện di, nhuộm bản gel với ethidium bromide (EtBr) có nồng độ 0,5 g/ml trong 15 phút, rửa lại bằng nước cất và cho vào hệ thống máy đọc gel. Ch p ảnh và phân tích kết quả. 2.2.4. Gắn sản phẩm PCR vào vector Sản phẩm PCR được gắn trong vector pGEM®-T Easy (Promega), thành phần NHÂN DÒNG VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ PROMOTER CỦA GENE IGF2 TỪ NHAU THAI CHU T 14 phản ứng gắn bao gồm: 1 µl vector, 5 µl đệm 2X (2X Rapid Ligation Buffer), 1 µl T4 ADN ligase, 1 µl sản phẩm, sau đó bổ sung nước vô trùng để đạt thể tích cuối cùng 10 µl, phản ứng được ủ ở 4oC qua đêm. 2.2.5. Biến nạp sản phẩm gắn dính vào tế bào khả biến E. coli Vector mang sản phẩm PCR được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5α bằng phương pháp shock nhiệt. Hỗn hợp biến nạp bao gồm: 10 µl dung dịch gắn chứa vector mang sản phẩm PCR, 200 µl dung dịch tế bào khả biến DH5α. Hỗn hợp được trộn nhẹ nhàng, ủ 30 phút trong tủ đá, sốc nhiệt ở 42oC trong 45 giây, ngay lập tức chuyển sang khay đá, ủ 3 phút. Sau đó hỗn hợp được nuôi trong môi trường LB lỏng (800 µl) (không có kháng sinh), ủ ở 37oC, lắc 200 vòng/phút trong 1 giờ. Lấy 200 µl dung dịch biến nạp trải trên môi trường LB đặc có bổ sung 50 µg/ml ampicillin, 30 µl X - Gal 40 µg/ml, 30 µl IPTG 100 mM. 2.2.6. Tách chiết và tinh sạch plasmid tái tổ hợp Lấy 1 ml dịch nuôi cấy các plasmid tái tổ hợp đưa vào ống Eppendorf 1,5 ml, ly t m 6000 vòng/phút trong 2 phút để thu tế bào. Sau ly tâm bỏ dịch phía trên, giữ cặn tế bào bên dưới. Thêm 600 µl nước cất vào để hòa tan cặn, dùng pipet hút nhẹ lên xuống vài lần cho đều. Thêm 100 µl dung dịch phá tế bào vào hỗn dịch trên để phá màng tế bào, đảo nhẹ nhàng, ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Thêm 350 µl dung dịch rửa (nhiệt độ 4 - 8oC), trộn nhẹ nhàng, sau đó ly t m trong 10 phút, nhiệt độ 4oC. Lấy dịch trong bên trên đưa lên màng của cột lọc. Ly tâm trong 1 phút, bỏ dịch dưới. Bổ sung 200 µl dung dịch rửa lên trên màng lọc, sau đó ly t m, bỏ dịch bên dưới. Rửa với 400 µl dịch rửa, ly tâm tiếp trong 1 phút. Làm khô cột bằng ly tâm trong 2 phút. Cuối cùng, chuyển cột lọc sang ống Eppendorf mới, thêm 50 µl dung dịch thôi rửa lên trên màng lọc, để ở nhiệt độ phòng trong 1 phút. Ly tâm trong 30 giây, bỏ cột lọc và thu được dịch chứa ADN plasmid tinh sạch ở dưới. Toàn bộ quá trình thực hiện với tốc độ ly tâm là 12000 vòng/phút. 2.2.7. Giải trình tự ADN Giải trình tự ADN theo nguyên lý của phương pháp Sanger dựa trên các dideoxyl. ADN polymerase xúc tác gắn các deoxynucleotide vào đầu 3’-OH của mạch đơn ADN đang tổng hợp, khi gặp các deoxynucleotide không có nhóm 3’-OH phản ứng tổng hợp sẽ bị ngừng lại. Kết quả là hỗn hợp sản phẩm sau phản ứng bao gồm các polynucleotide có kích thước hơn kém nhau 1 nucleotide được phát hiện bằng đầu dò huỳnh quang trên máy đọc chương trình tự động ABI PRISM 3100 Avant Gentic Analyzer. Các phản ứng tổng hợp bị dừng bằng cách bổ sung formamite ngăn không cho các sợi ADN bắt cặp với nhau, các phân tử ADN mới được tổng hợp được điện di trên gel polyacrylamite để tách nhau ra. Dịch chiết plasmid tinh sạch được gửi đến công ty Biomedic để giải trình tự thông qua Viện công nghệ Sinh học – Đại học Huế. 2.2.8. Phân tích trình tự các promoter Các trình peomoter của gene IGF2 trong nhau thai chuột 17 ngày được phân tích bằng chương trình BLAST. Các trình tự được chỉnh sửa và sắp xếp bằng phần mềm BioEdit 7.0. 3. Kết quả nghiên cứu và thảo luận 3.1. Tách chiết và khuếch đại ADN tổng số Mẫu nhau thai chuột được sử d ng để tách chiết ADN tổng số. ADN tổng số sau khi được tách chiết được điện di trên gel agarose 0,8 % (Hình 2 A). ĐỖ MỸ HIẾU - PHẠM QUANG CHINH - TRẦN VĂN GIANG 15 Hình 2. Điện di đồ ADN tổng số (A). Khuếch đại promoter P3, M: ADN marker 1 kb, 1: sản phẩm PCR (B). Khuếch đại promoter P2, M: ADN marker 1 kb, 2: sản phẩm PCR (C) Kết quả điện di cho thấy ADN tổng số được tách chiết từ nhau thai chuột tập trung thành một băng khá đậm, tương đối sạch, ít bị đứt gãy, đảm bảo chất lượng cho các nghiên cứu tiếp theo. Từ ADN tổng số, các promoter P2 và P3 của gene Igf2 được nhân lên bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu. Sản phẩm PCR tập trung một băng rõ nét, với kích thước khoảng hơn 200 bp đối với promoter P3 (Hình 2 B) và khoảng hơn 400 bp đối với promoter P2 (Hình 2 C). Kích thước ph n đoạn được nh n lên tương đương với kích thước của P2 và P3 được tính toán trên l thuyết. 3.2. Nhân dòng các promoter P2 và P3 3.2.1. Gắn sản phẩm PCR vào vector và biến nạp vào tế bào khả biến Sản phẩm PCR được gắn vào vector pGEM - T Easy, sau đó biến nạp vào tế bào tế bào khả biến. Dung dịch biến nạp được trải lên đĩa chứa môi trường chọn lọc (LB + agar + 50 µg/ml ampicillin + X-Gal 40 µg/ml + IPTG 100 mM). Nuôi qua đêm ở nhiệt độ 37oC, các khuẩn lạc sẽ xuất hiện trên đĩa thạch (Hình 3). Các khuẩn lạc trắng được chọn vì khuẩn lạc trắng là khuẩn lạc có thể mang gene tái tổ hợp và tiếp t c nuôi trong môi trường LB lỏng có bổ sung ampicillin. Dịch nuôi qua đêm được sử d ng để tách chiết plasmid và kiểm tra sự có mặt của các plamid tái tổ hợp mang các promoter. Hình 3. Khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch 3.2.2. Tách chiết và kiểm tra plasmid tái tổ hợp Các khuẩn lạc trắng được nuôi trong môi trường LB lỏng có chứa 50 µg/ml ampicillin để tiến hành tách plasmid. Plasmid sau khi được tách chiết được điện di kiểm tra với khuẩn lạc chỉ có vertor không mang gene chèn làm đối chứng âm (Hình 4). NHÂN DÒNG VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ PROMOTER CỦA GENE IGF2 TỪ NHAU THAI CHU T 16 Hình 4. Kiểm tra plasmid tái tổ hợp, (ĐC) plasmid đối chứng, (1, 2, 3, 4, 5) plasmid được tách chiết (A). PCR kiểm tra plasmid 5 (B). PCR kiểm tra plasmid 1 (C), M: marker Ba plasmid (1, 2, 3) tách chiết từ các khuẩn lạc mang sản phẩm biến nạp là PCR P2, trong đó chỉ có plasmid 1 có chênh so với đối chứng, nghĩa là nó có khả năng mang tái tổ hợp, nên kích thước lớn hơn và di chuyển chậm hơn, các plasmid này tiếp t c PCR với mồi đặc hiệu để kiểm tra độ chính xác, sản phẩm trên điện di đồ cho thấy, kích thước đúng với sản phẩm PCR P2 từ ADN tổng số cũng như tính toán trên lý thuyết (Hình 4 A C). Ba plasmid (4, 5, 6) tách chiết từ các khuẩn lạc mang sản phẩm biến nạp từ PCR P3, trong đó chỉ có plasmid 4 có chênh so với đối chứng, nghĩa là nó có khả năng mang tái tổ hợp, nên kích thước lớn hơn và di chuyển chậm hơn, các plasmid này tiếp t c PCR với mồi đặc hiệu để kiểm tra độ chính xác, sản phẩm trên điện di đồ cho thấy, kích thước đúng với sản phẩm PCR P3 từ ADN tổng số cũng như tính toán trên l thuyết (Hình 4 A &B). 3.3. Giải trình tự và so sánh với trình tự trên GenBank Mẫu plasmid tái tổ hợp mang promoter P2 và P3 của chuột Mus musculus sau khi tinh sạch được gửi đi giải trình tự. Kết quả giải trình tự promoter P2 có 420 nucleotide, 44 đảo CpG (Hình 5) và kết quả giải trình tự promoter P3 có 212 nucleotide, có 6 đảo CpG (Hình 5). Quá trình methyl hóa ADN chủ yếu xảy ra ở vị trí phân tử carbon C5 của cytosine nằm trong các đảo CpG, thành dạng 5- methylcytosine. Sự thay thế này không làm thay đổi trình tự ADN nhưng liên quan rất lớn đến cơ chế biểu hiện của gene [6]. Với sự có mặt nhiều đảo CpG trong trình tự P2 thì promoter này dễ bị methyl hóa và ảnh hưởng lớn đến quá trình biểu hiện của gene Igf2 so với promoter P3. Quá trình methyl hóa ADN thường xảy ra ở vị trí dinucleotide CpG, gọi là đảo CpG, nó thường diễn ra ở một số vùng nhất định như vùng promoter hoặc vùng exon đầu tiên. Ở nhiều bệnh, như ung thư, đảo CpG trong promoter của gene có sự methyl hóa quá mức bất thường, sẽ gây ra sự bất hoạt quá trình phiên mã và có thể được di truyền cho các tế bào con bởi sự phân bào [9]. ĐỖ MỸ HIẾU - PHẠM QUANG CHINH - TRẦN VĂN GIANG 17 Hình 5. Trình tự promoter P2 và P3 Sau khi khuếch đại và giải trình tự 2 promoter P2 và P3, kích thước và vị trí đoạn khuyếch đại được so sánh với các promoter khác của gene Igf2 (Hình 6). Trong tương quan các promoter thì P2 có kích thước lớn với 1 vị trí TSS, tiếp đến P1 [10] và kích thước nhỏ nhất là P0 và P3. Cả 2 promoter này không có hộp TATA như các promoter điển hình của một số loài sinh vật nhân chuẩn khác. Hình 6. Vị trí và kích thước các bản sao P2, P3 trong tương quan với các promoter khác NHÂN DÒNG VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ PROMOTER CỦA GENE IGF2 TỪ NHAU THAI CHU T 18 Trình tự promoter sau khi phân tích, tiến hành so sánh với trình tự (U71085.1) và (AH001929.2) trên GenBank bằng phần mềm BLAST. Kết quả cho thấy promoter P2 so với trình tự (U71085.1) có mức độ tương đồng promoter là 99%, có hai nucleotide sai khác (Hình 7 A). Còn mức độ tương đồng promoter P3 với trình tự (AH001929.2) là 100% (Hình 7 B). Điều này chứng tỏ promoter P3 không có sự đa hình di truyền, còn promoter P2 có hai điểm SNP, nhìn chung hai promoter này có tính bảo thủ cao. Đồng thời, trong quá trình thực nghiên cứu không xảy ra sai sót. A B Hình 7. So sánh P2 và P3 với trình tự trên GenBank ĐỖ MỸ HIẾU - PHẠM QUANG CHINH - TRẦN VĂN GIANG 19 4. Kết luận ADN tổng số được tách chiết từ mô nhau thai của chuột Mus musculus 17 ngày có nồng độ cao, sạch, ít bị đứt gãy và tập trung thành băng rõ nét. Đã giải trình tự và phân tích trình tự của promoter P2 có 44 đảo CpG và có 420 nucleotide, giải trình tự promoter P3 có 6 đảo CpG và có 212 nucleotide. Trong tương quan các promoter thì P2 có kích thước lớn với 1 vị trí TSS, P3 ngắn hơn và 1 TSS. Cả 2 promoter này không có hợp TATA như promoter của một số loài sinh vật nhân chuẩn khác. Trình tự promoter P2 có độ tương đồng là 99% so với trình tự trên GenBank (U71085.1), còn promoter P3 có độ tương đồng là 100% so với trình tự trên GenBank (AH001929.2). TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Christiansen, J., Kofod, M., Nielsen, F., C. (1994) A Guanosine Quadruplex and Two Stable Hairpins Flank a Major Cleavage Site in Insulin-like Growth Factor II mRNA. Nucleic acids research, 22(25): 5709 – 5716. 2. Constância, Hemberger, M., Hughes, J., Dean, W., Smith, F., Fundele, R,, Stewart, F., Kelsey, G., Fowden, A., Sibley, C., Reik, W. (2002) Placental - Specific IGF - II is a Major Modulator of Placental and Fetal growth, Nature, 417(6892): 945 - 948. 3. Butler, J. E., Kadonaga, J. T. (2002) Regulation of gene expression the RNA polymerase II core promotor: A Key component in the regulation of gene expression, Gene and development, 16. 2583 - 2592. 4. Elly, H. (2003) The many levels of control of Igf2 expression, Nature, 5, 91 - 102. 5. Firth, M., Ganeshprasad, U., Baxter, R. C. (1998) Structural determinants of ligand and cell surface binding of insulin-like growth factor-binding protein-3, J. Biol. Chem, 273(5): 2631 - 2638. 6. Kim, M., S., Lee, J., Sidransky, D. (2010) ADN methylation markers in colorectal cancer, Cancer Metastasis Review, 29. 181 - 206. 7. Monk, D., Sanches, R., Arnaud, P., Apostolidou, S., Hills, F., Abu-Amero, S., Murrell, A., Friess, H., Reik, W., Stanier, P., Constância, M., Moore, G. E. (2006) Imprinting of IGF2 P0 Transcript and Novel Alternatively Spliced INS-IGF2 Isoforms Show Differences between Mouse and Human.” Human molecular genetics, 15(8): 1259 – 1269. 8. Rand, K., Clark, S. J., Molloy, P. (2002) Conversion-specific detection of DNA methylation using real-time polymerase chain reaction (ConLight-MSP) to avoid false positives. Methods: 27 (2): 114 - 120. 9. Sambrook, J. and Russel, D. W. (2001) Molecular cloning: A laboratory manual, cold spring harbor labortory press. 10. Tran, V. G., Court, F., Duputié, A., Antoine, E., Aptel, N., Milligan, L., Carbonell, F., Lelay-Taha, M., Piette, J., Weber, M., Montarras, D., Pinset, C., Dandolo, L., Forné, T., Cathala, G. (2012) H19 Antisense RNA Can up-Regulate Igf2 Transcription by Activation of a Novel Promoter in Mouse Myoblasts. PloS one, 7(5): e37923. Ngày nhận bài: 30/6/2017 Biên tập xong: 15/8/2017 Duyệt đăng: 20/8/2017

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • pdf47_3516_2215099.pdf
Tài liệu liên quan