Luận văn Việc nghiên cứu đa hình trình tự vùng điều khiển (d-Loop) hệ gen ty thể của gà ri, gà đông tảo và gà tre

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM ---------------0o0--------------- LÊ TIẾN NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH TRÌNH TỰ VÙNG ĐIỀU KHIỂN (D-LOOP) HỆ GEN TY THỂ CỦA GÀ RI, GÀ ĐÔNG TẢO VÀ GÀ TRE LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM ---------------0o0--------------- LÊ TIẾN NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH TRÌNH TỰ VÙNG ĐIỀU KHIỂN (D-LOOP) HỆ GEN TY THỂ CỦA GÀ RI, GÀ ĐÔNG TẢO VÀ GÀ TRE Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS. TS. Nông Văn Hải Thái Nguyên - 2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chƣa đƣợc công bố trong bất kỳ một công trình nào. Tác giả luận văn Lê Tiến Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Nông Văn Hải đã tận tình hƣớng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình hoàn thành luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Đăng Tôn, KS. Vũ Hải Chi, CN. Địch Thị Kim Hƣơng và tập thể cán bộ Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Gen, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn. Đề tài đƣợc hỗ trợ kinh phí từ đề tài nhánh thuộc đề tài "Xác định sự sai khác di truyền của các giống gà nội" do PGS. TS. Lê Thị Thuý, Viện Chăn nuôi, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn làm chủ nhiệm. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo trƣờng Đại học Sƣ phạm - Đại học Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa Sinh - KTNN và các thầy cô cán bộ khoa Sinh - KTNN đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn. Tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã tạo điều kiện giúp đỡ, động viên và khích lệ tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn. Tác giả luận văn Lê Tiến Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU……………………………………………………………......... 01 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU…………………………..………. 04 1.1. SƠ LƢỢC VỀ NGUỒN GỐC VÀ VỊ TRÍ PHÂN LOẠI GÀ NHÀ.... 04 1.2. MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA CÁC GIỐNG GÀ NGHIÊN CỨU……. 06 1.2.1. Gà Ri………………………………………………………………. 06 1.2.2. Gà Đông Tảo (Ðông Cảo)…………………….………………...… 07 1.2.3. Gà Tre……………………………………………………………... 08 1.3. ĐẶC ĐIỂM HỆ GEN TY THỂ VÀ VAI TRÒ CỦA D-LOOP TRONG ĐỊNH LOẠI GÀ…………..……………………………..… 08 1.3.1. Ty thể và đặc điểm cấu trúc, cơ chế di truyền hệ gen ty thể gà…... 08 1.3.1.1. Đặc điểm cấu trúc ty thể………………………………..………... 08 1.3.1.2. Cấu trúc hệ gen ty thể gà…………………....……………........... 09 1.3.1.3. Cơ chế di truyền của mtDNA…………..………….……….….… 13 1.3.2. Cấu trúc và vai trò của vùng D-loop trong đánh giá đa dạng di truyền...………………………………..……………......................... 14 1.4. MỘT SỐ THÀNH TỰU VỀ ĐỊNH LOẠI PHÂN TỬ DỰA TRÊN GIẢI TRÌNH TỰ VÙNG D-LOOP TY THỂ TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM……………………..……………………………..……. 16 1.4.1. Các nghiên cứu trên thế giới………………………………….…. 16 1.4.2. Các nghiên cứu ở Việt Nam……………………………………... 20 Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............. 22 2.1. VẬT LIỆU VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU..................................... 22 2.1.1. Nguyên liệu...................................................................................... 22 2.1.2. Thiết bị............................................................................................. 22 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2.1.3. Hoá chất......................................................................................... 23 2.1.4. Địa điểm nghiên cứu……………………………………….……... 23 2.2. CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……..………………….…… 24 2.2.1. Điện di trên gel agarose…………..………………………….…… 24 2.2.2. Khuếch đại vùng D-loop bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)…………………..……..…..…………………...… 26 2.2.3. Tinh sạch sản phẩm PCR……..……….…………...……….…... 28 2.2.4. Giải trình tự vùng D-loop…………………………….….………. 29 2.2.5. Phân tích dữ liệu bằng phần mềm chuyên dụng.……….……… 30 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN…..………………….………. 31 3.1. Nhân vùng D-loop bằng kỹ thuật PCR……..…………………….. 31 3.2. Xác định và so sánh trình tự nucleotide của các mẫu nghiên cứu với trình tự chuẩn trên GenBank……..……………....…….…...... 36 3.3. Sự đồng nhất về trình tự nucleotide của 3 giống gà…..…….……. 56 3.4. Phân tích mối quan hệ di truyền giữa các giống gà nghiên cứu..….. 56 3.5. So sánh mức độ đa dạng di truyền của 3 giống gà nghiên cứu với một số quần thể gà châu Á……………..……………...…................ 58 3.6. Xây dựng cây phát sinh chủng loại……..………………..….……… 60 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ....................................................................... 62 CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ................................................................ 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO……..……..……………………..…………… 65 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên NHƢ̃NG CHỮ VIẾT TẮT ATP Adenosine triphosphate bp Base pair (cặp bazơ) CJF Gà rừng Cyelon ddNTP Dideoxynucleoside triphosphate DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxynucleoside triphosphate DNase Deoxyribonuclease đtg Đồng tác giả EDTA Ethylene diamine tetra-acetic acid EtBr Ethidium bromide ETOH Ethanol GJF Gà rừng màu xám GrJF Gà rừng màu xanh mtDNA Hệ gen ty thể Nxb Nhà xuất bản PCR Polymerase Chain Reaction RJF Gà rừng đỏ RNA Ribonucleic acid RNase Ribonuclease rpm Vòng/ phút TAE Tris – acetate – EDTA Tm Nhiệt độ biến tính Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1. Thành phần phản ứng khuếch đại DNA………….……...…. 34 Bảng 3.2. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR………………………...... 35 Bảng 3.3. Các điểm đa hình trong vùng D-loop của 3 giống gà nghiên cứu............................................................................................... 51 Bảng 3.4. Sự phân bố của 71 mẫu gà nghiên cứu theo các kiểu đơn bội…………….……..………………………………….……............ 55 Bảng 3.5. Mối quan hệ di truyền giữa các giống gà nghiên cứu….……. 58 Bảng 3.6. So sánh mức độ đa dạng di truyền của gà Việt Nam với một số quần thể gà châu Á.......................................................................... 59 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1. Sơ đồ cấu trúc của ty thể................................................................. 09 Hình 1.2. Sơ đồ mtDNA gà………………………………………….……... 12 Hình 3.1. Ảnh điện di sản phẩm PCR của một số mẫu gà nghiên cứu……………….……………………………………………………... 35 Hình 3.2. So sánh trình tự vùng D-loop của 71 mẫu gà nghiên cứu với trình tự mang mã số GenBank AP003580............................................ 50 Hình 3.3. Hai đa hình phổ biến nhất của các mẫu nghiên cứu C197T và T426C…………………………………………………………………... 52 Hình 3.4. Tỷ lệ % các kiểu thay thế nucleotide của 71 mẫu nghiên cứu……………………….…………………………………………..…. 53 Hình 3.5. Tần số phân bố của các kiểu đơn bội vùng D-loop hệ gen ty thể 3 giống gà nghiên cứu……………………….…………….....….... 56 Hình 3.6. Cây phát sinh chủng loại của 3 giống gà nghiên cứu................. 60 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Gà nhà (Gallus gallus domesticus) là giống vật nuôi phổ biến nhất trên thế giới. Theo Tổ chức Lƣơng thực và Nông nghiệp Thế giới (FAO), số lƣợng gà trên toàn cầu năm 2007 ƣớc tính đạt khoảng 17 tỉ con, hơn một nửa trong số đó là ở châu Á. Đây là một trong những nguồn thực phẩm thiết yếu của con ngƣời, đặc biệt là ở những nƣớc đang phát triển, cung cấp gần nhƣ toàn bộ nhu cầu về thịt và trứng cho những vùng nông thôn hẻo lánh và khoảng 20% nhu cầu cho khu vực đô thị [31]. Ngoài mục đích làm thực phẩm, gà nhà còn đƣợc nuôi làm cảnh, chọi gà hay làm thuốc. Không những thế, gà còn là đối tƣợng đƣợc sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu y sinh [29], [59]. Trong ngành nông nghiệp nƣớc ta, chăn nuôi gà chiếm tới 72 - 73% tổng đàn gia cầm hàng năm. Năm 2006, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đã xây dựng chiến lƣợc phát triển chăn nuôi gia cầm Việt Nam giai đoạn 2006 - 2015. Theo đó, ngành chăn nuôi phải phấn đấu đến năm 2015 tăng tỷ trọng thịt gia cầm lên 32% tổng sản lƣợng thịt các loại, trong đó sản lƣợng thịt gà chiếm 88% tổng đàn gia cầm, đạt 350 triệu con, khối lƣợng thịt 1.992.000 tấn, sản lƣợng trứng 9,236 tỷ quả [3]. Để đạt đƣợc mục tiêu trên thì cần thiết phải cải thiện nguồn con giống, đồng thời phải bảo tồn và phát triển những giống gia cầm quý của địa phƣơng. Ở nƣớc ta có 27 giống gà, trong đó có tới 16 giống gà nội. Các giống gà nội nhƣ gà Ri, gà Đông Tảo, gà H’Mông, gà Tre... là các giống có phẩm chất thịt trứng thơm ngon, khả năng chịu đựng kham khổ, khả năng chống chịu bệnh tật cao, là nguồn gen quý và cần đƣợc đầu tƣ chọn tạo để nâng cao năng suất và dùng lai tạo với các giống khác để cải tiến năng suất, tạo con lai năng suất cao cung cấp con giống cho sản xuất [2], [3], [11]. Tuy nhiên, do truyền thống chăn nuôi nhỏ lẻ theo hộ gia đình, các giống gà này thƣờng đƣợc chăn thả tự do cùng với các giống gà nội khác ở các địa Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2 phƣơng, cùng với sự du nhập của vật liệu di truyền mới do việc nhập khẩu một cách ồ ạt các giống nhập ngoại nên chúng đứng trƣớc nguy cơ bị lai tạp, mất dần. Do đó, vấn đề bảo tồn nguồn gen các giống gia cầm quý là một yêu cầu bức thiết của thực tế. Nghiên cứu đa dạng di truyền các giống vật nuôi là bƣớc đầu tiên trong quy trình tiến tới mục tiêu bảo tồn, cải tiến và sử dụng nguồn giống. Ngày nay, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử thì việc nghiên cứu đa dạng di truyền đã đƣợc tiến hành ở cấp độ DNA - vật chất di truyền của sự sống. Cũng nhƣ các loài động vật có xƣơng sống khác, hệ gen của gà cũng gồm hệ gen nhân và hệ gen ty thể (mtDNA). Do kích thƣớc của hệ gen nhân là rất lớn, việc sử dụng các gen trong nhân làm đối tƣợng nghiên cứu đa dạng di truyền có một số nhƣợc điểm. Gen nhân có tần số đột biến thấp, mặt khác chúng lại đƣợc di truyền từ cả bố và mẹ và bị phân ly qua mỗi thế hệ nên việc dò tìm tổ tiên và mối quan hệ di truyền của đoạn DNA nào đó trở nên rất khó khăn. Bởi vậy, DNA ty thể với những lợi thế của mình nhƣ tần số đột biến cao, di truyền theo dòng mẹ, không tái tổ hợp, số lƣợng bản sao lớn và khá đồng nhất đã, đang và sẽ là công cụ phân tử hữu hiệu trong các nghiên cứu về di truyền quần thể và phát sinh chủng loại [15], [30], [50], [57]. Hệ gen ty thể có hai vùng chức năng chính. Vùng mã hóa chiếm tới 93% hệ gen ty thể, vùng còn lại đƣợc gọi là vùng D-loop (vùng siêu biến hay vùng điều khiển) không đƣợc dịch mã, chứa trình tự khởi đầu cho quá trình tái bản của chuỗi nặng và các trình tự điều khiển quá trình phiên mã của các gen trong vùng mã hóa. Vùng D-loop có tốc độ tiến hóa nhanh hơn nhiều so với các vùng khác của hệ gen ty thể, vì vậy nó là vùng thích hợp và có giá trị nhất trong phân tích di truyền quần thể, đặc biệt là đối với các nghiên cứu biến đổi di truyền bên trong loài [25]. Do đó, xác định và so sánh trình tự mtDNA nhất là trình tự vùng D-loop là phƣơng pháp có độ tin cậy cao đƣợc sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu di Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 3 truyền quần thể [30], [34], [36], [49]. Kể từ khi trình tự toàn bộ hệ gen ty thể gà đƣợc Desjardins và Morais (1990) công bố lần đầu tiên, việc nghiên cứu DNA ty thể gà đã và đang đƣợc phát triển tƣơng đối rộng rãi với hàng nghìn trình tự đƣợc đăng ký trên GenBank. Trình tự hệ gen ty thể đã đƣợc sử dụng thành công trong việc xác định đa dạng di truyền của các quần thể gà trên thế giới [27], [41], [46], [52]. Những dữ liệu này đã góp phần giúp hiểu rõ hơn về quá trình thuần hóa và quan hệ di truyền của các giống gà. Ở Việt Nam, việc giải mã hệ gen ty thể nhằm tìm hiểu mối quan hệ di truyền và tiến hóa giữa các giống gà vẫn còn là vấn đề mới. Các nghiên cứu về hệ gen ty thể nói chung và vùng D-loop nói riêng còn rất ít, mang tính cá thể và không đặc trƣng cho quần thể. Với mục đích góp phần vào việc giải mã hệ gen ty thể của các giống gà địa phƣơng Việt Nam và nghiên cứu mối quan hệ di truyền và tiến hóa của các giống gà, trên cơ sở phân tích trình tự vùng điều khiển (D-loop), chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu đa hình trình tự vùng điều khiển (D-loop) hệ gen ty thể của gà Ri, gà Đông Tảo và gà Tre”. 2. Mục tiêu nghiên cứu Đề tài đƣợc tiến hành với mục tiêu chính nhƣ sau: Bƣớc đầu đánh giá đa dạng di truyền và mối quan hệ di truyền của 3 giống gà Ri, Đông Tảo, Tre trên cơ sở phân tích trình tự vùng D-loop của 71 mẫu cá thể. 3. Nội dung nghiên cứu Đề tài bao gồm các nội dung chính nhƣ sau: - Khuếch đại vùng D-loop của 71 mẫu thuộc 3 giống gà Ri, Đông Tảo và Tre. - Xác định trình tự vùng D-loop. - So sánh trình tự vùng D-loop với trình tự chuẩn đã đƣợc công bố trên GenBank, phát hiện các vị trí đa hình. - Phân tích mối quan hệ di truyền giữa các giống gà nghiên cứu - Xây dựng cây phát sinh chủng loại. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 4 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. SƠ LƢỢC VỀ NGUỒN GỐC VÀ VỊ TRÍ PHÂN LOẠI GÀ NHÀ Trong hệ thống phân loại, chi Gallus gồm 4 loài gà rừng khác nhau: 1. Gà rừng đỏ G. gallus (Red junglefowl - RJF) thƣờng gặp ở Đông Dƣơng, Ấn Độ, Myanmar, Malaysia và vài nƣớc khác. 2. G. lafayetti (Lafayette's JF) ở vùng Sri Lanka, loài này còn có tên gọi là gà rừng Ceylon (Cyelon junglefowl - CJF). 3. Gà rừng màu xanh G. varius (Green junglefowl - GrJF) phổ biến ở vùng Java nên còn gọi là gà rừng Java. 4. G. sonneratii (Grey junglefowl - GJF), còn gọi là gà rừng màu xám, thƣờng gặp ở vùng rừng núi Ấn Độ. Trong 4 loài trên thì phổ biến nhất là loài gà rừng đỏ G. gallus (RJF). Hiện nay, loài này gồm 5 phân loài: G. g. gallus (Southeast Asian Red junglefowl - SE Asian RJF), G. g. spadiceus, G. g. bankiva, G. g. murghi (Indian RJF) và G. g. jabuoillei [49]. Sự phân loại này chủ yếu dựa trên các đặc điểm kiểu hình và khu vực phân bố địa lí của các quần thể. Ở Việt Nam có ba phân loài của gà rừng đỏ với số lƣợng còn tƣơng đối nhiều: G. gallus gallus (1), G. gallus jabouibi (2), G. gallus spadiceus (3). Phân loài 1: phân bố từ phía nam tỉnh Hà Tĩnh vào đến Nam Bộ. Phân loài 2: phân bố ở vùng Đông Bắc nƣớc ta. Phân loài 3: phân bố ở vùng Tây Bắc nƣớc ta [8], [10]. Trong hệ thống phân loại sinh giới, gà nhà có vị trí phân loại nhƣ sau: Giới Động vật (Animalia) Ngành Động vật có xƣơng sống (Chordata) Lớp Chim (Aves) Bộ Gà (Galiformes) Họ Trĩ (Phasianidae) Giống Gallus Loài Gallus gallus Phân loài Gallus gallus domesticus Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 5 Hiện nay, gà là một trong những vật nuôi phổ biến và đƣợc nuôi ở nhiều vùng trên toàn thế giới. Tuy nhiên nguồn gốc của gà nuôi chƣa đƣợc thống nhất và vẫn đang đƣợc tranh cãi giữa thuyết đơn nguyên và đa nguyên. Thuyết đơn nguyên cho rằng tổ tiên của tất cả các loại gia cầm là phân loài Gallus gallus gallus của gà rừng đỏ sống ở Đông Nam Á (SE Asian RJF) [26], [27]. Trong khi nhiều tác giả lại đƣa ra bằng chứng chứng tỏ rằng gà nhà có nhiều tổ tiên khác nhau theo dòng mẹ, có tới 3 phân loài của gà rừng đỏ có thể là tổ tiên trực tiếp của gà nhà gồm G. g. gallus, G. g murghi và G. g. spadiceus. Cho đến nay đã có nhiều nghiên cứu góp phần làm sáng tỏ giả thuyết này [34], [42], [43], [50]. Boruxenco (1953) và Valilop (1993) cho rằng Nam Á, Ấn Độ, Đông Dƣơng… là một trong những trung tâm châu Á đầu tiên thuần dƣỡng nhiều loài vật nuôi trong đó có gà nhà [5]. Từ các khu vực rừng nhiệt đới Đông Nam Á và Ấn Độ, gà rừng đỏ Gallus gallus đã lan rộng ra các vùng khác trên thế giới khi con ngƣời thuần hóa chúng, kết quả là tạo ra nhiều giống gà khác nhau [61]. Tiếp theo quá trình thuần hóa là các chƣơng trình chọn giống rộng rãi đã tạo ra 4 dòng gà khác biệt: lấy trứng, lấy thịt, làm cảnh và chọi gà. Trƣớc đây, Ấn Độ đƣợc coi là trung tâm của quá trình thuần hóa gà nhà. Quá trình này diễn ra tại các vùng thung lũng Ấn Độ vào khoảng năm 3200 trƣớc Công nguyên. Tuy nhiên những bằng chứng địa chất gần đây đã chỉ ra rằng quá trình này diễn ra sớm hơn rất nhiều ở đại lục Trung Quốc vào khoảng năm 6000 trƣớc Công nguyên [27], [36]. Gà đƣợc đƣa sang châu Âu vào khoảng thế kỷ XVIII - XIX và nhờ tiến bộ của công tác chọn giống, các giống gà bản địa của châu Á đã đƣợc lai tạo thành những giống cho năng suất cao hơn. Trƣớc đây, phần lớn các tác giả đều cho rằng gà đƣợc đƣa vào châu Mỹ bởi những nhà thám hiểm Tây Ban Nha hoặc Bồ Đào Nha vào khoảng năm 1500 sau Công nguyên. Một giả thuyết khác cho rằng gà đƣợc đƣa trực tiếp từ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 6 lục địa hoặc các đảo ở Đông Nam Á vào Nam Mỹ từ khoảng 3300 năm trƣớc, tuy nhiên không có bằng chứng địa chất nào làm sáng tỏ giả thuyết trên. Những nghiên cứu gần đây liên quan tới việc phân tích trình tự mtDNA gà từ các mẫu vật thời tiền sử đã góp phần làm sáng tỏ giả thuyết thứ ba cho rằng gà đƣợc đƣa vào Nam Mỹ từ quần đảo Polynesia [62], điều đó cũng cho thấy vai trò vô cùng quan trọng của trình tự vùng D-loop ty thể trong việc xác định lịch sử thuần hóa của gà nhà [34]. Ở Việt Nam, gà rừng đƣợc thuần hóa và nuôi sớm nhất ở vùng Vĩnh Phú, Hà Bắc, Hà Tây… Từ giống gà nuôi ban đầu là tiền thân của giống gà Ri hiện nay, nhân dân ta đã lai tạo đƣợc nhiều giống gà: gà Mía, gà Ác, gà Ri, gà Tre, gà Đông Tảo… 1.2. MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA CÁC GIỐNG GÀ NGHIÊN CỨU 1.2.1. Gà Ri Phân bố rộng rãi ở mọi miền đất nƣớc, trong đó phổ biến là ở miền Trung và miền Bắc. Đây là giống gà nội phổ biến nhất ở nƣớc ta, khoảng 85% giống gà địa phƣơng là gà Ri, đƣợc chăn thả ở các vùng nông thôn [11]. Gà Ri có nguồn gốc từ nhóm gà rừng Gallus gallus bankiva. Gà có ngoại hình thon nhỏ, đầu mỏ nhỏ, mào cờ đơn có răng cƣa, màu đỏ tƣơi; tích và dái tai màu đỏ, có khi xen lẫn ánh bạc trắng; cổ thanh nhỏ dài vừa phải; ngực lép, bụng thon mềm; chân có hai hàng vẩy màu vàng có khi xen lẫn màu đỏ tƣơi. Màu sắc lông có nhiều loại, gà Ri thuần chủng có màu lông vàng rơm. Gà mọc lông sớm, tốc độ mọc lông nhanh hơn gà Đông Tảo, gà Mía nên có khả năng chịu đựng tốt hơn khi nuôi ở điều kiện thời tiết lạnh [2], [6]. Gà Ri nhỏ con (trọng lƣợng sơ sinh: 23,5 - 31,8 g; 6 tuần tuổi đạt bình quân 327,6 g; 12 tuần tuổi: 824,4 - 1163,0 g; 16 tuần tuổi: 1057,4 - 1862,3 g; 19 tuần tuổi: 1192,6 - 2050,0 g), tiêu tốn thức ăn/ đơn vị tăng trọng hoặc chục quả trứng còn cao (2 tuần tuổi: 2,47 kg/ 1 kg thịt; 4 tuần tuổi: 3,68 kg/ 1 kg thịt; 6 tuần tuổi: 3,91 kg/ 1 kg thịt) [6]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 7 Gà trống lông màu đỏ thẫm là phổ biến nhất, đầu lông cánh và lông đuôi có lông đen ánh xanh, lông bụng màu đỏ nhạt hoặc vàng đất, dáng chắc khỏe, ngực vuông và mào đứng, sớm phát triển; ba tháng đã biết gáy. Gà trống trƣởng thành (một năm tuổi) cho trọng lƣợng 1,5 - 2 kg/ con [2], [6]. Gà mái phổ biến nhất là màu lông vàng rơm, vàng đất hoặc nâu nhạt, xung quanh cổ đôi khi có hàng lông đen, có đốm đen đuôi và đầu cánh, mào không phát triển. Gà mái trƣởng thành trọng lƣợng 1,2 - 1,4 kg/ con. Gà 4 - 5 tháng tuổi bắt đầu đẻ. Sức đẻ năm đầu 100 - 110 trứng, tỷ lệ đẻ không ổn định trong 1 chu kỳ đẻ, trứng nặng 40 - 45 g, vỏ màu trắng. Gà đẻ theo từng đợt 15 - 20 trứng thì nghỉ đẻ và đòi ấp. Nuôi con khéo [2]. Các nghiên cứu trƣớc đây đều cho thấy gà Ri có ƣu điểm thích nghi tốt với đặc điểm khí hậu của Việt Nam, rất dễ nuôi, thích hợp với nuôi chăn thả, không đòi hỏi kỹ thuật cao, chuồng trại thức ăn đơn giản, tận dụng thức ăn của địa phƣơng, chịu đựng tốt điều kiện thức ăn nghèo dinh dƣỡng. Gà có khả năng kiếm thức ăn ngoài tự nhiên. Thuộc loại gà lấy trứng, thịt. Thịt thơm ngon. Vốn đầu tƣ thấp, khả năng kháng bệnh cao. Nhƣợc điểm của gà Ri là tầm vóc nhỏ, tốc độ sinh trƣởng chậm, sản lƣợng trứng không cao do bản năng đòi ấp mạnh, khối lƣợng trứng nhỏ [6]. 1.2.2. Gà Đông Tảo (Ðông Cảo) Có nguồn gốc và phân bố nhiều ở thôn Đông Tảo, huyện Khóai Châu, tỉnh Hƣng Yên. Gà có đặc điểm nổi bật là dáng to, thô, đùi và ống chân rất to, ngón chân múp míp, chân có vảy thịt, mào kép, mào nụ, da màu vàng. Thân hình to, ngực sâu, lƣờn rộng, dài. Xƣơng to, dáng đi chậm chạp, nặng nề [2], [6]. Gà trống hầu hết có màu lông mận chín pha lẫn lông đen, đỉnh đuôi và cánh có màu lông đen ánh xanh. Mào kép, nụ, hoa hồng, bèo dâu. Tích và dái tai màu đỏ, kém phát triển. Thể chất khoẻ, xƣơng to, điển hình chân to cao, cơ ngực và cơ đùi phát triển. Chân to màu vàng có 3 hàng vải trở lên, xù xì, nhiều hoa dâu. Khi trƣởng thành, con trống có thể nặng tới 5 - 6 kg [2], [6]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 8 Gà mái trƣởng thành có lông màu vàng nhạt hoặc màu nâu nhạt, khối lƣợng giai đoạn trƣởng thành của gà mái là 3 - 3,5 kg. Bắt đầu đẻ lúc 160 ngày tuổi. Nếu để gà đẻ rồi tự ấp, 10 tháng đẻ 70 quả. Khối lƣợng trứng 48 - 55 g/ quả. Tính đòi ấp mạnh nhƣng ấp và nuôi con không khéo. Gà mới nở có lông trắng đục. Khối lƣợng mới nở 38 - 40 g/ con. Gà con chậm mọc lông, chậm lớn [2], [6]. Gà có tốc độ sinh trƣởng nhanh, nhƣng sinh sản (đẻ và ấp nở, nuôi con) thấp. Gà Ðông Tảo là giống gà thịt ở nƣớc ta, có khả năng sinh trƣởng nhanh, sức khỏe tốt, đây là vốn gen quí dùng để lai với các giống gà khác sẽ cho gà Broiler có năng suất cao [6]. 1.2.3. Gà Tre Giống gà địa phƣơng có lâu đời ở vùng Đông Nam Bộ. Hiện nay phân bố ở Long An, thành phố Hồ Chí Minh và một số ít tỉnh phía Bắc. Con trống có màu lông sặc sỡ: tía đen, nâu sáng, vàng chuối, đuôi và cổ đen... Lông đuôi dài, mào nụ, chân cao, săn chắc. Con mái thƣờng kém sặc sỡ hơn, có màu đen (ô), đốm hoa mơ, vàng, nâu đất, thấp chân... [2] Đặc điểm nổi bật: gà trống và mái nhỏ hơn gà Ri, con trống nặng 1,2 - 1,3 kg/ con, con mái nặng 0,8 - 0,9 kg/ con [2]. Tập tính: hay bay và đậu trên hàng rào. Nuôi làm cảnh. Mỗi năm đẻ 5 - 7 lứa, mỗi lứa đẻ 8 - 10 quả/ mái [2]. 1.3. ĐẶC ĐIỂM HỆ GEN TY THỂ VÀ VAI TRÒ CỦA D-LOOP TRONG ĐỊNH LOẠI GÀ 1.3.1. Ty thể và đặc điểm cấu trúc, cơ chế di truyền hệ gen ty thể gà 1.3.1.1. Đặc điểm cấu trúc ty thể Ty thể (hình 1.1) đƣợc mô tả lần đầu tiên bởi Altmann vào năm 1890 và sau đó, cấu trúc siêu hiển vi của ty thể đã đƣợc nghiên cứu chi tiết bởi Palade (1952) và Sjostrand (1953) [23]. Đây là bào quan có hình tròn hoặc hình trụ dài, kích thƣớc 2 - 5 m. Toàn bộ cấu trúc của ty thể đƣợc bao bọc bởi hai lớp Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 9 màng. Lớp màng ngoài bao trùm, tạo nên ranh giới ngoài của ty thể; lớp màng trong tạo thành các nếp gấp (mào - cristae) hƣớng vào tâm và là nơi khu trú của các enzyme hô hấp. Các lớp màng chia ty thể thành hai khoang riêng biệt: khoang chứa chất nền nằm bên trong ty thể và khoang gian màng nằm giữa hai lớp màng. Hình 1.1. Sơ đồ cấu trúc của ty thể Ty thể là bào quan quan trọng, có mặt trong tất cả các tế bào hô hấp hiếu khí, giữ vai trò trung tâm trong việc sản sinh năng lƣợng, trao đổi amino acid, trao đổi chất béo, trao đổi steroid và chết theo chƣơng trình của tế bào (apoptosis) [30], [40]. Nhờ chứa chuỗi truyền điện tử, các enzyme của chu trình Krebs và phosphoryl hóa, ty thể thực hiện quá trình oxy hóa các carbohydrate, các acid béo, các amino acid… giải phóng ra năng lƣợng dƣới dạng các liên kết phosphate cao năng trong phân tử ATP. Đây là dạng năng lƣợng cần thiết cho mọi hoạt động sống của tế bào. 1.3.1.2. Cấu trúc hệ gen ty thể gà Ở động vật, ngoài hệ gen trong nhân còn có hệ gen tế bào chất nằm trong ty thể chiếm tỉ lệ từ 1 - 5% DNA của tế bào. Kích thƣớc của hệ gen ty thể (mtDNA) ở phần lớn động vật có xƣơng sống vào khoảng 16,8 kb, tuy Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 10 nhiên có thể sai khác đôi chút do có những đoạn chèn vào, hoặc do mất đoạn, hoặc có những trình tự lặp lại nối tiếp. Kích thƣớc mtDNA gà là 16.775 bp [22]. Ngƣời ta đã đƣa ra nhiều giả thuyết về nguồn gốc tiến hóa của hệ gen ty thể. Giả thuyết đƣợc chấp nhận rộng rãi nhất là hệ gen ty thể là dấu vết còn lại của hệ gen vi khuẩn cổ, sống cộng sinh bên trong tế bào sinh vật nhân chuẩn. Mỗi ty thể có từ 2 đến 10 bản sao của DNA và bởi vì mỗi tế bào chứa từ hàng trăm đến hàng triệu ty thể nên số lƣợng DNA ty thể là rất lớn. Trong tế bào trứng động vật có xƣơng sống, ƣớc tính con số này lên đến 108. Với số lƣợng bản sao lớn nhƣ vậy nên có thể thu đƣợc DNA ty thể có giá trị cho các phân tích quan hệ di truyền từ một số lƣợng ít tế bào. DNA ty thể có các đặc điểm cơ bản sau: - Tốc độ đột biến lớn gấp 5 - 10 lần so với hệ gen nhân [18]. - Số lƣợng bản sao lớn [34], [47], [57]. - Đơn bội, hầu nhƣ không có sự tái tổ hợp [32], [47], [57]. - Di truyền theo dòng mẹ ở phần lớn các loài [15], [32] [34], [47]. Phân tử mtDNA có tốc độ tiến hóa nhanh hơn 5 - 10 lần so với các gen nhân do cơ chế sửa chữa tái bản DNA không hiệu quả do đó dẫn đến nhiều biến dị trong ty thể, không chỉ giữa các loài mà còn cả trong một loài. Bên cạnh đó, các biến dị này không giống nhau giữa các ty thể trong cùng một tế bào và giữa các tế bào khác nhau. MtDNA có đặc điểm đơn bội, không tái tổ hợp, di truyền theo dòng mẹ, điều đó có nghĩa là mỗi phân tử cũng nhƣ toàn bộ mtDNA thƣờng chỉ có một lịch sử phả hệ theo dòng mẹ. Thêm vào đó mtDNA tồn tại với số lƣợng bản sao lớn trong mỗi tế bào. Các đặc điểm trên cùng với việc mtDNA bền vững hơn DNA nhân trong khi tách chiết do có cấu trúc dạng vòng [33], nên sử dụng mtDNA nhƣ là một công cụ phân tử trong việc phân tích các mối quan hệ tiến hóa và biến đổi di truyền trong loài và giữa các loài có nhiều thuận lợi [28], [30], [45], [49], [50]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 11 Hệ gen ty thể là phân tử DNA trần, kép, mạch vòng, gồm hai chuỗi: chuỗi nặng (H strand) giàu guanine và chuỗi nhẹ (L strand) giàu cytosine. Khác với DNA nhân, mtDNA không liên kết với protein histon, điều này làm cho mtDNA tƣơng tự với DNA của vi khuẩn. Hệ gen ty thể gà mang những đặc trƣng của hệ gen ty thể động vật có xƣơng sống và có độ tƣơng đồng rất cao khi so sánh với mtDNA của lƣỡng cƣ và động vật có vú, tức là cũng gồm hai vùng là vùng mã hóa và vùng điều khiển (D-loop). Vùng không mã hóa chiếm khoảng 7% mtDNA, chứa điểm khởi đầu sao chép của chuỗi nặng (OH) và các promoter phiên mã của chuỗi nặng và chuỗi nhẹ (PH và PL), khoảng 90% phần DNA không mã hóa của ty thể nằm trong vùng này. Vùng mã hóa chứa 37 gen và không có khoảng trống giữa các gen, mã hóa cho 13 polypeptide, 2 rRNA và 22 tRNA [20], [38]. Trong đó, chuỗi nặng chứa 12 trong 13 gen mã hóa polypeptide (trừ một tiểu phần ND6 của phức hệ I là đƣợc phiên mã từ chuỗi nhẹ), 14 trong số 22 gen tRNA và cả hai gen rRNA (12S và 16S). 13 chuỗi polypeptide đƣợc mã hóa bởi DNA ty thể là thành phần của phức hệ hô hấp của ty thể, trong đó có 7 tiểu phần (ND1, 2, 3, 4L, 4, 5, 6) trong số 46 chuỗi polypepetide của phức hệ I (NADH dehydrogenase), 1 tiểu phần (cytochrome b - Cytb) trong số 11 chuỗi polypeptide của phức hệ III (Phức hệ bc1), 3 tiểu phần (CO I, II, III) trong số 13 polypeptide của phức hệ IV (cytochrome c oxidase) và 2 tiểu phần (ATPase 6 và 8) trong số 16 polypeptide của phức hệ V (ATP synthase) [24]. Còn tất cả các protein khác của ty thể bao gồm tất cả 4 tiểu đơn vị của phức hệ II (succinate dehydrogenase), tiểu đơn vị DNA polymerase  của ty thể, các thành phần của RNA polymerase của ty thể, yếu tố phiên mã của ty thể (mtTFA), các protein ribosome của ty thể, các yếu tố kéo dài chuỗi và các enzyme trao đổi chất của ty thể đều đƣợc mã hóa bởi DNA nhân [60]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 12 Đáng chú ý là trật tự sắp xếp của các gen trong phân tử DNA dạng vòng có thể không giống nhau giữa các loài, điều này đƣợc thể hiện rõ khi so sánh trình tự genome ty thể các taxon bậc bộ trở lên. Vì thế, các đặc điểm về trật tự các gen trên ty thể có triển vọng đƣợc sử dụng nhƣ một dấu hiệu phân loại đối với các taxon bậc cao [43]. Một số gen mã hóa protein hoặc tRNA có khung đọc nằm gối lên nhau một phần (overlapping gene). Ngoài các đặc điểm trên, hệ gen ty thể gà có một số đặc điểm đáng chú ý, khác biệt với lớp thú và lƣỡng cƣ [22]: - Thứ nhất, theo chiều 5’ - 3’ của chuỗi nhẹ từ gen ND5 đến vùng D-loop là các gen Cyt b, tRNA Thr , tRNA Pro , ND6 và tRNA Glu, trong khi ở các động vật khác, gen Cyt b lại nằm gần hơn với vùng điều khiển. Trật tự này đƣợc bảo toàn trong các loài thuộc bộ gà (Galliformes). - Thứ hai, một điểm khởi đầu sao chép của chuỗi nhẹ tƣơng đƣơng với trình tự nằm giữa hai gen tRNACys và tRNAAsn đều có ở tất cả động vật có xƣơng sống đã đƣợc giải trình tự genome ty thể, riêng ở gà không có đặc điểm này. - Thứ ba, gen COI (cytochrome oxydase I) có mã khởi đầu là GTG thay vì ATG. Sơ đồ chi tiết của hệ gen ty thể gà đƣợc trình bày ở hình 1.2. Hình 1.2. Sơ đồ mtDNA gà Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 13 1.3.1.3. Cơ chế di truyền của mtDNA MtDNA đƣợc di truyền theo dòng mẹ thông qua tế bào chất của noãn bào [34], [40]. Trong quá trình hình thành hợp tử, tinh trùng cung cấp cho trứng genome nhân của nó, không cung cấp hoặc đóng góp rất ít tế bào chất, mtDNA vào hợp tử. Kết quả là hầu nhƣ tất cả ty thể trong phôi đều có nguồn gốc từ trứng. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng tinh trùng bị loại bỏ ngay sau khi vào trứng. Một số cơ chế đƣợc đƣa ra nhằm giải thích hiện tƣợng thú vị này đó là: (1) do sự phân hủy protein phụ thuộc ubiquitin, (2) do hiện tƣợng pha loãng, phân hủy mtDNA của tinh trùng, (3) do sự khác nhau về trao đổi chất giữa hợp tử và tinh trùng. Tuy nhiên, những cơ chế này vẫn chƣa phải là những lời giải thích thoả đáng và thật sự thuyết phục. DNA ty thể đƣợc sao chép từ hai điểm khởi đầu. Sự tái bản DNA bắt đầu từ OH sử dụng một primer RNA tổng hợp từ bản mã sao của chuỗi nhẹ. Tổng hợp chuỗi nặng đƣợc tiếp tục cho tới hai phần ba vòng của của phân tử mtDNA, chuỗi mới sẽ thay thế chuỗi nặng ban đầu cho đến khi nó tìm đƣợc điểm khởi đầu của chuỗi nhẹ (OL). Khi đƣợc bộc lộ ra trên chuỗi nặng đã thay thế, OL cuộn thành cấu trúc vòng móc (stem - loop) và sự tổng hợp chuỗi nhẹ bắt đầu, tiếp tục quay trở lại dọc theo sợi khuôn H. Năm 2005, Reyes và đồng tác giả (đtg) [53] khi nghiên cứu quá trình tái bản ở mtDNA gà đã đề xuất rằng phần lớn hệ gen ty thể gà (thậm chí toàn bộ mtDNA) đều có các điểm khởi đầu cho quá trình tổng hợp DNA nhƣng các điểm này tập trung nhiều nhất ở khu vực gần vùng D-loop, đặc biệt là ở gen ND6. Phiên mã của mtDNA đƣợc khởi đầu từ 2 promoter trong vùng D-loop. Quá trình phiên mã bắt đầu từ cả 2 promoter (PH, PL) trong vùng D-loop và liên tục theo mạch vòng của phân tử DNA. Hai sợi phiên mã theo 2 chiều ngƣợc nhau quanh một vòng để hình thành những phân tử RNA polycistronic. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 14 Các tRNA đƣợc tạo thành nhờ ngắt quãng các trình tự dài hơn của rRNA và mRNA, sau đó chúng đƣợc cuộn xoắn trong các bản phiên mã và đƣợc phân cắt. Các mRNA và rRNA tự do đƣợc polyadenyl hóa sau phiên mã và tRNA đƣợc biến đổi thêm CCA vào đầu cuối 3' [21], [58]. 1.3.2. Cấu trúc và vai trò của vùng D-loop trong đánh giá đa dạng di truyền Phân loại học cổ điển trên các đối tƣợng thuộc bộ Gà chủ yếu dựa vào các đặc điểm bộ lông bên ngoài của con trống, đó là những đặc điểm sinh dục thứ cấp. Những đặc điểm này mang một tiềm năng biến đổi nhanh chóng qua các thế hệ nên không đƣợc coi là cơ sở chính xác để xác định quan hệ tiến hóa giữa các loài. Chính vì vậy, các nhà nghiên cứu đã tìm đến những đặc điểm có thể bộc lộ mức độ biến đổi phù hợp hơn cho việc phân tích quan hệ tiến hóa và phát sinh chủng loại ở các loài. Khi đó, mtDNA và đặc biệt là vùng D-loop với những ƣu điểm nổi bật đã đƣợc chọn làm đối tƣợng nghiên cứu. Thuật ngữ D-loop đƣợc dùng để chỉ một vùng có chức năng điều khiển nằm trong mtDNA. Đây là vùng không mã hóa duy nhất trong DNA ty thể và cũng là vùng liên quan đến sự mở đầu tái bản của mtDNA. Ở gà nhà, vùng này có kích thƣớc 1227 bp [26], nó chứa điểm khởi đầu sao chép và các promoter cho quá trình phiên mã của cả chuỗi nặng và chuỗi nhẹ. Về mặt cấu trúc, D-loop của gia cầm có thể đƣợc chia thành ba vùng chính là vùng ngoại biên I và III có khả năng biến đổi cao và vùng II là vùng trung tâm ít biến đổi [55]. Vùng I nằm ở đầu 5' vùng điều khiển, kích thƣớc khoảng 400 bp, vùng này chứa chuỗi cytosine (C-stretch), đó là một chuỗi trình tự gồm toàn nucleotide cytosine; chuỗi C là đặc điểm đặc trƣng cho đầu 5' của vùng điều khiển hệ gen ty thể của nhiều họ trong lớp Chim. Vùng I còn chứa trình tự kết thúc quá trình tái bản hệ gen ty thể (TAS) là hộp TATAT hoặc TACAT. Vùng II bảo thủ nhất có chứa một số đơn vị cấu trúc mà trình tự sắp xếp của chúng không Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 15 thay đổi ngay cả ở bậc phân loại họ, vùng này chứa các cụm trình tự bảo thủ (hộp F, E, D, C và BSB) [19], [54]. Trong phần giữa của hộp E và hộp D có những trình tự ngắn (Rebox và Mt-3) tƣơng ứng với các trình tự có khả năng bám vào các nhân tố phiên mã trong nhân mà có liên quan tới việc điều chỉnh phản ứng oxy hóa phosphoryl hóa. Vùng II kích thƣớc khoảng 500 bp, vùng này có tốc độ tiến hóa chậm hơn so với vùng I và vùng III từ 10 - 20 lần [35]. Thông thƣờng, vùng thứ III là vùng biến đổi nhiều nhất và có trình tự giống với động vật có vú. Vùng này nằm ở đầu 3' của vùng điều khiển, kích thƣớc khoảng 350 bp và bắt đầu với cụm trình tự bảo thủ 1 (Conserved Sequence Block - CSB-1). Yếu tố phiên mã của ty thể có thể bám vào trình tự này và chuyển mtDNA từ quá trình phiên mã sang quá trình tái bản khi một yếu tố khác kết hợp vào phức hệ mtTFA - CSB-1 [51]. Vùng này còn chứa Promoter định hƣớng hai chiều cho quá trình phiên mã nằm giữa CBS-1 và trình tự lặp lại cuối cùng của hệ gen ty thể [39]. Hiện tƣợng mất đoạn hoặc chèn đoạn thƣờng tập trung chủ yếu ở phần cuối của vùng III ảnh hƣởng đến kích thƣớc vùng điều khiển cũng nhƣ mtDNA. Phần lớn các biến đổi tập trung ở vùng I và vùng III nên trình tự nucleotide của chúng thƣờng đƣợc phân tích để xác định các kiểu đơn bội trong vùng điều khiển [64]. Phân tích mtDNA trở thành một công cụ hữu hiệu trong việc tìm hiểu sự tiến hóa của loài do những đặc tính riêng biệt của nó nhƣ số lƣợng bản sao lớn, không tái tổ hợp, tỷ lệ đột biến cao và di truyền gần nhƣ tuyệt đối theo dòng mẹ. Các vùng khác nhau của mtDNA tiến hóa với các tỷ lệ khác nhau [55], trong đó vùng D-loop có tốc độ tiến hóa nhanh hơn từ 3 đến 10 lần so với các vùng khác của hệ gen ty thể [17]. Điều này làm cho nó đặc biệt có ý nghĩa trong các phân tích chủng loại phát sinh [14], [17]. Phần lớn các nghiên cứu về mối quan hệ di truyền đều căn cứ vào trình tự vùng D-loop thông qua việc phân tích các đa hình nucleotide đơn (SNP - single nucleotide polymorphism). Đây là những nghiên cứu phức tạp do tỷ lệ thay thế rất khác Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 16 nhau giữa các vị trí. Qua đó đƣa ra các dữ liệu phù hợp với sự đánh giá tỷ lệ đột biến và tính toán đƣợc thời gian của các sự kiện tiến hóa. Thông tin thu đƣợc từ việc nghiên cứu sự đa dạng trình tự vùng D-loop cũng nhƣ vùng mã hóa của mtDNA rất hữu ích trong việc phân tích các đột biến gây bệnh, xây dựng cây phát sinh chủng loại và mô tả lại sự di cƣ của các quần thể. Nhƣ vậy, các gen trong hệ gen ty thể và vùng D-loop đóng một vai trò vô cùng quan trọng trong các nghiên cứu thuộc lĩnh vực phân loại phân tử. Chính vì thế mà DNA ty thể đƣợc coi là một công cụ không thể bỏ qua khi tìm hiểu về mối quan hệ phát sinh chủng loại hay sự tiến hóa của các quần thể. 1.4. MỘT SỐ THÀNH TỰU VỀ ĐỊNH LOẠI PHÂN TỬ DỰA TRÊN GIẢI TRÌNH TỰ VÙNG D-LOOP TY THỂ TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 1.4.1. Các nghiên cứu trên thế giới Kể từ năm 1990, khi trình tự toàn bộ hệ gen ty thể gà đƣợc công bố lần đầu tiên, việc nghiên cứu DNA ty thể gà đã và đang đƣợc phát triển tƣơng đối rộng rãi với hàng nghìn trình tự đƣợc đăng ký trên GenBank. Trình tự hệ gen ty thể đã đƣợc sử dụng thành công trong việc xác định đa dạng di truyền của các quần thể gà trên thế giới. Những dữ liệu này đã góp phần giúp hiểu rõ hơn về quá trình thuần hóa và quan hệ di truyền của các giống gà. Dƣới đây là một vài nghiên cứu cụ thể đƣợc tiến hành trên một số loài thuộc bộ Gà (Galliformes). Trình tự toàn bộ hệ gen ty thể gà đã đƣợc Desjardins và Morais công bố năm 1990 [22]. Nó cho thấy có sự tƣơng đồng rất lớn khi so sánh với mtDNA của các động vật có xƣơng sống khác. Các gen mã hóa protein rất giống với các gen tƣơng ứng ở động vật có vú và lƣỡng cƣ, chúng đều sử dụng các mã di truyền giống nhau trong quá trình dịch mã. Guanine thƣờng vắng mặt ở vị trí thứ ba của các mã di truyền. Nhiều gen gối nhau và nhiều gen tận cùng với bộ ba kết thúc không hoàn chỉnh gồm toàn adenine. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 17 Năm 2002, tổng số 539 nucleotide đầu tiên của vùng D-loop ty thể của 5 giống gà địa phƣơng (Gallus gallus domesticus) ở tỉnh Zhejiang (Trung Quốc) và gà White Leghorn đã đƣợc giải trình tự và so sánh với gà rừng đỏ (Gallus gallus), gà rừng xám (Gallus sonneratii), gà rừng xanh (Gallus varius) và gà rừng Lafayettei (Gallus lafayettei) đã đƣợc đăng ký trên GenBank. Cây chủng loại phát sinh cho những mẫu gà này đã đƣợc xây dựng dựa trên trình tự của vùng D-loop. Kết quả cho thấy có 4 loài của chi Gallus có những sự khác biệt rất lớn với nhau, gà nhà G. g. domesticus có quan hệ họ hàng gần gũi nhất với gà rừng đỏ ở Thái Lan và những vùng giáp với nƣớc này. Từ đó các nhà khoa học cho rằng gà nhà Trung Quốc có lẽ có dạng tổ tiên trong các khu vực này [49]. Ở Nhật Bản, có một nhóm gà chọi đặc biệt có tên là Shamo. Tuy nhiên, quá trình mở rộng khu phân bố của loại gà này ở Nhật Bản nhìn chung còn chƣa đƣợc biết rõ. Năm 2003, Komiyama và đtg [37] đã tiến hành nghiên cứu về tiến hóa ở mức phân tử của gà chọi để có đƣợc những đánh giá sâu hơn không chỉ về khởi nguồn tiến hóa của Shamo mà còn của cả văn hóa chọi gà. Trong nghiên cứu này đã sử dụng các mẫu máu của gà chọi từ 11 chủng Shamo khác nhau. Tiếp đó, cây chủng loại phát sinh đƣợc xây dựng bằng việc sử dụng tổng số 42 trình tự vùng D-loop. Kết quả cho thấy gà Shamo đƣợc tách biệt rõ thành hai nhóm khác nhau: một nhóm gồm các mẫu từ đảo Okinawa và nhóm thứ hai gồm các mẫu từ Kyushu và Honshu. Điều đó có nghĩa là gà Shamo phải đƣợc mang vào Nhật Bản từ hai dạng tổ tiên khác nhau. Những điều tra về lịch sử của gà Shamo đã cho thấy những phân tích chủng loại phát sinh là phù hợp với quan điểm cho rằng gà Shamo có tổ tiên độc lập từ khu vực Đông Nam Á và lục địa Trung Quốc, nhƣng sau đó đã bị tạp giao ít nhiều về phƣơng diện địa lý. Những con gà có tiếng gáy dài thƣờng đƣợc ƣa chuộng trên khắp thế giới và những ngƣời am hiểu vật nuôi đã giữ lại các giống gà có đặc điểm Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 18 này. Ở Nhật Bản có 3 giống gà Naganakidori rất đặc biệt đƣợc nuôi để phát triển tiếng gáy dài khác thƣờng tới trên 15 giây. Nhằm làm sáng tỏ quá trình thuần hóa và nguồn gốc phát sinh của chúng, năm 2004, vùng D-loop ty thể gà Naganakidori đã đƣợc giải trình tự. Các mẫu máu của 9 con gà có tiếng gáy dài và 74 con gà từ 11 giống gà địa phƣơng đã đƣợc thu thập. Dữ liệu về trình tự DNA của 2 loài gà rừng cũng đã đƣợc thu thập từ GenBank. Tiếp theo, cây chủng loại phát sinh đã đƣợc thiết lập, kết quả cho thấy cả 3 giống gà Naganakidori đều có tổ tiên chung từ gà chọi Shamo bất chấp việc chúng có nhiều đặc điểm khác nhau rõ rệt và thú vui nuôi gà có tiếng gáy dài có thể đã đƣợc đến trƣớc bởi thú chơi gà chọi. Hơn nữa, những chủng gà này lần đầu tiên tách biệt khỏi gà chọi ở đảo Okinawa, nơi có vị trí gần với miền Nam Trung Quốc và Đông Dƣơng hơn so với lục địa Nhật Bản (Honshu/ Kyushu). Điều này cho thấy rằng có thể tổ tiên của những con gà có tiếng gáy dài lần đầu tiên đƣợc mang vào lục địa Nhật Bản qua đảo Okinawa là những con gà chọi từ các khu vực xung quanh ở miền Nam Trung Quốc hoặc Đông Dƣơng [36]. Năm 2005, Nishibori và đtg (Nhật Bản) [48] đã xây dựng cây chủng loại phát sinh của các loài gà thuộc chi Gallus dựa trên phân tích trình tự D-loop ty thể và dùng nó để chứng minh cho giả thuyết rằng gà rừng đỏ (Red junglefowl - RJF) là tổ tiên trực tiếp của gà nhà. Vị trí chủng loại phát sinh của gà nhà và các loài gà khác thuộc chi Gallus là rất quan trọng khi có ý định gìn giữ và cải tiến các giống gà bằng chuyển gen từ hệ gen của các chủng hoang dã. Các phân tích chủng loại phát sinh dựa trên trình tự mtDNA đã khám phá ra rằng hai chủng gà rừng xám (GJF) là cùng một nhánh với gà rừng đỏ (RJF) và gà nhà và chỉ có một chủng gà rừng xám nằm ở vị trí xa hơn cùng với gà rừng Cyelon (CJF). Quá trình thuần hóa của gà đƣợc tin rằng đã diễn ra ở Nam Á, đặc biệt là châu thổ Ấn Độ. Tuy nhiên, trong các nghiên cứu trƣớc đó lại không bao gồm Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 19 gà rừng đỏ Ấn Độ Gallus gallus murghi (RJF), do đó đã tạo ra một khoảng trống lớn về mối quan hệ di truyền với nhóm này. Tháng 6 năm 2008, Kanginakudru và đtg [34] đã công bố kết quả nghiên cứu bổ sung vấn đề này nhờ việc phân tích 76 mẫu gà Ấn Độ bao gồm 56 gà rừng đỏ G. g. murghi (RJF), 16 gà nhà G. g. domesticus và 4 gà rừng xám G. sonneratii (GJF) có sử dụng cả các marker vi vệ tinh và trình tự vùng D-loop ty thể gà. Các nhà khoa học cũng đã so sánh trình tự vùng D-loop của các loại gà này với 779 trình tự thu thập đƣợc từ GenBank. Các kết quả chỉ ra rằng sự thuần hóa của gà đã diễn ra một cách độc lập trong các địa phƣơng khác nhau của châu Á trong đó có Ấn Độ. Các tác giả cũng đã phát hiện ra bằng chứng về sự thuần hóa của gà Ấn Độ từ G. g. spadiceus và G. g. gallus cũng nhƣ từ G. g. murghi, qua đó đã củng cố thêm các dữ liệu về nguồn gốc đa dạng của gà nhà Ấn Độ và các loại gà nhà khác. Trƣớc đây có giả thuyết cho rằng gà đƣợc đƣa vào châu Mỹ bởi những nhà thám hiểm Tây Ban Nha hoặc Bồ Đào Nha vào khoảng năm 1500 sau Công nguyên. Một giả thuyết khác cho rằng gà đƣợc đƣa trực tiếp từ lục địa hoặc các đảo ở Đông Nam Á vào Nam Mỹ từ khoảng 3300 năm trƣớc. Tuy nhiên, những nghiên cứu gần đây liên quan tới việc phân tích trình tự mtDNA gà từ các mẫu vật thời tiền sử đã góp phần làm sáng tỏ giả thuyết thứ ba cho rằng gà đƣợc đƣa vào Nam Mỹ từ quần đảo Polynesia [62]. Năm 2008, Muchadevi và đtg (Zimbawean) [46] khi nghiên cứu đa hình trình tự đoạn 440 bp vùng D-loop hệ gen ty thể của 283 mẫu gà thuộc 14 quần thể đã đề xuất rằng gà Zimbawean bắt nguồn từ hai khu vực là Đông Nam Á và Ấn Độ. Cùng năm 2008, Razafindraibe và đtg [52] đã giải trình tự đoạn siêu biến I của vùng D-loop hệ gen ty thể 77 mẫu gà bản địa Madagascar. Khi so sánh với các trình tự tƣơng ứng của gà châu Phi và gà châu Á các tác giả đã kết luận rằng gà Madagascar có hai nguồn gốc tách biệt, trong đó có một dạng tổ tiên từ Indonesia. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 20 1.4.2. Các nghiên cứu ở Việt Nam Ở Việt Nam, các nghiên cứu về hệ gen ty thể gà nói chung và vùng D-loop nói riêng còn rất ít, phần lớn mang tính cá thể và không đặc trƣng cho quần thể. Mục đích chủ yếu của các nghiên cứu này là tìm hiểu đa hình trình tự nucleotide ở một vài cá thể. Năm 1997, trình tự 641 nucleotide đầu tiên của vùng D-loop 3 mẫu gà Việt Nam (1 mẫu gà nhà và 2 mẫu gà rừng đỏ phân loài G. g. gallus) đã đƣợc Miyake (Nhật Bản) xác định [44]. Đây là tác giả nƣớc ngoài đầu tiên tiến hành nghiên cứu đa hình trình tự vùng D-loop trên đối tƣợng gà Việt Nam, các trình tự này sau đó đƣợc đăng ký trên GenBank với các mã số là AB009435 (G. gallus domesticus), AB009434 (G. gallus gallus) và AB009449 (G. gallus gallus). Năm 1999, Kim Thị Phƣơng Oanh và đtg [9] đã nghiên cứu về sự khác biệt ở ba loài thuộc giống gà Lôi: gà Lôi lam đuôi trắng Hà Tĩnh (Lophura hatinhensis), Trĩ bạc (L. nycthemera) và gà Lôi lông tía (L. diardi). Tác giả đã chỉ ra sự thay đổi nucleotide trên vùng D-loop ty thể của chúng dựa trên vị trí nhận biết của các enzyme giới hạn SmaI và EcoRI. Năm 2000, Nguyễn Hải Hà và đtg [4] sử dụng cặp mồi H1255 và L16725 đã nhân đƣợc đoạn D-loop có kích thƣớc 1,3 kb từ DNA genome của 2 mẫu gà Lôi lam đuôi trắng (Lophura hatinhensis) và gà Lôi lam mào trắng (Lophura edwardsi), sau đó gắn thành công vùng D-loop ty thể của 2 cá thể này vào vector pBluescript KS (-) để chuẩn bị cho việc tiến hành phân tích trình tự nucleotide vùng D-loop để nhằm so sánh quan hệ di truyền giữa 2 loài. Năm 2007, Lê Đức Long và đtg [7] đã giải trình tự vùng D-loop gồm 1227 nucleotide của 3 cá thể gà Mông có nguồn gốc từ Điện Biên, Hà Giang và Yên Bái đƣợc nuôi tại trại gà Nông lâm Thái Nguyên theo dự án gà sạch, qua đó đã xác định đƣợc 10 vị trí khác biệt về nucleotide giữa các đại diện của 3 mẫu gà nghiên cứu. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 21 Năm 2008, Bùi Thị Kiều Vân và đtg [12] đã xác định trình tự vùng D-loop gồm 1220 nucleotide của 2 mẫu gà Ri và gà Mông, phát hiện đƣợc 16 điểm đa hình/ đột biến về nucleotide khi so sánh với trình tự gà White Leghorn gốc Nhật Bản mang mã số AB114078 trên GenBank. Năm 2008, Nguyễn Đăng Tôn và đtg [47] đã xác định trình tự 300 nucleotide từ vị trí 131 đến vị trí 430 của 80 mẫu thuộc 4 giống gà Ri, Tre, Chọi và Tàu Vàng (mỗi giống 20 mẫu), qua đó xác định đƣợc 21 vị trí đa hình nucleotide. Năm 2009, Berthouly và đtg [16] đã sử dụng 30 marker vi vệ tinh trên 1082 mẫu gà để nghiên cứu về cấu trúc di truyền của quần thể gà H’mong thuộc tỉnh Hà Giang và đƣa ra bằng chứng di truyền về hiện tƣợng tạp giao của nhóm gà này với gà rừng G. gallus. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng kỹ thuật PCR để nhân vùng điều khiển D-loop của 71 mẫu cá thể gà địa phƣơng Việt Nam thuộc 3 giống gà Ri, Đông Tảo và Tre (các cá thể này không bao gồm 40 cá thể gà Ri và gà Tre đã sử dụng trong nghiên cứu của Nguyễn Đăng Tôn và đtg), sau đó sản phẩm PCR sẽ đƣợc dùng để giải trình tự tự động. Các số liệu đa hình thu đƣợc về vùng điều khiển D-loop của 3 giống gà Ri, Đông Tảo và Tre sẽ đƣợc so sánh với trình tự chuẩn AP003580 đã đƣợc công bố trên GenBank, từ đó phân loại các mẫu này vào các kiểu đơn bội khác nhau. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 22 Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. VẬT LIỆU VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 2.1.1. Nguyên liệu Nguyên liệu sử dụng trong đề tài này là 71 mẫu DNA tổng số gồm 31 mẫu gà Ri (Hà Nội), 22 mẫu gà Đông Tảo (Hƣng Yên), 18 mẫu gà Tre (Long An), các mẫu DNA này do viện Chăn nuôi, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn cung cấp. 2.1.2. Thiết bị Các thiết bị đƣợc sử dụng thuộc Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Gen, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, bao gồm: - Máy PCR PTC-100 (MJ Research, Inc., Mỹ), GeneAmp PCR System 9700 (ABI, Mỹ). - Máy xác định trình tự tự động ABI PRISMTM 3100 Genetic Analyzer (ABI, Mỹ). - Pipetman các loại (Gilson, Pháp). - Bể điện di PowerPac 300 (Bio-Rad, Mỹ) - Bể ổn nhiệt (Tempette Junior Techne). - Máy khuấy trộn Vortex (OSI Rotolab). - Cân phân tích (Mettler Toledo, Thụy Sỹ). - Lò vi sóng (Sharp, Nhật Bản). - Máy chụp ảnh (Bio-Rad, Mỹ). - Máy làm khô chân không (Automatic Environmental Speed-Vac System, AES 1010, Savant, Mỹ). - Máy ly tâm lạnh (Biofuge, Sorvall). - Máy li tâm Eppendorf 5415C (Eppendorf, CHLB Đức). - Tủ lạnh sâu -20oC, -80C (Sanyo, Nhật Bản). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 23 2.1.3. Hóa chất Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu này đƣợc nhập khẩu từ các hãng Fermentas, Sigma Aldrich, Promega… Các hóa chất này gồm có: - Bộ hóa chất dùng cho PCR: đệm, MgCl2, dNTPs, Taq DNA polymerase… của hãng Fermentas. - Cặp mồi H1255 và L16725 đƣợc đặt tổng hợp tại hãng Invitrogen. + H1255: 5’- CAT CTT GGC ATC TTC AGT GCC -3’ + L16725: 5’- AGG ACT ACG GCT TGA AAG C -3’ - Hóa chất chạy điện di: + Agarose. + Dung dịch đệm TAE (Tris-acetate-EDTA) 1X. + Thang DNA chuẩn. + Dung dịch đệm tra mẫu: Glycerol 20%; Tris-Cl 0,1 M (pH = 8); EDTA 0,01 M (pH = 8); bromophenol blue 0,25%. + Dung dịch nhuộm gel ethidium bromide (EtBr). - Bộ hóa chất thôi gel: Kit Wizard SV gel and PCR Clean - up System của hãng Promega:  Dung dịch MBS (Membrane Binding Solution).  Dung dịch MWS (Membrane Wash Solution) có bổ sung ethanol 95%. - BigDye  Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit của hãng Applied BioSystems (ABI, Mỹ) phục vụ cho giải trình tự vùng D-loop. - Ethanol 100% và 70%. - Nƣớc khử ion vô trùng. 2.1.4. Địa điểm nghiên cứu Đề tài đƣợc thực hiện tại Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Gen, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 24 2.2. CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Chúng tôi sử dụng cặp mồi đặc hiệu H1255 và L16725 để nhân vùng điều khiển D-loop của DNA ty thể từ các mẫu DNA tổng số. Sản phẩm PCR đƣợc điện di trên gel agarose 0,8% và tinh sạch để đọc trình tự trực tiếp. Kết quả đọc trình tự đƣợc xử lý, phân tích bằng các phần mềm chuyên dụng. Các phƣơng pháp sử dụng đƣợc trình bày sau đây. 2.2.1. Điện di trên gel agarose Nguyên tắc chung: Điện di là kỹ thuật đƣợc sử dụng trong thí nghiệm để phân tích các đại phân tử tích điện. Trong phòng thí nghiệm sinh học phân tử, ngƣời ta thƣờng sử dụng phƣơng pháp điện di để tách ly, phát hiện phân tử DNA nguyên vẹn, DNA bị cắt hạn chế và DNA sản phẩm của PCR [13]. Kỹ thuật này dựa trên một đặc tính cơ bản của nucleic acid là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt (ở pH = 7) do sự có mặt của gốc PO4 3- . Do đó, khi đặt nucleic acid trong điện trƣờng với cƣờng độ và hiệu điện thế thích hợp, chúng sẽ dịch chuyển qua bản gel từ cực âm (cathode) sang cực dƣơng (anode). Trên cùng một bản gel, với cùng một cƣờng độ dòng điện, những phân tử DNA khác nhau về trọng lƣợng nên khác nhau về điện tích và chạy đƣợc những quãng đƣờng khác nhau sau cùng một khoảng thời gian. Gel đƣợc sử dụng trong kỹ thuật điện di có thể là gel agarose hoặc polyacrylamide. Sau khi phân tách bằng điện di, để phát hiện phân tử DNA, ngƣời ta dùng phƣơng pháp làm hiện hình. Đối với gel agarose, ngƣời ta nhuộm bằng EtBr. Chất này sẽ gắn xen vào các base của phân tử DNA và phát quang dƣới tia tử ngoại. Nhƣ vậy cho phép dễ dàng phát hiện vị trí các đoạn DNA trên gel và có thể phân biệt đƣợc phân tử DNA trên cùng một bảng gel. Đối với gel polyacrylamide, các phân tử thƣờng đƣợc đánh dấu bằng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 25 đồng vị phóng xạ và vị trí của chúng trên bản gel sẽ đƣợc phát hiện bằng kỹ thuật phóng xạ tự ghi [13]. Trong điện di, ngƣời ta sử dụng thang DNA chuẩn cho chạy cùng với mẫu nghiên cứu, qua đó có thể so sánh DNA mẫu với DNA chuẩn để biết trọng lƣợng phân tử, hoặc trích li đƣợc các DNA khác nhau [13]. Quy trình kỹ thuật: Hệ thống điện di bao gồm nguồn điện, buồng điện di, khuôn đổ gel và hệ thống soi chụp gel. Các bƣớc đƣợc tiến hành nhƣ sau: Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng gel agarose 0,8% bởi nồng độ này phù hợp với kích thƣớc trung bình của các đoạn DNA cần phân tích. - Cân 0,8 g thạch agarose vào 100 ml đệm TBE (Tris-borate-EDTA) hoặc TAE ở nhiệt độ phòng, khuấy đều và để yên 1 phút, cho vào lò vi sóng đun cho gel nóng chảy và không tạo bọt. - Để nguội đến khoảng 50 - 55oC, đổ dung dịch agarose vào khay đã cài sẵn răng lƣợc. Đợi thạch đông và ổn định. - Sau khi gel đông lại thì rút răng lƣợc ra và đặt khuôn gel vào bể điện di, đổ đệm vào khay gel sao cho đệm cao hơn mặt gel khoảng 2 - 5 mm. Ở đây, chúng tôi dụng đệm TAE 1X. - Tra mẫu DNA: trộn một lƣợng mẫu thích hợp với 3 l dung dịch đệm tra mẫu (loading dye), sau đó tra vào các giếng trên bản gel. Tra DNA chuẩn vào một giếng, đậy nắp bản gel và cắm điện cực. - Tiến hành điện di với dòng điện một chiều có hiệu điện thế 100 - 120 V, cƣờng độ 60 - 80 mA trong khoảng 30 phút. - Sau khi kết thúc điện di, lấy bản gel ra khỏi khuôn và nhuộm bản gel trong EtBr 10 g/ ml. Lấy bản gel ra sau 5 - 10 phút và rửa trong nƣớc sạch. - Quan sát và chụp ảnh gel trên máy Bio-Rad. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 26 2.2.2. Khuếch đại vùng D-loop bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) Kỹ thuật PCR (hay còn gọi là kỹ thuật nhân bản gen in vitro), do Kary Mullis và đtg phát minh vào năm 1985, đƣợc xem là một phát minh có tính đột phá lớn, tạo ra một cuộc đại cách mạng trong lĩnh vực nghiên cứu sinh học phân tử. PCR đƣợc ứng dụng rộng rãi trong các nghiên cứu nhân dòng gen, các phân tích cận lâm sàng cũng nhƣ trong nghiên cứu phân loại học phân tử. Nguyên tắc: Kỹ thuật PCR phối hợp khả năng lai đặc hiệu của DNA và khả năng tổng hợp DNA in vitro của enzyme DNA polymerase để nhân bản in vitro các đoạn gen lên hàng triệu lần qua một loạt các chu kỳ lặp lại [1], [13]. Tuy nhiên, do enzyme DNA polymerase hoạt động cần các mồi (primer) nên ngƣời ta phải biết đƣợc các trình tự nucleotide ở hai đầu DNA để thiết kế các cặp mồi đặc hiệu. Trong điều kiện thích hợp và môi trƣờng có chứa các nucleotide tự do, enzyme sẽ kéo dài đoạn mồi thành sợi bổ sung với sợi làm khuôn [1], [13]. Thành phần phản ứng PCR: - Phân tử DNA có chứa đoạn DNA cần nhân bản và chỉ cần biết trình tự nucleotide của đoạn nhỏ nằm cạnh đoạn cần nhân để thiết kế hai mồi oligonucleotide. - Hai đoạn mồi ngắn để xác định các điểm bắt đầu tổng hợp DNA. Đây là tín hiệu chỉ hƣớng đi (5’ - 3’) của enzyme DNA - polymerase. Mồi dài khoảng 20 nucleotide và các nucleotide ở hai đầu của mồi không tự kết hợp với nhau theo nguyên tắc bổ sung. - Bốn loại dNTPs: dATP, dTTP, dGTP, dCTP. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 27 - Dung dịch đệm cung cấp ion Mg2+ và nƣớc tinh khiết không có enzyme RNase và DNase. - Enzyme chịu nhiệt Taq polymerase [1], [13]. Dung tích tổng số cho một phản ứng PCR khoảng từ 20 - 50 µl. Các giai đoạn: Phản ứng PCR gồm một loạt chu kỳ lặp lại của ba giai đoạn cơ bản sau đây [1], [13]: - Giai đoạn biến tính DNA bằng nhiệt: tách sợi DNA kép thành dạng sợi đơn (single strands). Tất cả các phản ứng enzyme (phản ứng tổng hợp DNA từ chu kỳ trƣớc đó) trong giai đoạn này đều bị dừng lại. Mỗi sợi đơn sau đó sẽ trở thành một sợi khuôn cho mồi bám vào.  Nhiệt độ: 94 - 95oC, tại nhiệt độ này các phân tử DNA mạch kép bị tách ra do sự đứt gãy của các liên kết hydro.  Thời gian: khoảng 1 phút - Giai đoạn gắn mồi: thực hiện phản ứng lai giữa mồi và DNA khuôn. Các mồi đƣợc gắn vào vị trí có trình tự tƣơng đồng ở DNA khuôn mẫu, mồi bị lắc nhẹ chung quanh do chuyển động Brown vì thế các liên kết ion đƣợc tạo thành và đứt gãy liên tục giữa mồi sợi đơn và DNA khuôn sợi đơn. Các liên kết ion ổn định hơn tạo thành một đoạn nhỏ (các mồi đã lắp ráp chính xác) và trên các đoạn nhỏ DNA sợi đôi đó (DNA khuôn và mồi) Taq polymerase có thể bắt đầu quá trình sao chép khuôn mẫu.  Nhiệt độ: ở giai đoạn này phạm vi nhiệt độ đƣợc sử dụng có thể rất rộng tuỳ thuộc vào trình tự nucleotide của mồi, thông thƣờng khoảng 55oC, nhƣng có khi chỉ 35oC hoặc đôi lúc lên đến 68oC.  Thời gian: 20 giây đến 2 phút - Giai đoạn kéo dài: nhiệt độ lúc này đƣợc nâng lên đến 72oC, đây là nhiệt độ tối thích cho Taq polymerase tiến hành tổng hợp DNA bằng cách bổ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 28 sung các dNTP bắt đầu từ các vị trí có mồi gắn vào theo chiều 5’ - 3’. Ở nhiệt độ này, các mồi bắt cặp chính xác không bị rời khỏi DNA khuôn mẫu do có các mối liên kết ion mạnh hơn lực phá vỡ liên kết, trong khi đó các mồi ở các vị trí bắt cặp không chính xác sẽ bị rời ra khỏi khuôn (do nhiệt độ cao) do đó không tổng hợp đƣợc DNA từ những mồi này. Thời gian của giai đoạn này từ 30 giây đến vài phút, tuỳ thuộc chiều dài đoạn DNA cần nhân bản. Kết thúc một chu kỳ từ một DNA kép ban đầu tổng hợp đƣợc 2 sợi DNA kép mới. Cứ nhƣ vậy, phản ứng xảy ra trong 25 - 40 chu kỳ. Sau chu kỳ cuối, nhiệt độ đƣợc duy trì ở 72oC trong khoảng từ 5 - 10 phút sao cho tất cả các phản ứng enzyme diễn ra hoàn toàn. Sau đó nhiệt độ đƣợc hạ xuống 4oC để bảo quản sản phẩm. Sản phẩm PCR đƣợc kiểm tra bằng cách chạy điện di trên gel agarose nồng độ từ 0,8 - 2 %. Hiện nay, kỹ thuật PCR đã đƣợc phát triển, cải tiến so với ban đầu. Ngƣời ta đƣa vào thêm một số bƣớc phụ nhƣ khởi động nóng nhằm làm sợi DNA kép biến tính hoàn toàn, kéo dài thời gian tổng hợp chuỗi ở chu kì cuối cùng và giữ mẫu ở 4oC. 2.2.3. Tinh sạch sản phẩm PCR Để thu đƣợc các sản phẩm PCR đủ độ sạch để có thể tiến hành đọc trình tự trực tiếp, chúng tôi tiến hành cắt gel (thạch) sau đó tinh sạch bằng Kit Wizard  SV Gel and PCR clean-up system của hãng Promega theo quy trình kỹ thuật sau: - Điện di toàn bộ sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8%, sau đó tiến hành cắt gel trên máy soi DNA để thu lấy băng DNA quan tâm. Thêm 10 l dung dịch MBS (Membrane Binding Solution) đối với mỗi 10 mg gel và ủ hỗn hợp ở 50 - 65oC cho tới khi thạch tan hoàn toàn. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 29 - Đặt cột nhỏ vào trong ống thu. Chuyển hỗn hợp sản phẩm PCR và dung dịch bám màng vào trong cột nhỏ và để 1 phút ở nhiệt độ phòng. - Ly tâm 12000 rpm trong 1 phút ở 4oC và đổ dịch thừa. - Bổ sung 700 l dung dịch MWS (Membrane Wash Solution) có bổ sung ethanol 100%. Ly tâm 12000 rpm trong 1 phút ở 4oC, đổ dịch thừa. - Lặp lại bƣớc trên với 500 l dung dịch MWS, ly tâm 12000 rpm trong 5 phút ở 4oC. Đổ dịch thừa và ly tâm lại trong 1 phút. - Chuyển cột nhỏ sang ống 1,5 ml sạch. Sấy khô sản phẩm PCR trong máy làm khô chân không, thời gian 5 phút. Thêm 30 l nƣớc cất hai lần, giữ ở nhiệt độ phòng trong 5 - 10 phút. Ly tâm 12000 rpm trong 5 phút ở 4oC, sau đó giữ mẫu DNA tinh sạch ở -20oC. 2.2.4. Giải trình tự vùng D-loop Nguyên tắc chung: Trình tự vùng D-loop đƣợc xác định dựa trên nguyên tắc chung của phƣơng pháp do Sanger và đtg phát minh vào năm 1977: tạo ra các đoạn oligonucleotide hơn kém nhau 1 nucleotide kết thúc bởi các ddNTP đã đƣợc đánh dấu huỳnh quang (fluochrome). Mỗi loại ddNTP đƣợc đánh dấu bằng một fluochrome có màu khác nhau. Nhƣ vậy, tất cả các oligonucleotide cùng chấm dứt tại một loại ddNTP sẽ có cùng một màu. Sau khi điện di trên gel polyacrylamid, kết quả sẽ đƣợc xử lí qua một hệ thống vi tính [1], [13], [56]. Để tạo ra các đoạn kết thúc bằng các loại ddNTP khác nhau, chúng tôi tiến hành PCR sử dụng BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit có chứa sẵn các hóa chất cần thiết của phản ứng nhân gen để đọc trình tự nhƣ dNTPs, ddNTPs, DNA polymerase… Do đó, chỉ cần bổ sung thêm DNA khuôn (sản phẩm PCR tinh sạch) và mồi phù hợp. Phản ứng đƣợc thực hiện trong một ống vì 4 loại ddNTP đã đƣợc đánh dấu bằng các màu khác nhau. Thành phần của phản ứng nhân bản DNA để đọc trình tự bao gồm: mồi Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 30 L16725: 3,2 pmol, 200 ng DNA khuôn (sản phẩm PCR đã tinh sạch), BigDye 0,5X, đệm 1X và H2O với tổng thể tích 15 l. Chu trình nhiệt: Chu trình nhiệt cho phản ứng khuếch đại DNA trong máy luân nhiệt GenAmp PCR System 9700 nhƣ sau: 96oC - 4 phút; 25 chu kỳ (96oC - 10 giây, 50 o C - 5 giây, 60 o C - 4 phút). Sản phẩm đƣợc giữ ở 4oC. Tinh sạch sản phẩm PCR bằng phương pháp tủa EtOH/ EDTA: - Bổ sung vào sản phẩm PCR 5 l EDTA 125 mM (pH = 8); 60 l EtOH 100%. Đảo nhẹ hỗn hợp và để ở -20oC, 3 giờ. Sau đó ly tâm 12000 rpm, 15 phút để tủa DNA trong đó. - Loại bỏ EtOH và rửa tủa bằng 60 l EtOH 70%. Ly tâm 12000 rpm trong 10 phút. - Làm khô tủa và bổ sung 10 l Hi-Di TM Formamide để làm tan tủa và biến tính ở 95oC trong 5 phút. Sau bƣớc này các mẫu đƣợc đƣa vào các giếng của khay đựng mẫu sau đó điện di trong ống mao quản 80 cm x 50 m chứa POP-4™ của hãng ABI, Mỹ. Vùng điều khiển D-loop đƣợc xác định trình tự trên máy đọc trình tự tự động ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer. 2.2.5. Phân tích dữ liệu bằng phần mềm chuyên dụng Dữ liệu về trình tự vùng D-loop đƣợc xử lý bằng phần mềm DNA Sequencing Analysis v5.3.1, SeqScape ® v2.6 và BioEdit v7.0.9. Trình tự nucleotide của các mẫu nghiên cứu đƣợc so sánh với trình tự chuẩn bằng thuật toán ClustalW. Khoảng cách di truyền giữa các mẫu nghiên cứu đƣợc tính toán bằng phƣơng pháp Maximum Composite Likelihood. Cây phát sinh chủng loại của 71 mẫu gà đƣợc xây dựng theo phƣơng pháp NJ (Neighbor-Joining) và phƣơng pháp ML (Maximum Likelihood). Tất cả các phân tích trên đều đƣợc thực hiện thông qua phần mềm Molecular Evolution Genetics Analysis (MEGA) v4.0 [63]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 31 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Nhân vùng D-loop bằng kỹ thuật PCR D-loop là vùng không mã hóa duy nhất trên DNA ty thể ở động vật có xƣơng sống. Vùng này chứa điểm khởi đầu sao chép của chuỗi nặng và các promoter phiên mã của DNA ty thể. Với đặc trƣng tích luỹ các đột biến cao gấp 5 - 10 lần so với các gen khác trong ty thể và so với DNA nhân, D-loop trở thành vùng có ý nghĩa quan trọng trong nghiên cứu đa dạng sinh học và sự phát sinh chủng loại của sinh vật. Chính vì thế, nhằm mục đích đánh giá tính đa dạng di truyền của các cá thể gà thuộc 3 giống Ri, Đông Tảo và Tre, chúng tôi chọn trình tự nucleotide của vùng D-loop hệ gen ty thể làm đối tƣợng nghiên cứu. Nhân gen bằng kỹ thuật PCR thành công khi phản ứng có tính đặc hiệu cao. Do đó, để cho ra sản phẩm tốt nhất thì điều kiện phản ứng phải đƣợc tối ƣu hóa. Để nhân vùng D-loop cần có DNA khuôn, mồi, các dNTP, Taq DNA polymerase, MgCl2, dung dịch đệm và một chu trình nhiệt thích hợp. * Thành phần của phản ứng PCR - Dung dịch đệm (Buffer): phản ứng PCR đƣợc thực hiện trong môi trƣờng đệm có pH 7,2 để ổn định hoạt động của Taq polymerase. Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng loại đệm có chứa NH4+ nhƣng không chứa Mg 2+ của hãng Fermentas, đệm này phù hợp cho hoạt động của Taq polymerase và khoảng biến thiên rộng về nồng độ của MgCl2. Hơn nữa, loại đệm này cho chất lƣợng sản phẩm tốt hơn so với loại đệm không chứa NH4+. - Nồng độ Mg2+: trong các thí nghiệm, chúng tôi sử dụng đệm không chứa Mg2+ để có thể khảo sát mức độ ảnh hƣởng của nó tới phản ứng. Nồng độ ion Mg2+ (đƣợc cung cấp dƣới dạng MgCl2) có thể ảnh hƣởng tới nhiệt độ biến tính (Tm) của DNA khuôn, hoạt tính của Taq polymerase và độ chính Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 32 xác của kết quả. Nồng độ Mg2+ quá cao sẽ làm tăng sự ổn định của DNA sợi đôi và ngăn cản sự biến tính hoàn toàn để giải phóng sợi đơn trong mỗi chu kỳ PCR làm cho sản phẩm PCR nghèo đi, nó còn làm tăng hiện tƣợng bắt cặp giả tại những vị trí không tƣơng đồng dẫn đến xuất hiện các sản phẩm không đặc hiệu. Ngƣợc lại, nếu nồng độ Mg2+ quá thấp sẽ ảnh hƣởng xấu đến quá trình tổng hợp DNA vì Mg2+ đóng vai trò là một co-factor của Taq polymerase. Do đó, cần phải xác định nồng độ tối ƣu của Mg2+ nhằm đảm bảo hiệu suất khuếch đại và tính đặc hiệu của sản phẩm PCR. Sau khi khảo sát một số nồng độ Mg2+ khác nhau, chúng tôi nhận thấy nồng độ Mg2+ 10 mM thích hợp nhất cho việc khuếch đại vùng D-loop bằng kỹ thuật PCR. - dNTPs: hàm lƣợng của các dNTP thích hợp sẽ cho kết quả ổn định, chính xác và đặc hiệu. Bốn loại dNTP cần đƣợc sử dụng với nồng độ tƣơng đƣơng nhau để giảm thiểu tối đa hiện tƣợng kết hợp sai (misincorporation) mã di truyền nào đó. Nồng độ cao dNTP không tốt cho phản ứng vì nó sẽ cô lập ion Mg 2+ . Nồng độ của mỗi loại dNTP còn phụ thuộc vào kích thƣớc của đoạn DNA cần nhân lên. Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng nồng độ dNTPs 10 mM (0,25 mM mỗi loại). - Cặp mồi sử dụng để nhân bản vùng D-loop: Chúng tôi tiến hành PCR với việc sử dụng cặp mồi H1255 và L16725 [9], [22], [25], [30], [36] để nhân vùng D-loop từ các mẫu DNA tổng số đƣợc cung cấp. Các thông tin về cặp mồi này nhƣ sau: H1255 (Tm = 55 o C): 5’ - CAT CTT GGC ATC TTC AGT GCC - 3’ L16725 (Tm = 60 o C): 5’ - AGG ACT ACG GCT TGA AAG C - 3’ Ở đây, H (Heavy chain) và L (Light chain) là ký hiệu chuỗi nặng và chuỗi nhẹ, còn chữ số là số chỉ vị trí nucleotide đầu 3' của mồi trong trình tự đầy đủ của mtDNA ở gà [22]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 33 H1255 và L16725 là cặp mồi bảo thủ, đƣợc thiết kế dựa trên trình tự hai đầu vùng D-loop ở gà nhà do đó có thể sử dụng cho nhiều loài, giống khác nhau trong bộ Gà (Galliformes) [9]. Theo lý thuyết, sản phẩm thu đƣợc khi nhân bản bằng cặp mồi trên có chiều dài khoảng 1,3 kb. Việc điều chỉnh nhiệt độ gắn mồi và nồng độ mồi quyết định lƣợng sản phẩm thu đƣợc. Hai mồi H và L phải có nồng độ bằng nhau và phải đƣợc điều chỉnh thích hợp sao cho không quá cao để tránh hiện tƣợng primer-dimer và hiện tƣợng các mồi gắn nhầm vị trí trên khuôn mẫu, nồng độ mồi cũng không đƣợc quá thấp để tránh làm giảm lƣợng sản phẩm tạo thành. Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng mồi có nồng độ 10 pmol/ l đối với mỗi loại H và L. - Nồng độ DNA khuôn: PCR gồm hai giai đoạn: giai đoạn sàng lọc và giai đoạn khuếch đại. Nếu các chất trong thành phần phản ứng (bao gồm mồi) có nồng độ cao trong khi DNA khuôn lại có nồng độ thấp thì giai đoạn sàng lọc của PCR sẽ trở nên khó khăn hơn vì tần suất để mồi và DNA khuôn gặp nhau giảm rõ rệt, trong khi sự tiếp xúc giữa mồi với mồi lại tăng lên gây ra hiện tƣợng primer-dimer trong giai đoạn khuếch đại. Thông thƣờng, nồng độ DNA khuôn mẫu đƣợc sử dụng trong khoảng từ 10 - 100 ng/ 25 µl dung dịch phản ứng. DNA khuôn sử dụng trong đề tài là 71 mẫu DNA tổng số của 3 giống gà: Ri, Đông Tảo và Tre, các mẫu này có độ tinh sạch cao và ít bị đứt gãy. - Taq polymerase: nồng độ enzyme quá cao có thể làm xuất hiện các sản phẩm PCR không đặc hiệu dẫn tới sai lệch kết quả. Ngƣợc lại, nếu nồng độ enzyme quá thấp sẽ không đủ để xúc tác tạo ra đủ lƣợng sản phẩm mong muốn. Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng enzyme Taq polymerase nồng độ 5 unit/ l. Thành phần phản ứng khuếch đại đoạn DNA cho một mẫu với tổng thể tích 25 l nhƣ trong bảng 3.1. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 34 Bảng 3.1. Thành phần phản ứng khuếch đại DNA Thành phần Nồng độ Thể tích (l) Buffer 10 X 2,5 MgCl2 10 mM 2,5 dNTPs 10 mM 2,5 Mồi H1255 10 pmol/ l 1 Mồi L16725 10 pmol/ l 1 Taq DNA polymerase 5 unit/ l 0,2 DNA khuôn 15 ng x H2O - y Tổng thể tích 25 * Chu trình nhiệt của PCR: PCR là loại phản ứng đòi hỏi sự chính xác về chu trình nhiệt của phản ứng cũng nhƣ thành phần và nồng độ các chất tham gia. Tổng số chu kỳ chúng tôi tiến hành là 35, mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn chính nhƣ sau: - Giai đoạn biến tính: nhiệt độ biến tính thƣờng khoảng 94 - 95oC để đảm bảo sau khoảng 30 chu kỳ PCR, Taq DNA polymerase vẫn giữ đƣợc hoạt tính. Thời gian biến tính tuỳ thuộc vào hàm lƣợng G - C và chiều dài phân tử DNA. Chúng tôi chọn nhiệt độ biến tính là 940, thời gian 1 phút. - Giai đoạn gắn mồi: điều quan trọng nhất khi thực hiện phản ứng PCR là việc lựa chọn và tìm ra nhiệt độ gắn mồi thích hợp. Nhiệt độ gắn mồi phải thấp hơn Tm của cặp mồi sử dụng để cho mồi có thể bắt cặp tốt với DNA khuôn. Vì Tm nhỏ nhất của cặp mồi trên là 55oC nên chúng tôi đã tiến hành thử chạy phản ứng ở một số giá trị khác nhau trong khoảng nhiệt độ từ 50 - Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 35 54 oC, qua đó chọn đƣợc nhiệt độ gắn mồi tối ƣu trong thí nghiệm này là 54oC. Thời gian của giai đoạn gắn mồi là 1 phút 10 giây. - Giai đoạn kéo dài chuỗi: nhiệt độ lúc này đƣợc tăng đến 72oC để cho enzyme Taq polymerase hoạt động tốt nhất. Trình tự vùng D-loop quan tâm có kích thƣớc 1227 bp trong khi tốc độ tổng hợp của phản ứng vào khoảng 1000 nucleotide/ phút nên thời gian của giai đoạn này là 1 phút 20 giây. Bảng 3.2. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR Các bƣớc Khởi động nóng Biến tính Gắn mồi Kéo dài Ổn định Giữ mẫu Nhiệt độ 94oC 94 oC 54 oC 72 oC 72 oC 4 oC Thời gian 4’ 1’ 1’10’’ 1’20’’ 10’  Số chu kỳ 1 35 1 1 Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8% (Hình 3.1) cho thấy các băng DNA đều sáng đậm, rõ nét, tập trung ở vị trí giữa băng 1,5 kb và 1 kb, nhƣ vậy sản phẩm PCR có kích thƣớc phân tử vào khoảng 1,3 kb, phù hợp với tính toán lý thuyết khi thiết kế mồi. Do đó, có thể sơ bộ kết luận đây là vùng D-loop của hệ gen ty thể gà. Hình 3.1. Ảnh điện di sản phẩm PCR của một số mẫu gà nghiên cứu Dt: gà Đông Tảo, Ri: gà Ri, Tr: gà Tre M Dt01 Dt05 Dt09 Dt17 Ri03 Ri07 Ri14 Ri21 Tr06 Tr11 Tr18 1,5 1 Kb Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 36 3.2. Xác định và so sánh trình tự nucleotide của các mẫu nghiên cứu với trình tự chuẩn trên GenBank Trình tự 609 nucleotide vùng D-loop từ vị trí 21 đến vị trí 629 trên mtDNA của 71 mẫu thuộc 3 giống gà Ri, Đông Tảo, Tre, đƣợc xác định trực tiếp theo phƣơng pháp dideoxy sử dụng mồi L16725, bộ hóa chất BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit trên máy phân tích trình tự DNA tự động ABI PRISM® 3100 Genetic Analyzer. Dữ liệu trình tự nucleotide sau khi đƣợc xử lý bằng phần mềm DNA Sequencing Analysis v5.3.1, SeqScape® v2.6 và BioEdit v7.0.9 đƣợc so sánh với trình tự gà White Leghorn gốc Nhật Bản (thuộc phân loài Gallus gallus domesticus), trình tự này mang mã số AP003580 trên GenBank đƣợc Nishibori và đtg công bố năm 2003. Trình tự 609 nucleotide trong vùng D-loop của 71 mẫu cá thể thuộc 3 giống gà nghiên cứu đƣợc xử lý và so sánh nhƣ sau: 10 20 30 40 50 60 70 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| AP003580 CTCCCCTACT AAGTGTACCC CCCCTTTCCC CCCCAGGGGG GGTATACTAT GCATAATCGT GCATACATTT Dt-01 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Dt-02 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Dt-03 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Dt-04 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Dt-05 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Dt-06 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Dt-07 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Dt-08 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Dt-09 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Dt-10 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Dt-11 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Dt-12 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Dt-13 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Dt-14 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Dt-15 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Dt-16 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Dt-17 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Dt-18 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Dt-19 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Dt-20 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Dt-21 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Dt-22 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Ri-01 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 37 10 20 30 40 50 60 70 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| AP003580 CTCCCCTACT AAGTGTACCC CCCCTTTCCC CCCCAGGGGG GGTATACTAT GCATAATCGT GCATACATTT Ri-02 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Ri-03 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Ri-04 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Ri-05 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Ri-06 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Ri-07 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Ri-08 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Ri-09 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Ri-10 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Ri-11 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Ri-12 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Ri-13 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Ri-14 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Ri-15 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Ri-16 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Ri-17 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Ri-18 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Ri-19 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Ri-20 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Ri-21 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Ri-22 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Ri-23 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Ri-24 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Ri-25 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Ri-26 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Ri-27 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Ri-28 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Ri-29 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Ri-30 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Ri-31 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Tr-01 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Tr-02 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Tr-03 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Tr-04 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Tr-05 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Tr-06 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Tr-07 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Tr-08 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Tr-09 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Tr-10 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Tr-11 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Tr-12 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Tr-13 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Tr-14 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Tr-15 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Tr-16 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Tr-17 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Tr-18 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 38 80 90 100 110 120 130 140 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| AP003580 ATATACCACA TATATTATGG TACCGGTAAT ATATACTATA TATGTACTAA ACCCATTATA TGTATACGGG Dt-01 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Dt-02 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Dt-03 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Dt-04 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Dt-05 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Dt-06 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Dt-07 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Dt-08 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Dt-09 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Dt-10 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Dt-11 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Dt-12 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Dt-13 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Dt-14 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Dt-15 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Dt-16 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Dt-17 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Dt-18 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Dt-19 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Dt-20 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Dt-21 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Dt-22 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Ri-01 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Ri-02 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Ri-03 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Ri-04 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Ri-05 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Ri-06 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Ri-07 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Ri-08 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Ri-09 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Ri-10 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Ri-11 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Ri-12 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Ri-13 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Ri-14 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Ri-15 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Ri-16 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Ri-17 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Ri-18 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Ri-19 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Ri-20 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Ri-21 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Ri-22 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Ri-23 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Ri-24 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 39 80 90 100 110 120 130 140 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| AP003580 ATATACCACA TATATTATGG TACCGGTAAT ATATACTATA TATGTACTAA ACCCATTATA TGTATACGGG Ri-25 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Ri-26 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Ri-27 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Ri-28 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Ri-29 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Ri-30 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Ri-31 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Tr-01 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Tr-02 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Tr-03 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Tr-04 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Tr-05 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Tr-06 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Tr-07 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Tr-08 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Tr-09 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Tr-10 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Tr-11 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Tr-12 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Tr-13 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Tr-14 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Tr-15 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Tr-16 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Tr-17 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... Tr-18 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 150 160 170 180 190 197 200 210 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| AP003580 CATTAATCTA TATTCCACAT TTCTCCCAAT GTCCATTCTA TGCATGATCC AGGACACACT CATTCACCCT Dt-01 .......... .......... .......... .......... .......... .A....T... .......... Dt-02 .......... .......... .......... .......... .......... .A....T... .......... Dt-03 .......... .......... .......... .......... .......... .A....T... .......... Dt-04 .......... .......... .......... .......... .......... .A....T... .......... Dt-05 .......... .......... .......... .......... .......... .A....T... .......... Dt-06 .......... .......... .......... .......... .......... ......T... ....T..... Dt-07 .......... .......... .......... .......... .......... .A....T... .......... Dt-08 .......... .......... .......... .......... .......... .A....T... .......... Dt-09 .......... .......... .......... .......... .......... .A....T... .......... Dt-10 .......... .......... .......... .......... .......... .A....T... .......... Dt-11 .......... .......... .......... .......... .......... .A....T... .......... Dt-12 .......... .......... .......... .......... .......... .A....T... .......... Dt-13 .......... .......... .......... .......... .......... .A....T... .......... Dt-14 .......... .......... .......... .......... .......... .A....T... .......... Dt-15 .......... .......... .......... .......... .......... .A....T... .......... Dt-16 .......... .......... .......... .......... .......... .A....T... .......... Dt-17 .......... .......... .......... .......... .......... .A....T... .......... Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 40 150 160 170 180 190 197 200 210 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| AP003580 CATTAATCTA TATTCCACAT TTCTCCCAAT GTCCATTCTA TGCATGATCC AGGACACACT CATTCACCCT Dt-18 .......... .......... .......... .......... .......... .A....T... .......... Dt-19 .......... .......... .......... .......... .......... .A....T... .......... Dt-20 .......... .......... .......... .......... .......... .A....T... .......... Dt-21 .......... .......... .......... .......... .......... .A....T... .......... Dt-22 .......... .......... .......... .......... .......... .A....T... .......... Ri-01 .......... .......... .......... .......... .......... .A....T... .......... Ri-02 .......... .......... .......... .......... .......... .A....T... .......... Ri-03 .......... .......... .......... .......... .......... .A....T... .......... Ri-04 .......... .......... .......... .......... .......... .A....T... .......... Ri-05 .......... .......... .......... .......... .......... .A....T... .......... Ri-06 .......... .......... .......... .......... .......... .A....T... .......... Ri-07 .......... .......... .......... .......... .......... .A....T... .......... Ri-08 .......... .......... .......... .......... .......... .A....T... .......... Ri-09 .......... .......... .......... .......... .......... .A....T... .......... Ri-10 .......... .......... .......... .......... .......... .A....T... .......... Ri-11 ......C... .......... .......... .......... .......... ......T... ....T..... Ri-12 .......... .......... .......... .......... .......... .A....T... .......... Ri-13 .......... .......... .......... .......... .......... .A....T... .......... Ri-14 .......... .......... .......... .......... .......... .A....T... .......... Ri-15 .......... .......... .......... .......... .......... .A....T... .......... Ri-16 .......... .......... .......... .......... .......... .A....T... .......... Ri-17 .......... .......... .......... .......... .......... .A....T... .......... Ri-18 .......... .......... .......... .......... .......... .A....T... .......... Ri-19 .......... .......... .......... .......... .......... .A....T... .......... Ri-20 .......... .......... .......... .......... .......... .A....T... .......... Ri-21 .......... .......... .......... .......... .......... .A....T... .......... Ri-22 .......... .......... .......... .......... .......... .A....T... .......... Ri-23 .......... .......... .......... .......... .......... .A....T... .......... Ri-24 .......... .......... .......... .......... .......... .A....T... .......... Ri-25 .......... .......... .......... .......... .......... .A....T... .......... Ri-26 .......... .......... .......... .......... .......... .A....T... .......... Ri-27 .......... .......... .......... .......... .......... .A....T... .......... Ri-28 .......... .......... .......... .......... .......... .A....T... .......... Ri-29 .......... .......... .......... .......... .......... .A....T... .......... Ri-30 .......... .......... .......... .......... .......... .A....T... .......... Ri-31 .......... .......... .......... .......... .......... .A....T... .......... Tr-01 ......C... .......... .......... .......... .......... ......T... ....T..... Tr-02 ......C... .......... .......... .......... .......... ......T... ....T..... Tr-03 ......C... .......... .......... .......... .......... ......T... ....T..... Tr-04 ......C... .......... .......... .......... .......... ......T... ....T..... Tr-05 .......... .......... .......... .......... .......... ......T... .......... Tr-06 .......... .......... .......... .......... .......... ......T... .......... Tr-07 .......... .......... .......... .......... .......... ......T... .......... Tr-08 ......C... .......... .......... .......... .......... ......T... ....T..... Tr-09 .......... .......... .......... .......... .......... ......T... .......... Tr-10 .......... .......... .......... .......... .......... ......T... .......... Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 41 150 160 170 180 190 197 200 210 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| AP003580 CATTAATCTA TATTCCACAT TTCTCCCAAT GTCCATTCTA TGCATGATCC AGGACACACT CATTCACCCT Tr-11 .......... .......... .......... .......... .......... ......T... .......... Tr-12 ......C... .......... .......... .......... .......... ......T... ....T..... Tr-13 ......C... .......... .......... .......... .......... ......T... ....T..... Tr-14 ......C... .......... .......... .......... .......... ......T... ....T..... Tr-15 .......... .......... .......... .......... .......... ......T... .......... Tr-16 ......C... .......... .......... .......... .......... ......T... ....T..... Tr-17 .......... .......... .......... .......... .......... .A....T... .......... Tr-18 ......C... .......... .......... .......... .......... ......T... ....T..... 220 230 240 250 260 270 280 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| AP003580 CCCCATAGAC AGCTCCAAAC CACTACCAAG TCACCTAACT ATGAATGGTT ACAGGACATA AATCTCACTC Dt-01 .......... ..T..T.... .....T.... C......... .......... .......... .......... Dt-02 .......... ..T..T.... .....T.... C......... .......... .......... .......... Dt-03 .......... ..T..T.... .....T.... C......... .......... .......... .......... Dt-04 .......... ..T..T.... .....T.... C......... .......... .......... .......... Dt-05 .......... ..T..T.... .....T.... C......... .......... .......... .......... Dt-06 .......... ..T..T.... .....T.... C......... .......... .......... .......... Dt-07 .......... ..T..T.... .....T.... C......... .......... .......... .......... Dt-08 .......... ..T..T.... .....T.... C......... .......... .......... .......... Dt-09 .......... ..T..T.... .....T.... C......... .......... .......... .......... Dt-10 .......... ..T..T.... .....T.... C......... .......... .......... .....T.... Dt-11 .......... ..T..T.... .....T.... C......... .......... .......... .......... Dt-12 .......... ..T..T.... .....T.... C......... .......... .......... .....T.... Dt-13 .......... ..T..T.... .....T.... C......... .......... .......... .....T.... Dt-14 .......... ..T..T.... .....T.... C......... .......... .......... .......... Dt-15 .......... ..T..T.... .....T.... C......... .......... .......... .......... Dt-16 .......... ..T..T.... .....T.... C......... .......... .......... .......... Dt-17 .......... ..T..T.... .....T.... C......... .......... .......... .......... Dt-18 .......... ..T..T.... .....T.... C......... .......... .......... .......... Dt-19 .......... ..T..T.... .....T.... C......... .......... .......... .......... Dt-20 .......... ..T..T.... .....T.... C......... .......... .......... .......... Dt-21 .......... ..T..T.... .....T.... C......... .......... .......... .....T.... Dt-22 .......... ..T..T.... .....T.... C......... .......... .......... .....T.... Ri-01 .......... ..T..T.... .....T.... C......... .......... .......... .....T.... Ri-02 .......... ..T..T.... .....T.... C......... .......... .......... .......... Ri-03 .......... ..T..T.... .....T.... C......... .......... .......... .......... Ri-04 .......... ..T..T.... .....T.... C......... .......... .......... .....T.... Ri-05 .......... ..T..T.... .....T.... C......... .......... .......... .......... Ri-06 .......... ..T..T.... .....T.... C......... .......... .......... .......... Ri-07 .......... ..T..T.... .....T.... C......... .......... .......... .....T.... Ri-08 .......... ..T..T.... .....T.... C......... .......... .......... .....T.... Ri-09 .......... ..T..T.... .....T.... C......... .......... .......... .....T.... Ri-10 .......... ..T..T.... .....T.... C......... .......... .......... .......... Ri-11 .......... ..T....... .....T.... C......... .......... .......... .......... Ri-12 .......... ..T..T.... .....T.... C......... .......... .......... .....T.... Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 42 220 230 240 250 260 270 280 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| AP003580 CCCCATAGAC AGCTCCAAAC CACTACCAAG TCACCTAACT ATGAATGGTT ACAGGACATA AATCTCACTC Ri-13 .......... ..T..T.... .....T.... C......... .......... .......... .....T.... Ri-14 .......... ..T..T.... .....T.... C......... .......... .......... .......... Ri-15 .......... ..T..T.... .....T.... C......... .......... .......... .......... Ri-16 .......... ..T..T.... .....T.... C......... .......... .......... .......... Ri-17 .......... ..T..T.... .....T.... C......... .......... .......... .......... Ri-18 .......... ..T..T.... .....T.... C......... .......... .......... .......... Ri-19 .......... ..T..T.... .....T.... C......... .......... .......... .......... Ri-20 .......... ..T..T.... .....T.... C......... .......... .......... .....T.... Ri-21 .......... ..T..T.... .....T.... C......... .......... .......... .......... Ri-22 .......... ..T..T.... .....T.... C......... .......... .......... .......... Ri-23 .......... ..T..T.... .....T.... C......... .......... .......... .....T.... Ri-24 .......... ..T..T.... .....T.... C......... .......... .......... .......... Ri-25 .......... ..T..T.... .....T.... C......... .......... .......... .......... Ri-26 .......... ..T..T.... .....T.... C......... .......... .......... .....T.... Ri-27 .......... ..T..T.... .....T.... C......... .......... .......... .......... Ri-28 .......... ..T..T.... .....T.... C......... .......... .......... .......... Ri-29 .......... ..T..T.... .....T.... C......... .......... .......... .....T.... Ri-30 .......... ..T..T.... .....T.... C......... .......... .......... .......... Ri-31 .......... ..T..T.... .....T.... C......... .......... .......... .......... Tr-01 .......... ..T....... .....T.... C......... .......... .......... .......... Tr-02 .......... ..T....... .....T.... C......... .......... .......... .......... Tr-03 .......... ..T....... .....T.... C......... .......... .......... .......... Tr-04 .......... ..T....... .....T.... C......... .......... .......... .......... Tr-05 .......... .......... .......... .......... .......... G......... .......... Tr-06 .......... .......... .......... .......... .......... G......... .......... Tr-07 .......... .......... .......... C......... .......... G......... .......... Tr-08 .......... ..T....... .....T.... C......... .......... .......... .......... Tr-09 .......... .......... .......... C......... .......... G......... .......... Tr-10 .......... .......... .......... C......... .......... G......... .......... Tr-11 .......... .......... .......... C......... .......... G......... .......... Tr-12 .......... ..T....... .....T.... C......... .......... .......... .......... Tr-13 .......... ..T....... .....T.... C......... .......... .......... .......... Tr-14 .......... ..T....... .....T.... C......... .......... .......... .......... Tr-15 .......... .......... .......... .......... .......... G......... .......... Tr-16 .......... ..T....... .....T.... C......... .......... .......... .......... Tr-17 .......... ..T..T.... .....T.... C......... .......... .......... .......... Tr-18 .......... ..T..T.... .....T.... C......... .......... .......... .......... 290 300 310 320 330 340 350 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| AP003580 TCATGTTCTT CCCCCAACAA GTCACCTAAC TATGAATGGT TACAGGACAT ACATTTAACT ACCATGTTCT Dt-01 .........C ....T..... .......... .......... .......... .......... .......... Dt-02 .........C ....T..... .......... .......... .......... .......... .......... Dt-03 .........C ....T..... .......... .......... .......... .......... .......... Dt-04 .........C ....T..... .......... .......... .......... .......... .......... Dt-05 .........C ....T..... .......... .......... .......... .......... .......... Dt-06 .........C ....T..... .......... .......... .......... .......... .......... Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 43 290 300 310 320 330 340 350 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| AP003580 TCATGTTCTT CCCCCAACAA GTCACCTAAC TATGAATGGT TACAGGACAT ACATTTAACT ACCATGTTCT Dt-07 .........C ....T..... .......... .......... .......... .......... .......... Dt-08 .........C ....T..... .......... .......... .......... .......... .......... Dt-09 .........C ....T..... .......... .......... .......... .......... .......... Dt-10 .........C ....T..... .......... .......... .......... .......... .......... Dt-11 .........C ....T..... .......... .......... .......... .......... .......... Dt-12 .........C ....T..... .......... .......... .......... .......... .......... Dt-13 .........C ....T..... .......... .......... .......... .......... .......... Dt-14 .........C ....T..... .......... .......... .......... .......... .......... Dt-15 .........C ....T..... .......... .......... .......... .......... .......... Dt-16 .........C ....T..... .......... .......... .......... .......... .......... Dt-17 .........C ....T..... .......... .......... .......... .......... .......... Dt-18 .........C ....T..... .......... .......... .......... .......... .......... Dt-19 .........C ....T..... .......... .......... .......... .......... .......... Dt-20 .........C ....T..... .......... .......... .......... .......... .......... Dt-21 .........C ....T..... .......... .......... .......... .......... .......... Dt-22 .........C ....T..... .......... .......... .......... .......... .......... Ri-01 .........C ....T..... .......... .......... .......... .......... .......... Ri-02 .........C ....T..... .......... .......... .......... .......... .......... Ri-03 .........C ....T..... .......... .......... .......... .......... .......... Ri-04 .........C ....T..... .......... .......... .......... .......... .......... Ri-05 .........C ....T..... .......... .......... .......... .......... .......... Ri-06 .........C ....T..... .......... .......... .......... .......... .......... Ri-07 .........C ....T..... .......... .......... .......... .......... .......... Ri-08 .........C ....T..... .......... .......... .......... .......... .......... Ri-09 .........C ....T..... .......... .......... .......... .......... .......... Ri-10 .........C ....T..... .......... .......... ..........