Luận văn Tuyển chọn, nuôi cấy chủng aspergillus awamori sinh tổng hợp endo-Β-1,4-glucanase và đánh giá tính chất lý hóa của endo-β-1,4-glucanase

Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM --------------------------------- NGUYỄN VĂN TUÂN TUYỂN CHỌN, NUÔI CẤY CHỦNG ASPERGILLUS AWAMORI SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC THÁI NGUYÊN- 2009 Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM --------------------------------- NGUYỄN VĂN TUÂN TUYỂN CHỌN, NUÔI CẤY CHỦNG ASPERGILLUS AWAMORI SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60. 42. 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Quyền Đình Thi Thực hiện tại: Viện Công nghệ Sinh học- Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam THÁI NGUYÊN - 2009 Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên LỜI CẢM ƠN! Trƣớc hết tôi xin gửi lời cảm Sâu sắc tới TS. Quyền Đình Thi, Trƣởng phòng Công nghệ Sinh học Enzyme, Phó viện trƣởng Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã định hƣớng nghiên cứu, hƣớng dẫn thí nghiệm, sửa luận văn và tạo mọi điều kiện về hoá chất cũng nhƣ trang thiết bị nghiên cứu để tôi hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Phòng Công nghệ Sinh học Enzyme, Viện Công nghệ Sinh học đã giúp đỡ tôi tận tình trong suốt quá trình làm luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn Khoa Sinh học, Khoa Sau đại học, trƣờng Đại học Sƣ phạm, Đại học Thái Nguyên cùng các thầy cô giáo đã nhiệt tình giảng dạy và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khoá học. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Bộ môn Hoá- Sinh học, Ban chủ nhiệm khoa Khoa học Cơ bản, Trƣờng đại học Nông Lâm, Đại học Thái Nguyên đã tạo điều kiện cho tôi đi học. Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn những ngƣời thân trong gia đình và bạn bè đã giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian học tập. Thái Nguyên tháng 9 năm 2009 Học viên Nguyễn Văn Tuân Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên CÁC CHỮ VIẾT TẮT APS Ammonium persulphate BSA Bovine serum albumin CMC Carboxyl methyl cellulose cs Cộng sự DNA Deoxyribonucleic acid DEAE Diethylaminoethyl ĐC Đối chứng EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid IU International unit kb Kilo base kDa Kilo Dalton LB Luria and Bertani M Marker Nxb Nhà xuất bản OD Optical density PCR Polymerase chain reaction rRNA Ribosome ribonucleic acid SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis TBE Tris base-Boric acid-EDTA TE Tris-EDTA v/v Volume/volume w/v Weight/volume Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên MỤC LỤC MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 3 1.1 KHÁI NIỆM VỀ CELLULASE VÀ ENDO-β-1,4-GLUCANASE ............ 3 1.2 NGUỒN GỐC VÀ PHÂN LOẠI ENDO-β-1,4-GLUCANASE .................. 4 1.2.1 Nguồn gốc ............................................................................................. 4 1.2.2 Phân loại ................................................................................................ 6 1.3 CẤU TRÚC CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE .......................................... 7 1.3.1 Cấu trúc bậc một .................................................................................... 7 1.3.2 Cấu trúc không gian ............................................................................... 9 1.3.3 Cấu trúc của trung tâm xúc tác và vùng liên kết cơ chất ......................... 9 1.4 CƠ CHẾ XÚC TÁC CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE ........................... 11 1.5 ỨNG DỤNG CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE ....................................... 12 1.5.1 Trong công nghiệp thực phẩm ............................................................. 12 1.5.2 Trong công nghiệp sản xuất thức ăn gia súc ......................................... 13 1.5.3 Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ...................................... 15 1.5.4 Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy ....................................... 15 1.5.5 Trong công nghiệp sản xuất chất tẩy rửa .............................................. 16 1.5.6 Trong công nghệ xử lý rác thải sản xuất phân bón vi sinh .................... 16 1.6 ẢNH HƢỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN MÔI TRƢỜNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE ....................................................... 17 1.7 TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE ...................... 20 1.8 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU CÓ LIÊN QUAN Ở VIỆT NAM ...................... 22 CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ........................................ 25 2.1 NGUYÊN LIỆU VÀ HÓA CHẤT ............................................................... 25 2.1.1 Chủng nấm .......................................................................................... 25 2.1.2 Thiết bị thí nghiệm .............................................................................. 25 2.1.3 Hóa chất .............................................................................................. 26 2.1.4 Môi trƣờng .......................................................................................... 26 Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2.1.5 Dung dịch và đệm ................................................................................ 27 2.2 PHƢƠNG PHÁP ........................................................................................... 28 2.2.1 Nuôi cấy vi sinh vật ............................................................................. 28 2.2.2 Xác định hoạt tính endoglucanase ........................................................ 28 2.2.3 Khảo sát ảnh hƣởng của một số yếu tố lên khả năng sinh tổng hợp endoglucanase ................................................................................................ 30 2.2.4 Tinh sạch enzyme ................................................................................ 32 2.2.5 Điện di SDS-PAGE ............................................................................. 33 2.2.6 Xác định tính chất lý hóa của endoglucanase ....................................... 34 2.2.7 Xác định hàm lƣợng protein tổng số ..................................................... 35 2.2.8 Các phƣơng pháp sinh học phân tử ...................................................... 36 2.2.9 Xử lý số liệu ........................................................................................ 41 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................... 42 3.1 TUYỂN CHỌN VÀ PHÂN LOẠI CHỦNG ASPERGILLUS AWAMORI SINH TỔNG HỢP ENDOGLUCANASE CAO ........................................................ 42 3.1.1 Tuyển chọn .......................................................................................... 42 3.1.2 Phân loại chủng nấm sợi dựa vào phân đoạn gene 28S rRNA .............. 43 3.2 TỐI ƢU CÁC ĐIỀU KIỆN SINH TỔNG HỢP ENDOGLUCANASE .... 45 3.2.1 Khả năng sinh tổng hợp endoglucanase theo thời gian ......................... 45 3.2.2 Nhiệt độ nuôi cấy ................................................................................ 47 3.2.3 Ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất cảm ứng ............................................ 48 3.2.4 Ảnh hƣởng của nguồn carbon và nồng độ nguồn carbon ...................... 50 3.2.5 Ảnh hƣởng của nguồn nitrogen và nồng độ nguồn nitrogen ................. 52 3.2.6 pH môi trƣờng nuôi cấy ban đầu .......................................................... 54 3.3 TINH SẠCH ENDOGLUCANASE ............................................................ 55 3.3.1 Tinh sạch qua cột sắc ký lọc gel sephadex G-100 ................................ 55 3.3.2 Tinh sạch qua cột sắc ký trao đổi ion DEAE ........................................ 56 3.4 NHỮNG TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA ENDOGLUCANASE ................. 57 3.4.1 Ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất .......................................................... 57 Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 3.4.2 Nhiệt độ phản ứng tối ƣu ..................................................................... 58 3.4.3 pH phản ứng tối ƣu .............................................................................. 60 3.4.4 Độ bền nhiệt độ ................................................................................... 61 3.4.5 Độ bền pH ........................................................................................... 63 3.4.6 Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ ......................................................... 64 3.4.7 Ảnh hƣởng của ion kim loại................................................................. 65 3.4.8 Ảnh hƣởng của một số chất tẩy rửa ...................................................... 67 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................. 69 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 71 PHỤ LỤC ............................................................................................................. 79 Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Các thiết bị chính đƣợc sử dụng trong thí nghiệm ................................. 25 Bảng 2.2. Danh sách hóa chất chính đƣợc sử dụng trong thí nghiệm ..................... 26 Bảng 2.3. Danh sách dung dịch và đệm sử dụng trong thí nghiệm ......................... 27 Bảng 2.4. Thành phần gel điện di biến tính protein ............................................... 33 Bảng 3.1. Hoạt tính endoglucanase của 26 chủng A. awamori ............................... 43 Bảng 3.2. Trình tự nucleotide đoạn gene 28S rRNA chủng A. awamori VTCC-F-099 ...................................................................................... 79 Bảng 3.3. Khả năng sinh tổng hợp endoglucanase theo thời gian .......................... 79 Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy .......................................................... 80 Bảng 3.5. Ảnh hƣởng nồng độ cơ chất cảm ứng .................................................... 80 Bảng 3.6. Ảnh hƣởng của nguồn carbon ................................................................ 50 Bảng 3.7. Ảnh hƣởng của nồng độ lõi ngô ............................................................ 80 Bảng 3.8. Ảnh hƣởng của nguồn nitrogen ............................................................. 52 Bảng 3.9. Ảnh hƣởng của nồng độ ammonium acetate .......................................... 81 Bảng 3.10. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng nuôi cấy ban đầu ................................ 81 Bảng 3.11. Hoạt tính endoglucanase các phân đoạn qua cột Sephadex G-100 ....... 81 Bảng 3.12. Hoạt tính endoglucanase các phân đoạn qua cột sắc ký DEAE ............ 82 Bảng 3.13. Tóm tắt quá trình tinh sạch endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099 ...................................................................................... 57 Bảng 3.14. Ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất đến hoạt tính endoglucanase ............. 82 Bảng 3.15. Ảnh hƣởng của nhiệt độ phản ứng đến hoạt tính endoglucanase .......... 82 Bảng 3.16. Ảnh hƣởng của pH hỗn hợp phản ứng đến hoạt tính endoglucanase .... 83 Bảng 3.17. Độ bền nhiệt độ của endoglucanase ..................................................... 83 Bảng 3.18. Độ bền pH của endoglucanase ............................................................. 84 Bảng 3.19. Độ bền pH theo thời gian của endoglucanase ...................................... 85 Bảng 3.20. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ đến hoạt tính endoglucanase............ 86 Bảng 3.21. Ảnh hƣởng của ion kim loại ................................................................ 66 Bảng 3.22. Ảnh hƣởng của một số chất tẩy rửa đến hoạt tính endoglucanase ........ 86 Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Sơ đồ thủy phân liên kết -1,4-O-glucoside của cellulase ........................ 3 Hình 1.2. Trình tự amino acid tƣơng ứng với cấu trúc bậc 2 của Cel12A từ một số chủng vi sinh vật .................................................................................................... 8 Hình 1.3. Mô hình cấu trúc không gian (A); Sơ đồ trung tâm xúc tác (B) của Cel12A từ H. grisea ......................................................................................... 9 Hình 1.4. Cấu trúc vùng CBD của Cel12A từ Humicola grisea ............................. 10 Hình 1.5. Cơ chế thủy phân phân tử cellulose (A) và phức hệ cellulose (B) của các enzyme thuộc phức hệ cellulase ............................................................................. 11 Hình 2.1. Đƣờng chuẩn nồng độ glucose............................................................... 30 Hình 2.2. Quy trình tinh sạch endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099 . 33 Hình 2.3. Đƣờng chuẩn Bradford dùng BSA làm chuẩn ........................................ 36 Hình 3.1. Hoạt tính endoglucanase của 26 chủng A. awamori nghiên cứu ............. 42 Hình 3.2. Điện di đồ DNA tổng số (A); Sản phẩm PCR (B): với khuôn DNA tách chiết từ chủng A. awamori VTCC-F-099; Sản phẩm cắt vector tái tổ hợp bằng XbaI và XhoI (C). ................................................................................................. 44 Hình 3.3. Cây phân loại chủng A. awamori VTCC-F-099 ..................................... 45 Hình 3.4. Khả năng sinh tổng hợp endoglucanase theo thời gian của chủng A. awamori VTCC-F-099 ..................................................................................... 46 Hình 3.5. Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp endoglucanase của chủng A. awamori VTCC-F-099 ............................................. 48 Hình 3.6. Ảnh hƣởng của nồng độ CMC đến khả năng sinh tổng hợp endoglucanase của chủng A. awamori VTCC-F-099 .................................................................... 49 Hình 3.7. Ảnh hƣởng của nồng độ lõi ngô đến khả năng sinh tổng hợp endoglucanase của chủng A. awamori VTCC-F-099 ............................................. 51 Hình 3.8. Ảnh hƣởng của nồng độ ammonium acetate đến khả năng sinh tổng hợp endoglucanase của chủng A. awamori VTCC-F-099 .............................................. 53 Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Hình 3.9. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp endoglucanase của chủng A. awamori VTCC-F-099 ............................................. 54 Hình 3.10. Điện di đồ trên gel polyacrylamide sản phẩm tinh sạch endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099 qua cột Sephadex G-100 ............................... 56 Hình 3.11. Điện di đồ sản phẩm tinh sạch endoglucanase trên gel polyacrylamide....... ............................................................................................... 57 Hình 3.12. Ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất lên hoạt tính endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099 ...................................................................................... 58 Hình 3.13. Ảnh hƣởng của nhiệt độ phản ứng lên hoạt tính endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099 ...................................................................................... 60 Hình 3.14. Ảnh hƣởng của pH phản ứng lên hoạt tính endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099 ...................................................................................... 61 Hình 3.15. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên độ bền endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099 ...................................................................................... 62 Hình 3.16. Ảnh hƣởng của pH tới độ bền endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099 ...................................................................................... 63 Hình 3.17. Ảnh hƣởng của pH tới độ bền endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099 theo thời gian ................................................................ 64 Hình 3.18. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ lên hoạt tính endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099. ..................................................................................... 65 Hình 3.19. Ảnh hƣởng của chất tẩy rửa lên hoạt tính endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099. ..................................................................................... 68 Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1 1 MỞ ĐẦU Cellulose là một thành phần quan trọng cấu tạo nên lớp thành tế bào thực vật. Đó là một loại polysaccharide có cấu trúc phức tạp. Việc phân hủy cellulose bằng các tác nhân lý hóa gặp nhiều khó khăn, làm ảnh hƣởng đến tốc độ của nhiều quá trình sản xuất công nghiệp. Endo-β-1,4-glucanase (3.2.1.4) là một trong ba loại enzyme thuộc hệ enzyme thủy phân cellulose (cellulase). Enzyme này tham gia phân cắt ngẫu nhiên các liên kết β-1,4 glucoside từ bên trong các phân tử cellulose và một số loại polysaccharide tƣơng tự khác tạo thành các oligosaccharide. Endo-β-1,4-glucanase có thể đƣợc sản xuất bởi rất nhiều loại vi sinh vật nhƣ vi khuẩn, nấm men, nấm mốc. Ngoài ra, endo-β-1,4-glucanase còn có ở thực vật, động vật nguyên sinh và một số loài động vật không xƣơng sống khác. Các enzyme có nguồn gốc khác nhau sẽ có cấu trúc khác nhau. Điều này dẫn tới sự khác nhau về hoạt tính xúc tác và điều kiện phản ứng tối ƣu của các enzyme. Hiện nay, việc sử dụng các enzyme nhƣ endo-β-1,4-glucanase trong một số ngành công nghiệp nhƣ: công nghiệp thực phẩm, công nghiệp chế biến thức ăn gia súc, công nghiệp giấy, bột giặt, sản xuất dung môi hữu cơ và xử lý môi trƣờng là rất quan trọng, mang lại nhiều giá trị to lớn. Tuy nhiên, những enzyme và chế phẩm có liên quan đƣợc sử dụng trong các ngành công nghiệp ở Việt Nam và một số nƣớc hiện nay chủ yếu đƣợc nhập khẩu từ nƣớc ngoài với giá thành cao. Vì thế, việc nghiên cứu, sản xuất ra các chế phẩm enzyme có nguồn gốc tự nhiên đang là một đòi hỏi cấp thiết đối với nhiều quốc gia trên thế giới trong đó có Việt Nam. Nƣớc ta là một nƣớc sản xuất nông nghiệp nên nguồn nguyên liệu dùng để sản xuất các enzyme nhƣ endo-β-1,4-glucanase là rất phong phú. Xuất phát từ những lý do Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2 trên và tình hình nghiên cứu tại Việt Nam, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “Tuyển chọn, nuôi cấy chủng Aspergillus awamori sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase và đánh giá tính chất lý hóa của endo-β-1,4- glucanase” với các mục tiêu: (1) Tuyển chọn các chủng Aspergillus awamori sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase cao và tìm môi trƣờng nuôi cấy thích hợp để tạo endo-β-1,4-glucanase ngoại bào, (2) Tinh sạch đƣợc endo-β-1,4- glucanase và đánh giá một số tính chất lý hóa của nó. Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 3 2 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 KHÁI NIỆM VỀ CELLULASE VÀ ENDO-β-1,4-GLUCANASE Cellulase là nhóm enzyme thủy phân có khả năng cắt mối liên kết -1,4-O-glucoside trong phân tử cellulose và một số cơ chất tƣơng tự khác. Đó là một phức hệ gồm nhiều loại enzyme khác nhau và đƣợc xếp thành 3 nhóm cơ bản: endo-β-1,4-glucanase hay carboxymethyl cellulase (CMCase) (EC 3.2.1.4), exo-β-1,4-glucanase hay cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) và β-glucosidase hay β-D-glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21) [30], [39]. Mỗi loại enzyme tham gia thủy phân cơ chất theo một cơ chế nhất định và nhờ có sự phối hợp hoạt động của các enzyme đó mà phân tử cơ chất đƣợc thủy phân hoàn toàn tạo thành các sản phẩm đơn giản nhất. Endo-β-1,4-glucanase là loại enzyme tham gia xúc tác phản ứng thủy phân các liên kết β-1,4 glucoside ở bên trong các phân tử cellulose và một số cơ chất tƣơng tự khác thành các sản phẩm đơn giản hơn (các oligosaccharide). Hình 1.1. Sơ đồ thủy phân liên kết -1,4-O-glucoside của cellulase Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 4 2.2 NGUỒN GỐC VÀ PHÂN LOẠI ENDO-β-1,4-GLUCANASE 2.2.1 Nguồn gốc Endo-β-1,4-glucanase có thể đƣợc tổng hợp từ rất nhiều nguồn khác nhau trong tự nhiên, trong đó chủ yếu có nguồn gốc từ vi sinh vật. Trong tự nhiên có rất nhiều chủng vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc và một số loại nấm men có khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase. Nấm mốc là một trong những đối tƣợng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase mạnh nhất. Nhiều chủng nấm mốc thuộc các chi Aspergillus, Trichoderma, Penicillium, Phanerochaete đã đƣợc nghiên cứu là có khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase mạnh nhƣ: Aspergillus niger [25], [26], A. flavus, A. fumigatus [27] A. terreus [29] Trichoderma reesei [53], Penicillium persicinum, P. brasilianum [33], Penicillium sp. [10], Phanerochaete chrysosporium [34]. Bên cạnh nấm mốc, vi khuẩn cũng đƣợc xem là một trong những đối tƣợng có khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase khá phong phú. Nhiều loài vi khuẩn hiếu khí đã đƣợc nghiên cứu là có khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase mạnh nhƣ Acidothemus cellulobuticus [22], Bacillus pumilis [32], Cellulomonas flavigena, C. udai [20], [21], Pseudomonas fluoressens [42]. Không chỉ có các vi khuẩn hiếu khí mà một số vi khuẩn kỵ khí cũng có khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase mạnh nhƣ Clostridium [57]. Nhiều chủng xạ khuẩn thuộc chi Actinomyces, Streptomyces cũng có khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase mạnh nhƣ: Actinomyces griseus [13], Streptomyces reticuli [61]. Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 5 Ngoài ra, endo-β-1,4-glucanase còn đƣợc sinh tổng hợp ở thực vật Arabidopsis [23], ở động vật nguyên sinh và một số động vật không xƣơng sống khác nhƣ mối [62], ở động vật thân mềm nhƣ Mytilus edulis [63]. Trong số các nguồn sinh enzyme trên thì vi sinh vật đƣợc xem là nguồn cung cấp enzyme với nhiều ƣu điểm nổi bật và có tính chất độc đáo vƣợt xa so với enzyme có nguồn gốc từ động vật, thực vật. Vì thế, chúng đƣợc sử dụng rộng rãi trong quá trình sản xuất các chế phẩm enzyme. Trƣớc hết, vi sinh vật là nguồn nguyên liệu vô tận để sản xuất enzyme với số lƣợng lớn. Đây cũng là nguồn nguyên liệu mà con ngƣời chủ động tạo ra đƣợc. Chu kỳ sinh trƣởng của vi sinh vật ngắn (từ 16-100 giờ). Vi sinh vật sinh trƣởng, phát triển với tốc độ cực kỳ nhanh chóng, khối lƣợng lại nhỏ, kích thƣớc bé, nhƣng tỷ lệ enzyme trong tế bào tƣơng đối lớn nên quy trình sản xuất chế phẩm enzyme khá dễ dàng, hiệu suất thu hồi cao. Hơn nữa, enzyme từ vi sinh vật có hoạt tính rất mạnh, vƣợt xa các sinh vật khác. Đối với một số trƣờng hợp có thể dùng 100% sinh khối vi sinh vật làm nguồn enzyme. Vi sinh vật rất nhạy cảm đối với tác động của môi trƣờng, thành phần dinh dƣỡng nuôi chúng cũng nhƣ một số tác nhân lý hóa, cơ học khác. Do đó có thể thay đổi những điều kiện nuôi cấy để chọn những chủng cho hàm lƣợng enzyme đáng kể với hoạt tính xúc tác cao. Có thể nói rằng, với vi sinh vật, ngƣời ta có thể điều khiển sự tổng hợp enzyme dễ dàng hơn trên các đối tƣợng khác để tăng lƣợng enzyme đƣợc tổng hợp hoặc tổng hợp định hƣớng enzyme. Tuy vậy, trong quá trình chọn nguồn nguyên liệu từ vi sinh vật, cần lƣu ý một số vi sinh vật có khả năng sinh độc tố để có biện pháp xử lý thích hợp. Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 6 2.2.2 Phân loại Theo Ủy ban danh pháp của Hiệp hội Hóa sinh và Sinh học phân tử Quốc tế, cellulase thuộc lớp 3 (hydrolase): các enzyme xúc tác phản ứng thủy phân, tổ 2 (glycosidase): thủy phân các liên kết glycoside, nhóm 1: thủy phân liên kết O- và S-glycoside (International Union of Biochemistry and Molecular Biology, 1992; pedro/CAZY/db.html). Cellulase là một phức hệ gồm nhiều loại enzyme khác nhau. Tùy theo quan điểm của từng tác giả mà các enzyme thuộc phức hệ cellulase đƣợc xếp thành các nhóm khác nhau. Trƣớc đây, cellulase đƣợc chia làm hai nhóm: nhóm enzyme C1 và nhóm enzyme Cx. Các enzyme C1 có khả năng thủy phân sợi cellulose tự nhiên, có tính đặc hiệu không rõ ràng. Các enzyme Cx đƣợc chia thành hai loại: exo -1,4-glucanase (3.2.1.21) xúc tác cho phản ứng cắt đứt gốc glucose từ đầu không khử của chuỗi cellulose; endo -1,4-glucanase (3.2.1.4) hoạt động tùy tiện hơn, xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết bên trong phân tử cellulose [7]. Hiện nay, cellulase đƣợc chia làm ba dạng: dạng 1 là endoglucanase hoặc 1,4--D-glucan-4-glucanohydrolase hay carboxylmethylcellulase (CMCase) (EC 3.2.1.4), dạng 2 là exoglucanase bao gồm 1,4--D-glucan glucanohydrolase (còn gọi là cellodextrinase) (EC 3.2.1.74) và 1,4--D-glucan cellobiohydrolase (cellobiohydrolase) (EC 3.2.1.91), dạng 3 là -glucosidase hoặc -glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21). Endoglucanase xúc tác cho phản ứng thủy phân các liên kết ở bên trong phân tử cellulose. Exoglucanase thủy phân các liên kết ở đầu khử và đầu không khử của phân tử cellulose. -glucosidase thủy phân các phân tử cellodextrin và cellobiose thành glucose [30], [39], [45]. Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 7 Các cellulase có nguồn gốc khác nhau đƣợc sắp xếp thành các họ. Trƣớc đây, dựa vào cấu trúc bậc một của phân tử protein enzyme, cellulase đƣợc chia làm 6 họ: A, B, C, D, E và F [35]. Sau đó, cellulase đƣợc chia thành 9 họ: A, B, C, D, E, F, G, H và I dựa vào cấu trúc của tâm xúc tác [31]. Hiện nay, các cellulase đƣợc sắp xếp trong 12 họ: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 44, 45, 48, 61 và 74 [45]. 2.3 CẤU TRÚC CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE 2.3.1 Cấu trúc bậc một Endoglucanase từ các nguồn gốc khác nhau có thành phần cấu tạo và cấu trúc khác nhau. Sự khác nhau đó thể hiện trƣớc hết ở sự đa dạng về khối lƣợng phân tử, thành phần và trật tự sắp xếp của các amino acid trên chuỗi polypeptide. Chủng A. oryzae KBN616 có khả năng sinh tổng hợp hai loại endoglucanase là Cel A và Cel B. Phân tử protein Cel A gồm 239 amino acid, trọng lƣợng phân tử 31 kDa, đƣợc xếp vào họ cellulase H. Trong khi đó, Cel B đƣợc xếp vào họ cellulase C với chiều dài 416 amino acid và khối lƣợng phân tử 53 kDa [43]. Phân tử endoglucanase từ A. aculeatus bao gồm 410 amino acid với khối lƣợng phân tử khoảng 43,7 kDa [59]. Các endoglucanase từ chủng A. niger Z10 có khối lƣợng phân tử 83 kDa và 50 kDa [25], từ A. terreus là 25 kDa [29], từ Trichoderma reesei là 48 kDa và 55 kDa [40], [47], từ Bacillus sp. D04 có khối lƣợng 35 kDa [56]. Sandgren và cs (2003) đã có những nghiên cứu chi tiết về cấu trúc Cel12A thuộc họ 12 (GH 12) endoglucanase từ nấm chịu nhiệt Humicola grisea. Cel12A của H. grisea là một chuỗi polypeptide gồm 224 amino acid cấu tạo nên các chuỗi ,  và các vùng nối (Hình 1.2) [55]. Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 8 Hình 1.2. Trình tự amino acid tƣơng ứng với cấu trúc bậc 2 của Cel12A từ một số chủng vi sinh vật [55]. Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 9 2.3.2 Cấu trúc không gian Sự khác nhau về cấu trúc của các enzyme còn thể hiện ở sự sắp xếp trong không gian các chuỗi polypeptide, các trung tâm xúc tác và các vùng liên kết cơ chất. Chính nhờ sự khác nhau về cấu trúc không gian của các protein enzyme dẫn tới sự khác nhau về các tính chất hóa lý của chúng. Phân tử Cel12A của H. grisea cấu tạo bởi 1 chuỗi , 2 chuỗi  (A và B). Chuỗi -A đƣợc cấu tạo bởi 6 dải xoắn  (A1-A6), chuỗi -B đƣợc cấu tạo bởi 9 dải xoắn  (B1-B9). Các dải xoắn  đƣợc nối với nhau bởi các vùng nối, có 4 vùng nối lớn 29-32, 40-47, 92-96, và 165-169 nối tƣơng ứng các dải xoắn : B2-A2, A2-A3, A5-B5 và A6-B7 (Hình 1.3A) [55]. 2.3.3 Cấu trúc của trung tâm xúc tác và vùng liên kết cơ chất Trung tâm xúc tác của Cel12A từ H. grisea gồm 2 amino acid là glutamic acid E-120 và E-205 (Hình 1.3B), còn ở Cel12A từ Trichoderma reesei là E-116 và E-200 [55]. Hình 1.3. Mô hình cấu trúc không gian (A); Sơ đồ trung tâm xúc tác (B) của Cel12A từ H. grisea [55] Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 10 Vai trò liên kết cơ chất khi tham gia xúc tác thủy phân cellulose của các cellulase đƣợc thực hiện nhờ các vùng liên kết đặc hiệu cellulose bind domain (CBD). Các CBD có thể nằm trong trung tâm hoạt động của enzyme hoặc không. Tùy thuộc vào từng loại enzyme mà vùng liên kết này có cấu tạo hóa học và cấu trúc không gian khác nhau. Cel12A của H. grisea có 3 vùng liên kết với sự tham gia của các amino acid, trong đó cystein (C175, C206, C216) đóng vai trò trung tâm. CBD1 với C175 làm trung tâm nằm trên dải xoắn -A6 liên kết yếu với các amino acid T85, I123, A144, F173, I177, và F180 bằng tƣơng tác Van der Walls. Liên kết giữa các amino acid trong CBD1 có kích thƣớc 3,5 đến 4,1 Å (Hình 1.4A). CBD2 với C206 làm trung tâm nằm trên dải xoắn -B4 liên kết với các amino acid Q34, W52, W54, S63, P65, Y91, A98 và T204. Liên kết giữa các amino acid trong CBD2 có kích thƣớc 3,3 đến 4,9 Å và CBD2 chứa trung tâm hoạt động (Glu 205) (Hình 1.4B). CBD3 với C216 làm trung tâm nằm trên dải xoắn -A4 liên kết với các amino acid W48, V87, W89, F214 và F219. Liên kết giữa các amino acid trong CBD3 có kích thƣớc 3,3 đến 4,8 Å (Hình 1.4C) [55]. Hình 1.4. Cấu trúc vùng CBD của Cel12A từ Humicola grisea [55] Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 11 2.4 CƠ CHẾ XÚC TÁC CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE Mỗi dạng enzyme trong phức hệ cellulase tham gia thủy phân phân tử cơ chất theo một cơ chế riêng. Tuy nhiên, những enzyme này thƣờng phối hợp hoạt động để thủy phân hoàn toàn phân tử cơ chất thành sản phẩm đơn giản nhất là glucose. Endo-β-1,4-glucanase tham gia thuỷ phân các liên kết β-1,4 glucoside ở bên trong các phân tử cellulose và một số loại polysaccharide tƣơng tự khác. Sản phẩm phân cắt là các oligosaccharide. Exoglucanase thủy phân các liên kết ở đầu khử và đầu không khử của phân tử cơ chất, giải phóng các oligosaccharide, cellobiose và glucose. -Glucosidase thủy phân các phân tử cellodextrin và cellobiose tạo thành các phân tử glucose [45], [58] (Hình 1.5). Hình 1.5. Cơ chế thủy phân phân tử cellulose (A) và phức hệ cellulose (B) của các enzyme thuộc phức hệ cellulase Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 12 2.5 ỨNG DỤNG CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE Các cellulase nói chung và endo-β-1,4-glucanase nói riêng đƣợc ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp nhƣ: công nghiệp thực phẩm, công nghiệp sản xuất thức ăn gia súc, công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ, sản xuất chất tẩy rửa, công nghiệp giấy và bột giấy, đặc biệt trong công nghệ xử lý rác thải sản xuất phân bón vi sinh. 2.5.1 Trong công nghiệp thực phẩm Sử dụng các chế phẩm enzyme có thể coi là một trong những phƣơng hƣớng tiến bộ có triển vọng nhất của sản xuất nƣớc quả và nƣớc uống không cồn. Dịch quả sau khi ép chiết thƣờng chứa các thành phần tế bào thịt quả và các chất sơ có bản chất polysaccharide làm cho dịch có độ nhớt cao và màu đục. Glucanase thƣờng đƣợc sử dụng để phá vỡ thành tế bào, thủy phân các polysaccharide làm giảm độ nhớt của dịch quả tạo thuận lợi cho quá trình tách chiết và làm trong. Glucanase kết hợp với các hemicellulase, pectinase trong chế phẩm enzyme Viscozyme 120L đƣợc ứng dụng chủ yếu để xử lý phá vỡ màng tế bào đậu tƣơng [14]. Trong quá trình sản xuất nƣớc cà rốt thƣờng sử dụng endoglucanase xử lý ở giai đoạn dịch hóa đã tạo ra nhiều pectin hơn. Trong công nghệ sản xuất bia, dịch lên men ngoài các thành phần đƣờng, protein còn có một lƣợng không nhỏ các phân tử khối lƣợng cao nhƣ cellulose và -glucan, làm ảnh hƣởng xấu đến quá trình lọc và chất lƣợng sản phẩm. Ngƣời ta thƣờng sử dụng -glucanase để loại bỏ những thành phần này. Các chế phẩm nhƣ Finizym 200L gồm các cellulase từ A. niger, -glucanase từ Bacillus subtillis, Disporotrichum dimorphosporum đã đƣợc sử dụng trong sản xuất bia. Ngoài ra, endoglucanase còn đƣợc sử dụng trong công nghệ sản xuất bánh mì, bánh bisqui và thực phẩm chức năng. Glucanase từ Humicola Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 13 insolens đƣợc ứng dụng trong sản xuất bánh mì, làm tăng độ mềm và xốp cho bánh mỳ. Glucanase từ Trichoderma reesei, A. niger đƣợc ứng dụng trong sản xuất fructooligosaccharide. Đây là một trong số các oligosaccharide chức năng (prebiotic) đƣợc sản xuất để bổ sung vào khẩu phần ăn. Prebiotic có nhiều lợi ích về mặt dƣợc phẩm cũng nhƣ có ảnh hƣởng tốt đến sức khỏe. Khi đƣợc bổ sung vào cơ thể ngƣời và động vật, prebiotic có nhiều tác động sinh lý quan trọng nhƣ: ngăn cản quá trình xâm nhập của các vi sinh vật gây bệnh, bảo vệ các chức năng của gan, làm giảm lƣợng cholesterol trong huyết thanh, tăng khả năng miễn dịch của cơ thể, kháng lại bệnh ung thƣ, cản trở sự phát triển của các vi sinh vật trong khoang miệng [38], [64]. Các phế phụ phẩm nông nghiệp nhƣ lõi ngô, bã mía, bã sắn, vỏ trấu là cơ chất lý tƣởng cho việc sản xuất các oligosaccharide. Các enzyme tốt nhất sử dụng cho quá trình này chủ yếu có nguồn gốc từ nấm mốc. Hiện nay, nhu cầu sử dụng các oligosaccharide ở các nƣớc trên thế giới là rất lớn. Tại Nhật Bản, nhu cầu hàng năm về các oligosaccharide vào khoảng 1000-2000 tấn/năm [48]. 2.5.2 Trong công nghiệp sản xuất thức ăn gia súc Chăn nuôi là một nhánh quan trọng của ngành nông nghiệp Việt Nam. Thu nhập từ chăn nuôi hàng năm đạt 20% tổng giá trị kinh tế của ngành nông nghiệp. Chăn nuôi không những cung cấp các loại thực phẩm nhƣ trứng, thịt, sữa cho thị trƣờng mà còn cung cấp nguồn phân bón rất hữu ích cho ngành trồng trọt. Đây cũng là nguồn thu nhập đáng kể góp phần xóa đói giảm nghèo, nâng cao đời sống cho ngƣời dân Việt Nam. Tuy nhiên, ngành nông nghiệp nói chung và chăn nuôi nói riêng đang gặp phải nhiều khó khăn. Một trong những vấn đề cần đƣợc giải quyết hiện nay là làm thế nào để nâng cao năng suất vật nuôi, tăng hiệu quả chăn nuôi mà vẫn đảm bảo an toàn cho môi trƣờng xung quanh, đặc biệt là sức khỏe con ngƣời. Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 14 Trƣớc tình hình đó, nhiều nhóm giải pháp đã đƣợc đƣa ra và một trong những giải pháp đƣợc nhiều nhà khoa học quan tâm là sử dụng các loại thức ăn chăn nuôi có nguồn gốc sinh học hoặc bán sinh học nhƣ sản xuất và bổ sung các chế phẩm enzyme vào trong thức ăn chăn nuôi. Bổ sung chế phẩm enzyme vào thức ăn chăn nuôi một mặt làm tăng khả năng tiêu hóa thức ăn và hấp thụ chất dinh dƣỡng, từ đó làm tăng tốc độ sinh trƣởng phát triển, nâng cao chất lƣợng vật nuôi. Mặt khác, nhờ tác dụng của enzyme mà thức ăn đƣợc tiêu hóa triệt để, khai thác tối đa nguồn năng lƣợng vốn có, tiết kiệm chi phí chăn nuôi, đồng thời làm giảm lƣợng phân thải ra ngoài, góp phần quan trọng trong việc giảm thiểu ô nhiễm môi trƣờng. Thức ăn gia súc, gia cầm đƣợc chế biến từ các loại ngũ cốc có chứa nhiều cellulose và glucan. Những thành phần này thƣờng không đƣợc tiêu hóa triệt để, làm tăng độ nhớt của dịch dạ dày. Do đó chúng đã hạn chế sự hấp thu các chất dinh dƣỡng, làm giảm khả năng tiêu hóa của động vật. Bổ sung -glucanase vào thức ăn sẽ làm tăng khả năng phân giải các hợp chất trên, giải phóng glucose và các oligosaccharide, làm giảm độ nhớt, tăng khả năng hấp thu và chuyển hóa thức ăn [14]. Nhiều nghiên cứu cho thấy, khi bổ sung glucanase độc lập hoặc kết hợp với các enzyme khác vào thức ăn chăn nuôi làm tăng đáng kể tốc độ tăng trƣởng và giảm thiểu bệnh tật cho vật nuôi. Omogbenigun và cs (2004) cho thấy, khi bổ sung tổ hợp chế phẩm glucanase và một số enzyme khác (amylase, invertase, protease, phytase, xylanase) xử lý thức ăn cho lợn con 25 ngày tuổi có tác dụng nâng cao khả năng tiêu hóa so với đối chứng là khẩu phần cơ sở không bổ sung enzyme nhƣ sau: khả năng tiêu hóa tinh bột tăng 87-94%, các polysaccharide khác tăng 10-18%, phytate tăng 59-70% [52]. Tiềm năng ứng dụng to lớn của glucanase trong chăn nuôi đã thu hút sự quan tâm của nhiều công ty chế biến thức ăn gia súc, gia cầm. Một số chế Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 15 phẩm là tổ hợp các enzyme khác nhau có thể kể đến nhƣ: Rovazyme G2 (DSM Nutritional Products Ltd, Thụy Sỹ) là tổ hợp của 3 loại enzyme (cellulase, β-glucanase và xylanase); Roxazyme G (DSM Nutritional Products Ltd, Thụy Sỹ) là tổ hợp của 7 loại enzyme (cellulase, glucanase, protease, amylase, pectinase, xylanase, hemicellulase); Natugrain (tập đoàn BASF, Đức) là hỗn hợp của endoxylanase và endoglucanase; Rhodizyme-CF (Rampart-Power Bangladesh Ltd) là tổ hợp của 5 loại enzyme (cellulase, amylase, protease, lipase, pectinase). Chế phẩm SSF của Mỹ hiện đang bán tại thị trƣờng Việt Nam là tổ hợp của 6 loại enzyme: β-glucanase (200 BGU/g), phytase (1000 PU/g), α-amylase (30 FAU/g), pectinase (4000 AJDU/g), protease (700 HUT/g) và xylanase (100 XU/g) [3]. Ở Việt Nam đã có một số nghiên cứu về ứng dụng enzyme trong chăn nuôi. Chu Thị Thanh Bình và cs (2002) đã nghiên cứu ứng dụng các chủng nấm men trong chế biến bã thải từ hoa quả giàu chất sơ làm thức ăn cho gia súc [2]. 2.5.3 Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ Sử dụng glucanase xử lý nguyên liệu giàu cellulose, glucan trƣớc khi lên men đã làm tăng hiệu suất thu hồi dung môi lên trung bình là 1,5%. Nhiều chế phẩm enzyme đã đƣợc sử dụng trong ngành công nghiệp này nhƣ neutrase 0,5L có chứa -glucanase sử dụng trong công nghiệp sản xuất ethanol. Đồng thời, nhiều chủng vi sinh vật kỵ khí trong chi Clostridium sinh tổng hợp glucanase đƣợc sử dụng trong công nghệ lên men sản xuất dung môi hữu cơ, acetic acid [24], sản xuất acetone, butanol và isopropanol [28]. 2.5.4 Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy, nguyên liệu ban đầu đƣợc nghiền cơ học và xử lý hóa học để các sợi gỗ đƣợc tách riêng khỏi nhau Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 16 chuyển thành bột giấy chứa các sợi và bột mịn. Trong quy trình sản xuất giấy cần loại bỏ lignin khỏi bột giấy, còn cellulose thì đƣợc giữ lại. Phƣơng pháp thông thƣờng là bổ sung dung dịch chlor hoặc chlor diocide. Đây là một phƣơng pháp tốn kém và thƣờng gây ô nhiễm môi trƣờng do thành phần chlor tồn dƣ trong nƣớc thải. Vì thế, trong những năm gần đây một giải pháp mới đƣợc đƣa ra để thay thế phƣơng pháp truyền thống, đó là sử dụng các chế phẩm enzyme trong đó có glucanase để xử lý bột giấy. Glucanase thƣờng đƣợc bổ sung vào công đoạn nghiền bột giấy để làm thay đổi nhẹ cấu hình của sợi cellulose, tăng khả năng nghiền và tiết kiệm khoảng 20% năng lƣợng cho quá trình nghiền cơ học. Đồng thời xử lý glucanase trƣớc khi xử lý hóa chất nghiền bột hóa học sẽ làm phá vỡ lớp vỏ ngoài của gỗ, làm tăng khả năng khuếch tán của hóa chất vào phía trong gỗ, tăng hiệu quả khử lignin [14], [15]. Đặc biệt trong công nghệ tái chế giấy, glucanase đƣợc sử dụng để tẩy mực in bám trên giấy. Kỹ thuật này đã mở ra triển vọng đầy hứa hẹn cho ngành công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy tái sinh [37]. 2.5.5 Trong công nghiệp sản xuất chất tẩy rửa Cùng với protease, lipase, amylase, cellulase và hemicellulase đƣợc ứng dụng để sản xuất chất tẩy rửa. Cellulase sẽ thủy phân các tơ sợi của sợi vải là nơi bám của các phân tử bụi bẩn, loại bỏ chúng khỏi quần áo. Tính đến năm 2002 đã có nhiều cellulase đƣợc sản xuất dùng cho bột giặt nhƣ: endoglucanase và exoglucanase từ Thermomyces lanuginous [51]. 2.5.6 Trong công nghệ xử lý rác thải sản xuất phân bón vi sinh Việc sử dụng enzyme quan trọng nhất trong công tác bảo vệ môi trƣờng là sử dụng enzyme trong xử lý chất thải, chuyển các chất thải thành sản phẩm có ích, hoặc trong công nghệ tái sử dụng phế thải, chuyển các phế thải Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 17 thành sản phẩm có ích. Trong nhiều năm qua cả ở thế giới và Việt Nam, các chủng vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme phân hủy cellulose đã đƣợc ứng dụng rất có hiệu quả để xử lý rác thải sinh hoạt. Năm 1999, Nguyễn Lan Hƣơng và cs đã phân lập và tuyển chọn đƣợc các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn có hoạt tính cellulase, sau đó bổ sung vào bể ủ rác thải đã rút ngắn đƣợc chu kỳ xử lý rác thải sinh hoạt từ 5-7 ngày. Nhiều chủng vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm đã đƣợc nghiên cứu và ứng dụng có hiệu quả trong quá trình xử lý rác thải ở Việt Nam [1], [5], [8], [12]. Nhiều chế phẩm vi sinh trong đó có chứa hệ sinh vật sinh tổng hợp cellulase đã đƣợc nghiên cứu và sản xuất để xử lý rác thải. Trong đó, chế phẩm Micromix 3 khi bổ sung vào bể ủ rác thải có thổi khí đã rút ngắn đƣợc 15 ngày ủ, giảm một nửa thời gian lên men so với đối chứng. Đồng thời, lƣợng mùn tạo thành khi xử lý rác bằng chế phẩm Micromix 3 cao hơn 29% và các chất dinh dƣỡng cao hơn 10% so với đối chứng. Sản phẩm của quá trình xử lý rác thải đƣợc phối trộn và bổ sung thêm một số vi sinh vật có ích cố định đạm tạo thành phân bón vi sinh, đƣợc sử dụng rộng rãi trong nông nghiệp đã góp phần nâng cao năng suất cây trồng, giảm thiểu đƣợc nguồn và nguy cơ gây ô nhiễm môi trƣờng [1]. Ngoài ra, đã có những nghiên cứu ảnh hƣởng của cellulase đến nấm gây bệnh cây trồng nhƣ cellulase của Trichoderma harzianum, từ đó ứng dụng sản xuất thuốc bảo vệ thực vật sinh học [6]. 2.6 ẢNH HƢỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN MÔI TRƢỜNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE Trong tự nhiên, đa số các loài vi sinh vật sống hoại sinh, phân giải các nguồn hợp chất hữu cơ có sẵn trong môi trƣờng thành các chất dinh dƣỡng cần thiết cho quá trình sinh trƣởng và phát triển của mình. Khả năng Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 18 sinh trƣởng, phát triển cũng nhƣ khả năng sinh tổng hợp các enzyme chịu sự tác động của nhiều yếu tố môi trƣờng nhƣ: nhiệt độ nuôi cấy, pH môi trƣờng, nguồn carbon, nguồn nitrogen. Nguồn carbon: các loài vi sinh vật sinh tổng hợp endoglucanase có thể sử dụng nhiều nguồn carbon khác nhau tùy thuộc đặc điểm của từng loài. Có loài chỉ thích hợp với một hoặc một số ít nguồn carbon, có loài thì không đòi hỏi nghiêm ngặt mà có khả năng sử dụng nhiều nguồn carbon khác nhau. Nguồn carbon có thể đơn giản nhƣ các loại đƣờng đơn, đƣờng đôi hoặc phức tạp nhƣ glucan, tinh bột, cellulose. Nghiên cứu của Tăng Thị Chính và cs (1999) cho thấy, nguồn carbon thích hợp cho sinh trƣởng và sinh tổng hợp cellulase của các chủng vi khuẩn chịu nhiệt phân lập từ bể ủ rác thải là glucose và CMC. Nguồn carbon thích hợp cho sự sinh trƣởng và sinh tổng hợp cellulase của các chủng xạ khuẩn CD6-9 là tinh bột, chủng CD9-9 là CMC và saccharose, chủng CD5-12 là lactose [5]; các chủng Actinomyces griseus là bã mía hoặc mùn cƣa. Nguồn carbon thích hợp đối với các chủng xạ khuẩn ƣu ấm là vỏ lạc hoặc rơm [12]. Đối với các chủng nấm mốc, nguồn carbon thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp cellulase và một số loại enzyme khác là các nguồn carbon tự nhiên, đặc biệt là các phế phụ phẩm nông nghiệp. Theo Acharya và cs (2008), nguồn carbon thích hợp nhất cho các chủng A. niger sinh tổng hợp endoglucanase là mùn cƣa [18]. Còn theo kết quả nghiên cứu của Ojumu và cs (2003), chủng A. flavus Linn isolate NSPR 101 có khả năng sinh tổng hợp cellulase khi sử dụng mùn cƣa, bã mía hay lõi ngô làm nguồn cơ chất, trong đó mùn cƣa đƣợc xem là nguồn cơ chất tối ƣu. Các loài Penicillium pinophilum, P. persicinum, P. brasilianum sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất đối với nguồn cellulose tự nhiên, còn đối Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 19 với nguồn carbon xylan hoặc birchwood xylan thì khả năng sinh tổng hợp rất kém [33]. Theo kết quả nghiên cứu của Trịnh Đình Khá (2006), nguồn carbon thích hợp nhất cho chủng Penicillium sp. DTQ-HK1 là rơm [10]. Nguồn nitrogen: các loài vi sinh vật khác nhau có nhu cầu khác nhau đối với nguồn nitrogen. Nhìn chung, các loài đều có khả năng sử dụng cả nguồn nitrogen vô cơ và hữu cơ nhƣng mức độ đồng hóa tùy thuộc từng loài. Các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn chịu nhiệt sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất trong môi trƣờng chứa nguồn nitrogen là peptone và cao nấm men [5]. Nguồn nitrogen urea và đậu nành ảnh hƣởng mạnh mẽ đến quá trình sinh tổng hợp cellulase của chủng A. niger NRRL-363 với hoạt tính cellulase tổng số từ 46 đến 76 IU/g [11]. Nghiên cứu của Narasimha và cs (2006) cho thấy, các chủng A. niger có thể sử dụng nhiều nguồn nitrogen khác nhau nhƣ: urea, peptone, ammonium nitrate. Trong đó, urea là nguồn nitrogen tốt nhất cho khả năng sinh tổng hợp các cellulase của các chủng nấm này [49]. Nhiệt độ nuôi cấy: Căn cứ vào sự thích nghi nhiệt độ sinh trƣởng, các loài vi sinh vật đƣợc chia làm 3 nhóm: các loài ƣa lạnh và chịu lạnh; các loài ƣa ấm và các loài chịu nhiệt. Các loài ƣa lạnh có khả năng sinh trƣởng trong điều kiện dƣới 15C, các loài ƣa ấm thƣờng sinh trƣởng phát triển tốt ở khoảng nhiệt độ 20-37C; còn các loài chịu nhiệt có khả năng sinh trƣởng và phát triển tốt ở nhiệt độ cao trên 50C. Khi nghiên cứu các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn chịu nhiệt phân lập từ bể ủ rác thải cho thấy, các chủng này sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất ở điều kiện nhiệt độ 45-55C và có thể chịu đƣợc nhiệt độ 65-80C [5]. Nghiên cứu của Nguyễn Lan Hƣơng và cs (2003) cũng cho thấy, các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn ƣa nhiệt sinh tổng hợp cellulase cao nhất ở nhiệt độ 50C [9]. Chủng xạ khuẩn Actinomyces griseus có khả năng sinh tổng hợp Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 20 cellulase tối ƣu ở nhiệt độ 58C [13]. Trong khi đó, các chủng nấm mốc N1 và N2 có nhiệt độ sinh tổng hợp cellulase tối ƣu là 31 và 34C [8]. Acharya và cs (2008) cho rằng, các chủng A. niger tổng hợp cellulase mạnh nhất khi lên men trong điều kiện 28C, pH 4,0-4,5 [18]. pH môi trƣờng nuôi cấy ban đầu: pH môi trƣờng ban đầu ảnh hƣởng quan trọng đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của các chủng vi sinh vật. Tùy thuộc vào từng loài, từng chủng mà pH môi trƣờng ban đầu thích hợp là acid, trung tính hay kiềm. Các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn chịu nhiệt sinh tổng hợp cellulase thích hợp với pH môi trƣờng ban đầu là 8,0 [5]; còn chủng xạ khuẩn Actinomyces griseus thích hợp với pH môi trƣờng ban đầu là 6,7 [13]. Đối với các chủng nấm mốc N1 và N2 sinh tổng hợp cellulase tối ƣu ở môi trƣờng có pH ban đầu là 4,5 và 5,5 [8]; các chủng A. niger sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất trong khoảng pH môi trƣờng ban đầu từ 6,0-7,0 [19]. Ngoài những yếu tố trên, tốc độ sinh trƣởng và khả năng sinh tổng hợp các loại enzyme của các vi sinh vật còn chịu sự tác động của nhiều yếu tố khác nhƣ: thời gian nuôi cấy, tốc độ lắc và sục khí, lƣợng giống đƣợc tiếp vào ban đầu. 2.7 TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE Tùy thuộc vào cấu trúc và nguồn gốc của enzyme, hoạt tính enzyme đạt mạnh nhất ở nhiệt độ, pH nhất định. Độ bền đối với nhiệt độ và pH hay mức độ và tính chất chịu ảnh hƣởng của các chất tẩy rửa, dung môi hữu cơ hay ion kim loại cũng có sự khác nhau. Ảnh hƣởng của nhiệt độ: vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác chỉ tăng lên khi tăng nhiệt độ trong một giới hạn nhất định, chƣa ảnh hƣởng đến cấu trúc enzyme. Hoạt tính enzyme đạt cực đại ở nhiệt độ thích hợp, khoảng nhiệt độ thích hợp của nhiều enzyme vào khoảng 40-50C. Ở nhiệt độ Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 21 cao, enzyme bị biến tính làm hoạt tính giảm mạnh hoặc mất hoạt tính; còn ở nhiệt độ thấp dƣới 0C, hoạt tính enzyme bị giảm nhiều nhƣng lại có thể phục hồi khi đƣa về nhiệt độ thích hợp [4]. Cellulase từ A. niger NRRL-363 hoạt động mạnh nhất ở 50C [11]; trong khi đó cellulase từ A. niger Z10 là 40C [25], còn hoạt tính xúc tác của endoglucanase III từ Trichoderma reesei đạt tối đa ở 55C [46]. Theo kết quả nghiên cứu của Kiamoto và cs (1996), các endoglucanase từ chủng A. oryzae KBN616 hoạt động tốt nhất trong dải nhiệt độ 45-55C [43]. Ảnh hƣởng của pH: Khả năng hoạt động của enzyme còn phụ thuộc vào pH môi trƣờng phản ứng. Tùy thuộc vào bản chất của enzyme mà pH thích hợp để enzyme hoạt động có thể trung tính, kiềm hoặc acid. Theo nghiên cứu trƣớc đây cho thấy, pH tối ƣu cho hoạt động của cellulase từ A. niger NRRL-363 là 5,5 [11]; của cellulase từ A. niger Z10 là 4,5 và 7,5 [25]; của endoglucanase III từ Trichoderma reesei là 4,0-5,0 [46]; của endoglucanase từ A. oryzae KBN616 là 4,0 và 5,0 [43]. Khi nghiên cứu ảnh hƣởng của pH lên hoạt tính endoglucanase từ chủng nấm ƣa acid A. terreus M11, Gao và cs (2008) cho rằng enzyme này có khả năng hoạt động trong dải pH 2-5, trong đó pH 2 là tốt nhất [29]. Ảnh hƣởng của ion kim loại: Các ion kim loại có thể kìm hãm hoặc hoạt hóa sự hoạt động của các enzyme. Các ion kim loại nặng ở nồng độ nhất định có thể gây biến tính và kìm hãm không thuận nghịch enzyme. Sharma và cs (1995) nhận thấy, ion Ca2+ làm tăng hoạt tính cellulase của Bacillus sp. D04 lên 40% so với đối chứng; còn Mg2+ làm giảm nhẹ (hoạt tính còn lại 92%) và Zn 2+ ức chế mạnh hoạt tính enzyme này (hoạt tính còn lại bằng 37% so với đối chứng) [56]. Theo nghiên cứu của Gao và cs (2008), endoglucanase từ A. terreus M11 bị giảm 77% hoạt tính khi ủ với Hg2+ (2 mM), 59% khi ủ với Cu2+ (2 mM) [29]. Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 22 Ngoài ra, các dung môi hữu cơ, các chất tẩy rửa cũng ảnh hƣởng mạnh mẽ đến hoạt tính của enzyme. Tùy thuộc vào bản chất của các chất trên cũng nhƣ bản chất của enzyme mà tính chất và mức độ ảnh hƣởng tới hoạt động của enzyme là khác nhau. Nghiên cứu của Trịnh Đình Khá (2006) trên chủng Penicillium sp. DTQ-HK1 cho thấy, các dung môi hữu cơ methanol, ethanol, isopropanol và acetone đều ức chế hoạt động của cellulase, đặc biệt là n-butanol ức chế mạnh nhất, hoạt tính cellulase chỉ còn 33-63%. Các chất tẩy rửa tween 20, tween 80, SDS và triton X-100 đều làm giảm hoạt tính cellulase ở mức độ khác nhau, trong đó SDS làm giảm mạnh hoạt tính cellulase chỉ còn 18-34% [10]. 2.8 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU CÓ LIÊN QUAN Ở VIỆT NAM Cho đến nay, ở Việt Nam đã có khá nhiều tác giả nghiên cứu về cellulase nói chung và endo-β-1,4-glucanase nói riêng. Các nghiên cứu đƣợc tiến hành trên nhiều phƣơng diện khác nhau liên quan đến loại enzyme này. Vấn đề môi sinh ngày càng trở nên trầm trọng trên phạm vi toàn cầu. Ở Việt Nam, lƣợng rác thải ra ngoài môi trƣờng ngày càng lớn, nguy cơ ô nhiễm môi trƣờng ở nhiều nơi là rất cao. Việc sử dụng biện pháp vi sinh học trong xử lý rác thải đã và đang mang lại nhiều giá trị to lớn. Tuy nhiên, việc sử dụng các vi sinh vật có sẵn trong tự nhiên để xử lý rác thải, thời gian thƣờng kéo dài gây nên tình trạng ô nhiễm môi trƣờng, tốn nhiều diện tích và công sức. Để xử lý rác triệt để hơn, giảm giá thành và thời gian xử lý, ngoài việc tạo điều kiện thích hợp cho vi sinh vật phát triển tốt thì việc tuyển chọn các vi sinh vật có khả năng sinh trƣởng nhanh, hoạt tính phân giải mạnh, chịu đƣợc nhiệt độ cao để bổ sung vào các bể rác là một trong những hƣớng nghiên cứu đã và đang đƣợc nhiều nhà khoa học quan tâm. Năm 1999, Tăng Thị Chính và cs đã tiến hành nghiên cứu các điều kiện lên men và ảnh hƣởng của các yếu tố môi trƣờng đến khả năng sinh tổng hợp Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 23 cellulase của một số chủng vi khuẩn ƣa nhiệt đƣợc phân lập từ bể ủ rác thải, nhằm tìm ra điều kiện tối ƣu nhất cho khả năng sinh tổng hợp cellulase, ứng dụng vào việc xử lý rác thải chứa nhiều cellulose. Kết quả cho thấy, các chủng vi sinh vật nghiên cứu có khả năng chịu đƣợc nhiệt độ 80C, nhiệt độ lên men tối ƣu từ 45C đến 55C, pH môi trƣờng ban đầu thích hợp nhất là 8. Nguồn carbon tốt nhất cho sinh trƣởng và sinh tổng hợp cellulase của các chủng vi khuẩn nghiên cứu là glucose và CMC; nguồn nitrogen là peptone và cao nấm men. Các tác giả cũng đã nghiên cứu động thái của quá trình sinh tổng hợp cellulase và kết quả cho thấy, thời gian tích lũy cao nhất ở 48 giờ lên men [5]. Nguyễn Đức Lƣợng và cs (1999) đã tiến hành nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp cellulase của Actinomyces griseus. Qua nghiên cứu tác giả thấy rằng khả năng sinh tổng hợp cellulase của A. griseus là cao và khả năng này đạt tối ƣu ở 58C, pH ban đầu là 6,7, độ ẩm ban đầu là 55% với thời gian nuôi cấy là 72 giờ. Qua nghiên cứu tác giả cũng thấy rằng nguồn lignocellulose thích hợp là bã mía hoặc mùn cƣa [13]. Cũng trong năm này, Phạm Thị Ngọc Lan và cs đã tiến hành nghiên cứu và tuyển chọn đƣợc một số chủng xạ khuẩn ƣa ấm phân lập từ mùn rác ở một số nơi có khả năng phân giải cellulose mạnh. Trong số 195 chủng xạ khuẩn nghiên cứu thì các chủng xạ khuẩn phân lập đƣợc từ các mẫu rơm mục và đất chân đống rơm có khả năng phân giải cellulose và CMC mạnh nhất [12]. Trong số các loài vi sinh vật, nấm sợi là một trong những đối tƣợng có khả năng sinh tổng hợp cellulase cao. Việc tìm ra các chủng nấm sợi có khả năng phân hủy cellulose cao và tối ƣu điều kiện sinh tổng hợp cellulase của chúng đang là vấn đề đƣợc nhiều tác giả quan tâm. Năm 1999, Đặng Minh Hằng đã nghiên cứu tuyển chọn đƣợc hai chủng nấm sợi có khả năng phân Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 24 giải cellulose cao. Tác giả cũng đã nghiên cứu và tìm ra đƣợc một số điều kiện tối ƣu cho khả năng sinh tổng hợp cellulase của hai chủng nấm này [8]. Năm 2003, Hoàng Quốc Khánh và cs đã nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp và đặc điểm của cellulase từ chủng A. niger NRRL-363. Qua nghiên cứu, tác giả đã tìm ra đƣợc một số thông tin và điều kiện cơ bản cho sự tổng hợp cellulase của chủng này trên môi trƣờng trấu xay và một số chất thải công nghiệp nhƣ mật rỉ đƣờng [11]. Bằng cách tuyển chọn các chủng vi sinh vật chịu nhiệt, phân giải cellulose cao, Lý Kim Bảng và cs (1999) đã xây dựng đƣợc quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm Micromix 3 bổ sung vào bể ủ rác thải. Nghiên cứu cho thấy, khi chế phẩm này đƣợc bổ sung vào bể ủ rác thải có thổi khí đã rút ngắn đƣợc 15 ngày ủ, một nửa thời gian lên men so với bể đối chứng bổ sung chế phẩm VSV-xen. Lƣợng mùn tạo thành của bể ủ bổ sung chế phẩm Micromix 3 cao hơn 29%, và các chất dinh dƣỡng cao hơn 10% so với bể đối chứng [1]. Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 25 3 CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 3.1 NGUYÊN LIỆU VÀ HÓA CHẤT 3.1.1 Chủng nấm Hai mƣơi sáu chủng A. awamori do Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học - Đại học Quốc Gia Hà Nội cung cấp đƣợc sử dụng để tuyển chọn, nuôi cấy chủng vi sinh vật sinh tổng hợp endoglucanase cao nhất. Từ đó thu enzyme làm nguyên liệu cho các nghiên cứu tiếp theo. 3.1.2 Thiết bị thí nghiệm Bảng 2.1. Các thiết bị chính đƣợc sử dụng trong thí nghiệm Thiết bị Hãng sản xuất (quốc gia) Bể ổn nhiệt Trung Quốc Box cấy LB-1234 Việt Nam Cân phân tích BL 150S Sartorius (Thụy Sỹ) Hệ thống chụp ảnh gel Wealtec (Mỹ) Hệ thống điện di ngang Mupid  (Nhật bản) Lò vi sóng SamSung (Hàn Quốc) Máy ly tâm lạnh Mikro 22R Hettich (Đức) Máy quang phổ UV-2500 LaboMed Inc (Mỹ) Máy PCR Mastercycler personal Eppendorf (Đức) Máy chuẩn pH 827 pH Lab Metrohm (Thụy Sỹ) Máy lắc nuôi cấy Certomat HK (Đức) Nồi khử trùng ES-315 Tomy (Nhật Bản) Tủ lạnh 4ºC, -20ºC, -80ºC Toshiba, Sanyo (Nhật Bản) Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 26 3.1.3 Hóa chất Bảng 2.2. Danh sách hóa chất chính đƣợc sử dụng trong thí nghiệm Hóa chất Hãng sản xuất (quốc gia) 3,5-dinitrosalicylic acid (DNS) Fluka Cao nấm men Difco (Mỹ) DEAE Heldelberg (Đức) Peptone Merck (Đức) SDS Sigma (Mỹ) Sephadex G100 Pharmacia (Mỹ) Sodium dodecylsulfate Sigma (Mỹ) Triton X-100 Merck (Đức) Tween-20 BioBasic Inc (Mỹ) Tween-80 BioBasic Inc (Mỹ) CMC Prolabo (Pháp) 3.1.4 Môi trƣờng Môi trƣờng Czapek: 0,2% (w/v) NaNO3, 0,1% K2HPO4, 0,05% MgSO4, 0,05% KCl, 2% Saccharose, pH 6,5. Môi trƣờng đặc bổ sung 2% agar. Môi trƣờng MT1 theo Mandles (g/l): urea 0,3; (NH4)2SO4 1,4; KH2PO4 2; CaCl2 0,3; MgSO4.7H2O 0,3; peptone 1; cao nấm men 10; tween 80 1; CMC 10; các yếu tố vi lƣợng 0,1% (v/v) bao gồm các muối: FeSO4 18 mM; MnSO4 6,6 mM; ZnSO4 4,8 mM, CoCl2 15 mM. pH 7,0 [36], [60]. Môi trƣờng LB (Luria-Bertani): 1% (w/v) peptone; 0,5% (w/v) cao nấm men; 1% (w/v) NaCl; pH 7,0, khử trùng, với môi trƣờng đặc bổ sung Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 27 2% (w/v) agar. Đối với việc chọn chủng mang plasmid, môi trƣờng đƣợc bổ sung 100 g/ml ampicillin. 3.1.5 Dung dịch và đệm Bảng 2.3. Danh sách dung dịch và đệm sử dụng trong thí nghiệm Dung dịch Thành phần, nồng độ Dung dịch Bradford gốc 100 ml 95% ethanol; 350 mg serva blue G; 200 ml 88% phosphoric acid Đệm Bradford thí nghiệm 425 ml H2O; 15 ml 95% ethanol; 30 ml 88% phosphoric acid; 30 ml dung dịch bradford gốc Đệm điện di protein (biến tính) 25 mM Tris-HCl; 192 mM glycine; 0,1% SDS, pH 8,4 Đệm KP (K2HPO4) 0,1 M K2HPO4, pH 6,5 Đệm tra mẫu protein (biến tính) 5x 10% SDS; 0,05% brommophenol blue; 50% glycerol; 10% 2 mecaptho ethanol pha trong đệm 0,312 M Tris-HCl, pH 6,8 Dung dịch DNS (1000 ml) 205,4 g KNaC4H4O6.4H2O; 4,15 g Na2S2O5; 5,3 g DNS; 9,9 g NaOH; 3,8 ml phenol Dung dịch I Đệm Tris HCl 50 mM, pH 8,0; 50 mM NaCl Dung dịch II Đệm Tris HCl 50 mM, pH 8,0; 1000 mM NaCl Dung dịch III Đệm 80 mM phosphate, pH 7,5 Dung dịch A Đệm 1,5 M Tris-HCl, pH 8,8 Dung dịch APS 10% ammonium persulfate Dung dịch B Đệm 0,5 M Tris-HCl, pH 6,8 Dung dịch C 30% acrylamide; 0,8% bis-acrylamide Dung dịch D 10% SDS; 25 mM EDTA Dung dịch nhuộm gel polyacrylamide 0,1% (w/v) coomassie brilliant blue; 30% (v/v) methanol; 10% (v/v) acetic acid Dung dịch rửa PAGE 30% (v/v) methanol; 10% (v/v) acetic acid Dung dịch protease K 20 g/ml protease K Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 28 Dung dịch RNase 10 g/ml RNase Dung dịch ampicillin gốc 100 mg/ml ampicillin Dung dịch nhuộm gel agarose 0,1 g/ml ethidium bromide Đệm TE 100 mM Tris- HCl; 1 mM EDTA, pH 8,0 Đệm tra mẫu DNA 6x 0,09% (w/v) brommophenol blue; 0,09% (w/v) xylene xyanol (FF); 60% (v/v) glycerol Đệm TBE 10x 108 g Tris base; 55 g boric acid; 40 ml 0,5 M EDTA pH 8,0 Đệm cell lysis 10 mM Tris, 100 mM EDTA, 2% (w/v) SDS, pH 8,0 3.2 PHƢƠNG PHÁP 3.2.1 Nuôi cấy vi sinh vật Nuôi cấy hoạt hóa nấm sợi Các chủng A. awamori lấy từ các ống giống đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng Czapek lỏng ở điều kiện 30C, pH 6,5, lắc 200 vòng/phút trong 72 giờ. Nuôi cấy nấm thu sinh khối enzyme Các chủng A. awamori sau khi hoạt hóa đƣợc nuôi cấy chìm trong môi trƣờng MT1 với 0,5% CMC làm cơ chất, ở 30°C, lắc 200 vòng/phút. Sau 96 giờ nuôi cấy, dịch canh trƣờng đƣợc ly tâm loại sinh khối tế bào, thu dịch enzyme thô. 3.2.2 Xác định hoạt tính endoglucanase Định tính hoạt tính endoglucanase Hoạt tính endoglucanase đƣợc xác định tƣơng đối theo phƣơng pháp khuếch tán enzyme trên đĩa thạch. Đĩa thạch chứa 0,5% cơ chất CMC trong đệm 100 mM potassium phosphate pH 6,5, dày khoảng 0,5 cm đƣợc đục lỗ Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 29 đƣờng kính 0,5 cm. 50 µl dịch enzyme vào lỗ rồi ủ 12 giờ ở 4C cho enzyme khuếch tán đều xung quanh. Sau đó ủ tiếp 8 giờ ở 37C, lấy ra nhuộm bằng dung dich 1% lugol và đo đƣờng kính vòng phân giải cơ chất. Hoạt tính tƣơng đối của enzyme tỷ lệ thuận với kích thƣớc đƣờng kính vòng phân giải cơ chất: Dhalo = D - d (với D là đƣờng kính vòng ngoài và d là đƣờng kính lỗ) [7]. Xác định hoạt độ endoglucanase Hoạt độ endoglucanase đƣợc xác định chính xác dựa vào lƣợng đƣờng khử tạo thành sau phản ứng bằng phƣơng pháp đo quang phổ theo Miller (1959) [47]. Tiến hành Ống thí nghiệm (lặp lại 3 lần): 0,1 ml dịch enzyme đƣợc hút vào ống nghiệm, thêm 0,4 ml dung dịch 0,5% CMC trong đệm 100 mM potassium phosphate, pH 6,5. Hỗn hợp đƣợc lắc đều và ủ ở 50°C trong 20 phút, sau đó bổ sung ngay 1,25 ml dung dịch thuốc thử DNS và đun sôi cách thủy 5 phút. Ống đối chứng: 0,1 ml dịch enzyme đƣợc hút vào ống nghiệm, thêm 1,25 ml dung dịch thuốc thử DNS ủ trong 5 phút, bổ sung tiếp 0,4 ml dung dịch 0,5% CMC. Hỗn hợp đƣợc lắc đều và ủ ở 50°C trong 20 phút, sau đó lấy ra và đun sôi cách thủy 5 phút. Hỗn hợp sau phản ứng đƣợc đo độ hấp thụ quang phổ ở bƣớc sóng 540 nm. Kết quả đo độ hấp thụ quang phổ đƣợc đối chiếu với đồ thị chuẩn nồng độ glucose để suy ra lƣợng đƣờng khử tƣơng đƣơng đƣợc giải phóng ra. Dựng đƣờng chuẩn: Glucose đƣợc pha trong nƣớc cất với nồng độ chuẩn khác nhau từ 0,04-0,18 mg/ml. 2 ml dung dịch glucose chuẩn đƣợc đo độ hấp phụ ở bƣớc sóng 540 nm nhƣ trên. Sau đó, mối tƣơng quan giữa độ hấp phụ và nồng độ glucose đƣợc xây dựng bằng phần mềm Microsoft Excel. Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 30 Kết quả cho thấy, đƣờng nồng độ chuẩn glucose tuyến tính trong dải nồng độ 0,04-0,18 mg/ml (Hình 2.1). Đƣờng chuẩn có phƣơng trình: y = 2,6411x - 0,0799. Trong đó: y - độ hấp phụ ở bƣớc sóng 540 nm (OD540 nm); x - nồng độ glucose (mg/ml) Đơn vị hoạt độ: một đơn vị hoạt độ quốc tế (IU) đƣợc định nghĩa là lƣợng enzyme làm thủy phân cơ chất (CMC) thành đƣờng khử tƣơng đƣơng 1 mol glucose trong một phút ở điều kiện thí nghệm. 3.2.3 Khảo sát ảnh hƣởng của một số yếu tố lên khả năng sinh tổng hợp endoglucanase 3.2.3.1 Thời gian nuôi cấy Chủng A. awamori VTCC-F-099 đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng MT1 cơ bản cho sinh tổng hợp endoglucanase, dịch canh trƣờng đƣợc thu sau những khoảng thời gian nuôi cấy khác nhau: từ 24-240 giờ và xác định hoạt tính endoglucanase. R² = 0.997 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0 0.04 0.08 0.12 0.16 0.2 O D 5 40 n m Glucose (mg/ml) y = 2,6411x - 0,0799 Hình 2.1. Đƣờng chuẩn nồng độ glucose Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 31 3.2.3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường Để xác định nhiệt độ nuôi cấy tối ƣu, chủng nấm nghiên cứu đƣợc nuôi trong môi trƣờng MT1 cơ bản cho sinh tổng hợp endoglucanase, lắc 200 vòng/phút ở 25C, 28C; 30C, 32C và 37C; pH 7,0. Dịch canh trƣờng đƣợc thu sau 96 giờ nuôi cấy và xác định hoạt tính endoglucanase. 3.2.3.3 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất cảm ứng Cơ chất với một nồng độ nhất định thƣờng đóng vai trò là chất cảm ứng cho quá trình sinh tổng hợp loại enzyme tƣơng ứng. Để xác định khả năng cảm ứng của cơ chất CMC đến khả năng sinh tổng hợp endoglucanase, chủng A. awamori VTCC-F-099 đƣợc nuôi cấy chìm trong môi trƣờng MT1 cơ bản pH 7,0, lắc 200 vòng/phút ở 30C, CMC đƣợc bổ sung vào môi trƣờng với các nồng độ khác nhau từ 0,2-4%. Sau 96 giờ nuôi cấy, thu dịch nổi và xác định hoạt tính endoglucanase. 3.2.3.4 Ảnh hưởng của nguồn carbon và nồng độ nguồn carbon Chủng A. awamori VTCC-F-099 đƣợc nuôi cấy chìm trong môi trƣờng MT1 cơ bản với 2% CMC làm nguồn cơ chất cảm ứng, nuôi lắc 200 vòng/phút ở 30C, pH 7,0 và nguồn cao nấm men đƣợc thay thế bằng các nguồn carbon khác (vỏ cà phê, glucose, vỏ lạc, vỏ quýt, lõi ngô, bã mía, saccharose, lactose, vỏ cám trấu, mùn cƣa, xơ dừa) với cùng nồng độ. Dịch nổi canh trƣờng đƣợc thu sau 96 giờ để xác định hoạt tính endoglucanase ngoại bào. Sau khi chọn đƣợc lõi ngô là nguồn carbon thích hợp nhất cho khả năng sinh tổng hợp endoglucanase, lõi ngô đƣợc bổ sung vào môi trƣờng với các nồng độ khác nhau từ 0-5% (w/v) để xác định nồng độ tối ƣu. Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 32 3.2.3.5 Ảnh hưởng của nguồn nitrogen Chủng A. awamori VTCC-F-099 đƣợc nuôi cấy chìm trong môi trƣờng MT1 cơ bản với 2% CMC làm nguồn cơ chất cảm ứng, 3% lõi ngô làm nguồn carbon, nuôi lắc 200 vòng/phút ở 30C, pH 7,0 và các nguồn nitrogen (ammonium sulphate, urea, peptone) đƣợc thay thế bằng các nguồn nitrogen khác với cùng nồng độ. Dịch nổi canh trƣờng đƣợc thu sau 96 giờ nuôi cấy để xác định hoạt tính endoglucanase ngoại bào. 3.2.3.6 Ảnh hưởng của pH môi trường Chủng A. awamori VTCC-F-099 đƣợc nuôi cấy chìm trong môi trƣờng MT1 bổ sung 2% CMC làm nguồn cơ chất cảm ứng, 3% lõi ngô làm nguồn carbon và 0,3% ammonium acetate làm nguồn nitrogen, nuôi lắc 200 vòng/phút ở 30C, pH ban đầu thay đổi từ 3,0-8,0. Dịch nổi môi trƣờng đƣợc thu ở 96 giờ để xác định hoạt tính endoglucanase ngoại bào. 3.2.4 Tinh sạch enzyme Dịch enzyme sau khi đƣợc ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút, đƣợc đƣa lên cột sắc kí lọc gel Sephadex G-100 với tổng thể tích 10 ml. Cột có kích thƣớc 2,6 x 60 cm đƣợc cân bằng với đệm 50 mM potassium phosphate, pH 7,5. Tốc độ dòng chảy là 25 ml/giờ. Thu 20 phân đoạn, thể tích mỗi phân đoạn 2 ml. Hàm lƣợng protein và hoạt tính enzyme đƣợc xác định trong mỗi phân đoạn. Dịch enzyme sau khi qua cột sắc kí lọc gel Sephadex G-100, chọn những phân đoạn có hoạt tính endoglucanase cao đƣợc đƣa tiếp lên cột sắc kí trao đổi ion DEAE với tổng thể tích 12 ml. Cột có kích thƣớc 2,6 x 60 cm đƣợc cân bằng với đệm 50 mM Tris-HCl, pH 8,0; 50 mM NaCl, thôi mẫu bằng đệm 50 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1000 mM NaCl. Tốc độ dòng chảy là Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 33 20 ml/giờ. Thu 20 phân đoạn, thể tích mỗi phân đoạn 2 ml. Hàm lƣợng protein và hoạt tính enzyme đƣợc xác định cho mỗi phân đoạn. Quá trình tinh sạch endoglucanase có thể đƣợc tóm tắt nhƣ sơ đồ hình 2.2. Dịch enzyme thô ↓ Ly tâm 10000 vòng/10 phút ↓ Dịch trong ↓ Cột Sephadex G100 ↓ Cột DEAE ↓ Enzyme tinh sạch Hình 2.2. Quy trình tinh sạch endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099 3.2.5 Điện di SDS-PAGE Khối lƣợng phân tử tƣơng đối của enzyme tách chiết và độ tinh sạch của các dịch enzyme đƣợc đánh giá bằng phƣơng pháp điện di trên gel polyacrylamide theo Laemmli [44]. Thành phần gel điện di đƣợc thể hiện nhƣ bảng 2.4. Bảng 2.4. Thành phần gel điện di biến tính protein Thành phần Gel tách (l) Gel co (l) H2O 1940 1180 Dung dịch A 1500 0 Dung dịch B 0 500 Dung dịch C 2500 300 Dung dịch D 60 20 APS 10% 24 10 TEMED 7 5 Tổng 6031 2015 Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 34 Bản điện di đƣợc chạy với cƣờng độ dòng điện 18-20 mA cho gel co và 25-28 mA cho gel tách. 3.2.6 Xác định tính chất lý hóa của endoglucanase 3.2.6.1 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất Để tìm nồng độ cơ chất thích hợp dùng xác định hoạt tính endoglucanase, phản ứng đƣợc thực hiện với các nồng độ cơ chất từ 0,2-2% CMC pha trong đệm 100 mM potassium phosphate, pH 6,5. Hoạt tính enzyme đƣợc xác định sau 20 phút phản ứng ở 50C. 3.2.6.2 Xác định nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt Hỗn hợp phản ứng của dịch enzyme (0,002 mg protein) với cơ chất 1,2% (w/v) CMC pha trong đệm potassium phosphate pH 6,5 đƣợc ủ ở các nhiệt độ khác nhau trong khoảng 30-70C, trong 20 phút để tìm nhiệt độ phản ứng tối ƣu. Để xác định độ bền nhiệt của endoglucanase từ chủng nấm nghiên cứu, dịch enzyme đã tinh sạch (0,002 mg protein) đƣợc ủ ở các nhiệt độ khác nhau từ 30C đến 70C, sau các khoảng thời gian: 6; 12; 24; 36; 48; 60 và 72 giờ. Hoạt tính còn lại của enzyme đƣợc xác định theo phƣơng pháp nêu trên với thời gian phản ứng là 20 phút ở nhiệt độ phản ứng tối ƣu. 3.2.6.3 Xác định pH phản ứng tối ưu và độ bền pH Để xác định pH phản ứng tối ƣu cho phản ứng xúc tác của enzyme nghiên cứu, dịch enzyme tinh sạch (0,002 mg protein) đƣợc ủ với cơ chất CMC pha trong đệm 100 mM sodium acetate, pH từ 3,5-5,5 và 100 mM potassium phosphate, pH từ 6,0-8,0, hỗn hợp phản ứng đƣợc ủ ở 50C trong 20 phút. Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 35 Để đánh giá độ bền pH của enzyme nghiên cứu, trƣớc hết endoglucanase (0,002 mg protein) đƣợc ủ trong các đệm có pH thay đổi trong khoảng 3,5-8,0, trong 2 giờ ủ ở 37C. Sau đó, chọn ra khoảng pH thích hợp để tiếp tục xác định độ bền pH theo thời gian: 6, 12, 24, 36, 48, 60, 72 giờ. 3.2.6.4 Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ Để đánh giá ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ lên hoạt tính endoglucanase, dịch enzyme đƣợc ủ với 10-30% các loại dung môi hữu cơ: acetone, ethanol, isopropanol, methanol và n-butanol ở nhiệt độ 37C. Sau 2 giờ ủ, hoạt tính còn lại của enzyme đƣợc xác định. 3.2.6.5 Ảnh hưởng của một số chất tẩy rửa Dịch enzyme (0,002 mg protein) đƣợc ủ với 0,5-2% chất tẩy rửa tween 20, tween 80, SDS và triton X-100 ở nhiệt độ 37C. Sau 2 giờ, hoạt tính còn lại đƣợc xác định để đánh giá ảnh hƣởng của chúng lên hoạt tính endoglucanase. 3.2.6.6 Ảnh hưởng của ion kim loại Để đánh giá tính chất và mức độ ảnh hƣởng của ion kim loại lên hoạt tính endoglucanase, dịch enzyme (0,002 mg protein) đƣợc ủ cùng với muối của các ion kim loại: Ag+, Ca2+, Co2+, Cu2+, Fe3+, K+, Mg2+, Ni2+, Zn2+ và EDTA ở các nồng độ từ 5-15 mM ở 37C. Sau 2 giờ, hoạt tính còn lại của enzyme đƣợc xác định. 3.2.7 Xác định hàm lƣợng protein tổng số Hàm lƣợng protein đƣợc xác định theo phƣơng pháp Bradford. Phƣơng pháp này dựa trên nguyên tắc: các protein khi phản ứng với Coomassie Brilliant Blue sẽ hình thành phức hợp màu có khả năng hấp thụ ánh sáng mạnh nhất ở bƣớc sóng 595 nm, cƣờng độ màu tỉ lệ thuận với Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 36 nồng độ protein trong dung dịch. Hàm lƣợng protein tổng số đƣợc xác định dựa vào đồ thị chuẩn protein từ dung dịch albumin huyết thanh bò (Hình 2.3). R² = 0.993 0.0 0.2 0.4 0.6 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 O D 5 95 n m Hàm lượng protein (mg/ml) y = 2,5x - 0,0169 Hình 2.3. Đƣờng chuẩn Bradford dùng BSA làm chuẩn 3.2.8 Các phƣơng pháp sinh học phân tử 3.2.8.1 Tách chiết DNA tổng số của nấm sợi Tế bào nấm sợi đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng Czapek ở 30C, lắc 200 vòng/phút, sau 72 giờ dịch canh trƣờng đƣợc ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút. Tủa tế bào đƣợc nghiền nhanh, nhẹ trong cối sứ chứa nitrogen lỏng, sau đó đƣợc bổ sung 600 l đệm cell lysis và lắc nhẹ. Bổ sung 65 l lysozyme, ủ ở 37C trong 45 phút, cho 25 l protease K ủ ở 55C trong 2-3 giờ. Bổ sung tiếp hỗn hợp chloroform/isoamyl alcohol (24:1) với thể tích tƣơng đƣơng, trộn đều trong 5 phút, sau đó ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút. Hút 500 l dịch nổi chứa DNA sang ống eppendorf mới và bổ sung 500 l isopropanol. Hỗn hợp đƣợc đảo nhẹ và tủa DNA ở -20C Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 37 trong 2-3 giờ. Tủa sau khi ly tâm đƣợc làm khô bằng giấy thấm và bổ sung 500 l 70% ethanol để rửa DNA, loại muối và isopropanol. Sau khi ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút, tủa đƣợc làm khô, hòa trong 40 l đệm TE và bảo quản ở -20C [54]. 3.2.8.2 Khuếch đại gene bằng PCR Đoạn gene 28S rRNA của chủng A. awamori VTCC-F-099 đƣợc khuếch đại bằng kỹ thuật PCR, sử dụng cặp mồi NL1 (5-GCATATCAA TAAGCGGAGGAAAAG-3  ); NL4 (5 ’ -GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3  ). Hỗn hợp phản ứng PCR bao gồm: 1 l DNA khuôn; 0,5 l mồi mỗi loại; 1,2 l 25 mM MgCl2; 1 l Taq polymerase; 1,6 l 2,5 mM dNTP; 2 l đệm PCR, bổ sung nƣớc cất lên tổng thể tích 20 l. Phản ứng thực hiện theo chu trình nhiệt: 95C/5 phút; 35 chu kỳ: 95C/1 phút, 50C/1 phút, 72C/1 phút; 72C/10 phút. Sản phẩm PCR đƣợc điện di trên gel 0,8% agarose. 3.2.8.3 Gắn dính DNA Phản ứng gắn dính sản phẩm PCR vào vector tách dòng pJET 1.2/blunt đƣợc thực hiện theo protocol của hãng Fermentas. Hỗn hợp bao gồm: 2 l H2O; 5 l đệm gắn dính 2x; 0,5 l DNA blunting enzyme; 1,5 l sản phẩm PCR. Hỗn hợp đƣợc trộn đều và ủ ở 70C trong 15 phút. Sau đó, lấy ra bổ sung tiếp 0,5 l vector pJET 1.2/blunt và 0,5 l T4-DNA ligase. Phản ứng gắn dính đƣợc thực hiện ở 22C trong 2-3 giờ để tạo plasmid tái tổ hợp. Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 38 3.2.8.4 Biến nạp plasmid hóa học Plasmid đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5 theo phƣơng pháp sốc nhiệt và hóa học. Một khuẩn lạc E. coli DH5 đƣợc cấy chuyển vào 3 ml môi trƣờng LB, lắc 200 vòng/phút ở 37C qua đêm. 100 ml môi trƣờng LB đƣợc tiếp giống với 1 ml dịch tế bào đã nuôi qua đêm, nuôi lắc 200 vòng/phút ở 37C. Khi OD600 nm đạt 0,4-0,6 (khoảng 2-3 giờ nuôi cấy), dịch nuôi cấy đƣợc thu lại và đặt vào trong đá lạnh 1 giờ, rồi ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút ở 4C. Tủa tế bào đƣợc hòa đều trong 100 ml dung dịch 100 mM CaCl2 lạnh vô trùng, ủ đá 15 phút và ly tâm nhƣ trên. Tủa tế bào lại đƣợc hòa đều trong 40 ml dung dịch 100 mM CaCl2 lạnh vô trùng, ủ đá khoảng 1 giờ và ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút. Tủa tế bào đƣợc hòa vào 500 l dung dịch 100 mM CaCl2 lạnh, vô trùng chứa 15% glycerol. Dịch hỗn hợp tế bào và glycerol đƣợc chia nhỏ 40 l vào các ống eppendorf, dùng biến nạp ngay hoặc bảo quản ở -80C. Năm l plasmid tái tổ hợp đƣợc trộn với 40 l dịch tế bào khả biến, ủ 20-30 phút ở 4C. Hỗn hợp đƣợc gây sốc nhiệt 45 giây ở 42C. Sau đó đặt ngay vào đá lạnh, để 5 phút rồi bổ sung 250 l môi trƣờng LB đã khử trùng. Sau khi nuôi lắc hỗn hợp 200 vòng/phút trong khoảng 45-60 phút ở 37C với 50-200 l dịch tế bào đã biến nạp đƣợc cấy chải trên môi trƣờng LB đặc có chứa chất kháng sinh ampicillin, ủ qua đêm ở 37C. 3.2.8.5 Tách chiết DNA plasmid Mỗi khuẩn lạc biến nạp phát triển trên đĩa thạch đƣợc cấy vào ống nghiệm chứa 1,5 ml LB lỏng đã bổ sung 0,1% (v/v) ampicillin, nuôi lắc qua đêm ở 37C, 200 vòng/phút. Tủa tế bào từ 1,5 ml dịch nuôi cấy (ly tâm 6000 vòng/phút trong 5 phút) đƣợc lắc rung khoảng 30 giây trong 150 l Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 39 dung dịch I thành dịch đồng nhất, ủ 15-20 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó, thêm 150 l dung dịch II vào hỗn hợp và đảo trộn nhẹ, tiếp tục bổ sung 150 l dung dịch III vào hỗn hợp và đảo trộn nhẹ. Hỗn hợp đƣợc bổ sung 450 l dung dịch chloroform/isoamyl alcohol (24:1), lắc rung và ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút. 450 l pha trên đƣợc hút sang ống mới, bổ sung 320 l isopropanol, lắc nhẹ và ủ 5 phút ở -80C để tủa DNA plasmid. Tủa DNA plasmid (ly tâm 15 phút với 13.000 vòng/phút) đƣợc rửa với 500 l 70% ethanol ở 4C để loại muối và isopropanol và đƣợc làm khô trong không khí ở nhiệt độ phòng. Cuối cùng tủa DNA plasmid đƣợc hòa trong đệm TE pH 8,0 hoặc nƣớc khử ion vô trùng, phân tích điện di, cắt bằng enzyme cắt hạn chế để kiểm tra phân đoạn chèn hoặc bảo quản ở -20C [54]. Sau đó, plasmid tái tổ hợp mang đoạn gene cần tách dòng đƣợc biến nạp lại vào tế bào E. coli DH5, tách chiết và đƣợc tinh sạch theo protocol: bổ sung 0,25 l RNase vào dịch chứa plasmid, ủ ở 37ºC trong 1-2 giờ, lấy ra bổ sung 450 l H2O khử ion và đảo đều hỗn hợp. Tiếp đó, bổ sung 450 l chloroform/isoamyl alcohol (24:1), đảo đều trong 5 phút. Sau khi ly tâm 13.000/phút trong 15-20 phút, dịch nổi đƣợc hút sang ống eppendorf mới và bổ sung 500 l isopropanol cùng với 30 l dung dịch 3 M CH3COONa. Hỗn hợp đƣợc ủ ở -20ºC trong 15-20 phút, sau đó lấy ra ly tâm 13000 vòng/phút trong 20 phút để thu tủa. Tủa đƣợc rửa lại 2 lần bằng 70% ethanol. Sau khi tủa đƣợc rửa sạch và làm khô sẽ đƣợc hòa trong 40 l H2O. Mẫu plasmid tinh sạch đƣợc sử dụng để giải trình tự nucleotide [54]. 3.2.8.6 Cắt DNA bằng enzyme cắt hạn chế DNA plasmid tái tổ hợp đƣợc cắt bằng cặp enzyme cắt hạn chế XbaI và XhoI trong 2 giờ ở 37C để kiểm tra phân đoạn chèn. Hỗn hợp phản ứng gồm: 3 l DNA plasmid tái tổ hợp; 0,25 l enzyme cắt hạn chế mỗi loại; 2 l Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 40 đệm Tango Y+; bổ sung nƣớc khử ion đến tổng thể tích 10 l. Sau phản ứng, sản phẩm cắt đƣợc điện di trên gel 0,8% agarose để kiểm tra. 3.2.8.7 Điện di gel agarose Nguyên lí của phƣơng pháp này là dựa vào đặc tính của DNA là đại phân tử tích điện âm, dó đó trong môi trƣờng có điện trƣờng, các phân tử DNA có kích thƣớc khác nhau di chuyển từ cực âm sang cực dƣơng với tốc độ khác nhau. Bản gel agarose thích hợp cho việc làm giá đỡ phân tách các phân tử DNA. Điện di DNA hoặc plasmid đƣợc thực hiện trên gel 0,8% (w/v) agarose. Agarose đƣợc pha trong đệm 1x TBE, vi sóng cho agarose tan hoàn toàn. Sau đó để nguội xuống khoảng 60C và đổ vào khay điện di đã cài lƣợc sẵn. Khi gel đã đông ổn định thì gỡ lƣợc ra, đặt vào buồng điện di và tra mẫu. Sau khi chạy điện di xong, bản gel đƣợc lấy ra khỏi khuôn và nhuộm trong EtBr khoảng 3-5 phút, EtBr có thể cài xen vào trong DNA và phát sáng dƣới ánh sáng tia cực tím, do đó có thể phát hiện ra sự hiện diện của DNA. 3.2.8.8 Giải trình tự nucleotide Sau khi tinh sạch plasmid tái tổ hợp, phân đoạn chèn đƣợc giải trình tự nucleotide theo nguyên lý của phƣơng pháp Sanger cải tiến dựa trên các dideoxynucleotide. DNA polymerase xúc tác gắn các deoxynucleotide vào đầu 3‘-OH mạch đơn DNA đang tổng hợp, khi gặp dideoxynucleotide đánh dấu huỳnh quang không có nhóm 3’-OH phản ứng tổng hợp sẽ bị dừng lại. Kết quả là hỗn hợp sản phẩm sau phản ứng bao gồm các polynucleotide có kích thƣớc hơn kém nhau một nucleotide và đƣợc phát hiện bằng mẫu dò huỳnh quang trên máy đọc trình tự nucleotide tự động ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer. Kết quả đọc trình tự đƣợc phân tích, xử lý bằng phần mềm DNAStar để so sánh trình tự nucleotide. Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 41 3.2.9 Phƣơng pháp xử lý số liệu Phần mềm Microsoft Excel đƣợc sử dụng để xử lý số liệu thu đƣợc trong quá trình thực nghiệm và tính giá trị của các tham số thống kê. Chƣơng trình DNAstar đƣợc sử dụng để phân tích trình tự nucleotide, so sánh trình tự nucleotide và xây dựng cây phân loại chủng nấm nghiên cứu. Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 42 4 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 TUYỂN CHỌN VÀ PHÂN LOẠI CHỦNG ASPERGILLUS AWAMORI SINH TỔNG HỢP ENDOGLUCANASE CAO 4.1.1 Tuyển chọn Hai mƣơi sáu chủng A. awamori đƣợc nuôi cấy chìm trong môi trƣờng nuôi cấy cơ bản cho sinh tổng hợp endoglucanase, ở 30ºC, lắc 200 vòng/phút, sau 96 giờ thu dịch enzyme thô. Sử dụng phƣơng pháp khuếch tán enzyme trên đĩa thạch để định tính hoạt tính endoglucanase và phƣơng pháp đo hoạt độ endoglucanase đã chọn đƣợc chủng A. awamori VTCC-F-099 có khả năng sinh tổng hợp endoglucanase cao nhất trong số 26 chủng A. awamori nghiên cứu (Hình 3.1, Bảng 3.1). Nhƣ vậy, chủng A. awamori VTCC-F-099 đƣợc chọn để tối ƣu các điều kiện nuôi cấy và tinh sạch, đánh giá tính chất lý hóa của endoglucanase. Hình 3.1. Hoạt tính endoglucanase của 26 chủng A. awamori nghiên cứu Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 43 Bảng 3.1. Hoạt tính endoglucanase của 26 chủng A. awamori Chủng Hoạt tính Chủng Hoạt tính IU/ml Dhalo (mm) IU/ml Dhalo (mm) A. awamori VTCC-F-014 0,42 12,5 A. awamori VTCC-F-261 0,33 27,0 A. awamori VTCC-F-020 0,38 12,5 A. awamori VTCC-F-262 0,33 19,0 A. awamori VTCC-F-061 0,45 15,0 A. awamori VTCC-F-269 0,23 15,5 A. awamori VTCC-F-062 0,46 13,5 A. awamori VTCC-F-270 0,38 9,5 A. awamori VTCC-F-063 0,38 15,0 A. awamori VTCC-F-296 0,34 4,0 A. awamori VTCC-F-064 0,42 18,0 A. awamori VTCC-F-311 0,40 13,0 A. awamori VTCC-F-099 0,51 29,0 A. awamori VTCC-F-312 0,39 14,0 A. awamori VTCC-F-100 0,45 17,5 A. awamori VTCC-F-347 0,41 15,5 A. awamori VTCC-F-135 0,43 15,5 A. awamori VTCC-F-350 0,48 26,0 A. awamori VTCC-F-207 0,33 15,0 A. awamori VTCC-F-353 0,36 19,0 A. awamori VTCC-F-229 0,47 18,5 A. awamori VTCC-F-356 0,39 15,0 A. awamori VTCC-F-245 0,49 28,0 A. awamori VTCC-F-401 0,46 16,0 A. awamori VTCC-F-259 0,44 14,0 A. awamori VTCC-F-406 0,46 14,5 4.1.2 Phân loại chủng nấm sợi dựa vào phân đoạn gene 28S rRNA Sản phẩm tách chiết DNA tổng số của chủng A. awamori VTCC-F-099 đƣợc điện di kiểm tra trên gel 0,8% agarose. Kết quả hình 3.2A cho thấy DNA tƣơng đối sạch, không bị gãy và đủ lƣợng đảm bảo cho các nghiên cứu nhân dòng và đọc trình tự. Phản ứng PCR đƣợc tiến hành với cặp mồi NL1 và NL4, sau khi điện di kiểm tra, sản phẩm thu đƣợc có kích thƣớc khoảng hơn 600 bp (Hình 3.2B). Sản phẩm PCR sau khi đƣợc gắn vào vector pJET 1.2 và biến nạp vào tế bào E. coli DH5 đã đƣợc tách plasmid và cắt kiểm tra bằng cặp enzyme cắt hạn chế XbaI và XhoI. Kết quả đã nhận đƣợc một đoạn DNA có kích thƣớc khoảng hơn 600 bp (Hình 3.2C). Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 44 Hình 3.2. Điện di đồ DNA tổng số (A); Sản phẩm PCR (B): với khuôn DNA tách chiết từ chủng A. awamori VTCC-F-099; Sản phẩm cắt vector tái tổ hợp bằng XbaI và XhoI (C). M: Marker. Plasmid tái tổ hợp có mang đoạn gene mong muốn đã đƣợc tách với số lƣợng lớn và làm sạch theo protocol của Sambrook và Russell (2001) để đọc trình tự nucleotide. Đoạn gene 28S rRNA của các chủng nấm sợi nghiên cứu đƣợc xác định trình tự nucleotide trên máy giải trình tự tự động ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer. Đoạn gene 28S rRNA của chủng A. awamori VTCC-F-099 có chiều dài 614 bp (Bảng 3.2). So sánh trình tự đoạn gene 28S rRNA của chủng nấm nghiên cứu với một số trình tự gene 28S rRNA của nấm sợi đã công bố trên GenBank cho thấy, chủng A. awamori VTCC-F-099 có quan hệ họ hàng gần gũi với một số đại diện thuộc chi Aspergillus. Phân tích số liệu bằng phần mềm DNAStar cho thấy chủng A. awamori VTCC-F-099 có độ tƣơng đồng 99,5% với chủng A. awamori VTCC-F-296 (GQ903327), 96,9% với chủng A. flavus IFM 54306 (AB363745), 96,6% với chủng A. flavus UWFP 570 (AY216669), 96,1% với chủng A. flavipes UWFP 1022 (AY216668). Trình tự đoạn gene 28S rRNA của chủng A. awamori VTCC-F-099 đã đƣợc đăng ký trong Genbank với mã số là GQ892590. 3000 2000 1500 1000 750 500 250 614 bp bp 1500 1000 750 500 250 1 A B C Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 45 Nucleotide Substitutions (x100) 0 1.8 Af 45 Af 69 Aa 27 Aa 90 Af 68 Hình 3.3. Cây phân loại chủng A. awamori VTCC-F-099 Af 45: Aspergillus flavus IFM 54306 (AB363745); Af 69: A. flavus UWFP 570 (AY216669); Aa 27: A. awamori VTCC-F-296 (GQ903327); Aa 90: A. awamori VTCC-F-099 (GQ892590); Af 68: A. flavipes UWFP 1022 (AY216668) 4.2 TỐI ƢU CÁC ĐIỀU KIỆN SINH TỔNG HỢP ENDOGLUCANASE 4.2.1 Khả năng sinh tổng hợp endoglucanase theo thời gian Để đánh giá khả năng sinh tổng hợp endoglucanase theo thời gian, chủng A. awamori VTCC-F-099 đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng MT1 ở 30C, lắc 200 vòng/phút. Dịch canh trƣờng nuôi cấy đƣợc thu ở các thời gian khác nhau để xác định hoạt tính endoglucanase. Kết quả cho thấy, khả năng sinh tổng hợp endoglucanase của chủng A. awamori VTCC-F-099 tăng dần từ 24 giờ đến 96 giờ nuôi cấy. Tại thời điểm 96 giờ chủng này sinh tổng hợp endoglucanase mạnh nhất, hoạt tính đạt 0,55 IU/ml. Sau đó, hoạt tính endoglucanase giảm dần trong các khoảng thời gian nuôi cấy tiếp theo. Sau 120 giờ nuôi cấy hoạt tính là 0,39 IU/ml, đạt 71% và đến 240 giờ hoạt tính là 0,33 IU/ml, đạt 60% so với hoạt tính cực đại (Hình 3.4, Bảng 3.3). Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 46 0 40 80 120 0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240 264 H oạ t t ín h en do gl uc an as e tư ơn g đố i ( % ) Thời gian nuôi cấy (giờ) Hình 3.4. Khả năng sinh tổng hợp endoglucanase theo thời gian của chủng A. awamori VTCC-F-099 Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng phù hợp với một số kết quả nghiên cứu trong nƣớc cũng nhƣ trên thế giới. Theo kết quả nghiên cứu của một số tác giả trƣớc đây cho thấy, các chủng thuộc Trichoderma harzianam, Trichoderma spp, Phanerochaete chrysosporium và A. niger sinh tổng hợp endoglucanase cao nhất sau 96 giờ nuôi cấy với hoạt tính enzyme tƣơng ứng là 1,88; 1,53; 2,40 và 0,096 IU/ml [18], [41]. Các chủng nấm sợi phân lập từ rác thải sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất sau 144 giờ nuôi cấy [8], còn ba chủng nấm sợi thuộc các loài Penicillium pinophinum, P. persicinum, P. brasilianum có khả năng sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất sau 110-140 giờ nuôi cấy với hoạt tính khoảng 0,4 IU/ml [33], chủng Penicillium sp. DTQ-HK1 sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất sau 120 giờ nuôi cấy [10]. Tăng Thị Chính và cs (1999) khi nghiên cứu một số chủng vi khuẩn và xạ khuẩn chịu nhiệt phân lập từ bể ủ rác thải cho thấy, các chủng vi khuẩn Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 47 sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất sau 48 giờ nuôi cấy, còn các chủng xạ khuẩn sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất sau 48-72 giờ nuôi cấy [5]. Nhƣ vậy, các chủng nấm sợi thƣờng sinh tổng hợp endoglucanase chậm hơn so với các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn. 4.2.2 Nhiệt độ nuôi cấy Chủng A. awamori VTCC-F-099 đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng MT1, lắc 200 vòng/phút trong 96 giờ, ở các nhiệt độ khác nhau: 25, 28, 30, 32 và 37C để đánh giá ảnh hƣởng của nhiệt độ môi trƣờng nuôi cấy lên khả năng sinh tổng hợp endoglucanase của chủng nấm này và tìm ra nhiệt độ nuôi cấy tối ƣu. Kết quả trên hình 3.5 cho thấy, hoạt tính endoglucanase tăng dần trong dải nhiệt độ 25C-30C, nhiệt độ tối ƣu cho khả năng sinh tổng hợp endoglucanase của chủng nấm nghiên cứu là 30C, hoạt tính đạt 0,56 IU/ml. Ở các nhiệt độ cao hơn, hoạt tính endoglucanase lại giảm dần, ở 37C chỉ còn 0,44 IU/ml, đạt 78% so với hoạt tính cực đại (Hình 3.5, Bảng 3.4). Khi nghiên cứu trên các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn chịu nhiệt phân lập từ bể ủ rác thải, Tăng Thị Chính và cs (1999) thấy rằng, các chủng này sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất ở điều kiện nhiệt độ 45-55C và có thể chịu đƣợc nhiệt độ 65-80C [5]. Nghiên cứu của Nguyễn Lan Hƣơng và cs (1999) cũng cho thấy, các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn ƣa nhiệt sinh tổng hợp cellulase cao nhất ở nhiệt độ 50C [9]. Chủng xạ khuẩn thuộc Actinomyces griseus có khả năng sinh tổng hợp cellulase tối ƣu ở nhiệt độ 58C [13]. Theo Acharya và cs (2008), các chủng A. niger sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất khi lên men trong điều kiện 28C, pH 4,0-4,5 [18]. Kết quả nghiên cứu của Trịnh Đình Khá (2006) trên chủng Penicillium sp. DTQ-HK1 cho thấy, chủng này sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất khi nuôi cấy trong điều kiện 30C [10]. Nhƣ vậy, chủng A. awamori VTCC-F-099 là một chủng ƣa ấm và Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 48 trong các nhiệt độ khảo sát, nhiệt độ tối ƣu cho khả năng sinh tổng hợp endoglucanase là 30C. 0 40 80 120 20 25 30 35 40 H oạ t t ín h en do gl uc an as e tư ơn g đố i ( % ) Nhiệt độ nuôi cấy (oC) Hình 3.5. Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp endoglucanase của chủng A. awamori VTCC-F-099 4.2.3 Ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất cảm ứng Cơ chất với một nồng độ nhất định thƣờng đóng vai trò là chất cảm ứng cho quá trình sinh tổng hợp một loại enzyme tƣơng ứng. Để xác định khả năng cảm ứng của cơ chất CMC đến khả năng sinh tổng hợp endoglucanase, chủng nấm nghiên cứu đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng cơ bản cho sinh tổng hợp endoglucanase, CMC đƣợc bổ sung với các nồng độ khác nhau: từ 0,2-4%, sau 96 giờ thu dịch canh trƣờng và xác định hoạt tính endoglucanase. Kết quả cho thấy, khả năng sinh tổng hợp endoglucanase của chủng A. awamori VTCC-F-099 thay đổi rõ rệt khi nồng độ CMC trong môi trƣờng thay đổi. Hoạt tính endoglucanase tăng dần trong dải nồng độ Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 49 từ 0-2% CMC, đạt cực đại tại nồng độ 2% (0,81 IU/ml). Sau đó, khi nồng độ CMC tiếp tục tăng vƣợt quá 2% thì hoạt tính endoglucanase lại giảm dần. Ở nồng độ 3% CMC thì hoạt tính endoglucanase còn khoảng 61% (0,49 IU/ml) và ở nồng độ 4% hoạt tính chỉ còn 0,42 IU/ml, đạt khoảng 52% so với hoạt tính khi đạt cao nhất (Hình 3.6, Bảng 3.5). Nhƣ vậy, CMC với nồng độ 2% có vai trò cảm ứng tốt nhất khả năng sinh tổng hợp endoglucanase ngoại bào của chủng A. awamori VTCC-F-099. 0 40 80 120 0 1 2 3 4 5 H oạ t t ín h en do gl uc an as e tư ơn g đố i ( % ) Nồng độ CMC (%) Hình 3.6. Ảnh hƣởng của nồng độ CMC đến khả năng sinh tổng hợp endoglucanase của chủng A. awamori VTCC-F-099 Khi nghiên cứu chủng Penicillium sp. DTQ-HK1, Trịnh Đình Khá (2006) thấy rằng, chủng này sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất khi 0,5% CMC đƣợc bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy [10]. Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 50 4.2.4 Ảnh hƣởng của nguồn carbon và nồng độ nguồn carbon Chủng A. awamori VTCC-F-099 đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng MT1 chứa 2% CMC, cao nấm men đƣợc thay thế bằng một số nguồn carbon khác, ở 30C, lắc 200 vòng/phút, sau 96 giờ. Kết quả cho thấy, khả năng sinh tổng hợp endoglucanase của chủng nấm nghiên cứu khi sử dụng các nguồn carbon khác nhau có sự sai khác đáng kể. Trong đó, hoạt tính enzyme này cao nhất khi lõi ngô đƣợc sử dụng làm nguồn carbon thay cho cao nấm men (0,87 IU/ml), tiếp theo là bã mía (0,75 IU/ml) và glucose (0,70 IU/ml) (Bảng 3.6). Nhƣ vậy, với mục đích tìm nguồn nguyên liệu sắn có, nhất là nguồn phế phụ phẩm nông nghiệp thì lõi ngô đƣợc xem là nguồn carbon thay thế thích hợp cho chủng A. awamori VTCC-F-099 sinh tổng hợp endoglucanase. Bảng 3.6. Ảnh hƣởng của nguồn carbon Nguồn carbon Hoạt tính endoglucanase IU/ml % Bã mía 0,75 ± 0,146 86 Cao nấm men 0,65 ± 0,166 74 Glucose 0,70 ± 0,134 80 Lactose 0,28 ± 0,084 32 Lõi ngô 0,87 ± 0,158 100 Mùn cƣa 0,39 ± 0,101 45 Xơ dừa 0,54 ± 0,129 62 Sucrose 0,60 ± 0,019 69 Vỏ cà phê 0,64 ± 0,127 74 Vỏ cám trấu 0,57 ± 0,052 65 Vỏ lạc 0,51 ± 0,026 59 Vỏ quýt 0,65 ± 0,166 74 Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 51 Theo một số nghiên cứu trƣớc đây, các chủng nấm mốc sinh tổng hợp các enzyme thuộc nhóm cellulase mạnh trong những môi trƣờng có nguồn carbon tự nhiên nhƣ mùn cƣa, bã mía, lõi ngô [18], [50]. Ở một số chủng Penicillium có khả năng sinh tổng hợp endoglucanase và -glucosidase mạnh trong môi trƣờng có nguồn cơ chất cellulose tự nhiên còn đối với nguồn cơ chất là xylan yến mạch và birchwood xylan thì hoạt tính rất thấp [33]. Chủng Penicillium sp. DTQ-HK1 sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất khi 0,6% rơm đƣợc sử dụng nhƣ một nguồn carbon [10]. Sau khi tìm đƣợc nguồn carbon thay thế thích hợp là lõi ngô, chúng tôi tiến hành tối ƣu nồng độ nguồn carbon thay thế trên. Kết quả nghiên cứu cho thấy, hoạt tính endoglucanase có sự thay đổi đáng kể khi thay đổi nồng độ lõi ngô trong môi trƣờng nuôi cấy. Trong dải nồng độ khảo sát (0,5-5%) thì nồng độ lõi ngô thích hợp nhất cho khả năng sinh tổng hợp endoglucanase của chủng nấm nghiên cứu là 3%, hoạt tính đạt 0,90 IU/ml (Hình 3.7, Bảng 3.7). 40 80 120 0 1 2 3 4 5 Ho ạt tín h en do gl uc an as e t ươ ng đố i ( % ) Nồng độ lõi ngô (%) Hình 3.7. Ảnh hƣởng của nồng độ lõi ngô đến khả năng sinh tổng hợp endoglucanase của chủng A. awamori VTCC-F-099 Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 52 Theo nghiên cứu của một số tác giả thì lõi ngô không chỉ thích hợp cho khả năng sinh tổng hợp các enzyme thuộc nhóm cellulase mà còn là nguồn cơ chất cảm ứng cho một số loài vi sinh vật sinh tổng hợp một số enzyme khác nhƣ xylanase [16], [17]. 4.2.5 Ảnh hƣởng của nguồn nitrogen và nồng độ nguồn nitrogen Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của các nguồn nitrogen trong môi trƣờng nuôi cấy lên khả năng sinh tổng hợp endoglucanase của chủng A. awamori VTCC-F-099 cho thấy, khả năng sinh tổng hợp endoglucanase của chủng nấm nghiên cứu khi nuôi trong môi trƣờng có chứa các nguồn nitrogen khác nhau có sự khác nhau đáng kể. Trong số các nguồn nitrogen đƣợc khảo sát thì ammonium acetate đƣợc xem là nguồn nitrogen thích hợp nhất cho chủng A. awamori VTCC-F-099 sinh tổng hợp endoglucanase (4,88 IU/ml) (Bảng 3.8). Đây là một nguyên liệu khá dễ kiếm nên đƣợc chọn là nguồn nitrogen để thay thế cho các nguồn nitrogen có trong môi trƣờng cơ bản MT1. Bảng 3.8. Ảnh hƣởng của nguồn nitrogen Nguồn nitrogen Hoạt tính endoglucanase IU/ml % Ammonium acetate 4,88 ± 0,129 100 Ammonium nitrate 3,91 ± 0,104 80 Ammonium sulphate 4,19 ± 0,124 86 Bột cá 4,10 ± 0,118 84 Bột đậu tƣơng 3,51 ± 0,115 72 Casein 3,44 ± 0,128 71 Peptone 3,67 ± 0,105 75 Urea 3,87 ± 0,077 79 Nghiên cứu của Tăng Thị Chính và cs (1999) cũng cho thấy, các nguồn nitrogen hữu cơ (peptone, cao nấm men và bột đậu tƣơng) thích hợp cho Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 53 quá trình sinh trƣởng và sinh tổng hợp cellulase của các chủng vi khuẩn chịu nhiệt [5]. Bột đậu tƣơng cũng là nguồn nitrogen ảnh hƣởng mạnh tới khả năng sinh tổng hợp cellulase của chủng A. niger RNNL-363 [11]. Nghiên cứu của Trịnh Đình Khá (2006) cho thấy, chủng Penicillium sp. DTQ-HK1 sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất khi 1,6% bột đậu tƣơng đƣợc sử dụng nhƣ nguồn nitrogen trong quá trình lên men [10]. Sau khi tìm đƣợc nguồn nitrogen thay thế thích hợp là ammonium acetate, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ nguồn nitrogen này đến khả năng sinh tổng hợp endoglucanase của chủng nấm nghiên cứu. 0 40 80 120 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 H oạ t t ín h en do gl uc an as e tư ơn g đố i ( % ) Nồng độ ammonium acetate (%) Hình 3.8. Ảnh hƣởng của nồng độ ammonium acetate đến khả năng sinh tổng hợp endoglucanase của chủng A. awamori VTCC-F-099 Kết quả nghiên cứu cho thấy, hoạt tính endoglucanase của chủng nấm nghiên cứu có sự thay đổi đáng kể khi thay đổi lƣợng amonium acetate trong thành phần môi trƣờng. Hoạt tính enzyme tăng nhẹ trong dải nồng độ Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 54 0,1-0,25%, sau đó tiếp tục tăng mạnh và đạt cực đại tại 0,3% amonium acetate (4,97 IU/ml). Tiếp theo, khi nồng độ amonium acetate tiếp tục tăng vƣợt quá 0,3% thì hoạt tính endoglucanase lại giảm dần. Ở nồng độ 0,35% ammonium acetate thì hoạt tính endoglucanase là 4,03 IU/ml, đạt 81% và ở nồng độ 0,5% ammonium acetate thì hoạt tính chỉ còn 3,51 IU/ml, đạt 71% so với hoạt tính enzyme khi đạt cực đại (Hình 3.8, Bảng 3.9). 4.2.6 pH môi trƣờng nuôi cấy ban đầu pH môi trƣờng nuôi cấy ban đầu là một trong những yếu tố có ảnh hƣởng lớn đến tốc độ sinh trƣởng và khả năng sinh tổng hợp các enzyme của các loài vi sinh vật. Chủng A. awamori VTCC-F-099 đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng MT1 chứa 2% CMC, 3% lõi ngô, 0,3% ammonium acetate đƣợc điều chỉnh pH từ 3,0 đến 8,0 bằng các dung dịch HCl/NaOH, lắc 200 vòng/phút, ở 30C, trong 96 giờ. Kết quả đƣợc thể hiện nhƣ hình 3.9 và bảng 3.10. 0 40 80 120 2 3 4 5 6 7 8 9 H oạ t t ín h en do gl uc an as e tư ơn g đố i ( % ) pH Hình 3.9. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp endoglucanase của chủng A. awamori VTCC-F-099 Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 55 Kết quả trên hình 3.9 và bảng 3.10 cho thấy, khả năng sinh tổng hợp endoglucanase tăng dần trong dải pH 3,0-6,5, đạt cực đại tại pH 6,5 (5,22 IU/ml). Sau đó, khi pH tiếp tục tăng vƣợt qua pH 6,5 thì hoạt tính enzyme bắt đầu giảm dần. Ở pH 7 hoạt tính là 4,84 IU/ml, đạt 93% và đến pH 8 thì hoạt tính enzyme chỉ là 4,57 IU/ml, đạt 88% so với hoạt tính cực đại. Nhƣ vậy, pH 6,5 là tối ƣu cho chủng A. awamori VTCC-F-099 sinh tổng hợp endoglucanase. Nghiên cứu của Đặng Minh Hằng (1999) trên một số chủng nấm sợi cho thấy, khả năng sinh tổng hợp cellulase của chúng mạnh nhất trong khoảng pH 4,5-6,0 [8]. Các chủng A. niger sinh tổng hợp endoglucanase mạnh nhất trong khoảng pH môi trƣờng ban đầu từ 6,0-7,0 [19]. Trong khi đó, các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn chịu nhiệt sinh tổng hợp cellulase thích hợp với pH môi trƣờng ban đầu là 8,0 [5]. 4.3 TINH SẠCH ENDOGLUCANASE 4.3.1 Tinh sạch qua cột sắc ký lọc gel sephadex G-100 Dịch enzyme sau khi đƣợc ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút, đƣợc đƣa lên cột sắc ký lọc gel sephadex G-100 với tổng thể tích là 10 ml. Tốc độ dòng chảy là 25 ml/giờ. Thu 20 phân đoạn, thể tích mỗi phân đoạn 2 ml. Kết quả kiểm tra hoạt tính endoglucanase của các phân đoạn (Bảng 3.11) cho thấy, endoglucanase tập trung ở các phân đoạn từ 6 đến 16. Điện di đồ hình 3.10 cho thấy, ở các phân đoạn vẫn còn khá nhiều băng protein, tuy nhiên xuất hiện một băng protein đậm có khối lƣợng dƣới 35 kDa. Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 56 Hình 3.10. Điện di đồ trên gel polyacrylamide sản phẩm tinh sạch endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099 qua cột Sephadex G-100 (1-5: các phân đoạn 7-11 qua cột sephadex G-100; 6: Marker; 7: dịch enzyme thô) 4.3.2 Tinh sạch qua cột sắc ký trao đổi ion DEAE Những phân đoạn qua cột sephadex G-100 có hoạt tính endoglucanase cao (phân đoạn 6-16) đƣợc đƣa tiếp lên cột sắc kí trao đổi ion DEAE với tổng thể tích 12 ml. Tốc độ dòng chảy là 20 ml/giờ. Thu 20 phân đoạn, thể tích mỗi phân đoạn 2 ml. Kết quả kiểm tra hoạt tính endoglucanase của các phân đoạn cho thấy, các phân đoạn từ 3 đến 7 có hoạt tính riêng cao hơn hẳn so với các phân đoạn khác (Bảng 3.12). Các phân đoạn có hoạt tính cao: từ phân đoạn 3 đến phân đoạn 7 đƣợc điện di kiểm tra trên gel 12,5% polyacrylamide. Điện di đồ hình 3.11 cho thấy, enzyme thu đƣợc ở các phân đoạn trên là khá sạch. Các phân đoạn trên đều có duy nhất một loại protein có khối lƣợng phân tử khoảng 32 kDa. Enzyme thu đƣợc có độ sạch 3,08 lần so với dịch enzyme thô ban đầu (Bảng 3.13). kDa 166 66 45 35 Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 57 Bảng 3.13. Tóm tắt quá trình tinh sạch endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099 Bƣớc tinh sạch Protein tổng số (mg protein/ml) Hoạt tính endoglucamase Độ tinh sạch (lần) Hiệu suất thu hồi (%) IU/ml IU/mg protein Dịch thô 0,79 16,69 21,19 1 100 Sắc kí lọc gel Sephadex G-100 0,28 6,30 22,44 1,06 76 Sắc ký trao đổi ion DEAE 0,02 1,19 65,30 3,08 7 Hình 3.11. Điện di đồ sản phẩm tinh sạch endoglucanase trên gel polyacrylamide (1: dịch enzyme thô; 2: marker; 3-7: các phân đoạn 3-7 qua cột DEAE). 4.4 NHỮNG TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA ENDOGLUCANASE 4.4.1 Ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất Khi tăng nồng độ cơ chất thì vận tốc phản ứng tăng theo nghĩa là hoạt tính của enzyme tăng. Tuy nhiên, vận tốc phản ứng đạt cực đại ở một giới hạn nồng độ cơ chất nhất định, nếu tiếp tục tăng nồng độ cơ chất, có thể vận tốc phản ứng lại giảm xuống [4]. kDa 66 45 35 25 18 14 Endoglucanase (32 kDa) Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 58 0 40 80 120 0 0.5 1 1.5 2 2.5 H oạ t t ín h en do gl uc an as e tư ơn g đố i ( % ) Nồng độ CMC (%) Hình 3.12. Ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất lên hoạt tính endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099 Để khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất CMC đến hoạt tính xúc tác của endoglucanase, phản ứng đƣợc thực hiện ở nhiệt độ 50C, pH 6,5 với nồng độ cơ chất từ 0,2-2% CMC. Kết quả cho thấy, hoạt tính endoglucanase tăng tuyến tính khi tăng nồng độ cơ chất trong dải từ 0,2 đến 1,2% CMC, đạt cực đại ở nồng độ 1,2% CMC. Sau đó, nồng độ cơ chất tiếp tục tăng vƣợt quá 1,2% CMC thì hoạt tính endoglucanase lại giảm, chỉ đạt 75% so với hoạt tính cực đại ở nồng độ 1,4% CMC và ở nồng độ 2% CMC thì hoạt tính chỉ bằng 43% so với hoạt tính cực đại (Hình 3.12, Bảng 3.14). Nhƣ vậy, nồng độ cơ chất 1,2% CMC là tối ƣu cho phản ứng xúc tác của endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099. 4.4.2 Nhiệt độ phản ứng tối ƣu Nhiệt độ phản ứng ảnh hƣởng mạnh mẽ đến hoạt tính xúc tác của enzyme, mỗi enzyme có một nhiệt độ phản ứng thích hợp. Trong giới hạn Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 59 nhiệt độ chƣa làm biến tính enzyme, hoạt tính enzyme tăng khi nhiệt độ tăng. Tuy nhiên, khi nhiệt độ tăng quá giới hạn thì hoạt tính của enzyme lại giảm. Để khảo sát nhiệt độ tối ƣu của endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC- F-099, phản ứng đƣợc thực hiện ở cá