Luận văn So sánh đặc điểm hóa sinh trứng và trình tự vùng điều khiển d-Loop của ba giống gà ri, gà mông và gà sao nuôi tại Thái Nguyên

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM -------- -------- BÙI THỊ KIỀU VÂN SO SÁNH ĐẶC ĐIỂM HÓA SINH TRỨNG VÀ TRÌNH TỰ VÙNG ĐIỀU KHIỂN D-LOOP CỦA BA GIỐNG GÀ RI, GÀ MÔNG VÀ GÀ SAO NUÔI TẠI THÁI NGUYÊN LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2008 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM -------- -------- BÙI THỊ KIỀU VÂN SO SÁNH ĐẶC ĐIỂM HÓA SINH TRỨNG VÀ TRÌNH TỰ VÙNG ĐIỀU KHIỂN D-LOOP CỦA BA GIỐNG GÀ RI, GÀ MÔNG VÀ GÀ SAO NUÔI TẠI THÁI NGUYÊN Chuyên ngành: DI TRUYỀN HỌC Mã số: 60.42.70 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC Người hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Trọng Lạng THÁI NGUYÊN - 2008 LỜI CẢM ƠN Trước tiên, tôi xin trân trọng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới tới PGS.TS. Nguyễn Trọng Lạng, giảng viên khoa sinh - KTNN trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên, PGS.TS. Nông Văn Hải, Phó Viện trưởng, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, những người thầy đã tận tình dìu dắt và hướng dẫn tôi trong suốt quá trình hoàn thành luận văn. Trong thời gian hoc tập và nghiên cứu vừa qua, tôi đón nhận được sự giúp đỡ hết lòng, chỉ bảo tận tình và sâu sắc của CN. Địch Thị Kim Hương, ThS.NCS. Nguyễn Đăng Tôn cùng tập thể các cô, chú, anh, chị cán bộ nghiên cứu Phòng Công nghệ ADN ứng dụng, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam những người đã tạo nhiều điều kiện thuận lợi và nhiệt tình hướng dẫn tôi trong quá trình nghiên cứu. Tôi rất cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban chủ nhiệm khoa và các thầy, cô giáo, kỹ thuật viên khoa Sinh - KTNN trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên đã ủng hộ và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu. Cho phép tôi được tỏ lòng biết ơn tới Ths. Ngôn Thị Hoán, giảng viên chính khoa Chăn nuôi - Thú y trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong việc nghiên cứu thực hiện đề tài. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ tình cảm của mình bằng lời cảm ơn chân thành đến gia đình, người thân và bạn bè, những người luôn dành cho tôi những tình cảm nồng ấm, thân thương nhất trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu. Thái Nguyên, tháng 9 năm 2008 BÙI THỊ KIỀU VÂN MỤC LỤC MỞ ĐẦU ........................................................................................................ 1 1. Tính cấp thiết của đề tài .............................................................................. 1 2. Mục tiêu của đề tài ...................................................................................... 2 3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................... 2 Chƣơng I TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................. 3 1.1. NGUỒN GỐC GIA CẦM .......................................................................... 3 1.2. MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CÁC GIỐNG GÀ NGHIÊN CỨU .... 4 1.2.1. Gà Ri ................................................................................................... 4 1.2.2. Gà Mông ............................................................................................. 4 1.2.3. Gà Sao ................................................................................................ 5 1.3. CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI ......................................................... 6 1.3.1. Cơ sở của việc nghiên cứu các tính trạng ở trứng ............................. .6 1.3.2. Phân tích trình tự vùng điều khiển (D-loop) ty thể ........................ .8 1.3.2.1. Ty thể - đặc điểm cấu tạo DNA ty thể ......................................... .8 1.3.2.2. Đặc điểm cấu tạo hệ gen ty thể gà ............................................ .9 1.3.2.3. Ý nghĩa của DNA ty thể trong nghiên cứu phân loại ở gà ........ 12 1.3.2.4. Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà trên thế giới ..................... 12 13.2.5. Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà ở Việt Nam ........................ 15 Chƣơng 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................... 17 2.1. VẬT LIỆU ............................................................................................... 17 2.2. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ .................................................................... 17 2.2.1. Hóa chất ............................................................................................ 17 2.1.2. Thiết bị .............................................................................................. 18 2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................... 19 2.3.1. Các phƣơng pháp hóa sinh ................................................................ 19 2.3.1.1. Phương pháp xác định tỷ lệ lòng trắng, lòng đỏ, vỏ .................. 19 2.3.1.2. Phương pháp xác định hàm lượng vật chất khô ......................... 19 2.3.1.3. Định lượng lipid tổng số ............................................................ 19 2.3.1.4. Định lượng Protein. .................................................................... 20 2.3.1.5. Phương pháp xử lý số liệu ........................................................ 21 2.3.2. Các phƣơng pháp sinh học phân tử ................................................... 22 2.3.2.1. Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ máu động vật ............. 22 2.3.2.2. Kĩ thuật điện di DNA trên gel agarose ...................................... 23 2.3.2.3. Nhân vùng điều khiển D-loop bằng kỹ thuật PCR .................... 24 2.3.2.4. Kĩ thuật tách dòng gen ............................................................... 26 2.3.2.5. Phương pháp xác định trình tự DNA ........................................ 28 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................. 29 3.1. SO SÁNH ĐẶC ĐIỂM HÓA SINH TRỨNG CỦA 3 GIỐNG GÀ ...... 29 3.1.1. Tỷ lệ lòng trắng, lòng đỏ, vỏ tƣơi ...................................................... 29 3.1.2. Hàm lƣợng vật chất khô ................................................................... 30 3.1.3. Hàm lƣợng lipit tổng số ..................................................................... 31 3.1.4. Hàm lƣợng protein tổng số ............................................................... 32 3.2 . ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA BA MẪU GIỐNG GÀ ..... 34 3.2.1. Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ máu gà .............................. 34 3.2.2. Nhân đoạn trình tự của vùng D-loop của DNA ty thể ...................... 36 3.2.3. Tách dòng và xác định trình tự vùng D- loop của DNA ty thể ......... 39 3.2.3.1. Tách dòng vùng D-loop ............................................................. 39 3.3.2.2. Xác định trình tự vùng D-loop của DNA ty thể ......................... 44 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................ 51 Kết luận. ......................................................................................................... 51 Đề nghị ......................................................................................................52 CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ .............................................................. 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 53 PHỤ LỤC ........................................................................................................ 57 BẢNG KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Amp Ampicilline bp Base pair (cặp bazơ) ddNTP Dideoxynucleotide triphosphate dNTP Deoxynucleotide triphosphate DNA Deoxyribo Nucleic Axit D-loop Displacement loop E.coli Escherichia coli EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid Epp Eppenđorf EtBr Ethidium Bromide EtOH Ethanol (cồn) IPTG Isopropyl thio-β-D- galactoside kb Kilo base LB Luria - Bertani mtDNA DNA ty thể (mitochondrial DNA) NADH Nicotinamide adenine dinucleotide PBS Phosphate - buffer saline PCR Polymerase Chain Reaction RNA Ribonucleaxit RNase Ribonuclease SDS Sodium Dodecyl Sulphate TAE Tris-Acetate-EDTA TE Tris EDTA Tm Melting Temperature (nhiệt độ nóng chảy) v/p vòng/phút Danh môc c¸c b¶ng Bảng 1.1. Sự khác nhau giữa mã di truyền trong nhân và ngoài ty thể ......... 11 Bảng 2.1. Các thiết bị sử dụng trong đề tài .................................................... 18 Bảng 2.2. Thành phần phản ứng khuếch đại gen ........................................... 25 Bảng 3.1. Tỷ lệ lòng đỏ, lòng trắng, vỏ tƣơi ................................................. 29 Bảng 3.2. Hàm lƣợng vật chất khô trong trứng gà .................................. 30 Bảng 3.3. Hàm lƣợng lipid tổng số ở thịt gà thí nghiệm .............................. 31 Bảng 3.4. Hàm lƣợng protein thô trong trứng gà thí nghiệm ...................... 33 Bảng 3.5. Thống kê các điểm đa hình ở 2 mẫu nghiên cứu so với trình tự tham khảo mã số AB268515 .......................................................................... 49 Bảng 3.6. So sánh tỷ lệ sai khác trình tự nucleotide của một số giống gà ..... 50 Danh môc c¸c h×nh Hình 1.1. Sơ đồ tổ chức của DNA ty thể Gà .................................................. 10 Hình 2.1. Sơ đồ vector tách dòng pJET1/blunt .............................................. 26 Hình 3.1. Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ lòng đỏ, lòng trắng của trứng gà .............. 29 Hình 3.2. Biểu đồ biểu diễn hàm lƣợng vật chất khô của trứng gà .............. 30 Hình 3.3. Biểu đồ biểu diễn hàm lƣợng lipid tổng số ở trứng gà thí nghiệm .... 32 Hình 3.4. Biểu đồ biểu diễn hàm lƣợng protein thô trong thịt gà thí nghiệm ..... 33 Hình 3.5. Ảnh kết quả điện di DNA tổng số .................................................. 36 Hình 3.6. Ảnh kết quả điện di sản phẩm PCR ............................................... 39 Hình 3.7. Ảnh điện di một số DNA plasmid trên gel agarose 0,8% ............. 42 Hình 3.8. Ảnh kết quả kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng XhoI và XbaI ......... 44 Hình 3.9. So sánh trình tự D-loop của hai mẫu nghiên cứu Ri (Rhy), Mông (Mna) với trình tự tham khảo mã số AB268515 ........................................ 48 Hình 3.10. Quan hệ di truyền của một số giống gà ........................................ 50 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Trong những năm gần đây ngành chăn nuôi gia cầm nước ta phát triển nhanh, đạt được những tiến bộ rõ rệt, số lượng đầu gia cầm cũng như sản lượng thịt, trứng của ngành tăng hàng năm. Theo Hoàng Kim Giao và Nguyễn Thanh Sơn (Cục chăn nuôi - Bộ nông nghiệp: Thông tin Hiệp hội chăn nuôi gia cầm Việt Nam - 2005) trong những năm gần đây tốc độ tăng đầu con của đàn gia cầm từ năm 1990 đến năm 2000 là 5%/năm, năm 2002 là 6,69%, năm 2003 là 8,9%. Tổng đàn gia cầm trong cả nước 254,057 triệu con năm 2003, sản lượng trứng 4,85 tỷ quả năm 2003. Bên cạnh việc phát triển các giống gà nhập nội có năng suất cao như gà Lergho, Lương Phượng, Lương Phượng Sasso, gà Brow nick, Tam hoàng... thì việc bảo tồn và phát triển các giống gà nội có khả năng thích ứng tốt với điều kiện chăn nuôi của địa phương, chất lượng thịt, trứng tốt như gà Đông Tảo, gà Ác, gà Tè, gà Ri, gà Mông, gà Mía, gà Tre, gà Hồ, gà Tàu vàng, gà Móng, gà Chọi... cũng đang được quan tâm. Gần đây việc nhập nội các giống gà có năng suất cao, chất lượng thịt, trứng tốt, có khả năng thích ứng cao với điều kiện chăn nuôi ở địa phương như gà Sao, gà Ai cập cũng đã và đang thu hút sự chú ý của người nông dân. Việc đánh giá chất lượng trứng, thịt cũng như tìm hiểu sự đa dạng di truyền ở mức phân tử của các giống gà trên là cần thiết cho ngành chọn giống gia cầm. Hiện nay đã có các công trình nghiên cứu về thành phần hóa sinh trứng gà Ri, gà Ác, Lergho... [5], [9], [10], [27], [32], [36]. Xác định sự đa dạng di truyền ở mức phân tử của các giống gà qua nghiên cứu vùng điều khiển D-loop ty thể trên thế giới được chú ý từ những năm 1990 và đang phát triển rộng rãi. Ở Việt Nam các xác định đa dạng di truyền ở mức phân tử ở gà qua các nghiên cứu liên quan đến vùng điều khiển D-loop Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2 mới bắt đầu từ những năm 1999 trên đối tượng gà lôi [4]. Đến nay việc giải trình tự nucleotide vùng D-loop để đánh giá mức đa dạng di truyền đang được quan tâm. Hiện nay TS. Lê Thị Thúy - Viện Chăn Nuôi đang làm chủ nhiệm đề tài cấp nhà nước "Nghiên cứu sự đa dạng di truyền các giống gà nội" trong đó có giống gà Mông và gà Ri. Trong phạm vi nghiên cứu của luận văn này chúng tôi lựa chọn đề tài: " So sánh thành phần hóa sinh trứng và trình tự vùng điều khiển D-Loop của ba giống gà Ri, gà Mông và gà Sao nuôi tại Thái Nguyên". 2. Mục tiêu của đề tài - So sánh chất lượng trứng của ba giống gà. - So sánh trình tự đoạn điều khiển trong DNA ty thể giữa các giống gà. - Xác định mối quan hệ di truyền của một số giống gà. 3. Nội dung nghiên cứu - Xác định các chỉ tiêu hóa sinh trứng: Hàm lượng vật chất khô; tỷ lệ lòng trắng; lòng đỏ; hàm lượng lipit; protein. - Tách DNA tổng số từ máu của các giống gà trên. - Nhân toàn bộ vùng D-loop bằng kỹ thuật PCR. - Tạo dòng phân tử vùng D-loop. - Phân tích, so sánh trình tự vùng D-loop gen ty thể với trình tự đã được công bố trong ngân hàng genbank. - Vẽ cây phát sinh về mối quan hệ di truyền của một số giống gà. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 3 Chƣơng I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. NGUỒN GỐC GIA CẦM Nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu về nguồn gốc gia cầm và đưa ra kết luận rằng: Gà nhà hiện nay có chung nguồn gốc từ gà rừng Gallus gallus. Gà rừng có thân hình nhỏ bé, đẻ dồn theo mùa, trứng bé, có khả năng bay xa. Cơ sở của kết luận trên là gà nhà có nhiều đặc điểm giống gà rừng về mặt hình thái đến cấu tạo giải phẫu các bộ phận bên trong cơ thể, tiếng gáy, tập tính hoạt động. Theo loại hình gà có thể chia thành 3 kiểu: Kiểu Bakira (gà nguyên thuỷ): nhiều lông, ức nở, mào và dái tai lớn, mỏ hơi cong và nhọn. Kiểu Malaysia (gà chọi): ít lông và cứng, mào và dái tai nhỏ, đầu nhỏ, mắt lõm vào hốc mắt, mỏ ngắn khoẻ. Kiểu Cochin: nhiều lông bồng, lông tơ, mào và dái tai vừa, tai nhỏ màu đỏ, mỏ tương đối ngắn. Từ 3 loại hình trên, người ta chọn lọc, dần dần hình thành nên các giống gà chuyên thịt, chuyên trứng hay kiêm dụng ngày nay. Theo Nguyễn Ân (1983) [1] và nhiều tác giả đã sắp xếp vị trí của gà nhà trong hệ thống giới động vật như sau: Giới động vật (Animal); Ngành động vật có xương sống (Chordata); Lớp chim (Aves); Bộ gà (Galliformes); Họ Trĩ (Fasia nidea); Chủng Gallus; Loài Gallus gallus. Gà được thuần hoá đầu tiên ở Ấn Độ cách đây 5000 năm, sau đó là Ba Tư. Nhờ sự tiến bộ trong công tác chọn giống, từ các giống gà địa phương của châu Á, sau khi nhập vào châu Âu thế kỷ XVIII và XIX, đầu tiên là ở nước Anh, sau đó là nước Mỹ, các giống gà được lai tạo thành nhiều giống gà có năng suất cao hơn. Ở nước ta, gà rừng được thuần hoá và nuôi sớm nhất ở vùng Vĩnh Phú, Hà Bắc, Hà Tây… Từ giống gà nuôi ban đầu là tiền thân của gà Ri hiện nay nhân dân ta đã tạo được nhiều giống gà: gà Mía, gà Ác, gà Ri, gà Tre, gà Đông Tảo, gà Vàng…. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 4 1.2. MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA BA GIỐNG GÀ NGHIÊN CỨU 1.2.1. Gà Ri Gà Ri là giống gà nội phổ biến nhất ở nước ta, chiếm 70% tổng số gà trong cả nước, nguồn gốc từ nhóm gà rừng Gallus bankiva hay Gallus gallus. Ngoại hình thon, nhỏ; mỏ nhỏ; mào cờ có răng cưa mào đỏ tươi rất phát triển ở con trống; tích và dái tai có xen lẫn ánh bạc trắng; cổ thanh, dài vừa phải ngực lép bụng thon, mềm; chân có hai hàng vải màu vàng, có khi xen lẫn màu đỏ tươi. Bàn chân có bốn ngón, cựa phát triển sớm ở gà trống. Màu lông rất khác nhau phổ biến ở con mái có màu vàng rơm, vàng đất, nâu nhạt và đốm. Con trống màu lông đỏ sẫm, ở đầu lông cánh và lông đuôi có màu đen ánh xanh, lông bụng đỏ nhạt hoặc vàng đất. Ngoài ra còn màu lông khác như trắng, hoa mơ, đốm trắng... [1]. Gà Ri mọc lông sớm, tốc độ mọc lông nhanh hơn gà Mía, Đông Tảo nên có khả năng chịu đựng tốt hơn khi nuôi ở điều kiện thời tiết lạnh, gà Ri đẻ trứng sớm, tuổi đẻ đầu lúc 123 ngày tuổi và đạt tỷ lệ đẻ 5% lúc 127 ngày tuổi. Sản lượng trứng 90 - 115 quả/năm, con trống nặng 1,5 đến 2kg, con mái nặng 1,1 đến 1,6 kg. Gà Ri ham ấp bóng đẻ được 10 - 15 quả lại đòi ấp, khối lượng trung bình 36 – 45g/quả gà có chất lượng trứng, thịt tốt. 1.2.2. Gà Mông Theo Nguyễn Văn Trụ, 2000 [12] cho biết gà Mông phân bố ở vùng núi phía Bắc với số lượng không nhiều và đang có nguy cơ bị lai tạp, mất dần. Từ năm 1999 đề án “Bảo tồn quỹ gen Việt Nam 1999 - 2002” và dự án “Bảo tồn các giống vật nuôi có gen quý hiếm 2000 - 2001” đã đưa giống gà này vào bảo tồn tại Sơn La và Hà Nội. Gà Mông trưởng thành có hình dạng cân đối, vững chắc, nhanh nhẹn, chân cao màu đen. Màu sắc lông đa dạng, màu da đen, thịt đen chiếm 90%, sức kháng bệnh cao, khả năng sinh sản thấp. Năng suất trứng thấp, chất lượng trứng tốt, thơm ngon được nhiều người ưa thích. Gà Mông nuôi tại huyện Trạm Tấu tỉnh Yên Bái có tuổi thành thục muộn, Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 5 gà trống đạp mái lúc 157,20 ngày tuổi; gà mái đẻ trứng lúc 177,65 ngày tuổi. Gà mái đẻ ít và thưa, số trứng/mái/lứa là 13,65 quả, khoảng cách giữa 2 lứa đẻ là 19,88 ngày. Trứng gà Mông có khối lượng ở mức trung bình với 44,04g, chỉ số hình thái là 76,23%, chỉ số Haugh 105,90. Tỷ lệ vật chất khô ở lòng đỏ trứng là 50,56%, ở lòng trắng là 12,41. Tỷ lệ protein lòng đỏ 16,66%, lòng trắng 11,01%, lòng đỏ trứng có tỷ lệ lipit khá cao 26,94% ,[17]. 1.2.3. Gà Sao Gà Sao có nguồn gốc từ gà rừng, thuộc lớp: Aves, Bộ: Galliformes, Họ: Phasianidae. Tháng 4 năm 2002, trung tâm nghiên cứu gia cầm Thụy Phương đã nhập 3 dòng gà Sao từ Viện nghiên cứu tiểu gia súc Godollo (Hungari). Kết quả nghiên cứu khẳng định gà Sao hoàn toàn có khả năng thích ứng tốt với điều kiện sinh thái Việt Nam [14]. Ở 1 ngày tuổi, gà Sao có bộ lông màu cánh sẻ, có những đường kẻ sọc chạy dài từ đầu đến cuối thân. Mỏ và chân màu hồng, chân có 4 ngón và có 2 hàng vẩy. Giai đoạn trưởng thành gà Sao có bộ lông màu xám đen, trên phiến lông điểm nhiều những nốt chấm trắng tròn nhỏ. Thân hình thoi, lưng hơi gù, đuôi cúp. Đầu không có mào mà thay vào đó là mấu song cao khoảng 1,5 - 2 cm. Mào tích của gà Sao màu trắng hồng và có 2 loại: một loại hình lá dẹt áp sát vào cổ, còn một loại hình lá hoa đá rủ xuống. Da mặt và cổ của gà Sao không có lông, lớp da trần này có màu xanh da trời, dưới cổ có yếm thịt mỏng. Chân khô, đặc biệt con trống không có cựa. Gà Sao thuộc loài nhút nhát, cảnh giác, bay giỏi như chim, rất ít mổ, cắn nhau, thích mổ những vật lạ. Đặc biệt là có tập tính bày đàn cao; không bộc lộ tập tính sinh dục rõ ràng, gà Sao mái đẻ trứng tập trung. Gà bắt đầu đẻ vào tuần tuổi thứ 27 và đạt tỷ lệ đẻ 5% ở tuần tuổi thứ 30 khi cơ thể đạt khối lượng khoảng 2,2-2,3 kg. Tuổi đẻ đạt đỉnh cao là 34-40 tuần tuổi. Năng suất trứng/mái/23 tuần đẻ là 85-100 quả. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 6 1.3. CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI 1.3.1. Cơ sở của việc nghiên cứu các tính trạng ở trứng Theo H. Brandsch và H. Bichel một số tính trạng thuộc về đặc điểm sinh học như màu lông, màu sắc vỏ trứng, hình dáng cơ thể, thành phần các loại protein, lipit trong trứng, thịt thuộc các tính trạng chất lượng. Chất lượng lòng trắng Tỷ lệ lòng trắng chiếm 55 - 60% khối lượng trứng nếu nhìn bằng mắt thường những trứng tươi sẽ có lòng trắng màu hơi vàng, những trứng để lâu màu lòng trắng sáng hơn. Theo Rose [27]; Krax [34] và Pingel [35] cấu trúc lòng trắng được chia ra làm 3 lớp đó là: Lớp lòng trắng loãng bên ngoài 23%, Lớp lòng trắng đặc ở giữa 57%, Lớp lòng trắng loãng trong cùng 20%. Độ quánh của lòng trắng đặc (chủ yếu là sợi mucin) giảm đi theo tuổi gia cầm. Tỷ lệ lòng trắng đặc và lòng trắng loãng ở trứng gà tươi là 2:1, tỷ lệ này giảm dần theo thời gian bảo quản có khi xuống tới tỷ lệ 1: 1. Lòng trắng trứng có tác dụng hấp thụ cũng như cung cấp các chất dinh dưỡng cho phôi. Chiều cao lòng trắng đặc là một chỉ tiêu đánh giá chất lượng bên trong của trứng. Chất lượng lòng đỏ Lòng đỏ trứng là một tế bào khổng lồ được bao bọc bởi một lớp màng, đây cũng là nguồn dinh dưỡng dự trữ của phôi. Tỷ lệ lòng đỏ chiếm 30 đến 33% khối lượng trứng và có đường kính khoảng 30 đến 35mm. Lòng đỏ trứng có cấu tạo như sau: Lớp màng dày dày 6 - 11 µm; đĩa phôi màu trắng sáng có đường kính 3mm. Để đánh giá chất lượng lòng đỏ người ta dùng chỉ số lòng đỏ. Chỉ số này được xác định bằng tỷ lệ giữa chiều cao lòng đỏ so với đường kính lòng đỏ. Kết quả nghiên cứu trên gà Ri của Nguyễn Hoài Tao và cs [10], Nguyễn Văn Thạch [11] cho biết chỉ số lòng đỏ trứng là 0,43. Chỉ số lòng đỏ ở gà xương đen Thái Hòa Trung Quốc là 0,46 Vũ Quang Ninh [7]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 7 Thành phần hóa học của trứng Trứng gia cầm nói chung và trứng gà nói riêng là một loại thực phẩm rất giàu dinh dưỡng, đặc biệt là lòng đỏ cung cấp khoảng 50% protein. Thành phần dinh dưỡng của trứng các loại gia cầm khác nhau thì khác nhau. Protein trong trứng thường là những protein dễ tiêu hóa. Hàm lượng mỡ trong trứng ở dạng nhũ hóa và dễ tiêu hóa và có chứa hàm lượng acid béo không no rất cao, hàm lượng khoáng cao, đặc biệt là hàm lượng sắt và phospho. Thành phần khoáng trong trứng có thể thay đổi thông qua khẩu phần ăn của gia cầm đẻ Rose [27]. Theo Gilbert [16] trong một lòng đỏ trứng có khối lượng 19g có chứa: 10,5mg natrium; 17,9mg kalium; 25,7mg calcium; 2,6mg magecium; 1,5mg sắt; 29,8mg lưu huỳnh; 24,7mg clo; 98,4mg phospho. Hàm lượng vitamin trong trứng cao: 200-800UI vitamin A; 20UI vitamin D; 49µg vitamin B1; 84µg vitaminB2; 30µg acid nicotinic; 58 µg vitaminB6; 580µg acid pantothenic; 10µg biotin; 4,5µg acid folic; 0,3µg vitamin B12; 150µg vitamin E; 25µg vitamin K1. * Thành phần hóa học của lòng trắng Lòng trắng là nơi dự trữ khoảng 88% nước của trứng Rose [27]; Vogt [36] phần còn lại là protein như globulin, ovomucin và albumin. Ovomucin chiếm 75% tổng protein trong lòng trắng. Globulin chiếm khoảng 20%. Thành phần hóa học lòng trắng trứng ở tất cả các loại trứng gia cầm đều giống nhau. Lòng trắng đặc có hàm lượng ovomucin gấp 4 lần lòng trắng loãng, đây chính là nguyên nhân tạo nên cấu trúc keo của lòng trắng. Độ pH của lòng trắng trứng gà tươi là 7,6; sau 14 ngày bảo quản chúng có thể tăng lên 9,2 Rose [27] Và Hartfiel [33]. *Thành phần hóa học của lòng đỏ Lòng đỏ trứng gà có chứa 49% nước, 16% protein và 33% mỡ. Hai phần ba mỡ trong lòng đỏ là triglicerit; 30% phospholipit và 5% cholesteron. Hàm Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 8 lượng nước trong lòng đỏ có thể thay đổi từ 46 -50% tùy thuộc vào thời gian và điều kiện bảo quản. Hàm lượng mỡ trong lòng đỏ trứng cũng có thể thay đổi theo khẩu phần ăn, chỉ riêng thành phần acid béo không no như palmitin và acid stearic là không thay đổi. Hàm lượng acid béo này duy trì ở mức 30-38% trong tổng số chất béo. Nếu khẩu phần ăn chứa nhiều acid béo không no mạch đa (PolyUnsaturated Fatty Acid - PUFA) hàm lượng acid béo không no mạch đa trong mỡ trứng cũng tăng lên Rose [27]. Theo Creger [32] trong một trứng gà nặng 54g có chứa các acid béo không no là: 2,1g acid béo olêic; 1,2g linoleic; 0,16g linolenic; 0,13g arachidonic và các acid béo no là: 1,3g palmitinic; 0,4g stearic; ngoài ra còn có khoảng 0,2g lipoid khác. Do vậy tổng acid béo lên tới 5,5g. Thông thường tỷ lệ acid béo không no và no là 2:1. 1.3.2. Phân tích trình tự vùng điều khiển (D-loop) ty thể 1.3.2.1. Ty thể - đặc điểm cấu tạo DNA ty thể Ty thể là bào quan có mặt trong tất cả các tế bào hô hấp hiếu khí. Ty thể là trạm chuyển hóa năng lượng từ các phân tử hữu cơ thành dạng năng lượng tích lũy trong phân tử ATP. Ty thể có chứa DNA ty thể nó là một hệ di truyền độc lập với hệ di truyền của nhân tế bào. DNA ty thể (mtDNA) là sợi kép với cấu trúc vòng, có chiều dài khoảng 5µm, chiếm từ 1- 5% DNA của tế bào. Phân tử mtDNA tự tái bản theo kiểu bán bảo toàn nhờ hệ enzyme DNA polymerase có trong chất nền của ty thể và xảy ra ở gian kỳ của chu kỳ phân chia tế bào. Khác với DNA của nhân, mtDNA không liên kết với protein histon, điều này làm cho mtDNA tương tự với DNA của vi khuẩn, mtDNA là một trong các nhân tố quyết định tính di truyền tế bào chất. Các gen nằm trên mtDNA mã hóa cho nhiều protein/enzyme và RNA của ty thể. Ở phần lớn các động vật có xương sống, mtDNA có chiều dài khoảng 16,8 kb. Trên mtDNA, ngoài các gen cấu trúc còn có một vùng không mang Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 9 mã gọi là vùng điều khiển (Displacement loop hay D-loop), trên đó có các promotor của quá trình sao chép và phiên mã của mtDNA. Phân tử mtDNA có các đặc điểm đáng chú ý sau: - Tốc độ tiến hóa phân tử của mtDNA nhanh gấp 5-10 lần so với các gen trong nhân. - Phân tử mtDNA là đơn bội, không tái tổ hợp. Các kiểu đơn bội (halotype) khác nhau của mtDNA có thể được sử dụng làm các dấu hiệu chỉ thị trong việc phát hiện sự khác biệt di truyền theo dòng mẹ của các quần thể nuôi nhốt và các quần thể hoang dại. Vùng điều khiển là vùng tiến hóa nhanh nhất của mtDNA, nó tích lũy các đột biến cùng với sự thêm đoạn, mất đoạn với tỷ lệ cao gấp 5-10 lần so với các gen của ty thể. Vì thế, việc xác định trình tự nucleotide đoạn điều khiển mtDNA là công cụ hữu hiệu để đánh giá tính đa dạng di truyền và sự phân nhánh tiến hóa bên trong và giữa các quần thể trong cùng một loài. 1.3.2.2. Đặc điểm cấu tạo hệ gen ty thể gà Toàn bộ 16.775 bp trong genome ty thể của gà Leghorn đã được xác định trình tự, chúng mã hóa cho 13 protein, 2 rRNA và 22 tRNA. Một số gen mã hoá protein hoặc tRNA là các gen nằm gối lên nhau (overlapping genes) [15]. Các protein tạo ra được sử dụng để vận chuyển điện tử và phosphoryl hoá trong ty thể. Các gen mã hóa cho các protein này đều được dịch mã bởi cùng một bộ mã di truyền. Genome ty thể gà có ba đặc điểm riêng, khác lớp thú và lưỡng cư: - Theo chiều 5‟- 3‟ của chuỗi nhẹ từ gen ND5 đến vùng D-loop là các gen cytochrome b, tRNA(Thr), tRNA (Pro), ND6 và tRNA (Glu); trong khi ở các động vật khác, gen cytochrome b lại nằm gần vùng điều khiển hơn. Trật tự này được bảo toàn trong các loài thuộc bộ gà (Galliformes) [24]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 10 - Một điểm khởi đầu sao chép của chuỗi nhẹ tương đương với trình tự nằm giữa hai gen tRNA(Cys) và tRNA (Asn) đều có ở tất cả các động vật có xương sống đã được giải trình tự genome ty thể, riêng ở gà không có đặc điểm này [24]. - COI (cytochrome oxidase I) có mã mở đầu là GTG thay vì ATG. Toàn bộ genome ty thể gà (Gallus gallus) được tổ chức như sơ đồ trong hình 1.1. Hình 1.1. Sơ đồ tổ chức của DNA ty thể Gà Đặc điểm di truyền Di truyền ty thể là di truyền theo dòng mẹ. Trong thực tế, có đến 99% ty thể của tế bào con thừa hưởng từ mẹ do bào quan này nằm trong tế bào chất của tế bào trứng. So với trứng, tinh trùng có một số lượng các ty thể chỉ bằng 0,1% - 1,5%, số lượng này đảm bảo năng lượng giúp tinh trùng vận động trong quá trình thụ tinh. Khi tham gia thụ tinh, ty thể của tinh trùng bị loại bỏ nhờ cơ chế phân giải protein phụ thuộc ubiquitin. Đôi khi cơ chế này diễn ra không hoàn toàn dẫn đến sự có mặt của hai dòng ty thể của cả bố lẫn mẹ trong cơ thể con, hiện tượng này được gọi là dị tế bào chất (heteroplasmy). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 11 DNA ty thể không có intron, trong phân tử không có sự tái tổ hợp. Tốc độ biến đổi của DNA ty thể nhanh hơn nhiều so với DNA trong nhân, có thể là do ty thể thiếu hụt các cơ chế sửa chữa DNA. Tốc độ đột biến cao dẫn đến nhiều biến dị trong ty thể, không chỉ giữa các loài mà còn xảy ra ngay cả trong cùng một loài. Số lượng ty thể có biến đổi về mặt di truyền trong tế bào tùy thuộc không những vào số ty thể nó được thừa hưởng từ mẹ mà còn vào các yếu tố gây đột biến trong môi trường. Những biến dị ở genome ngoài nhân không giống nhau giữa các ty thể trong cùng một tế bào và giữa các tế bào khác nhau. Đây là một trong số các ví dụ cho thấy rằng có rất nhiều biến dị trong mã di truyền của ty thể nhưng không có hại đối với cơ thể mang đột biến. Trong hầu hết các trường hợp, mã di truyền là phổ biến. Tuy thế, vẫn có một số ngoại lệ trong di truyền học ty thể. Dưới đây là một số trường hợp mà người ta đã biết. Bảng 1.1. Sự khác nhau giữa mã di truyền trong nhân và ngoài ty thể Bộ ba Mã của gen nhân Mã của gen ty thể AUA, AUU Ile Met UGA Stop Trp AGA, AGG Arg Stop DNA ty thể và vai trò của vùng D-loop trong vấn đề định loại gà Về mặt cấu trúc, vùng D-loop của gia cầm có thể được chia làm 3 đoạn theo Baker và Marshall (1997), bao gồm các đoạn I, II và III. Trong đó đoạn II là đoạn bảo thủ nhất, có chứa một số đơn vị cấu trúc mà trình tự sắp xếp của chúng không thay đổi ngay cả ở bậc phân loại họ. Thông thường, vùng biến đổi nhiều nhất trong D-loop là đoạn III [20]. Đoạn này bắt đầu với cụm trình tự bảo thủ 1 (Conserved Sequence Block 1- CSB-1). Yếu tố phiên mã Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 12 của ty thể (mtTFA) có thể bám vào trình tự này và chuyển DNA ty thể từ quá trình phiên mã sang quá trình sao chép khi một yếu tố khác kết hợp vào phức hệ mtTFA - CSB - 1. Vùng điều khiển của DNA ty thể có tốc độ tiến hóa nhanh gấp 5-10 lần với các gen ty thể khác. Trình tự nuleotide của vùng D-loop là một công cụ rất hữu hiệu để đánh giá tính đa dạng di truyền và sự phân hóa bên trong loài và giữa các quần thể cùng loài. Chính vì thế mà các gen trong genome ty thể và vùng D-loop đóng một vai trò vô cùng quan trọng trong các nghiên cứu thuộc lĩnh vực phân loại học phân tử. Như vậy, DNA ty thể có thể được coi là một công cụ không thể bỏ qua khi tìm hiểu về mối quan hệ phát sinh chủng loại hay sự tiến hóa của các quần thể. 1.3.2.3. Ý nghĩa của DNA ty thể trong nghiên cứu phân loại ở gà Phân loại học cổ điển trên các đối tượng thuộc bộ gà chủ yếu dựa vào các đặc điểm bộ lông bên ngoài của con trống, đó là những đặc điểm sinh dục thứ cấp. Những đặc điểm này mang một tiềm năng biến đổi nhanh chóng qua các thế hệ nên không được coi là cơ sở chính xác để xác định quan hệ tiến hóa giữa các loài. Chính vì vậy, các nhà nghiên cứu đã tìm đến những đặc điểm có thể bộc lộ mức độ biến đổi phù hợp hơn cho việc phân tích quan hệ tiến hóa và phát sinh chủng loại ở các loài. Khi đó, mtDNA với những ưu điểm nổi bật đã được chọn làm đối tượng để nghiên cứu. 1.3.2.4. Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà trên thế giới Trong hơn 30 năm qua, việc nghiên cứu DNA ty thể đã và đang được phát triển tương đối rộng rãi. Người ta đã tiến hành nhiều công trình nghiên cứu ở mức độ phân tử trên các đối tượng vi sinh vật, côn trùng, cá, chim, thú, các loài thực vật và con người với nhiều mục đích khác nhau. Dưới đây là một vài nghiên cứu cụ thể trên một số loài thuộc bộ Gà (Galliformes): Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 13 Năm 1990, Desjadins và Morais đã công bố toàn bộ trình tự mtDNA của gà nhà (Gallus gallus) với tổng chiều dài 16775bp. Với trình tự này, các nhà khoa học đã có cơ sở để tiến hành nghiên cứu mối quan hệ chủng loại giữa các đối tượng thuộc bộ gà [15]. Năm 1994 - 1995, Fuhimito và cộng sự [23] đã nghiên cứu mối quan hệ chủng loại giữa các loài gà rừng, công, trĩ, chim cun cút... dựa trên các phân tích đoạn điều khiển ty thể. Kết quả phân tích tính đa hình chiều dài các đoạn giới hạn (RFLP) trên vùng điều khiển mtDNA cho phép các tác giả này đưa ra một sơ đồ phân loại giữa các loài trên. Đồng thời họ đã xác định được trình tự của 400bp đầu tiên trên vùng điều khiển mtDNA. Kết quả nhận được đã chỉ ra sự lặp lại của một đoạn khoảng 60bp trên vùng điều khiển mtDNA là điểm đặc trưng của giống Gallus. Randi và cộng sự [16]; Scott [20] phân tích trình tự của một phần đoạn điều khiển ty thể (đoạn D-loop) của 2 loài gà Lôi đặc hữu ở Việt Nam đã chỉ ra sự khác biệt rất ít ở mức độ phân tử giữa 2 giống gà này. Năm 1999, Kimball và cộng sự [18] cũng dựa trên sự phân tích trình tự đầy đủ của gen cytochrom b (1143bp) và đoạn siêu biến 1(350bp) của vùng điều khiển mtDNA để xác định mối quan hệ chủng loại của một số loài trĩ và gà gô. Hai cây phân loại được xây dựng từ hai hệ thống số liệu nhận được trên hai đoạn gen cho thấy sự khác nhau là rất ít. Như vậy chỉ với việc phân tích một đoạn trình tự ngắn trên mtDNA cũng cho kết quả khá phù hợp với kết quả phân tích trên toàn bộ gen cytochromb, điều này cho thấy trình tự vùng điều khiển có đủ cơ sở để phân tích quan hệ chủng loại. - Zhang và đồng tác giả đã giải trình tự 539 nuleotide đầu tiên trong vùng D-loop của 6 chủng gà nhà (Gallus gallus domesticus) Trung Quốc và so sánh dữ liệu này với trình tự DNA của 4 loài khác: Gallus gallus, Gallus sonneratii, Gallus varius, Gallus lafayettei đã được công bố trong Ngân hàng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 14 Gen Quốc tế. Ông đã thiết lập được mối quan hệ nguồn gốc của chúng dựa trên trình tự vùng D-loop. Kết quả cho thấy 4 loài thuộc giống Gallus có rất nhiều điểm khác nhau. G. g. domesticus có mối quan hệ thân thuộc nhất với G. gallus của Thái Lan và các vùng lân cận. Nhóm nghiên cứu đã giả thiết rằng, gà nhà Trung Quốc có thể có nguồn gốc từ loài G. gallus ở các nơi này và hai loài phụ G. g. gallus, G. g. spadiceus có thể thuộc một loài phụ do tính tương đồng cao giữa chúng [22], [30]. - Pereira và cộng sự đã tìm được ít nhất 13 gen giả (pseudogene hay Numt) trong genome của G. gallus với kích thước dao động từ 131 đến 1733 nuleotide. Đây là các đoạn DNA ty thể được tìm thấy trong hệ gen nhân của sinh vật nhân thật. Một số trong chúng có nhiều điểm tương đồng với các đoạn trong ty thể. Do đó, chúng có thể được dùng trong các nghiên cứu mối quan hệ chủng loại và di truyền quần thể sử dụng DNA ty thể làm đối tượng nghiên cứu. Tuy nhiên, người ta vẫn chưa xác định được tần số bắt gặp của Numt cũng như đóng góp của nó đối với genome trong nhân [24]. Komiyama T và đồng tác giả [19] đã tiến hành phân tích trình tự vùng D-Loop trong ty thể từ mẫu của 9 con gà cảnh đuôi dài và 74 con thuộc gà địa phương của Nhật bản đồng thời chọn trình tự DNA của 2 loài gà nhà Lông đỏ (Jungle Fowl) đã được công bố trên ngân hàng gen Quốc tế EMBL/Genbank/DDBJ, làm nhóm ngoại (outgroup). Trên cơ sở đó họ đã lập cây phát sinh và kết quả cho thấy cả 3 chủng Naganakidori có nguồn gốc từ gà chọi Shamo. Các kết quả này đã gợi ý rằng 3 mẫu gà cảnh đuôi dài đều có chung nguồn gốc mặc dù đặc điểm hình thái bên ngoài rất khác nhau. Hơn thế 3 chủng gà đuôi dài đầu tiên đã phân ly từ các con gà chọi Okinawa vốn có nguồn gốc địa lý gần với Nam Trung Quốc và Đông Nam Á hơn so với Honshu/Kyushu Nhật Bản. Điều này dẫn đế giả thiết rằng gà đuôi dài Nhật Bản đầu tiên được đưa đến Nhật Bản là gà chọi các vùng lân cận của vùng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 15 Nam Trung Quốc hoặc Đông Nam Á. Như vậy có thể thấy trình tự nucleotide của vùng D-Loop là một công cụ rất hữu hiệu để đánh giá tính đa dạng di truyền và sự phân hóa bên trong loài và giữa các quần thể địa lý. 1.3.2.5. Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà ở Việt Nam Ở gà Ri và gà Mông đã có một số công trình nghiên cứu được công bố về năng suất phẩm chất, thành phần hóa sinh trứng [5]. Ở Việt Nam các công trình nghiên cứu về gà Sao mới chỉ tập vào các lĩnh vực khả năng sinh trưởng, năng suất, phẩm chất thịt, thành phần hóa sinh thịt, khả năng sinh sản, năng suất trứng... Hiện nay, chưa có công bố nào nghiên cứu về thành phần hóa sinh trứng gà Sao. Cho đến nay ở Việt Nam việc sử dụng phương pháp phân loại phân tử trên đối tượng gà mới chỉ bắt đầu. Năm 1999, Kim Thị Phương Oanh và cộng sự [14] đã tiến hành phân tích vị trí nhận biết của một số enzyme giới hạn trên vùng điều khiển D-loop của 3 loài gà lôi Việt Nam gồm: gà lôi lam đuôi trắng (L. hatinhensis), trĩ bạc (L. nycthemera) và gà lôi hông tía (L. diardi). Từ đó xác định bước đầu được sự khác biệt trên vùng điều khiển mtDNA của 3 loài gà lôi. Tuy nhiên, để có những kết luận chính xác về vấn đề này cần phải xác định trình tự vùng điều khiển của 3 dòng gà lôi nói trên. Năm 2000 Nguyễn Hải Hà và cộng sự [2] đã tạo dòng phân tử đoạn gen điều khiển DNA ty thể của 2 loài gà lôi đặc hữu Việt Nam trong vector pBluescript KS (-) để chuẩn bị cho việc đọc và so sánh trình tự nucleotide vùng D-Loop. Năm 2006 Địch Thị Kim Hương và cộng sự [3] đã xác định được trình tự vùng D-Loop gồm 1227 nucloetide của 2 mẫu giống gà Ác Tiềm, Lương Phượng, đã phát hiện được 22 vị trí khác biệt về nucloetide giữa hai đại diện. Năm 2007 Lê Đức Long và cộng sự [4] đã giải trình tự và so sánh trình tự nucleotide vùng D-Loop của 3 đại diện gà Mông có nguồn gốc từ Điện Biên, Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 16 Hà Giang và Yên Bái được nuôi tại trại gà Nông lâm Thái Nguyên theo dự án gà sạch. Kết quả nghiên cứu đã xác định được trình tự vùng D-Loop gồm 1227 nucleotide của 3 mẫu gà nghiên cứu và đã xác định được 10 vị trí khác biệt về nucleotide giữa các đại diện của 3 mẫu gà này. Hiện nay TS. Lê Thị Thúy - Viện Chăn Nuôi đang làm chủ nhiệm đề tài cấp nhà nước "Nghiên cứu sự đa dạng di truyền các giống gà nội" trong đó có giống gà Mông và gà Ri. Đến nay, chưa có công bố về trình tự vùng D-loop gà Ri và gà Sao. Trong phạm vi đề tài, chúng tôi tiếp tục so sánh thành phần hóa sinh trứng qua hàm lượng protein, lipit, vật chất khô và xác định trình tự vùng điều khiển D-loop ty thể của ba mẫu giống gà: gà Ri, gà Mông Nghệ An và gà Sao. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 17 Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. VẬT LIỆU Vật liệu nghiên cứu là mẫu trứng, máu của các giống gà: - Gà Ri Hưng Yên (Rhy): Lông vàng, da vàng, chân vàng. - Gà Mông Nghệ An (Mna): Lông trắng, xương đen, thịt đen. - Gà Sao dòng trung (Sdt): Lông xám đen điểm các đốm trắng tròn nhỏ. Các giống gà trên được nuôi thử nghiệm trong trại giống gà của trường ĐHNL Thái Nguyên theo dự án gà sạch. 2.2. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 2.2.1. Hóa chất Petroleum ether, axít sunfuric đậm đặc 98%, NaOH 1N, H3BO3 4%, chỉ thị Tasiro, H2O2 30%, dung dịch H2SO4 0,1N. Dung dịch đệm phốt phat citrate, dung dịch đệm Tris tổng hợp (Tris 0,125M, SDS 2%, ß - rccapthanol) được pha theo tỷ lệ 3:1:1. Dung dịch A Na2CO3 2% trong NaOH, dung dịch B CuSO4 0,5% trong natricitrat 1%, dung dịch C hỗn hợp dung dịch A với B theo tỷ lệ 49:1 chỉ pha trước khi dùng, thuốc thử folin, Ba(OH)2. Proteinase K (20mg/ml); Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol (25:24:1); Chlorofom: Isoamyl alcohol (24:1); Agarose 0,8%; RNase (10mg/ml); Tris-HCl (0,1M; pH7,5); NaOH 1M; H2O khử ion vô trùng; Ethidium Bromide. Bộ hóa chất dùng để tách DNA tổng số của hãng Biosciences, Sigma. Dung dịch đệm PBS (Phosphate Buffer Saline) 10x, NaCl 8g; KCl 0,2g; Na2HPO4 1,44g; KH2PO4 0,24g. Dẫn nước đến 100ml. Dung dịch đệm tách tế bào (Lysis buffer): Tris - HCl (10mM, pH8); EDTA (10mM, pH8); NaCl 0,1M; SDS 2,1%. Dung dịch đệm TAE dùng trong kỹ thuật điện di: Tris base; CH3OOH; EDTA (0,5mM, pH8). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 18 Bộ hóa chất dùng cho PCR ( dNTPs, MgCl2, enzym chịu nhiệt,…). Bộ hóa chất CloneJET TM PCR Cloning của hãng Fermentas Bộ hóa chất BigDye Terminator v 3.1 Cycle Sequencing. Các môi trường nuôi cấy vi sinh vật: LB đặc, LB lỏng, SOC. - Các dung dịch tách chiết DNA plasmid: Dung dịch I (Sol I); Dung dịch II (Sol II); Dung dịch III (Sol III). 2.1.2. Thiết bị Các thiết bị và hóa chất được sử dụng thuộc sở hữu của phòng thí nghiệm hóa sinh - ĐHSP Thái Nguyên, Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen và Phòng Công nghệ ADN Ứng dụng - Viện Công nghệ Sinh học. Bảng 2.1 Các thiết bị sử dụng trong đề tài Tên thiết bị Hãng sản xuất Tủ lạnh sâu - 20ºC, - 84ºC Sanyo, Nhật Bản Máy li tâm Sorvall Máy đo pH Mettler, Anh Lò vi sóng Samsung, Hàn Quốc Cân phân tích Metter Toledo, Thụy Sỹ Pipetman các loại Gilson, Pháp Máy điện di PowerPac 300, Mỹ Máy PCR - PTC100 MJ Research, Mỹ Máy làm khô chân không Speed Vac Sc 110A-Savan, Mỹ Máy chụp ảnh Bio-Rad, Mỹ Máy khuấy trộn OSI, Rotolab Máy xác định trình tự tự động ABI PRISM TM 3100 Genetic Analyser Applied Biosystems, Mỹ Máy Gene Amp PCR System 9700 Applied Biosystems, Mỹ Bể ổn nhiệt Tempette Junior Tech Máy quang phổ; Tủ cấy vô trùng; Bể ổn nhiệt; Nồi khử trùng... Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 19 2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1. Các phƣơng pháp hóa sinh 2.3.1.1. Phương pháp xác định tỷ lệ lòng trắng, tỷ lệ lòng đỏ Sử dụng phương pháp cân bằng cân kỹ thuật có độ chính 10-4, xử lý số liệu trên máy vi tính. 2.3.1.2. Phương pháp xác định hàm lượng nước Cân 3 mẫu trứng (lòng đỏ, lòng trắng, vỏ) của mỗi giống trên cân điện tử rồi cho vào tủ sấy ở 60oC trong 3 - 5 ngày, sau đó lấy mẫu ra cân lại cho tới khi khối lượng không đổi. Hàm lượng nước được tính theo công thức: N = 100t k t P P P % Trong đó: N: Hàm lượng nước (%) Pt: Khối lượng mẫu tươi (g) Pk: Khối lượng mẫu khô (g) 2.3.1.3. Định lượng lipid tổng số Định lượng lipid tổng số theo phương pháp chiết bằng petroleum ether và cân trọng lượng đầu và cuối [13]. Nguyên tắc: Dựa vào tính hoà tan của lipid trong dung môi hữu cơ (ete, benzen, chloroform...) để chiết rút lipid ra khỏi nguyên liệu. Tiến hành: Cân 0,05g mẫu đã sấy khô tuyệt đối nghiền nhỏ cho vào tube, cho 1,5 ml petroleum ether vào ống đã chứa mẫu, lắc đều trên máy Vortex 15 phút. Tiến hành chiết 3 lần. Chiết lần 1: Mẫu cho vào 3 tube đổ dung môi hữu cơ theo mức quy định để vào tủ lạnh nhiệt độ 4oC trong 24 giờ, li tâm 12000 v/p, loại bỏ dịch. Chiết lần 2: Cho petroleum ether vào theo mức quy định, để vào tủ lạnh ở nhiệt độ 4oC trong 12 giờ, li tâm 12000 v/p, loại bỏ dịch. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 20 Chiết lần 3: Cho petroleum ether vào theo mức quy định để vào tủ lạnh độ 4oC trong 8 giờ, li tâm 12000 v/p, loại bỏ dịch. Lấy vài giọt dịch chiết lên lam kính hơ nhẹ cho petroleum ether bay hết, soi lên kính. Nếu thấy lam kính trong suốt chứng tỏ mỡ trong mẫu đã hết. Sấy khô các tube đã chiết ở nhiệt độ 105oC, cân đến khối lượng không đổi. Tính kết quả hàm lượng lipid được tính theo công thức: L = 100 A B A % Trong đó: L: Hàm lượng lipid (%) A: Khối lượng mẫu ban đầu (g) B: Khối lượng mẫu sau khi chiết lipid (g) 2.3.1.4. Định lượng Protein (theo phương pháp Lowry) Nguyên tắc của phương pháp: Dựa vào sự hình thành phức chất đồng và protein (phản ứng Biure). Chất này tác động với thuốc thử folin cho màu đặc trưng cường độ màu tỷ lệ với hàm lượng protein. Phức chất màu xanh da trời có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 750nm. Thuốc thử folin có tác dụng với gốc Tyr, Trp, His trong phân tử protein để tạo nên phức chất màu. Ngoài ra cường độ màu của phức chất có thể tăng lên trong môi trường phản ứng có chứa muối amôn, vòng imidazol, phenol, pirimidin, axit uric, các ion kim loại hoặc các hợp chất chứa nhóm - SH, các axit tự do Tyr, Trp. Hoặc cường độ màu của phức chất có thể bị giảm khi có mặt của etanol, ete ở nồng độ cao hơn 5%; axeton; Ba(OH)2 ở nồng độ hơn 1%, axit Cl3COOH, hay HClO4. Vì vậy để đạt cường độ màu chính xác dung dịch protein với thuốc thử folin phải được tinh sạch. Phương pháp Lowry có độ nhạy tương đối cao, cho phép xác định dung dịch chứa mẫu vài chục g protein. Vì vậy phương pháp này được áp dụng khá phổ biến với các mẫu đã loại bỏ các chất gây tác động tăng hoặc giảm Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 21 cường độ của phức chất với thuốc thử folin. Tuy nhiên phương pháp này không dùng để định lượng các protein không chứa vòng thơm. Cách tiến hành: Chuẩn bị dung dịch C và dịch chiết protein, cho vào mỗi ống nghiệm 2,5ml dung dịch C + 1.5ml H2O + 0,5ml mẫu + 0,5ml folin để 30' đem đo trên máy quang phổ bước sóng 750nm. Ống đối chứng 2,5ml dung dịch C + 1.5ml H2O + 0,5ml folin Sử dụng máy quang phổ để đo mật độ quang, lập đồ thị chuẩn: Pha dung dịch protein 0,02% từ dung dịch gốc albumin tiêu chuẩn 0,1% pha 5 lần được dung dịch albumin có khối lượng 0,2mg/ml. Tính kết quả: Kết quả trên máy quang phổ xác định được khối lượng protein trong 0,25ml dung dịch mẫu thí nghiệm (mg/ml). Từ đó tính hàm lượng protein trong nguyên liệu (%) theo công thức: % protein = %100 g Pa Trong đó: a: số đo trên máy quang phổ P: hệ số pha loãng (200) g: số mg mẫu cần phân tích 2.3.1.5 Phương pháp xử lý số liệu Xử lý số liệu thu được theo phương pháp thông kê sinh học trên máy vi tính bằng chương trình Excel [6] với các thông số: Giá trị trung bình X n X X n 1i i Độ lệch chuẩn X S )30( 1 )30( 1 2 1 2 n n XX S n n XX S n i i X n i i X Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 22 Sai số trung bình X m )30( 1 )30( n n S m n n S m X X X X 2.3.2. Các phƣơng pháp sinh học phân tử 2.3.2.1. Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ máu động vật Nguyên tắc chung Màng tế bào được phá vỡ bằng các chất tẩy mạnh, DNA trong và ngoài nhân được giải phóng cùng với các protein. Sau đó DNA được tinh sạch nhờ proteinase K và phenol trong hỗn hợp phenol:chloroform:isoamylalcohol. Cuối cùng, DNA được tủa bằng cồn 100% và thu lại bằng phương pháp ly tâm. Quy trình kỹ thuật Làm tan máu đông lạnh ở 37- 39oC trong bể ổn nhiệt khoảng 1 giờ, chia máu vào các ống eppendorf 1,5ml với thể tích 500 l/ống, tách chiết DNA tổng số theo phương pháp của Sambrook và Russell [28] các bước như sau: Bước 1: Hoà tan 500 l máu với 500 l PBS vortex và ly tâm ở 6000 v/p, 15 phút, 4ºC, đổ dịch, thu cặn. Bước 2: Thêm 1ml dung dịch đệm tách (buffer lysis) và 10 m proteinase K. Mẫu được ủ ở 65ºC trong 1h, sau đó để ở nhiệt độ phòng, chia vào mỗi ống Epp 500 l dịch. Bước 3: Bổ sung một lượng tương đương Phenol:Chlorofom:Isoamyl alcohol (tỷ lệ 25:24:1), vortex kỹ, sau đó ly tâm ở 12000 v/p, 15 phút, 4ºC. Hút pha trên vào ống mới. Bước 4: Thêm một thể tích tương đương Chloroform:Isoamyl alcohol (24:1), vortex và ly tâm ở 12000 v/p, 15phút, 4ºC. Thu pha trên. Bước 5: Thêm CH3COONa một lượng bằng 1/10 thể tích dung dịch trong ống. Thêm 3 thể tích cồn 100%, để ở tủ lạnh -20º trong 15h (qua đêm). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 23 Bước 6: Ly tâm ở 12000 v/p, 15 phút, 4ºC để thu DNA. Tiếp đó, bổ sung 500 l cồn 70% để rửa, ly tâm ở 12000 v/p, 15 phút, 4ºC, bỏ dịch và thu cặn. Bước 7: Làm khô cặn trong máy sấy, hoà tan cặn trong 50 l H2O, búng nhẹ. 2.3.2.2. Kĩ thuật điện di DNA trên gel agarose Nguyên tắc chung Điện di là kỹ thuật dùng để tách và định lượng axit nucleic với các kích thước và hàm lượng khác nhau. Kĩ thuật này dựa trên một đặc tính cơ bản của axit nucleic là các đại phân tử tích điện âm do sự có mặt của gốc PO4 3- trên bề mặt. Do đó, khi đặt axit nucleic trong điện trường với cường độ dòng và hiệu điện thế thích hợp, chúng sẽ di chuyển dần về phía cực dương. Gel được sử dụng trong kỹ thuật điện di có thể là gel agarose hoặc polyacrylamid. Trong thí nghiệm này, chúng tôi đã dùng gel agrose 0,8 % bởi nồng độ này phù hợp với kích thước trung bình của các đoạn DNA cần phân tích (1 - 20kb). Quy trình kỹ thuật Chuẩn bị gel agarose: Cân 0,8g agarose vào 100ml dung dich đệm TAE. Đun trong lò vi sóng cho đến khi thu được dung dịch trong suốt. Để nguội đến khoảng 50 - 60ºC, đổ dung dịch agarose vào khay đã cài sẵn răng lược. Sau 30 phút gel đông lại thì rút răng lược ra và đặt bản gel vào bể điện di có chứa dung dịch đệm TAE. Tra mẫu DNA: Trộn một lượng mẫu thích hợp (3 l) với đệm tra mẫu (2,5 l), tra vào các giếng trên bản gel. Điện di với dòng điện một chiều có hiệu điện thế 100V, dòng 60 - 80mA trong khoảng 30 phút. Sau khi kết thúc điện di, lấy bản gel ra khỏi khuôn và ngâm vào dung dịch EtBr nồng độ 0,5 l/ ml. Lấy bản gel ra sau 10 -15 phút và rửa trong nước sạch. Quan sát và chụp ảnh trên máy Bio-Rad. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 24 2.3.2. 3. Nhân vùng điều khiển D-loop bằng kỹ thuật PCR Kỹ thuật PCR do Mullis và cộng sự phát minh năm 1998. Từ đó đến nay Kỹ thuật PCR được sử dụng phổ biến trong công nghệ sinh học hiện đại và đã có những đóng góp đáng kể cho những tiến bộ về sinh học phân tử [21]. Nguyên tắc chung Trong kỹ thuật PCR, người ta sử dụng enzym DNA Taq polymerase đã được phân lập từ vi khuẩn Thermus aquaticus để tổng hợp DNA trong môi trường phản ứng có chứa 4 loại deoxynuleotide (dNTPs) cùng các cặp mồi chuyên biệt. Mồi được sử dụng ở đây là các oligonuleotide có khả năng kết cặp với một đầu của DNA khuôn và là nơi bám của DNA polymerase, từ đó mạch tổng hợp được kéo dài. PCR là một quá trình lặp lại, mỗi chu kì gồm có 3 giai đoạn: - Giai đoạn biến tính: DNA khuôn bị biến tính ở nhiệt độ 94 - 95ºC trong khoảng 1 phút để tách phân tử DNA thành hai sợi đơn. Mỗi sợi đơn sau đó sẽ trở thành một sợi khuôn cho mồi bám vào. - Giai đoạn gắn mồi: Ở giai đoạn này, nhiệt độ của hỗn hợp được hạ xuống trong khoảng 30 - 60ºC để cho mồi kết hợp với sợi khuôn. Nhiệt độ và thời gian của bước này thay đổi, phụ thuộc vào trình tự của mồi. - Giai đoạn kéo dài mạch: Sau khi mồi đã kết hợp được với sợi khuôn, nhiệt độ được tăng lên đến 72ºC cho phép quá trình tổng hợp các sợi mới xảy ra. Bước này cần 2 - 5 phút tùy thuộc chiều dài đoạn DNA cần khuếch đại. Sản phẩm cuối cùng của chu kì trước sẽ trở thành nguyên liệu cho chu kỳ tiếp theo. Sau mỗi chu kì, số lượng DNA đích sẽ tăng lên gấp đôi. Sau một thời gian, lượng DNA được tăng lên theo cấp số nhân, nhờ đó người ta có đủ số lượng DNA phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo. Nguyên liệu - DNA khuôn (Template). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 25 - Cặp mồi H1255 - L16725 chuyên biệt. Ở đây, H (Heavy) và L (Light) là ký hiệu chuỗi nặng và chuỗi nhẹ, còn chữ số là vị trí nuleotide đầu 3‟ của primer trong trình tự đầy đủ của mtDNA ở gà [15]. - Bộ hóa chất: dung dịch đệm có chứa NH4 + , dNTPs 10mM, MgCl2 10mM, Taq DNA polymerase của hãng Fermentas. - Nước khử ion vô trùng. Thành phần của phản ứng khuếch đại gen cho một mẫu với tổng thể tích 25 l như trong bảng 2.2. Bảng 2.2. Thành phần phản ứng khuếch đại gen Nước 10,85 l Buffer 2,5 l MgCl2 4 l dNTPs 2,5 l Mồi H1255-F 0,5 l Mồi L16725-R 0,5 l Taq DNA polymerase 0,15 l DNA temp 4 l Tổng thể tích 25 l Chu trình nhiệt 94ºC - 4 phút (94ºC - 1 phút; 50ºC- 1 phút; 72ºC- 1 phút 20 giây) x 30 chu kỳ; 72ºC -10 phút; giữ ở 4ºC. Sau khi kết thúc phản ứng, điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8%. 2.3.2.4. Kĩ thuật tách dòng gen Kĩ thuật tách dòng gen bao gồm 4 bước sau: Phản ứng ghép nối đoạn AND vào vector đầu bằng pJET1/Blunt Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 26 Phản ứng nối ghép được thực hiện theo hướng dẫn sử dụng của bộ hóa chất Gene JETTM PCR Cloning Kit. Vector tách dòng trong bộ Kit này là pJET1/Blunt chỉ ghép nối được với những đoạn DNA có đầu bằng hoặc đã dược làm bằng hóa. Ngoài ra hãng sản xuất đã cung cấp kèm theo enzyme AND blunting có tác dụng làm bằng hóa đầu của đoạn DNA cần ghép nối. Vì vậy, bộ Kit này phù hợp cho việc tách dòng không chỉ những đoạn gen đầu bằng mà cả những đoạn gen đầu dính (sản phẩm cắt enzyme giới hạn, sản phẩm PCR). Hình 2.1. Sơ đồ vector tách dòng pJET1/blunt Các sản phẩm PCR được nhân lên bằng enzyme taq polymerase trước khi tiến hành phản ứng ghép nối gen cần làm bằng hóa đầu 3‟ trong một hỗn hợp phản ứng gồm có 5µl 2X Reaction Buffer; 3µl sản phẩm PCR; 0,5µl H2O; 0,5µl enzyme làm bằng hóa DNA. Sau thời gian phản ứng, DNA blunting được biến tính ở nhiệt độ 70oC trong 5‟. Phản ứng ghép nối gen được tiến hành bằng cách bổ sung vào 0,5µl vector pJET1/Blunt Cloning vector (50ng/µl) và 0,5µl enzyme nối T4 ligase (5u/µl). Hỗn hợp này được để ở nhiệt độ phòng từ 5-30‟ sau đó dùng để biến nạp vào tế bào E. Coli. Biến nạp bằng phương pháp sốc nhiệt Bổ sung 2 l sản phẩm của phản ứng ghép nối vào mỗi ống tế bào khả biến đã được để trong đá khoảng 30 phút sau khi lấy ra từ -80oC, giữ trong đá Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 27 30 phút. Sốc nhiệt ở 42ºC trong 90 giây sau đó chuyển ngay vào đá và giữ trong 5 phút. Bổ sung 300 l SOC, nuôi lắc 200 v/p ở 37ºC trong 1 giờ. Cấy trải các tế bào này trên môi trường LB đặc có bổ sung thêm các thành phần như sau: Amp (50 l/ml) và nuôi ở 37ºC qua đêm. *Thành phần các môi trường nuôi cấy vi sinh vật: - LB lỏng (môi trường Luria- Bertani): Bacto-Trypton 10g/l; cao nấm men 5g/l; NaCl 10g/l; NaOH 2mM. - LB đặc: gồm môi trường LB lỏng có bổ sung Agar - Agar 15g/l. - Môi trường SOC: Trypton 5 %; cao nấm men 0,5 %; NaCl 10mM; KCl 2,5mM; MgCl2 10mM; MgSO4 10mM; Glucose 20mM. Tách DNA plasmid Các khuẩn lạc trắng sau khi biến nạp được cấy chuyển, nuôi lắc với tốc độ 200 v/p trong 2ml môi trường LB lỏng có bổ sung Amp (50 g/ml) ở 37ºC, 15 giờ. Sau đó, lắc đều hỗn hợp nuôi cấy và đổ dịch vào trong ống eppendoft loại 1,5 ml rồi tiến hành thu plasmid theo quy trình kỹ thuật sau: Ly tâm ở 6000 v/p, 6 phút, 4ºC. Bỏ dịch, thấm khô. Bổ sung 150 l sol I, vortex cho tan tủa. Thêm 150 l sol II, đảo nhẹ, và giữ trong đá. Thêm 150 l sol III, đảo nhẹ, giữ trong đá hoặc để trong tủ lạnh 0ºC trong 5'. Ly tâm 12000 vòng, 15 phút, 4ºC. Hút dịch sang ống eppendoft mới. Thêm 1 ml cồn 100%, đảo nhẹ và để lạnh ở -20ºC trong ít nhất là 3 giờ. Ly tâm ở 12000 v/p, 15 phút, 4ºC. Thu cặn, rửa tủa bằng EtOH 70%, ly tâm 12000 v/p trong 5 phút, 4ºC. Làm khô mẫu trong máy hút chân không. Cho 30 l RNAse 10 g/ ml, búng đều và ủ mẫu ở bể ổn nhiệt ở 37ºC trong 1 giờ. Điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%. *Thành phần của các dung dịch tách chiết plasmid: - Dung dịch I (Sol I): Glucose, Tris- HCl (1M, pH8), EDTA (0,5M, pH 8). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 28 - Dung dịch II (Sol II): SDS 10 %, NaOH 0,2M. Pha mới trước khi sử dụng và bảo quản ở nhiệt độ phòng. - Dung dịch III (Sol III): CH3COOK, CH3COOH (giữ ở tủ 4ºC). Kiểm tra DNA plasmid bằng enzym giới hạn Mục đích của bước này là kiểm tra xem đoạn DNA đích có được chèn vào vector hay không. Thành phần của phản ứng cắt bao gồm: Buffer Tango 1 l; enzyme XbaI 0,2 l (10u/ l); DNA plasmid 3 l; H2O 5,6 l (tổng thể tích 10 l). Hỗn hợp này sau đó đem ủ ở 37ºC trong ít nhất 3 giờ. Sau đó sản phẩm được điện di trên gel agarose 0,8%. 2.3.2.5. Phương pháp xác định trình tự DNA Nguyên tắc chung Trình tự vùng D-loop được xác định dựa trên nguyên tắc chung của phương pháp Sanger [3]: tạo ra các đoạn oliogonuleotide hơn kém nhau 1 nuleotide, kết thúc bởi các ddNTP đã được đánh dấu huỳnh quang. Để tạo ra các đoạn kết thúc bằng các loại ddNTP khác nhau, chúng tôi tiến hành PCR sử dụng BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit đã có chứa sẵn các hóa chất cần thiết của phản ứng nhân gen để đọc trình tự như dNTPs, ddNTPs, DNA polymerase… Do đó, chỉ cần bổ sung thêm DNA khuôn (sản phẩm PCR hoặc DNA plasmid tinh sạch) và mồi phù hợp. Phản ứng được thực hiện trong 1 ống vì 4 loại ddNTP đã được đánh dấu bằng các màu khác nhau. Thành phần của phản ứng khuếch đại gen để đọc trình tự bao gồm: Mồi 3,2pM, DNA plasmid 200ng BigDye và nước với tổng thể tích 15 l. Chu trình nhiệt Chu trình nhiệt cho PCR trong máy luân nhiệt GenAmp PCR System 9700 như sau: 94ºC- 1 phút; (96ºC-10 giây; 50ºC- 5 giây; 60ºC- 4 phút) x 25 chu kỳ. Sau đó sản phẩm được giữ ở 4ºC. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 29 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. SO SÁNH THÀNH PHẦN HÓA SINH TRỨNG CỦA 3 GIỐNG GÀ 3.1.1. Tỷ lệ lòng đỏ, lòng trắng, vỏ tƣơi Đây là một chỉ tiêu quan trọng đánh giá chất lượng trứng, trứng nhiều lòng đỏ được nhiều người ưa thích bởi lòng đỏ là nơi tập trung nhiều chất dinh dưỡng, nhiều loại protein, lipit, các vitamin, axit béo no và không no bổ dưỡng, dễ tiêu... Vì vậy, chúng tôi quan tâm nghiên cứu đến chỉ tiêu này, kết quả nghiên cứu được thể hiện ở bảng 3.1. và hình 3.1. Bảng 3.1. Tỷ lệ lòng đỏ, lòng trắng, vỏ tươi (n=30) Trứng gà Tỷ lệ lòng đỏ (%) X X m Tỷ lệ lòng trắng (%) X X m Tỷ lệ lòng đỏ/ lòng trắng Vỏ( %) X X m Ri (Rhy) 32.7 ± 0,66 57.9± 0,81 0.56 9.4± 0,22 Mông (Mna) 34.82 ± 0,53 54.05± 0,77 0.65 11.13± 0,13 Sao (Sdt) 29.67± 0,84 54.5± 0,58 0.55 15.9± 0,26 0 10 20 30 40 50 60 Tỷ lệ lòng đỏ (%) Tỷ lệ lòng trắng (%) Vỏ (%) chỉ tiêu so sánh % Ri (Rhy ) Mông (Mna) Sao (Sdt) Hình 3.1. Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ lòng đỏ, lòng trắng của trứng gà thí nghiệm Theo kết quả bảng 3.1 và hình 3.1 tỷ lệ lòng đỏ ở gà Mông cao nhất, thấp nhất ở gà Ri, tỷ lệ lòng trắng gà Ri cao nhất, tỷ lệ vỏ cao nhất ở gà Sao. Tỷ lệ này khá đồng đều ở các nhóm trứng nghiên cứu, đây đều là những giống gà Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 30 có chất lượng trứng cao được ưa chuộng trên thị trường. 3.1.2. Hàm lƣợng vật chất khô Tỉ lệ giữa hàm lượng nước và vật chất khô trong trứng gà là một chỉ tiêu quan trọng, rất có ý nghĩa trong việc đánh giá chất lượng của trứng gà. Sau khi tiến hành cân, sấy mẫu trứng gà ở 600C trong 3 ngày cho đến khi khối lượng không thay đổi, kết quả được trình bày trong bảng 3.2. và hình 3.2. Bảng 3.2. Hàm lượng vật chất khô trong trứng gà (n = 30) Trứng gà Lòng đỏ X X m Lòng trắng X X m Vỏ X X m Cả quả X X m Ri (Rhy) 47,28± 0,96 13,52± 0,41 9,022± 0,09 50,34± 1,1 Mông (Mna) 50,76± 1,03 14,64± 0,39 9,105± 0,11 52,15± 1,4 Sao (Sdt) 54,09± 1,17 15,98± 0,53 9,519± 0,25 55,09± 1,3 0 1 2 30 40 50 60 lòng đỏ Lòng trắng Vỏ Cả quả Chỉ tiêu so sánh % Ri (Rhy) Mông ( Mna) Sao (Sdt) Hình 3.2. Biểu đồ biểu diễn hàm lượng vật chất khô trứng gà thí nghiệm Hàm lượng nước lòng đỏ, lòng trắng, vỏ và cả quả đều cao nhất ở trứng gà Ri (Rhy): 52,72% ; 86,48% ; 9,78; 49,66 và thấp nhất ở gà Sao (Sdt): 45,91%; 84,02%; 4,81%; 44,91%. Tỷ lệ vật chất khô ở trứng gà Sao là cao nhất và ở trứng gà Ri là thấp nhất. Tỷ lệ nước lòng đỏ và lòng trắng theo nghiên cứu của Lê Viết Ly (2001) [5] ở gà Ri là 47,32%; ± 1,137; 87,925 ± 0,109 và vật chất khô lòng đỏ là 52,616 ± 1,137 và lòng trắng là 12,075 ± 0,109. Còn gà Mông Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 31 ở Trạm Tấu Yên Bái tỷ lệ vật chất khô ở lòng đỏ trứng là 50,56%, ở lòng trắng là 12,41. Ở trứng gà Ác hàm lượng nước lòng đỏ là 49,3% ± 1,9; hàm lượng nước lòng trắng là 88,8% ± 0,4 [9]; Hàm lượng nước ở lòng đỏ trứng nói chung khoảng 49% , hàm lượng nước trong lòng đỏ có thể thay đổi từ 46 -50% tùy thuộc vào thời gian và điều kiện bảo quản. Như vậy kết quả nghiên cứu phù hợp với kết quả của các nghiên cứu trước, hàm lượng nước và vật chất khô là tính trạng số lượng, nó phụ thuộc vào giống, nguồn thức ăn và đặc biệt còn phụ thuộc vào điều kiện bảo quản trứng như phần tổng quan đã đề cập. 3.1.3. Hàm lƣợng lipit tổng số Hàm lượng lipid tổng số cũng là một chỉ tiêu quan trọng để đánh giá chất lượng trứng. Lipid là một trong những chất dự trữ đem lại giá trị năng lượng cao rất cần thiết cho cơ thể sinh vật nói chung và gà nói riêng. Hàm lượng lipit tập trung chủ yếu ở lòng đỏ, lòng trắng hàm lượng lipit không đáng kể. Do đó hàm lượng lipit liên quan chặt chẽ đến tỷ lệ lòng đỏ/lòng trắng. Kết quả đo chỉ tiêu hàm lượng lipid tổng số chiết bằng petroleum ether được trình bày ở bảng 3.3. và hình 3.3. Bảng 3.3. Hàm lượng lipid tổng số trong trứng gà thí nghiệm (n = 10) Trứng gà L.L đỏ (%) X X m L.Ltrắng (%) X X m L. Lđỏ/ L. Ltrắng L tổng số (%) X X m Ri (Rhy) 64± 0,9 11.33± 0,3 5.65 37.67± 0,58 Mông (Mna) 63.33± 0,3 5.33± 0,8 11.88 34.33± 0,3 Sao (Sdt) 64.67± 0,8 6.67± 1.19 9.70 35.67± 0,65 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 32 0 10 20 30 40 50 60 70 L.Lòng đỏ (%) L.Lòng trắng (%) L. Lđỏ/ L. Ltrắng L tổng số (%) Chỉ tiêu so sánh % Ri (Rhy) Mông (Mna) Sao (Sdt) Hình 3.3. Biểu đồ biểu diễn hàm lượng lipid tổng số trong trứng gà thí nghiệm Qua bảng 3.3. và hình 3.3. ta thấy hàm lượng lipid lòng đỏ cao nhất ở gà Sao (Sdt) và thấp nhất ở gà Mông (Mna). Theo tác giả Rôse [27] thì hai phần ba lipit trong lòng đỏ là triglicerit; 30% phospholipit và 5% cholesteron. Hàm lượng mỡ trong trứng ở dạng nhũ hóa và dễ tiêu hóa và có chứa hàm lượng acid béo không no rất cao, hàm lượng khoáng cao, đặc biệt là hàm lượng sắt và phospho.Vì vậy lòng đỏ trứng được nhiều người ưa chuộng, hàm lượng mỡ trong lòng đỏ trứng cũng có thể thay đổi theo khẩu phần ăn. Lipit lòng trắng cao nhất ở gà Ri và thấp nhất ở gà Mông. Như vậy, ta thấy rằng hàm lượng lipid tổng số cao nhất ở trứng gà Ri (37.76%) thấp nhất ở trứng gà Mông Nghệ An (34.33%). Nếu so sánh với kết quả nghiên cứu trên trứng gà công nghiệp của Rôse [27] thì hàm lượng lipit của các giống gà trên cao hơn hẳn. Tỷ lệ lipit lòng đỏ/lòng trắng cao nhất ở gà Mông, thấp nhất ở gà Ri. 3.1.4. Hàm lƣợng protein tổng số Hàm lượng protein là một chỉ tiêu rất quan trọng trong việc đánh giá giá trị dinh dưỡng của trứng gà. Bằng phương pháp Lowry với máy đo quang phổ, chúng tôi đã thu được kết quả hàm lượng protein thô ở trứng gà của các giống nghiên cứu được trình bày ở bảng 3.4. và hình 3.4. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 33 Bảng 3.4. Hàm lượng protein thô trong trứng gà thí nghiệm (n = 10) Trứng gà Pr-Lđỏ (%) X X m Pr-Ltrắng(%) X X m Pr-Lđỏ/ Pr- Ltrắng Pr tổng số %) X X m Ri (Rhy) 18.32± 0,64 12.86± 0,24 1.42 15.59± 0,42 Mông (Mna) 16.31± 0,51 12.94± 0,33 1.26 14.63± 0,39 Sao (Sdt) 20.27± 0,82 14.2± 0,49 1.43 17.24± 0,51 0 5 10 15 20 25 Pr-Lđỏ Pr-Ltrắng (%) Pr-Lđỏ/ Pr- Ltrắng Pr tổng số (%) Chỉ tiêu so sánh % Ri (Rhy) Mông (Mna) Sao (Sdt) Hình 3.4. Biểu đồ biểu diễn hàm lượng protein thô trong trứng gà thí nghiệm Qua bảng 3.4. và hình 3.4. ta thấy hàm lượng protein tổng số cao nhất ở trứng gà Sao (17,24%) và thấp nhất ở trứng gà Mông (14,63%). Đặc biệt hàm lượng protein lòng đỏ rất cao 20,27%. Gà sao là giống gà đẻ trứng tập trung 6 tháng liền từ tháng 3 đến tháng 9 (âm) sau đó người ta thu hoạch thịt gà trưởng thành và nuôi lứa khác nên điều này rất có ý nghĩa kinh tế. Kết quả nghiên cứu trên có thể đưa ra một định hướng về chăn nuôi gà Sao, một giống gà rất có giá trị kinh tế, dễ nuôi. Theo kết quả nghiên cứu trên lòng đỏ của trứng gà Ác [9] có hàm lượng protein là 17,6% ± 0,5 thì hàm lượng protein lòng đỏ của trứng gà ri cao hơn. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của các tác giả khác [33]. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với kết quả nghiên cứu trên gà Mông nuôi tại Trạm Tấu Yên Bái tỷ lệ protein lòng đỏ là 16.66%, lòng trắng 11,01%. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 34 3.2. ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA BA MẪU GIỐNG GÀ Để tìm hiểu sự khác biệt ở mức độ phân tử giữa các cá thể thuộc ba giống gà Ri, Mông, Sao chúng tôi tiến hành tách chiết DNA tổng số của chúng, dùng kỹ thuật PCR để nhân đoạn điều khiển trong ty thể, tách dòng nhằm xác định trình tự của vùng D-loop. So sánh các trình tự này để tìm ra sự khác biệt giữa chúng. 3.2.1. Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ máu gà Hầu hết các nghiên cứu về sinh học phân tử đều bắt đầu từ việc thu nhận và tinh sạch một lượng axit nucleic đủ lớn và ở trạng thái tương đối nguyên vẹn cho các thí nghiệm tiếp theo. Một trong những mối quan tâm hàng đầu của các kỹ thuật tách chiết DNA là làm thế nào để giảm tối đa sự phân hủy của chúng. Các phân tử DNA có thể bị phân hủy hay đứt gãy do tác nhân cơ học (nghiền, lắc mạnh) hoặc hóa học (bị thủy phân bởi các enzym phân giải thoát ra môi trường khi các màng tế bào bị phá vỡ). Để đạt được hiệu suất và độ tinh sạch cao nhất thì việc lựa chọn một phương pháp tách chiết có nhiều ưu điểm và phù hợp với đối tượng nghiên cứu là rất quan trọng. Vì mẫu sử dụng trong thí nghiệm này là mẫu máu, cho nên chúng tôi đã lựa chọn phương pháp có sử dụng protease K và SDS của Sambrook và Russell để tách chiết DNA [28]. Máu đông được làm tan trong bể ổn nhiệt ở 39ºC trong 1 giờ. Trong điều kiện về nhiệt độ và thời gian như vậy, plasminogen trong huyết tương sẽ được chuyển sang dạng hoạt động là plasmin, chất này phân hủy các protein như fibrin, fibrinopeptit, prothrombin, nhờ đó mà các tế bào được giải phóng. Sau khi rã đông, đem ly tâm dung dịch máu đã được hòa tan trong dung dịch đệm PBS. Dung dịch muối này có tác dụng duy trì pH của máu. Các tế bào thu được đem hòa tan trong dung dịch đệm tách có chứa EDTA và SDS. Sự có mặt của SDS làm cho màng tế bào bị phá vỡ và giải phóng DNA ra ngoài Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 35 môi trường. Thành phần EDTA sẽ liên kết với các ion Mg2+, nhờ vậy mà hoạt động của các nuclease bị ức chế. Như vậy, cả SDS và EDTA đều tham gia bảo vệ DNA khỏi sự phân giải của các nuclease. Ngoài ra, protease K có trong đệm chiết sẽ phân hủy các liên kết peptit trong protein. Hơn thế, pH kiềm của dung dịch đệm chiết làm DNA trở nên ổn định cấu trúc hơn do bản chất tích điện âm của nó; đồng thời làm giảm tương tác tĩnh điện giữa DNA với protein histon. Để loại bỏ protein trong hỗn hợp, mẫu được lắc mạnh với hỗn hợp Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol. Chloroform làm tăng cường hoạt động của phenol trong việc biến tính protein nhưng không làm ảnh hưởng đến cấu trúc của DNA. Đồng thời, nó còn tạo điều kiện thuận lợi cho việc tách pha nước với pha hữu cơ. Isoamyl alcohol có tác dụng làm giảm bọt trong quá trình tách chiết. Sau khi lắc mạnh và đem ly tâm, hỗn hợp được phân làm ba pha: pha trên cùng là pha nước có chứa DNA, pha giữa là protein đã bị biến tính, và pha cuối cùng là hỗn hợp phenol, chloroform và isoamyl alcohol. Pha nước được hút nhẹ nhàng sang ống mới. Dịch chiết này sau đó được xử lý bằng hỗn hợp Chloroform:Isoamyl alcohol nhằm loại bỏ hoàn toàn phenol có lẫn trong dịch chiết và một lần nữa làm sạch DNA. Bước này có thể lặp lại 1-2 lần. Thu tủa bằng cách bổ sung vào dịch chiết 50 l CH3COONa 3M, pH5,2 và 1ml EtOH 100%. EtOH có tác dụng hút lớp nước bao quanh phân tử DNA, để lộ ra các gốc phosphate tích điện âm. Khi đó các ion Na+ sẽ kết hợp với các gốc phosphate này khiến cho lực đẩy giữa các chuỗi nuleotide giảm, do đó DNA bị kết tủa. Trong điều kiện - 20ºC trong 15 giờ thì DNA kết tủa gần như hoàn toàn. Rửa tủa bằng EtOH 70%, làm khô và hòa tan tủa trong nước. Trong dung dịch lúc này có lẫn nhiều RNA, vì thế chúng tôi đã loại RNA bằng RNAse, ủ ở 37ºC trong 2-3 giờ. Hòa tan DNA tinh sạch trong nước khử ion vô trùng và điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 36 Kết quả được thể hiện trên hình 3.5. Hình 3.5. Ảnh kết quả điện di DNA tổng số M: Marker DNA lamda; 1. DNA tổng số của gà Ri; 2. DNA tổng số của gà Mông; 3. DNA tổng số của gà Sao Kết quả điện di cho thấy, cả 3 băng DNA tổng số của mẫu gà Ri, Mông, Sao đều sáng tập trung và tương đối rõ nét, không có những “mảnh vụn” tạo nên vệt sáng kéo dài phía dưới. Hai băng DNA thu được có kích thước tương đương với vạch 21kb của marker DNA lamda Như vậy, có thể sơ bộ đánh giá DNA tổng số thu được đã đạt yêu cầu về nồng độ và độ tinh sạch để dùng cho các thí nghiệm tiếp theo. 3.2.2. Nhân vùng điều khiển D-Loop của DNA ty thể D-loop là vùng không mã hóa duy nhất trên DNA ty thể ở động vật có xương sống. Vùng này có chứa các điểm khởi đầu sao chép và các promoter phiên mã của DNA ty thể. Với đặc trưng tích lũy các đột biến cao gấp 5-10 lần so với các gen khác trong ty thể và so với DNA trong nhân, D-loop trở thành vùng ý nghĩa quan trọng trong nghiên cứu đa dạng sinh học và sự phát sinh chủng loại của sinh vật. Vì thế, để đánh giá tính đa dạng di truyền của các cá thể gà thuộc 3 giống Ri, Mông, Sao, chúng tôi chọn trình tự nuleotide của vùng D-loop như một công cụ để nghiên cứu. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 37 Sử dụng cặp mồi H1255 và L16725 [3] để nhân vùng D-Loop từ mẫu DNA tổng số đã thu được. Các thông tin về cặp mồi này như sau: L16725 (Tm = 60ºC): 5‟-AGGACTACGGCTTGAAAGC-3‟(19 nuleotide) H1255 (Tm = 55ºC): 5‟-CATCTTGGCATCTTCAGTGCC-3‟(21 nuleotide) Cặp mồi H1255 - L16725 được lựa chọn bởi vì đây là cặp mồi “bảo thủ”, nó có thể được dùng cho nhiều loài, giống khác nhau trong bộ Gà (Galliformes) [3]. Khi sử dụng cặp mồi này, chúng tôi dự tính sẽ nhân được đoạn điều khiển có kích thước 1227 bp. PCR là loại phản ứng đòi hỏi sự chính xác về chu trình nhiệt của phản ứng cũng như thành phần và nồng độ các chất tham gia. Chu trình nhiệt của PCR Điều quan trọng nhất là sự lựa chọn và tìm ra nhiệt độ gắn mồi thích hợp. Nhiệt độ gắn mồi phải thấp hơn Tm của các cặp mồi được sử dụng từ 3 - 5ºC để cho mồi có thể bắt cặp tốt với DNA khuôn. Tổng số chu kỳ chúng tôi tiến hành là 30, mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn chính như sau: - Giai đoạn biến tính (Denaturation): Nhiệt độ biến tính thường khoảng 94 - 95 oC để đảm bảo sau khoảng 30 chu kỳ PCR, Taq vẫn giữ được hoạt tính. Thời gian biến tính tuỳ thuộc vào hàm lượng G - C và chiều dài của phân tử DNA. Chúng tôi chọn nhiệt độ biến tính là 94oC trong 1 phút. Trước khi bước vào chu kỳ thứ nhất, nhiệt độ được đặt 95oC trong 3 phút để đảm bảo phân tử DNA được biến tính hoàn toàn. - Giai đoạn gắn mồi (Annealing): Vì Tm nhỏ nhất của cặp mồi trên là 55ºC nên nhiệt độ gắn mồi có thể từ 50 - 52ºC. Chúng tôi đã thử chạy phản ứng ở một số giá trị khác nhau trong khoảng nhiệt độ này và chọn được nhiệt độ gắn mồi tối ưu trong thí nghiệm là 50ºC. - Giai đoạn kéo dài chuỗi (Extension): Nhiệt độ tăng đến 72ºC để cho enzym Taq polymerase hoạt động tốt nhất. Tốc độ tổng hợp của phản ứng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 38 khoảng 1000 nuleotide/phút. Trình tự vùng D-loop quan tâm có kích thước 1227 bp nên thời gian giai đoạn kéo dài chuỗi được lựa chọn là 1 phút 20 giây. Sau khi kết thúc 30 chu kỳ, chúng tôi đặt nhiệt độ lên 72ºC trong 10 phút để đảm bảo sự tổng hợp được kết thúc hoàn toàn. Sản phẩm PCR được giữ ở nhiệt độ 4ºC. Thành phần và nồng độ các chất tham gia Tham gia vào phản ứng này là 7 thành phần thiết yếu, đó là: Taq DNA polymerase, dung dịch đệm, mồi, MgCl2, các dNTP, DNA khuôn và nước. Trong đó có 3 thành phần thường thay đổi trong từng phản ứng là: mồi, MgCl2 và DNA khuôn. - Dung dịch đệm: PCR được thực hiện trong một môi trường đệm phù hợp với hoạt động của enzym có giá trị pH là 7,2. Trong thí nghiệm này, sau khi khảo sát, chúng tôi sử dụng loại đệm có chứa NH4 + của hãng Fermentas, nó phù hợp với hoạt động của enzym Taq polymerase và khoảng biến thiên rộng về nồng độ của MgCl2. Hơn nữa, loại đệm này cho chất lượng sản phẩm tốt hơn so với loại đệm không có chứa NH4 + . - Mồi: là một yếu tố rất quan trọng trong PCR bởi việc điều chỉnh nhiệt độ gắn mồi và nồng độ của mồi có ảnh hưởng lớn đến lượng sản phẩm thu được. Nồng độ mồi xuôi và ngược sử dụng trong thí nghiệm này là 10 pmol/ l. - MgCl2: Vai trò của ion Mg 2+ là tạo phức với dNTP và gắn chúng với enzym, kích hoạt và tăng cường sự kết hợp giữa mồi và khuôn. Nồng độ Mg2+ quá thấp sẽ làm giảm hoạt tính của enzym. Tuy nhiên, nếu nồng độ này quá cao sẽ ức chế hoạt động của enzym. Sau khi khảo sát, chúng tôi thấy nồng độ Mg 2+ là 10mM cho kết quả PCR tốt nhất. - 4 loại dNTP: Nồng độ của mỗi loại dNTP đều phải bằng nhau và phụ thuộc nhiều vào kích thước của đoạn DNA đích, nồng độ của mồi và MgCl2. Nồng độ của các dNTP lớn hơn 4 mM sẽ ức chế phản ứng PCR do ion Mg2+ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 39 bị cô lập, dễ dẫn đến sự nhân lên của các đoạn không cần thiết. Qua thử nghiệm, chúng tôi thấy, nồng độ của các dNTP 1mM là phù hợp. - Thành phần cuối cùng của PCR là DNA khuôn được tinh sạch và ít bị đứt gãy có chứa trình tự đích cần nhân lên. Thông thường, hàm lượng DNA khuôn trong mỗi hỗn hợp phản ứng là 10-100ng/phản ứng. Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8% và bảo quản ở 4ºC. Hình 3.6. Ảnh chụp kết quả điện di sản phẩm PCR M: Marker; 1: Mẫu gà Ri; 2. Mẫu gà Mông; 3. Mẫu gà Sao Theo ảnh chụp kết quả điện di, cả 3 mẫu đều xuất hiện băng DNA nằm ở vị trí giữa vạch 1,5 kb và 1 kb trên thang kích thước chuẩn (marker); kích thước phân tử của sản phẩm PCR vào khoảng 1,3 kb, phù hợp với tính toán theo lý thuyết. Các băng sáng đậm, rõ nét, tập trung chứng tỏ sản phẩm PCR đặc hiệu, chúng tôi đã nhân được vùng D-loop. Sản phẩm PCR đặc hiệu, chương trình đã lựa chọn và nồng độ các chất tham gia phản ứng là phù hợp. Các sản phẩm PCR được trực tiếp sử dụng trong các thí nghiệm tiếp theo. 3.2.3 Tách dòng và xác định trình tự vùng D-Loop của DNA ty thể 3.2.3.1. Tách dòng vùng D-Loop Để tạo điều kiện cho việc xác định trình tự vùng D-loop, chúng tôi tiến hành tách dòng phân tử đoạn này với kích thước 1,3 kb đã nhân được bằng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 40 cặp mồi L16725- H1255. Chúng tôi đã sử dụng vector pJET1/Blunt để tách dòng vùng D-loop. Vector pJET1/Blunt có kích thước khoảng 3,1kb (3128 nucleotide), đây là vector tách dòng thế hệ mới của hãng Fermentas, mới được sử dụng tại các phòng thí nghiệm. Nó có chứa điểm khởi đầu sao chép nên có khả năng sao chép độc lập với các gen của tế bào chủ E.coli. Trên vector có gen kháng chất kháng sinh (bla), nên chỉ có những tế bào nào mang vector này mới có thể sống dược trong môi trường có Amp. Đồng thời, trên vector này còn có chứa gen gây chết Eco47IR, mã hóa cho enzyme nuclease phân hủy DNA nhân khi tồn tại trong tế bào vật chủ. Vì vậy, vector được gắn thêm gen ngoại lai sẽ làm lệch khung đọc của gen Eco47IR khiến enzyme được tổng hợp không còn hoạt tính như trước nữa dẫn đến sự không phân hủy được DNA nhân của tế bào chủ. Nhờ có Eco47IR mà quá trình lựa chọn khuẩn lạc có mang plasmid tái tổ hợp sẽ hiệu quả hơn. Vùng PlacUV5 điều khiển sự biểu hiện của gen Eco47IR một cách đầy đủ mà không cần đến chất cảm ứng IPTG. Thêm vào đó, vùng MCS (Muntiple Cloning Site) của vector có điểm nhận biết của nhiều enzyme cắt hạn chế như Kpn2I, XhoI, XbaI… nhằm phục vụ cho việc cắt kiểm tra sau khi tách dòng. Ngoài ra, vector mang trình tự 2 mồi PJET1 xuôi và ngược nằm về hai phía của điểm gắn sản phẩm PCR cho phép nhân đoạn PCR được gắn vào sau tách dòng với số lượng lớn, phục vụ cho việc giải trình tự gen. Như đã biết việc sử dụng Taq polymerase trong PCR sẽ tạo ra khoảng 70% - 90% sản phẩm PCR có thêm một nucleotide A ở đầu 3‟. Mặt khác, pJET1/Blunt lại là vector tách dòng đầu bằng nên chỉ các sản phẩm PCR dầu bằng hoặc đã được bằng hóa mới thực hiện được phản ứng ghép nối với vector này. Do đó, trước khi thực hiện phản ứng ghép nối,chúng tôi làm bằng hóa đầu 3‟ của sản phẩm PCR. Thành phần của phản ứng làm bằng hóa đầu 3‟ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 41 như sau: 5µl đệm phản ứng 2X; 3µl sản phẩm PCR; 0,5µl H2O; 0,5µl enzyme làm bằng hóa DNA. Sau thời gian phản ứng, DNA blunting được biến tính ở nhiệt độ 70oC trong 5‟. Tiếp theo, chúng tôi tiến hành phản ứng ghép nối sản phẩm PCR đã được làm bằng hóa vào 0,5µl vector pJET1 (50ng/µl) bằng 0,5µl enzyme T4 DNA ligase (5u/µl). Lấy 3µl sản phẩm ghép nối này để biến nạp vào tế bào khả biến E.coli dòng DH5α. Các tế bào khả biến được nuôi cấy trên môi trường LB đặc có bổ sung Amp (50µg/ml) ở 37oC qua đêm. Kết quả chúng tôi thu được rất nhiều khuẩn lạc là các dòng tế bào vi khuẩn có mang plasmid. Để xác định xem các plasmid này có thực sự đã mang đoạn gen đã nhân được bằng kỹ thuật PCR, chúng tôi tách chiết DNA plasmid từ một số khuẩn lạc để kiểm tra. Tách chiết plasmid Các tế bào sau khi nuôi cấy được thu nhận bằng ly tâm ở 6000 v/p, 6 phút, 4ºC. DNA tồn tại trong tế bào vi khuẩn E. coli gồm hai dạng: DNA nhiễm sắc thể có dạng mạch thẳng và DNA plasmid dạng mạch vòng. Để thu nhận và tinh sạch DNA plasmid, chúng tôi tiến hành xử lý tế bào thu được sau khi nuôi cấy bằng các dung dịch I, II, III. Dung dịch I (sol I) có tác dụng rửa sạch tế bào và hòa tan tế bào. SDS trong sol II có tác dụng phá màng và cùng với EDTA trong sol I sẽ gắn chặt với Mg2+ làm ức chế hoạt động của các nuclease, nhờ đó DNA được bảo vệ. DNA nhiễm sắc thể có kích thước lớn, liên kết chặt chẽ với protein tạo ra phức hệ nucleoprotein nên cấu trúc của chúng rất cồng kềnh, ngược lại với DNA plasmid có cấu trúc gọn nhẹ. Chính vì thế, khi DNA plasmid đã được giải phóng ra môi trường thì DNA nhiễm sắc thể hầu như vẫn chưa kịp thoát ra ngoài. CH3COOK và CH3COOH trong sol III có tác dụng làm giảm pH của dung dịch về gần với điểm đẳng điện của DNA và gây biến tính protein; cùng với sự có mặt của EtOH 100% ở nhiệt độ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 42 thấp, DNA plasmid bị kết tủa và dễ dàng được tách ra nhờ ly tâm. Sản phẩm được điện di trên gel agarose 0,8%. Kết quả được trình bày ở hình 3.7. Hỗn hợp DNA plasmid thu được sau khi tách chiết thường tồn tại 3 dạng cấu trúc: Dạng siêu xoắn, dạng vòng mở và dạng mạch thẳng. Dạng thứ nhất có cấu trúc không gian gọn nhẹ nhất, được hình thành do liên kết hidro hoặc liên kết tĩnh điện giữa các phần của phân tử plasmid với nhau. Dạng vòng mở có một mạch đơn bị đứt gãy và dạng còn lại có cả hai mạch đều bị đứt gãy. Khi điện di, dạng nào càng có kích thước gọn nhẹ thì sự di chuyển của chúng càng nhanh, càng xa so với vị trí của giếng tra mẫu. Theo đó, dạng siêu xoắn chạy nhanh nhất, tiếp đó là dạng vòng mở và cuối cùng là dạng mạch thẳng. Hình 3.7. Ảnh điện di một số DNA plasmid trên gel agarose 0,8% ĐC: DNA plasmid đối chứng (không được chèn thêm đoạn DNA) 1- 3: DNA plasmid mẫu Ri (Rhy) 4 - 6: DNA plasmid mẫu Mông (Mna) 7- 9: DNA plasmid mẫu Sao (Sdt) Để tiện lợi cho việc lựa chọn các dòng plasmid được chèn thêm đoạn DNA, khi tiến hành điện di kiểm tra, chúng tôi đã sử dụng một DNA plasmid đối chứng (không được chèn thêm đoạn DNA). Do vậy, dựa vào độ cao thấp của các băng so với băng đối chứng mà ta có thể dự đoán dòng nào đã được chèn thêm đoạn DNA. Kết quả trên hình 3.7 cho thấy: mẫu Rhy, mẫu Mna và Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 43 mẫu Sdt đều có các dòng thứ 2, thứ 4, thứ 7 và thứ 9 (kí hiệu Rhy 2; Mna 4; Sdt 7; Sdt 9) cao hơn dòng đối chứng. Từ đây, có thể dự đoán các dòng này có thể chèn thêm một đoạn DNA ngoại lai. Để khẳng định được các dòng đã chọn có mang đoạn DNA được nhân lên bằng PCR hay không, chúng tôi tiến hành cắt kiểm tra các dòng Rhy 2; Mna 4; Sdt 7; Sdt 9 bằng enzyme hạn chế. Kiểm tra plasmid bằng việc xử lý enzyme hạn chế Để kiểm tra kích thước thực tế của đoạn DNA được nối vào vector, chúng tôi tiến hành phân tích các mẫu DNA plasmid kể trên bằng phương pháp cắt enzyme hạn chế. Vector pJET1/Blunt có chứa điểm nhận biết của enzyme XhoI ở phía bên trái và chứa điểm nhận biết của enzyme XbaI ở phía bên phải của vị trí ghép nối gen. Mặt khác, trình tự vùng D-Loop đã công bố không chứa điểm nhận biết của 2 enzyme này. Do vậy khi phân tích vector tái tổ hợp bằng XhoI và XbaI sẽ thu được các đoạn gen có kích thước gần đúng với kích thước của vector nguyên bản và của đoạn gen đã được ghép nối vào vector. Kết quả phân tích sản phẩm cắt enzyme trên hình 3.8 cho thấy các DNA plasmid tái tổ hợp được cắt thành 2 băng: một băng có kích thước 3,1 kb (tương ứng với kích thước của vector pJET1/Blunt); băng kia có kích thước khoảng 1,3 (tương ứng với kích thước của sản phẩm PCR). Kết quả này chứng tỏ sản phẩm PCR đã được ghép nối thành công vào vector. Những plasmid tái tổ hợp này được tinh sạch để phục vụ cho việc xác định trình tự gen. Kết quả của phản ứng cắt trên hình 3.8 cho thấy: trên 3 đường chạy (4, 5 và 6) xuất hiện hai băng: một băng có kích thước 3,1 kb (bằng kích thước của vector pJET1/Blunt), băng khác có kích thước khoảng 1,3 kb (tương ứng với kích thước của sản phẩm PCR). Đường chạy 2 chỉ có một băng có kích thước 3,1 kb. Như vậy, đã chọn được 3 dòng (1 dòng thuộc mẫu gà Ri (Rhy), 1dòng thuộc mẫu gà Mông (Mna), 1 dòng thuộc mẫu gà Sao (Sdt)) chứa plasmid tái tổ hợp mang đoạn DNA quan tâm. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 44 Những plasmid mang đoạn chèn chứa vùng D-loop này được nhân với số lượng lớn và tinh sạch để phục vụ cho việc giải trình tự nuleotide. Hình 3.8. Kết quả kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng XhoI và XbaI M: Thang DNA chuẩn (DNA λ được cắt bằng EcoRI và Hind III) 1. Plasmit không được cắt DNA 2. Sản phẩm cắt của plasmid không có đoạn chèn DNA 3. Sản phẩm PCR 4; 5; 6. Sản phẩm cắt của dòng Ri (Rhy)2; Mông (Mna) 4; Sao (Sdt) 9 3.2.3.2 Xác định trình tự vùng điều khiển của DNA ty thể Sau khi DNA plasmid được tinh sạch, chúng tôi tiến hành xác định trình tự DNA trên máy đọc trình tự tự động trên cơ sở phương pháp của Sanger Nguyên tắc và cách thức đọc đã được mô tả trong mục 2.3.2.5. Xác định trình tự nucleotide từ 2 chiều của tất cả các đoạn DNA có trong các plasmid tái tổ hợp đã được tạo, sử lý bằng phần mềm ABI PRISM®3100- Avant Data Collection v2.0 và DNA Sequencing Analysis 5.2. Với mỗi chiều đọc ở tất cả các plasmid chúng tôi thu được các đoạn dài khoảng 800 nucleotide. Vì đoạn gen cần xác định trình tự dài khoảng 1,3 kb, trong khi với điều kiện thí nghiệm tốt nhất, máy đọc chỉ xác định được tối đa khoảng 900- 1000 nucleotide. Sử dụng phần mềm Sequencing Analysis 5.2, Seqscape 2.5 để kết hợp số liệu của 2 chiều đọc chúng tôi thu được trình tự hoàn chỉnh của Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 45 vùng D-loop của 2 mẫu nghiên cứu Mna và Rhy với kích thước 1220 bp. Do điều kiện thời gian có hạn, mẫu gà Sao (Std) trình tự có nhiều C, việc đọc trình tự gặp phải khó khăn nên trình tự D-loop của gà Sao chưa đầy đủ. Vì vậy chúng tôi chỉ công bố và so sánh kết quả hai mẫu Mna và Rhy. So sánh các trình tự Mna và Rhy với nhau và với trình tự D-loop của gà gallus gallus gốc Nhật Bản (Mã số AB268515) được công bố trên Ngân hàng trình tự gen quốc tế EMBL (EBI)/GenBank/DDBJ [37], chúng tôi thu được kết quả hình 3.9. 10 20 30 40 50 60 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AB268515 acctaactcccctactaagtgtaccccccctttcccccccagggggggtatactatgcat Mna .............................-.............................. Rhy .............................-.............................. 70 80 90 100 110 120 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AB268515 aatcgtgcatacatttatataccacatatattatggtaccggtaatatatactatatatg Mna ............................................................ Rhy ............................................................ 130 140 150 160 170 180 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AB268515 tactaaacccattatatgtatacgggcattaatctatattccacatttctcccaatgtcc Mna ............................................................ Rhy ............................................................ 190 200 210 220 230 240 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AB268515 attctatgcatgatccaggacacactcattcaccctccccatagacagctccaaaccact Mna .................A....T.........................T..T........ Rhy .................A....T.........................T..T........ 250 260 270 280 290 300 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AB268515 accaagtcacctaactatgaatggttacaggacataaatctcactctcatgttcttcccc Mna .T....C................................................C.... Rhy .T....C................................................C.... Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 46 310 320 330 340 350 360 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AB268515 caacaagtcacctaattatgaatggttacaggacatacatttaactaccatgttctaacc Mna T..............C............................................ Rhy T..............C............................................ 370 380 390 400 410 420 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AB268515 catttggttatgctcgccgtatcagatggatttattgatcgtccacctcacgagagatca Mna ............................................................ Rhy ............................................................ 430 440 450 460 470 480 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AB268515 gcaacccctgcttgtaatgtacttcatgaccagtctcaggcccattctttccccctacac Mna ...........C................................................ Rhy ...........C................................................ 490 500 510 520 530 540 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AB268515 ccctcgccctactt-gccttccaccgtacctctggttcctcggtcaggcacatcccatgc Mna ..............-............................................. Rhy ..............-............................................. 550 560 570 580 590 600 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AB268515 ataactcctgaactttctcactttt-cacgaagtcatctgtggattatcttcccctcttt Mna .........................-.................................. Rhy .........................-.................................. 610 620 630 640 650 660 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AB268515 agtccgtgatcgcggcatcttctctcttctattgctgttggttccttctctttttggggc Mna ............................................................ Rhy ............................................................ 670 680 690 700 710 720 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AB268515 ttcttcacaggttgcccttcacagtgcgggtgcggagtgctattcaagtgaagcctggac Mna ............................................................ Rhy ............................................................ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 47 730 740 750 760 770 780 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AB268515 tacacctgcgttgcgtcctatcctagtcctctcgtgtccctcgatgagacggtttgcgtg Mna ...........................................................A Rhy ............................................................ 790 800 810 820 830 840 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AB268515 tatggggaatcatcttgacactgatgcactttggatcgcatttggttatggttcttccac Mna ............................................................ Rhy ............................................................ 850 860 870 880 890 900 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AB268515 cccccccggtaaatggtgctatttagtgaatgcttgtcggacatatttttatcaattttc Mna ............................................................ Rhy ............................................................ 910 920 930 940 950 960 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AB268515 acttcctctattttcttcacaaaactaggaaattcaccacaattttttctttgttatttt Mna ............................................................ Rhy ............................................................ 970 980 990 1000 1010 1020 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AB268515 ttaattttttttttattttttaaaaacattttttaaaaaactaaattacatacaaactac Mna ............................................................ Rhy ............................................................ 1030 1040 1050 1060 1070 1080 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AB268515 cgcataaaatccctcaaactatacaaacgtttatcgtataatatatatacattattgttt Mna ............................................................ Rhy ............................................................ 1090 1100 1110 1120 1130 1140 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AB268515 attctatcattattagagaaactccactaccaaaaccatcattaaaacaaaaatttacat Mna ............................................................ Rhy ............................................................ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 48 1150 1160 1170 1180 1190 1200 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AB268515 gccacttaactcccctcacaaacaatcgttatttatattgttaattagcaaacacaaaac Mna ............................................................ Rhy ..........................................--................ 1210 1220 ....|....|....|....| AB268515 ctgccttctaccactataaa Mna .CA................. Rhy .................... Hình 3.9. So sánh trình tự D-loop của hai mẫu nghiên cứu Ri (Rhy) và Mông (Mna) với trình tự tham khảo mã số AB268515 So sánh trình tự 2 mẫu Mông Nghệ An (ký hiệu Mna) và Ri Hưng Yên (Rhy) với trình tự chuẩn chúng tôi thấy có 16 điểm đa hình/đột biến (khác biệt nucleotide). Mẫu gà Mna có 14 điểm (chiếm 1,15%) và mẫu gà Rhy có 13 điểm khác biệt với trình tự chuẩn (chiếm 1,1%). Trong 16 điểm khác biệt này cả mẫu gà Mna và Rhy đều mất một nucleotide C ở vị trí số 30 so với trình tự chuẩn. Cả hai dòng thuộc mẫu gà Mông nghệ An và Ri Hưng Yên đều cùng có sự khác biệt nucleotide so với trình tự chuẩn AB268515 đó là các đột biến: Thay thế C bằng T (C T) ở các vị trí 203, 229, 232, 242, 301; Thay thế T bằng C (T C) ở các vị trí 246, 296, 316, 432; Thay thế G thành A (G A) ở vị trí 198. Ngoài ra giữa hai dòng thuộc mẫu gà Mông nghệ An và Ri Hưng Yên còn có sự khác biệt với nhau ở 5 điểm đa hình (chiếm 0,4%) ở các vị trí: Mẫu Mna đột biến thay G A ở vị trí 778; Mẫu Rhy đột biến mất 2 nucleotide A ở vị trí 1181, 1182; Mẫu Mna vị trí 1201 đột biến thay T C và vị trí 1202 đột biến thay G A. Các sai khác giữa các mẫu chủ yếu là đột biến kiểu đồng hoán (81,25%), được thống kê ở bảng 3.5. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 49 Bảng 3.5. Thống kê các điểm đa hình ở 2 mẫu nghiên cứu so với trình tự chuẩn Chúng tôi đã so sánh trình tự vùng D-loop của 2 mẫu nghiên cứu với một số trình tự của các chủng gà đã được công bố WhiteLergo gốc Anh lấy trình tự trong ngân hàng gen mã số AB114078 [37], Lương Phượng, Ác Tiềm gốc Trung Quốc [3] để so sánh mức sai khác về trình tự nucleotide và xác định mối quan hệ di truyền giữa chúng kết quả so sánh bảng 3.6. SST Mẫu Thay đổi nucleotide Vị trí trên ty thể Kiểu biến dị 1 Mna, Rhy del C 30 Mất 1 nucleotide 2 Mna, Rhy G A 198 Đồng hoán 3 Mna, Rhy C T 203 Đồng hoán 4 Mna, Rhy C T 229 Đồng hoán 5 Mna, Rhy C T 232 Đồng hoán 6 Mna, Rhy C T 242 Đồng hoán 7 Mna, Rhy T C 246 Đồng hoán 8 Mna, Rhy T C 296 Đồng hoán 9 Mna, Rhy C T 301 Đồng hoán 10 Mna, Rhy T C 316 Đồng hoán 11 Mna, Rhy T C 432 Đồng hoán 12 Mna G A 778 Đồng hoán 13 Rhy del A 1181 Mất 1 nucleotide 14 Rhy del A 1182 Mất 1 nucleotide 15 Mna C T 1201 Đồng hoán 16 Mna G A 1202 Đồng hoán Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 50 Bảng 3.6. So sánh tỷ lệ sai khác trình tự nucleotide của một số giống gà Hệ số giống nhau AB268515 Mna Rhy Legho Ati LPh AB268515 0.0000 0.9892 0.9917 0.9892 0.9876 0.9967 Mna 0.0108 0.0000 0.9975 0.9892 0.9917 0.9892 Rhy 0.0083 0.0025 0.0000 0.9926 0.9926 0.9901 Legho 0.0108 0.0083 0.0074 0.0000 0.9934 0.9892 Ati 0.0124 0.0083 0.0074 0.0066 0.0000 0.9876 LPh 0.0033 0.0108 0.0099 0.0108 0.0124 0.0000 Hệ số khác nhau Qua bảng 3.6 và so sánh sai khác trên trình tự gen cho thấy sự sai khác trình tự nucleotide giữa gà Mông với gà Lương Phượng [3] là cao nhất 1,08% (13 điểm đa hình), gà Ri với gà Lương Phượng là 12 điểm đa hình chiếm 0,99% và sai khác về trình tự nucleotide giữa gà Mông với gà Ri là thấp nhất 0,25% (5điểm đa hình). Mối quan hệ di truyền giữa các giống gà trên được thể hiện trên hình 3.10 Hình 3.10. Quan hệ di truyền của một số giống gà Kết quả thu được hình 3.10. cho thấy các giống gà trên được chia thành 2 nhánh: nhánh 1 gồm giống Lương Phượng có quan hệ gần nhất với giống gà của Nhật Bản được đăng ký với mã số AB268515, mức độ đồng nhất về thành phần nucleotide giữa chúng rất cao 99,67%. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 51 Nhánh 2 gồm 4 giống gà Mông, Ri, Ác Tiềm và White Lơrgho trong đó gà Ri và gà Mông có quan hệ di truyền gần, mức đồng nhất về thành phần nucleotide đến 99,75% . Ác Tiềm và White Lơrgho có quan hệ di truyền gần mức đồng nhất về thành phần nucleotide đến 99,34%. Nhìn chung sự sai khác thành phần nucleotide giữa các giống gà này không nhiều. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Trên cơ sở bước đầu nghiên cứu thành phần hóa sinh trứng của 3 giống gà Ri, gà Mông, gà Sao và phân tích trình tự đoạn D-Loop của 2 mẫu giống gà gốc Việt Nam gà Ri, gà Mông. Chúng tôi rút ra một số kết luận và đề nghị sau: Kết luận 1. Tỷ lệ lòng đỏ cao nhất ở trứng gà Mông 34.82 % , thấp nhất ở gà Sao 29.67%. Tỷ lệ vật chất khô: trứng gà Sao đạt cao nhất 55,09%; trứng gà Ri thấp nhất 50,34%. 2. Hàm lượng L tổng số và hàm lượng protein tổng số trứng 3 giống gà: Hàm lượng lipid tổng số cao nhất ở gà Ri (37.76%); thấp nhất ở gà Mông Nghệ An (34.33%). Hàm lượng protein tổng số Cao nhất ở trứng gà Sao và thấp nhất ở trứng gà Mông (14,63%). Đặc biệt ở lòng đỏ trứng gà Sao hàm lượng protein và hàm lượng lipit rất cao (20,27%; 64,67%) cho nên trứng gà Sao được đánh giá là có chất lượng tốt nhất trong trứng của 3 giống nghiên cứu. 3. Tách chiết và tinh sạch được DNA tổng số từ mẫu gà thuộc ba mẫu giống gà Ri, gà Mông và gà Sao. Nhân bản thành công vùng D-loop ty thể của ba giống gà này với kích thước khoảng 1,3 kb của 3 mẫu giống gà trên bằng kỹ thuật PCR nhờ cặp mồi H1255 - L16725; tạo dòng phân tử sản phẩm PCR cả 3 mẫu . Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 52 4. Xác định trình tự của vùng D-loop gồm 1220 nucleotide của hai mẫu gà nghiên cứu và phát hiện được 16 điểm đa hình/đột biến về nucleotide giữa các đại diện của hai mẫu giống gà nghiên cứu với trình tự chuẩn. Mối quan hệ di truyền: Gà Ri và Mông có quan hệ di truyền gần; gà Lergho gốc Anh và Ác tiềm gốc Trung Quốc có quan hệ gần; gà Lương Phượng gốc Trung Quốc có quan hệ di truyền gần với giống gà gốc Nhật Bản mã số AB268515. Đề nghị Trong phạm vi nghiên cứu này, với số lượng chỉ lấy từ một cá thể thuộc mỗi giống, chúng tôi chỉ đưa ra được số liệu ban đầu về đặc điểm đa hình vùng D-loop trên ty thể của 2 giống gà Ri và Mông thuộc loài Gallus gallus domesticus. Để có thể đánh giá được toàn diện hơn về ý nghĩa của các vị trí đa hình/đột biến trên vùng D-loop hoặc đưa ra được các kết luận đầy đủ hơn về sự đa dạng DNA giữa hai chủng gà này cần phải tiến hành nghiên cứu và phân tích trên một số lượng mẫu lớn hơn. Tiếp tục nghiên cứu trình tự D-loop của gà Sao, và các giống gà nội, nhập nội để xác định sự đa dạng di truyền cũng như mối quan hệ di truyền giữa các giống gà hiện nay, nhằm cung cấp thông tin cho ngành chọn giống. CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ Bùi Thị Kiều Vân, Nguyễn Trọng Lạng: Nghiên cứu tách vùng điều khiển D-loop ty thể gà Ri, gà Mông và gà Sao. Tạp chí Khoa học và Công nghệ Đại học Thái Nguyên, 2008 tập 2, số 46, trang 67 - 69. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Nguyễn Ân, Nguyễn Viết Ly, Nguyễn Văn Thiện, Nguyễn Khánh Quắc, Trần Xuân Thọ, Hoàng Gián (1974), Di truyền động vật, NXB Nông nghiệp Hà Nội. 2. Nguyễn Hải Hà (2000), Tạo dòng phân tử đoạn gen điều khiển AND ty thể của hai loài gà Lôi đặc hữu Việt Nam, Khóa luận tốt nghiệp ngành công nghệ sinh học, ĐHQG Hà Nội, trường ĐHKHTN. 3. Địch Thị Kim Hương (2006), Phân định một số chủng gà nhà (gallus gallus domesticus)qua AND ty thể, Khóa luận tốt nghiệp, Trường ĐHKH tự nhiên, Hà Nội. 4. Lê Đức Long (2007), Nghiên cứu khả năng sinh trưởng, thành phần hóa sinh thịt và đánh giá sự sai khác di truyền của gà Mông nuôi tại Thái Nguyên, Luận văn thạc sĩ sinh học, trường ĐHSP Thái Nguyên, Thái Nguyên. 5. Lê Viết Ly (2001), "Gà Ri" - Chuyên khảo Bảo tồn nguồn gen vật nuôi ở Việt Nam, tập II Phần gia cầm, NXB Nông Nghiệp Hà Nội Tr 9-11 6. Chu Văn Mẫn (2003), Ứng dụng tin học trong sinh học, NXB ĐHQG Hà Nội. 7. Vũ Quang Ninh (2002), Nghiên cứu một số đặc điểm sinh vật học và khả năng sản suất của giống gà xương đen Thái Hòa Trung Quốc, luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp, trường ĐH Nông Nghiệp I, Hà Nội. 8. Kim Thị Phương Oanh (1999), Ứng dụng các phương pháp sinh học phân tử trong nghiên cứu sự khác biệt di truyền ở một số loài gà lôi Việt Nam, Luận văn Thạc sỹ khoa học sinh học, trường ĐHSPI, ĐHQG Hà Nội, Hà Nội. 9. Trần Thị Mai Phương, (2004), Nghiên cứu khả năng sinh sản, sinh trưởng và phẩm chất thịt của giống gà Ác Việt Nam, Luận án tiến sĩ chuyên ngành chăn nuôi, Viện Chăn Nuôi, Hà Nội. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 54 10. Nguyễn Hoài Tao, Tạ An Bình và ctv (1985), Một số chỉ tiêu về tính năng sản xuất và chất lượng trứng- thịt gà Ri, Tuyển tập công trình nghiên cứu chăn nuôi 1969- 1984, NXB Nông nghệp Hà Nội, tr100 - 107. 11. Nguyễn Văn Thạch (1996), Nghiên cứu khả năng sinh trưởng, cho thịt và sinh sản của gà Ri nuôi bán thâm canh, Luận Văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp, Viện KHKT Nông Nghiệp Việt Nam. 12. Nguyễn Văn Trụ (2000) Nghiên cứu các đặc tính sinh học và tính năng sản xuất của giống gà Mèo nuôi tại các nông hộ tỉnh Cao Bằng, Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp, Đại học Nông Lâm Thái Nguyên. 13. Lê Đức Trình, Nguyễn Hồng Quế, Hoàng Thị Bích Ngọc (1995), Thực tập hóa sinh, NXB Yhọc. 14. Phùng Đức Tiến, Nguyễn Thị Kim Anh (2007), “Đặc điểm sinh học của gà Sao” Tạp chí khoa học kỹ thuật nông nghiệp NXB Nông Nghiệp. tr 4-23 TÀI LIỆU TIẾNG ANH 15. Desjadins P., Morais R. (1990), ”Sequence DNA gene organisation of the chicken mitochondrial genome, A novel gene order in higher vertebrates”, J.Mol.Biol., 212, pp. 599-635. 16. Gilbert, A.B (1971), "The egg, ist physical and biochemical aspects", In:domestic fowl, Bd.3, Academic press, London/newyork,1971. 17. Hillis D. M., Moritz C., Mable B. K.,1996. Molecular Systematics. Sinauer Associates, Inc., Second edition. 18. Kimball R.T., Braun E.L., Zwarrtjes P. W., Crowe T. M. (1999), and ligon J. D. A Molecula phylogeny of the pheasants and partridges suggests that these lineages are not monophyletic. Mol. Phylogenet. Evol., 11(1) tr.38-54 . 19. Komiyama T., Ikeo K., Gojobori T. (2004), “The evolutionary origin of long-crowing chicken: its evolutionary relationship with fighting cocks disclosed by the mtDNA sequence analysis.”, Gene, 333, pp. 91 – 99. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 55 20. Krist L. (2000), Phylogeny DNA phylogeography of European parids, Oulu university, Oulu. 21. McPherson M.J., Quirke P.(1991), Taylor G.R.PCR - A Practical Approach. IRL Press at Oxford University Press. 22. Niu D., Fu Y., Luo J., Ruan H., Yu X. P., Chen G., Zhang Y. P. (2002), “The origin DNA genetic diversity of Chinese native chicken breeds”, Biochem. Gene., 40(5), pp. 163-174. 23. Fumihito A., Miya