Luận văn Khảo sát điều kiện nuôi cấy và sinh bào tử vi khuẩn bacillus subtilis

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC  NGUYỄN DUY KHÁNH KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN NUƠI CẤY VÀ SINH BÀO TỬ VI KHUẨN Bacillus subtilis LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH CƠNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC  KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN NUƠI CẤY VÀ SINH BÀO TỬ VI KHUẨN Bacillus subtilis LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH CƠNG NGHỆ SINH HỌC Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện TS. NGUYỄN NGỌC HẢI NGUYỄN DUY KHÁNH KHĨA: 2002 – 2006 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC FACULTY OF BIOTECHNOLOGY  EXAMINE CULTURE CONDITION AND SPORULATION OF Bacillus subtilis GRADUATION THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY Professor Student Dr.NGUYEN NGOC HAI NGUYEN DUY KHANH TERM: 2002 - 2006 HCMC, 09/2006 i LỜI CẢM ƠN Với tất cả lịng kính trọng, em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu trường Đại học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Mơn Cơng nghệ sinh học, cùng tất cả quý Thầy Cơ đã truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học tại trường. Em xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Ngọc Hải đã hết lịng hướng dẫn dạy dỗ, động viên, quan tâm, ủng hộ em hồn thành khố luận. Em xin chân thành cám ơn TS. Lê Anh Phụng, BSTY. Nguyễn Thị Kim Loan đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình hồn thành khố luận. Em xin chân thành cảm ơn Phịng vi sinh, Khoa Chăn nuơi – Thú Y đã cho phép và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em học tập và nghiên cứu tại phịng. Tơi xin cảm ơn các bạn lớp CNSH 28 đã chia xẻ cùng tơi những vui buồn trong thời gian học cũng như hết lịng hỗ trợ, giúp đỡ tơi trong thời gian thực tập. Sinh viên thực hiện Nguyễn Duy Khánh ii TĨM TẮT NGUYỄN DUY KHÁNH, ĐH Nơng Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 8/2006. “KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN NUƠI CẤY VÀ SINH BÀO TỬ VI KHUẨN Bacillus subtilis”. Hội đồng hướng dẫn: TS. NGUYỄN NGỌC HẢI Việt nam là một nước nơng nghiệp cĩ nghành chăn nuơi rất phát triển và cĩ đĩng gĩp rất lớn vào sự phát triển kinh tế của đất nước. Vì vậy, vấn đề nâng cao năng suất, chất lượng sản phẩm và cải thiện mơi trường chăn nuơi rất được quan tâm ở nước ta hiện nay. Xuất phát từ vấn đề này, chúng tơi tiến hành nghiên cứu khảo sát đặc điểm của vi khuẩn Bacillus subtils, tìm hiểu điều kiện nuơi cấy thích hợp và xử lí bào tử để sản xuất chế phẩm sinh học nhằm cung cấp những thơng tin để chọn lựa những điều kiện nuơi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis thích hợp, từ đĩ sản xuất chế phẩm sinh học cung cấp cho nghành chăn nuơi. Qua quá trình thực hiện đề tài chúng tơi đã cĩ những ghi nhận sau: Khảo sát ảnh hưởng của chế độ nuơi cấy tĩnh và nuơi cấy lắc (15 phút lắc, 45 phút nghỉ) thì chế độ nuơi cấy lắc cho số lượng vi khuẩn cao hơn. Khảo sát ảnh hưởng của 4 loại mơi trường khác nhau (TSB, TSB + 1% glucose, TSB + 1% cao nấm men, TSB + 1% glucose + 1% cao nấm men) thì mơi trường TSB cho số lượng vi khuẩn thấp nhất, 3 mơi trường cịn lại là những mơi trường phù hợp cho Bacillus subtilis phát triển. Khảo sát ảnh hưởng của pH mơi trường (pH 7 và 7,5), thời gian (24,36 và 48 giờ) và nhiệt độ nuơi cấy (nhiệt độ phịng, 37oC) thì ở pH 7, thời gian 48 giờ và nhiệt độ nuơi cấy 37oC cho số lượng vi khuẩn lớn nhất. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ (50, 70), pH (6, 9) và thời gian xử lí (3, 5 và 7 giờ) đến sự hình thành bào tử thì khi xử lí ở các nhiệt độ và pH này cĩ sự ảnh hưởng đến quá trình hình thành bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis. iii MỤC LỤC Trang tựa Lời cảm tạ ........................................................................................................... i Tĩm tắt ............................................................................................................... ii Mục lục ............................................................................................................. iii Danh sách chữ viết tắt ...................................................................................... iv Danh sách các hình ............................................................................................ v Danh sách các bảng .......................................................................................... vi Phần 1. MỞ ĐẦU ............................................................................................. 1 1.1. Đặt vấn đề ......................................................................................... 1 1.2. Mục đích – Yêu cầu ........................................................................... 1 Phần 2. TỔNG QUAN ..................................................................................... 2 2.1. Đại cương về vi khuẩn Bacilus subtilis ........................................... 2 2.1.1. Lịch sử phát triển .................................................................... 2 2.1.2. Đặc điểm phân loại ................................................................. 2 2.1.3. Đặc điểm phân bố ................................................................... 2 2.1.4. Đặc điểm hình thái .................................................................. 2 2.1.5. Đặc điểm nuơi cấy ................................................................... 3 2.1.6. Đặc điểm sinh hố ................................................................... 3 2.1.7. Cấu trúc kháng nguyên ........................................................... 4 2.1.8. Tính chất đối kháng của B. subtilis với một số vi sinh vật gây bệnh ....................................................................................... 4 2.2. Bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis............................................... 5 2.2.1. Khả năng sinh bào tử................................................................ 6 2.2.2. Cấu tạo của bào tử .................................................................... 7 2.2.3. Thành phần hố học của bào tử ................................................ 8 2.2.4. Sự nảy mầm của bào tử ............................................................ 9 2.2.5. Sức đề kháng của bào tử .......................................................... 9 2.3. Hệ vi sinh vật đường ruột và sự loạn khuẩn ................................... 10 2.3.1. Hệ vi sinh vật đường ruột ....................................................... 10 2.3.2. Vai trị của hệ vi sinh vật đường ruột ...................................... 11 iv 2.3.3. Sự loạn khuẩn ......................................................................... 12 2.4. Giới thiệu chung về probiotic ......................................................... 13 2.4.1. Định nghĩa .............................................................................. 13 2.4.2. Chức năng sinh học của probiotic .......................................... 13 2.5. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng chế phẩm chứa vi khuẩn Bacillus subtilis .............................................................. 14 PHẦN 3. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 16 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài ............................................ 16 3.2. Vật liệu thí nghiệm .......................................................................... 16 3.2.1. Giống vi khuẩn ....................................................................... 16 3.2.2. Mơi trường nuơi cấy ............................................................... 16 3.2.3. Hố chất .................................................................................. 16 3.2.4. Thiết bị và dụng cụ .................................................................. 16 3.3. Nội dung nghiên cứu ....................................................................... 17 3.4. Phương pháp thực hiện đề tài ......................................................... 17 3.4.1. Khảo sát đặc điểm sinh học của Bacillus subtilis .................. 17 3.4.2. Các thí nghiệm về Bacillus subtilis ........................................ 17 3.4.2.1. Ảnh hưởng của chế độ nuơi cấy (nuơi cấy tĩnh, nuơi cấy lắc) và thời gian nuơi cấy đến số lượng vi khuẩn ............................. 17 3.4.2.2. Khảo sát mơi trường và thời gian nuơi cấy thích hợp cho vi khuẩn Bacillus subtilis phát triển tạo sinh khối .................... 18 3.4.2.3. Khảo sát pH mơi trường thích hợp cho nuơi cấy vi khuẩn Bacilus subtilis .......................................................... 19 3.4.3. Các thí nghiệm về bào tử Bacillus subtilis ............................. 20 3.4.3.1. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự tạo bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis ........................................................ 20 3.4.3.2. Khảo sát ảnh hưởng của pH đến sự tạo bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis ....................................................... 21 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 22 4.1. Khảo sát đặc điểm sinh học của Bacillus subtilis .................................... 22 4.1.1. Đặc điểm hình thái của Bacillus sutilis .......................................... 22 v 4.1.2. Quan sát đặc điểm khuẩn lạc của Bacillus subtilis ......................... 22 4.1.3. Quan sát dăc điểm nuơi cấy Bacillus subtilis trên mơi trường canh23 4.1.4. Tính chất sinh hố ........................................................................... 23 4.2. Các thí nghiệm về Bacillus subtíils ......................................................... 25 4.2.1. Khảo sát chế độ (nuơi cấy tĩnh, nuơi cấy lắc) và thời gian nuơi cấy thích hợp ................................................................................. 25 4.2.2. Khảo sát mơi trường và thời gian nuơi cấy thích hợp .................... 27 4.2.3. Khảo sát pH mơi trường nuơi cấy vi khuẩn thích hợp .................... 29 4.2.4. Các thí nghiệm về bào tử Bacillus subtilis ..................................... 30 4.2.4.1. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự hình thành bào tử của Bacillus subtilis ......................................................................... 30 4.2.4.2. Khảo sát ảnh hưởng của pH đến sự hình thành bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis .......................................................... 32 Phần 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................. 34 5.1. Kết luận.................................................................................................... 34 5.2. Đề nghị .................................................................................................... 34 Phần 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................. 36 Phần 7. PHỤ LỤC ........................................................................................ 38 vi DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1. Hình thái vi khuẩn Bacillus subtilis .................................................. 3 Hình 2.2. Quá trình tạo bào tử ........................................................................... 6 Hình 2.3. Cấu tạo bào tử Bacillus sutilis ........................................................... 7 Hình 4.1 Tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis dưới kính hiển vi ở độ phĩng đại 1000 lần ..................................................................... 22 Hình 4.2. Đặc điểm khuẩn lạc của Bacillus subtilis trên mơi trường TSA ..... 23 Hình 4.3. Khuẩn lạc Bacillus subtilis trên mơi trường thạch tinh bột ............. 23 Hình 4.4. Phản ứng lên men một số loại đường của vi khuẩn Bacillus subtilis................................................................ 25 vii DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1. Các phản ứng sinh hố của Bacillus subtilis ..................................... 4 Bảng 2.2. Sự khác nhau giữa bào tử và tế bào sinh dưỡng của Bacillus subtilis 8 Bảng 3.1. Bố trí thí nghiệm 1 .......................................................................... 18 Bảng 3.2. Bố trí thí nghiệm 2 .......................................................................... 19 Bảng 3.3. Bố trí thí nghiệm 3 .......................................................................... 20 Bảng 3.4. Bố trí thí nghiệm 4 .......................................................................... 21 Bảng 3.5. Bố trí thí nghiệm 5 .......................................................................... 21 Bảng 4.1. Ảnh hưởng của thời gian và chế độ nuơi cấy đến số lượng vi khuẩn Bacillus subtilis................................................................... 25 Bảng 4.2. Ảnh hưởng của mơi trường và thời gian nuơi cấy đến số lượng vi khuẩn Bacillus subtilis................................................................... 27 Bảng 43. Ảnh hưởng của pH, nhiệt độ và thời gian nuơi cấy đến số lượng vi khuẩn Bacillus subtilis .................................................................... 29 Bảng 4.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự hình thành bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis .................................................................... 30 Bảng 4.6. Ảnh hưởng của pH đến sự hình thành bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis ................................................................................... 32 viii DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 4.1. Ảnh hưởng của chế độ nuơi cấy và thời gian đến số lượng vi khuẩn Bacillus subtilis.............................................................. 26 Biểu đồ 4.2. Ảnh hưởng của thời gian và mơi trường nuơi cấy đến số lượng vi khuẩn Bacillus subtilis............................................................. 28 Biểu đồ 4.3. Ảnh hưởng pH, nhiệt độ, thời gian nuơi cấy đến số lượng vi khuẩn Bacillus subtilis............................................................ 29 Biểu đồ 4.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự hình thành bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis............................................................ 31 Biểu đồ 4.5. Ảnh hưởng của pH đến sự hình thành bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis .......................................................................... 33 1 Phần 1. MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Hiện nay, các loại chế phẩm sinh học từ vi sinh vật đã và đang được sử dụng ngày càng phổ biến. Đặc biệt là các chế phẩm từ vi khuẩn Bacillus subtilis. Nước ta là một nước nơng nghiệp, ngành chăn nuơi rất phát triển. Với mục đích tăng năng suất chất lượng sản phẩm chăn nuơi, bảo vệ sức khoẻ người tiêu dùng, bảo vệ mơi trường sống khơng bị ơ nhiễm bởi các loại hố chất độc hại và đặc biệt là nhằm hạn chế dần việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuơi, chế phẩm sinh học là một giải pháp tối ưu để thực hiện mục đích này. Vì vậy, các nhà chăn nuơi đã rất chú ý đến vấn đề sử dụng chế phẩm sinh học. Chế phẩm sinh học chứa các vi sinh vật sống cĩ lợi, người ta chọn lọc các vi sinh vật cĩ lợi cĩ tính đối kháng cao để đưa vào đường ruột tạo sự cân bằng cĩ lợi cho hệ vi sinh vật đường ruột, khơi phục lại hoạt động bình thường, ức chế vi sinh vật cĩ hại cho vật nuơi. Ngồi ra, chế phẩm sinh học cịn cải thiện lượng thức ăn ăn vào và khả năng tiêu hố, cung cấp chất dinh dưỡng… Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn trên dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Ngọc Hải, chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài “ Khảo sát điều kiện nuơi cấy và sinh bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis”. 1.2. Mục đích – Yêu cầu  Mục đích Tìm hiểu điều kiện: nhiệt độ, thời gian, pH, mơi trường nuơi cấy thích hợp và nhiệt độ, pH xử lý bào tử để ứng dụng sản xuất thử nghiệm chế phẩm sinh học.  Yêu cầu  Khảo sát đặc điểm của Bacillus subtilis: về hình thái khuẩn lạc, tế bào vi khuẩn…  Tìm điều kiện: nhiệt độ, pH, mơi trường và thời gian nuơi cấy thích hợp.  Tìm điều kiên: nhiệt độ, pH xử lý tạo bào tử. 2 Phần 2. TỔNG QUAN 2.1. Đại cƣơng về vi khuẩn Bacillus subtilis 2.1.1. Lịch sử phát triển Bacillus subtilis được phát hiện lần đầu tiên trong phân ngựa (1941) bởi Tổ chức y học Nazi của Đức. Lúc đầu, chủ yếu được sử dụng để phịng bệnh lị cho các bệnh sĩ Đức chiến đấu ở Bắc Phi. Việc sử dụng để điều trị bệnh phải đợi đến những năm 1949 - 1957 khi Henry, Albot và các cộng sự tách được các chủng thuần khiết của Bacillus subtilis. Từ đĩ, “subtilistherapie” cĩ nghĩa là thuốc subtilin ra đời trị các chứng viêm ruột, viêm đại tràng, chống tiêu chảy do rối loạn tiêu hố. Ngày nay, vi khuẩn Bacillus subtilis trở nên phổ biến và được sử dụng rộng rãi trong chăn nuơi, y học, thực phẩm…. 2.1.2. Đặc điểm phân loại Theo khố phân loại của Bergey, vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc Bộ: Eubacteriales Họ: Bacillaceae Giống: Bacillus Lồi: Bacillus subtilis 2.1.3. Đặc điểm phân bố Vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc nhĩm vi sinh vật bắt buộc ở đường ruột, chúng được phân bố hầu hết trong tự nhiên như: cỏ khơ, bụi, đất nước…. Phần lớn chúng tồn tại ở trong đất, thơng thường đất trồng trọt chứa khoảng 10 - 100 triệu CFU/g. Đất nghèo dinh dưỡng ở sa mạc, đất hoang thì Bacillus subtilis rất hiếm. Nước và bùn ở cửa sơng cũng như nước biển cĩ sự tồn tại của bào tử và tế bào sinh dưỡng Bacillus subtilis (Vũ Thị Thứ, 1996). 2.1.4. Đặc điểm hình thái Bacillus subtilis là vi khuẩn nhỏ, hai đầu trịn, G+, kích thước 0,5 - 0,8 µm x 1,8 – 3 µm, đứng thành chuỗi ngắn hoặc đơn lẻ, di động, 8 - 12 lơng. Sinh bào tử nhỏ hơn vi khuẩn và nằm giữa tế bào, kích thước từ 0,8 - 1,8 µm. 3 Phát triển bằng cách nảy mầm do sự nứt bào tử, khơng kháng acid, cĩ khả năng chịu nhiệt, chịu ẩm, tia tử ngoại, tia phĩng xạ…(Tơ Minh Châu, 2000). Hình 2.1. Hình thái vi khuẩn Bacillus subtilis (www.microscopyconsulting.com/ Gallery/pages/Ba..._) 2.1.5. Đặc điểm nuơi cấy Điều kiện phát triển: hiếu khí, nhiệt độ tối ưu 37oC. Nhu cầu O2: Bacillus subtilis là vi khuẩn hiếu khí nhưng cĩ khả năng phát triển trong mơi trường thiếu oxy. Độ pH: Bacillus subtilis thích hợp nhất với pH = 7,0 – 7,4. Mơi trường thạch đĩa TSA: khuẩn lạc cĩ dạng hình trịn, rìa răng cưa khơng đều, cĩ tâm sẩm màu, phát triển chậm, màu vàng xám, đường kính 3 - 5mm. Sau 1- 4 ngày bề mặt nhăn nheo màu hơi sẩm. Mơi trường thạch nghiêng TSA: dễ mọc, tạo thành màu xám, rìa gợn sĩng. Mơi trường canh TSB: Bacillus subtilis phát triển làm đục mơi trường, tạo màng nhăn, lắng cặn kết lại như vẩn mây ở đáy, khĩ tan đều khi lắc lên. Dinh dưỡng cần các nguyên tố C, H, O, N và các nguyên tố khác. 2.1.6. Đặc điểm sinh hố Lên men khơng sinh hơi các loại đường: glucose, maltose, manitol, saccharose, xylose, arabinosse. Indol (-), nitrate (-), VP (+), H2S (-), NH3 (+), catalase (+), amylase (+), casein (+), citrate (+), di động (+), hiếu khí (+). Dung huyết: một số dịng gây dung huyết ở dạng trên thạch máu ngựa và thỏ do tác động của hemolysine. 4 Bảng 2.1. Các phản ứng sinh hố của Bacillus subtilis Phản ứng sinh hố Kết quả Hoạt tính catalase + Sinh Indol - MR + VP + Sử dụng citrate + Khử Nitrate + Tan chảy Gelatin + Di động + Phân giải tinh bột + Arabinose + Xylose + Saccharose + Mannitol + Glucose + Lactose - Maltose + (Theo Holt, 1992) 2.1.7. Cấu trúc kháng nguyên Bacillus subtilis cĩ kháng nguyên H và O, cấu trúc kháng nguyên dạng D và L - acid glutamic. Sản sinh kháng sinh subtilin và bacitracin cĩ tác dụng ức chế vi khuẩn G+ và G-. Bệnh học: đa số chủng Bacillus subtilis khơng gây bệnh. 2.1.8. Tính chất đối kháng của Bacillus subtilis với một số vi sinh vật gây bệnh Do Bacillus subtilis là vi khuẩn bắt buộc đường ruột nên ngồi khả năng chịu đựng được acid dạ dày , các chất dịch tiêu hố trong đường ruột. Chúng cịn cĩ khả năng đấu tranh lại với các vi sinh vật gây bệnh ở đường ruột. 5  Với các vi sinh vật gây bệnh Mơi trường nuơi cấy nấm bệnh cĩ sự hiện diện của Bacillus subtilis với một số lượng lớn sẽ gây ra sự cạnh tranh dinh dưỡng, cạnh trạnh khơng gian sống giữa vi khuẩn và nấm. Do vi khuẩn phát triển nhanh hơn (trong 24h) sẽ sử dụng phần lớn các chất dinh dưỡng trong mơi trường, đồng thời tạo ra kháng sinh subtilin nên sự sinh trưởng của nấm bị ức chế.  Với đồng loại Các chuyên gia tại Đại Học Havard, Mỹ cho biết: khi chất dinh dưỡng bắt đầu cạn kiệt, các vi sinh vật đối phĩ bằng cách chuyển sang tình trạng “ngủ đơng”, hay nghỉ ngơi trong một thời gian dài. Bacillus subtilis thực hiện điều đĩ bằng cách tạo ra bào tử, cĩ thể duy trì trạng thái sống tiềm tàng trong nhiều năm, thậm chí hàng thế kỉ. Tuy nhiên trong thí nghiệm của mình, nhĩm nghiên cứu nhận thấy ở giai đoạn rất sớm của sự hình thành bào tử, một vài tế bào Bacillus đã tạo ra kháng sinh để giết chết những tế bào vi khuẩn ở bên cạnh chưa bắt đầu quá trình này. Chất kháng sinh sẽ phá vỡ màng tế bào vi khuẩn bị tấn cơng, giải phĩng chất dinh dưỡng và được tế bào đang hình thành bào tử tiêu thụ. Theo các nhà nghiên cứu trên, quá trình tạo bào tử tiêu tốn một lượng lớn năng lượng, phải mất vài giờ và khi đã bắt đầu thì khơng thể đảo ngược. Do đĩ, vi khuẩn sẽ cố gắng tránh thời điểm đĩ càng lâu càng tốt. Đặc biệt, khi dinh dưỡng trong mơi trường đã cạn kiệt, vi khuẩn sẽ tiêu diệt những kẻ xung quanh để hút chất dinh dưỡng và kéo dài thời kì chờ đợi này, cho đến khi phải chuyển sang sống tiềm sinh (Nguyễn Thị Cơng Dung, 2004). 2.2. Bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis Bào tử là một hình thức tiềm sinh của vi khuẩn, nĩ giúp cho vi khuẩn vượt qua những điều kiện bất lợi như: mơi trường nghèo dinh dưỡng, nhiệt độ, pH khơng thích hợp, mơi trường tích luỹ nhiều sản phẩm trao đổi chất bất lợi…. Mỗi vi khuẩn chỉ tạo được một bào tử. Khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử sẽ nảy mầm để trở về dạng tế bào sinh dưỡng. 6 2.2.1. Sự hình thành bào tử Một trong những đặc điểm quan trọng của Bacillus subtilis là khả năng tạo bào tử trong những điều kiện nhất định. Bacillus subtilis cĩ khả năng hình thành bào tử trong chu trình phát triển tự nhiên hoặc khi vi khuẩn gặp điều kiện bất lợi (dinh dưỡng trong mơi trường bị kiệt quệ, nhiệt độ…) (Tơ Minh Châu, 2000). Quá trình hình thành bào tử gồm các bước 1. Hình thành vách ngăn. 2. Sự tạo tiền bào tử. 3. Tạo lớp vỏ bào tử. 4. Sự tổng hợp các lớp vỏ bào tử. 5. Sự giải phĩng bào tử. Hình 2.2. Quá trình tạo bào tử www.biol.lu.se/cellorgbiol/ membprot/pop_sv.html Lúc đầu lớp nguyên sinh chất trong tế bào được sử dụng. Tế bào chất và nhân tập trung tại một vị trí nhất định trong tế bào. Tế bào chất tiếp tục cơ đặc và tạo thành tiền bào tử (prospore). Tiền bào tử dần được bao bọc bởi các lớp màng. Tiền bào tử phát triển và trở thành bào tử. Khi bào tử trưởng thành, tế bào sinh dưỡng phân giải và bào tử được giải phĩng ra khỏi tế bào mẹ. Khi gặp điều kiện thuận lợi thì bào tử hút nước và bị trương ra. Sau đĩ vỏ của chúng bị phá huỷ và bào tử nảy mầm phát triển thành tế bào mới. Mỗi tế bào sinh dưỡng chỉ tạo ra một bào tử (Lê Đỗ Mai Phương, 2004). 7 2.2.2.Cấu tạo của bào tử Bào tử là một khối nguyên sinh chất đặc, cĩ chứa các thành phần hố học cơ bản như ở tế bào sinh dưỡng nhưng cĩ một vài điểm khác về tỉ lệ giữa các thành phần và cĩ thêm một số thành phần mới. Phía ngồi của nguyên sinh chất được bao bọc bởi nhiều lớp màng. Hình 2.3. Cấu tạo bào tử Bacillus sutilis www.biol.lu.se/cellorgbiol/ membprot/pop_sv.html Ngồi cùng của bào tử là một lớp màng, rất mỏng nhưng khơng thấm nước, cấu tạo chủ yếu là lipoprotein. Dưới lớp màng là vỏ, vỏ bào tử cĩ nhiều lớp, bề mặt của các lớp này xù xì, thành phần hố học là protein và cĩ sự tham gia của keratin đây là những lớp cĩ khả năng ngăn chặn sự thẩm thấu của nước và các chất hồ tan trong nước, chúng cĩ tác dụng tăng cường khả năng bảo vệ bào tử trước các điều kiện bất lợi. Dưới lớp vỏ là lớp màng trong của bào tử và trong cùng là một khối tế bào chất đồng nhất. Trong các bào tử tự do khơng tồn tại sự trao đổi chất, vì vậy cĩ thể giữ ở trạng thái tiềm sinh trong nhiều năm (Lê Đỗ Mai Phương. 2004). Bào tử khác tế bào sinh dưỡng về cấu trúc, thành phần hố học, tính chất sinh lí. 8 Bảng 2.2. Sự khác nhau giữa bào tử và tế bào sinh dƣỡng của B. subtilis Đặc tính Tế bào sinh dưỡng Bào tử Cấu trúc Tế bào G+, điển hình Vỏ bào tử dày, khĩ thấm nước Thành phần hố học Canxi Thấp Cao Protein Thấp hơn Cao hơn Hoạt tính enzyme Cao Thấp Đặc tính chịu nhiệt Yếu Cao Đặc tính chịu bức xạ Kém Mạnh Đặc tính chịu các chất hố học và acid Yếu Cao Khả năng bắt màu chất nhuộm Dễ nhuộm Phải sử dụng phương pháp đặc biệt 2.2.3. Thành phần hố học của bào tử Các lớp bao và màng của bào tử cĩ cấu tạo cơ bản là protein cĩ chứa nhiều glyxin, tyroxin và đặc biệt là cystein, ngồi ra cịn cĩ sự tham gia của keratin. Nguyên sinh chất của bào tử cĩ chứa nhiễm sắc thể, ribosome và enzyme chuyển hố ở trạng thái khơng hoạt động. Khi bào tử nảy mầm thì những enzyme này bắt đầu hoạt động. Bào tử cĩ chứa một lượng lớn canxi, magie và acid dipicolinic. Acid này chiếm từ 5- 12% khối lượng khơ của bào tử (acid này khơng bao giờ cĩ trong tế bào sinh dưỡng, nĩ được hình thành trong quá trình hình thành bào tử và mất đi khi nảy mầm). Lượng nước trong bào tử rất thấp và tồn tại ở dạng liên kết. 2.2.4. Sự nảy mầm của bào tử (Nguyễn Lân Dũng và các cộng sự, 1998) Quá trình chuyển bào tử từ trạng thái nghỉ sang tế bào sinh dưỡng của vi khuẩn được gọi là quá trình nảy mầm của bào tử. Quá trình này gồm 3 giai đoạn: hoạt hố, nảy mầm và sinh trưởng: 9  Hoạt hố Sau khi cho bào tử Bacillus subtilis tồn tại ở trạng thái nghỉ 7 ngày, ta xử lí ở 60 oC trong 5 phút cĩ thể xúc tiến quá trình nảy mầm. Sau khi xử lí nhiệt, ta chuyển vào mơi trường nuơi cấy thích hợp.. Cĩ một số hố chất đặc biệt cĩ thể xúc tiến quá trình nảy mầm của bào tử. Ví dụ: L-alanine, Mn 2+, chất hoạt động bề mặt, glucose,…. Cũng cĩ những chất lại cĩ tác dụng ức chế quá trình nảy mầm: D-alanine, natri bicarbonate…  Nảy mầm Protein cĩ chứa nhiều cystein trong áo bào tử hố xốp lên làm tăng tính thấm, xúc tiến sự hoạt động của enzyme protease. Khi đĩ lượng protein trong bào tử áo giảm xuống. Các cation bên ngồi co thể xâm nhập vào lớp vỏ bào tử và làm trương lớp vỏ bào tử lên, sau đĩ làm tan ra và tiêu đi. Khi đĩ, nước bên ngồi sẽ xâm nhập vào lớp lõi của bào tử, làm cho lõi trương to lên, các loại enzyme bắt đầu được hoạt hố, bắt đầu quá trình tổng hợp thành tế bào. Trong quá trình nảy mầm các đặc tính chịu nhiệt, tính chiết quang…bắt đầu giảm dần; lượng dipicolinate-canxi, acid amin, polipeptide dần dần mất đi; bắt đầu việc tổng hợp DNA, RNA và protein trong vỏ bào tử. Bào tử chuyển thành tế bào sinh dưỡng. Khi nảy mầm, bào tử cĩ thể đâm ra theo phía cực hoặc đâm ngang. Lúc đĩ thành tế bào cịn rất mỏng và chưa hồn chỉnh, do đĩ nâng cao khả năng tiếp nhận thêm DNA ngoại lai để thực hiện quá trình biến nạp. 2.2.5. Sức đề kháng của bào tử Bào tử cĩ sức đề kháng cao đối với các yếu tố vật lý và hố học như: nhiệt độ, tia cực tím, áp suất và chất sát trùng. Sỡ dĩ bào tử cĩ sức đề kháng cao và sống lâu là do các yếu tố sau:  Nước trong bào tử phần lớn ở trạng thái liên kết, do đĩ khơng cĩ khả năng làm biến tính protein khi tăng nhiệt độ.  Do bào tử cĩ khối lượng lớn ion Ca2+ và acid dipicolinic, protein của bào tử kết hợp với dipicolinate canxi thành một phức chất cĩ tính chất ổn định cao đối với nhiệt độ.  Các enzyme và các hoạt chất sinh học khác chứa trong bào tử đều tồn tại dưới dạng khơng hoạt động, hạn chế sự trao đổi chất của bào tử đối với tế bào bên ngồi. 10  Với cấu trúc cĩ nhiều màng bao bọc và tính ít thẩm thấu của các lớp màng làm cho các chất hố học và chất sát trùng khĩ cĩ thể tác động tới bào tử. 2.3. Hệ vi sinh vật đƣờng ruột và sự loạn khuẩn 2.3.1.Hệ vi sinh vật đƣờng ruột Theo Nguyễn Vĩnh Phước (1987), ở ruột và dạ dày động vật khi mới sinh ra hồn tồn khơng cĩ vi khuẩn, sau vài giờ từ khi chúng sinh ra mới thấy cĩ sự xuất hiện của một vài vi khuẩn và từ đĩ chúng bắt đầu sinh sản dần. Sau đĩ một vài vi khuẩn khác sẽ theo thức ăn, nước uống vào đường tiêu hố, sống và sinh sơi nảy nở ở đĩ, chúng sẽ biến đổi ít nhiều nhưng cơ bản chúng vẫn tồn tại cho đến khi con vật chết. Thành phần, số lượng của vi sinh vật đường tiêu hố phụ thuộc vào tuổi tác của gia súc, cách nuơi dưỡng, chăm sĩc…ngồi ra cịn cĩ các điều kiện vật lí, hố học của mơi trường đường tiêu hĩa. Theo Nguyễn Vĩnh Phước (1970) và nhiều tác giả khác, cĩ thể chia hệ vi sinh vật đường tiêu hố ra làm 2 nhĩm:  Nhĩm vi sinh vật tuỳ nghi Một số những vi sinh vật này là những vi sinh vật cĩ hại, chúng thay đổi theo điều kiện thức ăn, mơi trường, đường tiêu hố, khả năng đề kháng của cơ thể…như: Samonella, Klebsiella, E. coli, Clostridium, Shigella, Staphylococus…. Đa số chúng thích nghi với mơi trường pH trung tính đến kiềm. Dưới những điều kiện mơi trường thích hợp chúng phát triển, sản sinh độc tố xâm nhập phá vỡ tế bào đường ruột, gây tổn thương thành đường ruột nguy hại cho gia súc gia cầm.  Nhĩm vi sinh vật bắt buộc Đây là những vi sinh vật chịu được độ pH thấp, chúng phát triển tốt trong đường ruột của gia súc, gia cầm và định cư vĩnh viễn ở đĩ. Đa số chúng cĩ thể giúp cơ thể động vật tiêu hố thức ăn tốt hơn nhờ vào hệ thống enzyme của chúng và giúp cơ thể phịng chống một số bệnh do vi sinh vật cơ hội gây ra. Nhĩm vi sinh vật bắt buộc gồm cĩ:  Vi khuẩn: Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus, Streptococus lactic (hiện nay gọi là Lactococus lactis), Bacillus subtilis, Bifidobacterium, Cellulosemonas…  Nấm men: Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces bouladii… 11  Nấm mốc: Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Mucor spp…  Protozoa: Entodinium, Diploinium… Ngồi ra, người ta cũng chia hệ vi sinh vật đường ruột ra làm 3 nhĩm dựa vào số lượng của chúng cĩ trong đường ruột như  Nhĩm hệ phổ chính: chiếm tổng số trên 90% số lượng vi sinh vật đường ruột như: Bifidobacterium, Lactobacillus, Bacterioides…  Nhĩm hệ phổ vệ tinh chiếm dưới 10% bao gồm: nấm men, Clostridium, Proteus, Samonella…  Nhĩm tuỳ nghi: chiếm 0,1% gồm: Clostridium, Samonella… (Tơ Minh Châu, 2000) Hai nhĩm vi sinh vật trên luơn ở trạng thái cân bằng động và cũng là điều kiện cần thiết bảo đảm cho sức khoẻ vật chủ. Cũng cĩ thể hai nhĩm vi khuẩn khác nhau tranh chấp cùng một chất dinh dưỡng cĩ khối lượng rất ít trong ống tiêu hố. Vi khuẩn nào đồng hố chất dinh dưỡng này tốt thì sẽ loại trừ vi khuẩn kia. Một số vi khuẩn cĩ thể làm thay đổi một số đặc điểm lí hố của hệ thống tiêu hố như: độ pH, tiềm năng oxy hố khử, nồng độ các chất chuyển hố làm cho một số vi sinh vật khác phát triển hoặc khơng phát triển được (Nguyễn Kiều Uyên Vi, 2004). 2.3.2. Vai trị của hệ vi sinh vật đƣờng ruột Giúp cho quá trình tiêu hố tốt hơn nhờ vào hệ enzyme. Đa số các vi khuẩn cĩ lợi trong đường ruột tham gia vào quá trình tiêu hố, phân giải tinh bột, đường, đạm và chất xơ thành những sản phẩm dễ hấp thu hơn. Nhĩm này gồm những vi sinh vật sinh một số enzyme cĩ khả năng phân huỷ các chất trên: amylase, protease, glucanase, cellulase… gồm các vi khuẩn Lactic, Bacillus subtilis, Isotrichs, Aspergillus oryzae, Aspergillus niger… Theo Nguyễn Thị Vân Hương (1990), bổ sung chế phẩm Saccharomyces boulardii vào khẩu phần gà thịt làm giảm được hệ số chuyển biến thức ăn trên 1 kg tăng trọng, làm tăng sức kháng bệnh của gà làm giảm tỉ lệ chết, từ đĩ gĩp phần làm tăng hiệu quả kinh tế trong chăn nuơi. Đối với thú trưởng thành tiêu hố chủ yếu nhờ enzyme thì sự xuất hiện của vi sinh vật sản sinh enzyme cũng giúp thú tiêu hố thức ăn tốt hơn. So với enzyme tổng 12 hợp, nguồn enzyme của các vi sinh vật tương đối lí tưởng, do cĩ nhiều ưu điểm hơn so với các nguồn từ động vật và thực vật như:  Tốc độ sinh sản của vi sinh vật rất nhanh.  Nguồn nguyên liệu dễ nuơi cấy, dễ kiếm và rẻ tiền.  Các enzyme của vi sinh vật cĩ hoạt tính cao. Ngồi ra, cĩ thể điều khiển các điều kiện tối ưu trong quá trình nuơi cấy để đạt được hiệu quả cao trong sản xuất (Trần Thị Minh Chiến, 2002). 2.3.3. Sự loạn khuẩn Từ loạn khuẩn được Nissle đưa ra vào năm 1916. Ơng cho rằng các vi khuẩn cĩ trong ruột người và gia súc luơn ở thế quân bình để đảm bảo cho sự tiêu hố bình thường của vật chủ. Thế quân bình này dựa vào 2 cơ chế: (1) Cùng tranh giành chất dinh dưỡng nào đĩ cần cho sự sinh trưởng của chúng. (2) Chúng cĩ thể tiết ra chất cĩ tính kháng đối với các vi khuẩn khác.  Các nguyên nhân gây loạn khuẩn: Theo Tơ Minh Châu (2004) thì cĩ 3 nguyên nhân:  Do kháng sinh cĩ phổ rộng lâu ngày làm mất đi sự cân bằng của hệ vi sinh vật đường ruột.  Do yếu tố ngoại cảnh: thức ăn kém phẩm chất, thú bị stress, thay đổi thời tiết, vệ sinh kém…  Do yếu tố sinh lý của thú con: Sức đề kháng của cơ thể cịn yếu…  Cơ chế của hiện tƣợng loạn khuẩn Theo Nguyễn Vĩnh Phước (1977), khi cơ thể khoẻ mạnh, hai nhĩm vi sinh vật bắt buộc và tuỳ nghi luơn ở thế cân bằng cĩ lợi nhờ cơ chế cạnh tranh sinh học. Khi một trong hai hệ này mất cân bằng thì dễ gây ra sự rối loạn hệ vi khuẩn đường ruột. Thơng thường, hệ vi khuẩn tuỳ nghi lấn át hệ vi khuẩn bắt buộc. Dưới tác động của một vài điều kiện bất lợi nào đĩ, làm cho sức đề kháng của cơ thể giảm hoặc do dùng kháng sinh lâu ngày, trúng độc…làm cho hệ vi sinh vật đường ruột bị thay đổi về số lượng, về các dịng vi khuẩn cũng như vị trí cư trú của chúng. Từ đĩ, gây giảm độ tiêu hố, tạo điều kiện cho vi khuẩn gây thối hoạt động, gây ra quá trình thối rửa, phân giải các chất trong ruột sinh ra khí CO2, H2S, CH4… Những 13 chất này sẽ phá huỷ các phản ứng bình thường trong dạ dày, ruột phá hoại quá trình tạo men của thức ăn, gây ra những phản ứng trên ống tiêu hố như: biểu mơ niêm mạc bị phồng lên, rộp ra và trĩc đi tạo điều kiện cho thuận lợi cho sự xâm nhập của những vi khuẩn gây hại. Do đĩ để ổn định hệ vi sinh vật cĩ lợi, đồng thời giúp cho vật nuơi sớm trở lại trạng thái ban đầu thì việc bổ sung chế phẩm vi sinh vật cĩ lợi cho đường ruột là một vấn đề rất thiết thực cần được quan tâm. 2.4. Giới thiệu chung về probiotic 2.4.1. Định nghĩa Thuật ngữ probiotic được đưa ra lần đầu tiên bởi Lilly và Stillwel (1965) để mơ tả những yếu tố kích thích sinh trưởng được sản sinh bởi vi sinh vật. Probiotic được bắt nguồn từ nguồn gốc Hy Lạp với nghĩa “ tiền sự sống” (prolife) Năm 1989, Fuller định nghĩa probiotic như là thức ăn bổ sung vi sinh vật sống cĩ tác động cĩ lợi đến động vật chủ thơng qua cải tiến cân bằng vi sinh vật của nĩ. Năm 1992, Havenar và cộng sự chỉ ra rằng định nghĩa probiotic của Fuller bị hạn chế ở những thức ăn bổ sung cho động vật qua đường ruột. Ơng mở rộng định nghĩa probiotic của Fuller như là một lứa cấy đơn hoặc hỗn hợp các vi sinh vật sống mà chúng cĩ ảnh hưởng cĩ lợi đối với vật chủ bằng cách cải thiện những tính chất của hệ vi sinh vật bản xứ. 2.4.2.Chức năng sinh học của probiotic  Trung hồ độc tố, khử độc và phân huỷ một số thuốc cĩ độc tính cao.  Kích thích hệ thống miễn dịch.  Giúp ổn định hệ vi sinh vật đường ruột  Làm tăng thức ăn ăn vào và làm tăng khả năng tiêu hố nhờ hệ thống enzyme  Tổng hợp vitamine nhĩm B và K ở manh tràng. 2.5. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng chế phẩm chứa vi khuẩn Bacillus subtilis  Trong y học và chăn nuơi Trong kháng chiến chống Pháp Bacillus subtilis được các giáo sư Đặng Đức Trạch, Hồng Thuỷ Nguyên (là các bác sĩ quân y) đã nghiên cứu sản xuất chế phẩm Bacillus subtilis để đưa ra chiến trường nhằm giải quyết dịch tiêu chảy. 14 Năm 1949, tại Pháp đã lưu hành thuốc uống dạng ống chứa vi khuẩn Bacillus subtilis chủng IB 5832, đến năm 1955 cĩ thêm thuốc dạng bột đĩng ống và viên nang. Năm 1962,Guy Albot phát hiện Bacillus subtilis cĩ tác dụng trong điều trị tiêu chảy do lạm dụng kháng sinh và viêm đại tràng mãn, trộn thêm với các vi khuẩn lên men lactic khác chữa loạn khuẩn đường ruột rất hiệu quả. 1958 - 1960 bác sĩ Phạm Ngọc Thạch đã sản xuất đồng loạt chế phẩm Bacillus subtilis dùng trị bệnh đường ruột. Khoa vệ sinh y học bệnh viện Bạch Mai Hà Nội đã nghiên cứu và sản xuất chế phẩm Bacillus subtilis dùng điều trị bệnh tiêu chảy ở người. Viện bào chế Pharimex Tp.HCM, Viện Pasteur Nha Trang đã nghiên cứu sản xuất chế phẩm Bacillus subtilis. 1971, Trần Minh Hùng, Lê Thị Ba, Nguyên Văn Hùng đã nghiên cứu sản xuất chế phẩm Bacillus subtilis dạng viên nuơi cấy trên mơi trường đậu tương, cua đồng…hấp thu bằng tinh bột tan. Chế phẩm này dùng cho heo uống từ 0,5 - 1g/kg thể trọng. Kết quả heo sau khi sử dụng chế phẩm Bacillus subtilis tăng trọng nhanh. 1982 Vũ Văn Ngữ và các cộng sự đã sản xuất thử nghiệm chế phẩm coli_subtly (Escherichia coli và Bacillus subtilis) làm giảm tái phát do bệnh tiêu chảy gây ra ở lợn so với phương pháp điều trị bằng kháng sinh, kết quả heo tăng trọng tốt. Nghiên cứu của Baker, Braude và Kon (1925), Hauser (1957) khi bổ sung kháng sinh liều lượng thấp vào thức ăn thú nhận thấy: acid folic, acid patothenic, vitamin A, vitamin B12 tích tụ trong gan cao. Ngồi ra Bacillus subtilis cịn được phối trộn với một số chủng nấm mốc, nấm men và một số vi khuẩn khác dùng trong chế phẩm EM, probiotic…  Trong nơng nghiệp Chế phẩm Bacillus subtilis được dùng phịng trừ vi sinh vật gây bệnh như nấm Rhizoetonia solani, Fusarium sp, Pyriculariaoryaze… và trong bảo vệ nơng sản sau thu hoạch. Trung tâm sinh học thuộc liên hiệp sản xuất hố chất thuộc bộ cơng nghiệp nặng Tp.HCM, đã nghiên cứu sản xuất chế phẩm Bactophyl từ Bacillus subtilis để phịng trừ các loại nấm gây bệnh trên rau cải. 15 Hồ Thị Mỹ Hồng, Nguyễn Thanh Bình Trung tâm ứng dụng sinh học Hà Nội sản xuất chế phẩm Bacillus subtilis để phịng trừ nấm gây bệnh ở bắp Ostrinia furnacalis. 1940 Norio Kimura Yokohamo đã sử dụng chế phẩm Bacillus subtilis để ngăn chặn sự phát triển và sinh độc tố của chủng nấm mốc Aspergilus flavus, Aspergillus paraciticus. Roman và các cộng sự đã nghiên cứu B. subtilis (ATCC_6633, ATCC_9372) làm giảm đi 40 - 50% aflatoxin trong dịch chứa aflatoxin trong vịng 20 ngày. 16 PHẦN 3. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1.Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài Đề tài được thực hiện tại Phịng Vi sinh – Khoa Chăn nuơi Thú Y - Trường đại học Nơng Lâm Tp.HCM. Thời gian thực hiện: từ 3/2006 đến 7/2006. 3.2. Vật liệu thí nghiệm 3.2.1. Giống vi khuẩn Giống vi khuẩn Bacillus subtilis được cung cấp từ phịng vi sinh khoa Chăn nuơi Thú y trường đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh. 3.2.2. Mơi trƣờng nuơi cấy  Mơi trường giữ giống, đếm số lượng tế bào: TSA (Trypticase Soya Agar).  Mơi trường khảo sát đặc điểm sinh học: TSB (Tripticase Soya Broth), Simmon Citrate, mơi trường lên men các loại đường…  Các mơi trường đều đươc vơ trùng trước khi sử dụng. 3.2.3. Hố chất  Hố chất cơ bản: NaOH 1N, HCl 1%, NaCl,…  Hố chất dùng khảo sát đặc tính sinh học của vi khuẩn: dầu soi, xylen,…  Thuốc thử Kowac’s, Methyl-Red, …  Thuốc nhuộm Gram:  Thuốc nhuộm bào tử. 3.2.4. Thiết bị và dụng cụ  Thiết bị Kính hiển vi, tủ ấm, tủ sấy, nồi hấp autoclave, tủ lạnh, cân điện tử, nồi cách thuỷ, microwave…  Dụng cụ Đĩa petri, ống nghiệm, bình tam giác, lame, đũa thuỷ tinh, pipette, ống Durham, đầu tip vơ trùng… 17 3.3. Nội dung nghiên cứu  Khảo sát đặc điểm của Bacillus subtilis: hình thái khuẩn lạc, tế bào vi khuẩn, tính chất nuơi cấy trên một số mơi trường, thử đặc tính sinh hố.  So sánh phương pháp đếm số lượng vi khuẩn bằng phương pháp đỗ đĩa và phương pháp đếm trên kính hiển vi.  Ảnh hưởng của hình thức và thời gian nuơi cấy đến số lượng tế bào vi khuẩn.  Ảnh hưởng của mơi trường và thời gian nuơi cấy đến số lượng tế bào vi khuẩn. 3.4. Phƣơng pháp thực hiện đề tài 3.4.1.Khảo sát đặc điểm sinh học của Bacillus subtilis  Quan sát đặc điểm hình thái của Bacillus subtilis Vi khuẩn Bacillus subtilis được nuơi trong mơi trường thạch nghiêng TSA . Sau 24 giờ đem nhuộm Gram và xem dưới kính hiển vi ở độ phĩng đại 1000 lần (Xem phương pháp nhuộm Gram ở phần phụ lục).  Quan sát đặc điểm nhĩm của Bacillus subtilis Phân phối 15ml mơi trường TSA đã được hấp tiệt trùng vào đĩa petri vơ trùng rồi để nguội. Hồ vi khuẩn vào nước muối sinh lí đã được hấp tiệt trùng, lấy 10 dịch pha lỗng trang lên mơi trường để tạo khuẩn lạc đơn của vi khuẩn Bacillus subtilis. Sau đĩ, gĩi đĩa petri và ủ ỏ nhiệt độ 37oC trong 24 giờ. Quan sát đặc điểm nuơi cấy của Bacillus subtilis trong mơi trƣờng canh Mơi trường TSB được phân phối 4 - 5 ml vào ống nghiệm vơ trùng, đem hấp tiệt trùng và làm nguội. Cấy giống vi khuẩn vào mơi trường và ủ ở nhiệt độ 37oC trong 24 giờ. Sau đĩ quan sát và xem sự thay đổi của mơi trường nuơi cấy. 3.4.2. Các thí nghiệm về Bacillus subtilis 3.4.2.1. Ảnh hƣởng của chế độ nuơi cấy (nuơi cấy tĩnh, nuơi cấy lắc) và thời gian nuơi cấy đến số lƣợng vi khuẩn  Nguyên tắc Khi nuơi cấy vi sinh vật trong cùng một loại mơi trường nhưng khác nhau về thời gian và chế độ nuơi cấy (Nuơi cấy tĩnh và nuơi cấy lắc) thì cho lượng sinh khối khác nhau.  Mục đích Xác định số lượng vi khuẩn ở thời gian và chế độ nuơi cấy nào là phù hợp. 18 Bảng 3.1. Bố trí thí nghiệm 1 Thời gian Mơi trường Nuơi cấy tĩnh Nuơi cấy lắc 24h 36h 48h  Cách làm Cấy vi khuẩn Bacillus subtilis từ ống giống vào ống nghiệm chứa 4 - 5 ml mơi trường TSB đã được hấp tiệt trùng (121oC/15 phút), đem đi ủ ở 37oC trong 24 giờ. Sau đĩ, cấy vi khuẩn từ ống nghiệm vào bình tam giác chứa 50ml mơi trường TSB với tỉ lệ 2%, nuơi cấy trong 2 chế độ khác nhau: nuơi cấy tĩnh và nuơi cấy lắc (lắc 15 phút, nghỉ 45 phút) ở điều kiện 37oC. Kiểm tra số lượng vi khuẩn sau thời gian 24, 36, 48 giờ bằng phương pháp đếm khuẩn lạc. Từ khảo sát trên chúng tơi chọn được chế độ nuơi cấy vi khuẩn Bacillus subtiis thích hợp để tiếp tục khảo sát thi nghiệm tiếp theo. 3.4.2.2. Khảo sát mơi trƣờng và thời gian nuơi cấy thích hợp cho vi khuẩn Bacillus subtilis phát triển tạo sinh khối  Nguyên tắc Khi nuơi cấy vi khuẩn trong các loại mơi trường khác nhau ở điều kiện nuơi cấy giống nhau (pH, nhiệt độ, thời gian nuơi cấy) thì số lượng vi khuẩn sẽ khác nhau.  Mục đích Xác định mơi trường nuơi cấy nào là thích hợp.  Cách làm Cấy vi khuẩn từ ống giống vào ống nghiệm chứa 4 – 5 ml mơi trường TSB, ủ ở 37 oC trong 24 giờ. 19 Sau đĩ, chuyển vi khuẩn từ ống nghiệm vào 4 loại mơi trường khác nhau: TSB, TSB + 1% glucose, TSB + 1% cao nấm men, TSB + 1% glucose + 1% cao nấm men (với tỉ lệ 2%). Sau đĩ đem nuơi cấy ở chế độ đã được chọn ra từ thí nghiệm 1, đếm số lượng vi khuẩn sau 24, 36, 48 giờ nuơi cấy bằng phương pháp đếm khuẩn lạc. Từ khảo sát trên chúng tơi chọn được loại mơi trường nuơi cấy thích hợp để tiếp tục khảo sát thí nghiệm tiếp theo. Bảng 3.2. Bố trí thí nghiệm 2 Thời gian (giờ) Mơi trường TSB TSB+1%Glucose TSB + 1%Cao nấm men TSB + 1%Glucose + 1%Cao nấm men 24 36 48 3.4.2.3. Khảo sát pH, mơi trƣờng thích hợp nuơi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis  Nguyên tắc Mỗi loại vi khuẩn thích hợp với một độ pH khác nhau, vì vậy khi nuơi cấy vi khuẩn trong cùng một loại mơi trường nhưng ở các độ pH khác nhau thì số lượng vi khuẩn phát triển sau cùng một khoảng thời gian là khác nhau. Bảng 3.3. Bố trí thí nghiệm 4 Thời gian (giờ) pH 7,0 7,5 Nhiệt độ phịng 37oC Nhiệt độ phịng 37oC 24 36 48 20  Mục đích Xác định pH mơi trường nuơi cấy thích hợp.  Cách làm Cấy vi khuẩn từ ống giống vào ống nghiệm chứa 4 -5 ml mơi trường TSB, ủ ở 37 oC trong 24 giờ. Sau đĩ, chuyển vi khuẩn từ ống nghiệm vào mơi trường được chọn từ thí nghiệm 2 ở các pH khác nhau với tỉ lệ 2% và nuơi cấy ở chế độ nuơi cấy (1). Sau 48 giờ đếm số lượng vi khuẩn bằng phương pháp đếm khuẩn lạc. Từ thí nghiệm chúng tơi chọn ra pH mơi trường nuơi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis thích hợp. 3.4.3. Các thí nghiệm về bào tử Bacillus subtilis 3.4.3.1. Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ đến sự tạo bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis  Cách làm Cấy vi khuẩn từ ơng giống vào ống nghiệm chứa 4 – 5 ml mơi trường TSB, ủ ở 37 oC trong 24 giờ. Sau đĩ, chuyển vi khuẩn vào mơi trường đã được chọn từ các thí nghiệm trên. Sau thời gian nuơi cấy thích hợp chúng tơi xử lí nhiệt độ. Xử lí ở 50oC và 70oC, đếm số lượng bào tử hình thành sau 3, 5, 7 giờ xử bằng phương pháp đếm khuẩn lạc (xem phần phụ lục) Bảng 3.4. Bố trí thí nghiệm 4 Thời gian (giờ) Nhiệt độ 50 o C 70 o C 3 5 7 21 3.4.3.2 Khảo sát ảnh hƣởng của pH đến sự tạo bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis  Cách làm Cấy vi khuẩn từ ống giống vào ống nghiệm chứa 4 – 5 ml mơi trường TSB, ủ ở 37 o C trong 24 giờ. Sau đĩ, chuyển vi khuẩn vào mơi trường đã được chọn từ các thí nghiệm trên. Sau thời gian nuơi cấy thích hợp chúng tơi xử lí pH. Đếm số lượng bào tử hình thành sau 3, 5, 7 giờ xử lí bằng phương pháp đếm khuẩn lạc. Bảng 3.5: Bố trí thí nghiệm 5 Thời gian (giờ) pH 6 9 3 5 7 22 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Khảo sát đặc điểm sinh học của Bacillus subtilis 4.1.1. Đặc điểm hình thái của Bacillus sutilis Sau khi tiêu bản vi khuẩn được nhuộm Gram và được quan sát trên kính hiển vi ở độ phĩng đại 1000 lần, chúng tơi nhận thấy vi khuẩn Bacillus subtilis là :  Trực khuẩn bắt màu Gram dương, ngắn và nhỏ.  Kích thước từ 0,5 - 0,8 µm x 1,5 -3 µm, hai đầu trịn, đơi khi nối thành chuỗi dài, cĩ tạo bào tử khơng làm phình tế bào. Hình 4.1. Tế bào vi khuẩn B. subtilis dƣới kính hiển vi ở độ phĩng đại 1000 lần : www.answers.com/ topic/bacillus-1 4.1.2. Quan sát đặc điểm khuẩn lạc của Bacillus subtilis Vi khuẩn được cấy trên mơi trường TSA, sau 24 giờ cho thấy hình dạng của khuẩn lạc: khuẩn lạc khơ, cĩ màu xám nhạt trắng, tạo ra lớp màng mịn, lan trên bề mặt thạch, cĩ mép nhăn, mép lồi lõm, bám chặt vào mơi trường thạch. Hình 4.2. Đặc điểm khuẩn lạc của Bacillus subtilis trên mơi trƣờng TSA 23 4.1.3. Quan sát dăc điểm nuơi cấy Bacillus subtilis trên mơi trƣờng canh Sau khi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis vào mơi trường canh TSB, đem ủ ở 37oC:  Sau 12 giờ thì vi khuẩn làm đục mơi trường.  Nuơi cấy đến 24 giờ thì thấy vi khuẩn tạo váng trển bề mặt của mơi trường và làm cho mơi trường ở phía dưới trong hơn. 4.1.3. Tính chất sinh hố Bảng 4.1. Các phản ứng sinh hố khác của Bacillus subtilis Thử nghiệm Kết quả Hoạt tính catalase + Sinh Indol - MR + VP + Sử dụng citrate + Khử Nitrate + Saccharose + Mannitol + Glucose + Lactose - Maltose + Ghi chú: (-) là kết quả âm tính (+) là kết quả dương tính Qua bảng cho thấy kết quả khảo sát của chúng tơi phù hợp với tính chất sinh hố của Bacillus subtilis (Nguyễn Vĩnh Phước, 1976). Ngồi ra chung tơi cịn khảo sát thấy được rằng Bacillus subtilis cĩ khả năng sử dụng các chất như: glucose, citrate, hợp chất chứa nitrogen và cĩ khả năng di động. Tuy nhiên, Bacillus subtilis lại khơng cĩ enzyme tryptophase để phân giải tryptophan tạo Indol. 24 Hình 4.4. Phản ứng lên men một số loại đƣờng của vi khuẩn Bacillus subtilis  Khả năng phân giải tinh bột Chúng tơi đã tiến hành khảo sát khả năng sử dụng tinh bột bằng cách đo đường kính vịng phân giải trên mơi trường thạch tinh bột (Starch agar) và thu được kết quả đường kính vịng phân giải trung bình là 2,9 cm. Hình 4.3. Khuẩn lạc Bacillus subtilis trên mơi trƣờng thạch tinh bột. 4.2. Các thí nghiệm về Bacillus subtilis 4.2.1. Khảo sát chế độ (nuơi cấy tĩnh, lắc) và thời gian nuơi cấy thích hợp Chúng tơi tiến hành:  Nuơi cấy vi khuẩn trong mơi trường TSB ở hai chế độ nuơi cấy khác nhau: nuơi cấy tĩnh và nuơi cấy lắc (15 phút lắc, 45 phút nghỉ).  Đếm số lượng vi khuẩn ở 3 thời điểm: 24giờ, 36giờ, 48 giờ bằng phương pháp đỗ đĩa (thí nghiệm được lặp lại 2 lần). Kết quả được trình bày ở bảng 4.1. 25 Bảng 4.1. Ảnh hƣởng của thời gian và chế độ nuơi cấy đến số lƣợng vi khuẩn Bacillus subtilis Thời gian (giờ) Chế độ nuơi cấy Nuơi cấy lắc Nuơi cấy tĩnh 12 10,15 8,79 18 11,07 9,92 24 11,16 9,95 X 10,79 9,55 (Số lượng vi khuẩn/ml tính theo logarit) 0 2 4 6 8 10 12 12 18 24 Thời gian (giờ) Số lƣợng vi khuẩn (tính theo logarit) Nuơi cấy lắc Nuơi cấy tĩnh Biểu đồ 4.1 Ảnh hƣởng của chế độ và thời gian nuơi cấy đến số lƣợng vi khuẩn B. subtilis Qua kết quả ở bảng 4.1 cho thấy số lượng vi khuẩn trung bình trong 1 ml canh khuẩn ở chế độ nuơi cấy lắc là 10,79 (giá trị logarit) (số thực tế là 6,17.1010) cao hơn so với số lượng vi khuẩn trung bình ở chế độ nuơi cấy tĩnh 9,55 (giá trị logarit) (số thực tế là 35,48.108). Kết quả xử lí thống kê cho thấy rằng cĩ sự khác biệt về số lượng vi khuẩn giữa hai chế độ nuơi cấy tĩnh và lắc, sự khác biệt này cĩ ý nghĩa về mặt thống kê (với P<0,05). Điều này cĩ nghĩa là khi nuơi cấy lắc thì lượng oxy và chất dinh dưỡng sẽ phân bố đồng đều hơn trong mơi trường giúp cho vi khuẩn phát triển nhanh hơn khi 26 nuơi cấy tĩnh (vì Bacillus subtilis là vi khuẩn hiếu khí nên khi cung cấp nhiều oxy hơn thì chúng sinh sản và phát triển mạnh hơn). Kết quả xử lí thống kê cũng cho thấy rằng cĩ sự khác biệt về số lượng vi khuẩn giữa các khoảng thời gian nuơi cấy (12 giờ, 18 giờ và 24 giờ) (với P<0,05). Qua bảng kết quả, khi nuơi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis sau 24 giờ ở chế độ nuơi cấy lắc thì cho số lượng tế bào vi khuẩn là 11,16 (giá trị logarit) cao hơn ở các mức thời gian 12 giờ, 18 giờ (10,15; 11,07). Vì vậy, chúng tơi quyết định chọn chế độ nuơi cấy lắc để khảo sát số lương vi khuẩn trong các loại mơi trường nuơi cấy khác nhau ở thí nghiệm tiếp theo. 4.2.2. Khảo sát mơi trƣờng và thời gian nuơi cấy thích hợp Từ kết quả của thí nghiệm 1, chúng tơi tiến hành nuơi cấy để xác định số lượng vi khuẩn trên 4 loại mơi trường:  TSB.  TSB + 1% glucose.  TSB + 1% cao nấm men.  TSB + 1% glucose + 1% cao nấm men. Ở điều kiện 37oC, nuơi cấy lắc (15 phút lắc, 45 phút nghỉ) với tỉ lệ giống 2%. Đếm số lượng vi khuẩn bằng phương pháp đỗ đĩa vào các thời điểm: 24 giờ, 36 giờ và 48 giờ (thí nghiệm được lặp lại 2 lần). Kết quả thí nghiệm được trình bày qua Bảng 4.2 và Biểu đồ 4.2. Bảng 4.2. Ảnh hƣởng của mơi trƣờng và thời gian nuơi cấy đến số lƣợng vi khuẩn Bacillus subtilis Thời gian (giờ) Mơi trường TSB TSB + 1% glucose TSB+ 1% cao nấm men TSB+1% glucose+ 1% cao nấm men X 24 11,08 11,25 11,32 11,28 11,23 36 11,19 11,36 11,40 11,37 11,33 48 11,30 11,44 11,49 11,46 11,43 X 11,19 11,35 11,4 11,37 (Số lượng vi khuẩn /ml tính theo logarit) 27 0 2 4 6 8 10 12 14 24 36 48 Thời gian (giờ) Số lƣợng vi khuẩn (Tính theo logarit) TSB TSB+1%glucose TSB+1%cao nấm men TSB+1%glucose+1%cao nấm men Biểu đồ 4.2. Ảnh hƣởng của thời gian và mơi trƣờng nuơi cấy đến số lƣợng vi khuẩn Bacillus subtilis Qua kết quả trình bày ở Bảng 4.2 cho thấy số lượng vi khuẩn trung bình trong 1ml canh khuẩn của mơi trường TSB + 1% cao nấm men là 11,4 (giá trị logarit) (số thực tế là 25,19.1010) cao hơn số lượng vi khuẩn trung bình trong 1 ml canh khuẩn của các mơi trường TSB, TSB + 1% glucose và TSB + 1% glucose + 1% cao nấm men. Và số lượng vi khuẩn trung bình ở thời gian nuơi cấy 48 giờ là 11,43 (giá trị logarit) (số thực tế 26,6.1010) cao hơn số lượng vi khuẩn trung bình trong 1ml canh khuẩn khi nuơi cấy ở các mức thời gian khác. Kết quả xử lí thống kê cho thấy khơng cĩ sự khác biệt giữa 3 loại mơi trường TSB, TSB + 1% glucose và TSB + 1% glucose + 1% cao nấm men. Nhưng cĩ sự khác biệt giữa mơi trường TSB với 3 loại mơi trường trên. Kết quả xử lí thống kê cũng cho thấy cĩ sự khác biệt về số lượng vi khuẩn giữa các khoảng thời gian nuơi cấy (24 giờ, 36 giờ và 48 giờ) với (P<0,05). Từ kết quả trên, chúng tơi chọn mơi trường TSB + 1% cao nấm men và thời gian nuơi cấy 48 giờ để khảo sát các thí nghiệm tiếp theo. 4.2.3. Khảo sát pH, thời gian và nhiệt độ nuơi cấy vi khuẩn thích Từ kết quả của các thí nghiệm 1 và 2, chúng tơi tiến hành nuơi cấy vi khuẩn trên mơi trường TSB + 1% cao nấm men ở 2 mức pH (7 và 7,5) trong điều kiện 37oC, nuơi cấy lắc (15 phút lắc,45 phút nghỉ) với tỉ lệ cấy giống 2% (thí nghiệm lặp lại 2 lần). 28 Đếm số lượng vi khuẩn sau thời gian nuơi cấy bằng phương pháp đỗ đĩa. Kết quả được trình bày ở Bảng 4.3 . Bảng 4.3. Ảnh hƣởng của pH, nhiệt độ và thời gian nuơi cấy đến số lƣợng vi khuẩn Bacillus subtilis Thời gian (giờ) pH 7,0 7,5 Nhiệt độ phịng 37oC Nhiệt độ phịng 37oC 24 10,83 11,37 10,85 11,25 36 10,96 11,45 10,92 11,33 48 11,05 11,54 11,00 11,40 X 10,95 11,45 10,93 11,33 (Số lượng vi khuẩn/ml tính theo logarit) Qua kết quả Bảng 4.3 cho thấy số lượng vi khuẩn trung bình trong 1ml canh khuẩn ở pH = 7 và nhiệt độ 37oC là 11,45 (giá trị logarit) (giá trị thực tế 28,18.1010) cao hơn số lượng vi khuẩn trung bình ở các điều kiện khác (pH = 7 ở nhiệt độ phịng, pH = 7,5 ở nhiệt độ phịng và pH = 7,5 ở 37oC). Qua kết quả xử lý thống kê cho thấy cĩ sự khác biệt giữa các điều kiện nuơi cấy trên, sự khác biệt này cĩ ý nghĩa về mặt thống kê (P<0,05). 0 2 4 6 8 10 12 14 24 36 48 Thời gian (giờ) Số lƣợng vi khuẩn (tí theo logarit) pH 7, nhđộ phịng pH 7, 37 độ C pH 7.5, nhđộ phịng pH 7.5, 37 độ C Biểu đồ 4.3. Ảnh hƣởng của pH, nhiệt độ và thời gian nuơi cấy đến số lƣợng vi khuẩn Bacillus subtilis 29 Kết quả xử lý thống kê cũng cho thấy rằng cĩ sự khác biệt về số lượng vi khuẩn giữa các khoảng thời gian nuơi cấy (24 giờ, 36 giờ và 48 giờ) (P<0,05). Vậy khi nuơi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis trong mơi trường cĩ pH = 7, ở nhiệt độ 37oC trong 24 giờ cho số lượng tế bào vi khuẩn cao nhất. 4.2.4. Các thí nghiệm về bào tử Bacillus subtilis 4.2.4.1. Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ đến sự hình thành bào tử của Bacillus subtilis Từ kết quả của các thí nghiệm 1, 2 và 3,chúng tơi tiến hành nuơi cấy vi khuẩn trên mơi trường TSB + 1% cao nấm men, pH = 7, ở trong điều kiện 37oC, nuơi cấy lắc (15 phút lắc, 45 phút nghỉ), thời gian nuơi cấy là 48 giờ. Sau 48 giờ nuơi cấy, chúng tơi tiến hành xử lí nhiệt độ (50oC và 70oC). Lần lượt đếm số lượng bào tử vi khuẩn hình thành sau 3 giờ, 5 giờ, 7 giờ xử lí bằng phương pháp đếm khuẩn lạc (thí nghiệm được lặp lại 2 lần). Kết quả được trình bày ở Bảng 4.4 và Biểu đồ 4.4. Bảng 4.4. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến sự hình thành bào tử vi khuẩn B. subtilis Thời gian (giờ) Nhiệt độ (oC) X 37 50 70 0 5,65 5,65 5,65 5,65 3 5,81 5,9 5,92 5,87 5 6,37 6,97 6,85 6,73 7 7,12 8,75 8,81 8,23 X 6,22 6,82 6,81 (Số lượng vi khuẩn/ml tính theo logarit) Qua kết quả của chúng tơi được trình bày ở Bảng 4.4, số lượng bào tử hình thành trung bình trong 1 ml canh khuẩn sau khi xử lí 50oC là 6,82 (giá trị logarit) (số thực tế là 6,6.106 bào tử/1ml) cao hơn số lượng bào tử hình thành trung bình trong 1 ml canh khuẩn sau khi xử lí 70oC và đối chứng (37oC). Qua kết quả xử lý thống kê cho thấy cĩ sự khác biệt khi xử lý nhiệt độ (50oC, 70 o C) so với khơng xử lý (37oC) và sự khác biệt này cĩ ý nghĩa về mặt thống kê (P< 0,05). Tuy nhiên, kết quả xử lý thống kê cũng cho thấy khi xử lý nhiệt độ 50oC và 70 o C thì sự khác biệt khơng cĩ ý nghĩa (P>0,05). 30 0 2 4 6 8 10 0 3 5 7 Thời gian (giờ) Số lƣợng vi khuẩn (tính theo logarit) 37 độ C 50 độ C 70 độ C Biểu đồ 4.4. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến sự hình thành bào tử của vi khuẩn B. subtilis Qua Bảng 4.4 cũng thấy được số lượng bào tử hình thành tăng dần qua thời gian xử lí, số lượng bào tử trung bình sau 7 giờ xử lí là 8,81 (giá trị logarit) (số thực tế 64,5.10 7 ) cao hơn số lượng bào tử trung bình ở 3 giờ và 5 giờ xử lí nhiệt độ. Kết quả xử lí thống kê cho thấy cĩ sự khác biệt giữa các khoảng thời gian xử lí nhiệt độ (3 giờ, 5 giờ và 7 giờ), sự khác biệt này cĩ ý nghĩa về mặt thống kê (P<0.05) Từ kết quả của thí nghiệm, chúng tơi thấy rằng khi xử lý nhiệt độ (50oC, 70oC) cĩ ảnh hưởng đến sự hình thành bào tử theo thời gian. Cĩ thể, do thời gian xử lý nhiệt độ và theo dõi ngắn nên khơng thấy được sự tác động khác nhau của 2 mức nhiệt độ này. 4.2.4.2. Khảo sát ảnh hƣởng của pH đến sự hình thành bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis Chúng tơi tiến hành nuơi cấy vi khuẩn trên mơi trường TSB + 1% cao nấm men, pH = 7, ở trong điều kiện 37oC, nuơi cấy lắc (15 phút lắc, 45 phút nghỉ), nuơi cấy trong thời gian 48 giờ. Sau 48 giờ nuơi cấy, chúng tơi tiến hành xử lí pH (pH = 6 và pH = 9). Lần lượt đếm số lượng bào tử vi khuẩn hình thành sau 3 giờ, 5 giờ, 7 giờ xử lí bằng phương pháp đếm khuẩn lạc. 31 Bảng 4.5: Ảnh hƣởng của pH đến sự hình thành bào tử của vi khuẩn B. subtilis Thời gian (giờ) pH X 7 6 9 0 5,49 5,49 5,49 5,49 3 5,9 6,03 5,99 5,97 5 6,17 6,75 6,9 6,61 7 6,98 8,41 8,35 7,91 X 6,14 6,78 6,68 (Số lượng vi khuẩn/ml tính theo logarit) Qua kết quả Bảng 4.5, cho thấy số lượng bào tử hình thành trung bình trong 1ml canh khuẩn sau khi xử lí pH = 6 là 6,78 (giá trị logarit) (số thực tế là 6,03.106 bào tử/1ml) cao hơn sau khi xử lí pH = 9 và đối chứng (pH = 7). Kết quả xử lý thống kê cho thấy cĩ sự khác biệt cĩ ý nghĩa về mặt thống kê giữa việc xử lý pH và khơng xử lý pH đến sự hình thành bào tử. Nhưng khi xử lý pH = 6 và pH = 9 thì lại cĩ sự khác biệt khơng cĩ ý nghĩa về mặt thống kê (P> 0,05). Bảng kết quả cũng cho thấy số lượng bào tử vi khuẩn hình thành tăng dần theo thời gian, số lượng bào tử hình thành trung bình sau 7 giờ xử lí là 7,91 (giá trị logarit) (số thực tế là 8,13.107) cao hơn số lượng bào tử trung bình ở 3 và 5 giờ xử lí. Qua kết quả xử lí thống cũng cho thấy cĩ sự khác biệt cĩ ý nghĩa về mặt thống kê giữa các mức thời gian xủ lí pH (3 giờ, 5 giờ và 7 giờ). Từ kết quả trên, chúng tơi nhận thấy cĩ sự tác động trong việc xử lí pH (pH6, pH9) đến sự hình thành bào tử theo thời gian , tuy nhiên lại khơng thể nhận thấy sự khác nhau trong tác động khác nhau giữa hai mức pH này. Cĩ thể, do thời gian xử lí và theo dõi của chúng tơi ngắn nên khơng thể nhận thấy được sự tác động khác nhau của hai mức pH này. Qua hai bảng kết quả Bảng 4.4 và Bảng 4.5, chúng tơi so sánh thấy cĩ sự khác biệt về số lượng bào tử trung bình khi xử lí bào tử bằng nhiệt độ so với xử lí bằng pH. Tuy nhiên kết quả xử lí thống kê cho thấy giữa hai cách xử lí bào tử cĩ sự khác biệt khơng cĩ ý nghĩa về mặt thống kê. 32 0 2 4 6 8 10 0 3 5 7 Thời gian (giờ) Số lƣợng vi khuẩn (tính theo logarit) pH 7 pH 6 pH 9 Biểu đồ 4.5. Ảnh hƣởng của pH đến sự hình thành bào tử của vi khuẩn B. subtilis 33 PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Sau thời gian thực hiện đề tài chúng tơi đã rút ra những kết luận sau: Đặc điểm sinh học, sinh hố của vi khuẩn Bacillus subtilis do phịng thí nghiệm vi sinh khoa Chăn nuơi Thú y cung cấp cho thấy các đặc điểm về hình thái nuơi cấy và phản ứng sinh hố phù hợp. Khảo sát ảnh hưởng của chế độ nuơi cấy tĩnh và nuơi cấy lắc (15 phút lắc, 45 phút nghỉ) thì chế độ nuơi cấy lắc cho số lượng vi khuẩn cao hơn. Khảo sát ảnh hưởng của 4 loại mơi trường khác nhau (TSB, TSB + 1% glucose, TSB + 1% cao nấm men, TSB + 1% glucose + 1% cao nấm men) thì mơi trường TSB cho số lượng vi khuẩn thấp nhất, 3 mơi trường cịn lại là những mơi trường phù hợp cho Bacillus subtilis phát triển. Khảo sát ảnh hưởng của pH mơi trường (pH 7 và 7,5), thời gian (24,36 và 48 giờ) và nhiệt độ nuơi cấy (nhiệt độ phịng, 37oC) thì ở pH 7, thời gian 48 giờ và nhiệt độ nuơi cấy 37oC cho số lượng vi khuẩn lớn nhất. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ (50, 70), pH (6, 9) và thời gian xử lí (3, 5 và 7 giờ) đến sự hình thành bào tử thì khi xử lí ở các nhiệt độ và pH này cĩ sự ảnh hưởng đến quá trình hình thành bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis. 5.2. Đề nghị Khảo sát thêm nhiều chủng vi khuẩn Bacillus subtilis để chọn chủng cĩ khả năng phát triển mạnh. Khảo sát thêm nhiều loại mơi trường, nhiệt độ, pH và thời gian nuơi cấy để xác định điều kiện thích hợp cho vi khuẩn Bacillus subtilis phát triển. Khảo sát thêm nhiều điều kiện xử lý bào tử để tìm được điều kiện thích hợp cho sự hình thành bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis. ` 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1. Nguyễn Đức Duy Anh, 2005. Phân lập và khảo sát một số đặc điểm của vi khuẩn Lactobacillus acidophilus và Bacillus subtilis. LVTN, bộ mơn cơng nghệ sinh học, Trường Đại Học Nơng Lâm Tp.HCM. 2. Tơ Minh Châu, 2000. Giáo rình thực tập vi sinh vật học.. 3. Nguyễn Lân Dũng, 1983. Thực tập vi sinh vật. Nhà xuất bản đại học và trung học chuyên nghiệp Hà Nội. 4. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đăng Đức, Đặng Hồng Nguyên, Phạn Văn Ty, Nguyễn Vĩnh Phước, Nguyễn Phùng Tiến, 1976. Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học tập I, II, III. Nhà xuất bản Khoa học kỹ thuật. 5. Nguyễn Văn Đơng, 1993. Khảo sát một số tính chất của vi khuẩn Bacillus subtilis dùng sản xuất chế phẩm Biosubtyl phịng và trị bệnh tiêu chảy cho heo con. Luận văn tốt nghiệp khĩ Chăn Nuơi Thú y, trường Đại Học Nơng Lâm Tp.HCM. 6. Nguyễn Ngọc Hải, Tơ Minh Châu, 2001. Giáo trình thực tập vi sinh. Tủ sách trường Đại Học Nơng Lâm Tp.HCM. 7. Lý Kim Hữu, 2005. Khảo sát đặc điểm của Bacillus subtilis và tìm hiểu điều kiện nuơi cấy thích hợp sản xuất thử nghiệm chế phẩm probiotic LVTN, khoa Chăn nuơi Thú y, trường Đại Học Nơng Lâm Tp.HCM. 8. Nguyễn Đức Lượng, 2001. Cơng nghệ sinh học. NXB ĐH Quốc gia Tp.HCM 9. Lê Minh Cẩm Ngọc, 2005. Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ chế phẩm probiotic, tìm hiểu mơi trường nuơi cấy thích hợp và sản xuất thử nghiệm. LVTN, khoa Chăn nuơi Thú y , trường Đại Học Nơng Lâm Tp>HCM. 10. Vũ Văn Ngữ, 1978. Loạn khuẩn đường ruột và tác dụng của Colisubtin. Nhà xuất bản y học Hà Nội . 11. Lương Đức Phẩm. 1998. Cơng nghệ vi sinh vật . NXB Nơng nghiệp Hà Nội. 12. Lương Dức Phẩm, Hồ Xướng, 1978. Vi sinh tổng hợp. NXB KH tổng hợp. 35 TIẾNG NƢỚC NGỒI 13. www.microscopyconsulting.com/ Gallery/pages/Ba... 14. www.techno-science.net/ ?onglet=glossaire&defi... 15. www.mbc.ntu.edu.tw/ faculty/teachers/LeeKT1.htm 16. www.biol.lu.se/cellorgbiol/ membprot/pop_sv.html 17. www.answers.com/ topic/bacillus-1 18. www.foodnews.ch/.../ Begriffsglossar_B.html 19. www.cat.cc.md.us/.../ labmanua/lab2/bscolony.html 20. micro.med.harvard.edu/ faculty/rudner.html 36 PHỤ LỤC 1. Thành phần mơi trƣờng 1.1. Mơi trƣờng Trypticase Soya Agar (TSA) Soya peptone 15g Tryptone peptone 5g Agar 18g Nước cất 1000ml pH 7,3 ± 0,2 Cân 30g mơi trường TSB + 18g agar, hồ tan vào 1000ml nước cất, đun sơi cho hồ tan. Đem hấp tiệt trùng ở 121oC trong 20 phút. 1.2. Mơi trƣờng Trypticase Soya Broth (TSB) Soya pepton 15g Tryptone pepton 5g Nacl 5g Nước cất 1000ml pH 7,3 ± 0,2 Cân 30g bột mơi trường TSB hồ tan vào 1000ml nước cất, đun sơi cho hồ tan.Đem hấp khử trùng ở 121oC trong 20 phút. 1.3. Mơi trƣờng lên men các loại đƣờng Cao thịt 5g Pepton bột 10g Đường 10g Phenol red 0,01g Nước cất 1000ml pH 7,4 ± 0,2 Hấp khử trùng 121oC trong 10 phút. 1.4. Mơi trƣờng Simmons Citrate Agar Sodium citrate 2g K2PO4 1g MgSO4 0,2g Brothynol blue 0,08g NaCl 5g NH4H2PO4 1g Agar 18g pH 6,9 ± 0,2 1.5. Mơi trƣờng Starch Agar (Tinh bột) Nutrien Agar 23g Tinh bột tan 10g Nước cất 1000ml pH 7,4 ± 0,2 1.6. Mơi trƣờng Trypticase Soya Agar (TSB) + 1 % glucose Soya pepton 15g Tryptone pepton 5g Glucose 10g Nacl 5g Nước cất 1000ml pH 7,3 ± 0,2 Cân 30g bột mơi trường TSB và 10g glucose hồ tan vào 1000ml nước cất, đun sơi cho hồ tan.Đem hấp khử trùng ở 121oC trong 10 phút 37 1.7. Mơi trƣờng Trypticase Soya Broth (TSB) + 1% cao nấm men Soya pepton 15g Tryptone pepton 5g Cao nấm men 10g Nacl 5g Nước cất 1000ml pH 7,3 ± 0,2 Cân 30g bột mơi trường TSB và 10g cao nấm men hồ tan vào 1000ml nước cất, đun sơi cho hồ tan.Đem hấp khử trùng ở 121oC trong 20 phút 1.8. Mơi trƣờng Trypticase Soya Broth (TSB) + 1% glucose + 1% cao nấm men Soya pepton 15g Tryptone pepton 5g Glucose 10g Cao nấm men 10g Nacl 5g Nước cất 1000ml pH 7,3 ± 0,2 Cân 30g bột mơi trường TSB hồ tan vào 1000ml nước cất, đun sơi cho hồ tan.Đem hấp khử trùng ở 121oC trong 10 phút 1.9. Mơi trƣờng MR - VP Broth Mơi trƣờng 1: Buffered peptone-water powder Difco hoặc BBL 7g Glucose 5g K2HPO4 5g Nước cất 1000ml Mơi trƣờng 2 Casein Pancreatic Digesr 3.5g Peptic digest of animal tissue 3.5g Dextrose 5g Potassium phosphate 5g Nước cất 1000ml Hồ tan các thành phần trong nước, làm nĩng nhẹ nêu cần.Phân phối vào các ống nghiệm và hấp vơ trùng ở 121oC trong 15 phút. pH cuối là 6,9 + 0,2. Mơi trƣờng 3 Peptone 5g Glucose 5g Phosphat buffer 5g Nước cất 1000ml Hồ tan các thành phần trong nước. Phân phối 10ml vào các ống nghiệm và hấp vơ trùng ở 121oC trong 15 phút. pH cuối là 7,5 + 0,2. 2.Hố chất 2.1.Nƣớc muối sinh lý 9 ‰ NaCl 9g Nước cất 1000ml 2.2.HCl 1% HCl đđ 10ml Nước cất 1000ml 2.3. NaOH 1% NaOH đđ 10ml Nước cất 1000ml 38 2.4. Dung dịch Iod 0,2N Cân 2g KI hồ tan trong 3ml nước, lắc đều cho tan, thêm nước cất vào cho đủ 100ml. 3.Thuốc thử và chất chỉ thị màu 3.1.Thuốc thử Catalase Dung dịch 3% H2O2 (Hydogen peroxide) 3.2.Thuốc thử Methyl Red Methyl Red 0,1g Ethanol 95% 300ml Nước cất (vừa đủ) 500ml Hịa tan đỏ methyl vào 300ml ethanol. Thêm nước cất vào cho đủ 500ml 4.Thuốc nhuộm 4.1.Crystal violet a. Crystal violet 0,4g Cồn 96 10ml b. Phenol 1g Nước cất 100ml Trộn hai dung dịch a và b lại với nhau, khuấy cho tan đều rồi đem lọc. Dung dịch thuốc nhuộm luơn được bảo quản trong chai màu để tránh ánh sáng. 4.2. Lugol KI 2g Iod tinh thể 1g Nước cất 300ml Hồ 2g KI vào 5ml nước , sau đĩ thêm 1g Iod,chờ cho Iod tan hết rồi mới thêm nước cất vừa đủ 300ml 4.3. Fuschine kiềm lỗng a. Fuschine kiềm 0,3g Cồn 96o 10ml b Phenol 5g Nước cất 35ml Trộn dung dịch a với dung dịch bạn cho hồ tan. Đem bảo quản trong chai màu. 5.Thử các phản ứng sinh hố 5.1. Kiểm tra khả năng lên men đƣờng Chuẩn bị Mơi trường đường: glucose, maltose, saccharose, lactose. Giống vi khuẩn Bacilius subtili Ống nghiệm, ống durham. Tiến hành Cho vào mỗi ống nghiệm một ống durham, đem hấp khử trùng ở 121oC trong 10 phút. Sau đĩ cấy vi khuẩn vào mơi trường mơi trường, đem ủ ở 37oC/24 giờ. Quan sát sự đổi màu, sinh hơi. Nếu vi khuẩn cĩ khả năng lên men đường thì đường sẽ bị lên men rượu, rượu hố acid làm pH mơi trường giảm làm chuyển màu mơi trường. Kết quả Phản ứng (-): mơi trường cĩ màu hồng đỏ. Phản ứng (+): mơi trường cĩ màu vàng. 5.2.Thử phản ứng Catalase Chuẩn bị Dung dịch H2O2 30%. Lame. 39 Giống vi khuẩn Bacillus subtilis. Tiến hành Dùng pipete lấy một ít vi khuẩn phết lên giữa lame kính sạch và khơ. Sau đĩ nhỏ giọt H2O2 30% lên vết vi khuẩn. Đọc kết quả sau khoảng 15 giây. Kết quả Phản ứng (-): khơng cĩ hiện tượng sủi bọt. Phản ứng (+): Cĩ hiện tượng sủi bọt. 5.3. Kiểm tra khả năng sinh Indol Chuẩn bị Mơi trường TSB. Thuốc thử Kovacc Giống vi khuẩn Bacillus subtilis Tiến hành Cấy vi khuẩn vào mơi trường TSB, nuơi cấy ở 37oC trong 24 giờ. Sau đĩ nhỏ vài giọt thuốc thử Kovacc vào mơi truờng và đọc kết quả. Kết quả Phản ứng (-): Lớp mặt cĩ màu vàng. Phản ứng (+): Lớp mặt cĩ màu đỏ. 5.4. Phản ứng VP (Voges Proskauer) Chuẩn bị Giống vi khuẩn Bacillus subtilis. Mơi trường Clark Lubs. Alpha-naphtol 10%, NaOH 40%. Tiến hành Dùng que cấy vịng lấy vi khuủân vào mơi trường Clark Lubs, nuơi ở nhiệt độ 37oC trong 24 giờ. Sau đĩ nhỏ 3-5 giọt NaOH 40% và 3-5 giọt alpha-naphtol 10%. Sau 15 phút đọc kết quả. Kết quả Phản ứng VP (-): Mơi trường cĩ màu vàng. Phản ứng VP (+): Mơi trường cĩ màu đỏ. 5.5. Phản ứng Methyl-Red Chuẩn bị Mơi trường Clark Lubs Thuốc thử Methyl-Red Giống vi khuẩn Bacillus subtilis Tiến hành Dùng que cấy vịng lấy vi khuẩn vào mơi trường Clark Lubs, nuơi ở 37oC trong 24 giờ. Sau đĩ nhỏ 2-3 giọt thuốc thử Methyl-Red vào canh khuẩn va đọc kết quả. Kết quả Phản ứng (-): Mơi trường cĩ màu vàng. Phản ứng (+): Mơi trường cĩ mau đỏ. 5.6.Phản ứng khử Nitrate (NO3) Chuẩn bị Mơi trường Nitrate. Dung dịch thuốc thử Giess A, Giess B. Giống vi khuẩn Bacillus subtilis. Tiến hành Dùng que cấy lấy vi khuẩn vào mơi trường thạch Nitrate bán lỏng, nuơi ở 37oC. Sauu 24 giờ, nhỏ vào mơi trường 2-3 giọt Giess A, sau đĩ nhỏ tiếp 2-3 giọt Giess B. Kết quả Phản ứng (-): Mơi trường cĩ màu vàng. 40 Phản ứng (+): Mơi trường cĩ màu đỏ. 5.7.Khả năng sử dụng Citrate. Chuẩn bị Giống vi khuẩn Bacillus subtilis. Mơi trường Citrate. Tiến hành Cấy vi khuẩn vào mơi trường citrate, nuơi ở 37oC trong 24 giờ. Kết quả Phản ứng (-): Mơi trường cĩ màu xanh lá mạ non. Phản ứng (+): Mơi trường cĩ nàu xanh dương. 6.Phƣơng pháp nhuộm Gram Cố định tiêu bản. Đặt giấy lọc lên vết bơi. Nhuộm Crystal violet trong 1 – 2 phút. Rửa nước. Cố định Lugol trong 1 phút. Rửa nước. Tẩy cồn 90o trong 15 giây. Rửa nước. Nhuộm Fuschine kiềm lỗng trong 1 phút. Rửa nước. Châm khơ, soi kính hiển vi. 7. Phƣơng pháp nhuộm bào tử Cố định tiêu bản. Nhỏ dung dịch HCl 1% lên vếta bơi trong 1– 2 phút. Rửa nước. Đặt giấy lọc lên vết bơi. Nhỏ Fuschine đậm đặc, hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn trong 2– 4 phút. Bỏ giấy lọc, rửa nước. Nhúng vào cồn 96o cho đén khi cĩ màu hồng khơng phai. Rửa nước. Nhỏ dung dịch Xanh Methylene trong 1- 2 phút. Rửa nước. Châm khơ, đem soi kính. Cơng thức tính số lượng vi khuẩn bằng vết bơi: A = a x N x H x B Trong đĩ: A: Tổng số vi sinh vật cĩ trong 1 ml dịch. a = n ai : Số vi sinh vật trung bình cĩ trong 1 hiển vi trường. ai: Số vi sinh vật cĩ trong mỗi hiển vi trường. n: Số hiển vi trường. H = 1/Độ pha lỗng: Hệ số pha lỗng. B = 1/V: Hệ số thể tích (1 ml). V: Thể tích làm vết bơi. 8. Phƣơng pháp đếm khuẩn lạc Chuẩn bị các đĩa mơi trường TSA đã hấp tiệt trùng và để khơ mặt thạch. Lấy 1 ml dịch vi khuẩn cần đếm pha lỗng ở nhiều nồng độ liên tiếp nhau (theo phương pháp pha lỗng thập phân) bằng dung dịch nước muối sinh lí. Cấy trang 0,1 ml dịch pha lỗng lên mơi trường TSA (mỗi nồng độ trang 2 đĩa), ủ ở 37oC trong 24 giờ. Đem đếm số lượng vi khuẩn. 41 Đếm số lƣợng bào tử bằng phƣơng pháp đếm khuẩn lạc: Lấy dịch nuơi cấy vi khuẩn pha lỗng xử lí tế bào sinh dưỡng bằng cách đun ở 100oC trong 1 giờ, sau đĩ thực hiện các bước tiếp theo như trên. Tính kết quả *Số khuẩn lạc trong 1g mẫu hay 1 ml dịch mẫu ở mỗi độ pha lỗng. Cơng thức: X = Vh A 11 Trong đĩ: X: Số lượng vi khuẩn trong 1g mẫu hay 1 ml dịch mẫu. A: Số khuẩn lạc trung bình cĩ trong đĩa (trong tổng số 2 đĩa cĩ cùng nồng độ pha lỗng). h: Độ pha lỗng tứ (10-7, 10-8, 10-9, …). V: Thể tích dịch mẫu cấy lên một đĩa. *Số khuẩn lạc trung bình trong 1g mẫu hay 1 ml dịch mẫu ở 3 độ pha lỗng liên tiếp nhau: Cơng thức: Y = 3 321 XXX Trong đĩ: Y: Số khuẩn lạc trung bình ở các độ pha lỗng. X1, X2, X3: Số khuẩn lạc trung bình cĩ trong 1g mẫu hay 1 ml dịch mẫu ở mỗi nồng độ pha lỗng. Ảnh hưởng của mơi trường và thời gian nuơi cấy đến số lượng vi khuẩn Analysis of Variance for So luong - Type III Sums of Squares --------------------------------------------------------------------------- -- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level --------------------------------------------------------------------------- -- MAIN EFFECTS A:thoi gian .0814333 2 .0407167 11.258 .0018 B:moi truong .1736500 3 .0578833 16.005 .0002 INTERACTIONS AB .0023000 6 3.83333E-004 .106 .9941 RESIDUAL .0434000 12 .0036167 --------------------------------------------------------------------------- -- TOTAL (CORRECTED) .3007833 23 -------------------------------------------------------------------------- Multiple range analysis for So luong by moi truong --------------------------------------------------------------------------- -- Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups --------------------------------------------------------------------------- -- 1 6 11.170000 X 2 6 11.320000 X 4 6 11.363333 X 3 6 11.390000 X --------------------------------------------------------------------------- -- contrast difference limits 1 - 2 -0.15000 0.07567 * 1 - 3 -0.22000 0.07567 * 1 - 4 -0.19333 0.07567 * 2 - 3 -0.07000 0.07567 2 - 4 -0.04333 0.07567 3 - 4 0.02667 0.07567 --------------------------------------------------------------------------- denotes a statistically significant difference. Multiple range analysis for so luong by thoi gian --------------------------------------------------------------------------- -- Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups --------------------------------------------------------------------------- - 24 8 11.250000 X 36 8 11.318750 X 48 8 11.390000 X --------------------------------------------------------------------------- -- contrast difference limits 24 - 36 -0.06875 0.06087 * 24 - 48 -0.14000 0.06087 * 36 - 48 -0.07125 0.06087 * * denotes a statistically significant difference. Ảnh hưởng của chế độ và thời gian nuơi cấy đến số lượng vi khuẩn Analysis of Variance for so luong - Type III Sums of Squares --------------------------------------------------------------------------- ----- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level MAIN EFFECTS A: che do 6.5121333 1 6.5121333 89.617 .0001 B: thoi gian 2.8972667 2 1.4486333 19.935 .0022 INTERACTIONS AB .0480667 2 .0240333 .331 .7307 RESIDUAL .4360000 6 .0726667 TOTAL (CORRECTED) 9.8934667 11 -------------------------------------------------------------------------- Multiple range analysis for so luong by che do nuoi cay Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups 2 6 9.386667 X 1 6 10.860000 X contrast difference limits 1 - 2 1.47333 0.38094 * --------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Ảnh hưởng của pH, thời gian và nhiệt độ nuơi cấy đến số lượng vi khuẩn Analysis of Variance for so luong - Type III Sums of Squares Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level MAIN EFFECTS A:Thgian .0417000 2 .0208500 .750 .4931 B:pH .4160667 1 .4160667 14.975 .0022 C:Nhdo .5890667 1 .5890667 21.202 .0006 INTERACTIONS AB .2186333 2 .1093167 3.935 .0485 AC .4426333 2 .2213167 7.966 .0063 BC .1802667 1 .1802667 6.488 .0256 ABC .3606333 2 .1803167 6.490 .0123 RESIDUAL .3334000 12 .0277833 TOTAL (CORRECTED) 2.5824000 23 Multiple range analysis for so luong by pH Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups 7.5 12 10.913333 X 7 12 11.176667 X contrast difference limits 7 - 7.5 0.26333 0.14830 * * denotes a statistically significant difference. Multiple range analysis for so luong by nhdo Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups 32 12 10.888333 X 37 12 11.201667 X contrast difference limits 32 - 37 -0.31333 0.14830 * * denotes a statistically significant difference. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng hình thành bào tử của vi khuẩn Analysis of Variance for so luong - Type III Sums of Squares --------------------------------------------------------------------------- -- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level --------------------------------------------------------------------------- -- MAIN EFFECTS A:thgian 4.8966667 3 1.6322222 333.107 .0000 B:nhietdo 1.7563000 2 .8781500 179.214 .0000 INTERACTIONS AB 21.991433 6 3.6652389 748.008 .0000 RESIDUAL .0588000 12 .0049000 ----------------------- --------------------------------------------------- ------ TOTAL (CORRECTED) 28.703200 23 --------------------------------------------------------------------------- -- Multiple range analysis for so luong by thgian xu li --------------------------------------------------------------------------- -- Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups --------------------------------------------------------------------------- -- 0 6 6.1333333 X 3 6 6.2266667 X 5 6 6.9233333 X 7 6 7.1966667 X --------------------------------------------------------------------------- -- contrast difference limits 0 - 3 -0.09333 0.08808 * 0 - 5 -0.79000 0.08808 * 0 - 7 -1.06333 0.08808 * 3 - 5 -0.69667 0.08808 * 3 - 7 -0.97000 0.08808 * 5 - 7 -0.27333 0.08808 * denotes a statistically significant difference. Table of Least Squares Means for XLNHDO1.sltb ------------------------------------------------------------------------------ -- 95% Confidence Level Count Average Stnd. Error for mean ------------------------------------------------------------------------------ -- GRAND MEAN 24 6.6200000 .0142887 6.5888596 6.6511404 A:thgian 0 6 6.1333333 .0285774 6.0710525 6.1956142 3 6 6.2266667 .0285774 6.1643858 6.2889475 5 6 6.9233333 .0285774 6.8610525 6.9856142 7 6 7.1966667 .0285774 7.1343858 7.2589475 B:nhietdo 37 8 6.2375000 .0247487 6.1835632 6.2914368 50 8 6.8175000 .0247487 6.7635632 6.8714368 70 8 6.8050000 .0247487 6.7510632 6.8589368 AB 0 37 2 5.6500000 .0494975 5.5421264 5.7578736 0 50 2 5.9000000 .0494975 5.7921264 6.0078736 0 70 2 6.8500000 .0494975 6.7421264 6.9578736 3 37 2 7.1200000 .0494975 7.0121264 7.2278736 ------------------------------------------------------------------------------ -- Ảnh hưởng của pH đến khả năng hình thành bào tử của vi khuẩn Analysis of Variance for so luong tbao - Type III Sums of Squares ------------------------------------------------------------------------------ -- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level ------------------------------------------------------------------------------ -- MAIN EFFECTS A:thgian 19.861200 3 6.6204000 185.272 .0000 B:pH 1.601200 2 .8006000 22.405 .0001 INTERACTIONS AB 1.6900000 6 .2816667 7.882 .0013 RESIDUAL .4288000 12 .0357333 ------------------------------------------------------------------------------ -- TOTAL (CORRECTED) 23.581200 23 ------------------------------------------------------------------------------ -- 0 missing values have been excluded. All F-ratios are based on the residual mean square error. Multiple range analysis for so luong by pH --------------------------------------------------------------------------- -- Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups --------------------------------------------------------------------------- ----- 7 8 6.1350000 X 6 8 6.6700000 X 9 8 6.6950000 X --------------------------------------------------------------------------- -- contrast difference limits 6 - 7 0.53500 0.20599 * 6 - 9 -0.02500 0.20599 7 - 9 -0.56000 0.20599 * --------------------------------------------------------------------------- -- * denotes a statistically significant difference. Multiple range analysis for so luuong by thgian --------------------------------------------------------------------------- -- Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups --------------------------------------------------------------------------- -- 0 6 5.4900000 X 3 6 5.9733333 X 5 6 6.6233333 X 7 6 7.9133333 X --------------------------------------------------------------------------- -- contrast difference limits 0 - 3 -0.48333 0.23785 * 0 - 5 -1.13333 0.23785 * 0 - 7 -2.42333 0.23785 * 3 - 5 -0.65000 0.23785 * 3 - 7 -1.94000 0.23785 * 5 - 7 -1.29000 0.23785 * --------------------------------------------------------------------------- -- * denotes a statistically significant difference.