Luận văn Bước đầu nghiên cứu sản xuất nước tương lên men

ÑAÏI HOÏC QUOÁC GIA THAØNH PHOÁ HOÀ CHÍ MINH TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC BAÙCH KHOA KHOA KYÕ THUAÄT HOÙA HOÏC LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP ÑAÏI HOÏC BÖÔÙC ÑAÀU NGHIEÂN CÖÙU SAÛN XUAÁT NÖÔÙC TÖÔNG LEÂN MEN SVTH : VOÕ THÒ THU HAÈNG MSSV : 60300849 CBHD : PGS. TS. LEÂ VAÊN VIEÄT MAÃN KS. HUYØNH TRUNG VIEÄT BOÄ MOÂN COÂNG NGHEÄ THÖÏC PHAÅM TP Hoà Chí Minh, 01/2008 NHAÄN XEÙT CUÛA GIAÙO VIEÂN HÖÔÙNG DAÃN NHAÄN XEÙT CUÛA GIAÙO VIEÂN PHAÛN BIEÄN LÔØI CAÛM ÔN Em xin göûi lôøi caûm ôn chaân thaønh ñeán thaày Leâ Vaên Vieät Maãn vaø thaày Huyønh Trung Vieät ñaõ taän tình höôùng daãn vaø chæ baûo em trong thôøi gian laøm luaän vaên vöøa qua. Em cuõng xin göûi lôøi caûm ôn ñeán taát caû caùc quyù thaày coâ trong khoa Hoùa, ñaëc bieät laø caùc thaày coâ trong Boä moân Coâng ngheä Thöïc phaåm, Tröôøng Ñaïi Hoïc Baùch Khoa ñaõ truyeàn ñaït kieán thöùc cho em trong suoát 4 naêm hoïc. Caùm ôn gia ñình vaø baïn beø ñaõ nhieät tình giuùp ñôõ caû veà vaät chaát vaø tinh thaàn, taïo ñieàu kieän cho toâi hoaøn thaønh luaän vaên naøy. Tp.Hoà Chí Minh, ngaøy 28 thaùng 12 naêm 2007 Sinh vieân Voõ Thò Thu Haèng toùm taét luaän vaên Muïc ñích cuûa luaän vaên “Böôùc ñaàu nghieân cöùu saûn xuaát nöôùc töông leân men” nhaèm khaûo saùt caùc thoâng soá coâng ngheä ñeå thuûy phaân moät caùch coù hieäu quaû vaø trieät ñeå haøm löôïng protein thoâ coøn toàn taïi khaù lôùn trong nguyeân lieäu khoâ laïc cuûa caùc nhaø maùy eùp daàu, naâng cao haøm löôïng Nitô amin töï do trong nöôùc töông leân men. Ñoàng thôøi ñöa ngöôøi saûn xuaát vaø ngöôøi tieâu duøng trôû veà vôùi moät saûn phaåm leân men truyeàn thoáng thaân thieän vôùi moâi tröôøng vaø toát cho söùc khoeû con ngöôøi. Sau khi tham khaûo caùc nguoàn taøi lieäu thu thaäp ñöôïc veà caùc noäi dung: Quy trình saûn xuaát nöôùc töông leân men ôû moät soá nöôùc treân theá giôùi. Ñieàu kieän sinh tröôûng cuûa naám moác Aspergillus oryzae. Ñaëc tính cuûa moät soá cheá phaåm enzym protease treân thò tröôøng. Chuùng toâi ñaõ ñeà ra höôùng nghieân cöùu trong luaän vaên toát nghieäp naøy nhö sau: Khaûo saùt caùc yeáu toá aûnh höôûng tôùi quaù trình nuoâi naám moác ñeå sinh toång hôïp enzym protease coù hoaït tính cao nhaát. Khaûo saùt caùc yeáu toá aûnh höôûng tôùi quaù trình thuûy phaân ñeå naâng cao haøm löôïng Nitô amin töï do trong nöôùc töông. Böôùc ñaàu söû duïng keát hôïp enzym protease cuûa naám moác vaø caùc cheá phaåm protease thöông maïi nhaèm naâng cao hôn nöõa haøm löôïng Nitô amin töï do trong nöôùc töông. Saûn phaåm maø chuùng toâi thu ñöôïc trong nghieân cöùu naøy laø dòch nöôùc töông sau thuûy phaân vôùi haøm löôïng Nitô amin vaø Nitô toång cao nhaát laø 8.93 (g/l) vaø 14.41 (g/l). MUÏC luïc Lôøi caûm ôn ii Toùm taét luaän vaên iii danh muïc hình vii danh muïc baûng viii caùc töø vieát taét ix danh muïc hình HÌNH 2.1: Caây laïc 4 HÌNH 2.2: Quy trình coâng ngheä saûn xuaát nöôùc töông hoùa giaûi 11 HÌNH 2.3: Quy trình coâng ngheä saûn xuaát nöôùc töông leân men 13 HÌNH 2.4: Aspergillus oryzae 20 HÌNH 3.1: Baùnh daàu laïc 30 HÌNH 3.2: Khoâ laïc sau nghieàn 30 HÌNH 4.1: Quan heä giöõa tæ leä nguyeân lieäu vaø hoaït tính protease 44 HÌNH 4.2: Quan heä giöõa ñoä aåm moâi tröôøng vaø hoaït tính protease (laàn 1) 48 HÌNH 4.3: Quan heä giöõa ñoä aåm moâi tröôøng vaø hoaït tính protease (laàn 2) 49 HÌNH 4.4: Quan heä giöõa tæ leä moác caáy vaø hoaït tính protease. 52 HÌNH 4.5: Quan heä giöõa thôøi gian nuoâi caáy vaø hoaït tính protease (laàn 1) 55 HÌNH 4.6: Quan heä giöõa thôøi gian nuoâi caáy vaø hoaït tính protease (laàn 2) 56 danh muïc baûng BAÛNG 2.1: Thaønh phaàn hoùa hoïc trung bình cuûa laïc nhaân 5 BAÛNG 2.2: Thaønh phaàn hoùa hoïc cuûa haït laïc 5 BAÛNG 2.3: Caùc loaïi acid amin khoâng thay theá trong haït laïc 7 BAÛNG 2.4: Thaønh phaàn hoùa hoïc cuûa khoâ laïc 8 BAÛNG 2.5: Haøm löôïng acid amin trong khoâ laïc 8 BAÛNG 2.6: Haøm löôïng khoaùng trong khoâ laïc 8 BAÛNG 2.7: Chæ tieâu hoùa hoïc cuûa nöôùc chaám ( TCVN 1763-75) 16 BAÛNG 2.8: Chæ tieâu caûm quan cuûa nöôùc chaám ( TCVN 1763-75) 17 BAÛNG 2.9: Caùc loaøi vi sinh vaät duøng trong saûn xuaát nöôùc töông ôû caùc nöôùc 18 BAÛNG 4.1: Keát quaû khaûo saùt thaønh phaàn hoùa hoïc cuûa khoâ laïc 40 BAÛNG 4.2: Thaønh phaàn hoùa hoïc cuûa khoâ ñaäu naønh 40 BAÛNG 4.3: Thaønh phaàn hoùa hoïc cuûa boät mì töø coâng ty Bình Ñoâng 42 BAÛNG 4.4: Aûnh höôûng cuûa tæ leä khoái löôïng khoâ laïc:boät mì ñeán hoaït tính protease trong canh tröôøng beà maët Asp. oryzae 44 BAÛNG 4.5: Tæ leä phoái troän nguyeân lieäu trong saûn xuaát nöôùc töông ôû Nhaät Baûn 46 BAÛNG 4.6: Aûnh höôûng cuûa ñoä aåm moâi tröôøng ñeán hoaït tính protease töø Asp. oryzae (laàn 1) 47 BAÛNG 4.7: Aûnh höôûng cuûa ñoä aåm moâi tröôøng ñeán hoaït tính protease töø Asp. oryzae (laàn 2) 48 BAÛNG 4.8: Aûnh höôûng cuûa tæ leä gioáng caáy ñeán hoaït tính protease töø Asp. oryzae 51 BAÛNG 4.9: Aûnh höôûng cuûa thôøi gian nuoâi caáy ñeán hoaït tính protease (laàn 1) 54 BAÛNG 4.10: Aûnh höôûng cuûa thôøi gian nuoâi caáy ñeán hoaït tính protease töø Asp. oryzae (laàn 2) 55 caùc töø vieát taét Töø vieát taét Teân ñaày ñuû Ñvhñ/gctk Ñôn vò hoaït ñoä/gam canh tröôøng khoâ Tb Trung bình N Nitô W Khoái löôïng V Theå tích C Carbon Asp. Aspergillus Vit Vitamin TCVN Tieâu chuaån Vieät Nam 3-MCPD 3-monochloropropandiol MÔÛ ÑAÀU Giôùi thieäu Trong cuoäc soáng ngaøy nay, ngöôøi ta luoân duøng caùc loaïi gia vò keøm vaøo böõa aên nhö nöôùc maém, nöôùc chaám töø thöïc vaät … Nöôùc chaám töø thöïc vaät hay coøn goïi laø nöôùc töông, taøu vò yeåu ñöôïc duøng phoå bieán ôû Vieät Nam. Nöôùc chaám töø thöïc vaät ngoaøi vai troø cung caáp muøi vò, noù coøn cung caáp cho cô theå ngöôøi moät löôïng ñaïm nhaát ñònh vaø moät soá khoaùng chaát caàn thieát cho cô theå. Nöôùc töông laø teân goïi cho caùc saûn phaåm nöôùc chaám töø thöïc vaät leân men töø ñaäu naønh nguyeân haït. Coøn taøu vò yeåu laø saûn phaåm nöôùc chaám töø thöïc vaät ñöôïc saûn xuaát baèng phöông phaùp hoùa giaûi nguyeân lieäu khoâ daàu. Magi laø saûn phaåm nöôùc chaám thuûy phaân töø ñoäng vaät… Tuy nhieân, hieän nay, nöôùc töông, xì daàu, magi, taøu vò yeåu ñöôïc ngöôøi söû duïng goïi chung laø nöôùc töông. Nöôùc töông leân men laø moät loaïi nöôùc chaám giaøu chaát dinh döôõng, coù höông vò thôm ngon, noù laø saûn phaåm cuûa quaù trình thuûy phaân nguyeân lieäu giaøu protein döôùi taùc duïng cuûa enzym vi sinh vaät. Nöôùc töông coù vò ñaäm ñaø cuûa chaát ñaïm, vò ngoït cuûa ñöôøng, vò maën cuûa muoái aên… Nöôùc töông ñöôïc laøm vaø söû duïng caùch nay hôn 2500 naêm bôûi ngöôøi phöông Ñoâng. Khi ñaïo Phaät ñöôïc truyeàn baù roäng raõi vaø vieäc söû duïng thòt bò kieâng kò thì nöôùc töông laø moät thöïc phaåm coù giaù trò dinh döôõng cao, ñaùp öùng ñöôïc nhu caàu aên chay vaø nhanh choùng trôû thaønh loaïi gia vò phoå bieán ôû caùc nöôùc coù toân giaùo laø ñaïo Phaät. Töø theá kyû 16, nöôùc töông ñaõ ñöôïc caûi tieán höông vò vaø hình thöùc, chuùng trôû neân ña daïng hôn, phong phuù hôn. Nhôø vaøo nhöõng thöông gia ngöôøi Haø Lan maø nöôùc töông ñöôïc mang tôùi Chaâu AÂu vaøo theá kyû 17. Vaø ngaøy nay nöôùc töông ñöôïc tieâu thuï vaø ngaøy caøng trôû neân phoå bieán ôû Chaâu AÂu. Treân theá giôùi, nöôùc töông laø loaïi gia vò thöïc phaåm coù tính chaát coå truyeàn cuûa nhaân daân caùc nöôùc thuoäc khu vöïc chaâu AÙ nhö: Trung Quoác, Nhaät Baûn, Malaysia, Vieät Nam, Indonesia… Hieän nay, coù raát nhieàu loaïi nöôùc töông ñöôïc saûn xuaát theo khaåu vò vaø thoùi quen söû duïng cuûa ngöôøi tieâu duøng, chaúng haïn nhö nöôùc töông Kikoman ôû Nhaät Baûn, Taogi ôû Philippin, Tempeh ôû Indonesia, Trung Quoác coù Yanwajun, Thaùi lan coù Chiang… Ñeå thuûy phaân protein trong saûn xuaát nöôùc chaám, trong nöôùc, hieän nay thoâng duïng nhaát laø söû duïng phöông phaùp hoùa giaûi baèng acid. Tuy nhieân treân theá giôùi, ngöôøi ta daàn daàn huûy boû phöông phaùp hoùa giaûi trong saûn xuaát nöôùc töông vaø chuyeån sang phöông phaùp leân men vi sinh vaät. Nhaät Baûn vaø Trung Quoác laø nhöõng nöôùc vaãn duy trì coâng ngheä leân men truyeàn thoáng coù caûi tieán nhieàu veà caùc thieát bò vaø maùy moùc neân chaát löôïng nöôùc töông raát oån ñònh vaø ñöôïc tieâu thuï treân toaøn theá giôùi. Do nhöõng nhöôïc ñieåm veà oâ nhieãm moâi tröôøng, veà chaát löôïng dinh döôõng vaø an toaøn cuûa saûn phaåm neân xu theá hieän nay ôû trong nöôùc seõ chuyeån daàn caùc cô sôû saûn xuaát nöôùc töông töø phöông phaùp hoùa giaûi sang phöông phaùp leân men. Tröôùc nhöõng yeâu caàu thöïc teá ñoù, chuùng toâi thöïc hieän ñeà taøi “Böôùc ñaàu nghieân cöùu saûn xuaát nöôùc töông leân men”. Muïc tieâu cuûa ñeà taøi Khaûo saùt quaù trình nuoâi caáy naám moác ñeå taïo ra enzym protease coù hoaït tính cao nhaát. Khaûo saùt quaù trình thuûy phaân protein nhaèm naâng cao haøm löôïng acid amin baèng phöông phaùp: Söû duïng enzym töø canh tröôøng naám moác Aspergillus oryzae. Keát hôïp söû duïng enzym töø canh tröôøng naám moác Aspergillus oryzae vaø söû duïng cheá phaåm enzym protease. Noäi dung nghieân cöùu Khaûo saùt thaønh phaàn cuûa nguyeân lieäu. Xaùc ñònh tæ leä phoái troän nguyeân lieäu trong moâi tröôøng, tyû leä moác caáy, ñoä aåm vaø thôøi gian thích hôïp cuûa quaù trình nuoâi moác ñeå sinh toång hôïp protease coù hoaït tính cao nhaát. Xaùc ñònh tæ leä moâi tröôøng : dung moâi (nöôùc muoái), noàng ñoä muoái, nhieät ñoä, pH vaø thôøi gian thích hôïp cuûa quaù trình thuûy phaân protein baèng enzym töø canh tröôøng naám moác ñeå haøm löôïng ñaïm trong dòch thuûy phaân laø lôùn nhaát. Böôùc ñaàu khaûo saùt quaù trình thuûy phaân protein khi söû duïng keát hôïp enzym töø canh tröôøng naám moác vaø cheá phaåm enzym thöông maïi ñeå taêng haøm löôïng ñaïm trong dòch thuûy phaân. TOÅNG QUAN TAØI LIEÄU Toång quan veà caây laïc [2, 4, 9] Lòch söû phaùt hieän vaø ñaëc ñieåm thöïc vaät cuûa caây laïc HÌNH 2.1: Caây laïc Teân khoa hoïc : Arachis hypogea Giôùi : Magnoliophyta Lôùp : Magnoliopsida Boä : Fabales Hoï : Fabaceae Gioáng : Arachis Loaøi : Arachis hypogaea Laïc coøn ñöôïc goïi laø ñaäu phoäng (danh phaùp khoa hoïc: Arachis hypogaea), laø moät loaøi caây thöïc phaåm thuoäc hoï Ñaäu, coù nguoàn goác töø Nam Myõ. Lòch söû troàng laïc ôû Vieät Nam hieän nay chöa ñöôïc xaùc minh roõ raøng. Neáu caên cöù teân goïi maø xeùt ñoaùn thì danh töø “laïc” coù theå do ngöôøi Trung Quoác goïi caây laïc laø “laïc hoa sinh”. Nhö vaäy, coù theå laïc töø Trung Quoác nhaäp vaøo nöôùc ta khoaûng theá kyû XVII-XVIII. Laïc thuoäc ñaäu, thaân boø vaø thaúng, moïc thaønh buïi. Hoa sau khi nôû chui xuoáng ñaát, keát quaû vaø thaønh cuû. Laïc sinh tröôûng nhieàu ôû vuøng nhieät ñôùi vaø moät soá vuøng oân ñôùi. Treân theá giôùi, nôi nhieàu laïc nhaát laø caùc nöôùc thuoäc chaâu Phi, AÁn Ñoä. Mieàn nam nöôùc Nga cuõng troàng nhieàu laïc. ÔÛ Vieät Nam, laïc hieän troàng nhieàu treân caùc löu vöïc soâng Hoàng, soâng Maõ, soâng Lam, moät soá huyeän thuoäc Haø Baéc vaø moät soá noâng tröôøng. Troàng laïc khoâng nhöõng laøm taêng ñoä maøu môõ cho ñaát khi caáy luùa (do taùc duïng cuûa vi sinh vaät coá ñònh ñaïm cuûa caùc noát saàn coù ôû reã laïc, laøm taêng chaát ñaïm cho ñaát) maø coøn cho nguyeân lieäu coù daàu thöïc vaät, cho nguoàn ñaïm thöïc vaät phuïc vuï cho nhu caàu nöôùc chaám cuûa nhaân daân (saûn xuaát nöôùc chaám töø khoâ laïc) vaø laø nguyeân lieäu xuaát khaåu coù giaù trò lôùn. Töø khoâ laïc coøn coù theå cheá bieán thaønh boät baùnh, boät dinh döôõng phaåm chaát toát, loaïi phaåm chaát keùm duøng laøm thöùc aên gia suùc. Thaønh phaàn hoùa hoïc cuûa haït laïc BAÛNG 2.1: Thaønh phaàn hoùa hoïc trung bình cuûa laïc nhaân [9] Thaønh phaàn hoùa hoïc Haøm löôïng (% toång khoái löôïng) Lipid 40-55 Protein (N x 6.25) 20-37.2 Cellulose 1.2-4.9 Chaát hoøa tan khoâng chöùa N 6-24.5 Chaát tro 1.8-4.6 BAÛNG 2.2: Thaønh phaàn hoùa hoïc cuûa haït laïc [18] Thaønh phaàn Haøm löôïng/100g laïc nhaân Carbohydrates 21g Ñöôøng 0.0 g Xô  9 g Chaát beùo 48 g Baõo hoaø 7 g Moät noái ñoâi 24 g Nhieàu noái ñoâi  16 g Protein 25 g Thiamin (Vit. B1)   0.6 mg Riboflavin (Vit. B2)   0.3 mg Niacin (Vit. B3)   12.9 mg Pantothenic acid (B5)   1.8 mg Vitamin B6   0.3 mg Folate (Vit. B9)   246 mg Vitamin C   0.0 mg Calcium   62 mg Iron   2 mg Magnesium   184 mg Phosphorus   336 mg Potassium   332 mg Zinc   3.3 mg Thaønh phaàn hoùa hoïc cuûa laïc coù theå thay ñoåi phuï thuoäc vaøo gioáng, vaøo söï bieán ñoäng cuûa caùc ñieàu kieän khí haäu giöõa caùc naêm. Caùc yeáu toá khoâng bình thöôøng nhö saâu, beänh cuõng aûnh höôûng ñeán thaønh phaàn hoùa hoïc cuûa laïc. Tröôùc ñaây, ngöôøi ta chæ chuù yù ñeán daàu trong haït laïc maø chöa chuù yù ñeán protein khaù cao trong haït vaø trong caùc boä phaän khaùc cuûa caây laïc. Tình traïng thieáu protein hieän nay treân theá giôùi ñoøi hoûi phaûi nghieân cöùu söû duïng toaøn dieän loaïi caây naøy. Protein: Protein thoâ trong haït laïc khaù cao, chuû yeáu do 2 globulin (arachin vaø conarachin) hôïp thaønh (95%). Conarachin hôn haún arachin veà dinh döôõng vaø coù haøm löôïng methionine nhieàu gaáp 3 laàn. Trong protein haït laïc coù 2/3 arachin vaø 1/3 conarachin. Haøm löôïng 4 loaïi acid amin laø Lys, Trp, Met, Thr trong laïc thaáp hôn so vôùi caùc loaïi protein khaùc (BAÛNG 2.3). BAÛNG 2.3: Caùc loaïi acid amin khoâng thay theá trong haït laïc [4] Acid amin Chæ tieâu lyù töôûng (g/16g N) Laïc (g/16g N) Lysine 4.2 3a Tryptophan 1.4 1a Phenylalanine 2.8 5.1 Methionine 2.2 1a Treonin 2.8 2.6a Leucine 4.8 6.7 Isoleusine 4.2 4.6 Valine 4.2 4.4 Lipid: Trong lipid cuûa haït laïc coù 2 loaïi acid beùo no vaø acid beùo khoâng no. Loaïi acid beùo khoâng no bao goàm: Acid oleic (50-70%); Acid linoleic (13-20%); Acid linolenoic (13-20%). Loaïi acid beùo khoâng no bao goàm: Acid palmitic(6-11%); Acid stearic (2-6%); Acid arachidic (5-7%). Vitamin: Laïc laø thöùc aên giaøu vitamin nhoùm B (ngoaïi tröø B12), nhö thiamin (B1), riboflavin (B2), acid pantotenin (B3), B6, acid nicotinic (PP). Giaù trò chính cuûa laïc laø giaøu vitamin PP (100g laïc ñuû cung caáp nhu caàu vitamin PP haøng ngaøy cho 1 ngöôøi lôùn). Nhö vaäy, laïc laø moät loaïi thöùc aên giaøu lipid, nhieàu protein vaø vitamin. Ngoaøi ra, laïc coøn coù höông thôm vaø muøi vò ñaëc bieät ñöôïc taïo neân bôûi ñöôøng vaø moät soá chaát höõu cô bay hôi. Toång quan veà khoâ laïc [2, 9] Khoâ laïc hay coøn goïi laø khoâ ñaäu phoäng laø baõ thu ñöôïc sau quaù trình eùp laïc ôû caùc nhaø maùy eùp daàu. Khoâ laïc coù haøm löôïng protein thoâ cao, chöùa khoaûng 35-50% hoaëc 5.5-17% protein (tuyø töøng loaïi khoâ daàu). Tröôùc ñaây, ngöôøi ta thöôøng söû duïng khoâ laïc laøm thöùc aên gia suùc. Nhöng hieän nay, caùc nhaø saûn xuaát ñaõ nhaän ra ñöôïc giaù trò dinh döôõng cao trong khoâ laïc vaø bieát caùch taän duïng nguoàn nguyeân lieäu reû tieàn naøy trong saûn xuaát nöôùc töông nhaèm ñem laïi hieäu quaû kinh teá cao. BAÛNG 2.4: Thaønh phaàn hoùa hoïc cuûa khoâ laïc [2] Thaønh phaàn Khoâ laïc Caû voû Nhaân Chaát khoâ (% toång khoái löôïng) 90 90 Protein thoâ (% toång khoái löôïng) 27.7 45.5 Lipid thoâ (% toång khoái löôïng) 10 8 Cellulose (% toång khoái löôïng) 24.4 4.8 BAÛNG 2.5: Haøm löôïng acid amin trong khoâ laïc [2] Acid amin Haøm löôïng (g/1 kg khoâ laïc) Tryptophan 3.6 Cystine 3.6 Arginine 34.4 Lysine 10 Methionine 2.7 BAÛNG 2.6: Haøm löôïng khoaùng trong khoâ laïc [2] Chaát khoaùng Haøm löôïng (g/1 kg khoâ laïc) Na 0.67 K 12.45 Ca 1.14 P 5.7 Tình hình saûn xuaát khoâ laïc ôû Vieät Nam Hieän taïi ôû Vieät Nam, nguoàn nguyeân lieäu khoâ laïc ñeå saûn xuaát nöôùc töông chuû yeáu ñöôïc nhaäp töø AÁn Ñoää. Baõ laïc sau khi ñaõ trích ly daàu seõ ñöôïc eùp thaønh baùnh goïi laø baùnh khoâ laïc. Baùnh khoâ laïc eùp thuû coâng coù haøm löôïng beùo khoaûng 5-8%. Trong khi ñoù, baùnh khoâ laïc eùp coâng nghieäp chæ coøn khoaûng 3-5% chaát beùo. Toång quan veà nöôùc töông [2, 8, 12, 13, 14, 15, 16, 17] Ñònh nghóa nöôùc töông Nöôùc töông laø moät loaïi nöôùc chaám duøng laøm gia vò coù haøm löôïng ñaïm vaø noàng ñoä muoái töông ñoái cao. Maëc duø coù nhieàu teân goïi khaùc nhau nhö xì daàu, taøu vò yeåu, Magi… nhöng chuùng ñeàu ñöôïc saûn xuaát chuû yeáu baèng 2 phöông phaùp leân men vaø hoùa giaûi nguoàn nguyeân lieäu giaøu ñaïm maø chuû yeáu laø caùc haït coù daàu. Nöôùc töông laø saûn phaåm thuûy phaân protein cuûa nguyeân lieäu giaøu ñaïm thaønh hoãn hôïp caùc acid amin vaø polypeptide hoøa tan. Taùc nhaân xuùc taùc laø enzym protease do naám moác Asperillus oryzae sinh toång hôïp ra. Beân caïnh ñoù, coøn coù quaù trình thuûy phaân tinh boät thaønh ñöôøng (glucose, maltose, dextrin…) döôùi taùc duïng cuûa enzym amylase cuõng do naám moác Asperillus oryzae sinh toång hôïp. Ngoaøi ra, do hoaït ñoäng cuûa moät soá vi sinh vaät taïo höông vaø nhöõng phaûn öùng hoùa hoïc xaûy ra döôùi söï tham gia cuûa caùc chaát ñöôïc hình thaønh trong quaù trình thuûy phaân laøm cho nöôùc töông coù höông vò ñaëc tröng. Giaù trò dinh döôõng cuûa nöôùc töông ñöôïc theå hieän qua thaønh phaàn hoùa hoïc, goàm coù protein, ñöôøng, acid höõu cô, chaát thôm, chaát maøu. Ta quan taâm ñaëc bieät ñeán protein trong nöôùc töông, caùc acid amin coù trong nöôùc töông seõ laøm cho nöôùc töông coù vò ngoït vaø muøi thôm cuûa thòt. Ñöôøng coù vai troø quan troïng trong vieäc hình thaønh maøu saéc cuûa nöôùc töông do phaûn öùng caramel hoùa vaø phaûn öùng Maillard giöõa ñöôøng khöû vaø acid amin. Caùc acid höõu cô coù khaû naêng tham gia taïo höông vò cho nöôùc töông. Nöôùc töông coù nguoàn goác xuaát phaùt töø Trung Quoác caùch ñaây haøng ngaøn naêm. Theo con ñöôøng phaät giaùo, nöôùc töông du nhaäp vaøo Nhaät Baûn vaøo khoaûng theá kæ thöù 7, ñöôïc bieán ñoåi vaø trôû thaønh moät saûn phaåm mang neùt ñaëc tröng rieâng cuûa ngöôøi Nhaät. Vaøo khoaûng theá kæ thöù 17, nöôùc töông ñaõ du nhaäp vaøo phöông Taây vaø daàn daàn trôû neân phoå bieán khaép theá giôùi vôùi nhieàu chuûng loaïi khaùc nhau. Hieän nay treân theá giôùi, nöôùc töông ñöôïc saûn xuaát chuû yeáu bôûi caùc nöôùc chaâu AÙ nhö: Trung Quoác, Malaysia, Thaùi lan, Nhaät Baûn… vaø trong ñoù coù Vieät Nam. Nöôùc töông ñöôïc saûn xuaát ôû caùc nöôùc khaùc nhau, thaäm chí ôû caùc vuøng khaùc nhau trong cuøng moät nöôùc cuõng coù nhöõng ñaëc ñieåm chaát löôïng khaùc nhau, theå hieän qua ñoä seät, maøu saéc vaø muøi vò. Nguyeân nhaân laø do coù söï khaùc nhau veà nguyeân lieäu ban ñaàu, tyû leä phoái troän giöõa caùc nguyeân lieäu… Ngoaøi ra coøn khaùc nhau veà chuûng vi sinh vaät söû duïng trong quaù trình leân men, thôøi gian leân men vaø cheá bieán sau leân men. Hieän nay caùc nöôùc coù caùc saûn phaåm nöôùc töông leân men nhö: kecap cuûa Indonesia, Ceiew cuûa Thaùi Lan, meju cuûa Haøn Quoác, shoyu cuûa Nhaät Baûn. Giôùi thieäu moät soá phöông phaùp saûn xuaát nöôùc töông Ñeå saûn xuaát nöôùc töông, ngöôøi ta söû duïng 2 phöông phaùp coâng ngheä chuû yeáu laø phöông phaùp leân men vaø phöông phaùp hoùa giaûi. Cô sôû khoa hoïc cuûa caùc phöông phaùp saûn xuaát nöôùc töông Cô sôû khoa hoïc cuûa phöông phaùp saûn xuaát nöôùc töông leân men laø lôïi duïng heä enzym cuûa vi sinh vaät phaùt trieån treân nguyeân lieäu giaøu ñaïm, nuoâi chuùng ñeå roài thuûy phaân protein coù trong nguyeân lieäu thaønh nöôùc töông. Do vaäy, trong quaù trình saûn xuaát, phaûi nuoâi vi sinh vaät cho toát ñeå taïo ra nhieàu enzym protease, naâng cao hieäu suaát thuûy phaân protein cuûa nguyeân lieäu, haï giaù thaønh saûn phaåm. Cô sôû khoa hoïc cuûa phöông phaùp saûn xuaát nöôùc töông hoùa giaûi laø duøng hoùa chaát ñeå thuûy phaân protein cuûa nguyeân lieäu thaønh nöôùc töông. Do vaäy, trong quaù trình thuûy phaân phaûi ñaûm baûo toát caùc ñieàu kieän nhieät ñoä, thôøi gian ñeå phaûn öùng tieán haønh trieät ñeå. Phöông phaùp hoùa giaûi: Quy trình coâng ngheä (HÌNH 2.2) Ñaây laø quy trình chuû yeáu ñeå saûn xuaát nöôùc töông coâng nghieäp töø tröôùc cho ñeán nay ôû nöôùc ta. Nguyeân lieäu saûn xuaát laø baõ ñaäu phoäng hoaëc baõ ñaäu naønh ñöôïc eùp thaønh baùnh, tröôùc khi saûn xuaát caàn nghieàn nhoû ñeán 2-3mm. Giai ñoaïn thuûy phaân söû duïng taùc nhaân thuûy phaân laø acid HCl coù noàng ñoä 6-10 N, nhieät ñoä 100-180oC vaø thôøi gian thuûy phaân töø 24-72 giôø. Dòch sau thuûy phaân ñöôïc theâm nöôùc noùng vaø soda (Na2CO3) ñeå trung hoaø löôïng acid dö. Qua giai ñoaïn naøy, dòch thuûy phaân seõ ñöôïc loïc boû phaàn baõ, chæ laáy nöôùc vaø ñem ñi thanh truøng. Thoâng soá cuûa quaù trình thanh truøng laø: nhieät ñoä 60-70oC trong 2-3 giôø hoaëc ñun ôû 90-100oC trong 15-20 phuùt nhaèm tieâu dieät vi sinh vaät coù trong dòch loïc. Caùc phuï gia baûo quaûn (nhö natri benzoat hoaëc acid benzoic) ñöôïc ñöa vaøo tröôùc khi thanh truøng. Höông lieäu, gia vò, phuï gia taïo maøu (caramel) ñöôïc theâm vaøo sau khi thanh truøng. Sau ñoù, nöôùc töông baùn thaønh phaåm ñöôïc laéng loïc laïi laàn thöù 2 nhaèm taùch trieät ñeå caùc caën gaây vaån ñuïc hay caùc thaønh phaàn lô löûng coù khaû naêng taïo caën trong quaù trình baûo quaûn. Saûn phaåm taïo ra laø nöôùc töông thaønh phaåm. HÌNH 2.2: Quy trình coâng ngheä saûn xuaát nöôùc töông hoùa giaûi Öu ñieåm cuûa phöông phaùp hoùa giaûi: Reû vaø nhanh. Thôøi gian cuûa quy trình saûn xuaát ngaén. Hieäu suaát thuûy phaân protein cao. Saûn phaåm taïo ra giaøu acid amin. Muøi vò nöôùc töông phuø hôïp vôùi thò hieáu cuûa ngöôøi tieâu duøng taïi Vieät Nam hieän nay. Nhöôïc ñieåm cuûa phöông phaùp hoùa giaûi: Chi phí naêng löôïng vaø thieát bò cao do thieát bò phaûi chòu nhieät vaø chòu aên moøn. Vieäc söû duïng HCl ñaëc ñoäc haïi vaø gaây oâ nhieãm moâi tröôøng. Do nhieät ñoä cao vaø noàng ñoä acid ñaëc neân moät soá acid amin bò phaù huûy trong quaù trình thuûy phaân. Caùc acid amin chöùa S bò maát 10-30%. Caùc acid amin chöùa nhoùm –OH bò phaân huûy moät phaàn. Trp bò phaân huûy hoaøn toaøn vaø Thr, Ser, Met, Cys bò phaân huûy moät phaàn. Khi noàng ñoä HCl cao vaø nhieät ñoä cao thöôøng xaûy ra phaûn öùng giöõa Cl- hoaëc HCl vôùi glycerol coù trong chaát beùo, sinh ñoäc toá 3-MCPD. Phöông phaùp leân men Quy trình coâng ngheä (HÌNH 2.3) Thuyeát minh quy trình coâng ngheä Nghieàn: Muïc ñích: Chuaån bò cho quaù trình phoái troän vaø haáp. Baùnh daàu laïc ñöôïc nghieàn nhoû ñeå khi phoái troän, nöôùc thaám ñeàu hôn, khi haáp, nguyeân lieäu chín ñeàu hôn, traùnh hieän töôïng “trong soáng ngoaøi chín”. Ngoaøi ra, nghieàn coøn nhaèm muïc ñích taêng dieän tích phaùt trieån cuûa naám moác vaø khaû naêng xuùc taùc cuûa enzyme khi thuûy phaân. Kích thöôùc thích hôïp cuûa nguyeân lieäu sau nghieàn 0,5 – 1 mm.  Boät mì Baùnh daàu Nghieàn Phoái troän Haáp Caáy gioáng Nuoâi moác Loïc laàn 1 Phoái troän Thanh truøng Roùt chai Nöôùc Moác gioáng Nöôùc muoái Baõ Trích ly Loïc laàn 2 Baõ Chai Nöôùc töông Thuûy phaân Nöôùc muoái Ñieàu höông – Ñieàu vò Laéng Höông, vò Caën Nöôùc muoái HÌNH 2.3: Quy trình coâng ngheä saûn xuaát nöôùc töông leân men Phoái troän nguyeân lieäu: Muïc ñích: Chuaån bò cho quaù trình haáp vaø nuoâi moác. Khoâ laïc, boät mì, nöôùc ñöôïc phaân boá ñeàu trong hoãn hôïp. Boät mì laø nguoàn tinh boät cho naám moác söû duïng laøm nguoàn thöùc aên ñeå sinh tröôûng vaø phaùt trieån. Nöôùc coù taùc duïng laøm cho nguyeân lieäu coù ñoä aåm thích hôïp cho söï phaùt trieån cuûa naám moác. Haáp: Muïc ñích: Chuaån bò chaát dinh döôõng cung caáp cho quaù trình nuoâi moác. Haáp laøm chín tinh boät, laøm protein bò bieán tính. Ñaây laø nguoàn thöùc aên cho naám moác phaùt trieån. Ñoàng thôøi, haáp coøn tieâu dieät vi sinh vaät baùm treân nguyeân lieäu, laøm cho moác phaùt trieån thuaän lôïi. Caáy gioáng: Muïc ñích: Chuaån bò cho quaù trình nuoâi moác. Nguoàn moác gioáng seõ ñöôïc troän ñeàu trong nguyeân lieäu. Nuoâi moác: Muïc ñích: Khai thaùc - Taïo ñieàu kieän cho naám moác phaùt trieån ñeàu treân moâi tröôøng nuoâi caáy ñeå hình thaønh caùc heä enzyme caàn thieát (ñaëc bieät laø enzyme protease vaø amylase) coù hoaït löïc cao, coù khaû naêng thuûy phaân protein vaø tinh boät ñaït hieäu suaát cao. Thuûy phaân: Muïc ñích: Cheá bieán - Taïo pH thích hôïp cho enzyme protease vaø amylase cuûa naám moác hoaït ñoäng, quaù trình thuûy phaân laøm bieán ñoåi saâu saéc thaønh phaàn nguyeân lieäu theo höôùng taïo ra saûn phaåm laø nöôùc töông. Loïc: Muïc ñích: Khai thaùc - Loaïi boû khoâ laïc ñeå thu ñöôïc nöôùc töông thaønh phaåm. Trích ly baõ loïc: Muïc ñích: Khai thaùc - Trích ly phaàn nöôùc töông coøn soùt laïi trong khoâ laïc sau khi qua quaù trình loïc. Phoái troän nöôùc töông: Muïc ñích: Hoaøn thieän - Taïo ra caùc saûn phaåm nöôùc töông vôùi chaát löôïng khaùc nhau phuï thuoäc vaøo tæ leä phoái troän. Thanh truøng: Muïc ñích: Baûo quaûn - Tieâu dieät vi sinh vaät, keùo daøi thôøi gian baûo quaûn saûn phaåm. Thoâng soá kyõ thuaät: Nhieät ñoä thanh truøng: 70 – 800C hoaëc 90-100oC Thôøi gian thanh truøng: 0,5 – 1 giôø hoaëc 15-20 phuùt Ñieàu höông – ñieàu vò: Muïc ñích: Hoaøn thieän - Taïo höông vò thôm ngon cho nöôùc töông thaønh phaåm. Laéng: Muïc ñích: Hoaøn thieän - Taùch caùc chaát khoâng tan ra khoûi nöôùc töông thaønh phaåm. Roùt chai: Muïc ñích: Baûo quaûn: Traùnh söï tieáp xuùc cuûa saûn phaåm vôùi moâi tröôøng beân ngoaøi Hoaøn thieän: Taïo saûn phaåm coù hình daïng, maãu maõ ñeïp, thu huùt ngöôøi tieâu duøng. Ñaëc ñieåm cuûa phöông phaùp leân men laø: Nöôùc töông ñöôïc saûn xuaát baèng phöông phaùp leân men do khoâng coù phaûn öùng sinh ra Glycerin vaø khoâng söû duïng axit HCl neân khoâng taïo thaønh 3-MCPD. Tuy nhieân, thôøi gian saûn xuaát nöôùc töông baèng phöông phaùp leân men keùo daøi, hieäu suaát thuûy phaân thaáp vaø muøi vò khaùc so vôùi phöông phaùp hoùa giaûi. Tieâu chuaån chaát löôïng cuûa nöôùc töông Ngöôøi ta xem nöôùc töông laø moät loaïi nöôùc chaám gia vò thöïc phaåm, neân chaát löôïng cuûa nöôùc töông ñöôïc ñaùnh giaù thoâng qua tieâu chuaån cuûa nöôùc chaám theo 3 nhoùm chæ tieâu: Thaønh phaàn hoùa hoïc Veà thaønh phaàn hoùa hoïc, ngöôøi ta ñaùnh giaù nöôùc chaám theo caùc chæ tieâu: haøm löôïng acid (giaù trò pH), haøm löôïng N toång, haøm löôïng N amin, haøm löôïng N ammoniac, muoái aên. BAÛNG 2.7: Chæ tieâu hoùa hoïc cuûa nöôùc chaám ( TCVN 1763-75) Teân chæ tieâu Möùc (g/l) Loaïi ñaëc bieät Loaïi 1 Loaïi 2 Haøm löôïng Nitô toång, khoâng nhoû hôn 20 16 12 Haøm löôïng Nitô ammoniac, khoâng lôùn hôn 3,0 2,5 2,0 Haøm löôïng Nitô formol, khoâng nhoû hôn 10 8 6 Haøm löôïng acid ( tính baèng ml NaOH 0.1N duøng ñeå trung hoaø 1ml maãu), khoâng lôùn hôn 1.8 1.6 1.3 Haøm löôïng NaCl 230 – 250 Chæ tieâu vi sinh Vi sinh vaät coù 2 nhoùm: nhoùm laøm hö hoûng saûn phaåm (vi khuaån hieáu khí, naám men, naám moác) vaø nhoùm vi khuaån gaây beänh (E.coli…) Chæ tieâu vi sinh vaät vaø ñoäc toá cuûa nöôùc töông (TCVN1763-86) Khoâng coù naám moác nhìn thaáy baèng maét thöôøng Toång vi khuaån hieáu khí, khoâng lôùn hôn: 20.000 cfu/ml Clostridium perfringens, khoâng lôùn hôn 2 cfu/ml E.coli : khoâng ñöôïc coù Vi khuaån gaây beänh: khoâng ñöôïc coù Aflatoxin: khoâng ñöôïc coù Chæ tieâu caûm quan Nöôùc töông phaûi coù maøu töø naâu nhaït ñeán naâu, khoâng coù vaùng, khoâng coù caën baõ. Trong suoát, coù muøi thôm ñaëc tröng, vò ngoït vaø maën dòu, khoâng gaét coå. Sau ñaây chuùng toâi xin giôùi thieäu vaên baûn qui ñònh tieâu chuaån chaát löôïng cuûa nöôùc chaám theo TCVN 1763-75. BAÛNG 2.8: Chæ tieâu caûm quan cuûa nöôùc chaám ( TCVN 1763-75) Teân chæ tieâu Yeâu caàu Maøu saéc Maøu naâu caùnh giaùn Muøi Thôm ñaëc tröng cuûa nöôùc chaám leân men, khoâng coù muøi moác, khoâng coù muøi laï khaùc Vò Ngoït ñaäm (ñoái vôùi loaïi ñaëc bieät) Ngoït dòu (ñoái vôùi loaïi 1, loaïi 2), khoâng coù vò chua, vò laï Ñoä trong Trong, khoâng vaån ñuïc Vi sinh vaät duøng trong saûn xuaát nöôùc töông leân men Vi sinh vaät trong saûn xuaát nöôùc töông seõ chuyeån hoùa nhöõng protein phöùc taïp, tinh boät cuûa nguyeân lieäu thaønh acid amin, ñöôøng ñôn raát deã ñöôïc cô theå haáp thu. Ngoaøi ra, vi sinh vaät coøn taïo ra muøi vò ñaëc tröng cho töøng saûn phaåm nöôùc töông khaùc nhau. Ñoái vôùi töøng quoác gia, vieäc söû duïng vi sinh vaät ñeå saûn xuaát nöôùc töông cuõng coù moät soá ñieåm khaùc bieät. Döôùi ñaây laø baûng caùc loaøi vi sinh vaät duøng trong saûn xuaát nöôùc töông cuûa moät soá quoác gia Chaâu AÙ (BAÛNG 2.9). Trong phöông phaùp coå truyeàn, ngöôøi ta thöôøng duøng vi sinh vaät coù saün trong töï nhieân, caùc loaïi naám moác thöôøng gaëp laø Mucor rouxii, Rhizopus nignicans, Asp. oryzae… Tuy nhieân, neáu duøng naám moác töï nhieân nhö vaäy seõ raát khoù kieåm soaùt ñöôïc chaát löôïng cuûa saûn phaåm vaø coù theå sinh ra ñoäc toá do moät soá vi sinh vaät khoâng mong muoán. Vì vaäy, muoán ñöa nöôùc chaám vaøo saûn xuaát coâng nghieäp, ñieàu kieän tröôùc tieân laø phaûi coù gioáng thuaàn khieát vì noù quyeát ñònh höông vò, hieäu suaát vaø chaát löôïng saûn phaåm vaø laø ñieàu kieän cô baûn ñeå oån ñònh saûn xuaát, khoâng bò ñoäng cho saûn xuaát. BAÛNG 2.9: Caùc loaøi vi sinh vaät duøng trong saûn xuaát nöôùc töông ôû caùc nöôùc [13] STT Teân quoác gia Teân goïi loaïi nöôùc töông Vi sinh vaät söû duïng 1 Trieàu Tieân Kanjang Aspergillus oryzae Bacillus subtilis Bacillus pumillus Bacillus citreus Sarcina maxima Saccharomyces rouxii 2 Indonesia Kecap asin Kecap manis Rhizopus oligoporus Rhizopus oryzae Aspergillus oryzae 3 Malaysia Kicap kacang soya Aspergillus oryzae Pediococcus halophilus Pediococcus soyae Bacillus sp Bacillus licheniformis Pichia sp Candida sp 4 Trung Quoác Si yau Aspergillus oryzae Aspergillus sojae Aspergillus terriol 5 Vieät Nam Xì daàu, nöôùc töông Aspergillus oryzae 6 Philipine Toyo Aspergillus oryzae Hasinula anomala Hasinula sugelliculosa Lactobacillus delbrueckii 7 Singapore Soya sauce Aspergillus oryzae Sacchrosemyces sp Lactobacillus sp 8 Thaùi Lan Ce Iew Pediococcus halophilus Staphilococcus sp Bacillus sp Aspergillus oryzae 9 Nhaät Baûn Koikuchi shoyu Saichikomi shoyu Shiro shoyu Tamari shoyu Usukuchi shoyu Aspergillus oryzae Zygosaccharomyces rouxii Candida versatilis Candida etchellsii Lactobacillus delbrueckii Pediococcus halophilus Streptococcus faecalis Bacillus sp Saccharomyces halomebransis Töông töï Koikuchi shoyu Töông töï Koikuchi shoyu Töông töï Koikuchi shoyu Töông töï Koikuchi shoyu Gioáng ñöa vaøo saûn xuaát phaûi coù caùc ñieàu kieän sau: Hoaït löïc protease cao. AÛnh höôûng toát ñoái vôùi höông cuûa saûn phaåm. Khaû naêng phaùt trieån maïnh vaø choáng taïp khuaån toát Khoâng sinh ñoäc toá (Aflatoxin). Aflatoxin laø ñoäc toá gaây beänh ung thö, ñöôïc sinh ra bôûi Asp. parasiticus NRRL 2999. Ñoäc toá naøy raát beàn trong suoát quaù trình leân men nöôùc töông. Asp. oryzae, maëc duø khoâng sinh ñoäc toá naøy nhöng khoù coù theå phaân bieät ñöôïc Asp. oryzae vôùi Asp. flavus hay Asp. parasiticus vì chuùng ñeàu phaân boá roäng raõi vaø deã phaùt trieån trong canh tröôøng leân men khoâng thuaàn khieát. Trong khuoân khoå cuûa luaän vaên naøy, chuùng toâi chæ giôùi thieäu ñaëc tính cuûa loaøi vi sinh vaät phoå bieán trong saûn xuaát nöôùc töông laø naám moác Asp. oryzae coù maøu vaøng neân ta thöôøng goïi laø moác vaøng. Giôùi thieäu veà loaøi Aspergillus oryzae: Ñaëc ñieåm hình thaùi cuûa Aspergillus oryzae HÌNH 2.4: Aspergillus oryzae Aspergillus oryzae laø loaïi naám moác vi theå, thuoäc boä Plectascales, lôùp Ascomycetes (nang khuaån), cô theå sinh tröôûng laø moät heä sôïi, bao goàm nhöõng sôïi raát maûnh, chieàu ngang 5-7mm, phaân nhaùnh raát nhieàu vaø coù vaùch ngang, chia sôïi thaønh nhieàu teá baøo (naám ña baøo). Töø nhöõng sôïi naèm ngang naøy, hình thaønh nhöõng sôïi thaúng ñöùng goïi laø cuoáng ñính baøo töû, ôû ñaàu cô quan sinh saûn voâ tính. Ñaëc ñieåm nhaän dieän khuaån laïc Aspergillus oryzae: khuaån laïc phaùt trieån raát nhanh, coù maøu saéc thay ñoåi töø maøu vaøng luïc nhaït, maøu vaøng oâ liu ñeán maøu xanh luïc, moät vaøi daïng coù maøu naâu toái tuøy theo tuoåi vaø cuoái cuøng laø maøu vaøng naâu. Caùc khuaån ty luùc môùi moïc coù maøu traéng xaùm vaø khi phaùt trieån coù maøu xanh lôït laãn ít maøu vaøng. Khoái moác thöôøng thaáy coù maøu vaøng hoa cau, ñaây chính laø maøu cuûa ñính baøo töû. Môùi ñaàu, baøo töû hình elip, roài thay ñoåi daàn daàn ñeán hình caàu, nhaün hoaëc xuø xì khoâng ñeàu. Quan saùt döôùi kính hieån vi ta thaáy, ñaàu cuûa baøo töû ñính toûa ra, ñöôøng kính 150-300 mm. Chaân cuoáng baøo töû ñính trong suoát, daøi 4-5mm. Tuùi ñính coù daïng baàu duïc hay baùn baàu duïc, ít khi coù hình caàu, coù ñöôøng kính 75 mm. Caùc baøo töû ñính coù daïng caàu hoaëc hình oval coù tia, kích thöôùc khoâng gioáng nhau duø ñöôïc caáy trong moät moâi tröôøng. Baøo töû daøi hình chuoãi ñôn hoaëc keùp goàm coù 2 haøng naèm choàng leân nhau. Ñieàu kieän sinh tröôûng cuûa Asperillus oryzae [2]: Moâi tröôøng coù ñoä aåm 45% laø ñieàu kieän thích hôïp nhaát cho söï hình thaønh baøo töû ñeå laøm gioáng, coøn ñoä aåm thích hôïp ñeå sinh toång hôïp enzym laø 55-60%. pH moâi tröôøng laø 5,5-5,6. Ñoä aåm cuûa khoâng khí laø 85-95%. Asperillus oryzae laø loaïi naám hoaøn toaøn hieáu khí, khi coù ñuû oxi thì phaùt trieån raát maïnh. Theo thöïc teá saûn xuaát, 1kg moâi tröôøng khi nuoâi caáy moác trung bình caàn töø 1,7-1,9 m3 khoâng khí (aùp suaát 1atm, nhieät ñoä nuoâi caáy töø 27-300C). Thôøi gian: Khi nuoâi moác laøm gioáng, ñoøi hoûi thôøi gian 60-70 giôø, luùc ñoù baøo töû môùi hình thaønh ñaày ñuû, coøn nuoâi moác ñeå coù enzym amylase cöïc ñaïi laø 30-36 giôø, protease cöïc ñaïi laø 36-42 giôø, moät soá chuûng cuûa loaïi naøy cho 2 enzym cöïc ñaïi laø 30 vaø 60 giôø. Loaøi naám moác Asperillus oryzae cho ra 3 loaïi enzym chính laø amylase, protease vaø caùc enzym oxy hoùa khöû nhö glucooxydase. Heä enzyme trong saûn xuaát nöôùc töông leân men Naám moác Asp. oryzae coù khaû naêng saûn xuaát ra moät heä enzym raát phöùc taïp. Tuy nhieân, khoâng phaûi taát caû caùc chuûng thuoäc loaøi Asp. oryzae ñeàu coù khaû naêng sinh toång hôïp moät phöùc heä enzym nhö nhau. Vì vaäy, ñeå coù ñöôïc chuûng thích hôïp öùng duïng cho töøng muïc ñích saûn xuaát laø caû moät vaán ñeà khoù khaên, phöùc taïp vaø laâu daøi. Ñoái vôùi saûn xuaát nöôùc töông thì protease vaø amylase laø hai enzym ñoùng vai troø quan troïng nhaát. Cô cheá sinh toång hôïp enzym cuûa vi sinh vaät [1, 6, 10] Saûn xuaát enzym laø moät daïng ñaëc bieät cuûa saûn xuaát protein. Toång hôïp caùc enzym ngoaïi baøo phuï thuoäc raát nhieàu vaøo cô chaát. Tuy nhieân, cô cheá cuûa söï tieát enzym naøy coøn chöa ñöôïc nghieân cöùu chi tieát. Vi sinh vaät coù khaû naêng töï “cheá bieán” chaát dinh döôõng cho mình nhôø heä enzym cuûa chính chuùng. Tuy nhieân, trong moâi tröôøng khoâng phaûi luùc naøo cuõng coù saün caùc chaát dinh döôõng deã tieâu hoùa, coøn raát nhieàu loaïi chaát maø vi sinh vaät phaûi töï bieán ñoåi ñeå chuùng chuyeån thaønh nhöõng chaát coù kích thöôùc nhoû hôn hoaëc nhöõng chaát coù caáu taïo phaân töû nhoû hôn, deã daøng ñi qua maøng teá baøo ñeå haáp thu. Ñeå laøm ñöôïc ñieàu naøy thì vi sinh vaät phaûi töï toång hôïp caùc enzym ôû trong teá baøo vaø sau ñoù, caùc enzym naøy phaûi ra khoûi teá baøo vaø thöïc hieän caùc phaûn öùng phaân giaûi ngoaøi teá baøo. Caùc enzym ñöôïc toång hôïp trong teá baøo vaø thöïc hieän phaûn öùng ngoaøi teá baøo ñöôïc goïi laø enzym ngoaïi baøo. Quaù trình dò hoùa ngoaøi teá baøo vi sinh vaät xaûy ra trong tröôøng hôïp cô chaát coù kích thöôùc lôùn. Muoán tieâu hoùa ñöôïc cô chaát naøy, vi sinh vaät phaûi phaân huûy chuùng thaønh caùc chaát coù kích thöôùc nhoû hôn, ñuû ñeå coù theå xaâm nhaäp ñöôïc vaøo trong teá baøo thoâng qua thaønh vaø maøng teá baøo. Nhö vaäy, khi coù maët cuûa cô chaát, teá baøo seõ toång hôïp enzym töông öùng. Cô cheá naøy goïi laø cô cheá caûm öùng. Cô cheá caûm öùng chæ coù theå xaûy ra khi coù maët cuûa cô chaát. Khi ñoù, chính cô chaát laøm chaát kích thích ñeå taïo ra enzym töông öùng, thöïc hieän caùc phaûn öùng phaân giaûi. Cô cheá naøy xaûy ra thöôøng xuyeân ôû vi sinh vaät. Cô cheá caûm öùng ít khi hoaëc khoâng xaûy ra ôû caùc teá baøo sinh vaät ña baøo. Chaát kích thích quaù trình sinh toång hôïp enzym goïi laø chaát caûm öùng. Enzym ñöôïc taïo ra töø cô cheá naøy ñöôïc goïi laø enzym caûm öùng. Cô cheá caûm öùng coù yù nghóa raát lôùn trong quaù trình phaùt trieån cuûa vi sinh vaät vì ñaëc ñieåm töï “cheá bieán” chaát dinh döôõng ôû vi sinh vaät gaén lieàn vôùi söï taïo thaønh cuûa enzym caûm öùng. Protease vaø amylase laø hai enzym caûm öùng ñöôïc taïo ra bôûi Asp. oryzae trong saûn xuaát nöôùc töông leân men. Ngöôïc laïi vôùi quaù trình sinh toång hôïp caûm öùng enzym chính laø hieän töôïng kìm haõm toång hôïp caûm öùng enzym. Hieän töôïng naøy xaûy ra khi nhöõng saûn phaåm cuoái cuûa quaù trình chuyeån hoùa taêng tôùi möùc quaù thöøa thì chính saûn phaåm naøy kìm haõm söï toång hôïp enzym caûm öùng. Chaát kìm haõm taùc ñoäng vaøo heä gen toång hôïp caùc enzym cuûa quaù trình phaûn öùng, laøm ngöng saûn xuaát toaøn boä caùc enzym cuûa quaù trình. Caùc yeáu toá aûnh höôûng tôùi sinh toång hôïp enzym [1, 6, 10] Asp. oryzae coù theå sinh toång hôïp nhieàu loaïi enzyme khaùc nhau, nhöng trong saûn xuaát nöôùc töông söû duïng chuû yeáu laø amylase vaø protease. Ñaây laø loaïi naám moác coù khaû naêng sinh toång hôïp protease ngoaïi baøo maïnh meõ nhaát. Tuy nhieân, löôïng protease ñöôïc sinh toång hôïp coøn phuï thuoäc vaøo chuûng vi sinh vaät, thaønh phaàn moâi tröôøng, ñieàu kieän nuoâi caáy vaø thôøi gian nuoâi caáy. Tuyeån löïa vaø choïn gioáng caùc chuûng vi sinh vaät coù hoaït löïc enzym cao: Khoâng phaûi taát caû moïi vi sinh vaät ñeàu coù khaû naêng sinh toång hôïp enzym nhö nhau. Ngay caû nhöõng chuûng cuøng gioáng, cuøng loaøi cuõng coù theå khaùc nhau veà löôïng enzym do chuùng saûn sinh ra. Vì vaäy, vieäc tuyeån choïn vi sinh vaät taïo enzym nhieàu khi caàn phaûi luoân luoân keát hôïp chaët cheõ vôùi söï kieåm tra hoaït löïc cuûa haøng chuïc, haøng traêm chuûng vi sinh vaät ñeå tìm ra chuûng coù khaû naêng sinh toång hôïp enzym ñaõ cho cao nhaát. Thaønh phaàn moâi tröôøng dinh döôõng: Chuùng ta coù theå ñieàu khieån sinh toång hôïp enzym caàn thieát baèng caùch choïn moâi tröôøng dinh döôõng coù thaønh phaàn ñònh tính vaø ñònh löôïng phuø hôïp nhaát. Nguoàn carbon: Nguoàn carbon duøng nuoâi caáy vi sinh vaät laø caùc glucide: monosaccharide, disaccharide vaø tinh boät. Trong ñoù, fructose, saccharose, maltose laø nguoàn carbon toát nhaát ñeå sinh toång hôïp protease. Tinh boät cuõng laø nguoàn carbon toát ñoái vôùi moät soá chuûng vi sinh vaät nhaát ñònh. Ngoaøi glucide, ta cuõng coù theå duøng caùc nguoàn carbon khaùc nhö: daàu môõ, acid höõu cô, röôïu… Ñoái vôùi Asp. oryzae, caùc nguoàn carbon coù taùc duïng toát ñeán sinh toång hôïp protease ñöôïc saép xeáp theo thöù töï giaûm daàn nhö sau: fructose, saccharose, maltose, glucose, arabinose, galactose, lactose. Nguoàn nitô: Caùc chaát duøng laøm nguoàn nitô trong moâi tröôøng nuoâi caáy vi sinh vaät coù theå laø caùc chaát höõu cô (protein vaø caùc saûn phaåm thuûy phaân cuûa chuùng) hoaëc caùc muoái voâ cô (muoái amon, nitrat). Nöôùc chieát ngoâ, boät ñaäu naønh, boät mì, dòch thuûy phaân, casein… raát giaøu caùc hôïp chaát N. Caùc nguoàn N höõu cô vôùi haøm löôïng acid amin töï do töông ñoái thaáp thöôøng coù aûnh höôûng toát ñeán quaù trình sinh toång hôïp protease vì chuùng coù vai troø nhö chaát caûm öùng cuûa quaù trình naøy. Haøm löôïng N trong moâi tröôøng coù aûnh höôûng roõ reät ñeán quaù trình sinh toång hôïp protease. Ngoaøi ra, ñeå ñaûm baûo toång hôïp ñöôïc nhieàu protease, ta choïn tæ leä C:N thích hôïp. Theo moät soá nhaø khoa hoïc thì khi haøm löôïng C taêng quaù noàng ñoä toái thích thì khoâng aûnh höôûng ñeán quaù trình sinh toång hôïp protease. Tuy nhieân, neáu taêng löôïng N quaù noàng ñoä thích hôïp seõ kìm haõm quaù trình sinh toång hôïp protease [6]. Trong saûn xuaát protease, ngöôøi ta coù theå duøng moät soá cô chaát töï nhieân laøm nguoàn C, nguoàn N vaø nhöõng nguyeân toá khoaùng nhö boät mì ñen, boät ñaäu naønh, caùm mì, caùm ngoâ… Tæ leä C:N thích hôïp ñeå toång hôïp protease ñoái vôùi Asp. oryzae laø töø 8:1-2:1 Chaát caûm öùng: Trong tröôøng hôïp nuoâi caáy vi sinh vaät sinh toång hôïp protease, moâi tröôøng caàn phaûi coù chaát caûm öùng laø caùc nguoàn N höõu cô. Nhieàu loaøi naám moác khaùc nhau nhö Asp. oryzae, Asp. awamori, Asp. niger, Asp. flavus… treân moâi tröôøng coù caùc nguoàn N höõu cô, sinh toång hôïp protease coù hoaït löïc raát cao. Nhieàu nghieân cöùu cho thaáy, quaù trình sinh toång hôïp protease dieãn ra maïnh meõ treân moâi tröôøng chöùa caùm mì, boät ñaäu töông ñaõ taùch beùo vaø moät ít nguoàn N voâ cô. Ñieàu kieän nuoâi caáy: Nhieät ñoä: Moãi loaøi vi sinh vaät thöôøng coù moät nhieät ñoä toái thích cho quaù trình sinh tröôûng cuõng nhö sinh toång hôïp protease. Nhöõng nghieân cöùu môùi ñaây cho thaáy, ña soá caùc loaøi naám moác phaùt trieån thích hôïp trong khoaûng nhieät ñoä 22-32oC. Neáu nhieät ñoä cao hôn hoaëc thaáp hôn seõ kìm haõm quaù trình phaùt trieån vaø toång hôïp protease. Nhieät ñoä cao, caùc enzyme bò bieán tính do enzyme coù baûn chaát laø protein. Nhöng ñieàu kieän naøy coøn phuï thuoäc vaøo loaïi enzyme maø vi sinh vaät toång hôïp. Ñoä aåm moâi tröôøng: Coù aûnh höôûng ñaùng keå ñeán sinh tröôûng vaø sinh toång hôïp protease khi nuoâi caáy naám moác baèng phöông phaùp beà maët. Thoâng thöôøng, ñoä aåm thích hôïp cho ña soá caùc loaøi naám moác phaùt trieån treân khay hôû laø töø 58-60%. Neáu ñoä aåm quaù cao, ta khoù thoâng khí moâi tröôøng, coøn neáu quaù thaáp thì moâi tröôøng seõ khoâ nhanh, naám moác sinh baøo töû maïnh vaø laøm giaûm hoaït tính protease taïo thaønh. Trong quaù trình nuoâi caáy, ta neân giöõ ñoä aåm moâi tröôøng oån ñònh baèng caùch duy trì ñoä aåm cuûa khoâng khí ñöôïc naïp qua moâi tröôøng vôùi muïc ñích cung caáp oxy cho naám moác phaùt trieån. Thôøi gian nuoâi caáy: Thoâng thöôøng, löôïng enzyme ñöôïc sinh toång hôïp nhieàu nhaát trong moâi tröôøng khi naám moác chuaån bò sinh baøo töû. Thôøi gian nuoâi caáy coøn phuï thuoäc vaøo töøng chuûng naám moác vaø caùc ñieàu kieän nuoâi caáy naám moác. Ñoä thoaùng khí: Caùc loaøi naám moác laø nhöõng vi sinh vaät hieáu khí neân ñoä thoaùng khí cuûa moâi tröôøng nuoâi caáy coù aûnh höôûng ñeán quaù trình sinh toång hôïp protease. Thoâng thöôøng, ñeå laøm taêng ñoä thoaùng khí trong moâi tröôøng, ngöôøi ta thöôøng thoåi khoâng khí voâ truøng qua canh tröôøng hoaëc qua boä phaän khuaáy ñaûo. Toác ñoä ñaûo troän caøng lôùn thì moâi tröôøng baõo hoøa oxy nhieàu hôn. Ñoä thoaùng khí coù theå ñaùnh giaù döïa vaøo löôïng oxy hoøa tan trong moâi tröôøng. pH cuûa moâi tröôøng: Theo moät soá nghieân cöùu, pH moâi tröôøng aûnh höôûng ñeán tæ leä caùc protease ñöôïc toång hôïp neân. Do ñoù, neáu giöõ cho pH luoân coù moät giaù trò oån ñònh trong suoát quaù trình nuoâi caáy, vi sinh vaät seõ coù khuynh höôùng sinh toång hôïp moät daïng protease xaùc ñònh. Vì vaäy, loaïi protease naøy seõ chieám öu theá trong moâi tröôøng. Khi duøng phöông phaùp beà maët, pH moâi tröôøng ít aûnh höôûng ñeán quaù trình toång hôïp enzym cuûa vi sinh vaät vì pH haàu nhö khoâng ñoåi trong suoát quaù trình phaùt trieån cuûa vi sinh vaät. Trong khi theo phöông phaùp beà saâu, pH aûnh höôûng raát lôùn, nhieàu khi ñoùng vai troø quyeát ñònh ñeán söï tích luõy protease [6, 10]. Kyõ thuaät nuoâi caáy beà maët Moâi tröôøng ñöôïc traûi ñeàu ra caùc khay vôùi chieàu daøy 2-3 cm vaø tieán haønh troän gioáng vi sinh vaät vaøo khoái moâi tröôøng sao cho thaät ñeàu. Gioáng vi sinh vaät thöôøng ñöôïc nuoâi caáy rieâng ôû phoøng thí nghieäm hay caùc phaân xöôûng nhaân gioáng hoaëc laø caùc gioáng thöông phaåm. Caùc loaïi gioáng naøy thöôøng chöùa nhieàu baøo töû. Khi caáy vaøo moâi tröôøng dinh döôõng, chuùng seõ phaùt trieån thaønh teá baøo vi sinh vaät vaø taïo ra caùc loaïi enzym maø ta mong muoán. Sau khi troän gioáng, caùc khay chöùa moâi tröôøng seõ ñöôïc ñöa vaøo phoøng nuoâi caáy, ñaët treân caùc giaù ñôõ. Caùc giaù ñôõ naøy ñöôïc thieát keá sao cho löôïng khoâng khí ñöôïc löu thoâng thöôøng xuyeân. Phoøng nuoâi caáy phaûi coù heä thoáng ñieàu chænh nhieät ñoä vaø ñoä aåm khoâng khí. Nhieät ñoä thích hôïp cho ñaïi ña soá naám sôïi laø 28-32oC. Nhieät ñoä thaáp quaù hoaëc cao quaù ñeàu khoâng coù lôïi cho söï phaùt trieån cuûa naám sôïi. Thôøi gian nuoâi naám sôïi ñeå thu nhaän enzym vaøo khoaûng 36-60 giôø. Ñieàu naøy coøn phuï thuoäc vaøo gioáng vi sinh vaät vaø vaøo ñieàu kieän moâi tröôøng cuõng nhö phuï thuoäc vaøo ñieàu kieän nuoâi caáy. Quaù trình phaùt trieån cuûa naám moác trong moâi tröôøng baùn raén khi nuoâi baèng phöông phaùp beà maët coù theå traûi qua caùc giai ñoaïn sau: Giai ñoaïn 1: Giai ñoaïn naøy keùo daøi 10-14 giôø keå töø thôøi gian baét ñaàu nuoâi caáy. ÔÛ giai ñoaïn naøy coù nhöõng thay ñoåi sau: Nhieät ñoä taêng raát chaäm Sôïi naám baét ñaàu hình thaønh vaø coù maøu traéng hoaëc traéng söõa Thaønh phaàn dinh döôõng baét ñaàu coù söï thay ñoåi. Khoái moâi tröôøng coøn rôøi raïc. Enzym môùi baét ñaàu hình thaønh. Trong giai ñoaïn naøy phaûi ñaëc bieät quan taâm ñeán cheá ñoä nhieät. Tuyeät ñoái khoâng ñöôïc ñöa nhieät ñoä cao quaù 30oC vì thôøi kyø ñaàu naøy, gioáng raát maãn caûm vôùi nhieät ñoä. Giai ñoaïn 2: Giai ñoaïn naøy keùo daøi khoaûng 14-18 giôø. Trong giai ñoaïn naøy coù nhöõng thay ñoåi cô baûn nhö sau: Toaøn boä baøo töû ñaõ phaùt trieån thaønh sôïi naám vaø sôïi naám baét ñaàu phaùt trieån raát maïnh. Caùc sôïi naám naøy taïo ra nhöõng maïng sôïi chuû yeáu treân beà maët moâi tröôøng. Trong giai ñoaïn naøy, ta hoaøn toaøn nhìn roõ caùc sôïi naám coù maøu traéng xaùm baèng maét thöôøng. Moâi tröôøng ñöôïc keát laïi khaù chaët. Ñoä aåm moâi tröôøng giaûm daàn. Nhieät ñoä seõ taêng nhanh, coù theå leân tôùi 40-45oC. Caùc chaát dinh döôõng baét ñaàu giaûm nhanh do söï ñoàng hoùa maïnh cuûa naám sôïi. Caùc loaïi enzym ñöôïc hình thaønh vaø enzym naøo coù cô chaát caûm öùng troäi hôn seõ ñöôïc taïo thaønh nhieàu hôn. Löôïng oxy trong khoâng khí giaûm vaø löôïng CO2 seõ taêng daàn, do ñoù trong giai ñoaïn naøy caàn phaûi ñöôïc thoâng khí maïnh vaø nhieät ñoä coá gaéng duy trì trong khoaûng 29-30oC laø toát nhaát. Giai ñoaïn 3: Giai ñoaïn naøy keùo daøi khoaûng 10-20 giôø. ÔÛ giai ñoaïn naøy coù moät soá thay ñoåi cô baûn nhö sau: Quaù trình trao ñoåi chaát seõ yeáu daàn, do ñoù, möùc ñoä giaûm chaát dinh döôõng seõ chaäm laïi. Nhieät ñoä cuûa khoái moâi tröôøng giaûm, do ñoù laøm giaûm löôïng khoâng khí moâi tröôøng xuoáng coøn 20-25 theå tích khoâng khí/theå tích phoøng nuoâi caáy/1giôø. Nhieät ñoä nuoâi duy trì ôû 30oC. Trong giai ñoaïn naøy, baøo töû ñöôïc hình thaønh nhieàu, do ñoù löôïng enzym seõ giaûm. Chính vì theá, vieäc xaùc ñònh thôøi ñieåm ñeå thu nhaän enzym laø raát caàn thieát. Enzym protease Khaùi nieäm: Enzyme protease hay peptid hydrolase, laø moät chaát xuùc taùc sinh hoïc coù baûn chaát laø protein. Noù xuùc taùc cho quaù trình thuûy phaân caùc lieân keát peptid (-CO-NH-) trong phaân töû protein vaø caùc polypeptid. Saûn phaåm cuûa quaù trình thuûy phaân coù theå laø caùc acid amin, caùc peptide, caùc polypeptide chuoãi ngaén… Phaân loaïi protease: Protease laø teân goïi chung moät nhoùm bao goàm nhieàu enzyme khaùc nhau. Hieän nay, treân theá giôùi coù raát nhieàu phöông phaùp phaân loaïi protease. Theo pH xuùc taùc: Döïa vaøo möùc ñoä hoaït ñoäng trong dung dòch coù giaù trò pH khaùc nhau maø enzyme protease ñöôïc chia laøm ba loaïi: Protease acid: Loaïi protease naøy thöôøng ñöôïc thu nhaän töø caùc loaøi naám moác nhö: Asp. niger, Asp. awamori, Asp. saitoi, Asp. shirousami. pHopt = 2.5-3. Haàu heát ñöôïc söû duïng trong cheá bieán caùc saûn phaåm töø thòt. Protease trung tính: Loaïi naøy coù theå thu nhaän töø raát nhieàu loaïi naám moác khaùc nhau nhö: Asp. oryzae, Asp. flavus, Asp. fumigatus, Asp. terricola. Protease trung tính thöôøng coù pHopt : 6-7.5 vaø ñöôïc söû duïng trong coâng nghieäp thöïc phaåm. Protease kieàm: Loaïi protease kieàm naøy thöôøng ñöôïc thu nhaän töø caùc loaøi naám moác nhö: Asp. oryzae, Asp. sojae, Asp. flavus. Protease kieàm coù pHopt = 8-11. Caùc loaïi protease kieàm ñöôïc öùng duïng trong saûn xuaát boät giaët. Theo vò trí xuùc taùc trong phaân töû protein: Döïa treân cô cheá taùc duïng cuûa protease leân cô chaát, ngöôøi ta phaân loaïi enzyme thaønh hai nhoùm lôùn: Exopeptidase (coøn goïi laø peptidase) vaø Endopeptidase. Trong ñoù, exopeptidase tham gia xuùc taùc thuûy phaân lieân keát peptide töø ñaàu muùt cuûa phaân töû protein. Neáu phaân caét ôû goác amino hoaëc carboxyl töï do thì goïi laø enzyme aminopeptidase hay carboxypeptidase. Endopeptidase (coøn goïi laø protease) xuùc taùc phaûn öùng thuûy phaân lieân keát peptide naèm ôû giöõa maïch phaân töû protein. Phöông phaùp phaân loaïi naøy raát toång quaùt, neân chæ mang tính chaát ñònh tính sô boä ban ñaàu. Enzym amylase Ñònh nghóa vaø phaân loaïi: Amylase laø nhoùm enzym thuûy phaân tinh boät, glycogen, dextrin. Saûn phaåm cuûa quaù trình thuûy phaân laø maltose, glucose, dextrin coù phaân töû löôïng nhoû. a-amylase: (EC :3.2.1.1) Thuûy phaân lieân keát a-(1-4) glucoside beân trong chuoãi amylose vaø amylopectin ôû baát kyø vò trí naøo ñeå taïo ra hoãn hôïp caùc mono vaø oligosaccharide nhö glucose, maltose. Phaûn öùng naøy döøng laïi khi gaëp lieân keát a-(1-6) taïi ñieåm phaân nhaùnh. Ñaëc tính cuûa a-amylase cuûa Aspergillus oryzae: pH hoaït ñoäng laø 4-7. Nhieät ñoä toái öu laø 55-60oC. Glucose amylase (EC : 3.2.1.3) Ñaây laø exo-enzym, thuûy phaân tinh boät, glycogen, polysaccharide ôû caùc moái lieân keát a -(1-4) vaø a -(1-6) glucoside töø ñaàu khoâng khöû thaønh caùc dextrin coù phaân töû löôïng thaáp vaø cuoái cuøng taïo thaønh glucose. Ñaëc tính cuûa Glucoamylase cuûa Asp.Oryzae: Glucoamylase (pH toái öu 4.8, nhieät ñoä toái öu: 50oC) NGUYEÂN LIEÄU VAØ PHÖÔNG PHAÙP NGHIEÂN CÖÙU Nguyeân lieäu Khoâ laïc HÌNH 3.1: Baùnh daàu laïc HÌNH 3.2: Khoâ laïc sau nghieàn Trong luaän vaên naøy, khoâ laïc ñöôïc söû duïng laøm nguyeân lieäu chính ñeå saûn xuaát nöôùc töông leân men. Khoâ laïc ñöôïc nhaäp khaåu töø AÁn Ñoä vaø ñöôïc eùp thaønh caùc baùnh khoâ daàu naëng khoaûng 1kg. Boät mì Boät mì söû duïng ñeå phoái troän vôùi khoâ laïc. Trong luaän vaên naøy, chuùng toâi söû duïng boät mì cuûa coâng ty Bình Ñoâng. Muoái Chuùng toâi söû duïng NaCl do Trung Quoác saûn xuaát vôùi ñoä tinh khieát ≥ 99.5% . Nöôùc Nguoàn nöôùc duøng trong thí nghieäm laø nguoàn nöôùc thuûy cuïc taïi Tp. Hoà Chí Minh vaø ñöôïc qua xöû lyù baèng phöông phaùp vi loïc. Vi sinh vaät Loaøi naám moác Aspergillus oryzae söû duïng trong luaän vaên do Phoøng thí nghieäm Coâng ngheä thöïc phaåm 2, thuoäc Boä moân Coâng ngheä Thöïc phaåm cung caáp. Naám moác ñöôïc baûo quaûn theo phöông phaùp caáy chuyeàn ñònh kyø. Thôøi gian giöõa 2 laàn caáy chuyeàn lieân tieáp laø 3 thaùng. Hoùa chaát söû duïng Caùc hoùa chaát ñaõ söû duïng trong nghieân cöùu goàm: KOH, NaOH, KH2PO4, Na2HPO4, phenolphthalein, ninhydrin, KIO3, coàn 96o… coù xuaát xöù töø Trung Quoác. Duïng cuï vaø thieát bò Duïng cuï Caùc duïng cuï ñöôïc söû duïng trong nghieân cöùu bao goàm pipet, erlen, buret, becher, oáng ñong, bình ñònh möùc, oáng nghieäm, ñóa petri, coác söù, ñuõa thuûy tinh, que caáy, pheãu thuûy tinh…. Vaø moät soá duïng cuï khaùc. Thieát bò Caùc thieát bò ñaõ ñöôïc söû duïng trong nghieân cöùu thuoäc phoøng thí nghieäm Coâng ngheä thöïc phaåm 2 vaø phoøng thí nghieäm Hoùa Sinh, Tröôøng Ñaïi hoïc Baùch Khoa TP. Hoà Chí Minh, bao goàm: Khay nuoâi moác Maùy ly taâm hieäu MIKRO 22R Maùy ño pH hieäu CONSORT C830 Tuû saáy hieäu ECOCELL 111, haõng MEMMERT. Maùy khuaáy töø hieäu PLABINCO Beáp ñieàu nhieät haõng MEMMERT Maùy laéc ñieàu nhieät haõng GERHARDT Tuû laïnh. Caân ñieän töû, caân thöôøng. Maùy ño maøu quang phoá UV-VIS Maùy caát ñaïm haõng GERHARDT Noài haáp tieät truøng Maùy ño aåm hoàng ngoaïi Noäi dung vaø phöông phaùp nghieân cöùu Noäi dung nghieân cöùu Sô ñoà quaù trình nghieân cöùu Khaûo saùt thaønh phaàn cuûa nguyeân lieäu Xaùc ñònh tæ leä phoái troän nguyeân lieäu, tyû leä moác caáy, ñoä aåm vaø thôøi gian thích hôïp cuûa quaù trình nuoâi moác ñeå hoaït tính protease laø cao nhaát. Xaùc ñònh tæ leä canh tröôøng:nöôùc muoái, noàng ñoä muoái, nhieät ñoä, pH vaø thôøi gian thích hôïp cuûa quaù trình thuûy phaân. Xaùc ñònh tæ leä boå sung cheá phaåm protease ñeå thuùc ñaåy quaù trình thuûy phaân protein. Phöông phaùp nghieân cöùu Khaûo saùt thaønh phaàn cuûa khoâ laïc Xöû lyù maãu tröôùc phaân tích Baùnh daàu laïc tröôùc khi söû duïng caàn phaûi ñöôïc ñaäp nhoû vaø ñem nghieàn nhoû tôùi kích thöôùc khoaûng 1mm. Khaûo saùt caùc thaønh phaàn cuûa khoâ laïc bao goàm: Ñoä aåm. Haøm löôïng N toång. Lipid thoâ. Tinh boät Xô thoâ. Tro. Xaùc ñònh thaønh phaàn moâi tröôøng, tyû leä moác caáy, ñoä aåm vaø thôøi gian thích hôïp cuûa quaù trình nuoâi moác ñeå hoaït tính protease laø maïnh nhaát Xaùc ñònh aûnh höôûng cuûa thaønh phaàn moâi tröôøng ñeán hoaït tính protease Yeáu toá thay ñoåi: Thaønh phaàn nguyeân lieäu - Tæ leä khoâ laïc: boät mì = (50:50), (70:30), (90:10); (100:0) Giaù trò caàn ño: Hoaït tính protease cuûa maãu. Xaùc ñònh aûnh höôûng tyû leä moác caáy ñeán hoaït tính protease Yeáu toá thay ñoåi: Tyû leä moác caáy thay ñoåi laàn löôït laø 1; 3; 5; 7; 9% (v/w) Giaù trò caàn ño: Hoaït tính protease cuûa maãu. Xaùc ñònh aûnh höôûng cuûa ñoä aåm moâi tröôøng ñeán hoaït tính protease Yeáu toá thay ñoåi: Ñoä aåm ban ñaàu cuûa moâi tröôøng ñöôïc thay ñoåi laàn löôït laø 45%, 50%, 55%, 60%, 65% Giaù trò caàn ño: Hoaït tính protease cuûa maãu Xaùc ñònh thôøi gian thích hôïp cho quaù trình nuoâi moác Yeáu toá thay ñoåi: Thôøi gian nuoâi moác thay ñoåi töø 24 giôø, 36 giôø, 38 giôø; 40 giôø; 42 giôø, 46 giôø; 48 giôø; 50 giôø; 52 giôø; 60giôø Giaù trò caàn ño: Hoaït tính protease cuûa maãu Xaùc ñònh tæ leä canh tröôøng:dung moâi, noàng ñoä muoái, nhieät ñoä vaø thôøi gian thích hôïp cho quaù trình thuûy phaân Xaùc ñònh tæ leä canh tröôøng : dung moâi thích hôïp cho quaù trình thuûy phaân Yeáu toá thay ñoåi: Tæ leä canh tröôøng : dung moâi thay ñoåi laàn löôït laø 1:2; 1:3; 1:4 Giaù trò caàn ño: Haøm löôïng N amin cuûa caùc maãu. Haøm löôïng N ammoniac cuûa caùc maãu. Haøm löôïng N toång cuûa caùc maãu. Xaùc ñònh noàng ñoä muoái thích hôïp cho quaù trình thuûy phaân Yeáu toá thay ñoåi: Noàng ñoä muoái trong dung dòch nöôùc muoái thay ñoåi laàn löôït laø 0%, 4%, 10%, 16%, 22% (w/v) Giaù trò caàn ño: Haøm löôïng N amin cuûa caùc maãu. Haøm löôïng N ammoniac cuûa caùc maãu. Haøm löôïng N toång cuûa caùc maãu. Xaùc ñònh nhieät ñoä thích hôïp cuûa quaù trình thuûy phaân Yeáu toá thay ñoåi: Nhieät ñoä thuûy phaân thay ñoåi laàn löôït laø 450C, 500C, 550C, 600C Giaù trò caàn ño: Haøm löôïng N amin cuûa caùc maãu. Haøm löôïng N ammoniac cuûa caùc maãu. Haøm löôïng N toång cuûa caùc maãu. Xaùc ñònh thôøi gian thuûy phaân thích hôïp Yeáu toá thay ñoåi: Thôøi gian thuûy phaân thay ñoåi laàn löôït laø: 0; 12; 24; 36; 48; 60; 72; 84; 96; 108; 120 giôø Giaù trò caàn ño: Haøm löôïng N amin cuûa caùc maãu. Haøm löôïng N ammoniac cuûa caùc maãu. Haøm löôïng N toång cuûa caùc maãu. Xaùc ñònh tæ leä boå sung cheá phaåm protease trong quaù trình thuûy phaân Yeáu toá thay ñoåi: Tæ leä boå sung Neutrase thay ñoåi laàn löôït laø 0.5; 1; 1.5; 2% (khoái löôïng dòch ennzym/khoái löôïng canh tröôøng) Tæ leä boå sung Flavourzyme thay ñoåi laàn löôït laø 0.25; 0.5; 0.75; 1% (khoái löôïng dòch ennzym/khoái löôïng canh tröôøng) Giaù trò caàn ño: Haøm löôïng N amin cuûa caùc maãu. Haøm löôïng N ammoniac cuûa caùc maãu. Haøm löôïng N toång cuûa caùc maãu. Caùc phöông phaùp phaân tích [5, 11] Ñònh löôïng N toång Xaùc ñònh haøm löôïng N toång baèng phöông phaùp Micro Kieldahl. Nguyeân taéc: Khi ñoát noùng vaät phaåm ñem phaân tích vôùi H2SO4 ñaäm ñaëc, caùc hôïp chaát höõu cô bò oxy hoùa. Cacbon vaø hydro taïo thaønh CO2 vaø H2O. Coøn nitô sau khi ñöôïc giaûi phoùng ra döôùi daïng NH3 seõ keát hôïp vôùi H2SO4 taïo thaønh (NH4)2SO4 tan trong dung dòch. Ñuoåi NH3 ra khoûi dung dòch baèng NaOH ñoàng thôøi caát vaø thu NH3 baèng moät löôïng dö H2SO4 0,1N. Ñònh phaân löôïng H2SO4 coøn laïi baèng dung dòch NaOH 0,1N chuaån. Qua ñoù, tính ñöôïc deã daøng löôïng nitô coù trong maãu nguyeân lieäu thí nghieäm. Ñònh löôïng N amin Nguyeân taéc. Caùc nhoùm amin cuûa acid amin, coù theå cho phaûn öùng vôùi thuoác thöû ninhydrin, taïo ra phöùc chaát coù maøu xanh tím. Töø ñoù xaùc ñònh haøm löôïng nitô ñoàng hoùa thoâng qua vieäc so saùnh cöôøng ñoä maøu cuûa dung dòch vôùi cöôøng ñoä maøu cuûa chaát chuaån laø glycine vôùi noàng ñoä bieát tröôùc. Axit amin ñaõ phaûn öùng vôùi ninhydrin theo phöông trình: Ñònh löôïng N ammoniac Nguyeân taéc: Baèng phöông phaùp chöng loâi cuoán hôi nöôùc coù theå ñaåy ammoniac ra khoûi muoái cuûa chuùng baèng NaOH 40%, sau ñoù duøng hôi nöôùc ñeå loâi keùo löôïng ammoniac naøy ra khoûi dung dòch ñeå taùc duïng vôùi löôïng H2SO4 xaùc ñònh ôû bình höùng. Sau quaù trình chöng, ta seõ ñem ñònh löôïng haøm löôïng H2SO4 dö, töø ñoù seõ xaùc ñònh ñöôïc löôïng nitô ammoniac coù trong dung dòch. Ñònh löôïng lipid thoâ baèng boä Soxhlet Nguyeân taéc: Duøng dung moâi kò nöôùc trích ly hoaøn toaøn lipid töø nguyeân lieäu ñaõ ñöôïc nghieàn nhoû. Moät soá thaønh phaàn hoøa tan trong chaát beùo cuõng ñöôïc trích ly bao goàm saéc toá, caùc vitamin tan trong chaát beùo, caùc chaát muøi… Tuy nhieân, haøm löôïng cuûa chuùng thaáp. Do coù laãn taïp chaát, phaàn trích ly ñöôïc goïi laø lipid toång hay daàu thoâ. Haøm löôïng lipid toång coù theå tính baèng caùch caân tröïc tieáp löôïng daàu sau khi chöng caát loaïi saïch dung moâi hoaëc tính giaùn tieáp töø khoái löôïng baõ coøn laïi. Öu ñieåm cuûa caùch tính giaùn tieáp laø coù theå ñoàng thôøi trích ly nhieàu maãu trong cuøng moät truï chieát. Ñònh löôïng tinh boät Nguyeân taéc: Duøng enzym amilase thuûy phaân hoaøn toaøn tinh boät thaønh glucose. Chuaån ñoä vaø ñònh löôïng tinh boät döïa vaøo haøm löôïng glucose tröôùc vaø sau thuûy phaân. Ñònh löôïng cellulose Nguyeân taéc: Cellulose laø chaát xô baõ coøn laïi sau khi caùc glucide khaùc nhö tinh boät, lignin vaø caùc saéc toá, caùc taïp chaát bò thuûy phaân bôûi acid vaø kieàm. Sau khi loïc, röûa saïch xô baõ naøy, saáy khoâ ñeán khoái löôïng khoâng ñoåi vaø nung thaønh tro, tröø haøm löôïng tro, tính ñöôïc löôïng cellulose trong maãu. Ñònh löôïng ñoä tro Tro laø thaønh phaàn coøn laïi cuûa thöïc phaåm sau khi nung chaùy heát caùc chaát höõu cô. Nguyeân taéc: Duøng söùc noùng 6000C nung chaùy hoaøn toaøn caùc chaát höõu cô. Phaàn coøn laïi ñem caân vaø tính ra phaàn traêm tro trong maãu. Ñònh löôïng hoaït tính protease theo phöông phaùp Anson caûi tieán Nguyeân taéc Phöông phaùp naøy döïa vaøo söï thuûy phaân cô chaát (casein) bôûi protease. Ñònh löôïng saûn phaåm ñöôïc taïo thaønh baèng phaûn öùng taïo maøu vôùi thuoác thöû Folin-Cio-Calteau roài so maøu ôû böôùc soùng 750nm. Keát quaû ñöôïc tính toaùn döïa vaøo ñoà thò tyrosine chuaån vaø tính theo ñôn vò hoaït ñoä. Moät ñôn vò hoaït ñoä protease laø löôïng enzym caàn duøng trong 1 phuùt, ôû 300C ñeå thuûy phaân ñöôïc moät löôïng cô chaát taïo ra saûn phaåm töông ñöông vôùi 1 mmol tyrosine baèng 18,12mg. KEÁT QUAÛ VAØ BAØN LUAÄN Trong khuoân khoå luaän vaên naøy, chuùng toâi xin trình baøy phaàn keát quaû lieân quan ñeán vieäc khaûo saùt caùc yeáu toá aûnh höôûng tôùi quaù trình nuoâi naám moác ñeå sinh toång hôïp enzym protease trong quy trình saûn xuaát nöôùc töông leân men. Khaûo saùt thaønh phaàn nguyeân lieäu Khaûo saùt thaønh phaàn khoâ laïc BAÛNG 4.1: Keát quaû khaûo saùt thaønh phaàn hoùa hoïc cuûa khoâ laïc Thaønh phaàn hoùa hoïc Haøm löôïng (% toång khoái löôïng) Ñoä aåm 13.81 Protein thoâ 30.78 Lipid 4.51 Tinh boät 10.50 Cellulose 23.76 Tro 8.54 So saùnh thaønh phaàn hoùa hoïc cuûa khoâ laïc vôùi khoâ ñaäu naønh: BAÛNG 4.2: Thaønh phaàn hoùa hoïc cuûa khoâ ñaäu naønh [14] Thaønh phaàn hoùa hoïc Haøm löôïng (% toång khoái löôïng) Ñoä aåm 11-13 % Protein thoâ 47-51 % Chaát beùo thoâ 0.1-1.5 % Hydratcarbon 19-22 % Xô thoâ 3-5 % Tro 4-6 % Ta so saùnh thaønh phaàn nguyeân lieäu khoâ laïc ñöôïc söû duïng trong luaän vaên vôùi thaønh phaàn cuûa khoâ ñaäu naønh thöôøng ñöôïc söû duïng ñeå saûn xuaát nöôùc töông taïi Nhaät Baûn (BAÛNG 4.2) vaø nhaän thaáy nhö sau: Khoâ laïc ñöôïc thu nhaän töø caùc nhaø maùy saûn xuaát chaát beùo baèng phöông phaùp eùp taïi AÁn Ñoä coù haøm löôïng chaát beùo < 5%. So vôùi haøm löôïng chaát beùo trong khoâ ñaäu naønh (BAÛNG 4.2) thì haøm löôïng chaát beùo trong khoâ laïc lôùn hôn haøm löôïng chaát beùo trong khoâ ñaäu naønh, do khoâ ñaäu naønh thu ñöôïc töø phöông phaùp söû duïng dung moâi ñeå trích ly daàu trong haït ñaäu naønh. Haøm löôïng chaát beùo coøn laïi trong khoâ daàu chuû yeáu phuï thuoäc vaøo kyõ thuaät eùp. Trong saûn xuaát nöôùc töông, ngöôøi ta khoâng caàn söû duïng ñeán chaát beùo neân vieäc taùch beùo trong nguyeân lieäu caøng trieät ñeå caøng toát. Ñieàu naøy khoâng nhöõng mang laïi giaù trò kinh teá cho nhaø maùy eùp daàu maø quan troïng hôn, noù coøn haïn cheá vieäc hình thaønh ñoäc toá 3-MCPD trong saûn xuaát nöôùc töông, ñaëc bieät laø ñoái vôùi nöôùc töông hoùa giaûi. Ñoä aåm cuûa nguyeân lieäu khoâ laïc laø khaù cao (>13%) neân khoâ laïc deã bò hö hoûng neáu khoâng ñöôïc baûo quaûn trong ñieàu kieän thích hôïp. Haøm löôïng protein thoâ trong khoâ laïc khaûo saùt laø 30.78%. Trong khi ñoù, haøm löôïng protein thoâ trong haït ñaäu naønh thöôøng söû duïng ñeå saûn xuaát nöôùc töông laø khoaûng 40% vaø trong khoâ ñaäu naønh laø 47-51% [14]. Nhö vaäy, haøm löôïng protein thoâ cuûa khoâ laïc so vôùi khoâ ñaäu naønh laø töông ñoái thaáp. Haøm löôïng protein thoâ trong khoâ laïc chuû yeáu phuï thuoäc vaøo gioáng laïc vaø tæ leä voû laãn trong baõ. Khoâ laïc neáu bò laãn voû coù haøm löôïng protein thoâ khoaûng 27.7% vaø haøm löôïng naøy trong khoâ laïc nhaân laø khoaûng 45.5% [2]. Khoâ laïc ñöôïc söû duïng trong luaän vaên naøy coøn laãn voû neân coù haøm löôïng cellulose lôùn (23.76%) vaø haøm löôïng protein khoâng cao. Nhö vaäy, so vôùi haït ñaäu naønh vaø khoâ ñaäu naønh thì khoâ laïc laø nguoàn nguyeân lieäu coù theå thu nhaän töø caùc nhaø maùy eùp daàu trong nöôùc hay nhaäp khaåu töø nöôùc ngoaøi vôùi giaù reû. Hôn nöõa, ñaây cuõng laø moät nguoàn nguyeân lieäu coù giaù trò dinh döôõng cao, caàn phaûi ñöôïc taän duïng khai thaùc. Haàu heát, caùc cô sôû, nhaø maùy trong nöôùc hieän nay ñeàu ñang söû duïng khoâ laïc ñeå saûn xuaát nöôùc töông vôùi quy moâ lôùn. Vì vaäy, chuùng toâi choïn khoâ laïc laøm nguyeân lieäu chính ñeå saûn xuaát nöôùc töông leân men. Khaûo saùt thaønh phaàn boät mì BAÛNG 4.3: Thaønh phaàn hoùa hoïc cuûa boät mì töø coâng ty Bình Ñoâng Thaønh phaàn Haøm löôïng (% toång khoái löôïng) Ñoä aåm 14 Protein thoâ 8 Tinh boät 70 Lipid thoâ 1.2 Xô thoâ 2.5 Tro 1.4 Boät mì coù chöùa protein thoâ vôùi moät löôïng nhoû, chuû yeáu laø tinh boät vôùi haøm löôïng cao. Ñaây seõ laø nguoàn cung caáp C chuû yeáu (tinh boät) cho söï phaùt trieån cuûa naám moác trong quaù trình nuoâi caáy. Ngoaøi ra, boät mì coøn tham gia vaøo vieäc hình thaønh maøu saéc cho nöôùc töông thaønh phaåm. Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa caùc yeáu toá tôùi quaù trình nuoâi moác Muïc ñích cuûa quaù trình nuoâi moác laø taïo ñieàu kieän thích hôïp cho naám moác sinh ra enzym coù hoaït tính cao, quan troïng nhaát laø protease. Vì vaäy, quaù trình nuoâi moác laø moät quaù trình ñoùng vai troø quan troïng, caàn phaûi ñöôïc nghieân cöùu ñeå löïa choïn caùc thoâng soá coâng ngheä thích hôïp. Nhieäm vuï cuûa luaän vaên trong giai ñoaïn naøy laø khaûo saùt söï aûnh höôûng cuûa caùc yeáu toá tôùi quaù trình nuoâi moác ñeå tìm ra ñieàu kieän phuø hôïp cho naám moác sinh protease hoaït tính cao treân moâi tröôøng hoãn hôïp khoâ laïc vaø boät mì. Hoaït tính protease caøng cao thì khaû naêng thuûy phaân nguyeân lieäu taïo N amin töï do caøng cao. Ñaây laø thaønh phaàn deã tieâu hoùa, deã haáp thu coù trong nöôùc töông. Haøm löôïng N amin töï do trong nöôùc töông caøng cao thì dinh döôõng cuûa nöôùc töông thaønh phaåm seõ caøng cao. Aûnh höôûng cuûa thaønh phaàn moâi tröôøng tôùi hoaït tính protease. Löïa choïn tæ leä khoâ laïc vaø boät mì seõ aûnh höôûng tôùi haøm löôïng caùc chaát dinh döôõng coù trong moâi tröôøng nuoâi caáy (nguoàn C, nguoàn N, chaát caûm öùng, chaát khoaùng). Do vaäy, tæ leä nguyeân lieäu coù aûnh höôûng tôùi hoaït tính cuûa protease ñöôïc taïo ra bôûi naám moác. Theo caùc taøi lieäu veà saûn xuaát nöôùc töông ôû nöôùc ngoaøi, ngöôøi ta thöôøng söû duïng tæ leä phoái troän khoâ ñaäu naønh:boät mì dao ñoäng trong khoaûng (50-90%) : (10-50%) [17]. Do ñi töø nguoàn nguyeân lieäu laø khoâ laïc vaø boät mì neân chuùng toâi caàn khaûo saùt söï aûnh höôûng cuûa tæ leä nguyeân lieäu tôùi hoaït tính protease. Caùc thí nghieäm ñöôïc thöïc hieän nhö sau: Caùc yeáu toá coá ñònh trong quaù trình nuoâi naám moác: Tæ leä moác caáy: 3% v/w Ñoä aåm cuûa maãu: 50% Thôøi gian nuoâi moác: 42 giôø Nhieät ñoä nuoâi moác: nhieät ñoä phoøng Yeáu toá thay ñoåi: Tæ leä thaønh phaàn nguyeân lieäu (khoâ laïc : boät mì) = (50:50), (70:30), (90:10), (100:0) (w/w). Caùch tieán haønh: Troän nguyeân lieäu khoâ laïc vaø boät mì theo caùc tæ leä treân, boå sung aåm cho hoãn hôïp moâi tröôøng nuoâi caáy (coâng thöùc xem phaàn phuï luïc). Moâi tröôøng sau khi haáp tieät truøng 121oC, 1atm, 20 phuùt seõ ñöôïc laøm nguoäi, kieåm tra vaø hieäu chænh tôùi ñoä aåm 50%, sau ñoù, tieán haønh gieo caáy naám moác. Duøng pipet voâ khuaån laáy 10ml nöôùc voâ khuaån cho vaøo oáng nghieäm chöùa gioáng. Duøng que caáy ñaùnh nheï cho caùc baøo töû naám phaân taùn trong nöôùc. Sau ñoù huùt 3ml huyeàn phuø baøo töû vaø phaân phoái ñeàu treân khay nuoâi. Troän ñeàu moâi tröôøng vôùi gioáng naám moác. Naám moác ñöôïc nuoâi caáy treân khay nuoâi, ôû nhieät ñoä phoøng. Trong suoát thôøi gian nuoâi caáy, beà maët khay nuoâi ñöôïc che phuû baèng khaên vaûi ñaõ ñöôïc thaám öôùt ñeå haïn cheá söï maát aåm cuûa moâi tröôøng vaø söï nhieãm vi sinh vaät khaùc töø moâi tröôøng beân ngoaøi. Sau khi keát thuùc thôøi gian nuoâi moác, ta thu laáy canh tröôøng, ñem xaùc ñònh aåm vaø ño hoaït tính protease. BAÛNG 4.4: Aûnh höôûng cuûa tæ leä khoái löôïng khoâ laïc:boät mì ñeán hoaït tính protease trong canh tröôøng beà maët Asp. oryzae Tæ leä khoâ laïc:boät mì (w/w) Hoaït tính protease tb (Ñvhñ/g ctk) 50:50 1.11a 70:30 2.00b 90:10 2.72c 100:0 2.35d Chuù thích: “a, b, c, d…”: kí töï gioáng nhau thì caùc giaù trò khaùc bieät khoâng coù yù nghóa, kí töï khaùc nhau thì caùc giaù trò khaùc bieät coù yù nghóa vôùi P<0,05 HÌNH 4.1: Quan heä giöõa tæ leä nguyeân lieäu vaø hoaït tính protease Ta nhaän thaáy, khi haøm löôïng khoâ laïc trong hoãn hôïp nguyeân lieäu taêng thì hoaït tính protease taêng. Töùc laø khi taêng haøm löôïng cô chaát caûm öùng (protein) thì naám moác Asp. oryzae seõ sinh toång hôïp protease coù hoaït tính cao hôn. Coù theå giaûi thích quy luaät naøy döïa vaøo sô ñoà sau cuûa Monod vaø Jacob: Gen ñieàu khieån Gen toång hôïp 1. 2. 3. 4. Enzym E2 Chaát kìm haõm (I) Cô chaát Saûn phaåm (S) (P) Bình thöôøng, khi khoâng coù cô chaát caûm öùng, chaát kìm haõm coù trong teá baøo seõ töông taùc vôùi gen ñieàu khieån, toaøn boä quaù trình sinh toång hôïp enzym bò phong toûa vaø khoâng hoaït ñoäng. Khi ta cho cô chaát caûm öùng vaøo moâi tröôøng nuoâi caáy, cô chaát seõ töông taùc vôùi chaát kìm haõm, gen ñieàu khieån thoaùt ra khoûi söï phong toûa cuûa chaát kìm haõm, khi ñoù, quaù trình sinh toång hôïp protease seõ xaûy ra. Nhö vaäy, löôïng cô chaát caûm öùng trong moâi tröôøng caøng nhieàu thì seõ kích thích toång hôïp ra nhieàu enzym caûm öùng. Keát quaû thí nghieäm ñaït ñöôïc laø phuø hôïp vôùi lyù thuyeát ñieàu khieån sinh toång hôïp enzym caûm öùng maø Monod vaø Jacob ñaõ ñöa ra. Tuy nhieân, taùc ñoäng caûm öùng ñaït hieäu quaû cao chæ ôû moät lieàu löôïng nhaát ñònh naøo ñoù cuûa cô chaát caûm öùng. Khi naøo haøm löôïng cô chaát caûm öùng quaù cao, khaû naêng sinh toång hôïp enzym caûm öùng seõ giaûm [6]. Töø keát quaû thí nghieäm, ta nhaän thaáy: hoaït tính protease taêng daàn khi haøm löôïng khoâ laïc trong nguyeân lieäu taêng, nhöng noù khoâng taêng maõi maõi. Hoaït tính protease ñaït cöïc ñaïi khi nuoâi caáy naám moác trong moâi tröôøng coù thaønh phaàn 90% (khoâ laïc):10% (boät mì). Vaø sau ñoù, khi taêng haøm löôïng khoâ laïc leân thì hoaït tính protease laïi giaûm do hieän töôïng öùc cheá dò hoùa. Töùc laø, khi haøm löôïng protein trong moâi tröôøng taêng cao thì sau moät thôøi gian nuoâi caáy, löôïng acid amin töï do ñöôïc tích luõy trong canh tröôøng seõ taêng leân. Chuùng seõ ñoùng vai troø kìm haõm quaù trình sinh toång hôïp protease cuûa naám moác. Do vaäy, khoâng phaûi caøng cho nhieàu cô chaát thì khaû naêng sinh toång hôïp enzym caøng cao. So saùnh vôùi tæ leä thaønh phaàn nguyeân lieäu trong saûn xuaát nöôùc töông ôû moät soá nöôùc: Tæ leä phoái troän nguyeân lieäu khoâ ñaäu naønh vaø boät mì cuûa caùc loaïi nöôùc töông ôû caùc quoác gia khaùc nhau raát ña daïng vaø taïo neân neùt ñaëc tröng rieâng cho saûn phaåm nöôùc töông cuûa töøng nöôùc. Si yau (Trung Quoác): Khoâ ñaäu naønh vaø boät mì ñöôïc troän vôùi tæ leä 6:4 Kecap asin (Indonesia): Khoâ ñaäu naønh vaø boät mì ñöôïc troän vôùi tæ leä 1:2. Toyo (Philipine): Haøm löôïng khoâ ñaäu naønh khoaûng 66-90%, boät mì khoaûng 10-34%. Nhaät Baûn: Tæ leä phoái troän giöõa khoâ ñaäu naønh vaø boät mì cuûa caùc loaïi nöôùc töông khaùc nhau cuõng khaùc nhau (BAÛNG 4.5). BAÛNG 4.5: Tæ leä phoái troän nguyeân lieäu trong saûn xuaát nöôùc töông ôû Nhaät Baûn Loaïi nöôùc töông Koikuchi-shoyu Usukuchi-shoyu Tamari-shoyu Saishikomi-shoyu Shiro-shoyu Tæ leä khoâ ñaäu naønh:boät mì 1:1 1:1 Khoâng duøng boät mì 10:1 1:5 Ñoái vôùi nguyeân lieäu laø khoâ laïc ñaõ khaûo saùt ôû treân, do haøm löôïng protein thoâ khoâng cao nhö trong haït ñaäu naønh hay khoâ ñaäu naønh neân, neáu söû duïng tæ leä khoâ laïc thaáp coù theå seõ khoâng coù ñuû nguoàn N thích hôïp cho naám moác sinh toång hôïp protease coù hoaït tính cao. Vieäc söû duïng boät mì vôùi tæ leä 10% chuû yeáu cung caáp nguoàn C (tinh boät) cho moác sinh tröôûng vaø phaùt trieån. Thaønh coâng hay thaát baïi trong saûn xuaát enzym caûm öùng phuï thuoäc raát nhieàu vaøo vieäc xaùc ñònh cô chaát caûm öùng vaø lieàu löôïng caàn thieát cuûa chaát caûm öùng ñöa vaøo moâi tröôøng. Vôùi thaønh phaàn moâi tröôøng thích hôïp laø 90% (khoâlaïc):10% (boät mì), chuùng toâi tieáp tuïc tieán haønh khaûo saùt aûnh höôûng cuûa caùc yeáu toá khaùc tôùi hoaït tính protease. Aûnh höôûng cuûa ñoä aåm moâi tröôøng tôùi hoaït tính protease Quaù trình sinh tröôûng vaø phaùt trieån cuûa vi sinh vaät ñeàu coù lieân quan ñeán nöôùc. Do ñoù, ñoä aåm laø moät yeáu toá coâng ngheä quan troïng trong quaù trình nuoâi caáy naám moác ñeå thu nhaän enzym. Chuùng toâi tieán haønh khaûo saùt aûnh höôûng cuûa ñoä aåm moâi tröôøng nuoâi caáy tôùi hoaït tính protease sinh ra bôûi Asp. oryzae vôùi caùc ñieàu kieän thí nghieäm nhö sau: Caùc yeáu toá coá ñònh trong quaù trình nuoâi naám moác: Thaønh phaàn nguyeân lieäu (khoâ laïc : boät mì) = 90:10 (w/w). Tæ leä moác caáy: 3% v/w Thôøi gian nuoâi moác: 42 giôø Nhieät ñoä nuoâi moác: nhieät ñoä phoøng Yeáu toá thay ñoåi: Ñoä aåm moâi tröôøng nuoâi caáy thay ñoåi laàn löôït laø 45%, 50%, 55%, 60% BAÛNG 4.6: Aûnh höôûng cuûa ñoä aåm moâi tröôøng ñeán hoaït tính protease töø Asp. oryzae (laàn 1) Ñoä aåm moâi tröôøng Hoaït tính protease tb (Ñvhñ/g ctk) 45% 2.59a 50% 2.74b 55% 3.53c 60% 4.08d Chuù thích: “a, b, c, d…”: kí töï gioáng nhau thì caùc giaù trò khaùc bieät khoâng coù yù nghóa, kí töï khaùc nhau thì caùc giaù trò khaùc bieät coù yù nghóa vôùi P<0,05 HÌNH 4.2: Quan heä giöõa ñoä aåm moâi tröôøng vaø hoaït tính protease (laàn 1) Nhö vaäy, hoaït tính protease cao nhaát khi nuoâi moác treân moâi tröôøng coù ñoä aåm 60%. Chuùng toâi tieáp tuïc khaûo saùt aûnh höôûng cuûa ñoä aåm vôùi caùc giaù trò ñoä aåm cheânh leäch gaàn 60% hôn. Caùc giaù trò ñoä aåm ñöôïc thay ñoåi nhö sau: 50%, 55%, 60%, 65%, 70%. BAÛNG 4.7: Aûnh höôûng cuûa ñoä aåm moâi tröôøng ñeán hoaït tính protease töø Asp. oryzae (laàn 2) Ñoä aåm moâi tröôøng Hoaït tính protease tb (Ñvhñ/g ctk) 50% 2.73a 55% 3.53b 60% 4.11c 65% 3.88d 70% 3.36e Chuù thích: “a, b, c, d…”: kí töï gioáng nhau thì caùc giaù trò khaùc bieät khoâng coù yù nghóa, kí töï khaùc nhau thì caùc giaù trò khaùc bieät coù yù nghóa vôùi P<0,05 HÌNH 4.3: Quan heä giöõa ñoä aåm moâi tröôøng vaø hoaït tính protease (laàn 2) Nhö vaäy, hoaït tính protease thu ñöôïc seõ taêng daàn khi ñoä aåm cuûa moâi tröôøng nuoâi caáy taêng töø 45% ñeán 60%. Taïi moâi tröôøng coù ñoä aåm 60%, hoaït tính protease thu ñöôïc laø cao nhaát. Neáu ñoä aåm cuûa moâi tröôøng nuoâi caáy taêng hôn 60% thì hoaït tính protease seõ giaûm xuoáng. Coù theå giaûi thích keát quaû thí nghieäm nhö sau: Ñoä aåm cuûa moâi tröôøng nuoâi caáy laø yeáu toá aûnh höôûng tôùi hoaït ñoä nöôùc trong moâi tröôøng. Moãi loaøi vi sinh vaät muoán sinh tröôûng vaø phaùt trieån toát thì caàn phaûi coù moät giaù trò hoaït ñoä nöôùc thích hôïp. Nöôùc chính laø moâi tröôøng vaän chuyeån caùc chaát dinh döôõng ra vaøo teá baøo, moâi tröôøng cho hoaït ñoäng trao ñoåi chaát vaø tham gia vaøo caùc phaûn öùng thuûy phaân trong teá baøo vi sinh vaät. Trong moâi tröôøng thieáu nöôùc, quaù trình trao ñoåi chaát seõ bò yeáu ñi vaø teá baøo bò öùc cheá hoaëc bò cheát. Vì vaäy, neáu moâi tröôøng nuoâi caáy coù ñoä aåm thaáp thì naám moác seõ sinh tröôûng vaø phaùt trieån yeáu, laøm giaûm hoaït tính protease sinh ra. Ngöôïc laïi neáu moâi tröôøng aåm cao, moâi tröôøng voùn cuïc, möùc ñoä thoâng thoaùng khí yeáu, söï trao ñoåi oxy gaëp khoù khaên neân hoaït tính protease thu ñöôïc seõ thaáp. So saùnh keát quaû thí nghieäm vôùi caùc nghieân cöùu tröôùc ñaây, chuùng toâi coù moät soá nhaän xeùt nhö sau: Theo caùc taøi lieäu nghieân cöùu veà ñieàu kieän sinh tröôûng cuûa naám moác Asp. oryzae baèng phöông phaùp nuoâi caáy beà maët treân moâi tröôøng caùm thì ñoä aåm thích hôïp cho söï hình thaønh baøo töû ñeå laøm gioáng cuûa Asp. oryzae laø 45-50% vaø ñeå hình thaønh enzym thì ñoä aåm toái öu laø 58-60%. Khi naám moác ñöôïc nuoâi caáy trong ñieàu kieän tieät truøng nghieâm ngaët thì hoaït ñoä cuûa enzym seõ toát nhaát khi haøm aåm cao hôn 65-68% [1, 2, 6, 10]. Nhö vaäy, keát quaû thí nghieäm treân moâi tröôøng hoãn hôïp khoâ laïc vaø boät mì maø chuùng toâi khaûo saùt töông töï vôùi keát quaû nghieân cöùu treân moâi tröôøng caùm. ÔÛ Nhaät Baûn, ngöôøi ta söû duïng haït ñaäu naønh hoaëc khoâ ñaäu naønh troän vôùi boät mì theo tæ leä 50:50 vaø sau ñoù boå sung theâm nöôùc tôùi ñoä aåm 60%, haáp tieät truøng vaø ñem nuoâi caáy naám moác [13]. Taïi Thaùi Lan, nöôùc töông leân men ñöôïc saûn xuaát ñi töø ñaäu naønh vaø boät mì vôùi tæ leä 7:1, ñoä aåm cuûa moâi tröôøng nuoâi caáy ban ñaàu ñöôïc hieäu chænh veà 55% [15]. Qua moät vaøi so saùnh treân, chuùng toâi nhaän thaáy, ñoä aåm thích hôïp cho naám moác sinh toång hôïp protease coù hoaït tính cao trong saûn xuaát nöôùc töông haàu nhö khoâng phuï thuoäc nhieàu vaøo ñaëc tính cuûa nguyeân lieäu vaø tæ leä phoái troän nguyeân lieäu trong moâi tröôøng nuoâi caáy. Nhö vaäy, vieäc choïn ñoä aåm moâi tröôøng 60% ñeå nuoâi caáy naám moác treân moâi tröôøng hoãn hôïp khoâ laïc vaø boät mì nhaèm sinh protease coù hoaït tính cao nhaát laø phuø hôïp. Aûnh höôûng cuûa tæ leä moác caáy tôùi hoaït tính protease Tæ leä moác caáy ñöôïc söû duïng trong quaù trình nuoâi moác seõ aûnh höôûng tôùi khaû naêng sinh tröôûng vaø phaùt trieån cuûa naám moác vaø do ñoù aûnh höôûng tôùi hoaït tính protease sinh toång hôïp ra. Ñeå khaûo saùt söï aûnh höôûng cuûa tæ leä moác caáy tôùi hoaït tính protease, chuùng toâi tieán haønh thí nghieäm vôùi caùc thoâng soá nhö sau: Caùc yeáu toá coá ñònh trong quaù trình nuoâi naám moác: Tæ leä thaønh phaàn nguyeân lieäu (khoâ laïc : boät mì) = 90:10 (w/w). Ñoä aåm moâi tröôøng nuoâi caáy: 60% Thôøi gian nuoâi moác: 42 giôø Nhieät ñoä nuoâi moác: nhieät ñoä phoøng Yeáu toá thay ñoåi: Tæ leä moác caáy: 1, 3, 5, 7, 9 % (v/w moâi tröôøng nuoâi caáy). Huyeàn phuø baøo töû coù chöùa 0.005 g baøo töû/ml. Nhö vaäy, caùc tæ leä treân töông öùng vôùi: 0.005; 0.015; 0.025; 0.035; 0.045 % (khoái löôïng baøo töû /khoái löôïng moâi tröôøng nuoâi caáy). Sau 42 giôø nuoâi caáy, ta thu canh tröôøng vaø ño hoaït tính protease sinh ra bôûi naám moác. Keát quaû thu ñöôïc nhö sau: BAÛNG 4.8: Aûnh höôûng cuûa tæ leä moác caáy ñeán hoaït tính protease töø Asp. oryzae Tæ leä moác caáy % (khoái löôïng baøo töû/khoái löôïng moâi tröôøng nuoâi caáy) Hoaït tính protease tb (Ñvhñ/g ctk) 0.005 2.63a 0.015 3.82b 0.025 3.83b 0.035 4.16c 0.045 3.42d Chuù thích: “a, b, c, d…”: kí töï gioáng nhau thì caùc giaù trò khaùc bieät khoâng coù yù nghóa, kí töï khaùc nhau thì caùc giaù trò khaùc bieät coù yù nghóa vôùi P<0,05 HÌNH 4.4: Quan heä giöõa tæ leä moác caáy vaø hoaït tính protease. Döïa vaøo ñoà thò, quy luaät chung ñöôïc deã daøng nhaän thaáy laø: khi tæ leä moác caáy taêng trong moät giôùi haïn nhaát ñònh thì hoaït tính protease taêng theo. Ñieàu ñoù coù nghóa laø khi maät ñoä baøo töû naám moác treân 1g moâi tröôøng nuoâi caáy taêng, protease ñöôïc sinh ra seõ coù hoaït tính cao. Cuï theå: hoaït tính protease taêng daàn töø tæ leä moác caáy 0.005% tôùi 0.035%, vaø ñaït giaù trò cöïc ñaïi khi tæ leä moác caáy laø 0.035%. Khi taêng tæ leä moác caáy leân 0.045% thì giaù trò hoaït tính protease ño ñöôïc laïi thaáp hôn so vôùi hoaït tính protease ôû tæ leä moác caáy 0.035%. Keát quaû thöïc nghieäm naøy ñöôïc giaûi thích nhö sau: Löôïng gioáng caáy coù aûnh höôûng tôùi khaû naêng sinh tröôûng vaø phaùt trieån cuûa naám moác. Neáu löôïng gioáng caáy ban ñaàu quaù thaáp, naám moác seõ sinh tröôûng vaø phaùt trieån chaäm. Do vaäy, protease ñöôïc naám moác sinh toång hôïp ra vôùi soá löôïng vaø hoaït tính yeáu. Khi tæ leä moác caáy taêng thì toác ñoä sinh tröôûng vaø phaùt trieån cuûa naám moác cuõng taêng daàn. Khi ñoù, naám moác sinh toång hôïp protease coù hoaït tính cao ñeå phaân huûy caùc hôïp chaát cao phaân töû trong moâi tröôøng, phuïc vuï cho quaù trình sinh tröôûng vaø trao ñoåi chaát. Tuy nhieân, vieäc taêng tæ leä moác caáy leân quaù cao laïi khoâng laøm taêng hoaït tính protease thu ñöôïc maø coøn laøm taêng chi phí cho quaù trình nhaân gioáng cho saûn xuaát. Nhö vaäy, tæ leä moác caáy thích hôïp cho quaù trình nuoâi caáy naám moác treân moâi tröôøng hoãn hôïp khoâ laïc vaø boät mì, nhaèm sinh toång hôïp protease coù hoaït tính cao nhaát laø 0.035% (khoái löôïng baøo töû/khoái löôïng moâi tröôøng nuoâi caáy). So saùnh vôùi moät soá tæ leä moác caáy ñaõ ñöôïc aùp duïng trong saûn xuaát nöôùc töông leân men: Williams (1980) ñeà nghò tæ leä moác caáy Asp. oryzae hoaëc Asp. sojae thích hôïp cho quaù trình nuoâi caáy naám moác treân moâi tröôøng 50% haït ñaäu naønh vaø 50% boät mì trong khoaûng töø 0.001% ñeán 10% so vôùi khoái löôïng cuûa moâi tröôøng [17]. Cuøng moät ñieàu kieän nuoâi caáy nhö treân, Bajracharya vaø coäng söï (1992) laïi ñöa ra tæ leä moác caáy thích hôïp ñöôïc thu heïp laïi trong khoaûng 0.01% - 0.02%. Tæ leä moác caáy lôùn hay nhoû phuï thuoäc vaøo hoaït löïc sinh protease cuûa chuûng naám moác Asp. oryzae ñöôïc söû duïng, thaønh phaàn dinh döôõng trong moâi tröôøng nuoâi caáy [12]. Töø thí nghieäm khaûo saùt aûnh höôûng cuûa tæ leä moác caáy treân moâi tröôøng hoãn hôïp khoâ laïc vaø boät mì, chuùng toâi thu ñöôïc keát quaû tæ leä moác caáy thích hôïp laø 0.035% (khoái löôïng baøo töû/khoái löôïng moâi tröôøng nuoâi caáy). Aûnh höôûng cuûa thôøi gian nuoâi moác tôùi hoaït tính protease Sau khi ñaõ tieán haønh khaûo saùt caùc yeáu toá veà tæ leä phoái troän nguyeân lieäu, ñoä aåm moâi tröôøng nuoâi caáy, tæ leä moác caáy thích hôïp cho quaù trình nuoâi moác sinh toång hôïp protease, chuùng toâi tieán haønh khaûo saùt vaø choïn thôøi gian thích hôïp ñeå protease sinh toång hôïp bôûi Asp. oryzae coù hoaït tính cao nhaát. Ñieàu kieän thí nghieäm ñöôïc thöïc hieän nhö sau: Caùc yeáu toá coá ñònh trong quaù trình nuoâi naám moác: Thaønh phaàn moâi tröôøng (khoâ laïc : boät mì) laø 90:10 (w/w). Ñoä aåm moâi tröôøng nuoâi caáy: 60% Tæ leä moác caáy: 0.035% (w baøo töû /w moâi tröôøng) Nhieät ñoä nuoâi moác: nhieät ñoä phoøng Yeáu toá thay ñoåi: Thôøi gian nuoâi caáy thay ñoåi laàn löôït laø: 24h, 36h, 42h, 48h, 60h, 72h. Keát quaû ño hoaït tính protease thu ñöôïc nhö sau: BAÛNG 4.9: Aûnh höôûng cuûa thôøi gian nuoâi caáy ñeán hoaït tính protease (laàn 1) Thôøi gian nuoâi caáy Hoaït tính protease tb (Ñvhñ/g ctk) 0 giôø 0.00 24 giôø 1.96a 36 giôø 3.68b 42 giôø 4.25c 48 giôø 5.30d 60 giôø 3.56b 72 giôø 2.99e Chuù thích: “a, b, c, d…”: kí töï gioáng nhau thì caùc giaù trò khaùc bieät khoâng coù yù nghóa, kí töï khaùc nhau thì caùc giaù trò khaùc bieät coù yù nghóa vôùi P<0,05 HÌNH 4.5: Quan heä giöõa thôøi gian nuoâi caáy vaø hoaït tính protease (laàn 1) Nhaän thaáy, hoaït tính protease ñaït cöïc ñaïi sau 48 giôø nuoâi caáy. Chuùng toâi tieáp tuïc thí nghieäm nuoâi caáy naám moác vôùi caùc khoaûng thôøi gian nuoâi caáy dao ñoäng xung quanh giaù trò 48 giôø. Keát quaû ño hoaït tính protease nhö sau: BAÛNG 4.10: Aûnh höôûng cuûa thôøi gian nuoâi caáy ñeán hoaït tính protease töø Asp. oryzae (laàn 2) Thôøi gian nuoâi caáy Hoaït tính protease tb (Ñvhñ/g ctk) 0 giôø 0.00 24 giôø 2.29a 42 giôø 3.57d 43 giôø 4.21e 44 giôø 4.50f 45 giôø 4.13e 46 giôø 3.82de 47 giôø 3.15c 48 giôø 3.10c 49 giôø 2.97bc 50 giôø 2.67ab 51 giôø 2.67ab 52 giôø 2.65ab 53 giôø 2.65ab 54 giôø 2.48a 60 giôø 2.37a Chuù thích: “a, b, c, d…”: kí töï gioáng nhau thì caùc giaù trò khaùc bieät khoâng coù yù nghóa, kí töï khaùc nhau thì caùc giaù trò khaùc bieät coù yù nghóa vôùi P<0,05 HÌNH 4.6: Quan heä giöõa thôøi gian nuoâi caáy vaø hoaït tính protease (laàn 2) HÌNH 4.6 cho ta thaáy söï thay ñoåi hoaït tính cuûa enzym tuaân theo quy luaät nhö sau: trong khoaûng thôøi gian ñaàu, hoaït ñoä protease taêng daàn, ñeán moät thôøi ñieåm, hoaït ñoä protease ñaït cöïc ñaïi vaø sau ñoù giaûm daàn. Ñieàu naøy coù theå ñöôïc giaûi thích nhö sau: Ban ñaàu, naám moác söû duïng caùc chaát coù phaân töû löôïng thaáp trong moâi tröôøng ñeå phaùt trieån. Do ñoù, hoaït löïc protease chæ toàn taïi ôû daïng veát trong canh tröôøng nuoâi caáy. Do haøm löôïng caùc chaát dinh döôõng coù phaân töû löôïng thaáp trong moâi tröôøng khoâng nhieàu neân giai ñoaïn tieáp theo, naám moác baét buoäc sinh toång hôïp nhoùm enzym phaân giaûi caùc chaát dinh döôõng coù phaân töû löôïng cao thaønh nhöõng phaân töû löôïng thaáp, deã haáp thu qua maøng teá baøo, trong ñoù coù enzym protease. Hoaït tính protease do naám moác taïo ra baét ñaàu taêng daàn vaø ñaït cöïc ñaïi. Neáu tieáp tuïc keùo daøi thôøi gian nuoâi caáy, haøm löôïng caùc chaát dinh döôõng giaûm daàn, quaù trình trao ñoåi chaát cuûa naám moác vaø moâi tröôøng giaûm do teá baøo ñaõ ñeán giai ñoaïn giaø. Maët khaùc, caùc saûn phaåm trao ñoåi chaát trong moâi tröôøng quaù nhieàu baét ñaàu öùc cheá quaù trình trao ñoåi chaát cuûa teá baøo neân quaù trình sinh toång hôïp enzym protease seõ giaûm daàn. Ngoaøi ra, do laø enzym thuûy phaân neân caùc phaân töû protease coù theå thuûy phaân laãn nhau, laøm giaûm hoaït tính protease. Nhö vaäy, vieäc sinh toång hôïp enzym caûm öùng protease lieân quan khaù maät thieát vôùi vieäc phaân giaûi cô chaát dinh döôõng vaø sinh tröôûng vaø trao ñoåi chaát cuûa naám moác. Nhöõng thay ñoåi quan saùt ñöôïc trong quaù trình nuoâi caáy naám moác dieãn ra nhö sau: Trong khoaûng 6-10 giôø ñaàu tieân, ñaây laø giai ñoaïn naám moác thích nghi vôùi moâi tröôøng nuoâi caáy neân chöa tieán haønh sinh saûn. Enzym baét ñaàu ñöôïc toång hôïp ôû giai ñoaïn naøy nhöng khoâng ñaùng keå. Trong khoaûng 14-36 giôø tieáp theo, khuaån ti xuaát hieän roõ reät, luùc naøy nguyeân lieäu hôi keát baùnh. Heä sôïi naám baét ñaàu phaùt trieån nhanh, maøu traéng ngaø, nhieät ñoä moâi tröôøng taêng leân khoaûng 30-32oC. Töø 36-48 giôø, naám moác baét ñaàu sinh baøo töû, heä sôïi chuyeån daàn töø maøu traéng sang maøu vaøng nhaït. Luùc naøy laø giai ñoaïn enzym protease ñöôïc hình thaønh chuû yeáu vaø hoaït tính cao nhaát. Sau 48 giôø, heä sôïi chuyeån daàn töø maøu vaøng sang maøu vaøng luïc. Nguoàn cô chaát trong moâi tröôøng coøn ít, quaù trình trao ñoåi chaát dieãn ra yeáu daàn vaø coù theå keát thuùc giai ñoaïn nuoâi moác ñeå chuyeån sang giai ñoaïn thuûy phaân. Quan saùt ñoà thò, ta nhaän thaáy, taïi thôøi ñieåm 44 giôø sau khi nuoâi caáy, ta thu ñöôïc giaù trò hoaït tính protease laø cao nhaát vaø giaù trò hoaït tính laø khaùc nhau coù yù nghóa so vôùi caùc giaù trò taïi caùc thôøi ñieåm nuoâi caáy khaùc. Nhö vaäy, 44 giôø laø thôøi gian thích hôïp ñeå nuoâi caáy naám moác sinh protease coù hoaït tính cao nhaát vôùi caùc ñieàu kieän thí nghieäm neâu treân. Theo caùc taøi lieäu nghieân cöùu veà thôøi gian sinh tröôûng cuûa Asp.oryzae thì thôøi gian nuoâi moác ñeå laøm gioáng laø 60-70 giôø vì luùc naøy baøo töû môùi hình thaønh ñaày ñuû, coøn ñeå hình thaønh protease cöïc ñaïi laø trong khoaûng 36-42giôø. Tuøy thuoäc vaøo hoaït löïc cuûa chuûng naám moác ñem nuoâi caáy maø thôøi gian coù theå daøi hay ngaén hôn [2]. Keát quaû khaûo saùt thôøi gian nuoâi caáy moác thích hôïp cuûa chuùng toâi laø 44 giôø, töông töï nhö keát quaû cuûa nhöõng nghieân cöùu tröôùc ñaây. Trong thöïc teá saûn xuaát nöôùc töông leân men ôû moät soá quoác gia treân theá giôùi, thôøi gian nuoâi moác ñöôïc aùp duïng nhö sau: Nhaät Baûn: Ñoái vôùi moâi tröôøng nuoâi caáy chöùa (50-90%) haït ñaäu naønh hoaëc khoâ ñaäu naønh vaø(10-50%) boät mì thì quaù trình nuoâi moác ñöôïc thöïc hieän trong khoaûng 30 ñeán 50 giôø, nhieät ñoä nuoâi caáy laø 20-40oC. Thoâng thöôøng, hoï choïn 44 giôø laøm thôøi gian nuoâi caáy thích hôïp (Bajracharya vaø coäng söï) [12]. Thaùi Lan: Söû duïng baøo töû Asp.oryzae ñeå nuoâi caáy treân moâi tröôøng haït ñaäu naønh vaø boät mì theo tæ leä 7:1. Thôøi gian nuoâi caáy keùo daøi 40-48 giôø, taïi nhieät ñoä phoøng [15]. Indonesia: Thôøi gian nuoâi caáy moác treân moâi tröôøng 100% ñaäu naønh keùo daøi 3 ngaøy (72 giôø), ôû nhieät ñoä phoøng [16]. Neáu keùo daøi thôøi gian nuoâi caáy, naám moác seõ chuû yeáu hình thaønh baøo töû vaø löôïng enzym protease ñöôïc sinh toång hôïp ra vôùi hoaït tính thaáp. Hôn nöõa, thôøi gian nuoâi caáy quaù daøi seõ aûnh höôûng tôùi naêng suaát thieát bò vaø lôïi nhuaän kinh teá cuûa nhaø saûn xuaát. Nhö vaäy, choïn thôøi ñieåm keát thuùc thích hôïp cho quaù trình nuoâi caáy naám moác laø raát quan troïng. KEÁT LUAÄN VAØ KIEÁN NGHÒ Keát luaän Qua quaù trình nghieân cöùu, vôùi nhöõng keát quaû ñaït ñöôïc, chuùng toâi coù theå keát luaän nhö sau: Ñeå naám moác Aspergillus ozyae sinh toång hôïp enzym protease coù hoaït tính cao nhaát treân moâi tröôøng nuoâi caáy laø hoãn hôïp khoâ laïc vaø boät mì thì caùc thoâng soá thích hôïp cuûa quaù trình nuoâi moác laø: Tæ leä phoái troän nguyeân lieäu khoâ laïc vaø boät mì laø 90:10 Ñoä aåm moâi tröôøng laø 60% Tæ leä moác caáy laø 0.035% (khoái löôïng baøo töû khoâ/khoái löôïng moâi tröôøng nuoâi tröôøng) Thôøi gian nuoâi moác laø 44 giôø Khi ñoù, hoaït tính protease thu ñöôïc laø 4.50 (ñvhñ/g ctk) Ñieàu kieän thích hôïp thuûy phaân protein töø canh tröôøng khoâ laïc vaø boät mì ñeå haøm löôïng N amin töï do ñaït cao nhaát nhö sau: Tæ leä canh tröôøng : dung moâi (nöôùc muoái) trong quaù trình thuûy phaân laø 1:2 Noàng ñoä muoái trong dung dòch nöôùc muoái:10% (w/v) Nhieät ñoä thuûy phaân: 500C pH: 6.5 Thôøi gian thuûy phaân: 60 giôø Khi ñoù, löôïng N toång vaø N amin trong dòch thuûy phaân laø 10.34 (g/l) vaø 8.67 (g/l). Vieäc boå sung cheá phaåm protease trong quaù trình thuûy phaân cho keát quaû nhö sau: Khi boå sung cheá phaåm protease ôû thôøi ñieåm ñaàu cuûa quaù trình thuûy phaân thì: Ñoái vôùi cheá phaåm Neutrase: Tæ leä boå sung thích hôïp laø 0.5% (khoái löôïng dòch enzym/khoái löôïng canh tröôøng). Thôøi gian thuûy phaân laø 36 giôø. Haøm löôïng N toång vaø N amin thu ñöôïc trong dòch thuûy phaân laø 11.34 (g/l) vaø 8.37 (g/l) Ñoái vôùi cheá phaåm Flavourzymes: Tæ leä boå sung thích hôïp laø 0.5% (khoái löôïng dòch enzym/khoái löôïng canh tröôøng). Thôøi gian thuûy phaân laø 48 giôø. Haøm löôïng N toång vaø N amin thu ñöôïc trong dòch thuûy phaân laø 14.41 (g/l) vaø 8.93 (g/l) Kieán nghò Sau khi ñaõ coù ñöôïc nhöõng keát quaû treân, chuùng toâi coù moät soá kieán nghò nhö sau: Ñeå naâng cao hôn nöõa haøm löôïng acid amin trong nöôùc töông thaønh phaåm, taêng hieäu suaát thuûy phaân protein cuûa nguyeân lieäu, chuùng toâi ñeà nghò caùc höôùng nghieân cöùu tieáp theo nhö sau: Khaûo saùt choïn cheá ñoä boå sung nöôùc muoái nhieàu laàn trong quaù trình thuûy phaân. Khaûo saùt choïn cheá ñoä boå sung cheá phaåm enzym nhieàu laàn trong quaù trình thuûy phaân. Khaûo saùt vieäc boå sung keát hôïp nhieàu loaïi cheá phaåm enzym. Nghieân cöùu hoaøn thieän nöôùc töông thaønh phaåm veà muøi vò, maøu saéc theo höôùng: Ñieàu höông – ñieàu vò cho nöôùc töông baèng caùch söû duïng vi sinh vaät hoaëc baèng caùch boå sung caùc hôïp chaát taïo höông, vò ñaõ ñöôïc toång hôïp saün. Taøi lieäu tham khaûo 1. Nguyeãn Troïng Caån, Coâng ngheä enzym, Nhaø xuaát baûn Noâng nghieäp, 1998. 2. Ngaïc Vaên Daäu, Cheá bieán ñaäu naønh vaø laïc thaønh thöùc aên giaøu protein, Nhaø xuaát baûn Noâng nghieäp, 1983. 3. Nguyeãn Laân Duõng (chuû bieân), Vi sinh vaät hoïc, Nhaø xuaát baûn giaùo duïc, 2003. 4. Leâ Song Döï, Giaùo trình caây laïc, Boä Noâng nghieäp – Vuï ñaøo taïo, Nhaø xuaát baûn Noâng nghieäp, 1979. 5. Traàn Bích Lam, Toân Nöõ Minh Nguyeät, Ñinh Traàn Nhaät Thu, Thí nghieäm hoùa sinh thöïc phaåm, Nhaø xuaát baûn Ñaïi hoïc Quoác Gia Tp. Hoà Chí Minh, 2004. 6. Nguyeãn Ñöùc Löôïng (chuû bieân), Coâng nghieäp enzym, Nhaø xuaát baûn Ñaïi hoïc Quoác Gia Tp. Hoà Chí Minh, 2004. 7. Nguyeãn Ñöùc Löôïng, Coâng ngheä vi sinh taäp 2, Vi sinh vaät hoïc coâng nghieäp, Nhaø xuaát baûn Ñaïi hoïc Quoác Gia Tp. Hoà Chí Minh , 2002. 8. Nguyeãn Ñöùc Löôïng, Thöïc phaåm leân men truyeàn thoáng, Nhaø xuaát baûn Ñaïi hoïc Quoác Gia Tp. Hoà Chí Minh, 2004. 9. Leâ Vaên Thaïch, Kyõ thuaät eùp daàu vaø cheá bieán daàu môõ thöïc phaåm, Nhaø xuaát baûn Khoa hoïc & Kyõ thuaät, 1993. 10. Leâ Ngoïc Tuù(chuû yeáu), Hoùa sinh coâng nghieäp, Nhaø xuaát baûn Khoa hoïc vaø Kyõ thuaät. Haø Noäi, 2002. 11. Dieäp Thanh Xuaân, Nghieân cöùu leân men baõ ñaäu naønh ñeå saûn xuaát nöôùc chaám, Luaän vaên toát nghieäp Ñaïi hoïc ngaønh coâng ngheä thöïc phaåm, Tp. Hoà Chí Minh, 2007. 12. Bajracharya et al, Process for producing soya sauce, United States Patent, 1992. 13. Danji Fukushima, Industrialization of fermented soy sauce production centering around Japanese shoyu, Noda Institude for scientific research, Noda-shi, Japan. 14. Tzou-Chi Huang & Der-Feng Teng, Soy sauce: Manufacturing & Biochemical changes, National Pingtung University of science & technology, Pingtung, Taiwan. 15. Thawatchai Mongkolwai, “Technology transfer for small and medium soy sauce fermentation factories in Thailan: a consortium approach”, Food research international, vol.30, No.8, pp.555-563, 1997. 16. Wilfred F.M Roling, Physical factors influencing Microbial interactions and biochemical changes during the Baceman stage of Indonesian Kecap (Soy sauce) production, Journal of fermentation and bioengineering, vol.77, No.3, pp 293-300, 1994. 17. Williams, Koji process for producing soy sauce, United States Patent, 1980. 18. http// : www.wikipedia.com Phuï luïc Ñöôøng chuaån tyrosine trong xaùc ñònh hoaït tính protease Baûng 1: Keát quaû ño ñoä haáp thu cuûa dung dòch tyrosine chuaån Noàng ñoä tyrosine (mol/ml) 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 Ñoïâ haáp thu 0 0.129 0.262 0.361 0.486 0.602 0.724 Phöông trình ñöôøng chuaån: y = 0.4122x Trong ñoù: x – Ñoä haáp thu ôû böôùc soùng 750nm y – Noàng ñoä tyrosine trong dung dòch ñem so maøu (mol/ml) coâng thöùc tính löôïng aåm boå sung theâm Trong ñoù: X- Löôïng nöôùc caàn boå sung theâm a – Ñoä aåm cuûa hoãn hôïp nguyeân lieäu ban ñaàu b – Troïng löôïng nguyeân lieäu cho moät laàn nuoâi caáy c – Troïng löôïng chaát khoâ caàn ñaït ñöôïc sau khi chænh aåm Ñònh löôïng N toång Hoùa chaát: H2SO4 thoâ H2SO4 0,1N NaOH 0,1N NaOH 40% HclO4 tinh khieát Phenolphthalein 1% Caùch tieán haønh: Tröôùc tieân maãu ñöôïc voâ cô hoùa baèng H2SO4 ñaäm ñaëc ôû nhieät ñoä cao vaø coù chaát xuùc taùc. Caùc phaûn öùng cuûa quaù trình oxy hoùa xaûy ra nhö sau: Oxy taïo thaønh laïi oxy hoùa caùc nguyeân toá khaùc: Carbon taïo thaønh CO2, hydro taïo thaønh H2O, coøn nitô giaûi phoùng ra döôùi daïng NH3 keát hôïp vôùi H2SO4 dö taïo thaønh (NH4)2SO4 tan trong dung dòch. Ñuoåi NH3 ra khoûi dung dòch baèng NaOH Caát vaø thu NH3 baèng moät löôïng dö H2SO4 0,1N. Ñònh phaân löôïng H2SO4 coøn laïi baèng dung dòch NaOH 0,1N chuaån. Qua ñoù tính ñöôïc löôïng Nitô coù trong maãu nguyeân lieäu thí nghieäm. Voâ cô hoùa maãu: tieán haønh trong tuû hotte: huùt moät theå tích maãu nhaát ñònh cho vaøo bình Kjeldahl. Theâm töø töø 10ml H2SO4 ñaäm ñaëc. Ñeå taêng nhanh quaù trình voâ cô hoùa caàn phaûi cho theâm chaát xuùc taùc, coù theå duøng HClO4 giaûi phoùng O2 cho phaûn öùng oxy hoùa. Caát ñaïm: tieán haønh trong maùy caát ñaïm töï ñoäng Gerhardt. Maãu sau khi caát ñaïm ñöôïc ñem ñi ñònh phaân baèng dung dòch NaOH 0,1N. Coâng thöùc tính toaùn: Trong ñoù: x: haøm löôïng nitô toång (g/l). a: soá ml H2SO4 0,1N ñem haáp thuï NH3 (ml). b: soá ml NaOH 0,1N tieâu toán cho chuaån ñoä (ml). T: heä soá hieäu chænh noàng ñoä NaOH 0,1N. 0,0014: löôïng gam nitô öùng vôùi 1ml H2SO4 0,1N. Vdm: theå tích ñònh möùc (ml). Vm: soá ml maãu ñem voâ cô hoùa (ml). ñònh löôïng nitô amin (AOAC) Ñònh löôïng nitô amin baèng phöông phaùp so maøu, söû duïng nynhydrin. Hoùa chaát Dung dòch chuaån glycine: hoøa tan 0,1072g glycine vaø ñònh möùc ñeán 100ml. Baûo quaûn ôû 4oC. Tröôùc khi söû duïng pha loaõng dung dòch naøy 100 laàn ñöôïc dung dòch A. Hoøa tan 10g Na2HPO4.12H2O, 6g KH2PO4, 0,5g ninhydrin vaø 0,3g fructose trong nöôùc vaø ñònh möùc ñeán 100ml ñöôïc dung dòch B. Chænh pH cuoái 6,6 – 6,8. Dung dòch B ñöôïc baûo quaûn trong toái ôû 4oC, duøng trong 2 tuaàn. Hoøa tan 1g KIO3 trong 300ml nöôùc caát vaø 200ml coàn 96% v/v ñöôïc dung dòch C. Dung dòch C ñöôïc baûo quaûn ôû 5oC. Caùch tieán haønh. Cho 2ml maãu vaø 1ml dung dòch B vaøo moãi 3 oáng nghieäm. Ñun caùch thuûy (ôû 100oC) trong 16phuùt, laøm nguoäi veà nhieät ñoä 20oC trong thôøi gian 20 phuùt. Cho tieáp vaøo oáng nghieäm 5ml dung dòch C, laéc ñeàu vaø ño ñoä haáp thu ôû böôùc soùng 570nm. Laøm 3 maãu chuaån song song vôùi 2ml dung dòch A. Laøm maãu traéng vôùi 2 ml dung dòch nöôùc caát ñeå hieäu chænh maùy so maøu veà 0. Keát quaû. N = Trong ñoù: N: soá mg nitôamin coù trong 1l dòch nha caàn ño. A1: ñoä haáp thu cuûa maãu thí nghieäm. A2: ñoä haáp thu cuûa maãu chuaån (giaù trò trung bình). d : heä soá pha loaõng cuûa maãu ñònh löôïng nitô ammoniac Hoùa chaát, caùch tieán haønh, coâng thöùc tính toaùn: Gioáng vôùi phöông phaùp xaùc ñònh N toång baèng Microkieldahl, chæ khaùc laø khoâng tieán haønh voâ cô hoùa maãu. ñònh löôïng lipid Hoùa chaát : Ete etylic hoaëc ete daàu hoaû. Tieán haønh Saáy khoâ nguyeân lieäu ñeán khoái löôïng khoâng ñoåi (100-1050C). Caân 50g nguyeân lieäu ñaõ nghieàn nhoû cho vaøo goùi giaáy. Ñaët vaøo truï chieát. Laép truï vaøo bình caàu vaø gaén oáng sinh haøn (coù dung moâi trong bình caàu), qua oáng sinh haøn duøng pheãu cho dung moâi vaøo truï chieát sao cho moät löôïng dung moâi ñaõ chaûy xuoáng bình caàu, moät löôïng treân pheãu coøn ngaäp maãu. Duøng boâng laøm nuùt ñaàu oáng sinh haøn. Môû nöôùc laïnh. Môû coâng taéc ñeøn. Chieát 8-12h. Thöû xem heát chaát beùo chöa ôû ñaàu xiphon (khoâng coøn veát daàu khi dung moâi bay hôi). Laáy goùi giaáy, ñaët döôùi tuû hotte cho bay hôi dung moâi. Saáy ôû 100-1050C trong 1,5h. Ñeå nguoäi ôû bình huùt aåm. Caân treân caân phaân tích. Coâng thöùc Löôïng Lipid thoâ : Trong ñoù: M1 : khoái löôïng goùi giaáy vaø maãu ban ñaàu. M2 : khoái löôïng goùi giaáy vaø maãu sau khi trích vaø saáy. M : khoái löôïng maãu ban ñaàu. ñònh löôïng tinh boät Hoùa chaát duïng cuï Caùc duïng cuï ñeå xaùc ñònh ñöôøng khöû Enzym amilase vaø caùc hoùa chaát xaùc ñònh ñöôøng khöû (xem [5]) Caùch tieán haønh Caân 1-2g maãu, nghieàn nhuyeãn trong coái chaøy söù, chuyeån vaøo becher vaø theâm 3ml nöôùc caát. Khuaáy ñun soâi ñeå hoà hoùa tinh boät. Laøm nguoäi tôùi 40oC vaø theâm vaøo 2ml dung dòch enzym amilase ñeå thuûy phaân hoaøn toaøn tinh boät trong 20 phuùt. Kieåm tra ñaõ thuûy phaân hoaøn toaøn baèng moät gioït thuoác thöû Liugon. Sau ñoù tieán haønh gioáng nhö maãu xaùc ñònh ñöôøng khöû baèng phöông phaùp Ferrycyanure( tham khaûo [5]) Tính keát quaû Haøm löôïng tinh boät % trong maãu nguyeân lieäu: Trong ñoù: Xtb – haøm löôïng % ñöôøng khöû sau thuûy phaân Xk - haøm löôïng % ñöôøng khöû tröôùc thuûy phaân 0.9 - heä soá chuyeån ñoåi töø glucose sang tinh boät ñònh löôïng cellulose Duïng cuï, hoùa chaát Tuû saáy, loø nung, coái chaøy söù, cheùn nung. Bình caàu 150 coù gaén oáng sinh haøn khí, pheãu, giaáy loïc khoâng tro, becher. HCl ñaëc, KOH 10%, CH3COOH 2%. Thuoác thöû Liugon. Tieán haønh Caân 25g nguyeân lieäu ñaõ ñöôïc nghieàn mòn, cho vaøo moät bình caàu cao coå ñaõ chöùa 50ml nöôùc caát, theâm vaøo 10ml HCl ñaäm ñaëc. Ñaët bình caàu leân beáp ñieän trong tuû hotte, gaén oáng sinh haøn khí vaø ñun soâi thaät kyõ cho ñeán khi tinh boät bò thuûy phaân hoaøn toaøn, thöû ñieåm keát thuùc thuûy phaân baèng caùch chaám moät gioït dung dòch thuûy phaân leân lam kính vaøo gioït thuoác thöû Luigon ñeán maát maøu xanh. Laáy bình caàu ra khoûi beáp, loïc qua giaáy loïc khoâng tro, laáy baõ. Röûa baõ nhieàu laàn baèng nöôùc caát. Duøng bình tia nöôùc chuyeån heát baõ vaøo laïi bình caàu ñaõ duøng treân. Theâm vaøo bình caàu 10ml KOH 10%. Ñaët bình caàu leân beáp, ñun soâi 20- 30 phuùt nöõa. Loïc laáy baõ treân hai giaáy loïc khoâng tro coù troïng löôïng baèng nhau. Röûa baõ 5 laàn baèng nöôùc caát, moãi laàn 20ml. Sau ñoù röûa 3 laàn baèng dung dòch CH3COOH 2% roài baèng röôïu etylic nguyeân chaát (coàn tuyeät ñoái). Sau khi röûa baõ coù maøu traéng trong laø ñöôïc. Ñaët caû 2 giaáy loïc vaø baõ vaøo ñóa petri roài ñöa vaøo tuû saáy 1050C trong 2 giôø, laáy ra ñeå nguoäi trong bình huùt aåm vaø caân. Ñöa caû hai giaáy loïc vaø baõ vaøo cheùn nung (ñaõ ñöôïc nung trong loø nung ôû 400- 5000C, ñeå nguoäi vaø caân treân caân phaân tích), tieán haønh nung baõ trong loø nung ôû nhieät ñoä 400- 5000C trong 3 giôø ñeán khoái löôïng khoâng ñoåi. Laáy ra ñeå nguoäi trong bình huùt aåm vaø caân cheùn nung chöùa tro sau khi nung. Tính keát quaû Löôïng cellulose coù trong maãu ñöôïc tính theo coâng thöùc: Trong ñoù: m1: khoái löôïng baõ sau khi saáy (g). m 2: khoái löôïng cheùn nung vaø tro sau khi nung (g). m 3: khoái löôïng cheùn nung (g). m: khoái löôïng maãu (g). ñònh löôïng tro Tieán haønh: Nung cheùn söù ñaõ röûa saïch ôû loø nung (6000C) ñeán troïng löôïng khoâng ñoåi. Ñeå nguoäi ôû bình huùt aåm vaø caân treân caân phaân tích. Cho vaøo cheùn m (g) chaát thöû, caân treân caân phaân tích roài cho vaøo loø nung 6000C, nung ñeán tro traéng. Laáy ra cho vaøo bình huùt aåm vaø caân chính xaùc treân caân phaân tích. Tieáp tuïc nung 30 phuùt roài laáy ra cho vaøo bình huùt aåm vaø caân chính xaùc treân caân phaân tích ñeán khoái löôïng khoâng ñoåi. Coâng thöùc: Ñoä tro = Trong ñoù: G laø troïng löôïng cheùn. G1 laø troïng löôïng cheùn vaø maãu. G2 laø troïng löôïng cheùn vaø tro. ñònh löôïng hoaït tính protease Hoùa chaát: Dung dòch Casein 1% pha trong dung dòch ñeäm 0,2N Glycin-NaOH pH 9,5. Thuoác thöû Folin