Khóa luận Phân biệt các loại thịt heo, bõ, cừu bằng phương pháp multiplex pcr

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN BIỆT CÁC LOẠI THỊT HEO, BÕ, CỪU BẰNG PHƢƠNG PHÁP MULTIPLEX PCR Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Khóa: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: TRỊNH THỊ THANH HUYỀN Thành phố Hồ Chí Minh 09/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN BIỆT CÁC LOẠI THỊT HEO, BÕ, CỪU BẰNG PHƢƠNG PHÁP MULTIPLEX PCR Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS. TS. NGUYỄN NGỌC TUÂN TRỊNH THỊ THANH HUYỀN KS. LƢƠNG QUÝ PHƢƠNG Thành phố Hồ Chí Minh 09/2007 iii LỜI CẢM ƠN Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến: Thầy PGS.TS. Nguyễn Ngọc Tuân, Giảng viên khoa Chăn nuôi thú y, trƣờng Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Cô PGS.TS Trần Thị Dân, Giảng viên khoa Chăn nuôi thú y, trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh. KS. Lƣơng Quý Phƣơng, Trung tâm Phân tích thí nghiệm hóa sinh trƣờng Đại Học Nông Lâm Đã tận tình hƣớng dẫn, ủng hộ và giúp đỡ tôi thực hiện và hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp. Xin chân thành cảm ơn: - Ban Giám Hiệu trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, Ban Chủ Nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong suốt thời gian học tại trƣờng. - Ban giám đốc, thầy cô và các cán bộ công chức Trung tâm phân tích thí nghiệm hóa sinh trƣờng Đại Học Nông Lâm, đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực tập và hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp . - Thầy Đinh Xuân Phát đã nhiệt tình giúp đỡ, động viên tôi trong quá trình học tập cũng nhƣ thực hiện khóa luận. Tập thể các bạn sinh viên lớp Công nghệ sinh học 29 - Trƣờng Đại học Nông Lâm TP. HCM đã luôn bên tôi những lúc khó khăn, cùng tôi chia sẻ vui buồn trong quá trình học và quá trình thực hiện khóa luận. Và đặc biệt con xin thành kính ghi ơn Cha Mẹ đã sinh thành, dƣỡng dục con nên ngƣời, để con đƣợc nhƣ ngày hôm nay. Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 09 năm 2007. Sinh viên: Trịnh Thị Thanh Huyền. TÓM TẮT KHÓA LUẬN TRỊNH THỊ THANH HUYỀN, thực hiện khóa luận “Phân biệt ba loại thịt heo, bò cừu bằng phƣơng pháp multiplex PCR”. Hƣớng dẫn khoa học: PGS. TS. Nguyễn Ngọc Tuân KS. Lƣơng Quý Phƣơng Thời gian thực hiện từ tháng 2/2007 đến tháng 8/2007, tại Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hóa – Sinh, trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Để tạo tiền đề trong việc giải quyết vấn đề gian lận thƣơng mại đối với sản phẩm thịt tƣơi và thịt chế biến, bƣớc đầu chúng tôi tiến hành thiết lập quy trình phân biệt ba loại thịt heo, bò, cừu bằng phƣơng pháp multiplex PCR. Kết quả đạt đƣợc nhƣ sau: 1) Tách chiết DNA từ thịt tƣơi và thịt đã xử lý nhiệt ở nhiệt độ: 800C/15’, 120 0C/15’, 1200C/30’, 1300C/15’ với tỷ số OD trung bình là 2,0 (thịt tƣơi), 1,9 (thịt xử lý nhiệt)- tinh sạch, đạt tiêu chuẩn. 2) Sau khi tiến hành tối ƣu hóa phản ứng multiplex PCR bằng việc thử nghiệm nhiều quy trình (gồm quy trình của Matsunaga và ctv (1998) và các thử nghiệm điều chỉnh về thành phần hóa chất, nhiệt độ và thời gian của chu trình nhiệt, nồng độ mồi trong phản ứng), chúng tôi đã xác định đƣợc quy trình thích hợp, trong đó nồng độ MgCl2 2mM, lƣợng FSIM: RP: RB: RS lần lƣợt là 0,4: 0,83: 0,24: 0,17 M, nhiệt độ và thời gian của chu kỳ nhiệt ở giai đoạn lặp lại là: biến tính (940C/1phút), bắt cặp (540C/45giây), kéo dài (720C/1phút). 3) Sử dụng quy trình nultiplex PCR vừa tìm đƣợc đối với các hỗn hợp DNA của cả ba loài trong đó nồng độ DNA bò, cừu giảm dần và đã xác định đƣợc nồng độ của thịt cừu, bò mà quy trình này còn phát hiện đƣợc là 1ng/ l. 4) Chúng tôi tiếp tục thực hiện quy trình trên đối với các hỗn hợp thịt đã xử lý nhiệt ở các nhiệt độ khác nhau và rút ra kết luận là ở các nhiêt độ biến tính 80 0C/15’, 1200C/15’, 1200C/30’, 1300C/15’ vẫn còn phân biệt đƣợc ba loài trên. 5) Thực hiện quy trình trên với bột thịt của 3 hãng CE, A, VY, kết quả bột thịt của các hãng này có nguồn gốc lần lƣợt là: heo, bò, bò. SUMMARY TRINH THI THANH HUYEN in subject “Identifying meat of three meat species: pig, bovine, sheep by multiplex PCR” Suspervisors : PhD. Nguyen Ngọc Tuan BCs. Luong Quy Phuong To primarily resolve economic faudulent at meat products, we establish protocol to identify meat of three species (pig, bovine, sheep) by multiplex PCR. The results: 1) Extraction DNA from raw meats and heated meats (at temperatures: 80 0 C/15 min, 120 0 C/15 min, 120 0 C/30 min, 130 0 C/15 min), average ratio of OD were 2,0 (raw meat) and 1,9 ( heated meat) were pure, standard quality. 2) After optimizing procedures including protocol of Matsunaga et al.(1998) and changing volume of reaction, element of chemical, temperature and time of thermal cycle, concentration of primer), we established the suitable multiplex PCR protocol. This protocol was MgCl2 2 mM; concentration of primers FSIM: RP: RB: RS were 0,4: 0,83: 0,24: 0,17 M, temperature and thermal cycle (denature 94 0 C/1 min, anealing 54 0 C/45 sec, elongation 72 0 C/1 min). 3) Aplying the multiplex PCR protocol to analyse mix DNA from three meat with descending concentration on bovine DNA and sheep DNA, the limits of DNA sample detected were 1ng/ l for bovine and sheep. 4) Using the protocol for mix heated meats to reach the conlusion that at processing temperatures: 80 0 C/15 min, 120 0 C/15min, 120 0 C/30 min, 130 0 C/15min the meats of pig, bovine, sheep were still identified. Meat and bone meal from three companies (CE, A, VY) were examined by the established protocol, the products of those company were meat from pig, bovine and bovine, respectively. MỤC LỤC NỘI DUNG TRANG Bìa ............................................................................................................................. i Trang tựa .................................................................................................................. ii Lời cảm tạ ................................................................................................................ iii Tóm tắt khóa luận .................................................................................................... iv Summary .................................................................................................................. v Mục lục .................................................................................................................... vi Danh sách các chữ viết tắt ......................................................................................... x Danh sách các bảng ................................................................................................. xi Danh sách các hình và biểu đồ .......................................................................................... xii Chƣơng 1 MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1 1.1 Đặt vấn đề .......................................................................................................... 1 1.2 Mục đích ............................................................................................................ 2 1.3 Yêu cầu .............................................................................................................. 2 Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................................... 3 2.1 Sơ lƣợc về thịt chế biến ..................................................................................... 3 2.1.1 Giới thiệu về thịt ......................................................................................... 3 2.1.2 Giới thiệu về thịt chế biến ........................................................................... 4 2.1.3 Tình hình sản xuất và tiêu thụ thịt chế biến ................................................ 4 2.1.3.1 Tình hình gian lận trên thị trƣờng thịt tƣơi và thịt chế biến của thế giới .......................................................................................................... 4 2.1.3.2 Tình hình xuất nhập khẩu động vật và sản phẩm chế biến từ động vật ở Việt Nam .................................................................................... 5 2.2 Một vài đặc điểm về tế bào động vật ................................................................. 6 2.3 Cơ sở để phân biệt các loại thịt chế biến bằng phƣơng pháp multiplex PCR ... 7 2.4 Các phƣơng pháp phân biệt các loại thịt ........................................................... 8 2.4.1 Phƣơng pháp quan sát dƣới kính hiển vi quang học ................................... 8 2.4.2 Miễn dịch liên kết enzym (ELISA) ............................................................ 8 2.4.3 Protein array ................................................................................................ 9 2.4.4 Điện di 2 chiều ............................................................................................ 9 2.4.5. Giới thiệu chung về phƣơng pháp PCR (polymerase chain reaction) ..... 10 2.4.6 Nguyên tắc multiplex PCR ....................................................................... 16 2.5 Các công trình nghiên cứu về phát hiện loài trong thịt chế biến bằng phƣơng pháp multiplex PCR ................................................................................. 16 Chƣơng 3 NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................. 18 3.1 Nội dung thực hiện .......................................................................................... 18 3.2 Thời gian và địa điểm tiến hành ...................................................................... 18 3.3 Vật liệu ............................................................................................................ 19 3.3.1 Nguồn mẫu tách chiết DNA ..................................................................... 19 3.3.2 Đoạn mồi................................................................................................... 19 3.3.3 Hóa chất .................................................................................................... 19 3.3.3.1 Hóa chất dùng trong tách chiết DNA ............................................. 19 3.3.3.2 Hóa chất dùng trong điện di ........................................................... 19 3.3.3.3 Hóa chất dùng trong phản ứng PCR ............................................... 20 3.3.3.4 Thiết bị và dụng cụ ......................................................................... 20 3.4 Phƣơng pháp tiến hành .................................................................................... 20 3.4.1 Lấy và bảo quản mẫu ................................................................................ 20 3.4.2 Phối hợp các loại thịt để tạo hỗn hợp thịt và xử lý nhiệt .......................... 20 3.4.3 Tách chiết DNA ........................................................................................ 21 3.4.4 Thực hiện phản ứng s-PCR ....................................................................... 22 3.4.5 Tối ƣu hóa phản ứng m-PCR .................................................................... 24 3.4.5.1 Thực hiện phản ứng m-PCR theo quy trình của Matsugana và ctv (1998) ............................................................................................... 24 3.4.5.2 Thí nghiệm điều chỉnh thành phần phản ứng ................................. 24 3.4.5.3 Thí nghiệm điều chỉnh chu trình nhiệt ........................................... 24 3.4.5.4 Thí nghiệm điều chỉnh nồng độ mồi trong 1 phản ứng .................. 25 3.4.6 Thực hiện phản ứng m-PCR hai loài (heo, bò và heo, cừu) ở các nồng độ DNA khác nhau ................................................................................... 26 3.4.7 Thực hiện phản ứng m-PCR cho hỗn hợp DNA heo, bò, cừu .................. 27 3.4.8 S-PCR đối với DNA của thịt xử lý nhiệt ở các nhiệt độ khác nhau: 80 0C/15 phút, 1200C/15 phút, 1200C/30 phút, 1300C/15 phút .......................... 27 3.4.9 M-PCR để phát hiện thịt heo, bò, cừu trong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ở các nhiệt độ khác nhau .................................................................................... 28 3.4.10 M-PCR đối cới bột thịt ........................................................................... 28 Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................................. 29 4.1 Kết quả tách chiết ............................................................................................ 29 4.2 Kết quả s-PCR đối với thịt tƣơi thuần loài theo quy trình của Matsugana và ctv (1998) .......................................................................................................... 31 4.3 Kết quả phản ứng m-PCR 3 loài theo quy trình của Matsugana và ctv (1998) ............................................................................................................... 32 4.4 Kết quả quá trình thiết lập và tối ƣu hóa phản ứng m- PCR ........................... 33 4.4.1 Điều chỉnh thể tích phản ứng .................................................................... 33 4.4.2 Kết quả thí nghiệm điều chỉnh nồng độ Mg2+ .......................................... 33 4.4.3 Kết quả thí nghiệm điều chỉnh chu trình nhiệt ......................................... 34 4.4.4 Kết quả thí nghiệm điều chỉnh nồng độ mồi ............................................ 36 4.4.5 Kết quả kiểm tra tính ổn định của quy trình ............................................. 38 4.5 Kết quả m-PCR đối với 2 loài ......................................................................... 39 4.6 Kết quả m-PCR đối với các hỗn hợp DNA có nồng độ giảm dần của DNA bò, cừu ................................................................................................................... 40 4.7 Kết quả s-PCR của thịt xử lý nhiệt .................................................................. 40 4.8 Kết quả m-PCR đối với các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ...................................... 43 4.9 Kết quả m-PCR đối với bột thịt ....................................................................... 45 Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ....................................................................................... 47 5.1 Kết luận ........................................................................................................... 47 5.2 Đề nghị ............................................................................................................ 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 48 PHỤ LỤC .................................................................................................................. 51 DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2. 1. Tỉ lệ của các mô trong các loại thịt (%tính theo khối lƣợng thịt xẻ) ........ 3 Bảng 3. 1 Tỷ lệ các loại thịt trong các hỗn hợp thịt .................................................. 21 Bảng 3. 2 Thành phần hóa chất PCR ........................................................................ 23 Bảng 3. 3 Nồng độ mồi ngƣợc đối với mỗi loại thịt trong s-PCR ............................ 23 Bảng 3. 4 Chu trình nhiệt của phản ứng .................................................................... 23 Bảng 3. 5 Thành phần hóa chất PCR ........................................................................ 24 Bảng 3. 6 Chu trình nhiệt của phản ứng trƣớc và sau khi điều chỉnh ....................... 25 Bảng 3. 7 Điều chỉnh nồng độ mồi RS (giảm) .......................................................... 25 Bảng 3. 8 Điều chỉnh nồng độ mồi RP (tăng) ........................................................... 26 Bảng 3. 9 Phối hợp DNA của heo và bò ở các nồng độ khác nhau .......................... 26 Bảng 3. 10 Phối hợp DNA của heo và cừu ở các nồng độ khác nhau ...................... 27 Bảng 3. 11 Thành phần các hỗn hợp DNA heo, bò, cừu .......................................... 27 Bảng 3. 12 Hỗn hợp thịt ở các nhiệt độ xử lý khác nhau .......................................... 28 Bảng 4. 1 Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA của thịt bò, heo, cừu ................................ 29 Bảng 4. 2 Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA tách chiết từ thịt tƣơi và thịt xử lý nhiệt....... 30 DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ HÌNH TRANG Hình 4.1 Sản phẩm s-PCR theo quy trình của Matsugana và ctv (1999) ............... 32 Hình 4.2 Sản phẩm m-PCR theo quy trình của Matsugana và ctv (1998) .............. 33 Hình 4.3 Sản phẩm m-PCR khi điều chỉnh thể tích phản ứng ................................ 34 Hình 4.4 Sản phẩm m-PCR sau khi tăng nồng độ Mg2+ ......................................... 35 Hình 4.5 Sản phẩm m-PCR khi điều chỉnh nhiệt độ bắt cặp: 560C và 540C .......... 35 Hình 4.6 Sản phẩm m-PCR sau khi điều chỉnh chu trình nhiệt .............................. 36 Hình 4.7 Kết quả m-PCR khi giảm RS ................................................................... 38 Hình 4.8 Kết quả m-PCR khi tăng RP .................................................................... 38 Hình 4.9 Kết quả kiểm tra tính ổn định của quy trình ............................................ 39 Hình 4.10 Sản phẩm m-PCR đối với heo, bò .................................................................... 40 Hình 4.11 Sản phẩm m-PCR đối với DNA heo, cừu .............................................. 40 Hình 4.12 Kết quả m-PCR của các hỗn hợp DNA ................................................. 41 Hình 4.13 Kết quả s – PCR đối với thịt xử lý nhiệt ở 800C/15 phút ................................. 42 Hình 4.14 Kết quả phản ứng s-PCR đối với thịt xử lý nhiệt ở 1200C/15 phút ....... 42 Hình 4.15 Kết quả s-PCR của thịt xử lý nhiệt ở 1200C/30 phút ............................ 43 Hình 4.16 Sản phẩm s-PCR của thịt xử lý nhiệt ở 1300C/15 phút .......................... 43 Hình 4.17 Kết quả m-PCR đối với hỗn hợp thịt xử lý ở nhiệt độ 800C/15 phút ..... 44 Hình 4.18 Kết quả m – PCR đối với hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ở1200C/15 phút ...... 45 Hình 4.19 Kết quả m-PCR đối với hỗn hỗn hợp xử lý nhiệt 1200C/30 phút .......... 46 Hình 4.20 Kết quả m-PCR của các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ở 1300C/15 phút ....... 46 Hình 4.21 Kết quả m-PCR của bột thịt ................................................................... 47 BIỂU ĐỒ Biểu đồ 4. 1 So sánh tỷ số OD và nồng độ DNA của thịt heo, bò, cừu .................. 290 Biểu đồ 4. 2 So sánh tỷ số OD và nồng độ DNA của thịt tƣơi và thịt xử lý nhiệt .. 301 DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT bp: base pair BSE :Bovine spongiform encephalopathy ctv: cộng tác viên DNA: deoxyribonucleic acid dNTP : Deoxyribonucleotide triphosphate EDTA: ethylene diamine tetra acetate ELISA: enzyme link imuno assay Lad: Ladder MBM: Meat and bone meal mtDNA : mitochondrial cytochrome b DNA m – PCR : multiplex PCR NST: nhiễm sắc thể OD: optical density PCR: polymerase chain reaction SDS: sodium dodecyl sulfate RNA: ribonucleic acid Taq: Taq polymerase TBE: Tris borate EDTA TE: Tris EDTA t. bò: thịt bò t. cừu: thịt cừu t. heo: thịt heo TN: Thí nghiệm Tỷ số OD: tỷ số OD260 nm/OD280 nm UI: unit UV: ultra violet 1 Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Vấn đề chất lƣợng vệ sinh an toàn thực phẩm trong đó có các sản phẩm thịt tƣơi, thịt chế biến đã và đang là mối quan tâm của xã hội. Thịt chế biến thƣờng có nguồn gốc từ một loại hay nhiều loại thịt khác nhau. Do sự đa dạng về chất lƣợng, giá cả của các loại thịt đã gây ra vấn đề gian lận trong thƣơng mại (đối với cả thịt tƣơi và thịt chế biến). Đã có rất nhiều sản phẩm thịt trên thị trƣờng ghi thành phần trong công thức lệch với thực tế để nâng cao giá trị cho sản phẩm. Thịt chế biến thƣờng đƣợc xử lý ở nhiệt độ cao trên 1000C (khoảng 1200C đối với thịt hộp, xúc xích tiệt trùng…). Đặc biệt bột xƣơng thịt làm thức ăn gia súc (Meat and bone meal - MBM) tuy đƣợc xử lý ở nhiệt độ khoảng 1300C nhƣng lại đƣợc sản xuất từ những phụ phế phẩm trong công nghiệp giết mổ nên một số mầm bệnh nguy hiểm vẫn còn tồn tại và có khả năng gây bệnh. Ví dụ BSE (Bovine spongiform encephalopathy: bệnh bò điên) có khả năng lây sang ngƣời, protein prion gây bệnh này chỉ mất khả năng gây bệnh ở nhiệt độ 1800C. Hiện nay, các phƣơng pháp xử lý nhiệt thông thƣờng không thể loại bỏ đƣợc nguy cơ mầm bệnh BSE. Vì lý do này, các nƣớc trên thế giới trong đó có Việt Nam không cho phép nhập bột xƣơng thịt có nguồn gốc từ thịt bò, cừu, dê của các nƣớc Châu Âu, Châu Mỹ, Nhật Bản vì sợ bệnh BSE. Việc gian lận thƣơng mại sẽ gây ra vấn đề không thể kiểm soát nguồn gốc các thực phẩm nhập khẩu. Ngày nay, khi tình hình gian lận trong sản xuất và tiêu thụ sản phẩm thịt tƣơi, thịt chế biến vẫn diễn ra cùng với các dịch bệnh nguy hiểm liên tiếp hoành hành thì việc đảm bảo tính trung thực và an toàn của các sản phẩm này là rất cấp thiết. Điều này đặt ra cho các nhà quản lý và các nhà nghiên cứu phải tìm ra phƣơng pháp phát hiện, phân biệt nhanh chóng, chính xác các loại thịt trong sản 2 phẩm thịt tƣơi cũng nhƣ thịt chế biến để ngăn chặn kịp thời những gian lận nhằm mục đích bảo vệ lợi ích chính đáng và sức khỏe cho ngƣời tiêu dùng. Có nhiều cách để xác định nguồn gốc thịt: dùng kính hiển vi quang học, ELISA, điện di 2 chiều, protein array, multiplex PCR... Bốn phƣơng pháp đầu hoặc chậm hoặc không thể ứng dụng cho các sản phẩm thịt đã xử lý ở nhiệt độ cao. Còn phƣơng pháp multiplex PCR là một phƣơng pháp nhanh, đặc hiệu, đơn giản, thích hợp để phân biệt các loại thịt đã xử lý nhiệt. Vì vậy để tạo tiền đề cho việc giải quyết vấn đề trên, bƣớc đầu chúng tôi tiến hành xây dựng quy trình phân biệt ba loại thịt heo, bò, cừu trong hỗn hợp thịt chế biến bằng phƣơng pháp multiplex PCR. 1.2 Mục đích Bƣớc đầu xây dựng quy trình multiplex PCR phát hiện và phân biệt thịt heo, bò, cừu. Ứng dụng quy trình để phát hiện và phân biệt các hỗn hợp thịt đã xử lý nhiệt và bột thịt. 1.3 Yêu cầu Nắm vững qui trình tách chiết DNA. Tối ƣu hóa quy trình multiplex PCR và ứng dụng quy trình này vào việc phát hiện các loại bột thịt làm thức ăn gia súc. 3 Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sơ lƣợc về thịt chế biến 2.1.1 Giới thiệu về thịt Thịt là một khái niệm dùng để chỉ một số mô có giá trị sử dụng làm thực phẩm có nguồn gốc từ động vật. Trong thƣơng phẩm học thành phần của thịt gồm: mô cơ, mô mỡ, mô liên kết, mô xƣơng sụn và mô máu. Thành phần hóa học của thịt bao gồm: nƣớc, protein, lipit, glucit, các chất trích ly chứa nitơ và không chứa nitơ, khoáng, vitamin và enzym. Các thành phần này phụ thuộc vào loài thú, tuổi, giới tính, mục tiêu sử dụng, khẩu phần nuôi dƣỡng, mức độ và giai đoạn vỗ béo, bộ phận súc thịt và cơ thể học (Nguyễn Ngọc Tuân, Lê Thanh Hiền, 2004). Bảng 2. 1. Tỉ lệ của các mô trong các loại thịt (%tính theo khối lƣợng thịt xẻ) Loại mô Thịt bò Thịt heo Thịt cừu Mô cơ 57-62 % 40-62 % 49-58 % Mô mỡ 3-16 % 15-40 % 4-18 % Mô liên kết 9-12 % 6-8 % 7-11 % Mô xƣơng - sụn 17-29 % 8-18 % 18-38 % Mô máu 0,8-1 % 0,6-0,8 % 0,8-1 % (Theo Xmolxki, 1975) Tính chất của các mô và thành phần cấu tạo của các mô đều khác nhau. Do đó tùy theo đặc tính và tỉ lệ của các thành phần cấu tạo trong mỗi loại mô sẽ quyết định tính chất của thịt. Ngƣời ta thừa nhận mô mỡ và mô cơ có giá trị sử dụng cao nhất. Vì con ngƣời sử dụng thịt làm thực phẩm là để thỏa mãn nhu cầu về protein và lipit. 4 Ngoài ra theo khái niệm hiện nay, giá trị của thịt phụ thuộc vào sự đầy đủ và cân bằng về thành phần các axit amin thiết yếu. 2.1.2 Giới thiệu về thịt chế biến Thịt có giá trị sử dụng cao thì phải đƣợc chế biến thành nhiều dạng sản phẩm khác nhau tùy theo mục đích sử dụng khác nhau của giới tiêu dùng. Việc chế biến làm tăng sự ngon miệng, tăng khả năng hấp thụ các chất dinh dƣỡng, hạn chế sự hƣ hỏng do vi sinh vật, tăng thời gian bảo quản do đó tăng giá trị sử dụng của thịt (Romans và ctv, 1999). Thịt chế biến có hai nhóm chính: thịt chế biến làm thức ăn cho con ngƣời, thịt chế biến làm thức ăn cho gia súc. Thịt chế biến làm thức ăn cho con ngƣời đƣợc chế biến từ mô cơ, mô mỡ, mô liên kết. Riêng thịt chế biến dùng làm thức ăn gia súc (thƣờng là bột thịt) còn đƣợc chế biến từ các nguồn vật liệu giàu protein khác nhƣ: da, lông, móng, máu, hệ xƣơng và các nội quan (các phụ phế phẩm lò mổ). Có nhiều phƣơng pháp chế biến: phơi khô, muối, ƣớp đƣờng, lên men, xử lý nhiệt (nấu, hấp, sấy). Trong đó phƣơng pháp chế biến ở nhiệt độ cao là phổ biến nhất. Tùy theo loại sản phẩm và mục đích sử dụng mà ngƣời ta xử lý ở các nhiệt độ khác nhau. Hiện nay, hầu hết các sản phẩm chế biến nhƣ xúc xích, lạp xƣởng... đƣợc xử lý ở 800C; xúc xích tiệt trùng, thịt hộp các loại... thƣờng xử lý 1200C trở lên; đối với bột thịt sử dụng cho gia súc đƣợc xử lý ở 1300C (Hồ Thị Nguyệt Thu, 2003). 2.1.3 Tình hình sản xuất và tiêu thụ thịt chế biến 2.1.3.1 Tình hình gian lận trên thị trƣờng thịt tƣơi và thịt chế biến của thế giới Cơ quan tiêu chuẩn về thực phẩm (FSA – Food standard Agency) đã tổ chức nhiều cuộc điều tra trên đối tƣợng thịt và các sản phẩm thịt chế biến, kết quả cho thấy có rất nhiều sai lệch giữa thành phần thực tế với nhãn hiệu hàng hóa của sản phẩm. Nhất là sản phẩm thịt chế biến gồm nhiều loại thịt khác nhau, các nhà sản xuất thƣờng ghi trên nhãn sản phẩm những loại thịt có giá trị cao và tránh ghi những loại thịt có giá trị thấp đƣợc trộn vào trong sản phẩm. Một số trƣờng hợp lại ghi sai tỷ lệ 5 giữa các loại thịt. Trong khi đó, khả năng kiểm soát thành phần, độ an toàn và chất lƣợng sản phẩm thịt chế biến trên thị trƣờng của các tổ chức ban ngành có liên quan vẫn còn ít. (Nguồn: htm.) Một cuộc điều tra khác của bộ môn Kỹ thuật thực phẩm và vệ sinh thực phẩm, trƣờng Thú y, ĐH Ankara (Mỹ) (2006) về các loại thịt đƣợc trộn vào trong thịt và thịt chế biến. Trên 100 mẫu điều tra, kết quả là: 39,2% xúc xích lên men, 35,7 % xúc xích Ý, 27.2% xúc xích Đức, 22,2% thịt tƣơi, 6,2% thịt viên có chứa thịt của những loài động vật không công bố trên nhãn sản phẩm. Cụ thể là xúc xích lên men, xúc xích Ý, xúc xích Đức đƣợc công bố là chỉ chứa thịt bò nhƣng kết quả kiểm tra lại phát hiện có lẫn thịt gia cầm; các mẫu thịt bò tƣơi kết quả kiểm nghiệm lại cho dƣơng tính với thịt hƣơu và thịt ngựa; thịt bò viên lại có chứa thịt gia cầm. (Nguồn: www.blackwell-synergy.com/doi/abs/10.1111/j.1745-4573.2006.00046.x) 2.1.3.2 Tình hình xuất nhập khẩu động vật và sản phẩm chế biến từ động vật ở Việt Nam Ở Việt Nam, tình hình gian lận thƣơng mại trong sản xuất, tiêu thụ thịt và sản phẩm chế biến từ thịt là vấn đề nhức nhối đối với các nhà quản lý. Ngay cả thịt tƣơi bán ở chợ hay ở các cửa hàng cũng bị gian lận nhƣ: thịt trâu giả bò, thịt ngựa giả bò, heo giả thịt dê... Đối với thịt chế biến nhƣ xúc xích tôm, xúc xích bò, chả giò, thịt hộp… trên thị trƣờng có nhiều sản phẩm nghi ngờ không đúng thành phần nhƣ nhãn hiệu hàng hóa đã đăng kí, đặc biệt các thức ăn chế biến nhập khẩu. Chúng ta chƣa có các kỹ thuật để xác minh thành phần thịt trong sản phẩm. Những năm gần đây, Việt Nam nổi lên vấn đề về vệ sinh an toàn thực phẩm. Các bệnh dịch lớn đã và đang diễn ra. Tình trạng vận chuyển lậu động vật và các sản phẩm động vật vẫn thƣờng xảy ra. Cục Thú y đã phối hợp với Vụ Pháp chế – Bộ Nông nghiệp và PTNT, Cục An toàn vệ sinh thực phẩm – Bộ Y tế, Cục Quản lý Thị trƣờng – Bộ Thƣơng mại thƣờng xuyên tổ chức thanh tra, kiểm tra công tác 6 kiểm dịch nhập khẩu động vật, sản phẩm động vật, đặc biệt là hoạt động chống nhập lậu động vật, sản phẩm động vật qua biên giới. Kết quả thanh tra, kiểm tra cho thấy tình hình nhập lậu động vật, sản phẩm động vật qua biên giới diễn biến hết sức phức tạp, chính quyền địa phƣơng chƣa thực sự quan tâm chỉ đạo công tác ngăn chặn và xử lý nhập lậu động vật, sản phẩm động vật qua biên giới, sự phối hợp giữa các cơ quan, ban ngành tại địa phƣơng chƣa thống nhất và thiếu chặt chẽ. (nguồn: www.business.gov.vn/LicenseDetail.aspx?id=883 - 37k). Thêm vào đó công tác kiểm dịch đối với các mặt hàng xuất nhập khẩu có nguồn gốc động vật vẫn còn nhiều vấn đề bất cập: Các nhà xuất nhập khẩu đều có thể đáp ứng đƣợc các yêu cầu tiêu chuẩn kỹ thuật và quy định của Việt Nam. Tuy nhiên, do thiếu trang thiết bị và cán bộ, nên việc kiểm tra chất lƣợng, kiểm dịch và các thủ tục phê duyệt thƣờng kéo dài. Trong khi đó, các nƣớc nhập khẩu yêu cầu về đăng ký công bố chất lƣợng, kiểm dịch, kiểm soát giết mổ của các nƣớc nhập khẩu thƣờng rất chặt chẽ. Các yêu cầu, tiêu chuẩn về vệ sinh và an toàn thực phẩm của các nƣớc này cũng rất cao. Các nhà nhập khẩu nƣớc ngoài còn yêu cầu thịt và sản phẩm của thịt phải đƣợc lấy từ vùng an toàn đối với bệnh lở mồm long móng, dịch tả lợn, newcastle, BSE và những vùng này phải đƣợc tổ chức dịch tễ quốc tế (OIE) công nhận. Yêu cầu, tiêu chuẩn của Việt Nam thƣờng không chặt chẽ bằng các yêu cầu tiêu chuẩn của các nƣớc nhập khẩu (Bùi Thị Cúc, 2006) (Nguồn: http:// www.cucthuy.gov.vn). 2.2 Một vài đặc điểm về tế bào động vật Tế bào động vật thuộc dạng tế bào eukaryote, đƣợc bao quanh bởi màng tế bào, bên trong chứa nhân và các bào quan khác. Khác với các tế bào eukaryote khác nhƣ thực vật và nấm, tế bào động vật không có vách tế bào (cell wall) (nguồn: www.Micro.Magnet.fsu.edu/cells/animalcell.html - 40k). 7 Chính vì tế bào động vật không có vách vững chắc nên khi tách chiết DNA từ tế bào động vật không cần giai đoạn phá vỡ vách tế bào. Cũng do không có vách tế bào, tế bào động vật phát triển rất đa dạng về hình dạng. Đặc biệt là tế bào thần kinh và tế bào cơ (Davidson, 2005). Các tế bào động vật đƣợc nối với nhau bằng một loại protein cấu trúc xoắn bậc ba gọi là collagen. Còn ở thực vật và nấm các tế bào đƣợc nối với nhau bằng loại protein khác chẳng hạn nhƣ pectin. (Nguồn: www.Micro.Magnet.fsu.edu/cells/animals/animalmodel.html - 8k) Nguyên sinh chất của tế bào động vật chứa khoảng 85 % nƣớc và 15 % protein và các RNA, DNA, enzym, axit amin, các sản phẩm trung gian của sự trao đổi chất, muối khoáng…Mỗi tế bào thƣờng có một nhân, thƣờng có hình tròn hay hình bầu dục. Nhân thƣờng nằm ở giữa tế bào, nhƣng cũng có thể nằm lệch sát màng tế bào nhƣ ở tế bào cơ vân (Nguyễn Đình Trung, Nguyễn Minh Tâm, 2005). 2.3 Cơ sở để phân biệt các loại thịt chế biến bằng phƣơng pháp multiplex PCR Phƣơng pháp PCR thực chất là một phƣơng pháp tạo dòng trong ống nghiệm, nhằm mục đích thu nhận một lƣợng lớn bản sao của một trình tự xác định. Chính vì vậy, đoạn DNA mục tiêu đƣợc nhân lên rất nhiều lần và có thể đƣợc quan sát thông qua những kỹ thuật phân tách và điện di DNA (Hồ Huỳnh Thuỳ Dƣơng, 2002). Năm 1997, Sawyer đã khẳng định trên gen cytochrom b ở ty thể (mtDNA) có vùng bảo tồn cho các loài gia súc, gia cầm. Dựa vào đó tác giả thiết kế mồi xuôi cho việc khuếch đại một đoạn DNA của các loài gia súc, gia cầm này. Và dựa vào trình tự chuyên biệt cho từng loài trên mtDNA mà thiết kế mồi xuôi cho từng loài. Theo Matsugana và ctv (1998), việc sử dụng 7 đoạn mồi (1 mồi xuôi, 6 mồi ngƣợc) với tỉ lệ thích hợp để phát hiện một đoạn DNA chuyên biệt cho các loài bò, heo, gà, cừu, dê, ngựa. Các đoạn DNA chuyên biệt này của dê, gà, bò, cừu, heo, ngựa lần lƣợt có khích thƣớc: 157, 227, 274, 331, 398, 439 bp. Kết quả PCR đƣợc quan sát bằng điện di. Sự hiện diện hoặc vắng mặt sản phẩm PCR cho phép xác định có hay không thịt loài gia súc đó trong sản phẩm. 8 Nhằm xác định nồng độ nhỏ nhất để có thể phát hiện đƣợc loài từ thịt chế biến, năm 2004, Myers và ctv cũng đã sử dụng phƣơng pháp multiplex PCR để khuếch đại vùng gen trên mtDNA. Tác giả thực hiện phản ứng PCR với nhiều nồng độ DNA khác nhau. Sau đó dựa sự có hay không các sản phẩm PCR qua điện di để xác định nồng độ tối thiểu của DNA để phản ứng PCR còn phát hiện đƣợc. 2.4 Các phƣơng pháp phân biệt các loại thịt 2.4.1 Phƣơng pháp quan sát dƣới kính hiển vi quang học Để phân biệt các loài trong bột xƣơng thịt ngƣời ta lập ra một thƣ viện hình ảnh về các mẫu xƣơng. Theo đó các mẫu bột xƣơng thịt đƣợc quan sát dƣới kính hiển vi và đối chiếu với thƣ viện này để xác định các loài có trong mẫu xét nghiệm. Phƣơng pháp này đòi hỏi ngƣời xét nghiệm phải có kinh nghiệm và tay nghề cao. Ngoài ra, phƣơng pháp này có độ chính xác không cao vì còn phụ thuộc vào kinh nghiệm của nhân viên xét nghiệm. (Nguồn: 2.4.2 Miễn dịch liên kết enzym (ELISA) Năm 1972 – 1973, ELISA đƣợc sử dụng đầu tiên trong y học để chẩn đoán virut. Đến năm 1977, Clark và Adam lần đầu tiên ứng dụng ELISA để xác định virut hại thực vật tại Scottlen. Nguyên tắc chung của kỹ thuật ELISA là nguyên tắc bánh kẹp (sandwich), tạo liên kết đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể. Sự liên kết đó cho phép định lƣợng sự hiện diện của kháng thể hoặc kháng nguyên. Kháng thể hoặc kháng nguyên có thể đƣợc xác định khi đƣợc nhận biết đặc hiệu bằng một kháng thể thứ hai cộng hợp với hệ biotin – streptavidin – enzym sẽ tạo ra sản phẩm có màu khi tác dụng với cơ chất phù hợp. Đây là kỹ thuật khá nhạy và tƣơng đối đơn giản, cho phép xác định kháng nguyên (KN) và kháng thể (KT) ở nồng độ rất thấp (khoảng 0,1 ng/ml), rẻ tiền, an toàn và độ chính xác cao (Phạm Văn Ty, 2001). Tuy nhiên bản thân kỹ thuật ELISA nói chung cũng còn có một số nhƣợc điểm. Đối chứng âm vẫn có thể cho kết quả dƣơng tính do bị nhiễm chéo từ chất tạo 9 màu hoặc từ kháng thể đƣợc đánh dấu hoặc do bản thân đối chứng bị nhiễm. Đối chứng dƣơng không xuất hiện màu mà mẫu kiểm tra có màu do đối chứng quá hạn hay điều kiện bảo quản không tốt. Đặc biệt đối với việc xác định loài trong thịt chế biến bằng phƣơng pháp ELISA không tỏ ra là phƣơng pháp thích hợp (Ali và ctv, 2005), vì protein trong thịt xử lý nhiệt phần lớn đã bị biến tính. Hơn nữa kỹ thuật ELISA cần phải có lƣợng mẫu đủ lớn để có thể nhận diện màu. 2.4.3 Protein array Protein array là phƣơng pháp sử dụng một loại hạt hình cầu (hay slide) để xác định đồng thời nhiều phản ứng trong cùng một ống nghiệm hay giếng nhỏ có chứa mẫu. Phát hiện mẫu nhờ các chất nhuộm huỳnh quang có trong hạt cầu đƣợc kích thích. Độ nhạy của tín hiệu biểu thị cho lƣợng mẫu đích. Phƣơng pháp này có nhiều ƣu điểm: Cho phép phát hiện cùng lúc hàng trăm chỉ tiêu trong cùng một giếng mẫu. Độ lặp lại cao. Không cần lƣợng mẫu lớn. Độ chuyên biệt cao. Tuy nhiên, phƣơng pháp hiện đại với các thiết bị tiên tiến, đắt tiền đo đó ở Việt Nam chƣa có điều kiện ứng dụng rộng rãi kỹ thuật này vào trong các nghiên cứu (Trần Nhật Phƣơng, 2004). Hơn nữa cũng nhƣ ELISA, phƣơng pháp này khó có thể áp dụng đối với thịt đã xử lý nhiệt. 2.4.4 Điện di 2 chiều Phƣơng pháp điện di 2 chiều đƣợc xây dựng từ hai kỹ thuật phân tách sản phẩm theo 2 thành phần cấu thành của bản thân sản phẩm (điểm đẳng điện, khối lƣợng phân tử). Phƣơng pháp này có hai giai đoạn phân tách: giai đoạn đầu phân tách sản phẩm dựa vào điểm đẳng điện của phân tử protein mẫu; giai đoạn hai, sản phẩm đƣợc phân tách theo khối lƣợng phân tử (Rybicki và Purves, 2003). 10 Phƣơng pháp này có tính ứng dụng cao, cho phép phát hiện cùng lúc hàng ngàn polypeptide khác nhau với độ nhạy cao. Kết quả tốt nhất trên mẫu huyết thanh và dịch chiết tế bào (Garfin, 2000). Tuy nhiên, để kỹ thuật điện di 2 chiều đạt kết quả tốt cần phải có tay nghề kỹ thuật cao. Và cũng nhƣ hai kỹ thuật ELISA và protein array, kỹ thuật này không phù hợp để xác định protein của thịt đã xử lý nhiệt. 2.4.5. Giới thiệu chung về phƣơng pháp PCR (polymerase chain reaction) Phƣơng pháp PCR là một công cụ đã trở nên phổ biến trong sinh học phân tử, đem lại một cuộc cách mạng trong công nghệ di truyền học phân tử, đánh dấu một bƣớc tiến cực kỳ quan trọng cũng nhƣ các khám phá trƣớc đây về enzym cắt giới hạn và phƣơng pháp Southern blot. Phƣơng pháp này do K. Mulis cùng cộng sự phát minh năm 1985. Đây là một phƣơng pháp hoàn toàn mới trong việc nghiên cứu và phân tích gen và hệ gen. Đối với các phƣơng pháp trƣớc đây khó khăn lớn nhất trong phân tích gen ở chỗ chúng là những mục tiêu đơn lẻ và rất nhỏ trong một hệ gen phức tạp, khổng lồ. Trong khi đó kỹ thuật PCR lại giúp chúng ta có thể tạo ra một số lƣợng lớn các bản sao của một đoạn DNA mong muốn. Nhờ các ƣu điểm nổi trội trong nghiên cứu sinh học phân tử mà kỹ thuật PCR nhanh chóng đƣợc áp dụng rộng rãi để chẩn đoán các bệnh về virus, vi khuẩn, nấm, ký sinh trùng và cho kết quả chính xác. Mặt khác, sự phân tích thành phần và trật tự nucleotid trên phân tử DNA bằng phƣơng pháp PCR còn có ý nghĩa to lớn trong công tác phân loại các loài sinh vật. Thực chất đây là một phƣơng pháp tạo dòng in vitro, không cần sự hiện diện của tế bào và nguyên tắc sẽ đƣợc trình bày sau đây. Nguyên tắc Nguyên tắc của phƣơng pháp là tạo lƣợng lớn các đoạn DNA đặc thù từ phân tử DNA khuôn dựa trên sự hoạt động của DNA – polymerase để tổng hợp sợi mới bổ sung. 11 Các yếu tố cơ bản để thực hiện phản ứng PCR Sợi khuôn DNA chỉ cần biết trình tự nucleotid của đoạn nhỏ nằm cạnh đoạn cần nhân lên để thiết kế hai đoạn mồi oligonucleotid. Hai đoạn mồi ngắn xác định điểm bắt đầu tổng hợp DNA, là tín hiệu chỉ hƣớng đi (5’ – 3’) của enzym DNA polymerase. Mồi dài khoảng 20 nucleotid và ở hai đầu của mồi không kết hợp với nhau theo nguyên tắc bổ sung. Có đầy đủ 4 loại nuclotid tự do (dNTP): dATP, dTTP, dGTP, dCTP. Enzym chịu nhiệt Taq polymerase. Dung dịch đệm. Ion Mg 2+ . Nƣớc tinh khiết không có enzym nuclease. Các bƣớc cơ bản của một chu kỳ phản ứng PCR: Bước 1: Biến tính (denaturation). Sợi DNA khuôn mạch đôi tách thành hai sợi DNA mạch đơn dƣới tác dụng của nhiệt độ cao khoảng 94 – 950C trong vòng 30 giây – 1 phút. Bước 2: Bắt cặp (hybridization) Nhiệt độ trong giai đoạn này đƣợc hạ thấp xuống khoảng 37 – 680C tùy thuộc vào nhiệt độ nóng chảy (Tm) của cặp mồi sử dụng để đoạn mồi bắt cặp với sợi DNA khuôn. Thời gian cho giai đoạn này kéo dài từ 30 giây – 1 phút. Bước 3: Kéo dài (elongation) Nhiệt độ đƣợc tăng đến 720C giúp cho enzym polymerase hoạt động tổng hợp sợi DNA mới bổ sung với mạch khuôn từ vị trí bắt cặp của đoạn mồi. Thời gian của giai đoạn kéo dài từ 30 giây đến vài phút. Một chu kỳ gồm ba bƣớc trên sẽ đƣợc lặp đi lặp lại nhiều lần, và mỗi lần lại làm tăng gấp đôi lƣợng mẫu của lần trƣớc. Đây là sự khuếch đại theo cấp số nhân, theo tính toán sau 30 chu kỳ sự khuếch đại sẽ là 106 so với số lƣợng mẫu ban đầu. Các yếu tố ảnh hƣởng đến phản ứng PCR DNA mẫu Phản ứng PCR tối ƣu xảy ra khi đoạn DNA khuôn mẫu không đƣợc quá dài, 12 thƣờng khuếch đại tốt nhất đối với đoạn DNA dài khoảng 1 – 1,5 kb. Phƣơng pháp này cũng cho phép xác định DNA với một lƣợng thấp, khoảng nhỏ hơn 100 ng (Trần Thị Xô và Nguyễn Thị Lan, 1999). Tính trung thực của DNA polymerase không những phụ thuộc vào mức độ sai sót của bản thân enzym này mà còn phụ thuộc vào số bản sao ban đầu của DNA mẫu (Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, 1999). Lƣợng bản sao của DNA mẫu ban đầu quá lớn sẽ gây ra sai số cao trong quá trình sao chép. Sai số ngẫu nhiên trong vài chu kỳ đầu sẽ lan rộng đến những chu kỳ sau. Do đó, việc giảm lƣợng DNA mẫu ban đầu còn hạn chế đƣợc các khuếch đại “kí sinh” tạo những sản phẩm phụ không mong muốn. Mẫu DNA tinh sạch sẽ cho kết quả tốt nhất, tuy nhiên nhiều kỹ thuật PCR vẫn đạt kết quả tốt đối với DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào. Thậm chí phƣơng pháp PCR còn cho phép khuếch đại cả những mẫu DNA không đƣợc bảo quản tốt, đã bị phân hủy nhƣ vết máu lâu ngày, tinh dịch đã khô, hóa thạch, tóc, móng tay ngƣời chết,... (Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 2002). Enzym DNA polymerase Hiệu quả của phƣơng pháp phụ thuộc vào khả năng chịu nhiệt của enzym polymerase (vì phản ứng PCR luôn phải thực hiện ở những nhiệt độ khác nhau). Phƣơng pháp PCR chuyển sang bƣớc ngoặc mới với việc phát hiện enzym taq polymerase có nguồn gốc từ vi khuẩn (Thermus aquaticus) phân lập từ suối nƣớc nóng nên chịu đƣợc nhiệt độ cao. Enzym này không bị biến tính ở nhiệt độ biến tính và xúc tác tổng hợp từ đầu đến cuối quá trình phản ứng tạo ra các sản phẩm DNA tinh sạch. Điều này cho phép tự động hóa tất cả các bƣớc của chu trình nhân bản DNA. Từ đó máy luân nhiệt PCR ra đời và có khả năng điều khiển cả về nhiệt độ lẫn thời gian (Trần Thị Xô và Nguyễn Thị Lan, 1999). Ngày nay nhiều polymerase chịu nhiệt khác cũng đã đƣợc đƣa ra thị trƣờng với nhiều chức năng hoàn thiện hơn. Tth polymerase hoạt động nhƣ một enzym phiên mã ngƣợc khi có mặt RNA khuôn và ion Mn++. Tth pol lại xúc tác phản ứng tổng hợp cDNA trên bản mẫu RNA (Hồ Huỳnh Thuỳ Dƣơng, 2002). 13 Tuy vậy trong phản ứng PCR, nếu DNA Taq polymerase quá dƣ thừa, chúng ta sẽ thấy hiện tƣợng tổng hợp DNA do phản ứng giả của mồi trên dây đơn. Hầu hết ở các quy trình, ngƣời ta khuyến cáo nồng độ Taq nên sử dụng là 0,5 UI/25 l để kiểm soát tính chuyên tính của phản ứng và không nên sử dụng nồng độ cao hơn 2,5 UI/25 l (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999). Mồi Mồi là một chỉ tiêu quan trọng nhất để đạt đƣợc sự khuếch đại đặc trƣng và có hiệu quả cao nhất. Chọn mồi là một công việc rất quan trọng quyết định thành công của phƣơng pháp và công việc đó phải dựa theo một số nguyên tắc sau đây: Chọn trình tự mồi xuôi và mồi ngƣợc sao cho chúng không bắt cặp bổ sung giữa mồi xuôi và mồi ngƣợc và cũng không có những cấu trúc kẹp tóc do sự bắt cặp bổ sung giữa các phần khác nhau của một mồi. Mồi phải đặc hiệu đối với DNA cần khuếch đại và không trùng với các trình tự khác trên gen. Trình tự nằm giữa mồi xuôi và ngƣợc không đƣợc quá lớn, khoảng dƣới 1kb là tốt nhất và phản ứng PCR sẽ không cho kết quả tốt nếu đoạn khuếch đại lớn hơn 3 kb. Độ dài mồi cần chọn khoảng 18 – 30 nucleotid. Nếu mồi dài hơn 30 nucleotid sẽ ảnh hƣởng đến sự tổng hợp ở bƣớc 3. Trong trƣờng hợp tiến hành trên những DNA đƣợc dòng hóa nhƣ cosmid thì mồi cần dùng sẽ có chuỗi mã ngắn khoảng 10 nucleotid. Nhiệt độ bắt cặp của mồi xuôi và ngƣợc không đƣợc quá cách biệt, thông thƣờng trong khoảng 4 – 50C. Thành phần nucleotid của các mồi phải cân bằng tránh các cặp GC lặp đi lặp lại nhiều lần. Công thức tính nhiệt độ bắt cặp của mồi trong trƣờng hợp có khoảng 20 nucleotid là: Tm = 4(G+C) + 2(A+T) Trong đó: A, T, C, G là thành phần các nucleotid của đoạn mồi. Tuy nhiên, việc tính toán này chỉ có tính chất tạm thời, chúng ta phải điều chỉnh lại nhiệt độ này để có sự khuếch đại cao nhất và thu đƣợc tần suất đa hình cao 14 nhất. Bằng kinh nghiệm và thực hiện thí nghiệm nhiều lần chúng ta mới có thể có số liệu đúng về nhiệt độ bắt cặp của mồi. Dung dịch đệm Môi trƣờng đệm KCl đã và đang đƣợc áp dụng là một dung dịch đệm rất hữu hiệu cho kỹ thuật PCR. Ngoài ra còn có dung dịch điệm NaCl dùng cho việc khuếch đại những đoạn DNA giàu GC và amonium sulphate cho những sản phẩm PCR có trọng lƣợng phân tử thấp (Holm và ctv, 1991). pH của dung dịch đệm cũng đƣợc xem xét kỹ trong kỹ thuật PCR. Hầu hết các dung môi phản ứng đƣợc đệm trong môi trƣờng Tris – HCl ở pH = 8,3. Những hoạt chất ổn định enzym (enzym stabilizers) cũng đƣợc chú ý nhƣ: gelatin (0,01%), Triton X – 100 (0,1% (v/v)) trong những dung dịch đệm để tồn trữ enzym. Có trƣờng hợp ngƣời ta sử dụng cả hai làm dung dịch điệm. Ion Mg2+ Một trong những ảnh hƣởng có tính chất quyết định đến sự chuyên biệt và hiệu quả của phản ứng PCR là nồng độ Mg2+. Môi trƣờng có tính chất ion cao sẽ làm cho dung dịch đệm trở nên năng động rất nhiều. Do đó nồng độ Mg2+ cao hay thấp đều tạo ra những ảnh hƣởng rất lớn. Nồng độ Mg2+ cao sẽ làm cho phân tử DNA mạch đôi ổn định hơn nhƣng đồng thời ngăn cản sự biến tính hoàn toàn của sản phẩm trong mỗi chu kì và do đó làm giảm sản phẩm PCR tạo ra. Ngoài ra lƣợng Mg 2+ dƣ còn làm tăng hiện tƣợng bắt cặp giả tạo ra những sản phẩm không mong muốn với số lƣợng khá lớn. Ngƣợc lại nếu nồng độ Mg2+ quá thấp (< 0,5 M), sẽ ảnh hƣởng xấu đến quá trình kéo dài vì Mg2+ đóng vai trò là co-factor của Taq polymerase. Một vài ion Mg 2+ sẽ đƣợc kẹp giữ bởi dNTP trong phản ứng. Vì vậy cần phải tỷ lệ thích hợp giữa dNTP và Mg2+ . Nucleotid Cần phải có cả bốn loại nucleotid dạng triphophat: dATP, dTTP, dCTP, dGTP. Ngƣời ta khuyến cáo rằng mỗi loại deoxynucleotid đƣợc sử dụng là 200 M. 15 Phải giữ cho nồng độ của tất cả các deoxynucleotid luôn bằng nhau, để tránh sự gắn kết nhầm lẫn. Thời gian và số chu kỳ Phản ứng PCR diễn ra qua hai giai đoạn, giai đoạn đầu số lƣơng bản sao tăng theo cấp số nhân nhƣng sau đó hiệu quả khuếch đại giảm dần vì một số nguyên nhân sau: Cạn kiệt các thành phần phản ứng, nhất là sự giảm nồng độ các nucleotid. Xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng. Các bản sao vừa mới đƣợc tổng hợp không bắt cặp với mồi mà bắt cặp với nhau. Ngoài ra, số lƣợng chu kì còn phụ thuộc vào số lƣợng bản sao ban đầu, nếu số lƣợng ban đầu là 105 thì thực hiện 25 – 30 chu kì, còn số lƣợng mẫu là 102 – 103 thì phải thực hiện 30 – 40 chu kì (Trần Thị Xô và Nguyễn Thị Lan, 1999). Thiết bị và dụng cụ Thực chất thiết bị và dụng cụ để tiến hành phản ứng PCR chỉ cần đáp ứng đƣợc nhu cầu thay đổi nhiệt độ nhanh và chính xác. Các thiết bị hiện nay đã đƣợc cải thiện tối đa để tránh sự bốc hơi nƣớc trong quá trình phản ứng và cho phép tiến hành phản ứng PCR ngay trên mô và tế bào... Tuy nhiên, mỗi kiểu thiết bị đều có đặc điểm khuếch đại riêng nên mọi thí nghiệm của một nghiên cứu cần đƣợc tiến hành cùng một chủng loại thiết bị. Hơn nữa ống nghiệm dùng cho các phản ứng của cùng một thí nghiệm phải thuộc cùng một kiểu vì đặc tính truyền nhiệt của của các ống này cũng nhƣ độ tiếp xúc giữa ống và bộ phận tạo nhiệt của thiết bị có ảnh hƣởng lớn đến quá trình khuếch đại (Hồ Huỳnh Thuỳ Dƣơng, 2002). Ƣu và nhƣợc điểm của phản ứng PCR Ưu điểm của phản ứng PCR Thời gian thực hiện nhanh, đơn giản, ít tốn kém. 16 Không đòi hỏi mẫu phải tinh sạch cao (vết máu khô, mẫu vật khảo cổ). Nhược điểm của phản ứng PCR Đòi hỏi phải biết trình tự nucleotid của đoạn DNA cần khuếch đại, hay ít nhất cũng phải biết trình tự hai đầu của phân tử DNA. Chỉ khuếch đại những phân tử DNA có kích thƣớc nhỏ hơn 3 kb, tốt nhất là 1 kb. Rất dễ bị nhiễm, dẫn đến tạo sản phẩm phụ (dƣơng tính giả). Ứng dụng của kỹ thuật PCR Do có khả năng khuếch đại một lƣợng DNA cực nhanh và chuyên biệt nên kỹ thuật PCR đƣợc áp dụng rộng rãi trên nhiều lĩnh vực (Nguyễn Văn Uyển, 1995): - Sản xuất các mẫu dò. - Ứng dụng trong khuếch đại DNA, RNA. - Ứng dụng để phân tích đa dạng di truyền. - Ứng dụng trong chẩn đoán bệnh. 2.4.6 Nguyên tắc multiplex PCR Multiplex PCR là phản ứng PCR cho phép phát hiện cùng lúc nhiều gen của một sinh vật hay nhiều sinh vật khác nhau bằng cách sử dụng nhiều cặp mồi khác nhau trong một phản ứng. 2.5 Các công trình nghiên cứu về phát hiện loài trong thịt chế biến bằng phƣơng pháp multiplex PCR Hơn một thập kỉ qua, sau khi ra đời phƣơng pháp PCR nói chung và multiplex PCR nói riêng đã đƣợc sử dụng rộng rãi để phát hiện hay phân biệt DNA các sinh vật khác nhau từ nhiều nguồn mẫu. Vì vậy phƣơng pháp multiplex PCR cũng đã đƣợc nhiều nhà nghiên cứu sử dụng trong việc phân biệt loài động vật trong thịt chế biến. Năm 1997, Wayne và ctv đã có công trình nghiên cứu về trình tự mtDNA dài2001 bp của 23 dòng chó. Kết quả nghiên cứu cho thấy trên mtDNA có trình tự bảo toàn cho cả 23 dòng chó. 17 Tại Hoa Kỳ, Sawyer (1997) đã tìm ra một phƣơng pháp nhanh và nhạy để xác định và ngăn chặn tình trạng nhập khẩu bò nhiễm BSE. Tác giả đã xây dựng quy trình PCR phát hiện thịt bò trong thịt và bột thịt xƣơng dựa trên đoạn gen bảo tồn của mtDNA bò (B – mtDNA). Năm 1998, Matsugana đã công bố công trình nghiên cứu phát hiện 6 loại thịt (bò, heo, gà, cừu, dê, ngựa) từ thịt chế biến. Tác giả sử dụng 7 đoạn mồi với tỉ lệ thích hợp để phát hiện DNA chuyên biệt cho từng loài. Mồi xuôi đƣợc thiết kế dựa trên trình tự DNA bảo toàn của gen mtDNA, còn mồi ngƣợc đƣợc thết kế dựa vào trình tự chuyên biệt ở mỗi loài. Các cặp mồi này cho các sản phẩm PCR có kích thƣớc khác nhau tƣơng ứng với 6 loại thịt. Các đoạn DNA của dê, gà, bò, cừu, heo, ngựa lần lƣợt có khích thƣớc: 157, 227, 274, 331, 398, 439 bp. Kết quả PCR đƣợc quan sát bằng điện di. DNA của dê, gà, bò, cừu, heo đƣợc phát hiện cả đối với DNA tách chiết từ thịt xử lý nhiệt ở 1000C hay 1200C, riêng đối với thịt ngựa thì không phát hiện đƣợc ở 1200C. Giới hạn nhỏ nhất của nồng độ DNA mà phản ứng PCR còn phát hiện đƣợc là 0,25 ng. Năm 2000, Montiel-Sosa và ctv đã thiết kế cặp mồi có tính chuyên biệt cao trên đoạn bảo tồn của gen mtDNA. Cặp mồi này đƣợc dùng để khuếch đại đoạn DNA dài 531bp của gia cầm bằng phƣơng pháp PCR. Phƣơng pháp này tỏ ra hữu dụng đối với cả thịt tƣơi và hỗn hợp thịt chế biến bao gồm thịt phơi khô và thịt nấu chín từ bò, cừu, gà. Năm 2004, Myers và ctv cũng đã dựa vào đoạn mtDNA để thiết lập phản ứng multiplex PCR nhằm phát hiện thịt các loài bò, heo, cừu, dê, ngựa trong thức ăn chó. Giới hạn DNA để phát hiện là 1 g/kg. Kết quả cho thấy chỉ có 27 mẫu trong tổng số 31 mẫu là chứa thịt bò và heo (các mẫu thức ăn chó đƣợc ghi trên nhãn là chỉ gồm thịt bò và heo). 18 Chƣơng 3 NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Nội dung thực hiện (1) Tách chiết DNA từ thịt tƣơi và thịt xử lý nhiệt ở: 800C/15’, 1200C/15’, 120 0C/30’, 1300C/15’. (2) Thực hiện phản ứng single PCR (s-PCR) đối với DNA từ ba loại thịt tƣơi (heo, bò, cừu) để làm cơ sở cho phản ứng multiplex PCR (m-PCR). (3) Tối ƣu hóa quy trình m-PCR để xác định loại thịt trong hỗn hợp thịt tƣơi xay nhuyễn. (4)Thực hiện phản ứng s-PCR đối với DNA từ thịt xử lý ở nhiệt độ: 800C/15’, 120 0C/15’, 1200C/30’, 1300C/15’. (5) Thực hiện phản ứng m-PCR để xác định ba loại thịt heo, bò, cừu. Thực hiện phản ứng m-PCR đối với hỗn hợp DNA heo, bò, cừu có nồng độ của DNA bò, cừu giảm dần để xác định ở nồng độ nào phản ứng m-PCR vẫn còn phát hiện đƣợc hai loài này. Thực hiện phản ứng m-PCR với hỗn hợp thịt đã xử lý ở các nhiệt độ 80 0C/15’, 1200C/15’, 1200C/30’, 1300C/15’. (6) Thực hiện phản ứng m-PCR phát hiện thịt heo, bò, cừu trong bột thịt. 3.2 Thời gian và địa điểm tiến hành Đề tài đƣợc tiến hành từ ngày 01-02-2007 đến ngày 30-07-2007 tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm trƣờng Đại Học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh. 19 3.3 Vật liệu 3.3.1 Nguồn mẫu tách chiết DNA Mẫu cơ vân đƣợc lấy từ thịt heo, bò, cừu mua ở siêu thị Metro TP. Hồ Chí Minh. Mẫu bột xƣơng thịt sử dụng trong thức chế biến thức ăn gia súc của các hãng CE, A, VY. 3.3.2 Đoạn mồi Matsugana và ctv (1998) đã xác định đƣợc trình tự bảo toàn trên gen mtDNA, dựa vào trình tự này tác giả đã thiết kế đoạn mồi xuôi chung cho DNA thịt heo, bò, cừu. Đoạn mồi này đƣợc kí hiệu là FSIM: 5’– GACCTCCCAGCTCCATCAAACATCTCATCTTGATGAAA – 3’ Tuy nhiên ở mỗi loài thú khác nhau sẽ có những trình tự trên gen mtDNA khác nhau, từ đó tác giả cũng đã thiết kế mồi xuôi cho từng loại gia súc heo, bò, cừu, đƣợc kí hiệu lần lƣợt là: RP, RB, RS: RP: 5’ – GCTGATAGTAGATTTGTGATGACCGTA – 3’. RB: 5’ – CTAGAAAAGTGTAAGACCCGTAATATAAG – 3’. RS: 5’ – CTATGAATGCTGTGGCTATTGTCGCA – 3’. 3.3.3 Hóa chất 3.3.3.1 Hóa chất dùng trong tách chiết DNA Tris-HCl, NaCl, SDS, EDTA, proteinase K, sodium acetate, isoamyl alcohol, phenol, chloroform, ethanol, TE 1 X. 3.3.3.2 Hóa chất dùng trong điện di Agarose, TBE 0,5 X (Tris borate EDTA, pH = 8,3), loading dye 6 X, ladder 100bp, 200bp, ethidium bromide. 20 3.3.3.3 Hóa chất dùng trong phản ứng PCR Taq DNA polymerase: 5UI/µl (Promega), dung dịch đệm 10X (Promega), dNTP 25 mM (Promega), MgCl2 25 mM (Promega), 4 đoạn mồi (khuếch đại gen mtDNA ở heo, bò, cừu), nƣớc cất 2 lần (khử ion, hấp vô trùng, chiếu UV, pH 6,8 –7). 3.3.3.4 Thiết bị và dụng cụ Tủ sấy (Jencons - PLS), water bath (Memmert), autoclave (Tommy), máy cất nƣớc (khử ion) (Branstead), máy ly tâm (Mikro Z2K/Sigma 3K30C), tủ trữ mẫu và hóa chất (Reetech, Brandt, Sanyo), máy chụp gel (Biorad), máy luân nhiệt (Eppendorf, version 2.11.32), bộ điện di (Biorad), máy đo OD (Hewlett Packard), micropipet, đầu tip, eppendorf, kéo, chày, kẹp… 3.4 Phƣơng pháp tiến hành 3.4.1 Lấy và bảo quản mẫu Mua 500 g mỗi loại thịt bỏ vào túi nilon sạch kích thƣớc 5 x 10 cm, dán nhãn cho mỗi loại thịt, trữ trong thùng đá, đem về phòng thí nghiệm, trữ ở –700C. 3.4.2 Phối hợp các loại thịt để tạo hỗn hợp thịt và xử lý nhiệt Mỗi loại thịt, lấy khoảng 150 g đem nghiền nhuyễn bằng máy nghiền mẫu. Sau đó đem cân và trộn các loại thịt với tỉ lệ thịt heo, bò, cừu giảm dần (bảng 3.1). Mỗi túi mẫu có khối lƣợng 20 g. 21 Bảng 3. 1 Tỷ lệ các loại thịt trong các hỗn hợp thịt STT Đơn vị tính Thịt heo Thịt bò Thịt cừu 1 % 50 50 0 g 10 10 0 2 % 50 0 50 g 10 0 10 3 % 50 25 25 g 10 5 5 4 % 80 10 10 g 16 2 2 5 % 90 5 5 g 18 1 1 6 % 98 1 1 g 19,6 0,2 0,2 Sau đó chia mỗi hỗn hợp thành 4 phần, bỏ vào các túi nilon chịu nhiệt có dán nhãn ghi rõ về thành phần, tỉ lệ, nồng độ và thời gian xử lí nhiệt. Hấp hỗn hợp thịt bằng nồi hấp autoclave ở các nhiệt độ và thời gian: 800C/15 phút, 1200C/15 phút, 120 0C/30 phút, 1300C/15 phút. Làm nguội và trữ lạnh ở - 700C cho đến khi sử dụng. 3.4.3 Tách chiết DNA * Qui trình tách chiết Sau khi rã đông mẫu ở nhiệt độ phòng, tách chiết DNA theo dẫn liệu của Lƣơng Quý Phƣơng (2006). 1. Cho khoảng 0,1 g mẫu vào eppendorf 1,5 ml. Dùng chày nghiền nhuyễn mẫu. 2. Cho vào 60 µl dung dịch đệm tách chiết (50 mM Tris-HCl, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA và 1% SDS, pH= 8) và 3 µl dung dịch protease K (20 mg/ml). Ủ hỗn hợp ở 55oC trong 1h. 22 3. Cho vào 375 µl nƣớc cất khử ion vô trùng; vortex 14000 vòng/phút trong 30 giây. Cho thêm 200 µl dung dịch hỗn hợp phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1); vortex 14000 vòng/phút trong 1 phút; ly tâm 12000 vòng/phút trong 2 phút ở 10oC. 4. Lấy phần nƣớc nổi bên trên chuyển vào eppendorf 1,5 ml mới đã có sẵn 1 ml dung dịch cồn tuyệt đối; trộn đều; ủ – 20oC trong 1 giờ. 5. Ly tâm 12000 vòng/phút trong 2 phút ở 10oC; lấy cặn làm ráo. 6. Rửa cặn bằng 1ml ethanol 70 %, ly tâm 12000 vòng/phút trong 2 phút ở 10 oC, lấy cặn. 7. Làm khô cặn trong tủ ấm ở 55oC. 8. Hòa tan cặn bằng 200 µl dung dịch TE; ủ 55oC trong 2 giờ. Sản phẩm DNA sau khi tách chiết đƣợc trữ ở – 20oC hoặc sử dụng ngay. Kiểm tra độ tinh sạch DNA bằng cách đo mật độ quang (OD: optical density) ở bƣớc sóng 260 nm và 280 nm bằng quang phổ kế (model HP 8453). Hàm lƣợng DNA đƣợc ƣớc lƣợng theo công thức DNA (ng/μl) = 62,9*OD260nm – 36*OD280nm. Các mẫu DNA tách chiết có tỷ số OD260 nm/OD280 nm (tỷ số OD) trên 1,6 đƣợc sử dụng cho PCR. Sau khi đo OD, chúng tôi pha loãng mẫu đến nồng độ 100 ng/ l. Kết quả OD đƣợc xử ký bằng phần mền Statgraphics Version 7.0. 3.4.4 Thực hiện phản ứng s-PCR Để tìm quy trình PCR phù hợp cho việc xác định 3 loại thịt heo, bò, cừu trong hỗn hợp thịt, đầu tiên chúng tôi thử nghiệm phản ứng s-PCR theo quy trình của Matsugana và ctv (1998). Thành phần phản ứng đƣợc trình bày trong bảng 3.2 và bảng 3.3 23 Bảng 3. 2 Thành phần hóa chất PCR Tên hóa chất Nồng độ cuối Dung dịch đệm PCR 1X MgCl2 1,5 mM FSIM 0,4 M reversal Tùy mỗi loại thịt (bảng 3.3) dNTP 200 µM/mỗi loại Taq 1,25 UI DNA mỗi loại 100 ng /phản ứng H2O cất vừa đủ 50 µl Bảng 3. 3 Nồng độ mồi ngƣợc đối với mỗi loại thịt trong s-PCR Tên mồi Nồng độ mồi ( M) RP 0,24 RB 0,24 RS 1,2 Và có chu trình nhiệt nhƣ bảng 3.4. Bảng 3. 4 Chu trình nhiệt của phản ứng Giai đoạn Diễn giải Nhiệt độ 1 Tiền biến tính 940C trong 4 phút 2 Lặp lại 35 chu kỳ Biến tính Bắt cặp Kéo dài 94 0 C trong 30 giây. 60 0C trong 30 giây 72 0C trong 30 giây 3 Kéo dài cuối cùng 720C trong 5 phút 24 3.4.5 Tối ƣu hóa phản ứng m-PCR 3.4.5.1 Thực hiện m-PCR theo quy trình của Matsugana và ctv (1998) Đầu tiên, chúng tôi thực hiện phản ứng m-PCR theo quy trình của Matsugana và ctv (1998). Thành phần phản ứng đƣợc trình bày ở bảng 3.5. Bảng 3. 5 Thành phần hóa chất PCR Tên hóa chất Nồng độ cuối Dung dịch đệm PCR 1X MgCl2 1,5 mM FSIM 0,4 M RP 0,24 M RB 0,24 M RS 1,2 M dNTP 200 µM/mỗi loại Taq 1,25 UI DNA tổng số (hỗn hợp heo, bò, cừu) 100 ng /phản ứng H2O cất vừa đủ 50 µl Chu trình nhiệt của phản ứng tƣơng tự bảng 3.4 Chúng tôi thực hiện lặp lại 3 lần để khẳng định quy trình. 3.4.5.2 Thí nghiệm điều chỉnh thành phần phản ứng Để tối ƣu hóa phản ứng PCR, trƣớc tiên chúng tôi thực hiện việc giảm thể tích phản ứng xuống còn 30 l và giữ nguyên nồng độ cuối nhƣ bảng 3.5. Sau đó, chúng tôi chỉnh lại nồng độ Mg2+ (lên 2 mM thay vì 1,5 mM) để tăng độ hoạt động của Taq polymerase. 3.4.5.3 Thí nghiệm điều chỉnh chu trình nhiệt Giảm nhiệt độ bắt cặp từ 600C xuống 560C và 540C đồng thời giữ nguyên thời gian của chu trình nhiệt. 25 Giảm nhiệt độ bắt cặp xuống còn 540C và tăng thời gian lúc biến tính, bắt cặp và kéo dài (bảng 3.6) Bảng 3. 6 Chu trình nhiệt của phản ứng trƣớc và sau khi điều chỉnh Giai đoạn Chu trình nhiệt chƣa điều chỉnh Chu trình nhiệt đã điều chỉnh Nhiệt độ Thời gian Nhiệt độ Thời gian Biến tính 940C 30 giây 940C 1 phút Bắt cặp 600C 30 giây 540C 45 giây Kéo dài 720C 30 giây 720C 1 phút 3.4.5.4 Thí nghiệm điều chỉnh nồng độ mồi trong 1 phản ứng Giảm nồng độ mồi của loại thịt có sản phẩm PCR đậm và rõ để loại trừ việc mồi tác dụng mạnh ức chế mồi tác dụng yếu - giảm RS (bảng 3.7). Bảng 3. 7 Điều chỉnh nồng độ mồi RS (giảm) Tên mồi Nồng độ mồi gốc ( M) Điều chỉnh lần 1 ( M) Điều chỉnh lần 2 ( M) Điều chỉnh lần 3 ( M) FSIM 0,4 0,4 0,4 0,4 RP 0,24 0,24 0,24 0,24 RB 0,24 0,24 0,24 0,24 RS 1,2 0,67 0,33 0,17 Tiếp tục giảm RS xuống còn 0,17 M đồng thời tăng RP (tăng nồng độ mồi của đối tƣợng không xuất hiện rõ band sản phẩm PCR) cụ thể đƣợc trình bày ở bảng 3.8. 26 Bảng 3. 8 Điều chỉnh nồng độ mồi RP (tăng) Tên mồi Nồng độ mồi gốc ( M) Điều chỉnh lần 4 ( M) Điều chỉnh lần 5 ( M) Điều chỉnh lần 6 ( M) Điều chỉnh lần 7 ( M) FSIM 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 RP 0,24 0,33 0,5 0,67 0,83 RB 0,24 0,24 0,24 0,24 0,24 RS 1,2 0,17 0,17 0,17 0,17 Sau khi tìm ra quy trình m-PCR thích hợp để phát hiện ba loại thịt heo, bò, cừu tƣơi, chúng tôi tiếp tục lặp lại phản ứng 3 lần để khẳng định tính ổn định của quy trình này. 3.4.6 Thực hiện phản ứng m-PCR hai loài (heo, bò và heo, cừu) ở các nồng độ DNA khác nhau Sau khi tìm ra quy trình m-PCR thích hợp, trƣớc tiên chúng tôi thử nghiệm phản ứng với hai đối tƣợng heo và bò, heo và cừu để xác định ở nồng độ nào DNA của bò, cừu phản ứng m-PCR còn phát hiện đƣợc, làm cơ sở thực hiện phản ứng m-PCR của DNA cả ba loài. Việc thực hiện thí nghiệm với các nồng độ DNA giảm dần của bò, cừu nhằm tạo cơ sở xét nghiệm các sản phẩm chỉ gian lận một lƣợng rất nhỏ hai lọai thịt này. Thực hiện phản ứng m-PCR đối với DNA thịt heo, bò, chúng tôi phối hợp DNA theo các nồng độ ở bảng 3.9. Bảng 3. 9 Phối hợp DNA của heo và bò ở các nồng độ khác nhau Ký hiệu Nồng độ DNA heo (ng/ l) Nồng độ DNA bò (ng/ l) Tỷ lệ (%) T1.1 50 50 50:50 T1.2 75 25 75:25 T1.3 80 20 80:20 T1.4 95 5 95:5 T1.5 99 1 99:1 27 Nồng độ mồi của phản ứng này đƣợc tối ƣu ở bảng 3.8 Thực hiện phản ứng m-PCR với hai đối tƣợng heo, cừu ở các nồng độ DNA đƣợc trình bày trong bảng 3.10. Bảng 3. 10 Phối hợp DNA của heo và cừu ở các nồng độ khác nhau Ký hiệu Nồng độ DNA heo (ng/ l) Nồng độ DNA cừu (ng/ l) Tỷ lệ (%) T2.1 50 50 50:50 T2.2 50 25 75:25 T2.3 80 20 80:20 T2.4 95 5 95:5 T2.5 99 1 99:1 3.4.7 Thực hiện phản ứng m-PCR cho hỗn hợp DNA heo, bò, cừu Để tạo cơ sở cho việc thực hiện phản ứng m-PCR ở các nồng độ DNA heo, bò, cừu khác nhau và để xác định ở nồng độ nào của DNA bò, cừu mà phản ứng m-PCR còn phát hiện đƣợc, chúng tôi phối trộn DNA theo các tỷ lệ khác nhau nhƣ bảng 3.11. Bảng 3. 11 Thành phần các hỗn hợp DNA heo, bò, cừu STT Kí hiệu hỗn hợp Tỷ lệ của hỗn hợp (heo, bò, cừu) 1 C1.1 50:50:0 2 C1.2 50:0:50 3 C1.3 50:25:25 4 C1.4 80:10:10 5 C1.5 90:5:5 6 C1.6 98:1:1 3.4.8 S-PCR đối với DNA của thịt xử lý nhiệt ở các nhiệt độ khác nhau: 80 0 C/15 phút, 1200C/15 phút, 1200C/30 phút, 1300C/15 phút Nhằm xác định mức độ biến tính và xác định sự phù hợp của quy trình đối với DNA tách chiết từ thịt đã xử lý nhiệt, chúng tôi thực hiện phản ứng s-PCR cho 28 DNA của từng loại thịt xử lý nhiệt ở: 800C/15 phút, 1200C/15 phút, 1200C/30 phút, 130 0C/15 phút. Thực hiện phản ứng này theo chu trình nhiệt tối ƣu đã xác định ở bảng 3.6 và nồng độ mồi tối ƣu (bảng 3.8). 3.4.9 M-PCR để phát hiện thịt heo, bò, cừu trong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ở các nhiệt độ khác nhau Để khẳng định khả năng phát hiện cùng lúc ba loại thịt heo, bò, cừu xử lý nhiệt đồng thời xác định ở nồng độ nào của thịt bò, cừu phản ứng m-PCR vẫn còn phát hiện đƣợc hai loài này. Tiến hành thí nghiệm này với tỉ lệ các mồi tƣơng tự ở bảng 3.8 và với các hỗn hợp thịt theo bảng 3.12. Bảng 3. 12 Hỗn hợp thịt ở các nhiệt độ xử lý khác nhau Tỷ lệ thịt heo: bò:cừu trong các hỗn hợp Kí hiệu hỗn hợp thịt biến tính ở 80 0C/15 phút Kí hiệu hỗn hợp thịt biến tính ở 120 0C/15 phút Kí hiệu hỗn hợp thịt biến tính ở 120 0C/30 phút Kí hiệu hỗn hợp thịt biến tính ở 130 0C/15 phút 50:50:0 C2.1 C3.1 C4.1 C5.1 50:0:50 C2.2 C3.2 C4.2 C5.2 50:25:25 C2.3 C3.3 C4.3 C5.3 80:10:10 C2.4 C3.4 C4.4 C5.4 90:5:5 C2.5 C3.5 C4.5 C5.5 98:1:1 C2.6 C3.6 C4.6 C5.6 3.4.10 M-PCR đối cới bột thịt làm nguyên liệu thức ăn gia súc Với mục đích đánh giá khả năng ứng dụng của quy trình m-PCR này chúng tôi tiến hành xét nghiệm sản phẩm bột thịt trên thịt trƣờng. Chọn mẫu bột thịt của ba hãng: CE, A, VY. Sau khi tách chiết DNA và tiến hành m-PCR, chúng tôi điện di cùng với ba đối chứng s-PCR của heo, bò, cừu để xác định nguồn gốc của các loại bột thịt trên. 29 Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả tách chiết DNA thịt heo, bò, cừu (thịt tƣơi và thịt xử lý nhiệt) đƣợc tách chiết theo quy trình đƣợc trích dẫn bởi Lƣơng Quý Phƣơng (2006). Kết quả đo OD thịt heo, bò, cừu (thịt tƣơi) đƣợc trình bày ở bảng 4.1. Bảng 4. 1 Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA của thịt bò, heo, cừu Chỉ tiêu DNA thịt bò ( X ± SD) DNA thịt heo ( X ± SD) DNA thịt cừu ( X ± SD) Xác xuất thống kê Tỷ số OD 1,93 ± 0,3 2,09 ± 0,24 2,03 ± 0,26 P = 0,46 Hàm lƣợng DNA (µg /µl) 0,15 ± 0,08 0,32 ± 0,1 0,43 ± 0,2 P = 0,0001 Tổng số mẫu 14 14 14 1.93 0.154 2.14 0.32 2.03 0.426 0 0.5 1 1.5 2 2.5 bò heo cừu Loại thịt tỷ số OD nồng độ DNA Biểu đồ 4. 1 So sánh tỷ số OD và nồng độ DNA của thịt heo, bò, cừu 30 Kết quả bảng 4.1 cho thấy độ tinh sạch của DNA tách chiết từ thịt heo, bò, cừu khác nhau không ý nghĩa (p > 0,05). Hàm lƣợng DNA của ba loại thịt khác nhau có ý nghĩa (p<0,001). Cả ba loại thịt trên đều đƣợc ly trích cùng một quy trình nên DNA thu đƣợc có độ tinh sạch giống nhau. Tuy nhiên mỗi loài gia súc khác nhau thì số tế bào cơ trên đơn vị diện tích hoặc đơn vị khối lƣợng cũng khác nhau do đó hàm lƣợng DNA tách chiết từ ba loại thịt trên là khác nhau. Cụ thể là hàm lƣợng DNA tách chiết từ thịt bò thì khác biệt so với thịt heo và thịt cừu còn hàm lƣợng DNA từ thịt heo và thịt cừu khác nhau nhƣng không có ý nghĩa (phụ lục 4). Sự sai khác này phụ thuộc vào: tỉ lệ nƣớc, hàm lƣợng mô liên kết, vị trí cơ thể học, mức độ luyện tập của thú và nhiêṭ đô ̣xử lý. Kết quả đo OD thịt tƣơi, thịt xử lý nhiệt của thịt thuần loài với số lƣợng mẫu của mỗi loài đều bằng nhau ở hai loại này (bảng 4.2). Bảng 4. 2 Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA tách chiết từ thịt tƣơi và thịt xử lý nhiệt Chỉ tiêu DNA thịt tƣơi ( X ± SD) DNA xử lý nhiệt ( X ± SD) Xác xuất thống kê Tỷ số OD 2,02 ± 0,2 1,95 ± 0,2 P = 0,24 Hàm lƣợng DNA (µg /µl) 0,37 ± 0,02 0,16 ± 0,09 P = 0,0000 Tổng số mẫu 32 32 2.02 0.356 1.95 0.59 0 0.5 1 1.5 2 2.5 thịt tươi thịt xử lý nhiệt Loại thịt tỷ số OD nồng độ DNA Biểu đồ 4. 2 So sánh tỷ số OD và nồng độ DNA của thịt tƣơi và thịt xử lý nhiệt 31 Kết quả cho thấy độ tinh sạch của DNA tách chiết từ loại thịt tƣơi và thịt xử lý nhiệt khác nhau có ý nghĩa (p>0,05) nhƣng hàm lƣợng DNA lại có sự khác biệt rõ rệt (p<0,0001). Tƣơng tự nhƣ, trên độ tinh sạch của DNA các mẫu thịt đƣợc ly trích cùng một quy trình nên không có sự khác biệt. Thịt đã xử lý nhiệt thì DNA đã bị biến tính một phần do đó hàm lƣợng thấp hơn so với thịt tƣơi. 4.2 Kết quả s-PCR đối với thịt tƣơi thuần loài theo quy trình của Matsugana và ctv (1998) Tiến hành phản ứng s-PCR theo quy trình của Matsugana và ctv (1998) với một loại DNA tách chiết từ loại thịt tƣơi đã biết trƣớc, kết quả thu đƣợc là mỗi giếng có một band sản phẩm PCR chuyên biệt cho từng loài (heo, cừu, bò) có kích thƣớc tƣơng ứng: 398, 331, 274 (hình 4.1). Vậy các cặp mồi trong quy trình Matsugana và ctv (1998) gồm: FSIM, RP, RB, RS (mục 3.2.2) có tính chuyên biệt cao và thích hợp cho việc phát hiện các loại thịt heo, bò, cừu. t. heo t. bò t.cừu lad Hình 4.1 Sản phẩm s-PCR theo quy trình của Matsugana và ctv (1998) 274 bp 331 bp 398 bp 32 4.3 Kết quả phản ứng m-PCR 3 loài theo quy trình của Matsugana và ctv (1998) Thực hiện quá trình phản ứng m-PCR theo quy trình của Matsugana và ctv với nồng độ hóa chất và DNA giữ nguyên nhƣ bảng 3.5, kết quả điện di cho thấy ở các mẫu thí nghiệm chỉ có 1 band 398 bp chuyên biệt cho thịt heo mà thôi (hình 4.2). Matsugana và ctv (1998) đã xác định các loại thịt trong thịt xử lý nhiệt chính xác 100% khi tiến hành với quy trình m-PCR này. Nhƣng khi m-PCR với cùng quy trình của Matsugana và ctv (1998), chúng tôi không thu đƣợc kết quả mong muốn (chỉ có một band DNA chuyên biệt cho thịt heo). Chúng tôi tiến hành thí nghiệm này với hóa chất của hãng Promega và điều kiện phòng thí nghiệm Đại học Nông lâm còn Matsugana và ctv (1998) thì tiến hành trong điều kiện ở Nhật Bản. Có thể điều này đã tạo ra sự khác biệt về kết quả. Chúng tôi cho rằng quy trình này chƣa phù hợp với việc phát hiện hỗn hợp DNA ba loài heo, bò, cừu với điều kiện thí nghiệm trong nƣớc hiện nay. t.heo H14 Hình 4.2 Sản phẩm m- PCR theo quy trình của Matsugana và ctv (1998) ĐC Quy trình của Matsugana Band heo (389 bp) Tạp 33 4.4 Kết quả quá trình thiết lập và tối ƣu hóa phản ứng m- PCR 4.4.1 Điều chỉnh thể tích phản ứng Bƣớc đầu tiên để tối ƣu hóa quy trình phản ứng m-PCR, chúng tôi tiến hành giảm chi phí thí nghiệm (giảm lƣợng hóa chất) bằng cách giảm thể tích xuống còn 30 l. Khi thực hiện m-PCR của hỗn hợp DNA thịt heo, bò, cừu (tỉ lệ 1:1:1) với thể tích phản ứng là 30 l, điện di mẫu cùng với hai đối chứng s-PCR của DNA heo, bò (thí nghiệm 4.2), kết quả chỉ thu đƣợc hai band DNA của thịt bò và cừu (274 bp và 331 bp), không thu đƣợc band DNA của thịt heo (hình 4.3). Có thể khi giảm thể tích phản ứng xuống còn 30 l đã tăng độ đồng đều về nhiệt độ trong phản ứng m-PCR do đó kết quả đạt đƣợc tốt hơn. 4.4.2 Kết quả thí nghiệm điều chỉnh nồng độ Mg2+ Sau khi tiến hành tăng nồng độ Mg2+ lên 2 mM, điện di mẫu m-PCR (của hỗn hợp DNA heo, bò, cừu tỉ lệ 1:1:1) với đối chứng là sản phẩm s-PCR của DNA cừu (mục 4.2), kết quả thu đƣợc lần này vẫn chỉ có hai band bò và cừu (274 bp và 331 bp) nhƣng đậm và rõ nét hơn (hình 4.4). Hình 4.3 Sản phẩm m-PCR khi điều chỉnh thể tích phản ứng Heo bò ĐC ĐC hỗn hợp Band bò (274 bp) Tạp Band cừu (331bp) Band heo (398 bp) 34 Theo Yale (1997), phản ứng m-PCR khi các sản phẩm kích thƣớc ngắn không xuất hiện thì một trong các biện pháp giải quyết để có đƣợc các sản phẩm mong muốn là tăng nồng độ Mg2+ và vẫn giữ nguyên nồng độ dNTP. Việc tăng nồng độ Mg 2+ sẽ làm cho phản ứng trở nên linh hoạt hơn, tăng hoạt tính của Taq polymerase, tăng lƣợng sản phẩm. Do đó chúng tôi đã thu đƣợc kết quả các band rõ hơn. 4.4.3 Kết quả thí nghiệm điều chỉnh chu trình nhiệt Giảm nhiệt độ bắt cặp từ 600C xuống 560C, 540C (hình 4.5): 56 0 C 54 0 C 56 0 C 54 0 C 56 0 C 54 0 C ĐC: tăng Mg2+ t.cừu Hình 4.4 Sản phẩm m-PCR sau khi tăng nồng độ Mg2+ Tạp Band bò (274bp) Band cừu (331bp) Band cừu (331 bp) ĐC Hỗn hợp (cừu) Hình 4.5 Sản phẩm m-PCR khi điều chỉnh nhiệt độ bắt cặp: 560C và 540C Band cừu (331pb) Band heo (mờ) (398bp) Tạp Band bò (mờ) (274bp) 56 0 C 54 0 C 35 Nhiệt độ bắt cặp có vai trò quan trọng trong phản ứng PCR, nó quyết định khả năng gắn mồi vào khuôn để khởi đầu tổng hợp nên sợi mới, do đó ảnh hƣởng lớn đến khả năng tạo sản phẩm PCR. Nhiệt độ bắt cặp phụ thuộc vào Tm của mồi. Nhƣng trong phản ứng m-PCR có nhiều cặp mồi do đó phải lựa chọn nhiệt độ bắt cặp sao sao phù hợp nhất đối với tất cả các mồi, thông thƣờng nhiệt độ này đƣợc lệch so với Tm là 5-100C. Theo Yale (1997), trong phản ứng PCR khi đã sử dụng cặp mồi chuyên biệt mà vẫn không xuất hiện sản phẩm mong muốn thì ta nên tăng khả năng bắt cặp của mồi vào khuôn bằng cách giảm nhiệt độ bắt cặp. Tuy nhiệt độ bắt cặp 600C là phù hợp đối với các đoạn mồi đã đƣợc thiết kế nhƣng trong điều kiện thí nghiệm của chúng tôi ở nhiệt độ bắt cặp này không thu đƣợc sản phẩm PCR của thịt bò. Cho nên chúng tôi đã tiến hành lần lƣợt giảm nhiệt độ bắt cặp xuống còn 560C và 540C. Khi nhiệt độ bắt cặp là 540C, kết quả thu đƣợc cả ba band sản phẩm PCR của ba loài. Tuy nhiên các band này chƣa đƣợc rõ. Vậy nhiệt độ 540C là nhiêt độ bắt cặp tƣơng đối thích hợp cho việc khuếch đại đồng thời DNA của ba loài thịt heo, bò, cừu. Giảm nhiệt độ bắt cặp xuống còn 540C và tăng thời gian biến tính, bắt cặp, kéo dài (lặp lại hai phản ứng). Kết quả thu đƣợc ba band sản phẩm DNA rõ nét hơn nhƣng vẫn chƣa hoàn toàn tối ƣu (band heo, bò còn vẫn mờ) (hình4.6). Lặp lai lần: 1 2 Lặp lại lần: 1 2 Band bò (274bp) Band cừu (331bp) Hình 4.6 Sản phẩm m-PCR khi điều chỉnh chu trình nhiệt Band heo (mờ)(398bp) Lặp lại lần: Lần 1 lần 2 Tạp 36 Theo Sambrook và Russell (2001), thời gian của mỗi bƣớc trong giai đoạn lặp lại của các chu kỳ ảnh hƣởng quyết định đến năng suất sản phẩm PCR. Nếu thời gian biến tính không đủ lâu để cắt đứt hoàn toàn các liên kết hidro trong mạch đôi thì giai đoạn bắt cặp sẽ không đạt hiệu quả cao. Thời gian kéo dài chuỗi ngắn quá cũng hình thành sản phẩm không chuyên biệt. Theo lý thuyết, tốc độ kéo dài chuỗi của Taq polymerase là 2000 nucleotide/phút. Tuy nhiên, trong thực tế, ngƣời ta thƣờng thấy loại Taq này kéo dài 1000 nucleotid trong vòng 1 phút. Theo quy trình của Matsugana và ctv (1998), thời gian trong mỗi bƣớc của giai đoạn lặp lại đều là 30 giây. Nhóm tác giả này đã xác định các loại thịt trong hỗn hợp thịt chế biến chính xác đến 100% khi tiến hành với chu trình nhiệt ấy. Nhƣng khi thí nghiệm với cùng chu trình của tác giả, chúng tôi hoàn toàn không thu đƣợc kết quả mong muốn (chỉ đƣợc một band DNA chuyên biệt cho thịt heo). Vì vậy chúng tôi đã tiến hành giảm nhiệt độ bắt cặp đã đƣợc xác định ở phần trên đồng thời tăng thời gian của các bƣớc: biến tính, bắt cặp và kéo dài, kết quả thu đƣợc sản phẩm PCR gồm ba band có thể nhận diện đƣợc ba loài heo, bò, cừu. Vậy chu trình nhiêt (giai đoạn 2) thích hợp cho phản ứng m-PCR phân biệt ba loài heo, bò, cừu là: biến tính ở 940C/1phút, bắt cặp ở 540C/45 giây, kéo dài ở 72 0C/1 phút. 4.4.4 Kết quả thí nghiệm điều chỉnh nồng độ mồi Giảm nồng độ RS. Kết quả mỗi giếng đều có 3 band nhƣng band DNA của thịt heo và thịt bò mờ hơn band DNA của thịt cừu. Tuy vậy ở giếng thứ 3 (với RS là 0,17 M) thì thu đƣợc kết quả rõ ràng nhất (hình 4.7). 37 Tăng nồng độ RP. Kết quả là ở mỗi lần điều chỉnh đều thu đƣợc 3 band heo bò cừu. Trong đó ở nồng độ RS (0,17 M) và RP (0,83 M) xuất hiện ba band tốt nhất (hình 4.8). Hình 4.7 Kết quả m-PCR khi giảm RS Điều chỉnh nồng độ RS ( M) Band cừu (331bp) 0,67 0,33 0,17 Tạp Band heo (398bp) Band bò (274bp) Hình 4.8 Kết quả m-PCR khi tăng RP Điều chỉnh nồng độ RP ( M) Band cừu (331bp) Tạp Band bò (274 bp) Band heo (389bp) 0,33 0,5 0,67 0,83 38 Ở mục 4.4.3, kết quả m-PCR thu đƣợc sau khi điều chỉnh chu trình nhiệt chỉ có band DNA của thịt cừu đậm và rõ còn band DNA của thịt bò và heo nhạt hơn nhiều. Theo Yale (1997), trong phản ứng m-PCR, nếu có một số sản phẩm PCR mạnh (band DNA đậm và rõ) và một số sản phẩm PCR khác yếu (band DNA không rõ) thì nên tăng nồng độ mồi của sản phẩm yếu và giảm nồng độ mồi của sản phẩm mạnh. Vì vậy sau khi điều chỉnh mồi nhƣ bảng 3.7, thu đƣợc RS (0,17 M) là tốt nhất, sau đó tiếp tục giữ nguyên lƣợng RS và tăng RP nhƣ bảng 3.8, chúng tôi đã thu đƣợc kết quả mong muốn (hình 4.8). Vậy nồng độ mồi FSIM: RP: RB: RS thích hợp cho phản ứng m-PCR phát hiện ba loại thịt heo, bò, cừu lần lƣợt là: 0,4: 0,83: 0,24: 0,17 M. 4.4.5 Kết quả kiểm tra tính ổn định của quy trình Sau ba lần lặp lại phản ứng m-PCR với quy trình tối ƣu (nồng độ mồi theo bảng 3.8), chúng tôi thấy cả ba lần đều có kết quả tốt – có ba band chuyên biệt cho ba loài heo, bò, cừu đậm và rõ (hình 4.9). Lặp lại 3 lần: 1 2 3 Lad Hình 4.9 Kết quả kiểm tra tính ổn định của quy trình 398 bp (heo) 331 bp (cƣ̀u) 274bp (bò) Tạp 39 Nhƣ vậy quy trình này là quy trình tối ƣu cho việc xác định ba loại thịt heo, bò, cừu. 4.5 Kết quả m-PCR đối với 2 loài Sau khi đã pha loãng DNA đến nồng độ 100ng/ l, chúng tôi tiến hành phối trộn các DNA theo bảng 3.9 và bảng 3.10 và tiến hành m-PCR, kết quả thu đƣợc nhƣ sau: Phản ứng m-PCR đối với heo, bò (hình 4.10). Phản ứng m-PCR đối với heo, cừu (hình 4.11). Hình 4.11 Sản phẩm m-PCR đối với DNA heo, cừu T2.1 T2.2 T2.3 T2.4 T2.5 Band heo (398bp) Band cừu (331bp) Tạp Band heo (398bp) Tạp Band bò (274bp) Hình 4.10 Sản phẩm m-PCR đối với heo, bò T1.1 T1.2 T1.3 T1.4 T1.5 40 Kết quả trên cho thấy ở nồng độ DNA tách chiết từ thịt bò, cừu 1ng/ l (trong hỗn hợp T5.1 và T5.2) vẫn còn có thể phát hiện bằng m-PCR. Theo Matsugana và ctv (1998), nồng độ DNA nhỏ nhất còn có thể phát hiện đƣợc bằng PCR là 0,25 ng/ l. 4.6 Kết quả m-PCR đối với các hỗn hợp DNA có nồng độ giảm dần của DNA bò, cừu Sau khi phối trộn DNA của heo, bò, cừu nhƣ bảng 3.11 và thực hiện phản ứng m-PCR, kết quả thu đƣợc là ở nồng độ 1ng/ l của DNA tách chiết từ thịt bò, cừu vẫn còn phát hiện đƣợc bằng PCR (hình 4.12). 4.7 Kết quả s-PCR của thịt xử lý nhiệt Mức nhiệt độ để xử lý sản phẩm thịt chế biến rất đa dạng tùy thuộc quy trình chế biến của nhà sản xuất và mục đích sử dụng sản phẩm. Các sản phẩm nhƣ xúc xích, lạp xƣởng... đƣợc xử lý ở 800C. Xúc xích tiệt trùng, thịt hộp các loại... thƣờng đƣợc xử lý ở 120 0C trở lên. Riêng đối với bột thịt sử dụng trong chế biến thức ăn gia súc đƣợc xử lý ở 1300C. Do đó chúng tôi tiến hành các thí nghiệm s-PCR đối với thịt xử lý nhiệt ở các nhiệt độ: 800C/15 phút, 1200C/15 phút, 1200C/30 phút, 1300C/15 phút. Mục đích của thí nghiệm là xác định hiệu quả của phƣơng pháp PCR đối với thịt xử lý ở vài mức Hình 4.12 Kết quả m-PCR của các hỗn hợp DNA C1.1 C1.2 C1.3 C1.4 C1.5 C1.6 Band heo (398bp) Band bò (274) Band cừu (331bp) 41 nhiệt độ và thời gian xử lý trên để làm cơ sở xác định các loại thịt chế biến lƣu hành trên thị trƣờng. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau: Phản ứng s-PCR đối với thịt xử lý nhiệt ở 800C/15 phút (hình 4.13). Phản ứng s-PCR đối với thịt xử lý nhiệt ở 1200C/15 phút (hình 4.14). Band bò (274bp) Hình 4.13 Kết quả s – PCR đối với thịt xử lý nhiệt ở 80 0C/15 phút t.heo t.bò t.cừu Band cừu (331pb) Band heo (398bp) Hình 4.14 Kết quả s-PCR đối với thịt xử lý nhiệt ở 120 0C/15 phút Tạp Band cừu (331bp) t.heo t.bò t.cừu Band heo (398bp) Band bò (274bp) 42 Phản ứng s-PCR đối với thịt xử lý nhiệt ở 1200C/30 phút (hình 4.15). Phản ứng s-PCR đối với thịt xử lý nhiệt ở 1300C/15 phút (hình 4.16). t.heo t.bò t.cừu Hình 4.15 Kết quả s-PCR của thịt xử lý nhiệt ở 1200C/30 phút Band cừu (331bp) Band bò (274bp) Band heo (398bp) Tạp t.heo t.bò t.cừu Hình 4.16 Kết quả s-PCR của thịt xử lý nhiệt ở 1300C/15 phút Band heo ( (398bp) Band bò (274bp) Band cừu (331bp) t.heo t.bò t.cừu Tạp 43 Kết quả thí nghiệm cho thấy khi xử lý thịt ở: 800C/15phút, 1200C/15phút, 120 0C/30 phút, 1300C/15 phút thịt chƣa bị biến tính nhiều. Theo Ali (2005), thịt bò (mô cơ) xử lý ở 970C/200 phút và 1200C/90 phút vẫn phát hiện đƣợc bằng phƣơng pháp PCR. Năm 2003, Cheng và ctv cũng đã xác định bột xƣơng thịt xử lý ở 133 0 C/20 phút vẫn có thể cho sản phẩm PCR. Cho nên ở các nhiệt độ trong thí nghiệm của chúng tôi các loại thịt vẫn chƣa bị biến tính nhiều và cho kết quả s-PCR tốt. Vậy quy trình PCR tối ƣu hóa với tỷ lệ các mồi nhƣ bảng 3.8 thích hợp cho việc xác định DNA của thịt xử lý nhiệt từ 800C đến 1300C/15 phút. 4.8 Kết quả m-PCR đối với các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt Kết quả m-PCR đối với các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ở 800C/15 phút (hình 4.17). Kết quả m-PCR đối với các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ở 1200C/15 phút (hình 4.18). Hình 4.17 Kết quả m-PCR đối với hỗn hợp thịt xử lý ở nhiệt độ 80 0C/15 phút C2.1 C2.2 C2.3 C2.4 C2.5 C2.6 Band bò (274bp) Band cừu (331bp) Band heo (398 bp) 44 Kết quả m-PCR đối với các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ở 1200C/30 phút (hình 4.19) Tạp Hình 4.18 Kết quả m – PCR đối với hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ở1200C/15 phút Band bò (274bp) Band cừu (274bp) Band heo (398bp) C3.1 C3.2 C3.3 C3.4 C3.5 C3.6 Hình 4.19 Kết quả m-PCR đối với hỗn hỗn hợp xử lý nhiệt 120 0C/30 phút. C4.1 C4.2 C4.3 C4.4 C4.5 C4.6 Band bò (274 bp) Band cừu (331 bp) Band heo (398 bp) Tạp 45 Kết quả m-PCR đối với các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ở 1300C/15 phút – điện di với ladder để đối chứng (hình 4.20). Các kết quả này cho thấy, quy trình m-PCR của chúng tôi hoàn toàn có khả năng ứng dụng để phát hiện ba loại thịt heo, bò, cừu trong hỗn hợp thịt đã xử lý nhiệt. Với quy trình này, ở tỷ lệ 1% của thịt bò, cừu trong hỗn hợp thịt (C2.6, C3.6, C4.6, C5.6) đã xử lý từ 800C đến 1300C/15 phút vẫn còn phát hiện đƣợc. 4.9 Kết quả m-PCR đối với bột thịt Khi đã xác định đƣợc quy trình này hoàn toàn phù hợp để xác định thịt đã xử lý nhiệt, chúng tôi tiến hành m-PCR trên đối tƣợng bột thịt của 3 cơ sở: CE, A, VY. Qua điện di ba mẫu PCR bột thịt cùng với ba đối chứng là sản phẩm s-PCR của DNA thịt heo, bò, cừu (mục 4.2), kết quả thu đƣợc: bột thịt CE có nguồn gốc từ thịt heo, còn bột thịt A và VY có nguồn gốc từ thịt bò (hình 4.21). Tạp Lad C5.1 C5.2 C5.3 C5.4 C5.5 C5.6 Hình 4.20 Kết quả m-PCR của các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ở 1300C/15 phút Band cừu (274 bp) Band heo (398 bp) Band bò (331 bp) 46 Hình 4.21 Sản phẩm m-PCR của bột thịt 3 đối chứng T.heo T.bò T.cừu CE A VY Band bò (274 bp) Band heo (398 bp) Tạp 47 Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận 1. Tách chiết DNA thành công đối với cả thịt tƣơi và thịt xử lý nhiệt ở 80 0C/15 phút, 1200C/15 phút, 1200C/30 phút, 1300C/15 phút với độ tinh sạch cao. 2. Thiết lập đƣợc quy trình m-PCR tối ƣu để phát hiện ba loài heo, bò, cừu trong hỗn hợp thịt chế biến. Quy trình này có thể áp dụng cho cả thịt tƣơi và thịt xử lý nhiệt ở nhiệt độ: 800C/15 phút, 1200C/15 phút, 1200C/30 phút, 1300C/15 phút. 3. Quy trình vẫn phát hiện đƣợc khi nồng độ DNA của thịt cừu và thịt bò ở mức 1 ng/ l và tỉ lệ trong hỗn hợp thịt là 1%. 4. Quy trình áp dụng đƣợc đối với việc phân tích bột thịt làm nguyên liệu cho thức ăn gia súc. 5.2 Đề nghị 1. Thử nghiệm quy trình m-PCR đối với hỗn hợp thịt xử lý ở các nhiệt độ cao hơn. 2. Tối ƣu hóa quy trình để thử nghiệm với các nồng độ DNA nhỏ hơn. 3. Thử nghiệm với nhiều loại thịt gia súc gia cầm khác để tiến tới một quy trình kiểm nghiệm và kiểm soát loài trong bột thịt nhập khẩu vào nƣớc ta. 4. Xây dựng quy trình định lƣợng DNA loài trong hỗn hợp thịt chế biến bằng phƣơng pháp real time PCR (RT- PCR). 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO  Tài liệu tiếng Việt 1. Bùi Thị Cúc, 2006. Tình hình xuất nhập khẩu động vật và các sản phẩm động vật. Cục Thú y /Department of animal heath of Việt Nam. 2. Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 2002. Sinh Học Phân Tử (Khái Niệm - Phương Pháp - ứng Dụng). Tái bản lần 2, NXB Giáo Dục, Thành Phố Hồ Chí Minh. 3. Hồ Thị Nguyệt Thu, 2003. Giáo trình môn học chế biến thịt. Giáo trình môn học, khoa công nghệ thực phẩm trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh. 4. Lƣơng Quý Phƣơng, 2006. Sản xuất bộ kit tách chiết DNA và bộ kit PCR phát hiện gen halothan trên heo. Khóa luận tốt nghiệp kỹ sƣ công ngệ sinh học, Trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Việt Nam. 5. Nguyễn Đình Trung, Nguyễn Minh Tâm, 2005. Giáo trình Giải phẩu sinh ký vật nuôi. NXB Hà Nội. Tr. 38-39. 6. Nguyễn Ngọc Tuân, Lê Thanh Hiền, 2004. Chế biến bảo quản thịt và sữa. NXB Nông nghiệp, Thành Phố Hồ Chí Minh. Tr 11- 16. 7. Nguyễn Thị Lang, Bùi Chí Bửu, 1999. Sinh học phân tử. Giới thiệu và ứng dụng. Nhà xuất bản Nông nghiệp TP. Hồ Chí Minh. 8. Nguyễn Văn Uyển, 1995. Những phương pháp công nghệ sinh học thực vật, Tập 1. Nhà xuất bản nông nghiệp 9. Phạm Văn Ty, 2001. Miễn dịch học. Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia Hà Nội 10. Trần Nhật Phƣơng, 2004. Protein array. Tài liệu giảng dạy, bộ môn công nghệ sinh học, trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh. Tr. 6-10. 11. Trần Thị Xô, Nguyễn Thị Lan, 1999. Cơ sở di truyền và công nghệ gen. NXB Khoa Học và Kỹ Thuật Hà Nội. Tr. 163-169. 49 12. Xmolxki N.T., 1997. Hóa sinh học thịt gia súc. NXB KHKT, Hà Nội. (Đặng Đức Dũng dịch). 165 trang.  Tài liệu tiếng nƣớc ngoài 13. Ali A., Irfan O., Calicioglu M. , 2005. Effect of method of cooking on identification of heat processed beef using polymerase chain reaction (PCR) technique. Meat science 72: 326-330. 14. Garfin E. David, 2000. Electrophoretic Methods. Academic Press, A Harcourt Science and Technology Company. 109 p. 15. Rybicki E.D., Purves M., 2003. SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-page). Deft Microbiology, University of Cape Town. 51 pg. 16. Romans R. John, Costello J. William, Carson C. Wendell, Greaser L. Mairon, Kevin W. Jones, 1999. The meat we eat. Interstate publishers, INC. 593p. 17. Myers J. Michael, Farrell E. Dorothy; Heller N. David, Yancy F. Haile, 2004. Development of a polymerase chain reaction-based method to identify species-specific components in dog food. Food and drug Administration. 18. Davidson W. Michael, 2005. Molecular expressions cell biology and Microscopy structure and fuction of cell and viruses: animal cell structure. The Florida State University. 19. Montiel-Sosa JF, Ruiz-Pesini E, Montoya J, Roncalés P, López-Pérez MJ, Pérez-Martos A, 2000. Direct and highly species-specific detection of pork meat and fat in meat products by PCR amplification of mitochondrial DNA. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Celular, Facultad de Veterinaria, Universidad de Zaragoza, E-50013 Zaragoza, Spain. 20. Murray BW, McClymont RA, Strobeck C, 1995. Forensic identification of ungulate species using restriction digests of PCR-amplified mitochondrial DNA. Department of Biology, McMaster University, Hamilton, Ontario, Canada. 21. Sambrook Joseph and Russell W. David, 2001. Molecular cloning (A laboratory manual). 3 rd edition, Cold Spring Harbor laboratory press, New York, USA. Vol.2: p. 8.23, Vol.3: p. A8.13. 50 22. Sawyer M, Rensen G, Smith W, Yee M, Wong A, Osburn B, Cullor J, 1997. Overcoming RNA inhibition in the fluorescent polymerase chain reaction assay to enhance detection of bovine DNA in cattle feeds. Department of Population Health and Reproduction, School of Veterinary Medicine, University of California, Sawyer, California 95616, USA. 23. Matsugana T., Chikuni K., Tanabe R., Muroya S., Shibata K, Yamada J., Shinmura Y.,1998. A quick and simple method for the identification of meat species and meat products by PCR assay. Meat science 51: p. 143- 148. 24. Yale T., 1997. Troubleshooting for PCR and multiplex PCR. 25. Wayne RK., Geffen E., Girman DJ., Koepfli KP., Lau LM., Marshall CR., 1997. Molecular systematics of the Canidae. Department of Biology, University of California, Los Angeles, California 90095, USA. 26. Cheng Y.H., Wen C.M., Ding S.T., Kao C.C., Kuo T.Y., 2003. Detecting meat – bone meal in ruminant’s feeds by species – specific PCR. Journal of Animal and Sciences, 12, 2003, 851-860.  Tài liệu internet: 27. http:// www.cucthuy.gov.vn>. 28. >. 29. > 30. - 37k> 31. 4573.2006.00046.x 32. meat.htm. PHỤ LỤC Phụ lục 1: 30/08/07 03:05:53 PM Page 1 Analysis of Variance for TTTBT.tsod - Type III Sums of Squares ------------------------------------------------------------------------- ------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level ------------------------------------------------------------------------- ------- MAIN EFFECTS A:TTTBT.mau .0819391 1 .0819391 1.374 .2457 RESIDUAL 3.6984594 62 .0596526 ------------------------------------------------------------------------- ------- TOTAL (CORRECTED) 3.7803984 63 ------------------------------------------------------------------------- ------- 0 missing values have been excluded. All F-ratios are based on the residual mean square error. 30/08/07 03:06:52 PM Page 1 Table of Least Squares Means for TTTBT.tsod ------------------------------------------------------------------------- ------- 95% Confidence Level Count Average Stnd. Error for mean ------------------------------------------------------------------------- ------- GRAND MEAN 64 1.9848438 .0305298 1.9238016 2.0458859 A:TTTBT.mau t 32 2.0206250 .0431757 1.9342984 2.1069516 c 32 1.9490625 .0431757 1.8627359 2.0353891 ------------------------------------------------------------------------- ------- 30/08/07 03:07:39 PM Page 1 Multiple range analysis for TTTBT.tsod by TTTBT.mau ------------------------------------------------------------------------- ------- Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups ------------------------------------------------------------------------- ------- c 32 1.9490625 X t 32 2.0206250 X ------------------------------------------------------------------------- ------- contrast difference +/- limits t - c 0.07156 0.12208 ------------------------------------------------------------------------- ------- * denotes a statistically significant difference. Phụ lục 2: 30/08/07 03:08:40 PM Page 1 Analysis of Variance for TTTBT.NDDND - Type III Sums of Squares ------------------------------------------------------------------------- ------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level ------------------------------------------------------------------------- ------- MAIN EFFECTS A:TTTBT.mau .7331641 1 .7331641 26.615 .0000 RESIDUAL 1.7078977 62 .0275467 ------------------------------------------------------------------------- ------- TOTAL (CORRECTED) 2.4410618 63 ------------------------------------------------------------------------- ------- 0 missing values have been excluded. All F-ratios are based on the residual mean square error. 30/08/07 03:09:12 PM Page 1 Table of Least Squares Means for TTTBT.NDDND ------------------------------------------------------------------------- ------- 95% Confidence Level Count Average Stnd. Error for mean ------------------------------------------------------------------------- ------- GRAND MEAN 64 .2660625 .0207465 .2245814 .3075436 A:TTTBT.mau t 32 .3730938 .0293400 .3144306 .4317569 c 32 .1590312 .0293400 .1003681 .2176944 ------------------------------------------------------------------------- ------- 30/08/07 03:09:52 PM Page 1 Multiple range analysis for TTTBT.NDDND by TTTBT.mau ------------------------------------------------------------------------- ------- Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups ------------------------------------------------------------------------- ------- c 32 .1590312 X t 32 .3730938 X ------------------------------------------------------------------------- ------- contrast difference +/- limits t - c 0.21406 0.08296 * ------------------------------------------------------------------------- ------- * denotes a statistically significant difference. Phụ lục 3: 30/08/07 03:36:41 PM Page 1 Analysis of Variance for BPS.tisood - Type III Sums of Squares ------------------------------------------------------------------------- ------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level ------------------------------------------------------------------------- ------- MAIN EFFECTS A:BPS.mau .1804513 2 .0902256 .785 .4637 RESIDUAL 4.1364154 36 .1149004 ------------------------------------------------------------------------- ------- TOTAL (CORRECTED) 4.3168667 38 ------------------------------------------------------------------------- ------- 0 missing values have been excluded. All F-ratios are based on the residual mean square error. 30/08/07 03:37:08 PM Page 1 Table of Least Squares Means for BPS.tisood ------------------------------------------------------------------------- ------- 95% Confidence Level Count Average Stnd. Error for mean ------------------------------------------------------------------------- ------- GRAND MEAN 39 2.0166667 .0542786 1.9065591 2.1267743 A:BPS.mau b 13 1.9269231 .0940133 1.7362111 2.1176350 p 13 2.0915385 .0940133 1.9008265 2.2822504 s 13 2.0315385 .0940133 1.8408265 2.2222504 30/08/07 03:37:42 PM Page 1 Multiple range analysis for BPS.tisood by BPS.mau ------------------------------------------------------------------------- ------- Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups ------------------------------------------------------------------------- ------- b 13 1.9269231 X s 13 2.0315385 X p 13 2.0915385 X ------------------------------------------------------------------------- ------- contrast difference +/- limits b - p -0.16462 0.26971 b - s -0.10462 0.26971 p - s 0.06000 0.26971 ------------------------------------------------------------------------- ------- * denotes a statistically significant difference. Phụ lục 4: 30/08/07 03:14:08 PM Page 1 Analysis of Variance for BPS.dna - Type III Sums of Squares ------------------------------------------------------------------------- ------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level ------------------------------------------------------------------------- ------- MAIN EFFECTS A:BPS.mau .4887762 2 .2443881 12.075 .0001 RESIDUAL .7286095 36 .0202392 ------------------------------------------------------------------------- ------- TOTAL (CORRECTED) 1.2173857 38 ------------------------------------------------------------------------- ------- 0 missing values have been excluded. All F-ratios are based on the residual mean square error. 30/08/07 03:14:37 PM Page 1 Table of Least Squares Means for BPS.dna ------------------------------------------------------------------------- ------- 95% Confidence Level Count Average Stnd. Error for mean ------------------------------------------------------------------------- ------- GRAND MEAN 39 .3005128 .0227805 .2543010 .3467246 A:BPS.mau b 13 .1544615 .0394570 .0744204 .2345027 p 13 .3206154 .0394570 .2405742 .4006565 s 13 .4264615 .0394570 .3464204 .5065027 ------------------------------------------------------------------------- ------- 30/08/07 03:15:05 PM Page 1 Multiple range analysis for BPS.dna by BPS.mau ------------------------------------------------------------------------- ------- Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups ------------------------------------------------------------------------- ------- b 13 .1544615 X p 13 .3206154 X s 13 .4264615 X ------------------------------------------------------------------------- ------- contrast difference +/- limits b - p -0.16615 0.11320 * b - s -0.27200 0.11320 * p - s -0.10585 0.11320 ------------------------------------------------------------------------- ------- * denotes a statistically significant difference.