Khóa luận Bước đầu hoàn thiện phương pháp và nghiên cứu mức độ đa dạng di truyền cây đưng (rhizophora mucronata lamk.) tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ bằng kỹ thuật rapd

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP BƢỚC ĐẦU HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU MỨC ĐỘ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÂY ĐƢNG (Rhizophora mucronata Lamk.) TẠI KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khoá: 2003 - 2007 Sinh viên thực hiện: TRƢƠNG THỊ MINH THÙY Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ********************** BƢỚC ĐẦU HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU MỨC ĐỘ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÂY ĐƢNG (Rhizophora mucronata Lamk.) TẠI KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. BÙI MINH TRÍ TRƢƠNG THỊ MINH THÙY Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 ii LỜI CẢM ƠN Con thành kính ghi ơn Ba Mẹ đã sinh ra và nuôi nấng con thành ngƣời. Con xin cảm ơn gia đình về tất cả. Em xin chân thành cảm ơn: Các Thầy, Cô trƣờng Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh đã tận tình truyền đạt kiến thức cho em trong suốt 4 năm học. Ban chủ nhiệm cùng các Thầy Cô trong Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học đã động viên, giúp đỡ em trong thời gian học tập và thực hiện khóa luận. Thầy TS. Bùi Minh Trí đã tận tình chỉ dẫn em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận. Các anh chị trong Trung tâm Phân tích và Thí nghiệm Hóa sinh đã động viên, giúp đỡ em trong quá trình thực hiện khóa luận. Ban quản lý rừng phòng hộ Cần Giờ đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thu thập mẫu. Anh Bình, anh Kiệt cùng các anh chị trong phòng Kỹ thuật thuộc Ban quản lý Rừng phòng hộ Cần Giờ đã tận tình giúp đỡ em trong quá trình thu thập mẫu. Các bạn cùng thực hiện đề tài đã hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện khoá luận. Xin cảm ơn tất cả các bạn lớp Công Nghệ Sinh Học 29 đã cùng tôi chia sẻ bao niềm vui, nỗi buồn trong suốt 4 năm đại học. Đặc biệt cảm ơn tất cả các bạn cùng phòng đã ủng hộ tinh thần và đồng hành với tôi trong suốt thời gian học tập. Chúc mọi ngƣời đều hạnh phúc và thành đạt. Xin chân thành cảm ơn! Trƣơng Thị Minh Thùy iii TÓM TẮT TRƢƠNG THỊ MINH THÙY, Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, 9/2007. “BƢỚC ĐẦU HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÂY ĐƢNG (Rhizophora mucronata Lamk.) TẠI KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD”. Giáo viên hƣớng dẫn: TS. BÙI MINH TRÍ. Khóa luận đƣợc tiến hành tại Trung tâm Phân tích và Thí nghiệm Hóa Sinh trƣờng Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh từ 7 / 5 / 2007 đến 31 / 8 / 2007. Rừng ngập mặn là hệ sinh thái gồm nhiều loài cây khác nhau, trong đó có Đƣng Rhizophora mucronata Lamk., một loài chiếm số lƣợng lớn ở vùng nƣớc mặn, đồng thời quần thể Đƣng cũng là hàng rào bảo vệ bờ biển các quốc gia nhiệt đới và cận nhiệt đới. Tuy ý nghĩa kinh tế và môi trƣờng của rừng ngập mặn ngày càng đƣợc công nhận, song diện tích của chúng trên khắp thế giới đang giảm dần theo thời gian do ô nhiễm và nạn phá rừng. Trên cơ sở đó, cần có những kế hoạch hợp tác nhằm cải thiện hệ sinh thái, thiết lập sự phát triển bền vững cho rừng ngập mặn nói chung và khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ nói riêng. Khóa luận này nhằm mục đích thiết lập quy trình thích hợp cho việc đánh giá sự đa dạng di truyền cây Đƣng Rhizophora mucronata tại rừng ngập mặn Cần Giờ. Kết quả đạt đƣợc:  Hoàn thiện quy trình ly trích DNA từ mẫu lá Đƣng tƣơi.  Xây dựng đƣợc quy trình phản ứng RAPD đối với cây Đƣng. Xác định đƣợc OPAC10 là mồi tạo độ đa hình cao nhất trong số những mồi tiến hành khảo sát. Từ 14 mẫu, OPAC10 đã khuếch đại 18 locus, trong đó có 2 band đồng hình (trọng lƣợng phân tử: 300 bp và 400 bp) và 13 band đa hình.  Kết quả phân tích bằng phần mềm NTSYS 2.1, hệ số đồng dạng di truyền giữa các cá thể trong quần thể Đƣng tự nhiên và Đƣng đƣợc trồng biến thiên từ 46 đến 79 %. Kết quả phân tích trên 14 mẫu ngẫu nhiên khác, chúng tôi nhận thấy hệ số đồng dạng di truyền dao động từ 68 đến 100 %. Điều này cho thấy giữa các cá thể trong iv quần thể Đƣng tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ có mối quan hệ di truyền tƣơng đối gần, tuy nhiên chúng lại phân bố rải rác khắp các tiểu khu vì vậy giữa các cá thể vẫn thể hiện đƣợc tính đa dạng sinh học cao. Tp. HCM, ngày 7 tháng 9 năm 2007. Trƣơng Thị Minh Thùy v ABSTRACT TRUONG THI MINH THUY, Nong Lam University, Ho Chi Minh City, September 2007. “PREMILINARY RESEARCH ON METHOD DEVELOPMENT AND GENETIC DIVERSITY EVALUATION OF Rhizophora mucronata Lamk. IN CAN GIO MANGROVE BIOSPHERE RESERVE AREA BY RAPD”. The thesis was carried out in Chemical and Biological Analysis and Experiment Center at Nong Lam University from May to August in 2007. Supervisor: BUI MINH TRI, PhD. Mangrove is an ecological term referring to a taxonomical diverse assemblage of trees, including Rhizophora mucronata Lamk., that forms the dominant plant communities in tidal, saline wetlands along sheltered tropical and subtropical coast. Although the economic and environmental significance of mangroves is being increasingly recognized, it is in fact, decreasing around the world because of pollution and deforestation of the mangrove forests. By those reason, it is necessary to set up an integrated plan improving the ecosystem in order to establish a sustainable development for the mangrove forest in general and Can Gio Biosphere reserve are in particular. This research was aimed to set up appropriate protocols for evaluating genetic diversity of Rhizophora mucronata in Can Gio mangrove forest. The obtained results were:  Set up suitable protocol for extracting genomic DNA of fresh leaves of R. mucronata.  Optimize RAPD analysis protocol for R. mucronata. It was indicated that Primer OPAC10 gave highest polymorphic level among tested primers. From 14 samples, primer OPAC10 amplified at 18 loci, those included 2 monomorphic bands (with molecular weight: 300 bps & 400 bps) and 13 polymorphic bands.  Analysing with NTSYS 2.1, similarity between the natural R. mucronata and cultivated R. mucronata populations was in a range from 46 to 79 %. Another vi analysis on 14 randomized samples, we obtained similarity ranged from 68 to 100%. The result also suggested that R. mucronata at Can Gio biosphere reserve area have not had closed relation but scattered in to various groups. vii MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang tựa ............................................................................................................................ i Lời cảm ơn ........................................................................................................................ iii Tóm tắt .............................................................................................................................. iv Abstract ............................................................................................................................. vi Mục lục ............................................................................................................................. viii Danh sách các chữ viết tắt ................................................................................................. xii Danh sách các bảng .......................................................................................................... xiii Danh sách các hình ........................................................................................................... xiv Chƣơng 1. MỞ ĐẦU .................................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................................... 1 1.2. Mục đích ..................................................................................................................... 2 1.3. Yêu cầu ....................................................................................................................... 2 1.4. Giới hạn của đề tài ..................................................................................................... 2 Chƣơng 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................... 3 2.1. Giới thiệu về khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ, Tp. Hồ Chí Minh ....................................................................................................... 3 2.1.1. Khái niệm và chức năng của khu dự trữ sinh quyển ..................................... 3 2.1.2. Tổng quan về khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ ................... 4 2.1.2.1. Điều kiện tự nhiên ..................................................................................... 4 2.1.2.2. Chức năng từng vùng trong khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ, Thành phố Hồ Chí Minh .............................. 6 2.1.2.3. Hệ sinh vật ở rừng ngập mặn Cần Giờ ................................................... 7 2.1.3. Thực trạng của rừng ngập mặn Cần Giờ hiện nay ........................................ 8 2.2. Cây Đƣng (Rhizophora mucronata Lamk.) ........................................................... 9 viii 2.2.1. Phân loại ............................................................................................................. 9 2.2.2. Hình thái học .................................................................................................... 10 2.2.3. Phân bố ............................................................................................................. 11 2.2.4. Giá trị kinh tế ................................................................................................... 11 2.3. DNA (Deoxyribonucleic acid) ............................................................................... 12 2.3.1. Quy trình ly trích DNA thực vật .................................................................... 13 2.3.2. Các phƣơng pháp định lƣợng, định tính DNA ............................................. 14 2.3.2.1. Định lƣợng DNA bằng phƣơng pháp quang phổ ................................ 14 2.3.2.2. Định tính DNA bằng phƣơng pháp điện di .......................................... 15 2.4. Enzyme giới hạn (RE – restriction enzyme) ........................................................ 16 2.4.1. Các loại enzyme giới hạn ............................................................................... 16 2.4.2. Trình tự nhận biết của enzyme cắt giới hạn ................................................. 16 2.4.3. Sử dụng các enzyme cắt giới hạn trong phân tích DNA ............................ 16 2.5. PCR (Polymerase Chain Reaction) ....................................................................... 18 2.5.1. Khái niệm ......................................................................................................... 18 2.5.2. Nguyên tắc của phản ứng PCR ...................................................................... 18 2.5.3. Quy trình phản ứng PCR ................................................................................ 19 2.6. Khái niệm đa dạng sinh học (Biodiversity) và tầm quan trọng ......................... 20 2.7. Sự đa dạng di truyền (Genetic diversity) .............................................................. 21 2.8. Ý nghĩa của việc nghiên cứu sự đa dạng di truyền ............................................. 21 2.9. Một số kỹ thuật đánh giá sự đa dạng di truyền và phát hiện chỉ thị phân tử ... 22 2.9.1. Kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Lenghth Polymorphism) .............. 22 2.9.1.1. Khái niệm ................................................................................................. 22 2.9.1.2. Một số nghiên cứu, ứng dụng dựa trên kỹ thuật RFLP ...................... 23 2.9.2. Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Lenghth Polymorphism) ............... 24 2.9.2.1. Khái niệm ................................................................................................. 24 2.9.2.2. Một số nghiên cứu, ứng dụng dựa trên kỹ thuật AFLP ...................... 26 2.9.3. Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) ........................ 27 2.9.3.1. Khái niệm ................................................................................................. 27 ix 2.9.3.2. Những ƣu điểm của kỹ thuật RAPD ..................................................... 29 2.9.3.3. Những hạn chế của kỹ thuật RAPD ...................................................... 29 2.9.3.4. Một số nghiên cứu, ứng dụng dựa trên kỹ thuật RAPD ..................... 29 2.9.4. So sánh một số kỹ thuật đánh giá đa dạng di truyền và phát hiện chỉ thị phân tử ............................................................................. 30 Chƣơng 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM .............................. 31 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện ............................................................................ 31 3.1.1. Thời gian thực hiện ......................................................................................... 31 3.1.2. Địa điểm thực hiện .......................................................................................... 31 3.2. Vật liệu thí nghiệm .................................................................................................. 31 3.2.1. Nguyên tắc thu thập mẫu ................................................................................ 31 3.2.2. Cách ký hiệu mẫu ............................................................................................ 31 3.2.3. Cách lấy mẫu .................................................................................................... 32 3.2.4. Cách bảo quản mẫu ......................................................................................... 32 3.3. Phƣơng pháp thí nghiệm ......................................................................................... 32 3.3.1. Quy trình ly trích DNA ................................................................................... 32 3.3.1.1. Vật liệu dùng trong ly trích DNA .......................................................... 32 3.3.1.2. Quy trình ly trích DNA ........................................................................... 33 3.3.1.3. Kiểm tra kết quả ly trích DNA bằng phƣơng pháp quang phổ .......... 35 3.3.1.4. Kiểm tra kết quả ly trích DNA bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose .......................................................................... 35 3.3.2. Kỹ thuật RAPD ................................................................................................ 35 3.3.2.1. Vật liệu dùng trong RAPD ..................................................................... 35 3.3.2.2. Tiến hành thí nghiệm .............................................................................. 37 Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................ 42 4.1. Kết quả thu thập mẫu Đƣng tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ .......................................................................................... 42 4.2. Bảo quản mẫu .......................................................................................................... 43 4.3. Kết quả OD (Optical Density) ............................................................................... 44 x 4.4. Kết quả điện di ......................................................................................................... 45 4.4.1. Kết quả điện di DNA thu đƣợc theo quy trình ly trích 1 ............................ 45 4.4.2. Kết quả điện di DNA thu đƣợc theo quy trình ly trích 2 ............................ 45 4.4.3. Kết quả điện di DNA thu đƣợc theo quy trình ly trích 3 ............................ 47 4.5. Kết quả phản ứng RAPD ........................................................................................ 49 4.5.1. Kết quả khảo sát Primer OPAC10 ................................................................. 49 4.5.2. Kết quả khảo sát 7 mồi trên cây Đƣng cùng một số cây ngập mặn khác . 50 4.5.3. Kết quả khảo sát nồng độ OPAC10 .............................................................. 53 4.5.4. Kết quả sử dụng OPAC10 thực hiện phản ứng RAPD với tất cả các mẫu DNA ly trích đạt tiêu chuẩn .......................................... 53 4.5.5. Đánh giá quy trình phản ứng PCR – RAPD ................................................ 56 4.6. Bƣớc đầu đánh giá mức độ di truyền cây Đƣng tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ bằng phần mềm NTSYS .............................................. 56 Chƣơng 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................................... 61 5.1. Kết luận ..................................................................................................................... 61 5.2. Đề nghị ...................................................................................................................... 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................ 63 xi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT AFLP : Amplified Fragment Length Polymorphism. bp : Base pair. DNA : Deoxyribonucleic Acid. dNTP : Deoxynucleotide Triphosphate. EB : Extraction Buffer. EDTA : Ethylenediamine Tetra Acetic Acid. GPS : Global Position System. MAB : Man and Biosphere. OD : Optical Density. PCR : Polymerase Chain Reaction. RAPD : Random Amplified Polymorphism of DNA. RE : Restriction Enzyme. RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism. RNA : Ribonucleic Acid. Rnase : Ribonuclease. SSCP : Single – strand Conformation Polymorphism. SSR : Simple Sequence Repeat. STS : Sequence – tagged Sites. Ta : Annealing temperature. TAE : Tris Glacial Acetic Acid EDTA. TE : Tris EDTA. Tm : Melting temperature. UNESCO : United Nations Educational Scientific and Cultural Organization. UV : Ultra Violet. WWF : World Wildlife Fund. xii DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1: So sánh một số kỹ thuật đánh giá đa dạng di truyền và phát hiện chỉ thị phân tử ........................................................................ 30 Bảng 3.1: Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng RAPD ở thí nghiệm 1 .. 37 Bảng 3.2: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD ở thí nghiệm 1 ................................ 37 Bảng 3.3: Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng RAPD ở thí nghiệm 2 .. 38 Bảng 3.4: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD ở thí nghiệm 2 ................................ 38 Bảng 3.5: Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng RAPD ở thí nghiệm 3 .. 39 Bảng 3.6: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD ở thí nghiệm 3 ................................ 39 Bảng 3.7: Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng RAPD ở thí nghiệm 4 .. 40 Bảng 3.8: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD ở thí nghiệm 4 ................................ 40 xiii DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1 Bản đồ khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ ........................... 5 Hình 2.2 Các thành phần trong cấu tạo hình thái cây Đƣng .................................. 10 Hình 2.3 Cấu trúc mạch đôi xoắn kép của phân tử Deoxyribonucleic acid ........... 12 Hình 2.4 Một số enzyme cắt giới hạn .................................................................... 17 Hình 2.5 Phản ứng PCR ......................................................................................... 20 Hình 2.6 RFLP trong trƣờng hợp có đột biến điểm ............................................... 23 Hình 2.7 Nguyên lý kỹ thuật AFLP ....................................................................... 25 Hình 2.8 Nguyên lý kỹ thuật RAPD ...................................................................... 28 Hình 4.1 Vị trí các mẫu Đƣng đƣợc thu thập trên bản đồ Cần Giờ ....................... 42 Hình 4.2 Kết quả điện di mẫu ly trích theo quy trình 1 ......................................... 45 Hình 4.3 Kết quả điện di mẫu ly trích theo quy trình 2 ......................................... 45 Hình 4.4 Sự khác biệt giữa DNA mẫu ly trích theo quy trình 2 và quy trình 3 ..... 46 Hình 4.5 Kết quả điện di 12 mẫu ly trích theo quy trình 3 .................................... 47 Hình 4.6 Kết quả điện di 13 mẫu ly trích theo quy trình 3 .................................... 47 Hình 4.7 Kết quả điện di sử dụng primer OPAC10, khảo sát quy trình RAPD .... 49 Hình 4.8 Kết quả điện di khảo sát Primer 1 ........................................................... 50 Hình 4.9 Kết quả điện di khảo sát Primer 9 và 2 ................................................... 50 Hình 4.10 Kết quả điện di khảo sát Primer RAH8 ................................................. 51 Hình 4.11 Kết quả điện di sản phẩm RAPD của mẫu 7.12 với 7 mồi ................... 51 Hình 4.12 Kết quả điện di khảo sát nồng độ Primer OPAC10 trên mẫu 2B.14 và 7.12 ......................................................................... 53 Hình 4.13 Kết quả điện di 7 sản phẩm RAPD ....................................................... 53 Hình 4.14 Kết quả điện di 8 sản phẩm RAPD ....................................................... 54 Hình 4.15 Kết quả điện di 10 sản phẩm RAPD ..................................................... 54 Hình 4.16 Cây phân loại 6 cây Đƣng tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ ........................................................................ 57 Hình 4.17 Cây phân loại 14 cây Đƣng tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ ........................................................................ 59 1 Chƣơng 1. MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Trong quá trình tồn tại và phát triển, con ngƣời không ngừng khai thác, tàn phá tài nguyên thiên nhiên và môi trƣờng. Ngày nay, sự mở rộng và phát triển các khu công nghiệp đã tạo một lƣợng khí thải vô cùng lớn, gây ô nhiễm không khí góp phần tàn phá sự sống trên trái đất. Những hoạt động đó đang dần làm mất cân bằng hệ sinh thái, phá hủy một trong những nguồn tài nguyên quý giá nhất, không thể thay thế trên thế giới, đó là đa dạng sinh học - cơ sở của sự sống còn, sự thịnh vƣợng và phát triển bền vững. [41] Từ thực tế trên, các khu dự trữ sinh quyển đƣợc ra đời, nhằm thực hiện nhiệm vụ trọng yếu: Bảo vệ hệ sinh quyển - một hệ sinh thái khổng lồ, đồng thời đảm bảo sự cân bằng, bảo tồn đa dạng sinh học, thúc đẩy kinh tế - xã hội phát triển và duy trì các giá trị văn hóa truyền thống. Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ là khu dự trữ sinh quyển đầu tiên của Việt Nam đƣợc UNESCO công nhận [22]. Với cảnh quan thiên nhiên tƣơi đẹp, thành phần các loài động thực vật phong phú, đa dạng, rừng ngập mặn Cần Giờ không những là rừng phòng hộ mà còn là điểm du lịch sinh thái hấp dẫn, mô hình học tập và nghiên cứu lý tƣởng [22], [43]. Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ là nguồn tài nguyên vô giá, có vai trò và vị trí đặc biệt quan trọng đối với đời sống cộng đồng dân địa phƣơng và các vùng phụ cận. Quần thể Đƣng (R. mucronata) cùng những quần thể thực vật khác góp phần điều hòa khí hậu [30], chắn gió, chống xói lở, giảm bớt sự xáo trộn đất đai và ô nhiễm nguồn nƣớc ven biển, nuôi dƣỡng, cung cấp thức ăn cho các loài động vật hoang dã và hải sản có giá trị cao, đồng thời tạo sinh kế cho ngƣ dân [21]. Nhằm đem lại hiệu quả kinh tế và môi trƣờng cao hơn, chúng ta cần lập kế hoạch phát triển lâu dài và bền vững, tiến hành nghiên cứu, đánh giá nguồn gene và mức độ đa dạng di truyền các quần thể thực vật rừng ngập mặn Cần Giờ, trong đó có quần thể Đƣng, nhằm tìm đƣợc những chỉ thị phân tử phục vụ đắc lực cho việc chọn lọc 2 nhanh giống Đƣng, góp phần đảm bảo công tác trồng và phát triển rừng đạt hiệu quả cao nhất. Phƣơng pháp tốt nhất đáp ứng yêu cầu này là sử dụng các marker phân tử. Đƣợc sự phân công của Bộ môn Công nghệ Sinh học - Trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. HCM, dƣới sự hƣớng dẫn của Thầy TS. Bùi Minh Trí chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “BƢỚC ĐẦU HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÂY ĐƢNG (Rhizophora mucronata Lamk.) TẠI KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD”. 1.2. Mục đích  Hoàn thiện quy trình ly trích DNA đối với cây Đƣng.  Xây dựng quy trình RAPD và bƣớc đầu đánh giá mức độ đa dạng di truyền quần thể Đƣng tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ.  Phục vụ công tác tuyển chọn giống Đƣng để lai tạo và xây dựng tiền đề cho những nghiên cứu chuyên sâu về sự đa dạng di truyền, nhận diện chỉ thị phân tử. 1.3. Yêu cầu  Thu thập mẫu lá từ những cây Đƣng có đặc điểm hình thái khác nhau: thân cây to, cây mọc tốt, cây mọc yếu ớt, cây bị bệnh, cây mọc tự nhiên hay đƣợc trồng.  Ly trích DNA có chất lƣợng tốt làm nguyên liệu cho kỹ thuật RAPD.  Thực hiện kỹ thuật RAPD và phân tích kết quả bằng phần mềm NTSYS 2.1. 1.4. Giới hạn của đề tài  Đề tài chỉ tiến hành nghiên cứu quần thể Đƣng tại một số tiểu khu trong khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ, Tp. Hồ Chí Minh.  Thời gian thực hiện ngắn.  Chƣa đủ điều kiện để thực hiện nhiều thí nghiệm tối ƣu, chƣa khảo sát nhiều primer đối với kỹ thuật RAPD nhằm đạt đƣợc kết quả chính xác hơn. 3 Chƣơng 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Giới thiệu về khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ, Tp. Hồ Chí Minh 2.1.1. Khái niệm và chức năng của khu dự trữ sinh quyển Sinh quyển là lớp vỏ trái đất có các sinh vật sống trên đó, kể cả đại dƣơng, ao hồ, sông suối, đất và phần dƣới của khí quyển. Sinh quyển cùng với khí quyển, địa quyển và thủy quyển tác động qua lại với nhau trong “Hệ thống trái đất”. [45] Sinh quyển là một hệ sinh thái khổng lồ, bao gồm các hệ sinh thái nhỏ hơn trên bề mặt trái đất. Việc bảo tồn nguyên vẹn tất cả hệ sinh thái là điều không thể, nên ngƣời ta chỉ có thể lựa chọn ra một số đại diện của các hệ sinh thái này để bảo tồn với ý nghĩa là các khu dự trữ vốn gene, loài và hệ sinh thái cho toàn bộ sinh quyển. [45] Khu dự trữ sinh quyển là những vùng có các hệ sinh thái trên cạn hoặc ven biển đƣợc quốc tế công nhận trong phạm vi chƣơng trình Con ngƣời và Sinh quyển (Man and Biosphere – MAB) của UNESCO, nhằm thúc đẩy và trình diễn mối quan hệ giữa con ngƣời với thiên nhiên. Các khu dự trữ sinh quyển là mô hình mẫu của các hệ sinh thái trên trái đất, là phòng thí nghiệm sống cho việc nghiên cứu và giám sát các hệ sinh thái đem lại lợi ích cho ngƣời dân địa phƣơng mà không gây hại đến môi trƣờng. [45] Mỗi khu dự trữ sinh quyển có 3 chức năng [45]:  Chức năng bảo tồn: đóng góp vào việc bảo tồn đa dạng di truyền, loài, hệ sinh thái và cảnh quan.  Chức năng phát triển: thúc đẩy phát triển kinh tế bền vững về sinh thái cũng nhƣ các giá trị văn hóa truyền thống.  Chức năng hỗ trợ: tạo điều kiện cho các hoạt động nghiên cứu, giám sát, giáo dục và trao đổi thông tin giữa các địa phƣơng, quốc gia, quốc tế về bảo tồn và phát triển bền vững. 4 2.1.2. Tổng quan về khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ 2.1.2.1. Điều kiện tự nhiên Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ đƣợc hình thành ở hạ lƣu sông Đồng Nai – Sài Gòn đổ ra biển Đông ở cửa Xoài Rạp, Đồng Tranh và vịnh Gành Rái, đồng thời nằm ở cửa ngõ Đông Nam Thành phố Hồ Chí Minh, cách trung tâm thành phố khoảng 300 km. [8], [29], [44] Tọa độ địa lý [29]  Vĩ độ Bắc: 10o 22’ 14” – 10o 37’ 39”  Kinh độ Đông: 106o 46’ 12” – 107o 00’ 59” Phía Bắc giáp tỉnh Đồng Nai, phía Nam giáp biển Đông, phía Tây giáp tỉnh Tiền Giang và Long An, phía Đông giáp tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu. Cần Giờ có khí hậu nhiệt đới gió mùa cận xích đạo với hai mùa rõ rệt: mùa mƣa từ tháng 5 – 11, gió hƣớng Tây Nam, mùa nắng từ tháng 12 – 4 năm sau, gió hƣớng Đông Nam. Nhiệt độ trung bình 25,8 0C. Lƣợng mƣa thấp, trung bình từ 1.000 – 1.200 mm / năm. [27] Dân số khoảng 63.000 ngƣời (2003), sống chủ yếu bằng nghề đánh bắt và nuôi trồng thủy sản. Dân cƣ phân bố không đều trên địa bàn 7 xã, phần đông tập trung ở xã Bình Khánh, Long Hòa, Cần Thạnh và An Thới Đông. [17] Tổng diện tích khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ là 75.740 ha (2000) [29], [51], gồm vùng lõi, vùng đệm, vùng chuyển tiếp. Theo định hƣớng qui hoạch phát triển của huyện Cần Giờ đến năm 2010, cơ cấu đất đai về cơ bản vẫn giữ vai trò nồng cốt là rừng phòng hộ, rừng sinh quyển trên diện tích khoảng 38.000 ha (1993 - 1999) [29], mở mang thêm diện tích nuôi trồng thủy sản (6.990 ha [23]) với nguyên tắc gắn bó chặt chẽ với các hệ sinh thái rừng ngập mặn. 5 Hình 2.1 Bản đồ khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ. Ghi chú: Vùng lõi Vùng đệm Vùng chuyển tiếp 6 2.1.2.2. Chức năng từng vùng trong khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ, Thành phố Hồ Chí Minh a. Vùng lõi (4.721 ha) Vùng lõi bao gồm các tiểu khu rừng số 3, 4b, 6, 11, 12 và 13. Vùng này đặc trƣng cho các hệ sinh thái rừng trồng, đặc biệt là rừng ngập mặn tái sinh tự nhiên dọc theo các kênh rạch và bìa rừng, có mức độ đa dạng sinh học cao về thành phần các loài động vật, thực vật, vi sinh vật cùng cảnh quan rừng ngập mặn đa dạng và hấp dẫn [28], [45]. Các chức năng chính bao gồm:  Bảo tồn hệ sinh thái rừng ngập mặn bao gồm rừng trồng và rừng tự nhiên.  Bảo tồn cảnh quan rừng ngập mặn với các môi trƣờng sống của động vật hoang dã, đặc biệt là chim nƣớc.  Bảo tồn hệ thống thủy vực, các bãi bồi dọc bờ sông và ven biển, nơi kiếm ăn và sinh đẻ của các loài động vật vùng triều.  Tiến hành một số công trình nghiên cứu khoa học về sức bền hệ sinh thái và du lịch sinh thái có giới hạn. b. Vùng đệm (41.139 ha) Là vùng tiếp giáp với vùng lõi, có thể tiến hành các hoạt động kinh tế, nghiên cứu, giáo dục và giải trí nhƣng không ảnh hƣởng đến mục đích bảo tồn vùng lõi. Vùng đệm bao gồm các tiểu khu rừng số 1, 2, 4a, 5, 7, 8, 9, 10, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22. 23 và 24. Với chức năng phục hồi các hệ sinh thái, dựa trên các quần xã chiếm ƣu thế [28], [45], bao gồm:  Góp phần bảo vệ chung vùng lõi của khu dự trữ sinh quyển.  Tạo không gian lớn cho thú hoang dã ngoài vùng lõi. Khi các khu vực này trở nên ổn định, có thể bổ sung vào vùng lõi nếu cần thiết.  Tạo ra cảnh quan tự nhiên và văn hóa nhân văn phục vụ cho du lịch sinh thái.  Các mô hình lâm ngƣ kết hợp với môi trƣờng cũng đƣợc ứng dụng trong vùng này cho cƣ dân địa phƣơng. 7 c. Vùng chuyển tiếp (29.880 ha) Vùng chuyển tiếp bao gồm các khu vực còn lại của huyện Cần Giờ, cả các khu lúa nƣớc và vƣờn cây ăn trái cùng thảm cỏ dọc theo bờ biển Cần Thạnh, Long Thành, Lý Nhơn. [28], [45] Chức năng chính của vùng này:  Đệm xã hội: các hoạt động sản xuất trong vùng chuyển tiếp cung cấp các loại sản phẩm và dịch vụ chủ yếu cho cƣ dân địa phƣơng. Việc sử dụng đất và tài nguyên thiên nhiên trong khu vực này không đƣợc mâu thuẫn với mục tiêu của khu dự trữ sinh quyển do UNESCO qui định. Mối quan hệ giữa con ngƣời và thiên nhiên phải đƣợc hài hòa.  Đệm mở rộng: việc quản lý và phát triển của vùng chuyển tiếp nhằm mục tiêu mở rộng không gian có sẵn nhƣ môi trƣờng sống cho các loài thú hoang dã từ vùng đệm. 2.1.2.3. Hệ sinh vật ở rừng ngập mặn Cần Giờ Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ mang tính đa dạng sinh học cao. Hệ thực vật, có trên 158 loài thực vật thuộc 76 họ, các loài chủ yếu nhƣ Đƣớc, Bần trắng, Mắm trắng, các quần hợp Đƣớc đôi - Bần trắng cùng Xu ổi, Trang, Đƣng (Đâng hay Đƣớc xanh) và các loài nƣớc lợ nhƣ Bần chua, các quần hợp Mái dầm – Ô rô, Dừa lá, Ráng. Thảm cỏ biển với các loài ƣu thế Halophyla sp., Halodule sp., và Thalassia sp., đất canh tác nông nghiệp với lúa, khoai mỡ, các loại đậu, dừa, vƣờn cây ăn trái. Thảm thực vật này là môi trƣờng sống cho nhiều loài động vật [29], [40], [44], theo thống kê năm 1999 nhƣ sau:  Khu hệ động vật thủy sinh không xƣơng sống có trên 700 loài thuộc 44 họ, 19 bộ, 6 lớp, 5 ngành. Điển hình: Tôm sú (Penaeus monodon), Cua biển (Scylla serrata).  Khu hệ cá có trên 137 loài thuộc 39 họ, 13 bộ. Điển hình: cá Dứa (Pangasius polyurandon), cá Thòi lòi (Periophthalmus schosseri).  Khu hệ động vật có xƣơng sống trên cạn có 9 loài lƣỡng thê, 31 loài bò sát, 4 loài hữu nhũ. Trong đó có 11 loài bò sát có tên trong sách đỏ Việt Nam nhƣ: Tắc kè 8 (Gekko gekko), Kỳ đà nƣớc (Varanus salvator), trăn Đất (Python molurus), trăn Gấm (Python reticulatus), rắn Cạp nong (Bungarus fasciatus), rắn Hổ mang (Naja naja), rắn Hổ chúa (Ophiophagus hannah), Vích (Chelonia mydas), cá Sấu hoa cà (Crocodylus porosus).  Khu hệ chim có khoảng 130 loài thuộc 47 họ, 17 bộ. Trong đó có 51 loài chim nƣớc và 79 loài không phải chim nƣớc sống trong nhiều sinh cảnh khác nhau. Điển hình nhƣ: Cò lạo Ấn Độ (Mycteria leucocephala), Choắt lớn mỏ vàng (Tringa stagnatilis). Ngày 21 / 01 / 2000, khu rừng ngập mặn Cần Giờ đã đƣợc MAB / UNESCO công nhận là khu dự trữ sinh quyển đầu tiên của Việt Nam nằm trong mạng lƣới 459 khu dự trữ sinh quyển thuộc 97 quốc gia trên thế giới tính đến 10 / 2004, đồng thời cũng là khu rừng trồng đầu tiên của thế giới đƣợc công nhận là khu dự trữ sinh quyển. [49], [52] 2.1.3. Thực trạng của rừng ngập mặn Cần Giờ hiện nay Sau 29 năm tái tạo (1978 - 2007) và 7 năm là khu dự trữ sinh quyển (2000 - 2007), chất lƣợng rừng tại rừng ngập mặn Cần Giờ đã có chiều hƣớng giảm. Sâu bệnh phát triển mạnh. Đặc biệt khi mật độ cây quá dày, tán cây bao kín nhƣ hiện nay thì sự tấn công của sâu bệnh sẽ càng thuận lợi hơn. Sâu ăn lá, nấm trắng, sâu đục thân làm cho cây sinh trƣởng chậm và chết hàng loạt. Hiện ở rừng Cần Giờ, cây khỏe và cây bệnh đang sống chen nhau [50]. Ngoài ra, do bịt kín bờ đê, không cho nƣớc ra vào tự nhiên nhƣ trƣớc nên gây ra hiện tƣợng cả khu vực nƣớc bị tù đọng, sẫm màu, rễ cây ngày càng phát triển nên sự lắng tụ càng nhiều làm cho vùng đất gò cao hơn. Bên cạnh đó, việc xây dựng tuyến đƣờng xuyên Bắc – Nam rộng lớn nhƣ hiện nay đã phân rừng thành 2 khu rõ rệt tạo sự cách ly địa lý, nên hệ sinh thái cũng có sự khác biệt. Một số loài động vật (chuột, ếch, nhái) cũng hạn chế qua lại. Tuyến đƣờng này không những làm ô nhiễm không khí, mà còn ngăn cản dòng chảy ở một số nơi, làm hạn chế nƣớc triều ngập vào rừng hoặc gây tình trạng ứ nƣớc, làm cây chết, chủ yếu là đƣớc. Rừng ngập mặn Cần Giờ không chỉ là rừng phòng hộ mà còn là khu dự trữ sinh quyển, khu 9 bảo tồn thiên nhiên. Cho nên nhất thiết phải có chủ trƣơng về quản lý và những tác động lâm sinh, cũng nhƣ cơ chế chính sách phù hợp cho khu rừng này. [39] 2.2. Cây Đƣng (Rhizophora mucronata Lamk.) 2.2.1. Phân loại [35], [46], [47] Tên La tinh: Rhizophora mucronata. Ngành: Thực vật có hoa. Ngành phụ: Thực vật hạt kín. Lớp: Hai lá mầm. Lớp phụ: Có nhiều cánh tràng. Bộ: Sim Myrtales. Nhóm: Cây ngập mặn. Họ: Đƣớc Rhizophoraceae. Chi: Rhizophora. Loài: mucronata Lamk. Tên thông dụng tại một số quốc gia Đông Nam Á [47] Brunei: Lengayong. Campuchia: Doeum prasak. Indonesia: Bakau bakau hitam. Malaysia: Bakau jangkar. Mianma: Pyoo. Philipine: Bakßuan. Singapore: Belukap. Thái Lan: Phangka. Việt Nam: Đƣng, Đâng, Đƣớc xanh. 10 2.2.2. Hình thái học Cây gỗ cao khoảng 20 m, đƣờng kính 60 – 70 cm. Vỏ có màu xám đen hay đỏ sẫm, có đƣờng nứt ngang đều đặn. Hệ rễ rất phát triển, gốc có nhiều rễ chống hình nơm, và rễ nổi. Trên rễ có nhiều lỗ bì. Rễ dài khoảng 3 m, đƣờng kính rễ dao động từ 2,5 – 8,0 cm. Mạng lƣới rễ đan vào nhau chằng chịt nhƣ những tấm đăng khổng lồ giữ phù sa. [31], [34], [46], [47] Lá đơn, mọc đối, dài 6 – 16 cm, rộng 3 – 8 cm, dày, cứng, dai. Lá màu xanh đậm bóng có hình trái xoan hay thuôn nhọn giáo. Gân giữa lớn, màu lục, gân bên không rõ. Cuống lá thô, hơi dẹt, màu lục. Lá kèm hình tam giác thƣờng rụng sớm. Hình 2.2 Các thành phần trong cấu tạo hình thái cây Đƣng. [18], [37], [28] (A) lá, (B) hoa, (C) trái, (D) hệ thống rễ. Đài hoa không rụng cho đến khi thành trái [12]. Có 4 đài hoa, nhiều lá đài, lá đài hình ovan, nhọn, có nhiều thịt, dày, màu xanh lá, không có lông tơ. Đài hoa dài khoảng 1,2 cm, rộng khoảng 0,7 cm, chiều dài các đài hoa bằng nhau. Cánh hoa màu trắng, có 4 cánh hoặc nhiều hơn, nhọn, cánh hoa đều, mọc thẳng, không theo quy luật, có lông tơ, mép nguyên hơi cong, dày, đầy thịt. Các cánh hoa mọc so le với đài hoa. Mặt lƣng cánh hoa có lông thƣa, uốn cong vào ôm lấy nhị. Nhị 8 chiếc, chỉ nhị ngắn, bao phấn 3 khía, bầu trung hoặc bầu dƣới hình nón 2 ô, mỗi ô 2 B B C C A A D 11 noãn, vòi chẻ đôi [12]. Hoa có cuống dài khoảng 0,5 cm, dẹt, màu xanh lá, không có lông tơ. Trái non hình trứng phía dƣới phình rộng, màu lục hoặc màu xám, có đài rủ xuống. Trụ mầm dài 35 – 70 cm, phía dƣới hơi phình to, một hạt. Trái Đƣng nảy mầm ngay trên cây mẹ, trái chín rơi xuống, trụ mầm cấm vào trong bùn nhƣ một cái cọc, tránh cho cây con khỏi bị nƣớc biển cuốn trôi, cây con tự cấm rễ xuống bùn để tiếp tục phát triển. [2], [12] 2.2.3. Phân bố Đƣng đƣợc tìm thấy ở nhiều nơi, dọc bờ biển Ấn Độ Dƣơng, Tây Thái Bình Dƣơng nhƣ Ấn Độ, Campuchia, Trung Quốc (đảo Hải Nam, Đài Loan), Malaysia, Indonesia, Philipin, Nhật Bản, Madagascar, Ustralia, Melanesia. Ở Kenya (Đông Phi), Đƣng là loài cây đặc trƣng cho Rhizophoraceae. [2], [47] Ở Việt Nam Đƣng đƣợc trồng trên các bãi bồi ven biển, chịu ảnh hƣởng thƣờng xuyên của thủy triều giàu mùn hay trên các bãi đang ổn định ở vùng ngập mặn ven biển. Cây trƣởng thành nhanh, tái sinh hạt tốt, ra hoa vào khoảng tháng 5 – 6, tạo trái vào tháng 10 – 11. 2.2.4. Giá trị kinh tế Gỗ Đƣng màu đỏ vàng sẫm, nặng, rắn nên đƣợc sử dụng trong xây dựng, làm đồ nội thất, làm củi rất tốt, than đốt tỏa nhiệt lƣợng cao [26], [32]. Vỏ cây giàu tannin, đƣợc dùng trong công nghiệp thuộc da, nhuộm lƣới đánh cá [46]. Bột vỏ cây Đƣng còn đƣợc dùng làm thuốc trị bệnh thiếu máu, bệnh đái tháo đƣờng, bệnh viêm họng, bệnh xuất huyết, chứng huyết niệu, urê máu, lá cây còn đƣợc dùng làm thuốc cao đắp rất tốt [33]. Ngoài ra, Đƣng còn giữ chức năng điều hòa khí hậu, chắn gió, chống xói lở đất ven sông, ven biển, mở rộng diện tích bãi bồi ra biển, giảm bớt sự xáo trộn đất đai và ô nhiễm nguồn nƣớc ven biển, nuôi dƣỡng và cung cấp thức ăn cho các loài động vật hoang dã và hải sản có giá trị cao [43]. Trong quá trình phân giải lƣợng protein trong lớp thảm mục nhờ quá trình hoạt động của vi sinh vật, quần thể Đƣng đã giúp tạo ra nhiều mùn bã hữu cơ là nền tảng của chuỗi thức ăn đặc trƣng của vùng ven biển cửa 12 Hình 2.3 Cấu trúc mạch đôi xoắn kép của phân tử Deoxyribonucleic acid.[25] sông. Những thảm mục giàu dinh dƣỡng này là thức ăn quan trọng của ấu trùng, nhiều loài tôm, cá và các loài động vật khác có giá trị kinh tế cao. [40], [41], [42] 2.3. DNA (Deoxyribonucleic acid) Tế bào là đơn vị của sự sống, đƣợc phân ra làm 2 loại: tế bào tiền nhân (Prokaryote) và tế bào nhân thật (Eukaryote). Bộ máy di truyền của 2 loại tế bào trên đƣợc hình thành từ 2 loại nucleic acid: DNA (Deoxyribonucleic acid) và RNA (Ribonucleic acid). Ở sinh vật có tế bào nhân thật (Eukaryote), thông tin di truyền là phân tử DNA – là chuỗi xoắn kép mạch đôi gồm 2 chuỗi polynucleotide song song, có trình tự các nucleotide bắt cặp bổ sung với nhau. Các nucleotide trong cùng một mạch đơn đƣợc nối với nhau bằng liên kết phosphodieste và 2 mạch đơn sắp xếp đối song với nhau theo nguyên tắc bổ sung A liên kết với T bằng 2 liên kết hydro, G liên kết với C bằng 3 liên kết hydro. [4], [6] 13 2.3.1. Quy trình ly trích DNA thực vật Gồm ba bƣớc [5]  Bƣớc 1: Phá màng tế bào và màng nhân giải phóng DNA ra môi trƣờng bằng phƣơng pháp cơ học (nghiền), đồng thời phân hủy các protein liên kết với DNA. Thông thƣờng ngƣời ta nghiền tế bào trong một hỗn hợp chất tẩy (nhƣ SDS, Sarcosyl, CTAB) và proteinase (Proteinase K). Để đảm bảo sự toàn vẹn cấu trúc của các bào quan, hạn chế sự hoạt động của các enzyme thủy phân nội bào, ngƣời ta có thể phá vỡ cơ học mô và tế bào bằng cách nghiền mịn trong điều kiện lạnh sâu của Nitơ lỏng (- 196 0C). Sau đó sử dụng chất tẩy mạnh để phá màng tế bào và màng nhân (phá vỡ hóa học).  Bƣớc 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu, chủ yếu là các protein theo nguyên tắc các loại phân tử khác nhau (nucleic acid / protein) sẽ tạo thành các pha không hòa tan (phenol, chloroform / nƣớc) riêng biệt. Mẫu đƣợc lắc nhẹ trong dung dịch phenol / chloroform / iso amylalcohol (tỷ lệ 25 / 24 / 1). Dung dịch này có tác dụng làm biến tính protein đồng thời không hòa tan nucleic acid. Protein đã bị biến tính sẽ không còn hòa tan trong pha nƣớc có chứa nucleic acid nhờ vậy mà khi ly tâm sẽ tạo đƣợc một lớp tủa nằm giữa pha nƣớc và pha phenol chloroform. Pha nƣớc có chứa nucleic acid đƣợc thu nhận lại.  Bƣớc 3: Tủa nucleic acid. Có thể tủa bằng ethanol hoặc isopropanol, nhƣng thông thƣờng ngƣời ta dùng isopropanol. Nucleic acid sẽ đƣợc thu nhận lại bằng ly tâm. Sau đó, cặn tủa đƣợc rửa trong ethanol 70 % để loại bỏ các muối hoặc các dấu vết của isopropanol còn dính lại trên mẫu. Việc tủa giúp thu nhận nucleic acid dƣới dạng cô đặc, nhằm bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy của các enzyme, đồng thời có thể hòa tan chúng lại trong dung dịch theo nồng độ mong muốn. 14 2.3.2. Các phƣơng pháp định lƣợng, định tính DNA 2.3.2.1. Định lƣợng DNA bằng phƣơng pháp quang phổ Mỗi loại phân tử có một đỉnh hấp thụ ở một độ dài sóng nhất định tùy thuộc vào cấu trúc của chúng. Ví dụ đỉnh hấp thụ của các phân tử acid nucleotide là 260 nm. Sự hấp thụ này là do sự tƣơng tác giữa các photon với các electron của vòng purine và pyrimidine. Dựa vào sự hấp thụ này ngƣời ta có thể định lƣợng đƣợc hàm lƣợng DNA có trong mẫu ly trích. [11], [14] Sự hấp thụ ở đây đƣợc tính bằng đơn vị OD (Optical Density). Đối với DNA tinh khiết một đơn vị OD260nm tƣơng ứng với:  50 g / ml DNA sợi đôi.  40 g / ml DNA sợi đơn hay RNA.  20 g / ml oligonucleotide sợi đơn. Từ giá trị OD đo đƣợc, ngƣời ta có thể suy ra đƣợc nồng độ acid nucleotide trong mẫu ly trích. DNA (ng / l) = [(62,9 * OD260nm) – (36 * OD280nm)] * n Với  OD260nm: Giá trị mật độ quang của mẫu ở bƣớc sóng 260 nm.  OD280nm: Giá trị mật độ quang của mẫu ở bƣớc sóng 280 nm.  n: Độ pha loãng (thƣờng n = 100). Cách tính trên chỉ đúng với mẫu DNA tinh khiết. Nếu mẫu ly trích có lẫn tạp protein thì kết quả tính toán sẽ không chính xác. Ngoài đỉnh hấp thụ là 280 nm protein cũng hấp thụ ánh sáng ở bƣớc sóng 260 nm nhƣ các nucleoic acid và làm sai lệch giá trị thật của nồng độ nucleoic acid. Để ƣớc lƣợng độ tinh sạch của mẫu ly trích ngƣời ta tính tỷ lệ OD260nm / OD280nm.  Nếu tỷ lệ này nằm trong khoảng 1,7 - 2,2 thì mẫu ly trích đƣợc xem là sạch.  Nếu mẫu bị nhiễm protein thì tỷ lệ này sẽ thấp hơn nhiều. 15 Tuy nhiên, việc định lƣợng bằng phƣơng pháp hấp thu mật độ quang lại không cho biết chất lƣợng của DNA ly trích. Để biết chính xác chất lƣợng DNA ly trích, ngƣời ta sử dụng phƣơng pháp điện di trên gel. 2.3.2.2. Định tính DNA bằng phƣơng pháp điện di Trong một điện trƣờng, các phân tử sẽ di chuyển với vận tốc tùy thuộc vào điện tích và kích thƣớc của chúng. Nếu hai phân tử có cùng khối lƣợng thì phân tử nào có điện tích lớn hơn sẽ di chuyển về điện cực ngƣợc dấu nhanh hơn. [11], [14] Đối với phân tử DNA, việc điện di đƣợc thực hiện trên giá thể bán rắn là gel. Gel là môi trƣờng xốp với các lỗ nhỏ cho phép các phân tử acid nucleotide đi qua. Kích thƣớc phân tử càng lớn thì việc di chuyển qua gel càng chậm. Có hai loại gel đƣợc sử dụng tùy theo kích thƣớc và mức độ phân tách của phân tử acid nucleic: gel agarose và gel polyacrylamide.  Gel agrose: Lỗ có đƣờng kính trung bình cho phép phân tách các phân tử DNA sợi đôi, kích thƣớc 300 - 10000 bp. Các nồng độ agarose khác nhau cho phép tăng hiệu quả phân tách các nhóm phân tử có kích thƣớc khác nhau.  Gel polyacrylamide: Cho những lỗ nhỏ, thích hợp để phân tách những đoạn DNA có kích thƣớc dƣới 500 bp, hiệu quả phân tách có thể đạt 1 nucleotide. Sau khi phân tách bằng điện di, để phát hiện các phân tử DNA trên gel, ngƣời ta sử dụng một số phƣơng pháp phát hiện nhƣ sau:  Đối với gel agarose: Nhuộm bằng ethidium bromide. Chất này sẽ gắn xen vào giữa các base của phân tử DNA, phát huỳnh quang dƣới tia tử ngoại. Điều này cho phép phát hiện vị trí các đoạn DNA trên gel.  Đối với gel polyacrylamide: Các phân tử DNA thƣờng đƣợc đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ và vị trí của nó sẽ đƣợc phát hiện bằng kỹ thuật phóng xạ tự ghi. Ngoài ra, các phân tử DNA còn có thể đƣợc đánh dấu bằng các chất nhuộm chuyên biệt. Dựa vào kết quả điện di, chúng ta có thể biết đƣợc chất lƣợng của DNA ly trích nhƣ gãy, lẫn tạp, hay cho band sáng rõ. 16 2.4. Enzyme giới hạn (RE – restriction enzyme) 2.4.1. Các loại enzyme giới hạn Enzyme giới hạn là những endonuclease, có khả năng thủy giải DNA mạch đôi một cách lặp lại ở những vị trí xác định. Chính vì đặc tính đó mà chúng đƣợc chia làm 3 loại (type). [5]  Type I: khi một enzyme nhận biết đƣợc một trình tự, nó sẽ di chuyển trên phân tử DNA đến một vị trí cách đó khoảng 1000 – 5000 nucleotide và giải phóng độ vài chục nucleotide.  Type II: enzyme nhận biết trình tự và cắt ngay tại vị trí nhận biết đó.  Type III: enzyme nhận biết một trình tự và cắt DNA ở vị trí cách đó khoảng 20 nucleotide. Type I và Type III có vai trò rất hạn chế, tuy nhiên type II là những enzyme cắt có vai trò rất quan trọng trong kỹ thuật biến đổi di truyền. 2.4.2. Trình tự nhận biết của enzyme cắt giới hạn Mỗi RE nhận biết một trình tự nucleotide đặc trƣng, các trình tự này thƣờng bao gồm 4 – 8 nucleotide. Từ đó, DNA hệ gene sẽ đƣợc cắt ra thành những đoạn ngắn, hoặc dài có kích thƣớc khác nhau. Tuy nhiên đối với một số enzyme, trình tự nhận biết không có tính chuyên biệt tuyệt đối, một số nucleotide của trình tự có thể đƣợc thay thế bởi nucleotide khác. [5] Một đặc trƣng quan trọng của trình tự nhận biết là chúng có cấu trúc palindromic, có nghĩa là hai mạch của trình tự hoàn toàn giống nhau nếu chúng đƣợc đọc theo chiều 5’ – 3’. Nhƣ vậy vị trí cắt giống nhau trên 2 mạch DNA. 2.4.3. Sử dụng các enzyme cắt giới hạn trong phân tích DNA Việc sử dụng các enzyme cũng khá đơn giản, chỉ cần thêm một lƣợng enzyme thích hợp vào DNA mục tiêu trong dung dịch đệm thích hợp và sau đó để cho phản ứng xảy ra ở 37 C. Hoạt tính của các enzyme đƣợc biểu hiện bằng đơn vị (unit). Đó là lƣợng enzyme cần thiết để phân cắt 1 g DNA trong 1 giờ ở 37 C. Phần lớn các thí 17 nghiệm đòi hỏi phải phân cắt hoàn toàn DNA mục tiêu, tuy nhiên trong một số trƣờng hợp sử dụng kết hợp nhiều enzyme chỉ cần tính toán nồng độ và thời gian ủ để đạt đƣợc sự phân cắt không hoàn toàn. [5] Các kiểu đoạn DNA tạo thành do sự phân cắt của các enzyme phụ thuộc vào trình tự nhận biết và vị trí điểm cắt trong trình tự này. Chiều dài của đoạn DNA tùy thuộc vào tần số xuất hiện của trình tự nhận biết. Vị trí cắt của enzyme sẽ xác định kiểu đầu của đoạn DNA tạo thành (đầu bằng – blunt end hay đầu dính – sticky end). Nếu RE cắt hai mạch DNA tại cùng một điểm sẽ tạo thành các đoạn DNA có đầu bằng, sau khi cắt, hai đầu bằng không thể tự kết hợp trở lại, để nối chúng lại cần phải dùng enzyme T4 ligase. Nếu vị trí cắt của RE lệch nhau trên hai mạch thì sẽ tạo thành các đầu dính, các đầu dính bổ sung có thể bắt cặp trở lại. Việc tạo thành đầu bằng hay đầu dính có ý nghĩa rất quan trọng đối với những thao tác ở mức độ DNA, đặc tính đƣợc quan tâm nhất là khả năng cắt tạo đầu dính, đƣợc ứng dụng rất nhiều trong tái tổ hợp di truyền in vitro. Hai phân tử DNA có nguồn gốc khác nhau đƣợc cắt bởi cùng một RE sẽ có khả năng kết hợp thành một phân tử tái tổ hợp. Hình 2.4 Một số enzyme cắt giới hạn. [48] 18 2.5. PCR (Polymerase Chain Reaction) 2.5.1. Khái niệm Phƣơng pháp PCR đƣợc nhà khoa học Mỹ Karl Mullis và cộng sự phát minh vào năm 1985 (giải Nobel Hóa học năm 1993). Đây là phƣơng pháp nhằm khuếch đại một đoạn phân tử DNA nào đó một cách đặc hiệu in vitro nhờ sự xúc tác của enzyme Taq polymerase từ một lƣợng DNA mẫu rất nhỏ. PCR là một kỹ thuật trong sinh học phân tử để tạo dòng DNA rất đơn giản, hiệu quả, hàng triệu đoạn DNA đặc hiệu và đồng nhất sẽ đƣợc thu nhận. [5], [10] 2.5.2. Nguyên tắc của phản ứng PCR PCR là một phƣơng pháp tổng hợp DNA dựa trên mạch khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lƣợng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp enzyme đặc hiệu cho đoạn DNA này. Hiện nay, phƣơng pháp này đƣợc sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu, tạo ra các đột biến gene, chẩn đoán phát hiện bệnh trên ngƣời, động vật, thực vật và kiểm nghiệm thực phẩm. [5] Tất cả các DNA polymerase đều cần những primer chuyên biệt để tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn. Mạch khuôn thƣờng là một trình tự DNA của gene (gọi là trình tự DNA mục tiêu) đặc trƣng cho loài sinh vật mục tiêu hoặc là gene quy định việc tổng hợp một loại độc tố chuyên biệt của vi sinh vật. Primer là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một mạch của đoạn DNA khuôn và nhờ hoạt động của DNA polymerase đoạn primer này đƣợc kéo dài để hình thành mạch mới. Phƣơng pháp PCR đƣợc hình thành dựa trên đặc tính này của DNA polymerase, đoạn DNA nằm giữa hai primer sẽ đƣợc khuếch đại thành số lƣợng lớn bản sao đến mức có thể thấy đƣợc sau khi thực hiện điện di trên gel, nhuộm ethidium bromide và quan sát dƣới tia UV. Nhƣ vậy, để khuếch đại một trình tự DNA xác định, cần phải có những thông tin tối thiểu về trình tự của DNA, đặc biệt là trình tự base ở hai đầu đoạn DNA đủ để tạo các primer bổ sung chuyên biệt. 19 2.5.3. Quy trình phản ứng PCR Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại nối tiếp nhau [5]. Mỗi chu kỳ gồm 3 bƣớc  Bƣớc 1 (biến tính, denaturation): trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA đƣợc biến tính ở điều kiện nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy của phân tử, thƣờng là ở nhiệt độ 94 - 95 C phân tử DNA từ dạng sợi đôi sẽ tách thành dạng sợi đơn trong vòng 30 – 60 giây.  Bƣớc 2 (lai, annealation): trong bƣớc này ở nhiệt độ đƣợc hạ thấp hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của các primer, cho phép các primer bắt cặp với mạch khuôn. Trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động trong khoảng 40 - 70 C. Tùy thuộc vào Tm của các primer mà thời gian bắt cặp kéo dài từ 30 – 60 giây.  Bƣớc 3 (kéo dài, elongation - extension): dƣới tác động của DNA polymerase, các nucleotide lần lƣợt gắn vào primer theo nguyên tắc bổ sung với mạch khuôn. Mạch mới đƣợc tạo thành từ mạch đƣợc kéo dài. Nhiệt độ của phản ứng là 72 C và thƣờng kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại. Trong phản ứng PCR một chu kỳ gồm 3 bƣớc nhƣ trên đƣợc lặp đi lặp lại nhiều lần, làm số lƣợng DNA đƣợc gia tăng theo cấp số nhân. Theo tính toán, sau 30 – 40 chu kỳ, sự khuếch đại sẽ cho ra 106 bản sao. Sau phản ứng PCR, DNA sản phẩm đƣợc nhuộm bằng ethdium bromide sau khi thực hiện điện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamide và quan sát dƣới tia UV (bƣớc sóng 312 nm). 20 Andy Vierstraete, 1999. Hình 2.5 Phản ứng PCR. [20] 2.6. Khái niệm đa dạng sinh học (Biodiversity) và tầm quan trọng Định nghĩa do Quỹ bảo tồn thiên nhiên thế giới – World Wildlife Fund (WWF) (1989) đề xuất nhƣ sau: “Đa dạng sinh học là sự phồn thịnh của sự sống trên Trái đất, là hàng triệu loài thực vật, động vật và vi sinh vật, là những gene chứa đựng trong các loài và là những hệ sinh thái vô cùng phức tạp cùng tồn tại trong môi trƣờng”. Đa dạng sinh học đƣợc xem xét trên ba mức độ: đa dạng hệ sinh thái, đa dạng loài và đa dạng di truyền. [13] Tính đa dạng trong thiên nhiên là nguồn tài nguyên vô tận của nhân loại, là nguồn gốc của sự thịnh vƣợng, cung cấp cho chúng ta toàn bộ thức ăn, phần lớn các loại nguyên vật liệu, hàng hoá và dịch vụ, cung cấp nguyên liệu di truyền cần thiết cho 21 nông nghiệp, dƣợc học, công nghệ. Đa dạng sinh học giúp duy trì các dịch vụ sinh thái quan trọng, cung cấp cơ sở cho sức khoẻ con ngƣời, là nguồn tạo ra năng suất và tính bền vững trong nông nghiệp tạo cơ sở ổn định kinh tế và các hệ thống chính trị, xã hội đồng thời làm giàu chất lƣợng cuộc sống của chúng ta. Vì vậy, việc duy trì đƣợc tính đa dạng sinh học sẽ giúp loài ngƣời bảo vệ môi trƣờng sống, hạn chế đến mức thấp nhất những thiệt hại do thiên nhiên hay do con ngƣời gián tiếp tạo nên nhƣ hiệu ứng nhà kính, băng các vùng cực tan, môi trƣờng đất, môi trƣờng nƣớc bị nhiễm độc phóng xạ. Chính việc lạm dụng tài nguyên thiên nhiên trong quá trình công nghiệp hóa, đô thị hóa con ngƣời đã, đang và sẽ gây ra những tác động lớn đến môi trƣờng làm rối loạn các hệ sinh thái tự nhiên và suy giảm tính đa dạng về sự sống trên trái đất. Trƣớc thực tế nhƣ hiện nay, việc nghiên cứu và bảo tồn tính đa dạng sinh học là một vấn đề cấp bách nhằm bảo đảm cho sự phát triển bền vững. 2.7. Sự đa dạng di truyền (Genetic diversity) Trong một loài, các giống khác nhau có trình tự bộ gene khác nhau. Trình tự bộ gene của các cá thể trong một giống cũng có thể khác nhau, do sự xuất hiện của một loại đột biến nào đó. Đôi khi sự khác biệt này lại có ý nghĩa về mặt di truyền, do đột biến xuất hiện tại vị trí của một gene nào đó trong bộ gene của một cá thể, làm cho gene đó không biểu hiện hay biểu hiện khác đi thành một tính trạng khác với những cá thể khác cùng giống. Sự khác biệt về di truyền nhƣ vậy đƣợc gọi là sự đa dạng di truyền. 2.8. Ý nghĩa của việc nghiên cứu sự đa dạng di truyền Đa dạng sinh học rất cần thiết cho sự tồn tại của các loài, các quần xã tự nhiên đồng thời cũng quan trọng đối với con ngƣời. Sự đa dạng di truyền là cần thiết cho tất cả sinh vật để duy trì nòi giống, kháng với các loại dịch bệnh và thích nghi với những thay đổi của môi trƣờng. Sự đa dạng di truyền của cây trồng và vật nuôi có giá trị đặc biệt trong chọn tạo giống cây trồng, vật nuôi mới phục vụ lợi ích của con ngƣời. 22 2.9. Một số kỹ thuật đánh giá sự đa dạng di truyền và phát hiện chỉ thị phân tử Từ khi con ngƣời biết đến sự hiện diện của gene cùng với việc Watson và Crick phát minh ra cấu trúc chuỗi DNA năm 1953, các kỹ thuật sinh học phân tử đƣợc phát minh ngày càng nhiều và trở thành công cụ đắc lực cho công tác nghiên cứu khoa học với độ tin cậy cao hơn. Hiện nay, con ngƣời đã tìm ra đƣợc nhiều kỹ thuật đánh giá đa dạng di truyền và phát hiện chỉ thị phân tử khác nhau, có thể chia ra làm 2 nhóm sau [7]:  Dựa trên PCR: RAPD, STS, SSR, SSCP, AFLP,…  Dựa trên kỹ thuật lai DNA – DNA (Non PCR based): điển hình là RFLP. 2.9.1. Kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Lenghth Polymorphism) 2.9.1.1. Khái niệm Đây là kỹ thuật sinh học phân tử nhằm phát hiện sự khác nhau về di truyền giữa các cá thể, giữa các giống trong cùng một loài dựa vào sự khác nhau về số lƣợng và kích thƣớc của những đoạn DNA đƣợc tạo ra do sử dụng những enzyme cắt giới hạn (restriction enzymes) cắt toàn bộ bộ gene của những cá thể hay giống đƣợc nghiên cứu, sau đó những đoạn DNA đƣợc cắt ra này lai với những probe đánh dấu huỳnh quang đã biết, kết quả đƣợc quan sát qua màu huỳnh quang phát ra. Sử dụng đoạn probe chuyên biệt với loài hay giống cần nghiên cứu. Nguyên lý của kỹ thuật này dựa vào hiện tƣợng đột biến làm mất hay xuất hiện một vị trí cắt giới hạn, vì vậy kỹ thuật RFLP có thể phát hiện đột biến mặc dù mức độ tin cậy không cao. [7], [9] RFLP marker có khả năng sử dụng rất phong phú, nhƣng quy trình thực hiện phức tạp, nguy hiểm đến sức khỏe ngƣời thực hiện, đắt tiền, yêu cầu DNA có số lƣợng và chất lƣợng rất cao. Do đó, ngƣời ta có xu hƣớng áp dụng những marker đơn giản hơn, an toàn hơn, trên cơ sở phản ứng chuỗi polymerase. 23 Hình 2.6 RFLP trong trƣờng hợp có đột biến điểm. 2.9.1.2. Một số nghiên cứu, ứng dụng dựa trên kỹ thuật RFLP a. Nghiên cứu lập bản đồ gene Mc. Couch và ctv (1988) thiết lập bản đồ di truyền nhờ marker phân tử (RFLP) trên cây lúa gồm 135 loci [9], [10]. Bản đồ gồm 12 nhiễm sắc thể (NST) với tổng cộng 1.389 cM trên genome cây lúa từ cặp lai IR34583 (indica) và Bulu Dalam (Javanica). Ba năm sau, bản đồ thứ hai từ quần thể IRAT117 (Japonica) và Apura (indica) đƣợc công bố (Mc. Couch 1991, Tanksley và ctv 1991). Saito và ctv (1991) thiết lập một bản đồ khác dựa trên cặp lai Kasalath (indica) và Fl134 (Japonica) với 347 RFLP marker, phủ trên 12 NST với tổng cộng 1.836 cM với 347 loci. Để phân tích sự đa dạng di truyền của 112 giống lúa ở Châu Á, Takashige và cộng sự (1995) đã sử dụng 12 probe DNA để nghiên cứu và đã xác định đƣợc mối tƣơng quan di truyền giữa các giống lúa nói trên. Qifa Zhang và cộng sự (1992) đã xác định đƣợc sự đa dạng di truyền giữa các giống lúa indica (12 dòng) và Japonia (14 dòng) qua sử dụng 49 probe RFLP. Yu và cộng sự (1995) cho thấy một số marker hình thái (17 marker, thí dụ nhƣ vỏ trấu màu tím, lá không có lông, hạt gạo nâu, dạng cây lùn) có mối liên kết với marker RFLP. 24 b. Một số ứng dụng khác  Lập bản đồ gene cho bệnh đạo ôn và các gene kháng bệnh bạc lá, rầy nâu, sâu đục thân.  Marker phân tử trong di truyền và chọn giống.  Phân tích tƣơng quan di truyền giữa các cá thể.  Đánh giá sự đa dạng di truyền của quần thể. 2.9.2. Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Lenghth Polymorphism) 2.9.2.1. Khái niệm Kỹ thuật AFLP là kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại do Zebeau và Vos (1993) phát minh ra. Sau đó đƣợc Vos và cộng sự (1995), Vos và Kuiper (1997) tiếp tục phát triển. Kỹ thuật này dựa trên nền tảng kỹ thuật PCR bằng cách sử dụng những cặp primer đặc biệt đƣợc thiết kế sẵn, điều kiện phản ứng PCR đƣợc thiết lập nghiêm ngặt giúp nhân bản một cách có chọn lọc những đoạn DNA đƣợc cắt bằng RE từ bộ gene của đối tƣợng nghiên cứu. Những đoạn DNA đƣợc nhân bản có độ dài khoảng từ 60 – 500 bp. Kỹ thuật AFLP giúp đánh giá mức độ đa dạng di truyền của quần thể và phát hiện chỉ thị phân tử với độ tin cậy cao. [1], [3], [15], [16] Kỹ thuật AFLP bao gồm 5 bƣớc cơ bản [24]  Bƣớc 1: Tách chiết DNA. AFLP đòi hỏi DNA phải có độ tinh sạch cao.  Bƣớc 2: Cắt giới hạn và gắn adapter. Bƣớc này gồm có hai giai đoạn: Giai đoạn cắt toàn bộ bộ gene tạo những đoạn DNA ngắn nhờ 2 enzyme cắt. Giai đoạn gắn những adapter: Adapter là một chuỗi sợi đôi DNA đầu dính gồm một trình tự khoảng 20 nucleotide đã biết có khả năng bắt cặp bổ sung với những đoạn DNA vừa đƣợc cắt, để trong 2 phản ứng PCR sau ngƣời ta sử dụng những primer có trình tự bổ sung với trình tự của các adapter đã gắn. Để các đoạn DNA vừa cắt không bắt cặp với nhau, giai đoạn cắt giới hạn và gắn adapter đƣợc xem nhƣ một. 25 Hình 2.7 Nguyên lý kỹ thuật AFLP. [36]  Bƣớc 3: Nhân bản tiền chọn lọc (Pre – selective amplification). Thực hiện phản ứng PCR thứ nhất, sử dụng những sản phẩm đã gắn adapter từ bƣớc 2 làm khuôn DNA, primer nhân bản tiền chọn lọc là những chuỗi DNA mạch đơn có trình tự bổ sung với các adapter đã sử dụng ở bƣớc 2 và cộng thêm 1 nucleotide ở đầu 3’. Primer nhân bản tiền chọn lọc MseІ = trình tự bổ sung với trình tự của adapter MseI + 1 nucleotide (thƣờng là C). Primer nhân bản tiền chọn lọc EcoRІ = trình tự bổ sung với trình tự của adapter EcoRI + 1 nucleotide (thƣờng là A). 26 Mục đích để tạo ra sự chọn lọc đầu tiên – tiền chọn lọc ở mức độ thấp những đoạn DNA đƣợc cắt và gắn adapter, đồng thời tăng số lƣợng của những đoạn có thể nhân bản (là những đoạn có khả năng bắt cặp với các primer nhân bản tiền chọn lọc). Việc thêm 1 nucleotide sẽ giảm bớt đƣợc nhiều đoạn bổ sung với adapter. Bƣớc này có thể kiểm tra kết quả bằng cách điện di trên gel agarose 1,5 %.  Bƣớc 4: Nhân bản chọn lọc (Selective amplification). Thực hiện phản ứng PCR thứ hai sử dụng các primer nhân bản chọn lọc có trình tự tƣơng tự nhƣ primer nhân bản tiền chọn lọc, cộng thêm 2 hay 3 nucleotide ở đầu 3’. Mục đích chính của bƣớc này nhằm chọn lọc tối đa các đoạn DNA đã đƣợc cắt giới hạn và gắn adapter đã đƣợc nhân bản ở bƣớc 3, chỉ nhân bản những đoạn DNA có trình tự 2 đầu hoàn toàn bổ sung với trình tự của các primer nhân bản chọn lọc, qua đó làm giảm nhiều độ phức tạp của kết quả. Primer nhân bản chọn lọc MseІ = trình tự bổ sung với trình tự của adapter MseI + 2 hay 3 nucleotide. Primer nhân bản tiền chọn lọc EcoRІ = trình tự bổ sung với trình tự của adapter EcoRI + 3 nucleotide + chất phát màu huỳnh quang (giúp phát hiện sản phẩm khi điện di).  Bƣớc 5: Điện di và phân tích kết quả. Kết quả AFLP có thể đƣợc điện di trên máy giải trình tự gene hay điện di trên gel polyacrylamide. 2.9.2.2. Một số nghiên cứu, ứng dụng dựa trên kỹ thuật AFLP a. Nghiên cứu đa dạng di truyền Sử dụng AFLP để nghiên cứu tính đa dạng di truyền của các giống điều (Anacardium occidentale L.) đang đƣợc trồng ở Đông Nam Bộ (Hồ Bích Liên và ctv., 2006) đã thu đƣợc một số kết quả [7]: Xác định đƣợc 7 / 64 tổ hợp mồi cho sản phẩm khuếch đại có mức đa hình cao. Tổ hợp primer AM – CTG / E – AGC cho tính đa hình cao nhất (139 / 141 sản phẩm 27 khuếch đại đa hình) trong tổng số 7 tổ hợp primer đƣợc chọn. Qua phân tích thấy rằng quần thể điều ở 3 tỉnh Bình Dƣơng, Bình Phƣớc, Đồng Nai có hệ số đồng dạng cao. Phát hiện đƣợc 17 chỉ thị phân tử có thể cho phép nhận dạng đối với 17 mẫu điều trong số 26 mẫu phân tích và có 21 chỉ thị có liên quan chặt với 10 tính trạng. Đặc biệt, có 4 chỉ thị (kích thƣớc 310 bp, 265 bp, 222 bp,111 bp) liên quan đến màu sắc của hoa và lá. b. Một số ứng dụng khác  Phân nhóm di truyền: phân nhóm di truyền gene khoai lang (Liu, 1999).  Bản đồ gene cloning.  Kỹ thuật “finger printing”. [7], [10] 2.9.3. Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) 2.9.3.1. Khái niệm Kỹ thuật RAPD dựa trên kỹ thuật PCR, bằng cách sử dụng những primer ngắn (khoảng 10 nucleotide) có trình tự biết trƣớc, bắt cặp và nhân bản ngẫu nhiên những đoạn DNA có trình tự bổ sung với trình tự của các primer. Theo nguyên tắc, khi 2 cá thể hoàn toàn giống nhau, sau khi thực hiện phản ứng PCR – RAPD ở điều kiện nhƣ nhau sẽ tạo ra số lƣợng các đoạn bằng nhau và chiều dài các đoạn tƣơng ứng bằng nhau. Khi có đột biến làm xuất hiện hay mất đi một vị trí bắt cặp ngẫu nhiên sẽ tạo ra số lƣợng và chiều dài các đoạn DNA khác nhau giữa các cá thể, vì vậy kỹ thuật RAPD có thể phát hiện đột biến. [1], [3], [7], [15] Các bƣớc tiến hành kỹ thuật RAPD  Bƣớc 1: Tách chiết DNA. DNA đƣợc tách chiết có chất lƣợng tốt, tƣơng đối sạch và không bị gãy (smear) nhiều. Một số vấn đề có thể gặp phải khi tách chiết DNA: DNA bị phân hủy hoặc bị gãy. Có RNA trong mẫu DNA. Có polysaccharide trong mẫu DNA. 28 WSSP/StudentScholars/project/archives/onions/rapd1.gif Hình 2.8 Nguyên lý kỹ thuật RAPD. [78] 1, 2, 3, 4, 5, 6: mồi. (A) sản phẩm khuếch đại đoạn DNA được giới hạn giữa 2 mồi 2 và 5. (B) sản phẩm khuếch đại đoạn DNA được giới hạn giữa 2 mồi 3 và 6. Có polyphenol trong mẫu DNA. Thực hiện phản ứng PCR: Phản ứng PCR đƣợc thực hiện với các primer ngắn, thiết lập điều kiện phản ứng nghiêm ngặt để hạn chế tạo ra những sản phẩm không chính xác.  Bƣớc 2: Điện di phát hiện. Kết quả PCR – RAPD đƣợc điện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamid.  Bƣớc 3: Xác định tính đa dạng di truyền bằng các phần mềm thông dụng (NTSYSpc, UPGMA cluster, Gelcompar, lập dendrogram), các số liệu thu đƣợc cho thấy sự gần gũi hoặc cách biệt di truyền của các mẫu nghiên cứu. Đoạn DNA đƣợc khuếch đại thƣờng có kích thƣớc dƣới 1.000 bp. Đó là lý do đoạn DNA đƣợc giới hạn giữa 2 mồi 1 và 4 không đƣợc khuếch đại. Một số vấn đề thƣờng gặp khi thực hiện phản ứng RAPD – PCR:  Nồng độ DNA mẫu khác nhau có thể làm thay đổi số band trên bảng gel điện di. Nồng độ DNA mẫu thích hợp cho mỗi phản ứng là 20 – 50 ng.  Nồng độ Mg++: nếu nồng độ Mg++ khác nhau thì sản phẩm RAPD sẽ khác nhau. 29  Taq - polymerase đƣợc cung cấp từ các nhà sản xuất khác nhau cho kết quả sản phẩm khác nhau. Vì vậy, nồng độ và thời gian sử dụng tối ƣu của mỗi loại Taq đòi hỏi phải chính xác và đƣợc xác định qua thực nghiệm.  Kết quả không ổn định: cùng 1 mẫu DNA, cùng 1 thành phần hóa chất nhƣng mỗi lần thực hiện khác nhau có thể cho kết quả khác nhau. 2.9.3.2. Những ƣu điểm của kỹ thuật RAPD  Về mặt kỹ thuật: RAPD dễ thực hiện và dễ thành công do không cần biết trƣớc trình tự bộ gene của đối tƣợng nghiên cứu, thao tác đơn giản, chất lƣợng DNA mẫu không cần độ tinh sạch cao, lƣợng DNA cần ít, thời gian thực hiện nhanh, khả năng nhân bản cao. [9]  Về mặt kinh tế: chi phí thực hiện thấp, kỹ thuật RAPD thƣờng đƣợc sử dụng kết hợp với những kỹ thuật cao cấp khác để đánh giá đa dạng di truyền và nhận diện chỉ thị phân tử có độ tin cậy cao, tạo sự đa hình nhanh. [9] 2.9.3.3. Những hạn chế của kỹ thuật RAPD Kỹ thuật RAPD cho kết quả không ổn định, mức độ giống nhau giữa các lần lặp lại thấp. [4], [9] 2.9.3.4. Một số nghiên cứu, ứng dụng dựa trên kỹ thuật RAPD Do tính hiệu quả nên RAPD nhanh chóng có vị trí xứng đáng trong nghiên cứu về sự đa dạng di truyền ở một số giống cây trồng một và hai lá mầm nhƣ lúa, chuối, khoai tây, bắp, dứa, bông cải, đậu nành, cà chua, dâu tây, cacao, cúc lai, cà phê. RAPD đƣợc xem là một phƣơng pháp tạo sự đa hình DNA nhanh. [4], [9]  Thái Kỳ Tài và cộng sự (2004) đã phân tích đƣợc tính đa hình 8 giống cà chua (KBT4, giống số 12, SG2.1, SG2.2, F21, F4, M21, M4), đồng thời cũng phân tích sự đa dạng di truyền các locus, sự tƣơng đồng gene và khoảng cách gene.  Hoàng Thị Bích Thủy và cộng sự (2004) đã khảo sát tối ƣu phản ứng RAPD và nghiên cứu tính đa hình DNA thông qua việc sử dụng 9 loại mồi (N1 – N6, P5 – P7) 30 trên 7 giống (dòng) dứa (Thái Lan có gai, Thái Lan, Lâm Đồng, Trung Quốc 220, Trung Quốc 250, Bình Phƣớc, Đắc Lắc).  Xu L.X và cộng sự (1994) ghi nhận sự đa dạng di truyền của 13 giống lúa nƣớc và lúa cạn qua sử dụng 42 cặp mồi ngẫu nhiên giàu G và C. 2.9.4. So sánh một số kỹ thuật đánh giá đa dạng di truyền và phát hiện chỉ thị phân tử Việc chọn lựa một kỹ thuật sinh học phân tử để sử dụng phải căn cứ vào nhiều yếu tố, cụ thể nhƣ những ƣu và khuyết điểm của kỹ thuật đó hay tùy thuộc vào tình hình nghiên cứu thực tế, tuy nhiên các kỹ thuật đánh giá đa dạng di truyền và phát hiện chỉ thị phân tử có thể đƣợc so sánh một cách tƣơng đối [16] theo những tiêu chí sau: Bảng 2.1: So sánh một số kỹ thuật đánh giá đa dạng di truyền và phát hiện chỉ thị phân tử Các yếu tố chính RFLP AFLP RAPD SSR Allozyme Số lƣợng thông tin Khả năng đáng tin cậy Độ phân giải Cách tiến hành Thời gian tiến hành Thấp Cao Cao Khó Dài Cao Cao Cao Vừa phải Ngắn Cao Biến đổi Vừa phải Dễ Ngắn Cao Cao Cao Khó Dài Thấp Cao Vừa phải Dễ Ngắn 31 Chƣơng 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện 3.1.1. Thời gian thực hiện Đề tài đƣợc thực hiện từ 7 tháng 5 năm 2007 đến 31 tháng 8 năm 2007. 3.1.2. Địa điểm thực hiện Thu thập mẫu tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ, TP. Hồ Chí Minh. Phân tích di truyền tại trung tâm Phân tích và Thí nghiệm Hóa Sinh trƣờng Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. 3.2. Vật liệu thí nghiệm 36 mẫu lá Đƣng đƣợc thu thập tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ. 3.2.1. Nguyên tắc thu thập mẫu  Xác định đƣợc vị trí cụ thể của cây lấy mẫu trên bản đồ thông qua hệ thống định vị toàn cầu GPS (Global Position System).  Thu thập lá của cây Đƣng (lá già, lá non, lá trƣởng thành).  Chọn mẫu lá từ những cây có đặc điểm khác nhau nhƣ: thân cây to, cây mọc tốt, cây mọc yếu ớt, cây bị bệnh. 3.2.2. Cách ký hiệu mẫu Mẫu đƣợc đặt tên xx.yy với xx là tiểu khu, yy là thứ tự của mẫu. Ví dụ: 7.12 là mẫu thứ 12 thu thập ở tiểu khu 7, 2B.14 là mẫu thứ 14 thu thập ở tiểu khu 2B, hay 27 là mẫu thứ 27 thu thập đƣợc ở tiểu khu 10. 32 3.2.3. Cách lấy mẫu Chọn những lá tƣơi tốt, thu thập lá non, lá trƣởng thành và lá già. Mỗi mẫu lấy khoảng 2 - 3 lá, cho vào bịch nylon và để vào thùng lạnh để bảo quản độ tƣơi của lá. Đồng thời ghi những thông tin về cây: tọa độ, chiều cao thân cây, đƣờng kính thân, cây có nhiều sâu hay xanh tốt, cây mọc tự nhiên hay trồng. Mẫu đƣợc thu thập trên đƣờng thủy (26 mẫu: từ mẫu thứ 1 đến 26 thuộc các tiểu khu 1, 2, 7, 11, 12) và đƣờng bộ (10 mẫu: từ mẫu thứ 27 đến 36, thuộc tiểu khu 10). Khoảng cách trung bình giữa 2 mẫu thu thập là 500 m. 3.2.4. Cách bảo quản mẫu Mẫu lá tƣơi sau khi thu thập sẽ đƣợc đem về phòng thí nghiệm và bảo quản ở 40C. 3.3. Phƣơng pháp thí nghiệm 3.3.1. Quy trình ly trích DNA 3.3.1.1. Vật liệu dùng trong ly trích DNA a. Thiết bị và dụng cụ Chày và cối (Đức). Pippet các loại (Nichiry - Nhật Bản). Lò Viba (Electrolux). Eppendorf 1,5 ml (Pháp). Đầu típ các loại (Đức). Tủ lạnh 4oC và -20oC (Sanyo - Nhật Bản). Cân điện tử (Ohaus - Mỹ). Máy vi ly tâm lạnh (Hettich - Đức). Máy Vortex (IKA – Thụy Điển). Máy điện di (Biorad - Thụy Điển). Tủ hút (Việt Nam). Máy đo hấp thu quang phổ (HP - Mỹ). Tủ cấy vô trùng (Anh). Tủ sấy (Jencons - Anh). Bồn ủ nhiệt (Memmert - Anh). Nồi hấp Autoclave (ToMy - Nhật Bản). Máy chụp hình DNA Geldoc (Biorad - Thụy Điển). b. Hóa chất ly trích EB. Sodium acetate. Chloroform : Isoamylalcohol. Ethanol 70 %, 100 %. Isopropanol TE 1X. 33 3.3.1.2. Quy trình ly trích DNA a. Quy trình 1: Quy trình ly trích mẫu tƣơi (Doyle và Doyle (1988)) gồm 11 bƣớc (đã bỏ qua bƣớc thêm RNase)  Bƣớc 1: Cân 0,15 g lá đã rửa sạch. Cho 1,2 ml dịch trích EB vào eppendorf, nghiền lá với dung dịch này. Vortex thật kỹ (14.000 vòng / phút). Ủ ở 650 C trong 45 phút.  Bƣớc 2: Thêm 500 l Chloroform: isoamyl alcohol (24: 1), khuấy bằng vortex 10 phút, ly tâm 5 phút 14.000 vòng ở 10 0C. Thu 350 l dịch nổi.  Bƣớc 3: Lặp lại bƣớc 2. Thu 250 l dịch nổi.  Bƣớc 4: Thêm vào 250 l dung dịch isopropanol lạnh. Để tủa ở – 200 C khoảng 30 phút (nên để qua đêm).  Bƣớc 5: Ly tâm 5 phút 14.000 vòng ở 100 C. Đổ bỏ dịch trong.  Bƣớc 6: Cho vào 300 l TE 1X, ủ ở 370 C trong 1h.  Bƣớc 7: Thêm 20 l muối Sodium acetate 3 M, và 640 l Ethanol 100 %, trộn đều và để – 20 0C trong 30 phút.  Bƣớc 8: Ly tâm 10 phút 14.000 vòng ở 10 0C. Đổ bỏ dịch trong.  Bƣớc 9: Rửa cặn với 400 l Ethanol 70 % bằng cách ly tâm 2 phút 14.000 vòng ở 10 0C, đổ bỏ dịch trong.  Bƣớc 10: Lặp lại bƣớc 9. Để khô cặn, hòa tan cặn trong 100 l TE 1X, ủ ở 370 C trong 30 phút.  Bƣớc 11: Bảo quản mẫu ở - 20 0C. b. Quy trình 2: Quy trình ly trích cải tiến thứ nhất gồm 12 bƣớc  Bƣớc 1: Lấy 0,2 g lá non rửa sạch và lau khô. Thêm 1,8 ml dịch trích EB, vortex kỹ ở tốc độ thấp (800 vòng / phút). Ủ ở 65oC trong 1h.  Bƣớc 2: Ly tâm 10.000 vòng trong 30 phút ở 4 0C. Thu 700 l dịch nổi.  Bƣớc 3: Thêm 500 l Chloroform: Isoamyl alcohol (24:1), đảo nhẹ. Ly tâm 9.800 vòng trong 10 phút ở 4 0C. Thu 500 l dịch nổi. 34  Bƣớc 4: Lặp lại bƣớc 3. Thu 300 l dịch nổi.  Bƣớc 5: Thêm 250 l dung dịch isopropanol lạnh. Để tủa ở - 20 0C qua đêm.  Bƣớc 6: Ly tâm 9.800 vòng trong 10 phút ở 4 0C. Đổ bỏ dịch trong, thu kết tủa trắng.  Bƣớc 7: Cho vào 300 l TE 1X, ủ ở 37 0C trong 1h.  Bƣớc 8: Thêm 20 l muối Sodium acetate 3 M, và 640 l Ethanol 100 %, trộn đều. Ủ – 20 0C trong 1 h.  Bƣớc 9: Ly tâm 5.000 vòng trong 20 phút ở 4 0C. Đổ bỏ dịch trong.  Bƣớc 10: Rửa cặn với 400 l Ethanol 70 % bằng cách ly tâm 5.000 vòng trong 15 phút ở 4 0C. Đổ bỏ dịch trong.  Bƣớc 11: Lặp lại bƣớc 10. Để khô cặn ở 37 0C, hòa tan cặn trong 50 l TE 1X, ủ ở 37 0C trong 1 h.  Bƣớc 12 : Bảo quản mẫu ở - 20 0C. c. Quy trình 3: Quy trình ly trích cải tiến thứ 2 gồm 12 bƣớc  Bƣớc 1: Lấy 0,2 g lá non rửa sạch và lau khô. Nghiền trong nitơ lỏng. Thêm 1,2 ml dịch trích EB (có thêm PVP – Polyvinyl pyrrolidone, trong 100 ml EB sử dụng 2 g PVP), vortex kỹ ở tốc độ thấp (800 vòng / phút) đến khi hỗn hợp đồng nhất. Ủ ở 65 0 C trong 1h.  Bƣớc 2: Ly tâm 11.000 vòng trong 15 phút ở 4 0C. Thu 700 l dịch nổi.  Bƣớc 3: Thêm 500 l Chloroform: Isoamyl alcohol (24:1), đảo nhẹ. Ly tâm 11.000 vòng trong 15 phút ở 4 0C. Thu 500 l dịch nổi.  Bƣớc 4: Lặp lại bƣớc 3. Thu 300 l dịch nổi.  Bƣớc 5: Thêm 200 l dung dịch isopropanol lạnh. Để tủa ở - 20 0C qua đêm.  Bƣớc 6: Ly tâm 11.000 vòng trong 15 phút ở 4 0C. Đổ bỏ dịch trong, thu kết tủa trắng.  Bƣớc 7: Cho vào 300 l TE 1X. Ủ ở 37 0C trong 1h. 35  Bƣớc 8: Thêm 20 l muối Sodium acetate 3 M, và 640 l Ethanol 100 %, trộn đều. Ủ – 20 0C trong 1 h.  Bƣớc 9: Ly tâm 11.000 vòng trong 25 phút ở 4 0C. Đổ bỏ dịch trong.  Bƣớc 10: Rửa cặn với 400 l Ethanol 70 % bằng cách ly tâm 12.000 vòng trong 3 phút ở 4 0C. Đổ bỏ dịch trong.  Bƣớc 11: Lặp lại bƣớc 10. Để khô cặn ở 37 0C, hòa tan cặn trong 50 l TE 1X, ủ ở 37 0C trong 1 h.  Bƣớc 12: Bảo quản mẫu ở - 20 0C. 3.3.1.3. Kiểm tra kết quả ly trích DNA bằng phƣơng pháp quang phổ Dựng đƣờng chuẩn bằng dung dịch TE 1X theo hƣớng dẫn ghi trên máy đo hấp thu quang phổ. Độ pha loãng mẫu 100 lần, ứng với 5 l DNA và 495 l TE 1X. 3.3.1.4. Kiểm tra kết quả ly trích DNA bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose  Pha gel agarose với nồng độ 1%: Cân 0,15 g agarose cho vào 15 ml dung dịch TAE 0,5X (đối với gel 6 giếng). Đun bằng lò Viba cho agarose tan thật đều.  Đổ gel, chờ agarose đông.  Load mẫu vào các giếng với tỷ lệ 2 l loading dye và 4 l DNA mẫu.  Chạy điện di ở điều kiện 100 V, 250 mA, thời gian khoảng 20 phút. Nhuộm ethidium bromide khoảng 15 phút, sau đó đƣa vào máy Geldoc đọc kết quả. Dƣới tia UV, Ethidium Bromide liên kết với sợi đôi DNA sẽ phát quang và tạo thành các band trên gel. 3.3.2. Kỹ thuật RAPD 3.3.2.1. Vật liệu dùng trong RAPD a. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm Tủ hút (Việt Nam). Các loại pippet (Nichiry - Nhật Bản). 36 Đầu típ các loại (Đức). Ống eppendorf 200 μl (Pháp). Giếng đổ gel. Máy điện di (Biorad - Thụy Điển). Đá gel, bao tay. Tủ lạnh – 200C (Sanyo - Nhật Bản). Máy PCR Biorad (Biorad - Thụy Điển). Máy chụp hình DNA Geldoc (Biorad - Thụy Điển). b. Hóa chất thí nghiệm Taq DNA polymerase (Promega - Mỹ). Ladder 2. Buffer B. MgCl2. dNTP. Nƣớc siêu sạch. Primer: sử dụng 7 primer:  Primer OPAC10: 5’ AGCAGCGAGG 3’ và Tm = 34 0 C.  Primer 1: 5’ TGCCGAGCTG 3’ và Tm = 40,7 0 C.  Primer 2: 5’ AGTCAGCCAC 3’ và Tm = 34,3 0 C.  Primer OPA05: 5’AGGGGTCTTG 3’ và Tm = 30,2 o C.  Primer RAH8: 5’ GAGAGCCAAC 3’ và Tm = 31,9 0 C.  Primer 9: 5’ GGTACTCCCC 3’ và Tm = 33,9 0 C.  Primer OPA10: 5’ GTGATCGCAG 3’ và Tm = 30,7 0 C. 37 3.3.2.2. Tiến hành thí nghiệm a. Thí nghiệm 1: Sử dụng primer OPAC10, khảo sát quy trình RAPD với thành phần hóa chất và chu kỳ nhiệt đƣợc thể hiện ở bảng 3.1 và bảng 3.2. Bảng 3.1: Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng RAPD ở thí nghiệm 1. Hóa chất Nồng độ đầu Nồng độ cuối Thể tích sử dụng ( l) PCR buffer 10 X 1 X 2,5 MgCl2 25 mM 3 mM 3 dNTP 25 mM 0,2 mM 0,2 Primer 100 pmol / l 1,2 pmol / l 0,3 Taq DNA polymerase 5 U 1 U 5 DNA 20 ng / l 1 H2O 13 Tổng thể tích phản ứng 25 l Bảng 3.2: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD ở thí nghiệm 1. Số chu kỳ Nhiệt độ (0C) Thời gian 1 94 5 phút 40 94 30 giây 36 30 giây 72 1 phút 1 72 5 phút 38 Ổn định 40 C b. Thí nghiệm 2: Khảo sát 7 mồi trên cây Đƣng cùng một số cây ngập mặn khác, với thành phần hóa chất và chu kỳ nhiệt đƣợc thể hiện ở bảng 3.3 và bảng 3.4. Bảng 3.3: Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng RAPD ở thí nghiệm 2. Hóa chất Nồng độ đầu Nồng độ cuối Thể tích sử dụng ( l) PCR buffer 10 X 1 X 2,5 MgCl2 25 mM 3 mM 3 dNTP 25 mM 0,2 mM 0,2 Primer 100 pmol / l 1,2 pmol / l 0,3 Taq DNA polymerase 5 U 1 U 5 DNA 20 ng / l 1 H2O 13 Tổng thể tích phản ứng 25 l Bảng 3.4: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD ở thí nghiệm 2. Số chu kỳ Nhiệt độ (0C) Thời gian 1 94 5 phút 40 94 30 giây Ta= Tm ± X 0 C (2 < X < 4) 30 giây 72 1 phút 1 72 5 phút Ổn định 40 C Ta: nhiệt độ của phản ứng PCR. T m: nhiệt độ nóng chảy của mồi. Nhiệt độ phản ứng PCR đối với mỗi mồi Primer 1: Ta = 38 0 C. Primer 2: Ta = 36 0 C Primer OPA5: Ta = 34 0 C. Primer 9: Ta = 36 0 C. Primer RAH8: Ta = 34 0 C. Primer OPAC10: Ta = 36 0 C. Primer OPA10: Ta = 34 0 C. 39 c. Thí nghiệm 3: Khảo sát nồng độ primer OPAC10 với thành phần hóa chất và chu kỳ nhiệt đƣợc thể hiện ở bảng 3.5 và bảng 3.6. Bảng 3.5: Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng RAPD ở thí nghiệm 3. Nghiệm thức Hóa chất Nồng độ đầu Nồng độ cuối Thể tích sử dụng ( l) PCR buffer 10 X 1 X 2,5 MgCl2 25 mM 3 mM 3 dNTP 25 mM 0,2 mM 0,2 Taq DNA polymerase 5 U 1 U 5 DNA 20 ng / l 1 Nghiệm thức 1 Primer 100 pmol / l 1,2 pmol / l 0,3 Nghiệm thức 2 Primer 100 pmol / l 1 pmol / l 0,25 Nghiệm thức 3 Primer 100 pmol / l 0,8 pmol / l 0,2 Nghiệm thức 4 Primer 100 pmol / l 0,6 pmol / l 0,15 H2O Thêm vào cho đủ 25 l. Bảng 3.6: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD ở thí nghiệm 3. Số chu kỳ Nhiệt độ (0C) Thời gian 1 94 5 phút 94 30 giây 40 40 36 30 giây 72 1 phút 1 72 5 phút Ổn định 40 C d. Thí nghiệm 4: Sử dụng primer OPCA10 thực hiện phản ứng RAPD với các mẫu DNA đạt tiêu chuẩn, với thành phần hóa chất và chu kỳ nhiệt đƣợc thể hiện ở bảng 3.9 và bảng 3.10. Bảng 3.7: Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng RAPD ở thí nghiệm 4. Hóa chất Nồng độ đầu Nồng độ cuối Thể tích sử dụng ( l) PCR buffer 10 X 1 X 2,5 MgCl2 25 mM 3 mM 3 dNTP 25 mM 0,2 mM 0,2 Primer 100 pmol / l 1,2 pmol / l 0,3 Taq DNA polymerase 5 U 1 U 0,2 DNA 20 ng / l 20 ng / l 1 H2O 17,8 Tổng thể tích phản ứng 25 l Bảng 3.8: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD ở thí nghiệm 4. Số chu kỳ Nhiệt độ ( 0 C) Thời gian 1 94 5 phút 40 94 30 giây 36 30 giây 72 1 phút 41 1 72 5 phút Ổn định 40 C Một số lƣu ý khi thực hiện phản ứng RAPD Trong thành phần phản ứng, Taq DNA polymerase đƣợc sử dụng với thể tích rất nhỏ (0,2 l), để đảm bảo độ chính xác của thí nghiệm, thông thƣờng ngƣời ta trộn một lần nhiều phản ứng. Các thao tác trộn mẫu phải đƣợc thực hiện trong tủ cấy vô trùng, nhằm tránh sự tạp nhiễm. Trong quá trình trộn mẫu, hóa chất và DNA mẫu phải đƣợc giữ lạnh để tránh hƣ hỏng. Các thao tác trộn mẫu phải tiến hành nhẹ nhàng, tránh tạo bọt dẫn đến thể tích hút không chính xác, các hóa chất trong dung dịch hút không đồng đều. Taq DNA polymerase phải đƣợc thêm vào sau cùng. Sau khi đã thêm Taq vào hỗn hợp, các thao tác tiếp theo phải đƣợc tiến hành nhanh chóng vì Taq sẽ hoạt động ngay. Ngoài ra, kết quả phản ứng RAPD còn phụ thuộc một số yếu tố khách quan khác nhƣ: chất lƣợng gel (độ dày của gel không đồng nhất, chiều cao các giếng không đều), điện thế không ổn định hoặc điện cực của máy điện di bị cong và dung dịch điện di. 42 Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả thu thập mẫu Đƣng tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ Chúng tôi đã tiến hành thu thập đƣợc 36 mẫu lá Đƣng từ những cây có đặc điểm hình thái khác nhau: thân cây to, cây mọc tốt, cây mọc yếu ớt, cây con, cây mọc tự nhiên, tái sinh hay đƣợc trồng. Hình 4.1 Vị trí các mẫu Đƣng đƣợc thu thập trên bản đồ Cần Giờ. Tuy số mẫu thu đƣợc rất ít so với tổng diện tích hơn 38.000 ha (1993 - 1999) của khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ nhƣng các mẫu có sự phân bố rải rác giữa 43 hai vùng quan trọng, đó là vùng lõi (tiểu khu 11,12) và vùng đệm (tiểu khu 1, 2, 7, 10). Cách thu thập mẫu ngẫu nhiên cũng giúp kết quả phân tích, đánh giá mức độ đa dạng di truyền quần thể Đƣng tại đây mang tính tổng thể và khách quan hơn. Đa số nhóm cây Đƣng mọc tự nhiên (22 cây) xanh tốt, có nhiều nhánh, nhiều hoa và trái, ít sâu bệnh. Bên cạnh cây xanh tốt, những cây đƣợc trồng (11 cây) khác đều có lá to, nhiều lá vàng, sâu bệnh. Riêng 3 cây tái sinh thu thập đƣợc đều có lá to và nhiều sâu. Điều này chứng tỏ, cây mọc tự nhiên có sức sống tốt ít bị tác động bởi sâu bệnh, sinh trƣởng mạnh, cho nhiều hoa và trái to, có thể trồng xen vào các quần thể Đƣng đƣợc trồng nhằm tăng hiệu quả tái tạo rừng và đảm bảo tính đa dạng sinh học tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ. 4.2. Bảo quản mẫu Mẫu lá Đƣng tƣơi trong điều kiện – 20 0C sẽ nhanh chóng bị hƣ hỏng (hóa nâu, dập) ngay khi vừa lấy ra khỏi tủ lạnh. Điều này là do khi trữ ở – 20 0C, các tinh thể nƣớc có kích thƣớc lớn đã đƣợc tạo thành và phá vỡ vách cellulose của tế bào lá Đƣng. Khi tiếp xúc với nhiệt độ phòng, các tinh thể nƣớc tan ra làm cho hợp chất phenol có trong tế bào lá Đƣng đƣợc phóng thích ra ngoài và làm hóa nâu mẫu lá. Để khắc phục nhƣợc điểm trên, chúng tôi đề nghị một số giải pháp nhƣ sau:  Cách trữ mẫu tƣơi tốt nhất là cho vào trong túi nilông, ép hết không khí trong túi ra ngoài và trữ ở 4 oC. Với cách trữ này, mẫu có thể bảo quản đƣợc trong vòng 15 ngày mà không bị hƣ hỏng khi lấy ra ngoài điều kiện nhiệt độ phòng. Cách khác cắt mẫu lá tƣơi sẵn trƣớc khi nghiền, có thể trữ đƣợc 7 ngày. Tuy nhiên theo cách này, thì mẫu đem ra phải đƣợc nghiền ngay trong nitơ lỏng, vì nếu nghiền trong EB mẫu sẽ nhanh chóng hóa nâu, chất lƣợng ly trích giảm. Lá có màu nâu do các hợp chất phenol tiết ra trong quá trình trữ mẫu tiếp xúc với không khí. Khi nghiền những mẫu này trong nitơ lỏng ở nhiệt độ - 196 0C, các thành phần có trong lá nhanh chóng đƣợc đông lạnh lại, trong suốt quá trình nghiền mẫu luôn đƣợc tiếp xúc với nitơ lỏng, vì vậy chất lƣợng DNA ly trích đƣợc sẽ tốt hơn. Mẫu lá tƣơi cũng có thể đƣợc nghiền trong nitơ lỏng và bảo quản ở - 70 0C, nhƣng sau khi lấy ra khỏi tủ âm phải 44 cho EB vào ủ liền, nếu không mẫu sẽ hóa nâu rất nhanh. Việc trữ mẫu đã nghiền trong nitơ lỏng ở điều kiện – 70 oC có thể bảo quản đƣợc trong vòng 20 ngày nhƣng mẫu nhanh chóng bị hƣ hỏng (hóa nâu, dập) ngay khi vừa lấy ra khỏi tủ lạnh.  Để đạt đƣợc kết quả ly trích tốt nhất nên ủ mẫu với dịch trích EB ngay khi vừa nghiền xong. 4.3. Kết quả OD (Optical Density) Tỷ lệ OD của tất cả các mẫu thu thập đƣợc dao động từ 1,1 đến 2,43, tỷ lệ trung bình 1,7. Tỷ lệ này không cao do một số mẫu DNA có kết quả quá thấp (1,095 đến 1,66). Một số mẫu DNA khác cho kết quả cao hơn (1,72 đến 2,43). Tỷ lệ OD trung bình đối với 25 mẫu điện di cho kết quả tốt là 1,86. Tỷ lệ này không cao là do những mẫu thực hiện phản ứng RAPD không tốt có tỷ lệ OD rất thấp, từ 1,1 đến 1,75. Đó là những mẫu đƣợc ly trích đã lâu và thƣờng xuyên bị lấy ra khỏi nơi bảo quản trong quá trình thao tác gây sốc nhiệt mẫu DNA. Hàm lƣợng DNA trung bình của 36 mẫu là 676,02 ng / µl. Hàm lƣợng DNA 25 mẫu điện di tốt (752,19 ng / µl) cao hơn mức trung bình chung, tuy nhiên vẫn còn một ít mẫu có hàm lƣợng DNA thấp nhƣ mẫu 29 (263,56 ng / µl). Mẫu 1B.23 có hàm lƣợng DNA cao nhất (1436,5 ng / µl), tỷ lệ OD không cao (1,66) nhƣng kết quả điện di band sản phẩm sáng rõ, không tạp và không bị đứt gãy. Từ kết quả OD và hàm lƣợng DNA thu đƣợc chúng tôi nhận thấy chỉ những mẫu Đƣng có tỷ lệ OD cao hơn 1,48 và hàm lƣợng DNA phải đạt 263,56 ng / µl trở lên thì khi thực hiện phản ứng RAPD mới xây dựng đƣợc cây phân loại. 45 4.4. Kết quả điện di 4.4.1. Kết quả điện di DNA thu đƣợc theo quy trình ly trích 1 Hình 4.2 Kết quả điện di mẫu ly trích theo quy trình 1. Ban đầu thực hiện quy trình 1 (quy trình của Doyle và Doyle (1988)), kết quả chúng tôi không thu đƣợc DNA hoặc DNA không tinh sạch và các band bị nhòe (smear) không gọn đẹp. Điều này có thể do quá trình bảo quản mẫu không tốt, thao tác nghiền mạnh, vortex quá mạnh (14.000 vòng / phút) hoặc sau khi cho Chloroform : Isoamyl alcohol mà vẫn vortex đã làm DNA bị gãy. Mẫu DNA thu đƣợc từ quy trình này không đủ tiêu chuẩn để thực hiện phản ứng RAPD. Việc ly trích DNA từ mẫu Đƣng gặp nhiều khó khăn vì lá Đƣng chứa nhiều polysaccharide làm cho dịch trích rất nhớt. Có thể chất nhớt này đã hạn chế sự kết tủa của DNA và làm cho DNA bị trôi đi khi đổ bỏ dịch trong ở bƣớc 5, 8, 9, cũng ảnh hƣởng đến thao tác hút dịch nổi ở bƣớc 2, 3, của cả 3 quy trình, và thêm bƣớc 4 ở quy trình 3. Ngoài ra, trong lá Đƣng chứa rất nhiều hợp chất thứ cấp nên ảnh hƣởng đến tác dụng của các hóa chất ly trích. 4.4.2. Kết quả điện di DNA thu đƣợc theo quy trình ly trích 2 Hình 4.3 Kết quả điện di mẫu ly trích theo quy trình 2. 46 Quy trình 2 đƣợc thực hiện nhằm thu đƣợc DNA chất lƣợng tốt hơn. Trong quy trình này, ly tâm sẽ đƣợc thực hiện trƣớc khi cho Chloroform : Isoamyl alcohol, nhằm loại bỏ đƣợc phần lớn chất thứ cấp trong lá Đƣng giúp cho Chloroform : Isoamyl alcohol có tác dụng tốt hơn, band tƣơng đối rõ, hiện tƣợng DNA gãy và lẫn tạp giảm đi một ít. Vì thế, mẫu DNA thu đƣợc có chất lƣợng tƣơng đối tốt hơn. Thế nhƣng, trong quá trình thực hiện quy trình 2, chúng tôi nhận thấy không phải mẫu lá Đƣng nào ly trích cũng cho kết quả ổn định. Trong những lần ly trích khác nhau, với cùng một mẫu lá với cùng quy trình nhƣng chất lƣợng đã có sự khác biệt. Ngoài ra, việc khắc phục hiện tƣợng DNA bị đứt gãy chƣa thật tốt, tạp chất vẫn còn nhiều. Sau nhiều lần thử nghiệm với quy trình 3, nghiền mẫu trong nitơ lỏng, có sử dụng PVP (Polyvinyl pyrrolidone) chúng tôi nhận thấy chất lƣợng DNA tốt hơn, band điện di sáng rõ, DNA ít bị đứt gãy, ít tạp hơn. Hình 4.4 Sự khác biệt giữa DNA mẫu ly trích theo quy trình 2 và quy trình 3. Cùng mẫu 7.10, ở quy trình 2 band sáng rõ, nhƣng vẫn còn tạp, quy trình 3 sản phẩm điện di tốt hơn, không bị tạp. Tƣơng tự nhƣ vậy, mẫu 7.13 ở quy trình 2 chƣa tốt, DNA bị gãy, có tạp, nhƣng quy trình 3 hai mẫu 7.13 đều tạo band sáng rõ, không tạp và DNA không bị đứt gãy. Kết quả điện di hình 4.4 thể hiện chất lƣợng DNA ly trích theo quy trình cải tiến sử dụng nitơ lỏng tốt hơn so với hai quy trình 1 và 2. Quy trình 2 Quy trình 3 47 4.4.3. Kết quả điện di DNA thu đƣợc theo quy trình ly trích 3 Hình 4.5 Kết quả điện di 12 mẫu ly trích theo quy trình 3. Hình 4.6 Kết quả điện di 13 mẫu ly trích theo quy trình 3. DNA mẫu thu đƣợc từ quy trình 3 khá tốt. Những mẫu đủ tiêu chuẩn thực hiện phản ứng RAPD là những DNA tạo band sáng rõ, ít bị gãy và tạp khi điện di. Kết quả OD của 25 mẫu này dao động từ 1,48 (mẫu 33) đến 2,43 (mẫu 2B.15), trung bình là 1,86. Tỷ lệ OD trung bình trên 20 mẫu thực hiện phản ứng RAPD tốt là 1,95. Đối với những mẫu thực hiện phản ứng RAPD không thành công, tỷ lệ OD trung bình 1,36 biến thiên trong khoảng 1,1 (mẫu 11.7) đến 1,75 (mẫu 11.2), tuy có vài mẫu kết quả OD tƣơng đối cao (mẫu 11.2: 1,75), nhƣng nhìn chung kết quả này rất thấp. Những mẫu này là những mẫu lá trƣởng thành, lá già. Hơn nữa, việc bảo quản mẫu không tốt, số lá thu đƣợc trên một cây bị hạn chế, lƣợng DNA bị mất dần theo thời gian bảo quản. Tất cả đều đƣợc thu thập từ những cây có lá vàng, nhiều sâu và cây ốm yếu. Từ những kết quả thu đƣợc, chúng tôi quyết định ly trích DNA theo quy trình 3 và bảo quản mẫu ở - 20 0C, hạn chế lấy mẫu ra khỏi nơi bảo quản nhằm ổn định chất lƣợng DNA để thực hiện kỹ thuật RAPD. 48 Trong quá trình hoàn thiện quy trình ly trích, chúng tôi nhận thấy:  Mẫu đƣợc nghiền trong nitơ lỏng tốt hơn mẫu nghiền trong EB.  Tăng thời gian ủ mẫu và ly tâm trƣớc khi cho Chloroform : Isoamyl alcohol nhằm loại bỏ đƣợc phần lớn chất thứ cấp trong lá Đƣng giúp các hóa chất tăng khả năng hoạt động.  Khi đã cho Chloroform : Isoamyl alcohol không nên vortex mà chỉ đảo nhẹ để tránh làm đứt gãy DNA.  Những bƣớc lấy dịch nổi không nên để đầu tip chạm vào phần tạp (protein) ngăn cách 2 pha, cũng cần tránh hút quá mạnh vì tạp sẽ bị hút lên, ảnh hƣởng đến độ tinh sạch của DNA.  Không để khô cặn quá lâu sẽ làm hỏng DNA.  Không chọn lá quá non (đọt) vì lá còn non đang trong thời kỳ sinh trƣởng mạnh, chứa nhiều hợp chất thứ cấp ảnh hƣởng đến tác dụng của hóa chất. Ngoài ra, lá non chứa nhiều nƣớc nên lƣợng DNA trong lá non ít hơn lá trƣởng thành. Đồng thời cũng không chọn lá già. Bởi vì polysachride trong lá già tạo nhớt, ảnh hƣởng đến chất lƣợng ly trích qua các thao tác hút dịch nổi, đổ bỏ dịch trong gây thất thoát DNA mẫu. Nên sử dụng lá non (liền kề với đọt) sẽ cho kết quả ly trích tốt hơn.  Để khắc phục việc chọn mẫu lá non, chúng ta có thể tăng nồng độ các hóa chất có tác dụng làm kết tủa protein, peptide, polyphenol nhƣ CTAB, - mercaptroethanol, chloroform và tăng lƣợng mẫu lá khi nghiền. Đối với lá già thì cho thêm PVP (Polyvinyl pyrrolidone) vào sẽ giúp hạn chế đƣợc ảnh hƣởng của polyscharide (tạo nhớt), sản phẩm ly trích ít có tạp hơn so với hai quy trình trƣớc, dịch nhớt cũng đã giảm đáng kể.  Nên trữ mẫu DNA ở - 20 0C nhằm hạn chế sự mất dần lƣợng DNA.  Dịch trích EB khi bảo quản thƣờng có hiện tƣợng kết tủa (CTAB) ảnh hƣởng đến kết quả ly trích DNA, do đó cần ủ dung dịch EB ở 650 C khoảng 10 phút trƣớc khi sử dụng. Khi hút dịch trích nên khuấy đều dung dịch, để các thành phần hóa chất trong EB nhƣ nhau trong các lần hút. 49  Quy trình ly trích đã sử dụng - mercaptoethanol trong dung dịch EB, có tác dụng phá hủy mạnh thành tế bào tăng khả năng giải phóng DNA, muối sodium acetate làm bất hoạt enzyme phân hủy DNA và việc sử dụng Chloroform : Isoamyl acohol 2 lần, ly tâm tốc độ cao đã giúp loại bỏ đƣợc tạp chất nhƣ protein, polysaccharide, và một số hợp chất thứ cấp khác. Nhìn chung quy trình ly trích cải tiến, nghiền trong nitơ lỏng và sử dụng PVP (Polyvinyl pyrrolidone) khá ổn định và hiệu quả. 4.5. Kết quả phản ứng RAPD 4.5.1. Kết quả khảo sát Primer OPAC10 Hình 4.7 Kết quả điện di sử dụng primer OPAC10, khảo sát quy trình RAPD. Kết quả điện di cho thấy chu kỳ nhiệt và thành phần hóa chất của quy trình RAPD trong thí nghiệm 1 phù hợp với cây Đƣng. So với những cây khác, với cùng thành phần hóa chất, cùng chu kỳ nhiệt thì cây Đƣng cho kết quả khá tốt: có nhiều band, các band tƣơng đối rõ, xuất hiện band đa hình giữa các cây. Để có đƣợc kết quả tốt hơn, chúng tôi tiến hành khảo sát trên những mồi khác với cùng thành phần hóa chất, chu kỳ nhiệt nhƣ thí nghiệm 1. 50 4.5.2. Kết quả khảo sát 7 mồi trên cây Đƣng cùng một số cây ngập mặn khác Hình 4.8 Kết quả điện di khảo sát Primer 1. (ĐƢ) Đưng, (C) Cóc, (ĐĐ) Đước đôi, (MĐ) Mắm đen, (MT) Mắm trắng, (MB) Mắm biển. Tham khảo kết quả của nhóm 3 cây mắm thì band đồng hình có kích thƣớc 400 bp, quan sát gel điện di thì thấy ở cây Đƣng cũng xuất hiện band có kích thƣớc tƣơng tự. Do chỉ mới khảo sát một lần đồng thời ở cây cóc và cây đƣớc đôi không xuất hiện band rõ ràng nên chƣa đủ cơ sở kết luận đây là band đại diện cho nhóm cây ngập mặn hay không. Vì vậy nên tiến hành thêm nhiều thí nghiệm kiểm chứng để có đƣợc một kết quả chính xác hơn. Hình 4.9 Kết quả điện di khảo sát Primer 9 và 2. (MĐ) Mắm đen, (MT) Mắm trắng, (C) Cóc, (ĐĐ) Đước đôi, (ĐƢ) Đưng, (MB) Mắm biển. Band đồng hình 51 Hình 4.10 Kết quả điện di khảo sát Primer RAH8. Kết quả điện di cho thấy, so với những cây khác thì Đƣng cho số band nhiều hơn, các band phân tách tƣơng đối rõ, có sự đa hình giữa các cây Đƣng với nhau (hình 4.7, 4.10). Cụ thể nhƣ sau:  Hình 4.7: Primer OPAC10 tạo nhiều band hơn các mồi khác, các mẫu đều cho nhiều band. Cụ thể, đối với mẫu 7.12 có 8 band, mẫu 2B.14 có 6 band.  Hình 4.8: Primer 1: mẫu 7.12 có 4 band.  Hình 4.9: Primer 2: mẫu 7.12 có 1 band.  Hình 4.9: Primer 9: mẫu 7.12 có 2 band.  Hình 4.10: Primer RAH8: lần lƣợt theo thứ tự mẫu 7.12 có 4 band, mẫu 2B.14 có 1 band. Để thấy rõ sự khác biệt trong việc tạo sản phẩm RAPD giữa các mồi, chúng tôi tiếp tục thực hiện phản ứng RAPD với 7 mồi trên cùng một cây (7.12) theo chu kỳ nhiệt và thành phần hóa chất của thí nghiệm 2. Hình 4.11 Kết quả điện di sản phẩm RAPD của mẫu 7.12 với 7 mồi. (L) ladder, (Pr1) primer 1, (Pr2) primer 2, (Pr5) primer OPA5, (H8) primer RAH8, (C10) primer OPAC10,( Pr9) primer 9, (Pr10) primer OPA10. 52 Từ kết quả điện di trên hình 4.11, chúng tôi nhận thấy:  Primer 1: mẫu 7.12 có 4 band (300 bp, 430 bp, 550, bp, 650 bp).  Primer 2: mẫu 7.12 có 2 band (350 bp, >1000 bp).  Primer RAH8: mẫu 7.12 có 3 band (380 bp, 620 bp, >1000 bp) và một vài band mờ, khó xác định.  Primer OPAC10 tạo nhiều band, band sáng rõ và đậm, phân tách tốt hơn so với các mồi khác. Mẫu 7.12 có 5 band (400 bp, 520 bp, 800 bp, 1000 bp, >1000 bp).  Primer OPA5, primer 9 và primer OPA10 không có sản phẩm. Trong quá trình thực hiện thí nghiệm, chúng tôi rút ra nhận xét: Đối với các mồi OPA5, 9, OPA10 đã không tạo sản phẩm RAPD, điều này không thể hiện đƣợc bản chất của kỹ thuật RAPD là cho nhiều band với khả năng nhân bản lớn do sử dụng primer ngẫu nhiên. Vì vậy có thể tiến hành thêm nhiều khảo sát khác để có những khi kết quả phân tích RAPD đối với ba mồi trên chính xác hơn. Từ những kết quả thu đƣợc của thí nghiệm 1 và thí nghiệm 2, chúng tôi quyết định sử dụng primer OPAC10 với chu kỳ nhiệt và thành phần hóa chất trong thí nghiệm 1 để thực hiện phản ứng RAPD cho tất cả mẫu ly trích đạt tiêu chuẩn. Tuy nhiên, để có kết quả phản ứng RAPD tốt hơn thông qua việc thay đổi nồng độ mồi tăng khả năng tạo nhiều sản phẩm khuếch đại, nhằm thu đƣợc band sáng rõ, giúp cho việc xây dựng cây di truyền đạt đƣợc độ chính xác cao. 53 4.5.3. Kết quả khảo sát nồng độ OPAC10 Hình 4.12 Kết quả điện di khảo sát nồng độ Primer OPAC10 trên mẫu 2B.14, 7.12. Theo kết quả điện di hình 4.12, thì nồng độ mồi 0,6 pmol / l và 0,8 pmol / l các band rất mờ và không phân tách rõ. Với nồng độ 1 pmol / l, số lƣợng band nhiều hơn, sáng hơn hai nồng độ trên nhƣng các band vẫn chƣa phân tách rõ ràng. Với nồng độ 1,2 pmol / l thì sản phẩm RAPD cũng có khá nhiều band, đồng thời các band đã có sự phân tách rõ hơn, dễ dàng xác định số band sản phẩm RAPD hơn các nồng độ khác, giúp xây dựng cây di truyền đạt kết quả tốt hơn. Chính vì vậy, chúng tôi quyết định vẫn sử dụng nồng độ primer 1,2 pmol / l. 4.5.4. Kết quả sử dụng OPAC10 thực hiện phản ứng RAPD với tất cả các mẫu DNA ly trích đạt tiêu chuẩn Hình 4.13 Kết quả điện di 7 sản phẩm RAPD. Band đa hình Sản phẩm PCR không tốt (NT) nghiệm thức. 54 Hình 4.14 Kết quả điện di 8 sản phẩm RAPD. Hình 4.15 Kết quả điện di 10 sản phẩm RAPD. Chúng tôi thực hiện phản ứng RAPD với 25 mẫu DNA, 20 mẫu đạt kết quả, chiếm tỷ lệ 80 %. Kết quả điện di cho thấy phản ứng RAPD trên mẫu Đƣng cho sản phẩm PCR tƣơng đối tốt, chỉ 5 mẫu (11.3, 11.6, 2B.25, 2B.26, 33) không cho sản phẩm. Tất cả những DNA mẫu này đều là mẫu ly trích từ những cây non (2B.26, 33), lƣợng lá ít nên không chọn đƣợc loại lá thích hợp cho ly trích (lá gần kề đọt) và từ những mẫu lá già (11.3, 11.6, 2B.25) chất lƣợng ly trích không tốt, do lƣợng polysacharide lớn tạo nhiều nhớt, lƣợng DNA bị thất thoát lớn trong quá trình đổ bỏ dịch trong, hút dịch nổi. Vì vậy, cần tăng lƣợng DNA mẫu trong phản ứng RAPD nhằm có kết quả khả quan hơn. Band đồng hình là những band có ở tất cả các mẫu, band đa hình là những band có ở mẫu này, không có ở mẫu kia. Các band đa hình là cơ sở phân biệt giữa các mẫu có tính trạng khác nhau, từ đó làm nền tảng phân chia và xác định giống. Band đồng hình 300 bp Band đồng hình Sản phẩm PCR không tốt 300 bp 55 Hình 4.13 trong 6 mẫu DNA cho kết quả phản ứng RAPD, giữa các mẫu có sự đa hình cao (8 band đa hình, tuy nhiên không xác định đƣợc kích thƣớc các band, vì không sử dụng thang chuẩn – ladder khi điện di). Hình 4.14 trong 4 mẫu cho kết quả phản ứng RAPD thì đã xuất hiện 2 band đồng hình có kích thƣớc 300 bp, 400 bp. Tuy số mẫu rất ít cũng đã xuất hiện 4 band đa hình (đều ở mẫu 1B.23 có kích thƣớc 150 bp, 520 bp, mẫu 1B.23, 7.10 và 29: 480 bp, mẫu 1B.23 và 29: 680 bp). Hình 4.15 trong tổng số 10 mẫu đạt kết quả phản ứng RAPD đã thu đƣợc 9 band đa hình. Có 2 band đồng hình, kích thƣớc 300 bp, 400 bp. Trung bình có 4,25 band / mẫu (85 band / 20 mẫu). Tuy số band / mẫu không cao nhƣng kết quả điện di đã thấy rõ sự đa hình giữa các mẫu. Trong tổng số 20 mẫu DNA đạt kết quả trong phản ứng RAPD, căn cứ vào những band đã biết kích thƣớc, có 2 band đồng hình 300 bp, 400 bp chiếm tỷ lệ 11,11 %, 13 band đa hình chiếm tỷ lệ 72,22 %, đó là những band cùng có ở 1, 2 hoặc 3 mẫu mà không có ở những mẫu còn lại, có kích thƣớc >>> 1.000 bp (7.12), >> 1.000 bp (2B.19, 30), > 1.000 bp (7.12), 1.000 bp (30), 900 bp (7.12), 680 bp (1B.23, 29), 520 bp (1B.23), 480 bp (1B.23, 7.10, 29), 270 bp (28), 230 bp (2B.19, 30, 7.12), 180 bp (30, 2B.15), 160 (36), 150 bp (1B.23). Tuy lƣợng mẫu nghiên cứu không lớn, nhƣng tất cả các mẫu đều xuất hiện band đồng hình có kích thƣớc 300 bp. Band này có thể sử dụng là band chỉ thị để phân biệt loài Đƣng Rhizophora mucronata Lamk. với các loài khác thuộc họ đƣớc Rhizophoraceae. Do đó nên tách band này để giải trình tự, nhằm phục vụ cho công tác lai tạo trong chọn giống cũng nhƣ trong những nghiên cứu chuyên sâu hơn về cây Đƣng ở mức độ phân tử. Bên cạnh đó, số lƣợng band đa hình tƣơng đối cao 13 band trong 20 sản phẩm RAPD thu đƣợc. Với band đồng hình có kích thƣớc 400 bp thì một vài cây không tạo sản phẩm PCR, vì vậy cần tăng số lần thực hiện phản ứng RAPD để có kết luận chính xác hơn. 56 4.5.5. Đánh giá quy trình phản ứng PCR – RAPD Quy trình thực hiện phản ứng PCR – RAPD khá ổn định, cho nhiều band, có độ phân giải và độ sáng khá tốt, song còn một số vấn đề:  Với những mẫu không ra kết quả tốt có thể thực hiện lại và có thể cho nhiều hơn 1 μl DNA mẫu vào hỗn hợp phản ứng RAPD.  Một số band tách không rõ có thể trong quá trình điện di, các band có độ dài gần bằng nhau nên khó tách ra rõ ràng. Chúng tôi sử dụng nồng độ agarose 2 % và điện di ở 50 V trong 70 phút cho độ phân tách cao hơn song vẫn gặp một số khó khăn, điển hình là các band di chuyển không đều, một số trƣờng hợp band không thẳng có thể do điện cực bị cong hay do hiệu ứng thành máy điện di ảnh hƣởng đến sự di chuyển của các DNA. Những mẫu này nên thực hiện lại phản ứng PCR, cho lƣợng mẫu nhiều hơn và chỉnh sửa máy điện di có thể cho kết quả tốt hơn. Bên cạnh đó, khi điện di bằng gel agarose, kích thƣớc của các band sẽ không thật sự chính xác do những hạn chế của gel agarose. Những band trên bản điện di có thể không hoàn toàn bằng nhau nhƣng không thể phát hiện bằng mắt thƣờng. Có thể giải trình tự để biết chính xác kích thƣớc và trình tự của chúng. 4.6. Bƣớc đầu đánh giá mức độ di truyền cây Đƣng tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ bằng phần mềm NTSYS Từ kết quả thu đƣợc trên gel điện di chúng tôi mã hóa thành dạng nhị phân 0 và 1, theo nguyên tắc có band thì ghi 1, không có band thì ghi 0, để phân tích mối tƣơng quan di truyền giữa các mẫu nghiên cứu bằng phần mềm NTSYS 2.1. Bảng số liệu (phụ lục 8, 9) hiển thị hệ số đồng dạng di truyền giữa các mẫu một cách cụ thể, nhƣng vẫn khó khăn trong đánh giá tổng thể nhiều mẫu về mức độ tƣơng quan di truyền vì vậy trong phân tích đa dạng di truyền thƣờng sử dụng cây di truyền. Phụ lục 8 cho kết quả phân tích hệ số đồng dạng di truyền trên 6 mẫu đại diện, hệ số đồng dạng di truyền của các mẫu biến thiên từ 14 đến 79 %. Nhƣ vậy các mẫu phân tích có khoảng cách di truyền khá xa nhau. Tuy nhiên kết luận này còn phụ thuộc vào tỷ lệ mẫu có hệ số đồng dạng di truyền thấp. Nếu các mẫu có hệ số đồng dạng di 57 truyền thấp chiếm một tỷ lệ lớn, thì các mẫu phâ